DE69533443T2

DE69533443T2 - Die herstellung von biologisch aktiven, rekombinanten und neurotrophem protein

Info

Publication number: DE69533443T2
Application number: DE69533443T
Authority: DE
Inventors: Jack Lile; Tadahiko Kohno; Duane Bonam; Mary S. Rosendahl
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1994-05-09
Filing date: 1995-05-02
Publication date: 2005-01-20
Anticipated expiration: 2015-05-03
Also published as: US5606031A; ATE275152T1; EP0772627A1; CA2189659C; JP3673278B2; AU2432095A; AU697891B2; WO1995030686A1; DE69533443D1; EP0772627B1; CA2189659A1; JPH10502804A; DK0772627T3; EP0772627A4; PT772627E; ES2230549T3

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Herstellung rekombinanter Wachstumsfaktoren aus der NGF/BDNF Familie. Im genaueren beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven rekombinaten NGF, BDNF, NT3 und NT4.
Hintergrund der Erfindung
Neurotrophe Faktoren sind natürliche Proteine, die im Nervensystem oder in nichtnervenartigen Geweben gefunden werden, die durch das Nervensystem angeregt werden, und deren Funktion die Förderung des Überlebens und der Aufrechterhaltung der phänotypischen Differenzierung von Nerven und/oder glialen Zellen darstellt (Varon & Bunge (1978) Ann. Rev. Neurosc. 1:327; Thoenen & Edgar (1985) Science 229:238). In vivo Studien haben gezeigt, dass eine Vielzahl endogener und exogener neurotropher Faktoren einen tropischen Effekt auf neuronale Zellen nach ischämischen, hypoxischen oder anderen durch Erkrankungen verursachten Schäden ausüben. Beispiele spezifischer neurotropher Faktoren schließen den basischen fibroblasten Wachstumsfaktor (bFGF, „basic fibroblast growth factor"), den sauren fibroblasten Wachstumsfaktor (aFGF, „acidic fibroblast growth factor"), den Nervenwachstumsfaktor (NGF, „nerve growth factor"), den ziliären neurotrophen Faktor (CNTF, „ciliaric neurotrophic factor"), den „brain derived neurotrophic factor" (BDNF), Neurotrophin 3 (NT3), Neurotrophin 4 (NT4), und die insulinartigen Wachstumsfaktoren I und II (IGF-I, IGF-II).
Von einigen neurotrophen Faktoren, wie beispielsweise bFGF und CNTF, wurde angenommen, dass sie breite trophische Effekte besitzen und das Überleben vieler verschiedener Arten neuronaler Zellen fördern oder eine Funktion zur Aufrechterhaltung dieser Zellen beisteuern. Andere neurotrophe Faktoren besitzen einen kleineren, mehr spezifischeren trophischen Effekt und fördern das Überleben einer geringeren Anzahl an Zellen. Beispielsweise fördert im peripheren Nervensystem NGF das neuronale Überleben und die axonale Ausdehnung bestimmter spezifischer neuronaler Zelltypen wie beispielsweise sensorische und sympatethische Neuronen (Ebendal et al. (1984) Cellular and Molecular Biology of Neuronal Development, Kapitel 15, Hrsg. Black, I.B.). NGF untersützt gleichwohl im zentralen Nervensystem (ZNS) ebenfalls das Überleben von cholinergischen Neuronen im basalen Vorhirnkomplex (Whittemore et al. (1987) Brain Res. Rev. 12:439-464).
BDNF, ein basisches Protein mit einem Molekulargewicht von 12.300, unterstützt einige sensorische Neuronen , welche nicht auf NGF antworten (Barde et al. (1982) EMBO J. 1:549-553 und Hofer & Barde (1988) Nature 331:261-262). Neurotrophin 3 (NT3) unterstützt das Überleben von (dorsal root ganglion neurons) und proprioceptifen Neuronen in den trigeminalen mesencephalen Kernen. CNTF, ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 23.000, unterstützt Neuronen des ziliären Ganglions in parasympathetischen Nervensystemen, sympathetische Neuronen, Neuronen des dorsalen Hauptganglions im sensorischen Nervensystem und Motorneuronen im ZNS (Kandel et al. (1991) Principles of Neural Science, 3. Ausgabe, Elsevier Science Publishing Co., Inc., NY).
Einige neurotrophe Faktoren begründen eine Familie an neurotrophen Fakoren, die durch etwa 50% Homologie der Aminosäuren charakterisiert wird. Eine solche Familie ist die NGF/BDNF Familie, welche BDNF, NGF, NT3 und NT4 mit einschließt (Hohn et al., WO 91/03569; U.S. Patentanmeldung Seriennummer 07/680,681). Beiderseits NGF und BDNF werden offensichtlich als größere Vorläuferform synthetisiert, die anschließend durch proteolytische Spaltung prozessiert werden, um die reifen neurotrophen Faktoren zu erzeugen (Edwards et al., (1986), Nature 319:784; Leibrock et al., (1989) Nature 319:149). In den Aminosäuresequenzen zwischen rei fen NGFs und reifem BDNF gibt es eine signifikate Ähnlichkeit, einschließlich der relativen Position aller sechs Cysteinaminosäurereste, welche bei allen untersuchten Spezies in reifen NGF und BDNF identisch sind (Leibrock et al., (1989) supra). Siehe 2, welche die Ähnlichkeiten der humanen Form von BDNF (SEQ ID NO:3) und NGF (SEQ ID NO:4) vergleicht und hervorhebt. Dies liegt nahe, dass die dreidimensionalen Strukturen der reifen Proteine, wie sie durch die Lokalisation der Disulfidbindungen bestimmt wurden, ähnlich sind. Die reifen NGFs und die BDNF Proteine besitzen ebenfalls einen gemeinsamen isoelektrischen Punkt (pl).
NGF ist mindestens für cholinergische Neuronen im basalen Vorhirn ein neurotropher Faktor (Hefti und Will (1987) J. Neural Transm. [Suppl] (Österreich) 24:309). Die funktionelle Inaktivierung und Degenerierung der Antwort cholinergischer Neuronen vom basalen Vorhirn auf NGF im Zusammenhang mit der Alzheimerschen Erkrankung erscheint die naheliegende Ursache für die kognitiven Defizite wie auch von Gedächtnisdefiziten, welche mit dieser Erkrankung verbunden sind (Hefti und Will (1987) supra). Von NGF wurde gezeigt, dass es der Degeneration vorbeugt und die Funktion der cholinergischen Neuronen des basalen Vorhirns in Tiermodellen für die Alzheimersche Erkrankung wiederherstellt und auf dieser Basis wurde es als eine Behandlung zur Vorbeugung der Degeneration und zur Wiederherstellung der Funktion dieser Neuronen bei Alzheimerscher Erkrankung vorgeschlagen (Williams et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9231; Hefti (1986) J. Neuroscience 6:2155; Kromer (1987) Science 235:214; Fischer et al., (1987) Nature 329:65.
