BRPI0012265B1

BRPI0012265B1 - fator estimulante de colônia de granulócitos humano modificado e processo para produzir o mesmo

Info

Publication number: BRPI0012265B1
Application number: BRPI0012265A
Authority: BR
Inventors: Sun Lee Gwan; Chang Kwon Se; Min Bae Sung; Youb Jung Sung
Original assignee: Hanmi Holdings Co Ltd; Hanmi Science Co Ltd; Hanmi Pharm Ind Co Ltd
Priority date: 1999-07-08
Filing date: 2000-07-07
Publication date: 2018-11-21
Also published as: ATE299187T1; DE60021188T3; US20040224393A1; CN1195859C; KR100356140B1; AU757147B2; NZ516476A; ES2243275T3; DK1194575T3; JP2003504069A; WO2001004329A1; DE60021188D1; PT1194575E; AU757147C; EP1194575A4; ES2243275T5; EP1194575B1; EP1194575B2; US7704709B2; CA2378543C

Abstract

"fator estimulante de colônia de granulócitos humano modificado e processo para produzir o mesmo". um fator (hg-csf) estimulante de colônia de granulócitos humano modificado é produzido por cultivo de um microorganismo transformado com um vetor de expressão compreendendo um gene codificando um hg-csf modificado para produzir e secretar o hg-csf modificado para periplasma, o referido hg-csf modificado sendo obtido por substituição de pelo menos um dentre os 1n<0>, 2n<0>, 3n<0> e 17n<0> aminoácidos de hg-csf tipo selvagem (seq id no: 2) com outro aminoácido.

Description

(54) Título: FATOR ESTIMULANTE DE COLÔNIA DE GRANULÓCITOS HUMANO MODIFICADO E PROCESSO PARA PRODUZIR O MESMO (73) Titular: HANMI SCIENCE CO., LTD.. Endereço: 214, Muha-ro, Paltan-Myeon, Hwaseong-si, Gyeonggi-do 445958, REPÚBLICA DA CORÉIA(KR) (72) Inventor: SE CHANG KWON; SUNG YOUB JUNG; SUNG MIN BAE; GWAN SUN LEE.

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 21/11/2018, observadas as condições legais

Expedida em: 21/11/2018

Assinado digitalmente por:

Alexandre Gomes Ciancio

Diretor Substituto de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados

FATOR ESTIMULANTE DE COLÔNIA DE GRANULÓCITOS

HUMANO MODIFICADO E PROCESSO PARA PRODUZIR O MESMO

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a um fator (hG-CSF) estimulante de colônia de granulócitos humano modificado, um gene codificando o referido peptídeo, um vetor compreendendo o referido gene, um microorganismo transformado com o referido vetor e um processo para produzir o hG-CSF modificado usando referido microorganismo.

Antecedentes da Invenção

O termo fator estimulante de colônia (CSF) inclui o fator (GM-CSF) estimulante de colônia de granulócitos/macrófagos, fator (M-CSF) estimulante de colônia de macrófagos e fator (G-CSF) estimulante de colônia de granuló15 citos, que são produzidos por células T, macrófagos, fibroblastos e células endoteliais. GM-CSF estimula as células indiferenciadas de granulócitos ou macrófagos para induzir a diferenciação das mesmas e proliferação de colônias de granulócitos ou macrófagos. M-CSF e G-CSF primariamente induzem 20 a formação de colônias de macrófagos e granulócitos, respectivamente. In vivo, G-CSF induz a diferenciação de leucócitos da medula óssea e melhora a função de granulócitos maduros e, conseqüentemente, sua importância clínica no tratamento de leucemia foi bem estabelecida.

G-CSF humano (hG-CSF) é uma proteína consistindo de 174 ou 177 aminoácidos, a variedade de 174 aminoácidos tendo atividade de melhora de neutrófilos superior (Morishita, K. et al. , J. Biol. Chem. 262, 15208 - 15213 (1987)). A ···· ··· • · seqüência de aminoácidos de hG-CSF consistindo de 174 aminoácidos ê mostrada na fig. 1 e foram realizados muitos estudos para a produção em massa de hG-CSF por manipular um gene codificando referido hG-CSF.

Por exemplo, Chugai Pharmaceuticals Co., Ltd. (Japan) descreveu a sequência de aminoácidos de hG-CSF e um gene codificando a mesma (publicação da patente coreana Nos. 91-5624 e 92-2312), e registrou um método para preparar proteínas tendo atividade hG-CSF por um processo de recombina10 ção de genes (patente coreana Nos. 47178, 53723 e 57582) .

Neste método de preparação, hG-CSF glicosilado é produzido ç em uma célula de mamíferos por emprego de um DNA genômico ou cDNA compreendendo um polinucleotídeo codificando hG-CSF. O hG-CSF glicosilado tem uma cadeia de açúcar O-glicosídica, 15 mas sabe-se que a referida cadeia de açúcar não é necessária para a atividade de hG-CSF (Lawrence, M. et al. , Science, 232, 61 (1986) ) . Ainda, é também bem conhecido que a produção de hG-CSF glicosilado empregado em células de mamíferos requer materiais e instalações onerosos, e assim, este pro20 cesso não é economicamente praticável.

Por volta deste tempo, foram realizadas tentativas para produzir hG-CSF não glicosilado por emprego de um microorganismo, por exemplo, E. coli. Nestes estudos, hG-CSFs tendo 175 ou 178 aminoácidos tendo um resíduo metionina fi-

5 xado no N-terminal do mesmo são obtidos devido ao códon de iniciação ATG empregado no microorganismo. O resíduo de metionina adicional, no entanto, causa respostas imunes indesejáveis no corpo humano quando o hG-CSF recombinante é ad3

ministrado ao mesmo (publicação da patente européia No. 256.843). Além disso, a maior parte de hG-CSFs contendo metionina produzido in E. coli é depositada nas células como corpos de inclusão insolúveis, e eles devem ser convertidos para uma forma ativa através de um processo de reduplicação, em uma perda significante de rendimento. Neste aspecto, quatro dos cinco resíduos Cys presentes em hG-CSF de tipo selvagem participam na formação de ligações dissulfeto, enquanto os restantes contribuem para a agregação do produto hG-CSF durante o processo de reduplicação para diminuir o rendimento .

Recentemente, a fim de resolver os problemas associados com a produção de uma proteína estranha dentro de uma célula microbiana, vários esforços foram feitos para desenvolver um método baseado em secreção eficiente de uma proteína de marcação através da membrana da célula microbiana no domínio extra-celular.

Por exemplo, em um método empregando um peptídeo de sinal, uma proteína desejada é expressada na forma de uma proteína de fusão em que um peptídeo de sinal é adicionado ao N-término da proteína. Quando a proteína de fusão passa através de uma membrana de célula, o peptídeo de sinal é removido por uma enzima e a proteína desejada é secretada na forma madura. O método de produção secretório é vantajoso em que a seqüência de aminoácidos produzida é geralmente idêntica ao tipo selvagem. No entanto, o rendimento de um método de produção secretório é com frequência bastante baixo devido às eficiências insatisfatórias tanto no transporte da membra4

·· ·· «·« ··«· ···· ·· ·· na como no processo de purificação subsequente. Isto está em

linha com o	fato bem conhecido de que o rendimento de uma
proteína de	mamífero, produzida em um modo secretório em
procariotos,	é muito baixo. Até agora, não foi registrado

método microbiano para a expressão eficiente e secreção de hG-CSF solúvel não tendo resíduo de metionina adicionado em seu N-término.

Os presentes inventores registraram previamente o uso de um novo peptídeo de sinal secretório preparado por modificação do peptídeo de sinal de E. coli de enterotoxina termo-resistente II (publicação acessível ao público de patente coreana No. 2000 - 19788) na produção de hG-CSF. Especificamente, um vetor de expressão compreendendo um gene hGCSF fixado na extremidade 3' do peptídeo de sinal modificado de enterotoxina II termo-resistente de E. coli foi preparado, e hG-CSF maduro biologicamente ativo, foi expressado por emprego de E. coli transformado com o vetor de expressão. No entanto, a maior parte de hG-CSF expressado acumulou no citoplasma em vez de no periplasma.

Os presentes inventores realizaram esforços, com sucesso, para ainda desenvolver um método secretório eficiente para a produção de hG-CSF em um microorganismo e verificaram que um hG-CSF modificado, que é preparado por substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido, especialmente o 17° resíduo de cisteína, de hG-CSF de tipo selvagem, com outro aminoácido, retém a atividade biológica do tipo selvagem e que o hG-CSF modificado não tendo resíduo metionina no N-término do mesmo pode ser eficientemente expressado e ··· secretado por um microorganismo quando se emprega um peptídeo de sinal secretório apropriado.

Sumário da Invenção

Consequentemente, é um objeto da presente invenção para prover um fator (hG-CSF) estimulante de granulócitos humano modificado que pode ser eficientemente produzido usando um microorganismo.

É outro objeto da presente invenção prover um gene codificando do referido peptídeo e um vetor compreendendo o referido gene.

É um outro objeto da presente invenção prover um microorganismo transformado com o referido vetor.

Ê ainda um outro objeto da presente invenção prover um processo para produzir um hG-CGF que não é fixado no resíduo metionina para o término amino usando o referido microorganismo .

De acordo com um aspecto da presente invenção, provê-se um hG-CSF modificado caracterizado em que pelo menos um dentre I^o, 2^o, 3^o e 17° aminoácidos de hG-CSF tipo selvagem é substituído por outro aminoácido.

Breve Descrição dos Desenhos

Os objetos acima e outros e aspectos da presente invenção se tornarão evidentes a partir da seguinte descrição da invenção tomada em conjunto com os seguintes desenhos anexos, que respectivamente mostram:

Fig. 1: as sequências de aminoácidos e nucleotídeos do fator estimulante de granulócitos humano tipo selva6 ··· i··» ··* gem composto de 174 resíduos de aminoácidos (SEQ ID NOS: 1 e

2) ;

Fig. 2: o procedimento para construir vetor pTCSF;

Fig.	3 :	O	procedimento	para	construir	vetor
pT14SlSG;
Fig.	4 :	o	procedimento	para	construir	vetor
pT14SSlSG;
Fig.	5 :	o	procedimento	para	construir	vetor
pT140SSG-4T22Q;
Fig.	6 :	o	procedimento	para	construir	vetor
PT14SS1S17SEG;
Fig.	7 :	o	procedimento	para	construir	vetor
pTOlSG;
Fig. 8	: O	procedimento para	construir vetor	pBADG;
Fig.	9:	o	procedimento	para	construir	vetor

pBAD2M3VG;

Figs. 10a e 10b: os resultados de análises western blot que verificam a expressão de hG-CSF e hG-CSFs modificados a partir de linhagens de célula recombinantes e o peso molecular de proteínas expressadas, respectivamente; e

Figura 11: as atividades celulares de hG-CSF e hGCSF modificado produzido a partir de linhagens de célula recombinantes .