BDNF ist ein neurotropher Faktor für sensorische Neuronen im peripheren Nervensystem (Barde (1989) Neuron 2:1525). Auf dieser Grundlage kann sich BDNF als nützlich für die Behandlung des mit der Beschädigung von sensorischen Nervenzellen einhergehenden Wahrnehmungsverlustes erweisen, der in verschiedenen peripheren Neuropathien auftritt (Schaumberg et al., (1983) in Disorders of Peripheral Nerves, F. A. Davis Co., Philadelphia, PA).
Damit ein bestimmter neurotropher Faktor bei der Behandlung von Nervenschäden verwendbar ist, muss dieser in einer ausreichenden Menge verfügbar sein, um für die pharmazeutische Behandlung eingesetzt zu werden. Da neurotrophe Faktoren Proteine sind, ist es weiterhin erwünschenswert, humanen Patienten lediglich die humane Form des Proteins zu verabreichen, um eine immunologische Antwort auf ein Fremdprotein zu vermeiden. Da neurotrophe Faktoren üblicherweise in Geweben in verschwindend geringen Mengen vorkommen (z.B. Hofer & Barde (1988) Nature 331:261; Lin et al., (1989) Science 246:1023) und da humane Gewebe für die Extraktion nicht leicht erhältlich sind, käme es ungelegen, pharmazeutische Mengen von humanen neurotrophen Faktoren direkt aus humanen Geweben zu gewinnen. Als Alternative ist es wünschenswert, das isolierte humane Gen für den neurotrophen Faktor in einem rekombinanten Expressionssystem zu verwenden, um potentiell unbegrenzte Mengen des humanen Proteins zu erzeugen.
Reife und biologisch aktive neurotrophe Faktoren können erzeugt werden, wenn Gene von humanen oder tierischen neurotrophen Faktoren in eukaryotischen Zellexpressionssystemen exprimiert werden (z.B. Edwards et al., (1988) Molec. Cell. Biol. 8:2456). In solchen Systemen wird zunächst das Vorläufermolekül des neurotrophen Faktors in voller Länge synthetisiert und anschließend proteolytisch prozessiert, um den reifen neurotrophen Faktor zu erzeugen, welcher korrekt dreidimensional gefaltet und vollständig biologisch aktiv ist. Eukryotische Zellexpressionssysteme erzeugen gleichwohl relativ geringe Mengen an Protein pro Grammen und Zellen und sind verhältnismäßig teuer, um in der Herstellung verwendet zu werden.
Im Gegensatz dazu ergeben Expressionssysteme, die prokaryotische Zellen wie beispielsweise Bakterien verwenden, im allgemeinen relativ große Mengen an exprimiertem Protein pro Gramm an Zellen und sind verhältnismäßig günstig, um in der Herstellung verwendet zu werden. Gleichwohl ist die Gewinnung von biologisch aktivem und mittels Bakterien exprimiertem neurotrophen Faktor eine wesentliche Hürde aufesem Gebiet. Bakterien sind nicht Lage, in korrekter Form Vorläuferproteine, wie beispielsweise das Vorläuferprotein für NGF, durch Erzeugung geeigneter proteolytischer Spaltungen zu prozessieren, um das richtige kleinere reife Protein zu erzeugen. Um den reifen neurotrophen Faktor in Bakterien zu erzeugen ist es daher notwendig, lediglich den Teil der DNA-Sequenz zu exprimieren, der das reife Protein kodiert, und nicht diejenige DNA-Sequenz für die größere Vorläuferform. Als dies in E. coli durchgeführt wurde, wurden relativ große Mengen des reifen humanen NGF Proteins erzeugt (siehe z.B. Iwai et al., (1986) Chem. Parm. Bull. 34:4724; Dicou et al., (1989) J. Neurosci. Res. 22:13; Europäische Patentanmeldung Nr. 121,338). Unglücklicherweise zeigt das bakteriell recombinierte Protein keine augenscheinliche biologische Aktivität.
Die bakterielle Erzeugung rekombinanter Proteine aus Säugetieren führt häufig zu biologisch inaktiven Proteinen durch die Bildung von sogenannten Einschlußkörpern. Dies erfordert die Abtrennung der Einschlußkörper von anderen zellkomponenten und die Auflösung der Einschlußkörper, um das Proteins zu entfalten (Spalding (1991) Biotechnology 9:229). Der wahrscheinliche Grund für diesen Mangel an biologischer Aktivität liegt darin, dass das reife Protein nicht in der Lage ist, spontan die korrekte dreidimensionale Struktur einzunehmen und das korrekte intramolekulare Disulfidbindungsmuster zu bilden, das für die volle biologische Aktivität erforderlich ist. Die Prozessierung schließt die Abtrennung und Auflösung der Einschlußkörper mit ein, das Entfalten des Proteins, und anschließend die Rückfaltung des Proteins in die korrekte biologische aktive Tertiärstruktur. Gleichwohl kann das Protein während der Rückfaltung erneut zu aggregieren, was die Ausbeute an aktiven Proteinen reduziert und den Aufreinigungsprozess weiter kompliziert (Spalding (1991) supra).
Protokolle für die Entfaltung und Rückfaltung von NGF wurden beschrieben (z.B. Europäische Patentanmeldung Nr. 336,324; U:S: Patent Nr. 4,511,503 und 4,620;948). Gleichwohl besitzen diese Protokolle schwerwiegende Nachteile. Viele Protokolle machen Gebrach davon, dass NGF einem hohen pH ausgesetzt wird, um inkorrekt gebildete Disulfidbrücken aufzubrechen, gefolgt von einer Behandlung bei einem niedrigeren pH, um die Bildung korrekter intramolekularer Disulfidbindungen zu ermöglichen. NGF einem hohen pH auszusetzen, führt bekannterweise zur extensiven Modifikation des Proteins, einschließlich der Eliminierung von Aminosäureseitenketten bei Glutamin und Asparagin (von denen im reifen humanen NGF 7 vor handen sind) und zur extensiven chemischen Veränderung von Asparagin-Glyzin, Asparagin-Serin, und Asparagin-Threonin Paaren (von denen 2 im reifen humanen NGF vorkommen). Zusätzlich zu diesen chemischen Modifikationen scheint das Rückfaltungsverfahren lediglich ungefähr 1/10 der biologischen Aktivität von NGF zurückzugewinnen. Obwohl es eine Anzahl an Protokollen für die Rückfaltung und die Denaturierung von Proteinen gibt, die keine harten Bedingungen verwenden, konnte kein solches Verfahren erfolgreich auf NGF angewendet werden. Für einen generellen Überblick über Rückfaltungsverfahren, siehe Kohno (1990) Methods Enzymol. 185:187.
Um die Wiedergewinnung biologisch aktiver Proteine zu verbessern, die in einem bakteriellen Expressionssystem erzeugt wurden, wurden verschiedene Verfahren verwendet. Ein Verfahren zur Spaltung inkorrekt gebildeter Disulfidbrücken ist die Verwendung von S-sulfonierten Proteinen, die mittels Sulfitolyse erhalten wurden (U.S. Patent Nr. 4,421,685; Gonzales und Damodaran (1990) J. Agric. Food Chem. 38:149; Europäische Patentanmeldung Nr. 361,830).
Die Zugabe von Sulfit zu einem Protein spaltet anfänglich die Disulfidbrücken, die dieser Lösung ausgesetzt werden, was in der Bildung eines S-SO₃-Derivats und einer freien SH Gruppe für jede gespaltene Disulfidbindung führt. In der Anwesenheit eines oxidierenden Agenz werden die freien SH Gruppen zurück zum Disulfid oxidiert, welches erneut durch das im System vorhandene Sulfit gespalten wird. Der Reaktionszyklus wiederholt sich solange selbst, bis alle Disulfidbindungen und die Sulfhydrylgruppen in Proteinen zu cys-SO₃- umgewandelt wurden. Im allgemeinen ermöglicht es dieses Verfahren die meisten Proteine lösen zu können (Europäische Patentanmeldung Nr. 361,830).
Ein anderes Verfahren zur Verbesserung der Wiedergewinnung von biologisch aktiven Proteinen aus bakteriellen Expressionssystemen schließt die Verwendung von Polyethylenglykol (PEG) in der Rückfaltungsmischung mit ein. Es wurde nahegelegt, dass der Zusatz von PEG der Proteinaggregierung vorbeugt, was in der Assoziation von hydrophoben Intermediaten beim Rückfaltungspfad führt. Cleland et al., (1990) Biotechnology 8:1274 und (1992) J. Biol. Chem. 267:13327, berichtet über die verbesserte Rückgewinnung biologisch aktiver boviner carbonischer Anhydrase B (CAB, bovine carbonic Anhydrase B) unter Zusatz von PEG während des Rückfaltungsverfahrens. Die Konzentration von PEG, die erforderlich ist um einen Anstieg in der Rückfaltung des aktiven Proteins zu erreichen, betrug das Doppelte der gesamten Proteinkonzentration und erforderte PEG mit einem Molekulargewicht von 1000-8000 (Cleland et al., (1992) supra).
Ein bakterielles Expressionssystem zur Erzeugung von NGF wird im kanadischen Patent Nr. 1,220,736 und U.S. Patent Nr. 5,169,762 offenbart. Gleichwohl werden keine Verfahren zur Rückfaltung des Exprimierten Proteins gezeigt. Ein Verfahren zur Herstellung großer Mengen an biologisch aktivem rekombinantem NGF, das für die pharmazeutische Verwendung geeignet ist, wird in der U.S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/071,912 beschrieben, eingereicht am 06. Juli 1993 durch Collins et al., mit dem Titel: Production of Biologically Active, Rekombinant Members of the NGF/BDNF Family 9of Neurotrophic Proteins. Das Protein wird in einem denaturiertem Agenz wie beispielsweise Guanidiniumhydrochlorid oder Harnstoff sowie einer ausreichenden Menge an reduzierendem Agenz wie beispielsweise ß-Mercaptoethanol, Dithiothreitol oder Cystein ausgesetzt, um das Protein zu denaturieren, nicht-kovalente Interaktionen zu unterbrechen und Disulfidbrücken zu reduzieren. Die freien Thiole, die im reduziertem Protein vorhanden sind, werden anschließend oxidiert und man lässt das Protein die korrekten Disulfidbrücken ausbilden. Die Rückfaltungsmischung beinhaltet bevorzugt bis zu 25% PEG 200 oder 300.
Während das in der U.S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/087,912 beschriebene Verfahren verbesserte Ausbeuten an biologisch aktivem NGF erreicht, besteht weiterhin der Bedarf für ein effizienteres Mittel zur Rückfaltung von NGF. Die bakterielle Herstellung rekombinanter Proteine führt zu biologisch inaktiven Proteinen, die als Einschlußkörper innerhalb der Bakterienzelle gefunden werden. Es gibt daher einen Bedarf für ein verbessertes Verfahren zur Prozessierung sowie zur Abtrennung der Einschlußkörper von anderen Zeltbestandteilen und zur Auflösung der Einschlußkörper, um das Protein zu entfalten. Weiterhin gibt es einen Bedarf an ver besserten Verfahren zum Aufbrechen inkorrekt gebildeter Disulfidbindungen und zur Rückfaltung des Proteins in die korrekte Tertiärstruktur, was für eine maximale Ausbeute an vollständig aktiven Proteinen erforderlich ist, während gleichzeitig die chemische Modifikation des Proteins geringer wird.
Die vorliegende Offenbarung zeigt ein ausgedehntes und verbessertes Verfahren zur Herstellung bakteriell exprimierter biologisch aktiver Mitglieder der NGF/BDNF Familie des neurotrophen Faktors, einschließlich der ersten Verwendung des Verfahrens der Sulfitolyse, um einen neurotrophen Faktor aufzulösen und chemisch zu modifizieren.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines reifen Proteins aus der NGF/BDNF Familie in einer biologisch voll aktiven Form, die für die therapeutische Verwendung geeignet ist, umfassend:

a) Exprimieren eines für den neurotrophen Faktor kodierenden Gens in einem bakteriellen Expressionssystems, wobei das Protein des genannten neurotrophen Faktors erzeugt wird;
b) Lösen des genannten neurotrophen Faktors in Harnstoff;
c) Sulfonylieren des genannten neurotrophen Faktors;
d) Isolieren und Aufreinigen des sulfonylierten neurotrophen Faktors;
e) Ermöglichung der Rückfaltung des sulfonylierten neurotrophen Faktors, um den biologisch aktiven neurotrophen Faktor zu ergeben; und
f) Aufreinigen des biologisch aktiven neurotrophen Faktors.