Descrição Detalhada da Invenção

Os hG-CSFs modificados da presente invenção são derivados por substituição de um ou mais dos aminoácidos de hG-CSF tipo selvagem (SEQ ID NO: 2), preferivelmente os I^o,

··»♦

2^o, 3^o e 17° aminoácidos dos mesmos, por outros aminoácidos. Mais preferidos são os obtidos por substituição do 17° aminoácido de hG-CSF com um aminoácido que não é carregado em pH neutro. Exemplos específicos de hG-CSFs modificados preferidos tem a seqüência de aminoácidos de hG-CSF tipo selvagem, exceto que:

(a) o I^o aminoácido é Ser;

(b) o I^o aminoácido é Ser e o 17° aminoácido é X;

(c) o 2° aminoácido é Met e o 3° aminoácido é Vai;

(d) o 2° aminoácido é Met, o 3° aminoácido é Vai e o 17° aminoácido é X; ou (f) o 17° aminoácido é X, em que X é um aminoácido que não é carregado em pH neutro, preferivelmente Ser, Thr, Ala ou Gly, mais preferivelmente Ser.

Quatro dos cinco resíduos Cys de hG-CSF participam na formação de ligações dissulfeto, enquanto o 17° resíduo Cys permanece não ligado no estado natural. No entanto, quando uma quantidade grande de hG-CSF é expressada em células recombinantes, o 17° resíduo Cys se torna envolvido na formação de ligação dissulfeto inter-molecular, levando ao acúmulo de hG-CSFs aglomerado no citoplasma. No entanto, o hG-CSF modificado inventivo tendo um aminoácido diferente de Cys na 17° posição é livre deste problema e pode ser efetivamente produzido por um método secretório usando um microorganismo apropriadamente transformado.

O hG-CSF modificado da presente invenção pode ser codificado por um gene compreendendo uma seqüência de nucle8

otídeos deduzida de uma sequência de aminoácidos hG-CSF modificada de acordo com o código genético. Sabe-se que vários diferentes códons codificando um aminoácido específico podem existir devido à degenerescência de códons e, assim, a presente invenção inclui, em seu escopo, todas as seqüências de nucleotídeos deduzidas de sequência de aminoácidos hG-CSF modificado. Preferivelmente, a sequência de genes hG-CSF modificado inclui um ou mais códons preferidos de E. coli.

gene assim preparado pode ser inserido em um vetor convencional para obter um vetor de expressão, que pode, por sua vez, ser introduzido em um hospedeiro apropriado, por exemplo, um E. coli. 0 vetor de expressão pode ainda compreender um peptídeo de sinal. Os peptídeos de sinal representativos incluem um peptídeo de sinal de enterotoxina II de E. coli termo-resistente (SEQ ID NO: 53), um peptídeo de sinal de enterotoxina II de E. coli termo-resistente modificado (SEQ ID NO: 54) , um peptídeo de sinal beta lactamase (SEQ ID NO: 24) , um peptídeo de sinal de Gene III (SEQ ID NO: 42) ou um peptídeo modificado do mesmo; mas estes não limitam os peptídeos de sinal que podem ser usados na presente invenção. O promotor usado na preparação do vetor de expressão da presente invenção pode ser qualquer um que pode expressar uma proteína heteróloga em um hospedeiro microorganismo. Especialmente, promotor lac, Tac, e arabinose é preferido quando a proteína heteróloga é expressada a partir de E. coli.

Vetor de expressão exemplar da presente invenção inclui pT14SSlSG, pT14SS!S17SEG, pTOlSG, pT01S17SG, pTO17SG,

pT017TG, pT017AG, pT017GG, pBAD2M3VG, pBAD17SG e pBAD2M3V17SG.

Os vetores de expressão da presente invenção podem ser introduzidos em microorganismos, por exemplo, E. coli

BL21(DE3) (Novagen), E. coli XL-1 blue (Novagen) de acordo com um método de transformação convencional (Sambrook et al. , supra) para obter E. coli BL21(DE3)/pT14SSlSG(HM 10310) , E. coli BL21 (DE3)/pT14SSlS17SEG(HM 10311), E. coli BL21(DE3)/pTOlSG(HM 10409), E. coli BL21(DE3)/pTOlSl7SG(HM

10410), E. coli BL21 (DE3)/pTO17SG (HM 10411), E. coli

BL21 (DE3)/pTO17TG(HM 10413), E. coli BL21(DE3)/pTO17AG(HM 10414), E. coli BL21(DE3)/pTO17GG(HM 10415), E. coli

BL21(DE3)/pBAD2M3VG(HM 10510), E. coli BL21(DE3)/pBAD17SG (HM 10511) e E. coli BL21 (DE3)/pBAD2M3V17SG (HM 10512) transfor15 mantes. Dentre o microorganismo transformado, preferidos são

E. coli BL21(DE3)/pT14SSlS17SEG(HM 10311), E. coli BL21(DE3)/pT01S17SG(HM 10410), E. coli BL21(DE3)/pTO17SG (HM 10411) e E. coli BL21 (DE3)/pBAD2M3VG (HM 10510) transformantes que foram depositados junto ao Korean Culture Center of 20 Microorganisms (KCCM) (endereço; Department of Food Engineering, College of Eng., Yonsei University, Sodaemun-gu, Seoul 120 - 749, Republic of Korea) em 24 de março de 1999 sob números de acesso KCCM-10154, KCCM-10151, KCCM-10152 e KCCM10153, respectivamente, de acordo com os termos de Budapest 25 Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganism for the Purpose of Patent Procedure.

A proteína hG-CSF modificada da presente invenção pode ser produzida por cultivo do microorganismo transfor-

mante para expressar o gene codificando a proteína hG-CSF modificada e secretar o hG-CSF modificado, proteína para periplasma; e recuperando a proteína hG-CSF modificada do periplasma. O microorganismo transformante pode ser cultivado de acordo com um método convencional (Sambrook et al. , supra) . A cultura de microorganismos pode ser centrifugada ou filtrada para coletar o microorganismo secretando a proteína hG-CSF modificada. 0 microorganismo transformado pode ser rompido de acordo com um método convencional (Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Bioloqy, (1989)) para obter uma solução periplásmica. Por exemplo, o microorganismo pode ser rompido em uma solução hipotônica, por exemplo, água destilada, por um choque osmótico. A recuperação do hGCSF modificado na solução periplásmica pode ser conduzida por um método convencional (Sambrook et al. , supra) , por exemplo, cromatografia de troca de íons, cromatografia de coluna de filtragem em gel ou cromatografia de coluna imune. Por exemplo, hG-CSF pode ser purificado por condução sequencial da cromatografia de coluna CM-Sepharose e cromatografia de coluna Phenyl Sepharose.

A proteína hG-CSF modificada produzida de acordo com a presente invenção não é metionilada no N-término e tem atividade biológica que é igual a, ou maior do que, a de hGCSF de tipo selvagem. Assim, pode ser usado como em várias aplicações.

Os seguintes exemplos se destinam a ainda ilustrar a presente invenção sem limitar seu escopo.

Exemplo 1: Preparação de Gene A Codificando hG-CSF

Um gene cDNA codificando hG-CSF foi preparado por realização de PCR usando como um gabarito hG-CSF (R&D system, USA) . Os iniciadores usados são os descritos na patente US No. 4 .810.643.

Para preparar um gene cDNA codificando hG-CSF maduro, vetor pUC19-G-CSF (Biolabs, USA) foi submetido ao PCR usando os iniciadores de SEQ ID NOS: 3 e 4. O iniciador de SEQ ID NO: 3 foi designado para prover um sítio de restrição Ndel (5¹-CATATG-3') a montante a partir do primeiro códon de aminoácido (treonina) de hG-CSF maduro, e o iniciador de SEQ ID NO: 4, para prover um sítio de restrição BamHI (5'GGATCC-3¹) a jusante a partir do códon de terminação do mesmo .

O gene hG-CSF amplificado foi clivado com Ndel e BamHI para obter um gene codificando hG-CSF maduro. O gene hG-CSF foi inserido na seção Ndel/BamHI de vetor pET14b (Novagen, USA) para obter vetor pT-CSF.

Fig. 2 mostra o procedimento acima para construir o vetor pT-CSF.

Exemplo 2 Construção de um vetor contendo o gene codificando o peptídeo de sinal de enterotoxina II de E. coli e um hG-CSF modificado.

(Etapa 1) Clonagem de gene de peptídeo de sinal de enterotoxina II de E. coli

Para preparar o gene de peptídeo de sinal de enterotoxina II de E. coli, o par de oligonucleotídeos complementares tendo SEQ ID NOS: 5 e 6 foram projetados baseados na sequência de nucleotídeos de peptídeo de sinal de entero12

toxina II de E. coli, e sintetizados usando sintetizador de DNA (Modelo 380B, Applied Biosystem, USA).

Os oligonucleotídeos acima foram designados para prover o sítio de restrição BspHI (sítios complementares aos sítios de restrição Ncol) a montante a partir do códon de iniciação de enterotoxina II de E. coli e um sítio de restrição MluI introduzido por uma mudança silente na outra extremidade .

Ambos oligonucleotídeos foram recombinados a 95 °C para obter fragmentos de terminação cega de DNA tendo uma sequência de nucleotídeos codificando peptídeo de sinal de enterotoxina II de E. coli (gene STII).

O gene STII foi inserido no sítio Smal de vetor pUC19 (Biolabs, USA) para obter vetor pUC19ST.

(Etapa 2) Preparação de um gene codificando STII/hG-CSF

Para preparar um gene codificando STII/hG-CSF, vetor pT-CSF obtido no Exemplo de preparação 1 foi submetido a PCR usando os iniciadores de SEQ ID NOS: 7 e 8. O iniciador de SEQ ID NO: 7 foi designado para substituir códon Ser para o primeiro de hG-CSF, e o iniciador de SEQ ID NO: 8, para prover um sítio de restrição BamHI (5'-GGATCC-3') a jusante do códon de terminação do mesmo.

Os fragmentos de DNA amplificados foram clivados com MluI e BamHI, e então inseridos na seção MluI/BamHI de pUC19ST obtido na etapa 1 para obter vetor pUC19SlSG. Vetor pUC19SlSG assim obtido continha um gene codificando um STII/hG-CSF (designado gene STII-hG-CSF).

Vetor pUC19SlSG foi clivado com BspHI e BamHI para obter um fragmento de DNA (522 bp) . O fragmento de DNA foi inserido na seção NcoI/BamHI de vetor pET14b (Novagen, USA) para obter vetor pT14SlSG.

Fig. 3 mostra o procedimento acima para construir vetor pT14SlSG.

(Etapa 3) Adição de seqüência Shine-Dalgarno de enterotoxina II de E. coli para gene STII-hG-CSF

Vetor pT14SlSG obtido na etapa 2 foi submetido a PCR usando os iniciadores de SEQ ID NOS: 9 e 10. O iniciador de SEQ ID NO: 9 foi designado para prover uma seqüência Shine-Dalgano de enterotoxina II de E. coli (designado sequência STII SD) e um sítio de restrição Xbal, e o iniciador de SEQ ID NO: 10, para prover um sítio de restrição BamHI a jusante a partir do códon de terminação de hG-CSF maduro para obter um fragmento de DNA (STII SD-STII-hCSF) contendo um gene STII SD e STII-hG-CSF.