Der sulfonylierte neurotrophe Faktor wird mit Hilfe einer Anionenaustauschchromatographie aufgereinigt und in Anwesenheit von 20% Polyethylenglykol 300 (PEG 300) rückgefaltet. Der rückgefaltete neurotrophe Faktor wird durch Kationenaustauschchromatographie aufgereinigt.
Es soll klar sein, dass beiderseits die vorangegangene allgemeine Beschreibung die folgende detaillierte Beschreibung lediglich beispielhaft und erklärend sind, und nicht für die Erfindung, so wie beansprucht, beschränkend sein soll. Die beigefügten Figuren, welche hier mit aufgenommen sind und einen Teil der Beschreibung darstellen, illustrieren verschiedene Ausführungsformen der Erfindung und dienen gemeinsam mit der Beschreibung dazu, die Grundzüge der Erfindung zu erklären.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 beschreibt die Nukleinsäuresequenz von humanem BDNF (SEQ ID NO:1) und NGF (SEQ ID NO:2). Lücken, die durch Bindestriche angedeutet wurden, korrespondieren zu der Position von Lücken, welche verwendet wurden, um die Aminosäuresequenz anzupassen.
2 vergleicht die Aminosäuresequenzen von humanem BDNF (SEQ ID NO:3) und NGF (SEQ ID NO:4). Die abgeleiteten Sequenzen der reifen Proteine sind in Fettschrift dargestellt. Die durch Bindestriche angedeuteten Lücken wurden in die Sequenzen eingefügt, um die Anpassung zu steigern. Die in BDNF und NGF gefundenen sechs Cysteine werden an den gleichen Positionen bestimmt und sind mit Klammern versehen.
3 zeigt die synthetische NGF Sequenz (SEQ ID NO:5), welche in E. coli insertiert wurde und als reifes NGF Protein exprimiert wurde.
4 zeigt die Sequenzen der Oligonukleotide von Mut1 (SEQ ID NO:6), Mut2 (SEQ ID NO:7) und Mut3 (SEQ ID NO:8), die verwendet wurden um die NGF Sequenzen zu korrigieren.
5 zeigt die Oligonukleotidsequenz de Syn NGF 5P, die verwendet wurde, um eine gesteigerte Expression von NGF (SEQ ID NO:9) zu erzeugen.
6 zeigt die Oligonukleotidsequenzen von TP NGF (SEQ ID NO:10) und REP NGF (SEQ ID NO:11), die zur Erzeugung des TP (TNF Bindungsprotein) NGF REP Konstrukts verwendet wurden.
7 zeigt die Nukeinsäuresequenz von TP Δ53 (SEQ ID NO:12).
8 zeigt die Oligonukleotidsequenz, die für die Herstellung des TP NGF (2start-) REP Konstrukts verwendet wurde (SEQ ID NO:13).
9 zeigt ein Fließdiagramm für ein Verfahren dieser Erfindung.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Es wird nun im genaueren auf die gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung Bezug genommen, die zusammen mit den folgenden Beispielen dazu dienen, die Grundzüge der Erfindung zu erklären.
Die vorliegende Erfindung stellt ein ausgedehntes und verbessertes Verfahren zur Herstellung von bakteriell exprimierten biologisch aktiven neurotrophen Faktoren aus der NGF/BDNF Familie dar, ausgehend von dem in der früheren Anmeldung US Patentanmeldung Seriennummer 08/087,912 offenbarten Verfahren, welches durch den Bezug darauf hier spezifisch mit eingeschlossen ist.
Das Herstellungsverfahren dieser Erfindung zur Erhaltung des biologisch voll aktiven reifen humanen rekombinanten neurotrophen Faktors aus der NGF/BDNF Familie umfasst:

a) Exprimieren des neurotrophen Faktors in einem bakteriellen Expressionssystems;
b) Lösen und Sulfonierung des neurotrophen Faktors;
c) Rückfalten des sulfonylierten neurotrophen Faktors in einer solchen Weise, dass die korrekte Tertiärstruktur erhalten wird, die für die volle biologische Aktivität notwendig ist; und
d) Aufreinigen des biologisch aktiven voll neurotrophen Faktors.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren zur effizienten Herstellung von rekombinanten neurotrophen Faktoren der Familie des Nervenwachstumsfaktors (NGF) und der Familie des „brain derived neurotrophic factors" (BDNF).
Die hier beschriebene Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer "Familie" von neurotrophen Wachstumsfaktoren in einer reinen und biologisch aktiven Form dar, so dass sie für die therapeutische Anwendung geeignet sind. NGF ist ein Mitglied einer Familie von miteinander strukturell verwandten neurotrophen Proteinen, welche sich wahrscheinlich in ihrer physiologischen Rolle im Organismus unterscheiden, wobei jedes Mitglied eine unterschiedliche Gruppe von responsiven Neuronen beeinflusst. Bekannte Mitglieder der NGF Familie schließen NGF, BDNF, NT3 und NT4 mit ein. Jedes dieser Mitglieder besitzt eine signifikate Homologie und eine identische Anzahl und Position an Cysteinresten. Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls rekombinante Proteine, die für solche Proteine kodieren, welche nicht mit humanem NGF oder BDNF identisch sind, jedoch klar mit NGF oder BDNF in Bezug auf mögliche definierte Merkmale der Familie verwandt sind. Solche Merkmale können eine oder mehrere der folgenden mit einschließen: neurotrophe Aktivität in einem geeigneten Bioassay; signifikate Homologie in der Aminosäuresequenz, was beiderseits Aminosäureidentität und konservative Austausche mit einschließt; konservierte Position von Cysteinresten in der Aminosäuresequenz; hydrophobe Signalsequenzen zur Sekretion des Proteins; Signalsequenzen für die proteolytische Prozessierung in eine reife Form; und/oder der basale isoelektrische Punkt des prozessierten Proteins.