O fragmento STII SD-STII-hG-CSF foi clivado com Xbal e BamHI, e então inserido na seção Xbal/BamHI de vetor pET14b (Novagen, USA) para obter vetor pT14SSlSG.

Fig. 4 mostra o procedimento acima para construir vetor pT14SSlSG.

E. coli BL21(DE3) (Stratagene, USA) foi transformado com vetor pT14SSlSG para obter um transformante designado E. coli HM 10310.

(Etapa 4) Construção de um vetor contendo um gene codificando a proteína de fusão STIl/hG-CSF

O primeiro códon de gene hG-CSF modificado de plasmídeo pT14SSlSSG obtido na etapa 3 foi substituído por Thr de acordo com um mutagênese dirigida ao sítio (Papworth, C. et al. , Strategies, 9, 3 (1996)), que foi conduzido por PCR de plasmídeo com um iniciador sentido (SEQ ID NO: 12) tendo uma seqüência de nucleotídeos modificada, um iniciador antisentido complementar (SEQ ID NO: 13), e pfu (Stragene, USA) .

O fragmento de DNA amplificado foi recuperado e enzima de restrição Dpnl foi adicionada ao mesmo para remover plasmídeos não convertidos.

E. coli XL-1 blue (Novagen, USA) foi transformado com o plasmídeo modificado. A seqüência de base de DNA recuperada a partir de colônias transformadas foi determinada, e assim foi obtido plasmídeo pT14SSG que continha um gene ten-

do Thr no lugar do primeiro aminoácido de hG-CSF (SEQ ID NO:
11)	•	-5 -4 -3 -2 -1 +1 +2 +3 +4 +5
		Thr Asn Ala TyrAla Thr Pro Leu Gly Pro (SEQ ID	NO :
11)
		-ACA-AAT-GCC-TAC-GCG-ACA-CCC-CTG-GGC-CCT (SEQ	ID
NO:	12)	- TGT-TTA-CGG-ATG-CGC-TGT-GGG-GAC-CCG-GGA (SEQ	ID
NO:	13)

E. coli BL21(DE3) (Stratagene, USA) foi transformado com vetor pT14SSG para obter um transformante designado E. coli HM 10301.

(Etapa 5) Construção de um vetor contendo um gene codificando STIl/hG-CSF modificado

Vetor pT14SSG obtido na etapa 4 foi submetido a PCR usando os iniciadores complementares de SEQ ID NOS: 15 e 16, que foram designados para substituir códon Thr para o 4^ocódon de STII de acordo com o procedimento de etapa 4 para obter um plasmídeo modificado.

E. coli XL-1 blue (Novagen, USA) foi transformado com o plasmídeo modificado. A seqüência de base de DNA recuperado a partir de colônias transformadas foi determinada, e assim foi obtido plasmídeo que continha um gene tendo Thr no lugar do 4° aminoácido de STII (SEQ ID NO: 14).

Met Lys Lys Thr Ile Ala Phe Leu (SEQ ID NO: 14) ' -GG-TGT-TTT-ATG-AAA-AAG-ACA-ATC-GCA-TTT-CTT-C-3 ' (SEQ ID NO: 15) ' -CC-ACA-AAA-TAC-TTT-TTC-TGT-TAG-CGT-AAA-GAA-G-5 ¹ (SEQ ID NO: 16)

O plasmídeo assim foi obtido clivado com Xbal e MluI, e então inserido na seção Xbal/Mlul de vetor pT14SSG obtido na etapa 4 para obter vetor pT14SSG-4T.

(Etapa 6) Construção de um vetor contendo um gene codificando STII/hG-CSF modificado

Vetor pT14SSG-4T obtido na etapa 5 foi submetido a PCR usando os iniciadores complementares de SEQ ID NOS: 18 e 19, que foram designados para substituir o códon Gin pelo 22° códon de STII de acordo com o procedimento de etapa 4 para obter um plasmídeo modificado.

E. coli XL-1 blue (Novagen, USA) foi transformado com o plasmídeo modificado. A base da sequência de DNA recuperado a partir das colônias transformadas foi determinada, e assim foi obtido o plasmídeo pT14SSG-4T22Q que continha um gene tendo Gin no lugar do 22° aminoácido de STII (SEQ ID NO: 17).

ASN Ala Gin Ala Thr Pro Leu Gly (SEQ ID NO: 17)

5'-CA-AAT-GCC-CAA-GCG-ACA-CCC-CTG-GGC-3' (SEQ ID

NO: 18)

3¹-GT-TTA-CGG-GTT-CGC-TGT-GGG-GAC-CCG-5' (SEQ ID

NO: 19) (Etapa 7) Construção de um vetor contendo um STII SD modificado e um gene codificando STII/hG-Csf modificado

Vetor pT14SSG-4T22Q obtido na etapa 6 foi submetido a PCR usando os iniciadores complementares de SEQ ID NOS: 2 0 e 21 de acordo com o procedimento de etapa 4 para obter vetor pT140SSG-4T22Q tendo as seis sequências de nucleotídeos entre a seqüência STII SD (GAGG) e o códon de iniciação de STII (STII SD modificado de SEQ ID NO: 71).

Fig. 5 representa o procedimento acima para construir vetor pT140SSG-4T22Q.

E. coli BL21(DE3) foi transformado com vetor pT140SSG-4T22Q para obter um transformante designado E. coli HM 10302.

Exemplo 3 Construção de um vetor contendo um gene codificando hG-CSF modificado

Para preparar um gene hG-CSF modificado, oligômero SI (SEQ ID NO: 22) tendo códons preferidos E. coli e Ser no

lugar do 17 aminoácido de hG-CSF

NO: 23) foram sintetizados usando sintetizador de DNA (Mode lo 380B, Applied Biosystem, USA) .

Quantidades de 0,5? (50 pmole) de oligonucleotídeos foram reagidas a 95? durante 15 minutos e mantidas até 35? durante 3 horas. A mistura foi precipitada em etanol e submetida a eletroforese de gel (SDS-PAGE) para obter um oligômero (ds) de filamento duplo terminado de modo coesivo.

O plasmídeo pT14SSlSG obtido na etapa 3 de exemplo 2 foi clivado com Apal e BstXI, e então ligado com o oligômero ds terminado adesivo, para obter vetor pT14SSlS17SEG. Vetor pT14SSlS17SEG continha um gene codificando hG-CSF tendo códons preferidos E. coli no término amino e Ser no lugar do I^o e 17° aminoácidos de hG-CSF, respectivamente.

Fig. 6 ilustra o procedimento acima para construir vetor pT140SSlS17SEG.

E. coli BL21(DE3) foi transformado com vetor pT14SSlS17SEG para obter um transformante designado E. coli HM 10311, que foi depositado junto ao Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) em 24 de março de 1999 sob número de acesso KCCM-10154.

Exemplo 4: Construção de vetor contendo um gene codificando peptídeo de sinal OmpA de E. coli e hG-CSF modificado

Um vetor contendo um gene codificando promotor Tac e peptídeo de sinal OmpA (SEQ ID NO: 24) assim como um gene codificando hG-CSF modificado foi preparado como segue:

; .·· .· .............

Met-Lys-Lys-Thr-Ala-Ile-Ala-Ile-Ala-Val-Ala-Leu-

Ala-Gly-Phe-Ala-Thr-Val-Ala-Gin-Ala-	(SEQ	ID	NO :	24)
--GTT-GCG-CAA-GCT-TCT-CGA--	(SEQ	ID	NO :	25)
--CAA-CGC-GTT-CGA-AGA-GCT--	(SEQ	ID	NO :	26)

sítio de restrição HindIII

Vetor pT-CSF obtido no exemplo 1 foi submetido a PCR usando um iniciador (SEQ ID NO: 27) designado para substituir códon Ser para o 1° códon de hG-CSF e outro iniciador (SEQ ID NO: 28), para prover um sítio de restrição EcoRI (5'-GAATTC-3') a jusante dentre a terminação do códon do mesmo para obter um fragmento de DNA contendo um gene codificando hG-CSF modificado.

O fragmento de DNA foi clivado com HindIII e EcoRI, e então inserido na seção HindIII/EcoRI de vetor pFlag.CTS (Eastman, USA) para obter vetor pTOlSG que continha um gene codificando peptídeo de sinal OmpA de E. coli e hGCSF modificado (SEQ ID NO: 29).

Fig. 7 mostra o procedimento acima para construir vetor pTOlSG.

E. coli BL21(DE3) (Stratagene, USA) foi transformado com vetor pTOlSG para obter um transformante designado E. coli HM 10409.

Exemplo 5: Construção de um vetor contendo um gene codificando peptídeo de sinal OmpA de E. coli e hG-CSF modificado

O primeiro códon de gene hG-CSF modificado de plasmídeo pTOlSG obtido no exemplo 4 foi substituído por Thr de acordo com mutagênese dirigido ao sítio (Papworth, C. et

al. , Strategies

9, 3 (1996)),

conduzindo PCR de plasmídeo pTOlSG obtido no exemplo 4 com um iniciador sentido (SEQ ID NO: 30) designado para substituir o códon Thr pelo 1° códon de hG-CSF e um iniciador antisentido complementar (SEQ ID NO: 31).

E. coli XL-1 blue (Novagen, USA) foi transformado com o plasmídeo modificado. A sequência de base de DNA recuperado a partir das colônias transformadas foi determinada, e assim obtido plasmídeo pTOG que continha um gene tendo Thr no lugar do primeiro aminoácido de hG-CSF.

E. coli BL21(DE3) (Stratagene, USA) foi transformado com vetor pTOG para obter um transformante designado E. coli HM 10401.

Exemplo 6: Produção de hG-CSFs modificado (a) Produção de [Serl, Serl7] hG-CSF

Vetor pTOlSG obtido no exemplo 4 foi submetido a

PCR usando um iniciador sentido (SEQ ID NO: 32) designado para substituir códon Ser pelo 17° códon de hG-CSF e um iniciador antisentido complementar (SEQ ID NO: 33) de acordo com o procedimento de etapa 4 de exemplo 2 para obter um plasmídeo modificado.

E. coli XL-1 blue (Novagen, USA) foi transformado com o plasmídeo modificado. A base da sequência de DNA recuperado a partir das colônias transformadas foi determinada e assim foi obtido plasmídeo pT01S17SG que continha um gene tendo Ser no lugar dos I^o e 17° aminoácidos de hG-CSF.

E. coli BL21(DE3) (Stratagene, USA) foi transformado com vetor pT01S17SG para obter um transformante desig20 ; «·«··· · ··· · ” nado E. coli HM 10410, que foi depositado junto ao Korean

Culture Center of Microorganisms (KCCM) em 24 de março de 1999 sob número de acesso KCCM-10151.

(b) Produção de [Serl7] hG-CSF

Vetor pTOG obtido no exemplo 5 foi submetido a PCR usando um iniciador sentido (SEQ ID NO: 32) designado para substituir códon Ser pelo 17° códon de hG-CSF e um iniciador anti sentido complementar (SEQ ID NO: 33) de acordo com o procedimento de etapa 4 de exemplo 2 para obter um plasmídeo modificado.

E. coli XL-1 blue (Novagen, USA) foi transformado com o plasmídeo modificado. A base da seqüência de DNA recuperado a partir das colônias transformadas foi determinada, e assim foi obtido plasmídeo pTO17SG que continha um gene tendo Ser no lugar do 17° aminoácido de hG-CSF.

E. coli BL21(DE3) (Stratagene, USA) foi transformado com vetor pTO17SG para obter um transformante designado E. coli HM 10411, que foi depositado junto ao Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) em 24 de março de 1999 sob número de acesso KCCM-10152.

(c) Produção de [Thrl7] hG-CSF

Vetor pTOG obtido no exemplo 5 foi submetido a PCR usando um iniciador sentido (SEQ ID NO: 34) designado para substituir códon Thr pelo 17° códon de hG-CSF e um iniciador antisentido complementar (SEQ ID NO: 35) de acordo com o procedimento de etapa 4 de exemplo 2 para obter um plasmídeo modificado.

E. coli XL-1 blue (Novagen, USA) foi transformado com o plasmídeo modificado. As seqüências de base de DNA recuperado a partir das colônias transformadas foram determinadas, e assim foi obtido plasmídeo pT017TG que continha um gene tendo Thr no lugar do 17° aminoácido de hG-CSF.

E. coli BL21(DE3) (Stratagene, USA) foi transformado com vetor pTO17TG para obter um transformante designado E. coli HM 10413.

(d) Produção de [Alal7] hG-CSF

Vetor pTOG obtido no exemplo 5 foi submetido a PCR usando um iniciador sentido (SEQ ID NO: 36) designado para substituir códon Ala pelo 17° códon de hG-CSF e um iniciador antisentido complementar (SEQ ID NO: 3 7) de acordo com o procedimento de etapa 4 de exemplo 2 para obter um plasmídeo modificado.

E. coli XL-1 blue (Novagen, USA) foi transformado com o plasmídeo modificado. A seqüência de base de DNA recuperado a partir das colônias transformadas foi determinada, e assim foi obtido plasmídeo pTO17AG que continha um gene tendo Ala no lugar do 17° aminoácido de hG-CSF.

E. coli BL21(DE3) (Stratagene, USA) foi transformado com vetor pTO17AG para obter um transformante designado E. coli HM 10414.

(e) Produção de [Glyl7] hG-CSF

Vetor pTOG obtido no exemplo 5 foi submetido a PCR usando um iniciador sentido (SEQ ID NO: 38) designado para substituir códon Gly pelo 17° códon de hG-CSF e um iniciador antisentido complementar (SEQ ID NO: 39) de acordo com o

procedimento de etapa 4 de exemplo 2 para obter um plasmideo modificado.

E. coli XL-1 blue (Novagen, USA) foi transformado com o plasmideo modificado. A sequência de base de DNA recuperado a partir das colônias transformadas foi determinada, e assim foi obtido plasmideo pTO17GG que continha um gene tendo Gly no lugar do 17° aminoácido de hG-CSF.

E. coli BL21(DE3) (Stratagene, USA) foi transformado com vetor pTO17GG para obter um transformante designado E. coli HM 10415.

(f) Produção de [Aspl7] hG-CSF

Vetor pTOG obtido no exemplo 5 foi submetido a PCR usando um iniciador sentido (SEQ ID NO: 40) designado para substituir códon Asp para o 17° códon de hG-CSF e um iniciador antisentido complementar (SEQ ID NO: 41) de acordo com o procedimento de etapa 4 de exemplo 2 para obter um plasmideo modificado.

E. coli XL-1 blue (Novagen, USA) foi transformado com o plasmideo modificado. A sequência de base de DNA recuperado a partir de colônias transformadas foi determinada, e assim foi obtido plasmideo pTO17APG que continha um gene tendo Asp no lugar do 17° aminoácido de hG-CSF.

E. coli BL21(DE3) (Stratagene, USA) foi transformado com vetor pTO17APG para obter um transformante designado E. coli HM 10416.

Exemplo 7: Construção de um vetor contendo um gene codificando peptídeo de sinal Gene III de E. coli e hG-CSF modificado.

(a) Construção de um vetor contendo um gene codificando promotor arabinose e peptídeo sinal Gene III de E. coli

Um vetor contendo um gene codificando promotor arabinose peptídeo de sinal Gene III de E. coli (SEQ ID NO:

42) assim como um gene codificando hG-CSG modificado preparado como a seguir:

Met-Lys-Lys-Leu-Leu-Phe-Ala-Ile-Pro-Leu-Val-VaiPro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser- (SEQ ID NO: 42)

-TAT-AGC-CAT-AGC-ACC-ATG-GAG- (SEQ ID NO:

43)

-ATA-TCG-GTA-TCG-TGG-TAC-CTC- (SEQ ID NO:

44) sítio de restrição Ncol

Plasmídeo pBAD? glIIA (Invitrogen, USA) contendo um gene codificando promotor arabinose e peptídeo de sinal Gene III foi clivado com Ncol, e DNAs de filamento único foram removidos com polimerase de DNA Klenow para obter um DNA de filamento duplo, terminado cego, que foi então clivado com BglII para obter um fragmento de vetor tendo tanto extremidade cega como extremidade coesiva.

Vetor pT-CSF obtido no exemplo 1 foi submetido a PCR usando um iniciador sentido (SEQ ID NO: 46) tendo uma sequência de nucleotídeos codificando para o 2^o e para o 9^oaminoácidos de hG-CSF (SEQ ID NO: 45) e um iniciador antisentido complementar (SEQ ID NO: 47) de acordo com o procedimento de etapa 4 de exemplo 2 para obter um fragmento de DNA terminado cego contendo o gene hG-CSF e um sítio de res····

trição BamHI no terminal carbóxi. O fragmento então foi clivado com BamHI para obter fragmento de gene hG-CSF tendo tanto uma extremidade cega como uma extremidade coesiva.

Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu (SEQ ID NO: 45)

5'-C-CCC-CTG-GGC-CCT-GCC-AGC-TCC-CTG-3¹ (SEQ IDNO: 46)

3^r-G-GGG-GAC-CCG-GGA-CGG-TCG-AGG-GAC-5¹ (SEQ IDNO: 47)

O fragmento de gene hG-CSF como inserido no vetor obtido acima para obter vetor pBADG que continha um gene codificando peptídeo de sinal Gene III de E. coli e hG-CSF (SEQ ID NO: 48).

Fig. 8 descreve o procedimento acima para construir vetor pBADG.

E. coli BL21(DE3) (Stratagene, USA) foi transformado com vetor pBADG para obter um transformante designado E. coli HM 10501.

(b) Produção de [Met2, Val3] hG-CSF

Plasmídeo pBAD? glIIA (Invitrogen, USA) foi clivado com Ncol e BglII para obter um fragmento tendo duas extremidades coesivas.

Vetor pT-CSF obtido no exemplo 1 foi submetido a PCR usando um iniciador sentido (SEQ ID NO: 50) tendo uma seqüência de nucleotídeos codificando para o I^o e para o 9^oaminoácidos de [Met2, Val3] hG-CSF (SEQ ID NO: 49) e um iniciador antisentido complementar (SEQ ID NO: 51) de acordo com o procedimento de etapa 4 de exemplo 2 para obter um fragmento de DNA terminado obtuso contendo gene hG-CSF e um sítio de restrição BamHI no terminal carbóxi, que foi então

clivado com Neol e BamHI para obter um fragmento de gene hGCSF tendo duas extremidades coesivas.

Thr Met Vai Gly Pro Ala Ser Ser Leu (SEQ ID NO:

49)

5'-TAC-GCG-TCC-ATG-GTG-GGC-CCT-GCC-AGC-TCC-CTG-3 ' (SEQ ID

NO: 50) ' -ATG-CGC-AGG-TAC-CAC-CCG-GGA-CGG-TCG-AGG-GAC-5 ¹ (SEQ ID

NO: 51) sítio de restrição Ncol

O fragmento de gene hG-CSF foi inserido no vetor obtido acima para obter vetor pBAD2M2VG contendo um gene codificando peptídeo de sinal Gene III de E. coli, e Met e Vai no lugar dos 2^o e 3^o aminoácidos de hG-CSF (SEQ ID NO: 52) , respectivamente.

Fig. 9 mostra o procedimento acima para construir vetor pBAD2M3VG.

E. coli BL21 (DE3) (Stratagene, USA) foi transformado com vetor pBAD2M3VG para obter um transformante designado E. coli HM 10510, que foi depositado junto ao Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) em 24 de março de 1999 sob número de acesso de KCCM-10153.

(c) Produção de [Serl7] hG-CSF

Vetor pBADG obtido em (a) foi submetido a PCR usando um iniciador sentido (SEQ ID NO: 32) designado para substituir códon Ser pelo 17° códon de hG-CSF e um iniciador antisentido complementar (SEQ ID NO: 33) de acordo com o procedimento de etapa 4 de exemplo 2 para obter um plasmídeo modificado.

E. coli XL-1 blue (Novagen, USA) foi transformado com o plasmídeo modificado. A seqüência de base de DNA recuperado a partir de colônias transformadas foi determinada, e assim foi obtido plasmídeo pBAD17SG que continha um gene tendo Ser no lugar do 17° aminoácido de hG-CSF.

E. coli BL21(DE3) (Stratagene, USA) foi transformado com vetor pBAD17SG para obter um transformante designado E. coli HM 10511.

(d) Produção de [Met2, Val3, Serl7] hG-CSF

Vetor pBAD2M3VG obtido em (b) foi submetido a PCR usando um iniciador sentido (SEQ ID NO: 32) designado para substituir códon Ser pelo 17° códon de hG-CSF e um iniciador antisentido complementar (SEQ ID NO: 33) de acordo com o procedimento de etapa 4 de exemplo 2 para obter um plasmídeo modificado.

E. coli XL-1 blue (Novagen, USA) foi transformado com o plasmídeo modificado. A sequência de base de DNA recuperado a partir das colônias transformadas foi determinada, e assim foi obtido plasmídeo pBAD2M3V17SG que continha um gene tendo Met, Vai e Ser no lugar dos 2^o, 3° e 17° aminoácidos de hG-CSF, respectivamente.

E. coli BL21(DE3) (Stratagene, USA) foi transformado com vetor pBAD2M3V17SG para obter um transformante designado E. coli HM 10512.

Exemplo 8: Produção de hG-CSF

Transformantes preparados nos exemplos 2 a 7 foram cultivados em meio LB (1% de bacto-triptona, 0,5% de bactoextrato de levedura e 1% de NaCl) e então incubados na presença β··¹

de um indutor de expressão (IPTG) durante 3 horas ou cultivado na ausência de IPTG em mais de 15 horas. Cada das culturas foi centrifugada a 6.000 rpm durante 20 minutos para células bacterianas precipitadas, e o precipitado foi colo5 cado em suspensão em um 1/10 volume de solução isotônica (20% de sacarose, 10 mM de uma solução tampão de Tris-Cl contendo 1 mM de EDTA, pH 7,0). A suspensão foi deixada permanecer a temperatura ambiente durante 30 minutos, e então centrifugada a 7.000 rpm durante 10 minutos para coletar as 10 células bacterianas. As células foram recolocadas em suspensão em D.W. para 4? e centrifugadas a 7.0 00 rpm durante 10 minutos para obter um sobrenadante como uma solução periplásmica. O nível hG-CSF na solução periplásmica foi testado de acordo com o método ELISA (Kato, K. et al. , Immunol, 116,

1554 (1976)) usando um anticorpo contra hG-CSF (Alan, USA), gue foi calculado como a quantidade de hG-CSF produzido por 1 1 de cultura. Os resultados são mostrados na tabela I.