Wie in der Offenbarung verwendet, soll der Begriff "biologische Aktivität" wenn auf NGF bezogen, Proteine bedeuten, die die biologische Aktivität von NGF besitzen, was z.B. die Fähigkeit bedeutet, dass Überleben von Neuronen aus der sympathetischen Kette von Hühnerembryonen und von Neuronen aus dem dorsalen Hauptganglion in einem Bioassay zu fördern, das in Beispiel 3 beschrieben wird. Für andere Mitglieder des NGF/BDNF Familie bedeutet "biologische Aktivität" eine neurotrophe Aktivität in dem geeigneten Bioassay.
Diese Erfindung umfasst die Herstellung neurotropher Proteine jeglichen Ursprungs, welche zu dem neurotrophen Proteinen der NGF/BDNF Familie biologisch äquivalent sind. In der bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung umfasst dies reife humane neurotrophe Proteine. In der gesamten Beschreibung soll jegliche Referenz auf ein neurotrophes Protein dahingehend ausgelegt werden, dass es sich auf die Proteine bezieht, die hier als Mitglieder der NGF/BDNF Familie der neurotrophen Proteine identifiziert und beschrieben wurden.
Unter dem in der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen verwendeten Begriff "biologisch äquivalent" verstehen wir Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die in der Lage sind, das Überleben und die Aufrechterhaltung der phänotypischen Differenzierung von Nervenzellen oder glialen Zellen aufrechtzuerhalten, aber nicht notwendigerweise in dem gleichen Maß wie die hier beschriebenen nativen neurotrophen Proteine. Biologisch äquivalente Zusammensetzungen schließen Fragmente von Proteinen mit ein, die eine NGF/BDNF familienähnliche neurotrophe Aktivität zeigen. Weiterhin sind durch die vorliegende Erfindung die Aminosäuresequenzen mit umfasst, die in 2 gezeigt werden, und solche, die im wesentlichen homolog sind mit 1, 2, 3 oder 4 Aminosäureaustauschen oder -deletionen, die die neurotrophe Aktivität nicht wesentlich ändern. Diese Erfindung schließt weiterhin chemisch modifizierte Sequenzen mit ein, die im wesentlichen zu solchen homolog sind, die in der 2 gezeigt werden, beispielsweise durch Zugabe von Polyethylenglykol.
Durch "im wesentlichen homolog", wie während der gesamten vorliegenden Beschreibung und Ansprüche verwendet, soll der Grad der Homologie zu den nativen neurotrophen Proteinen verstanden werden, der diejenige überschreitet, die durch jedes vorher berichtete neurotrophe Protein gezeigt wurde. Bevorzugt liegt der Grad der Homologie bei über 70%, noch bevorzugter bei über 80%, und sogar noch stärker bevorzugt bei über 90%, 95% oder 99%. Eine besonders bevorzugte Gruppe neurotropher Proteine ist über 95% homolog zu den nativen Proteinen. Der Prozentanteil der Homologie, wie hier beschrieben, wird als Prozentanteil derjenigen Aminosäurereste berechnet, die in der kleineren der beiden Sequenzen gefunden wird, welche sich an identischen Aminosäurereste in der Sequenz ausrichten, wenn sie unter der Bedingung miteinander verglichen werden, dass 4 Lücken auf eine Länge von 100 Aminosäuren eingeführt werden können, um die Ausrichtung zu unterstützen, wie sie durch Dayhoff in Atlas of Protein Seguence and Structure, Band 5, Seite 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., dargestellt wird, welches durch Bezug hier spezifisch mit aufgenommen wurde. Als im wesentlichen homolog werden ebenfalls solche neurotrophen Proteine mit eingeschlossen, welche auf Grund der Kreuzreaktivität mit Antikörpern auf das beschriebene Protein isoliert werden können, oder wenn dessen Antigene mit Hilfe der Hybridisierung mit dem Gen oder mit Segmenten des beschriebenen Proteins isoliert werden können.
Mitglieder der NGF/BDNF Familie des neurotrophen Faktors werden natürlicherweise als größere Vorläuferformen erzeugt, welche anschließend durch proteolytische Spaltungen prozessiert werden, um das "reife" Protein zu erzeugen (Edwards et al., (1986) supra; Leibrock et al., (1989) supra). Da bakterielle Expressionssysteme nicht in der Lage sind, die Vorläuferform des Proteins korrekt zu prozessieren, wird lediglich derjenige Anteil der DNA Sequenz in einem bakteriellen Expressionssystems exprimiert, der für das reife Protein kodiert.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine synthetische NGF DNA Sequenz konstruiert, welche für die Produktion innerhalb eines E. coli Expressionssystems optimiert wurde. Das synthetische NGF Gen kann mit Hilfe einer DNA Sequenz konstruiert werden, welche für humanes oder tierisches NGF kodiert. Das synthetische NGF Gen wird in einem Vektor kloniert, die in der Lage ist, in die Wirtszelle transferiert und dort repliziert zu werden, wobei ein solcher Vektor operationelle Einheiten enthält, die zur Expression der DNA Sequenz notwendig sind. Die Konstruktion eines bevorzugten synthetischen NGF Gens und die Klonierung in einen für den Transfer in ein E. coli Expressionssystem geeigneten Vektor wird in Beispiel 1 beschrieben. Diese Erfindung umfasst die Verwendung eines synthetischen Gens eines neurotrophen Faktors aus NGF/BDNF Familie sowie ein synthetisches Gen mit einer wesentlichen Homologie zu einem Gen aus der NGF/BDNF Familie.