TABELA 1

Transforman	Exemplo	Vetor de Expres-	Nível hG-CSF em
Te		são	periplasma (?/?)
HM 10301	2 (Etapa 4)	pT14SSG	65
HM 10302	2 (Etapa 7)	pT140SSG-4T22Q	277
HM 10310	2 (Etapa 3)	pT14SSlSG	92
HM 10311	3	pT14SSlS17SEG	1.512
HM 10401	5	pTOG	85
HM 10409	4	pTOlSG	105
HM 10410	6 (a)	pT01S17SG	1.477 ^/b·· ’’
HM 10411	6 (b)	pTO17SG	1.550 .

HM 10413	6 (c)	pTO17TG	1.373 7'; ¹
HM 10414	6 (d)	pTO17AG	1.486
HM 10415	6 (e)	pTO17GG	r h 1.480
HM 10416	6 (f)	pTO17APG	67
HM 10501	7 (a)	pBADG	54
HM 10510	7 (b)	pBAD2M3VG	69
HM 10511	7 (c)	pBAD17SG	937
HM 10512	7 (d)	pBAD2M3V17SG	983 lAct

Exemplo 9: Purificação de hG-CSF

HM 10411 de E. coli transformante preparado no exemplo 6 (b) foi cultivado em meio LB e a cultura foi centrifugada durante 6.000 rpm durante 20 minutos para coletar as células. A solução periplásmica foi preparada a partir de células por repetição do procedimento de exemplo 8.

A solução periplásmica foi ajustada a pH 5,0 a

5,5, absorvida em CM-Sepharose (Pharmacia Inc., Sweden) coluna pré-equilibrada a pH 5,3, e então, a coluna foi lavada 10 com 25 mM de NaCl. hG-CSF foi eluído por adição sequencial para as soluções de tampão de coluna contendo 50 mM, 100 mM e 200 mM de NaCl, e frações contendo hG-CSF foram coletadas e combinadas.

As frações combinadas foram submetidas a cromato15 grafia de coluna Phenyl Sepharose (Pharmacia Inc., Sweden) para obter [Serl7] hG-CSF tendo uma pureza de 99%.

Além disso, o procedimento acima foi repetido usando cada HM 10311, HM 10409, HM 10411, HM 10413, HM 10414, HM 10415, HM 10510 e HM 10512 de E. coli transformantes pre29

parados nos exemplos 3, 4, 6 (b) , 6 (c) , 6 (d) , 6 (e) , 7 (b) e 7 (d), respectivamente.

Cada dentre a fração hG-CSF purificada foi submetida a eletroforese gel poliacrilamida dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) para determinar a pureza e concentração aproximadas de hG-CSF, e então submetidas a ELISA para determinar a concentração hG-CSF exata na solução periplásmica. Met-hG-CSF (Kirin amgen) foi usado como um controle.

Fig. 10a reproduz o resultado de SDS-PAGE, em que linha 1 mostra Met-G-CSF, linha 2, a solução periplásmica of HM 10411 de E. coli transformante, e linha 3, o [Serl7] hGCSF purificado. Como pode ser visto da Fig. 10b, o peso molecular de [Serl7] hG-CSF é o mesmo que de hG-CSF tipo selvagem e a solução periplásmica de HM 10411 de E. coli transformante contém um nível alto de [Serl7] hG-CSF.

Ainda, as seqüências de aminoácido N-terminal de hG-CSFs foram determinadas e as seqüências de nucleotídeos codificando do I^o para 32° aminoácidos produzidos usando os transformantes HM 10311, HM 10409, HM 10411, HM 10413, HM 10414, HM 10415, HM 10510 e HM 10512 mostrados na SEQ ID NOS: 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 e 70, respectivamente. O resultado mostra que o hG-CSF modificado produzido de acordo com a presente invenção não é metionilado no N-término.

Um filtro de nitrocelulose (Bio-Rad Lab,, USA) foi umedecido com uma solução de tampão para blotting (170 mM de glicina, 25 mM Tris? HC1 (pH 8) , 20% de metanol) e as proteínas separadas em gel foram submetidas a western blotted sobre um filtro de nitrocelulose (Bio-Rad Lab., USA.) durante

horas. O filtro foi mantido em 1% de caseína durante 1 hora e foi lavado três vezes com PBS contendo 0,05% de Tween

20. O filtro foi colocado em uma solução de anticorpo antiG-CSF de cabra (R&D System, AB-214-NA, USA) diluída com PBS e reagido a uma temperatura ambiente durante 2 horas. Após reação, o filtro foi lavado 3 vezes com uma solução de PBST para remover anticorpo não reagido. IgG anti-cabra de coelho conjugado a peroxidase de raiz forte (Bio-Rad Lab., USA) diluído com PBS foi adicionado ao mesmo e reagido a uma temperatura ambiente durante 2 horas. 0 filtro foi lavado com PBST, e um kit de solução de substância peroxidase (Bio-Rad Lab., USA) foi adicionado ao mesmo para revelar uma reação colorida. Os resultados dos acima western blottings são mostrados na fig. 10b, em que linha 1 representa um controle positivo, Met-G-CSF, e linha 2, purificado [Serl7] hG-CSF. Como pode ser visto da fig. 10b, o peso molecular de [Serl7] hG-CSF é igual ao de hG-CSF tipo selvagem.

Exemplo 10: Atividade Celular de hG-CSF e hG-CSF Modificado

Linhagem de célula HL-60 (ATCC CCL-240 derivada de medula óssea de um paciente com leucemia promielocítica / uma mulher de 3 6 anos de idade) foi cultivada em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro bovino fetal e ajustado a 2,2 X 10⁵ células/ ? , seguido por adição ao mesmo de DMSO (sulfóxido de dimetila, tipo cultura/ SIGMA) a uma concentração de 1,25% (v/v). 90? de solução resultante foram adicionados a uma placa de 96 reservatórios (Corning/ placa de 96 reservatórios de baixa evaporação) em uma quantidade de 2 x 10⁴ cé31

lulas/ reservatório e incubada a 37 ? sob 5% de C02 durante 48 horas.

Cada um dentre [Alal7] hG-CSF, [Gly 17] hG-CSF, [Serl7] hG-CSF, e [Thr 17] hG-CSF modificado foi diluído em meio RPMI 1640 a uma concentração de 500 ng/? e então diluído em série 10 vezes por 2-vezes com meio RPMI 1640.

A solução resultante foi adicionada a reservatórios a 10 ml por reservatório e incubada a 37? durante 48 horas. Como um controle positivo, um hG-CSF comercialmente disponível (Jeil Pharmaceutical.\0.

O nível de linhagem de célula aumentado foi determinado usando um CellTiter96™ comercialmente disponível (Cat # G4100, Promega) baseado em densidade óptica medida a 670 nm.

Como pode ser visto da Fig. 11, as atividades celulares dos hG-CSFs modificados são as mesmas, ou maiores do que as de um controle positivo, hG-CSF tipo selvagem.

Apesar das formas de realização da presente invenção terem sido descritas e ilustradas, é óbvio que várias mudanças e modificações podem ser feitas sem sair do espírito da presente invenção que deve ser limitada somente pelo escopo das reivindicações anexas.

TRATADO DE BUDAPESTE NO RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA OS PROPÓSITOS DO PROCESSO DE PATENTE

FORMULÁRIO INTERNACIONAL

To. Hanmi Pharm.Co., Ltd. #893-5 Hajeo-ri Paltan-myun Hwasung-Kun

Kyonggi-do,

KOREA

RECIBO NO CASO DE ÜM ORIGINAL emitido em conformidade com a Regra 7.1 pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL identificada no fundo desta página

I. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO
Referência de identificação dada pelo DEPOSITANTE: HM10311	NÚMERO DE ACESSO DADO PELA AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL KCCM-10154
II. DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA
0 microorganismo identificado sob I acima foi acompanhado por: ΓΊ uma descrição científica [2] uma designação taxonômica proposta (Marque com uma cruz onde aplicável)
III. RECIBO E ACEITAÇÃO
Esta Autoridade Depositária Internacional aceita o microorganismo identificado sob I acima, o qual foi recebido por este em 24 de Março de 1999 (data do depósito original)¹
IV. AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL
Nome: Korean Culture Center of Microorganisms Endereço: Department of Food Engineering College of Eng.Yonsei University Sodaemun-gu. Seoul 120-749 Korea	Assinatura(s) da(s) pessoa(s) que possui o poder de representar a Autoridade Depositária Internacional ou do(s) funcionário(s) autorizado(s): Data: 6 de Abril de 1999.

Onde a Regra 6.4 (d) se aplica, tal data é a data na qual a condição da autoridade depositária internacional foi adquirida: onde um depósito feito fora do Tratado de

Budapeste após a aquisição da condição da autoridade depositária internacional é convertida em um depósito sob o Tratado de Budapeste, tal data é dada na qual o microorganismo foi recebido pela autoridade depositária internacional.

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RECIBO NO CASO DE UM ORIGINAL emitido em conformidade com a Regra 7.1 pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL identificada no fundo desta página

I. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO
Referência de identificação dada pelo DEPOSITANTE: HM10410	NÚMERO DE ACESSO DADO PELA AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL KCCM-10151
II. DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA
0 microorganismo identificado sob I acima foi acompanhado por: □ uma descrição científica Q uma designação taxonômica proposta (Marque com uma cruz onde aplicável)
III. RECIBO E ACEITAÇÃO
Esta Autoridade Depositária Internacional aceita o microorganismo identificado sob I acima, o qual foi recebido por este em 24 de Março de 1999 (data do depósito original) ¹
IV. AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL
Nome: Korean Culture Center of Microorganisms Endereço: Department of Food Engineering College of Eng.Yonsei University Sodaemun-gu. Seoul 120-749 Korea	Assinatura(s) da(s) pessoa(s) que possui o poder de representar a Autoridade Depositária Internacional ou do(s) funcionário(s) autorizado(s): Data: 6 de Abril de 1999.

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RECIBO NO CASO DE UM ORIGINAL emitido em conformidade ccm a Regra 7.1 pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL identificada no fundo desta página

I. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO
Referência de identificação dada pelo DEPOSITANTE: HM10411	NÚMERO DE ACESSO DADO PELA AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL KCCM-10152
II. DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA
0 microorganismo identificado sob I acima foi acompanhado por: 1 1 uma descrição científica ΓΊ uma designação taxonômlca proposta (Marque com uma cruz onde aplicável)
III. RECIBO E ACEITAÇÃO
Esta Autoridade Depositária Internacional aceita o microorganismo identificado sob I acima, o qual foi recebido por este em 24 de Março de 1999 (data do depósito original)¹
IV. AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL
Nome: Korean Culture Center of Microorganisms Endereço: Department of Food Engineering College of Eng.Yonsei Universlty Sodaemun-gu. Seoul 120-749 Korea	Assinatura(s) da(s) pessoa(s) que possui o poder de representar a Autoridade Depositária Internacional ou do(s) funcionário(s) autorizado(s): Data: 6 de Abril de 1999.

¹ Onde a Regra 6.4 (d) se aplica, tal data é a data na qual a condição da autoridade depositária internacional foi adquirida: onde um depósito feito fora do Tratado de

FORMULÁRIO INTERNACIONAL

To. Hanmi Pharm.Co., Ltd. #893-5 Hajeo-ri Paltan-myun Hwasung-Kun

Kyonggi-do,

KOREA

I. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO
Referência de identificação dada pelo DEPOSITANTE: HM10510	NÚMERO DE ACESSO DADO PELA AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL KCCM-10153
II. DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA
0 microorganismo identificado sob I acima foi acompanhado por: □ uma descrição científica ΓΊ uma designação taxonômica proposta (Marque com uma cruz onde aplicável)
III. RECIBO E ACEITAÇÃO
Esta Autoridade Depositária Internacional aceita o microorganismo identificado sob I acima, o qual foi recebido por este em 24 de Março de 1999 (data do depósito original)¹
IV. AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL
Nome: Korean Culture Center of Microorganisms Endereço: Department of Food Engineering College of Eng.Yonsei University Sodaemun-gu. Seoul 120-749 Korea	Assinatura(s) da(s) pessoa(s) que possui o poder de representar a Autoridade Depositária Internacional ou do(s) funcionário(s) autorizado(s): Data: 6 de Abril de 1999.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110>

Pharm.Co., Ltd.

<120>	Fator estimulante de modificado e processo	colônia de guanulócito humano para produzir o mesmo
<130>	PCA00729/HMY
<160>	71
<170>	KOPATIN 1,0
<210> <211> <212> <213>	1 522 DNA Homo sapiens
<220> <221> <222>	CDS (1)...(522)
<400>	1

aca Thr 1

ccc Pro

ctg Leu

ggc Gly

cct Pro 5

gcc Ala

age Ser

tcc Ser

ctg Leu

ccc Pro 10

cag Gin

age Ser

ttc Phe

ctg Leu

ctc Leu 15

aag Lys

48

tgc

tta

gag

caa

gtg

agg

aag

ate

cag

ggc

gat

ggc

gea

gcg

ctc

cag

96

Cys

Leu

Glu

Gin

Vai

Arg

Lys

Ile

Gin

Gly

Asp

Gly

Ala

Leu

Gin

20

25

30

gag

aag

ctg

tgt

gcc

acc

tac

aag

ctg

tgc

cac

ccc

gag

ctg

gtg

144

Glu

Lys

Leu

Cys

Ala

Thr

Tyr

Lys

Leu

Cys

His

Pro

Glu

Leu

Vai

35

40

45

ctg

ctc

gga

cac

tet

ctg

ggc

ate

ccc

tgg

gct

ccc

ctg

age

tcc

tgc

192

Leu

Gly

His

Ser

Leu

Gly

Ile

Pro

Trp

Ala

Pro

Leu

Ser

Cys

50

55

60

ccc

age

cag

gcc

ctg

cag

ctg

gea

ggc

tgc

ttg

age

caa

ctc

cat

age

240

Pro

Ser

Gin

Ala

Leu

Gin

Leu

Ala

Gly

Cys

Leu

Ser

Gin

Leu

His

Ser

65

70

75

80

ggc

ctt

ttc

ctc

tac

cag

ggg

ctc

ctg

cag

gcc

ctg

gaa

ggg

ata

tcc

288

Gly

Leu

Phe

Leu

Tyr

Gin

Gly

Leu

Gin

Ala

Leu

Glu

Gly

Ile

Ser

85

90

95

ccc

gag

ttg

ggt

ccc

acc

ttg

gac

aça

ctg

cag

ctg

gac

gtc

gcc

gac

336

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Thr

Leu

Asp

Thr

Leu

Gin

Leu

Asp

Vai

Ala

Asp

100

105

110

ttt gcc

acc

ate

tgg

cag

atg

gaa

ctg

gga

atg

gcc

cct

384

Phe Ala

Thr

Iel

Trp

Gin

Met

Glu

Leu

Gly

Met

Ala

Pro

115

120

125

gcc ctg

cag

ccc

acc

cag

ggt

gcc

atg

ccg

gcc

ttc

gcc

tet

gct

ttc

432

Ala Leu

Gin

Pro

Thr

Gin

Gly

Ala

Met

Pro

Ala

Phe

Ala

Ser

Ala

Phe

130

135

140

cag cgc

cgg

gca

gga

ggg

gtc

ctg

gtt

gct

age

cat

ctg

cag

age

ttc

480

Gin Arg

Arg

Ala

Gly

Vai

Leu

Val

Ala

Ser

His

Leu

Gin

Ser

Phe

145

150

155

160

ctg gag

gtg

tcg

tac

cgc

gtt

cta

cgc

cac

ctt

gcg

cag

ccc

522

Leu Glu

Vai

Ser

Tyr

Arg

Vai

Leu

Arg

His

Leu

Ala

Gin

Pro

165

170

<210>

2

<211>

174

<212>

PRT

<213>

Homo sapiens

<400>

2

Thr (Pro

(Leu

Gly

Pro

Ala

Ser

Leu

Pro

Gin

Ser

Phe

Leu

Lys

1

5

10

15

^Cys Leu

Glu

Gin

Vai

Arg

Lys

Ile

Gin

Gly

Asp

Gly

Ala

Leu

Gin

..A

20

25

30

Glu Lys

Leu

Cys

Ala

Thr

Tyr

Lys

Leu

Cys

His

Pro

Glu

Leu

Val

35

40

45

Leu Leu

Gly

His

Ser

Leu

Gly

Ile

Pro

Trp

Ala

Pro

Leu

Ser

Cys

50

55

60

Pro Ser

Gin

Ala

Leu

Gin

Leu

Ala

Gly

Cys

Leu

Ser

Gin

Leu

His

Ser

65

70

75

80

Gly Leu

Phe

Leu

Tyr

Gin

Gly

Leu

Gin

Ala

Leu

Glu

Gly

Ile

Ser

85

90

95

Pro Glu

Leu

Gly

Pro

Thr

Leu

Asp

Thr

Leu

Gin

Leu

Asp

Val

Ala

Asp

100

105

110

Phe Ala

Thr

Ile

Trp

Gin

Met

Glu

Leu

Gly

Met

Ala

Pro

115

120

125

Ala Leu

Gin

Pro

Thr

Gin

Gly

Ala

Met

Pro

Ala

Phe

Ala

Ser

Ala

Phe

130

135

140

Gin Arg

Arg

Ala

Gly

Vai

Leu

Val

Ala

Ser

His

Leu

Gin

Ser

Phe

145

150

155

160

Leu Glu Vai Ser Tyr Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 • · ·· · · ·

<210> <211> <212> <213>

3 32 DNA Seqüência Artificial

<220> <223>	Primer oligonucleotídeo para o N-terminal de hG-CSF
<400>	3
cgccgccata	tgacacccct gggccctgcc ag 32
<210> <211> <212> <213>	4 36 DNA Seqüência Artificial

<220> <223>	Primer oligonucleotídeo para o C-terminal de hG-CSF
<400>	4
accgaattcg	gatcctcagg gctgcgcaag gtggcg 36
<210> <211> <212> <213>	5 72 DNA Seqüência Artificial

<220> <223>	Oligonucleotídeo para preparar o peptídeo de sinal E.Coli enterotoxina II.
<400>	5
tcatgaaaaa atgcctacgc	gaatatcgca tttcttcttg catctatgtt cgttttttct attgctacaa 60 gt 72
<210> <211> <212> <213>	6 72 DNA Seqüência Artificial

<220> <223>	Oligonucleotídeo para preparar o peptídeo de sinal E.Coli enterotoxina II.
<400>	6

acgcgtaggc atttgtagca atagaaaaaa cgaacataga tgcaagaaga aatgcgatat tctttttcat ga

<210> <211> <212> <213>

7 39 DNA Seqüência Artificial

<220> <223>	Primer oligonucleotídeo codificando para o N-terminal de [Serl]hG-CSF
<400>	7
acaaatgcct	acgcgtctcc cctgggccct gccagctcc 39
<210> <211> <212> <213>	8 42 DNA Seqüência Artificial

<220> <223>	Primer oligonucleotídeo codificando para o C-terminal de [Serl]hG-CSF
<400>	8
accgaattcg	gatcctcagg gctgcgcaag gtggcgtaga ac 42
<210> <211> <212> <213>	9 65 DNA Seqüência Artificial

<220> <223>	Primer oligonucleotídeo codificando para seqüência de E.coli enterotoxina II Shine-Dalgarno.
<400>	9
cggtttccct ctatg	ctagaggttg aggtgtttta tgaaaaagaa tatcgcattt cttcttgcat 60 65
<210> <211> <212> <213>	10 45 DNA Seqüência Artificial

<220> <223>	Oligonucleotídeo contendo sítio de restrição BamHI.
<400>	10

accgaattcg gatcctcagg gctgcgcaag gtggcgtaga acgcg

<210> <211> <212> <213> <220>	11 10 PRT Seqüência Artificial
<223>	Últimos cinco aminoácidos do peptídeo de sinal E. coli enterotoxina II mais o 1° ao 5^o aminoácidos de hG-CSF.
<400>	11

Thr Asn Ala Tyr Ala Thr Pro Leu Gly Pro
1	5	10
<210>	12
<211>	30
<212>	DNA
<213>	Seqüência Artificial
<220>
<223>	Oligonucleotídeo para	preparar [Thrl]hG-CSF.
<400>	12
acaaatgcct	acgcgacacc cctgggccct	30
<210>	13
<211>	30
<212>	DNA
<213>	Seqüência Artificial
<220>
<223>	Antisenso de SEQ ID NO: 12
<400>	13
agggcccagg	ggtgtcgcgt aggcatttgt	30
<210>	14
<211>	8
<212>	PRT
<213>	Seqüência Artificial
<220>
<223>	Seqüência N-terminal	de peptídeo de sinal E.coli
	enterotoxina II possuindo treonina como o 4^o ami-
	noácido.