Eine natürliche und synthetische DNA Sequenz kann zur direkten Herstellung von NGF verwendet werden. Das synthetische NGF Gen, das in Beispiel 1 beschrieben wurde und in 3 (SEQ ID NO:5) gezeigt wurde, wurde speziell zur Expression des reifen humanen NGF Proteins in einem bakteriellen Expressionssystem entworfen. Die Kodons für bestimmte Aminosäuren wurden für die Expression in E. coli optimiert, sowie auch Restriktionsschnittstellen erzeugt wurden, um die anschließenden Klonierungsschritte zu erleichtern. Das allgemeine Expressionsverfahren umfasst:

1. Herstellen einer DNA Sequenz, die in der Lage ist, E. coli zu veranlassen, reifes humanes NGF zu erzeugen;
2. Klonieren der DNA Sequenz in einen Vektor, der in der Lage ist, in E. coli transferiert und dort repliziert zu werden, wobei ein solcher Vektor operationelle Einheiten enthält, die zur Expression der NGF Sequenz benötigt werden;
3. Transferieren des Vektors, der die synthetische DNA Sequenz und operationelle Einheiten enthält, in E. coli Wirtszellen; und
4. Kultivieren der E. coli Wirtszellen unter Bedingungen für die Amplifikation des Vektors, und Expression von NGF.

Die Wirtszellen werden unter Bedingungen kultiviert, die für die Expression von NGF geeignet sind. Diese Bedingungen sind im allgemeinen für die Wirtszelle spezifisch und können durch einen Fachmann mit Hinblick auf die veröffentlichte Literatur bezüglich von Wachstumsbedingungen für solche Zellen und den darin enthaltenen Lehren leicht bestimmt werden. Beispielsweise enthält Bergey's Manual of Determi native Bacteriology, 8. Ausgabe, Williams & Wilkins Company, Baltimore, Maryland, die durch Referenz hier spezifisch mit eingeschlossen ist, Informationen über die Kultivierung von Bakterien. In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird NGF in einem E. coli Expressionssystem erzeugt. Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung dieses Herstellungsverfahrens zur Erzeugung jeden neurotrophen Faktors aus der NGF/BDNF Familie zu erzeugen.
Ein Verfahren für die Herstellung von rekombinanten Mitgliedern der humanen NGF/BDNF Familie an neurotrophen Proteinen in ihrer biologisch aktiven Form wird in der US Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/087,912 beschrieben (Collins et al.). Collins et al. beschreiben ein Verfahren zur Rückfaltung und Renaturierung rekombinanter humaner reifer Mitglieder der NGF/BDNF Familie der neurotrophen Proteine. Alle intramolekularen oder intermolekularen Disulfidbrücken und/oder alle nicht-kovalenten Interaktionen, welche im Bezug auf ein in einem Mikroorganismus erzeugtes reifes neurotrophes Protein auftreten, werden zuerst unterbrochen. Um dies durchzuführen wird das Protein einer ausreichenden Menge an denaturierendem Agenz, wie beispielsweise Guanidiniumhydrochlorid oder Harnstoff, ausgesetzt und einer ausreichenden Menge an reduzierendem Agenz wie beispielsweise ß-Mercaptoethanol, Dithiothreitol, oder Cystein, um das Protein zu denaturieren, nichtkovalente Interaktionen zu unterbrechen und Disulfidbrücken zu reduzieren. Nachdem das reife neurotrophe Protein denaturiert und reduziert wurde, werden die im reduzierten Protein vorhandenen freien Thiole durch Zugabe eines großen Überschusses an Disulfid-enthaltendem Reagenz, wie beispielsweise Glutathion oder Cystin oxidiert. Diese Reaktion erzeugt gemischte Disulfidbrücken, in welchen jeder Cysteinrest im reifen neurotrophen Protein eine Disulfidbrücke mit der monomeren Form des oxidierenden Agenz bildet. Das denaturierende und oxidierende Agenz wird anschließend auf eine definierte Konzentration verdünnt und zur Katalyse des Disulfidaustausch wird ein Thiol-enthaltendes Reagenz wie beispielsweise Cystein zugesetzt. Dies erzeugt ein Umfeld, in welchem die Konzentration an denaturierendem Agenz so ausreichend verringert wurde, dass das neurotrophe Protein in die Lage versetzt wird, verschiedene dreidimensionale Konfigurationen anzunehmen, in welchen das Oxidations/Reduktionspotential so angepasst ist, dass die Bildung und das Aufbrechen von Disulfidbrücken ermöglicht wird. Es wird angenommen, dass ein signifikanter Anteil des neurotrophen Proteins das Muster der intramolekularen Disulfidbindungen und damit die korrekte dreidimensionale Struktur bildet und dadurch die biologische Aktivität erhalten wird. Collins et al. beschreiben weiterhin die Verwendung von bis zu 25% Polyethylenglykol (PEG) 200, 300 oder 1000, welches zur finalen Rückfaltungsmischung zugegeben wird. In der Anwesenheit von PEG wird ein mehr als 30%iger Anstieg der Menge von korrekt rückgefaltetem biologisch aktivem NGF erhalten. Das Verfahren nach Collins et al. stellt eine Verbesserung gegenüber den harschen Bedingungen der Methoden aus dem Stand der Technik dar und führt zu einem Protein mit bis zu 50% biologischer Aktivität.
Das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung stellt in mehreren Punkten eine Ausweitung und Verbesserung gegenüber dem von Collins et al. beschriebenen Verfahren dar. Zur Auflösung des in E. coli hergestellten unlöslichen Proteins wird das Verfahren der Sulfitolyse verwendet. Die Sulfitolyse verleiht dem NGF Aufreinigungsverfahren gegenüber allen im Stand der Technik bekannten Verfahren verschiedene wichtige Vorteile. Natriumsulfit ist ein starkes Reduktionsmittel und funktioniert mindestens so gut wie 2-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol bei der Lösung von NGF aus den gewaschenen Feststoffen. Das in Anwesenheit von Harnstoff vollständig reduzierte NGF ist auf chromatographischen Säulen nicht als klarer Peak aufzulösen. Im Gegensatz dazu zeigt sulfonyliertes NGF eine markante Verbesserung bei der Auflösung auf Ionenaustauschsäulen. Die Sulfitolyse verleiht dem Protein für jedes modifizierte Cystein eine negative Ladung. Jedes Monomer von NGF enthält sechs Cysteinreste und die vollständig sulfonylierte monomere Form enthält daher zusätzlich 6 negative Ladungen. Dies bedeutet verschiedene Vorteile: 1) der Anstieg der Gesamtladung jedes Monomers steigert seine Hydrophilie und Löslichkeit; 2) die zusätzlichen negativen Ladungen verringern den effektiven isoelektrischen Punkt des Proteins. Dies ermöglicht die Verwendung einer Anionenaustauschchromatographie bei einem niedrigeren pH, als dies mit der vollständig reduzierten Form des Proteins möglich ist. Weiterhin ermöglicht dies die Aufreinigung einer in Harnstoff gelösten Form des Proteins mit einem scheinbaren pl von etwa 7,5, gefolgt von der Aufreinigung der löslichen rückgefalteten Form des Prote ins mit einem theoretischen pl von etwa 10,4. Die Fähigkeit, zwei Formen des gleichen Proteins aufzureinigen, welche offensichtlich unterschiedliche isoelektrische Punkte besitzen, schafft die Basis für den hohen Grad der Abtrennung von NGF von kontaminierenden E. coli Proteinen.