<400>	15
ggtgttttat	gaaaaagaca atcgcatttc ttc
<210>	16
<211>	33
<212>	DNA
<213>	Seqüência Artificial
<220>
<223>	Antisenso de SEQ ID NO
<400>	16
gaagaaatgc	gattgtcttt ttcataaaac acc
<210>	17
<211>	8
<212>	PRT
<213>	Seqüência Artificial
<220>
<223>	Seqüência C-terminal do terotoxina II possuindo ácido.
<400>	17
Asn Ala Gin	Ala Thr Pro Leu Gly
1	5
<210>	18
<211>	26
<212>	DNA
<213>	Seqüência Artificial

<220> <223>	Oligonucleotídeo para substituir o 22° aminoácido do peptídeo de sinal E.coli enterotoxina II com glutamina.
<400>	18

caaatgccca agcgacaccc ctgggc 26

<210> <211> <212> <213> <220> <223>	19 26 DNA Seqüência Artificial Antisenso de SEQ ID NO: 18
<400>	19
gcccaggggt	gtcgcttggg catttg 26
<210> <211> <212> <213>	20 24 DNA Seqüência Artificial

<220> <223>	Oligonucleotídeo para modificar a seqüência E.coli enterotoxina II Shine-Dalgarno.
<400> tctagaggtt	20 gaggtgtttt atga 24
<210> <211> <212> <213>	21 24 DNA Seqüência Artificial

<220> <223>	Antisenso de SEQ ID NO: 20
<400>	21
tcataaaaca	cctcaacctc taga 24
<210> <211> <212> <213>	22 66 DNA Seqüência Artificial

<220>

·· <223>

Oligômero SI possuindo a seqüência de nucleotídeo preferida de E.coli codificando para os 6° ao aminoácidos de [Serl7]hG-CSF.

26°

<400>	22
cagcctcttc tcttccacaa tctttccttc ttaagtctct tgaacaagtt agaaagatcc
aaggcg
<210>	23
<211>	66
<212>	DNA
<213>	Seqüência Artificial
<220>
<223>	Antisenso de SEQ ID NO: 22 (oligômero AS1)
<400>	23
ccgggtcgga gaagagaagg tgttagaaag gaagaattca gagaacttgt tcaatctttc
taggtt
<210>	24
<211>	21
<212>	PRT
<213>	Escherichia coli
<220>
<221>	SINAL
<222>	(1)..·(21)
<223>	Peptídeo de sinal E.coli OmpA
<400>	24
Met Lys	Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Vai Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1	5 10 15
Thr Vai	Aal Gin Ala
	20
<210>	25
<211>	18
<212>	DNA
<213>	Seqüência Artificial
<220>
<223>	Oligonucleotídeo contendo sítio de reconhecimento

Hind III.

<400>

··

M · · · · • · * · gttgcgcaag cttctcga

<210>	26
<211>	18
<212>	DNA
<213>	Seqüência Artificial
<220> <223>	Antisenso de SEQ ID NO: 25
<400>	26
tcgagaagct	tgcgcaac	18
<210>	27
<211>	39
<212>	DNA
<213>	Seqüência Artificial
<220> <223>	Oligonucleotideo para o N-terminal	de [Serl]hG-CSF
<400>	27
gttgcgcaag	cttctcccct gggccctgcc agctccctg	39
<210>	28
<211>	39
<212>	DNA
<213>	Seqüência Artificial
<220> <223>	Oligonucleotideo contendo sítio de EcoRI	restrição de
<400>	28
accgaattct	cagggctgcg caaggtggcg tagaacgcg	39
<210>	29
<211>	13
<212>	PRT
<213>	Seqüência Artificial

<220>

<223>

Peptídeo de sinal E.coli OmpA mais noácidos de [Serl]hG-CSF.

o I^o ao 5 ° ami<400>

Gly Phe Ala Thr Vai Ala Gin Ala Ser Pro Leu Gly Pro 15 10

<210> <211> <212> <213>

30 30 DNA Seqüência Artificial

<220> <223>	Oligonucleotídeo para preparar [Thrl]hG-CSF.
<400>	30
accgttgcgc	aagctacacc cctgggccct 30
<210> <211> <212> <213>	31 30 DNA Seqüência Artificial

<220> <223>	Antisenso de SEQ ID NO: 30
<400>	31
agggcccagg	ggtgtagctt gcgcaacggt 30

<210> <211> <212> <213>

32 33 DNA Seqüência Artificial

<220> <223>	Oligonucleotídeo para preparar [Serl7]hG-CSF.
<400>	32

agcttcctgc tcaagtcttt agagcaagtg agg

<210> <211> <212> <213>

33 33 DNA Seqüência Artificial

<220> <223>	Antisenso de SEQ ID NO: 32
<400>	33

cctcacttgc tctaaagact tgagcaggaa gct <210> 34

<211>	33
<212>	DNA
<213>	Seqüência Artificial
<220>
<223>	Oligonucleotídeo para preparar	[Thrl7]hG-CSF
<400>	34
agcttcctgc	tcaagacctt agagcaagtg agg		33
<210>	35
<211>	33
<212>	DNA
<213>	Seqüência Artificial
<220>
<223>	Antisenso de SEQ ID NO: 34
<400>	35
cctcacttgc	tctaaggtct tgagcaggaa gct		33
<210>	36
<211>	33
<212>	DNA
<213>	Seqüência Artificial
<220>
<223>	Oligonucleotídeo para preparar	[Alal7]hG-CSF.
<400>	36
agcttcctgc	tcaaggcctt agagcaagtg agg		33
<210>	37
<211>	33
<212>	DNA
<213>	Seqüência Artificial
<220>
<223>	Antisenso de SEQ ID NO: 36
<400>	37
cctcacttgc	tctaaggcct tgagcaggaa gct		33
<210>	38
<211>	33
<212>	DNA
<213>	Seqüência Artificial

<220> <223>	Oligonucleotídeo para preparar	[Glyl7]hG-CSF.
<400>	38
agcttcctgc	tcaagggctt agagcaagtg agg		33
<210>	39
<211>	33
<212>	DNA
<213>	Seqüência Artificial
<220> <223>	Antisenso de SEQ ID NO: 38
<400>	39
cctcacttgc	tctaagccct tgagcaggaa gct		33
<210>	40
<211>	33
<212>	DNA
<213>	Seqüência Artificial
<220> <223>	Oligonucleotídeo para preparar	[Aspl7]hG-CSF.
<400>	40
agcttcctgc	tcaaggactt agagcaagtg agg		33
<210>	41
<211>	33
<212>	DNA
<213>	Seqüência Artificial
<220> <223>	Antisenso de SEQ ID NO: 40
<400>	41
cctcacttgc	tctaagtcct tgagcaggaa gct		33
<210>	42
<211>	18
<212>	PRT
<213>	Escherichia coli
<220> <221>	SINAL

<222> (1)...(18) <223> Peptídeo de sinal E.coli Gene III;

<400> 42

Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Vai Vai Pro Phe Tyr Ser

1	5	10	15
His Ser
<210>	43
<211>	21
<212>	DNA
<213>	Sequência	Artificial
<220>
<223>	Oligonucleotideo contendo sítio de	restrição Nco I
<400>	43
tatagccata	gcaccatgga g		21
<210>	44
<211>	21
<212>	DNA
<213>	Sequência	Artificial
<220>
<223>	Antisenso	de SEQ ID NO: 43
<400>	44
ctccatggtg	ctatggctat a		21

<210> <211> <212> <213>

45 8 PRT Sequência Artificial

<220> <223>	Os 2^o ao 10° aminoácido de hG-CSF.
<400>	45

Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu

1	5
<210> <211> <212>	46 25 DNA

<213>

Seqüência Artificial

<220> <223>	Primer oligonucleotídeo codificando para os 2^o ao 10° aminoácidos de hG-CSF mais uma citosina adicional na sua extremidade 5'.
<400>	46
ccccctgggc	cctgccagct ccctg 25
<210> <211> <212> <213>	47 25 DNA Seqüência Artificial

<220> <223>	Antisenso de SEQ ID NO: 46
<400>	47
cagggagctg	gcagggccca ggggg 25
<210> <211> <212> <213>	48 10 PRT Seqüência Artificial

<220> <223>	Peptídeo de sinal de E.coli Gene III mais os 1° ao 5^o aminoácidos de hG-CSF.
<400>	48

Phe Tyr Ser His

Ser Thr Pro Leu Gly Pro

<210> <211> <212> <213>

49 9 PRT Seqüência Artificial

<220> <223>	Os 1° ao 9^o aminoácidos de [Met2, Val3]hG-CSF.
<400>	49

Thr Met

Pro Ala Ser Ser Leu

Vai Gly

<♦«

<210>	50
<211>	33
<212>	DNA
<213>	Seqüência Artificial
<220> <223>	Oligonucleotídeo para preparar [Met2,	Val3]hG-CSF.
<400>	50
tacgcgtcca	tggtgggccc tgccagctcc ctg	33
<210>	51
<211>	33
<212>	DNA
<213>	Seqüência Artificial
<220> <223>	Antisenso de SEQ ID NO: 50
<400>	51
cagggagctg	gcagggccca ccatggacgc gta	33
<2 10 >	52
<211>	10
<212>	PRT
<213>	Seqüência Artificial
<220> <223>	Peptídeo de sinal E.coli Gene III mais aminoácidos de [Met2, Val3]hG-CSF.	os 1° ao 5 °
<400>	52
Phe Tyr Ser	His Ser Thr Met Vai Gly Pro
1	5 10
<210>	53
<211>	23
<212>	PRT
<213>	Escherichia coli
<220> <221>	SINAL
<222>	(1) . . · (23)
<223>	Peptídeo de sinal E.coli enterotoxina sistente	II termorre-

<400>	53
Met Lys 1	Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Vai Phe Ser 5 10 15
<210> <211> <212> <213>	54 23 PRT Seqüência Artificial

<220> <223>	Peptídeo de sinal E.Coli enterotoxina II termorresistente modificado
<400>	54
Met Lys 1	Lys Thr Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Vai Phe Ser 5 10 15
Ile Ala	Thr Asn Ala Gin Ala 20
<210> <211> <212> <213>	55 96 DNA Seqüência Artificial

<220> <223>

Seqüência de nucleotídeo codificando para os l°ao 32° aminoácidos de [Serl, Serl7]hG-CSF.

<220>

<221>

CDS

<222>

(D

. . .

(96)

<400>

55

tct ccc

ctg

ggc

cct

gcc

age

tcc

ctg

ccc

cag

age

ttc

ctg

ctc

aag

Ser Pro

Leu

Gly

Pro

Ala

Ser

Leu

Pro

Gin

Ser

Phe

Leu

Lys

1

5

10

15

tct tta

gag

caa

gtg

agg

aag

ate

cag

ggc

gat

ggc

gea

gcg

ctc

cag

Ser Leu

Glu

Gin

Vai

Arg

Lys

Ile

Gin

Gly

Asp

Gly

Ala

Leu

Gin

20

25

30

<210> <211> <212> <213>	56 32 PRT Seqüência Artificial
<400>	56

···· « ·*

Ser Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu Lys 15 1015

Ser Leu Glu Gin Vai Arg Lys Ile Gin Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gin 20 2530

<210>	57
<211>	96
<212>	DNA
<213>	Seqüência	Artificial
<220>
<223>	Seqüência	de nucleotídeo codificando para os 1° ao

32° aminoácidos de [Serl]hG-CSF

<220>

<221>

CDS

<222>

(1)

..(96)

<400>

57

tct ccc

ctg

ggc

cct

gcc

age

tcc

ctg

ccc

cag

age

ttc

ctg

ctc

aag

48

Ser Pro

Leu

Gly

Pro

Ala

Ser

Leu

Pro

Gin

Ser

Phe

Leu

Lys

1

5

10

15

tgc tta

gag

caa

gtg

agg

aag

ate

cag

ggc

gat

ggc

gea

gcg

ctc

cag

96

Cys Leu

Glu

Gin

Val

Arg

Lys

Ile

Gin

Gly

Asp

Gly

Ala

Leu

Gin

20

25

30

<210>	58
<211>	32
<212>	PRT
<213>	Seqüência Artificial

<400>58

Ser Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu Lys

1015

Cys Leu Gin Gin Vai Arg Lys Ile Gin Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gin

	20	25	30
<210>	59
<211>	96
<212>	DNA
<213>	Seqüência	Artificial

<220>

<223>

Seqüência de nucleotídeo codificando para os 1° 32° aminoácidos de [Serl7]hG-CSF.

ao

<220>
<221>	CDS
<222>	(1) . . (96)
<400>	59

aca ccc	ctg	ggc cct gcc	age tcc ctg ccc	cag	age	ttc	ctg	ctc	aag	48
Thr Pro	Leu	Gly Pro Ala	Ser Ser Leu Pro	Gin	Ser	Phe	Leu	Leu	Lys
1		5	10					15
tct tta	gag	caa gtg agg	aag ate cag ggc	gat	ggc	gea	gcg	ctc	cag	96
Ser Leu	Glu	Gin Vai Arg	Lys Ile Gin Gly	Asp	Gly	Ala	Ala	Leu	Gin
		20	25				30
<210>		60
<211>		32
<212>		PRT
<213>		Seqüência	Artificial
<400>		60
Thr Pro	Leu	Gly Pro Ala	Ser Ser Leu Pro	Gin	Ser	Phe	Leu	Leu	Lys
1		5	10					15
Ser Leu	Glu	Gin Vai Arg	Lys Ile Gin Gly	Asp	Gly	Ala	Ala	Leu	Gin
		20	25				30
<210>		61
<211>		96
<212>		DNA
<213>		Seqüência	Artificial
<220>
<223>		Seqüência	de nucleotídeo codificando	para os	1° ac
		32° aminoácidos de [Thrl7]hG-CSF.
<220>
<221>		CDS
<222>		(D · . (96)
<400>		61
aca ccc	ctg	ggc cct gcc	age tcc ctg ccc	cag	age	ttc	ctg	ctc	aag	48
Thr Pro	Leu	Gly Pro Ala	Ser Ser Leu Pro	Gin	Ser	Phe	Leu	Leu	Lys
1		5	10					15
acc tta	gag	caa gtg agg	aag ate cag ggc	gat	ggc	gea	gcg	ctc	cag	96
Thr Leu	Glu	Gin Vai Arg	Lys Ile Gin Gly	Asp	Gly	Ala	Ala	Leu	Gin

25 30 <210> 62 <211> 32

			• •	··· ·· ·· ·· ···· ·
<212>	PRT
<213>	Seqüência	Artificial
<400>	62
Thr Pro	Leu Gly Pro Ala	Ser Ser Leu	Pro Gln Ser Phe	Leu Leu Lys
1	5		10	15

Thr Leu Glu Gln Vai Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln

	20	25 30
<210>	63
<211>	96
<212>	DNA
<213>	Seqüência	Artificial
<220>
<223>	Seqüência	de nucleotídeo para os 1° ao 32° amino-
	ácidos de	[Alal7]hG-CSF.
<220>
<221>	CDS
<222>	(D · . (96)
<400>	63

aca ccc	ctg	ggc cct	gcc	age tcc ctg	ccc	cag	age	ttc	ctg	ctc
Thr Pro	Leu	Gly Pro	Ala	Ser Ser Leu	Pro	Gln	Ser	Phe	Leu	Leu
1		5			10					15
gcc tta	gag	caa gtg	agg	aag ate cag	ggc	gat	ggc	gea	gcg	ctc
Ala Leu	Glu	Gln Vai	Arg	Lys Ile Gln	Gly	Asp	Gly	Ala	Ala	Leu
		20		25					30
<210>		64
<211>		32
<212>		PRT
<213>		Seqüência	Artificial
<400>		64
Thr Pro	Leu	Gly Pro	Ala	Ser Ser Leu	Pro	Gln	Ser	Phe	Leu	Leu
1		5			10					15
Ala Leu	Glu	Gln Vai	Arg	Lys Ile Gln Gly	Asp	Gly	Ala	Ala	Leu
		20		25					30
<210>		65
<211>		96
<212>		DNA
<213>		Seqüência	Artificial

<220> <223>	Seqüência ácidos de	de nucleotídeo para [Glyl7]hG-CSF.	OS	1 °	ao 32°	amino-
<220>
<221>	CDS
<222>	(D . . (96)
<400>	65
aca ccc ctg	ggc cct gcc	age tcc ctg ccc cag age	ttc	ctg	ctc aag	48
Thr Pro Leu	Gly Pro Ala	Ser Ser Leu Pro Gin Ser	Phe	Leu	Leu Lys
1	5	10			15
ggc tta gag	caa gtg agg	aag ate cag ggc gat ggc	gea	gcg	ctc cag	96
Gly Leu Glu	Gin Vai Arg	Lys Ile Gin Gly Asp Gly	Ala	Ala	Leu Gin
	20	25		30
<210>	66
<211>	32
<212>	PRT
<213>	Seqüência	Artificial
<400>	66
Thr Pro Leu	Gly Pro Ala	Ser Ser Leu Pro Gin Ser	Phe	Leu	Leu Lys
1	5	10			15
Gly Leu Glu	Gin Vai Arg	Lys Ile Gin Gly Asp Gly	Ala	Ala	Leu Gin
	20	25		30
<210>	67
<211>	96
<212>	DNA
<213>	Seqüência	Artificial
<220>
<223>	Seqüência	de nucleotídeo para	OS	1 °	ao 32“amino-
	ácidos de	[Met2, Val3]hG-CSF.
<220>
<221>	CDS
<222>	(1) . . (96)
<400>	67
aca atg gtc	ggc cct gcc	age tcc ctg ccc cag age	ttc	ctg	ctc aag	48
Thr Met Vai	Gly Pro Ala	Ser Ser Leu Pro Gin Ser	Phe	Leu	Leu Lys

10 15

	• ·· · « • * · • ·· ·	• · ·	• · • •
tgc tta	9ag	caa gtg agg	aag ate cag ggc	gat	ggc	• gea	·· gcg	9 9 9 ctc	• · · cag
Cys Leu	Glu	Gin Vai Arg	Lys Ile Gin Gly	Asp	Gly	Ala	Ala	Leu	Gin
		20	25				30
<210>		68
<211>		32
<212>		PRT
<213>		Seqüência	Artificial
<400>		68
Thr Met	Vai	Gly Pro Ala	Ser Ser Leu Pro	Gin	Ser	Phe	Leu	Leu	Lys
1		5	10					15
Cys Leu	Glu	Gin Vai Arg	Lys Ile Gin Gly	Asp	Gly	Ala	Ala	Leu	Gin
		20	25				30
<210>		69
<211>		69
<212>		DNA
<213>		Seqüência	Artificial
<220>
<223>		Seqüência	de nucleotídeo codificando	para os
		32° aminoácidos de [Met2, Val3	, Serl7]hG	-CSF
<220> <221>		CDS
<222>		(1) . . (96)
<400>		69
aca atg	gtc	ggc cct gcc	age tcc ctg ccc	cag	age	ttc	ctg	ctc	aag
Thr Met	Vai	Gly Pro Ala	Ser Ser Leu Pro	Gin	Ser	Phe	Leu	Leu	Lys
1		5	10					15
tct tta	gag	caa gtg agg	aag ate cag ggc	gat	ggc	gea	gcg	ctc	cag
Ser Leu	Glu	Gin Vai Arg	Lys Ile Gin Gly	Asp	Gly	Ala	Ala	Leu	Gin
		20	25				30
<210>		70
<211>		32
<212>		PRT
<213>		Seqüência	Artificial
<400>		70
Thr Met	Vai	Gly Pro Ala	Ser Ser Leu Pro	Gin	Ser	Phe	Leu	Leu	Lys
1		5	10					15
Ser Leu	Glu	Gin Vai Arg	Lys Ile Gin Gly	Asp	Gly	Ala	Ala	Leu	Gin
		20	25				30

I^o ao

<210>	71
<211>	10
<212>	DNA
<213>	Seqüência	Artificial
<220> <223>	Seqüência	de Shine-Dalgarno modificada
<400>	71

gaggtgtttt

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Fator estimulante de colônia de granulócitos humano modificado (hG-CSF) não contendo cadeia de açúcar e metionina N-terminal, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de aminoácido do hG-CSF modificado é a mesma que do hG-CSF tipo selvagem (SEQ ID NO:
2), exceto que (a) o I^o aminoácido é Ser e o 17° aminoácido é X;

(b) o 2^o aminoácido é Met, o
3^o aminoácido é Vai, e o 17° aminoácido é X, ou (c) o 17° aminoácido é X, em que X é um aminoácido que é não carregado em pH

neutro e é diferende do aminoácido presente no hG-SCF selvagem. 2. hG-CSF modificado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que X é Ser, Thr, Ala ou Gly. 3. hG-CSF modificado, de acordo com a

reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que X é Ser.
4. Vetor de expressão de E. coli, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o DNA que codifica o hG-CSF modificado, conforme definido na reivindicação 1, e um polinucleotídeo que codifica um peptídeo de sinal anexado ao final 5' do DNA que codifica o hG-CSF modificado.
5. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo sinal é peptídeo de sinal de enterotoxina II termoresistente de E. coli ou peptídeo de sinal de enterotoxina II termoresistente de E. coli modificado.
6. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo de sinal de enterotoxina

II termoresistente de E. coli tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53.
7.

Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação

5, CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo de sinal de enterotoxina

II termoresistente de

E. coli modificado tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54.
8. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que ainda compreende uma sequência Shine-Dalgano de enterotoxina II de E. coli modificado tendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 71.
9. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo de sinal é peptídeo de sinal beta lactamase de E. coli ou peptídeo de sinal beta lactamase de E. coli modificado.
10. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo de sinal beta lactamase de E. coli tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.
11. E. coli transformado, CARACTERIZADO por ser com o vetor de expressão de E. coli, conforme definido na reivindicação 4.

12. E. coli, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que é E. coli BL21(DE3)/pT14SSlS17SEG(HM 10311, KCCM-10154), E. coli BL21(DE3)/pT01S17SG(HM 10410, KCCM-10151), E. coli

BL21(DE3)/pT017SG(HM 10411, KCCM-10152), E. coli

BL21(DE3)/pTO17TG(HM 10413), E. coli BL21(DE3)/pTO17AG(HM

10414), E. coli BL21(DE3)/pTO17GG(HM 10415), E. coli

BL21(DE3)/pBAD17SG(HM 10511) ou E. coli

5 BL21(DE3)/pBAD2M3V17SG(HM 10512).
13. Processo para produzir um hG-CSF modificado em

E. coli, CARACTERIZADO pelo fato de compreender cultivar o

E. coli, conforme definido na reivindicação 12 para produzir e secretar o hG-CSF modificado em periplasma.