Beispiel 2 beschreibt das Rückfaltungs- und Aufreinigungsverfahren der vorliegenden Erfindung nach Expression von NGF im E. coli Expressionssystem. Die E. coli Wirtszellen werden lysiert und die NGF enthaltende Fraktion wird als "NGF gewaschene Feststoffsuspension" isoliert.
NGF wird in der Anwesenheit von Harnstoff und Sulfit gelöst und sulfonyliert.
Sulfonyliertes NGF kann eingefangen und mittels einer Anionenaustauschchromatographie anhand verschiedener unterschiedlicher Modelle aufgereinigt werden. In einer Ausführungsform, die genau in Beispiel 2 beschrieben wird, wird sulfonyliertes NGF mit Puffer A verdünnt (8 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 9.0), auf eine Anionenaustauschsäule gegeben und mit Puffer B (8 M Harnstoff, 36 mM MES, pH 6.0) eluiert. In einer anderen Ausführungsform wird sulfonyliertes NGF von der Säule mittels eines linearen Gradienten von Puffer A zu Puffer B eluiert. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird sulfonyliertes NGF gegen Puffer A in einer Ultrafiltrationskartusche diafiltriert, auf eine Anionenaustauschsäule gegeben und mit einem linearen Gradienten von Puffer A zu Puffer B eluiert. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird sulfonyliertes NGF in einer Ultrafiltrationsmembrane in einer gerührten Zelle aufkonzentriert und diafiltriert, auf eine Anionenaustauschsäule gegeben und wie oben eluiert.
Aufgereinigtes sulfonyliertes NGF kann durch verschiedene Verfahren, wie in Beispiel 2 beschrieben, rückgefaltet werden. Harnstoff und PEG werden zu einem Säureballon zugegeben und die Lösung wird gekühlt. NGF wird zugegeben, der pH wird eingestellt und festes Cystein zugegeben. Der Säureballon wird anschließend bei 10°C für 4 Tage gelagert.
Sauber zurückgefaltetes NGF wurde mit Hilfe einer Kationenaustauschchromatographie eingefangen. Rückgefaltetes NGF wurde als einzelner Peak eines Proteins wiedergewonnen, der verschiedene Spezies von NGF mit geänderter Ladung beinhaltet. Nicht korrekt geladene Formen von NGF wurden außerhalb des Hauptpeaks von NGF aufgereinigt und aufkonzentriert.
Obwohl die folgenden Beispiele jeden Schritt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von biologisch aktivem NGF beschreiben, umfasst die vorliegende Erfindung die Herstellung von biologisch aktiven neurotrophen Faktoren aus der NGF/BDNF Familie, einschließlich BDNF, NGF, NT3 und NT4, wie auch von neurotrophen Faktoren, die eine wesentliche Homologie und ähnliche biologische Aktivität besitzen. Der Grad der Homologie, der unter den Mitgliedern der NGF/BDNF Familie der neurotrophen Faktoren auftritt, einschließlich der Aminosäuresequenz und der Position von Disulfidbrücken, legt nahe, dass diese Proteine ähnliche dreidimensionale Strukturen besitzen. Die mit der nicht-korrekten Bildung von Disulfidbindungen assoziierten Probleme und der Bedarf für ein verbessertes Verfahren zur Rückfaltung und Denaturierung der bakteriell erzeugten Proteine sind weiterhin für alle Mitglieder der NGF/BDNF Familie an neurotrophen Faktoren ähnlich.
Beispiel 1
Konstruktion eines synthetischen NGF Gens und Expression in E. coli.
Ein synthetisches NGF Gen wurde entworfen, um sowohl die Kodons für die Expression in E. coli zu optimieren als auch um einzelne Restriktionsschnittstellen zu schaffen, um die anschließenden Klonierungsschritte zu erleichtern.
Das NGF Gen wurde aus zwei Stücken zusammengesetzt: 1) Sektion A – ein 218 Basenpaar (Bp) BamHI-Sall Stück an DNA, das aus 3 Paaren komplementärer Oligonukleotide besteht, die auf einem DNA Synthesizer 380A von Applied Biosystems synthetisiert wurden; 2) Sektion B – ein 168 Bp Sall-Kpnl Stück an DANN, bestehend aus 2 Paaren komplementärer synthetischer Oligonukleotide (3) (SEQ ID NO:5).
A. Zusammensetzung der Sektion. Jedes Oligonukleotid wurde unter Verwendung der T4 Polynukleotidkinase phosphoryliert. Die phosphorylierten Oligonukleotide wurden anschließend an ihr Komplement durch Erhitzen auf 80°C und langsames Abkühlen auf 35°C angelagert. Die Paare an Oligonukleotiden (3 für Sektion A und 2 für Sektion B) wurden ligiert und anschließend mit BamHI-Sall verdaut (Sektion A) oder mit Sall-Kpnl (Sektion B), um multiple Insertionen zu minimieren. Die resultierten Fragmente wurden anschließend auf einem 5%-igen Polyacrylamidgel isoliert und eluiert. Jedes Fragment wurde in ein pUC18 Fragment ligiert, das mit den geeigneten Enzymen (BamHI und Sall für Sektion A; Sall und Kpnl für Sektion B) verdaut wurde. JM109 wurde transformiert und Isolate wurden in Luria Medium kultiviert, welchem Ampicillin mit einer Konzentration von 100 μg/ml zugegeben wurde. Es wurde Plasmid DNA präpariert und Hilfe von Restriktionsverdauanalysen bestätigt, dass ein Fragment geeigneter Größe vorlag.
B. Zusammensetzung des gesamten synthetischen NGF Gens. Ein BamHI-Sall 218 Bp Fragment wurde aus Sektion A pUC18 und ein 168 Bp Sall-Kpnl Fragment wurde aus Sektion B pUC18, wie oben durchgeführt, unter Verwendung eines 5%igen Polyacrylamidgels isoliert. Diese Fragmente wurden in mit BamHI-Kpnl geschnittenes pUC18 ligiert (IPTG und Xgal wurden verwendet um kolorimetrisch Kolonien mit Inserts und weiße Kolonien mit Inserts zu bestimmen). Eine weiße Kolonie wurde ausgewählt und eine Plasmidwurde DNA hergestellt. Wurde ein BamHI-Kpnl Verdau durchgeführt, wurde ein 387 Bp Fragment eingesetzt und aus einem 1%igen Agarosegel isoliert. Das 387 Bp Fragment wurde in ein BamHI-Kpnl Vektorfragment mit etwa 7 Kilobasen (Kb), REP pT3XI-2 ligiert, das aus einem Verdau des Plasmids TP NGF (2start-)REP pT2XI-2 erhalten wurde. REP ist eine repetitive extragenische Palindromsequenz, von der berichtet wurde, dass sie messenger-RNA dadurch stabilisiert, dass sie 3'-5' exonukleolytischer Aktivität vorbeugt (Merino et al. (1987) Gene 58:305). Ein Transformant wurde in Luria Medium mit Tetrazyklin bei einer Konzentration von 10 μg/ml kultiviert. Es wurde Plasmid DNA hergestellt und mit BamHI-Kpnl verdaut. Es wurde zwar ein 387 Bp Fragment beobachtet; um jedoch sicherzustellen, dass das Fragment das synthetische Gen darstellte, wurde ein zweiter Verdau mit BamHI-EcoRV durchgeführt (die EcoRV Schnittstelle wurde durch die kodierende Region des synthetischen Gens eliminiert). Als das Konstrukt sequenziert wurde, erschienen drei Bereiche, die scheinbar die falsche Sequenz aufwiesen und diese wurden durch in vitro Mutagenese unter Verwendung eines Mutagenesekits korrigiert, der von Biorad vertrieben wird. Die betroffenen Bereiche liegen zwischen den Nukleotiden 83-91 (Mut1) (4, SEQ ID NO:6), Nukleotid 191 (Mut2) (4, SEQ ID NO:7), und eine Deletion von 2 C's bei den Nukleotiden 258 und 259 (Mut3) (4, SEQ ID NO:8). Das synthetische NGF Gen wurde in den BamHI-Kpnl Schnitt als BamHI-Kpnl Fragment ligiert, um als Template für die Mutagenese verwendet zu werden. Die Mutagenese wurde in einem Zwei-Stufen-Verfahren durchgeführt, wobei zunächst die Oligo-Nukleotide Mut1 und Mut2 für eine doppelte Mutagenese verwendet wurden. Zwei Isolate mit der korrekten Sequenz wurden mittels Hybridisierung an ³²Pmarkierte Mut1 und Mut2 Oligonukleotide ausgewählt (Mut1, 2A und Mut1, 2B genannt).
Diese wurden anschließend in einem zweiten Schritt mit Mut3 Oligonukleotid mutagenisiert und aus jeder Platte wurde ein Isolat durch Hybridisierung an eine ³²P-markierte Mut3 Sonde ausgewählt (Syn NGF MutA und Syn NGF MutB). Beide Isolate wiesen die korrekte Sequenz auf. Es wurde eine replikative Form (RF-doppelsträngige DNA) hergestellt und mit BamHI-Kpnl verdaut und ein 387 Bp Fragment wurde aus einem 1 %igen Agarosegel isoliert.
Das Syn NGF MutA Fragment wurde in einer 7 Kb BamHI-Kpnl Vektorfragment, REP pT3XI-2 ligiert, welches aus TP NGF REP pT3XI-2 isoliert wurde. MCB00005 wurde transformiert, ein Isolat wurde in Luria Medium zusammen mit Tetrazyclin bei einer Konzentration von 10μg/ml kultiviert und Plasmid DNA wurde hergestellt. Ein diagnostischer BamHI-Kpnl Verdau wurde durchgeführt, um die Anwesenheit des Inserts zu bestätigen.
C. Vermehrtes synthetisches NGF. Als Mittel zur Verstärkung der Expression des synthetischen Gens wurde die Region zwischen dem initiierenden Methionin und der BamHI Schnittstelle unter Verwendung der in vitro Mutagenese verändert, um die Region wie die eines hoch exprimierten Proteins des T7 Bakteriophagen, Gen 10, unter Verwendung des Oligonukleotids, Syn NGF 5P (5) (SEQ ID NO:9) neu anzuordnen. Syn NGF MutA mp18 wurde als Template verwendet. Vier Plaques wurden durch die Hybridisierung an ein ³²P-markiertes Syn NGF 5P Oligonukleotid ausgewählt. Es wurde RF DNA hergestellt und mit BamHI-Kpnl verdaut. Alle besaßen das Fragment in der richtigen Größenordnung und die Sequenz von jedem Fragment stimmte ebenfalls. Das BamHI-Kpnl 387 Bp Fragment wurde aus einem 1%igen Agarosegel isoliert und in ein BamHI-Kpnl, etwa 7 Kb großes Vektorfragment, REP pT3XI-2 (isoliert aus BamHI-Kpnl, verdaut mit Syn NGF A REP pT3XI-2, wie oben beschrieben) ligiert. MCB00005 wurde transformiert. Es wurden Kolonien mit ³²P-markiertem Syn NGF 5P Oligonukleotid gesichtet und 2 Kolonien, die an die Sonde hybridisierten, wurden in Luria Medium mit Tetrazyclin bei einer Konzentration von 10 μg/ml kultiviert. Beide Isolate besaßen die korrekte Sequenz.
D. Konstruktion von TP NGF REP pT3XI-2 und TP NGF (2start-) REP pT3XI-2.

(1) TP NGF REP PT3XI-2. DH5α, das ein BamHI-Hindlll Fragment des NGF Gens aus British Biotechnology (British Biotechnology, Limited, Oxford, England) trägt, wurde mit BamHI-Hindlll verdaut, ein 380 Basenpaar Fragment wurde isoliert und in BamHI-Hindlll verdautes mp18 ligiert. Die DNA wurde in vitro in einem Zwei-Stufen-Verfahren mutagenisiert. Der erste Schritt schließt die Insertion einer BamHI Schnittstelle unmittelbar 3' zur Hindlll Schnittstelle am 5'-Ende des Gens mit ein und ebenfalls eine Insertion einer Shine-Delgarno (S/D) Sequenz mit dem "optimalen" Abstand für eine effiziente Expression zwischen der S/D-Sequenz und dem initiierendem Met Kodon (siehe TP NGF Oligonukleotid, 6) (SEQ ID NO:10). Ein Plaque wurde nach Hybridisierung an das ³²P-markierte TP NGF Oligonukleotid ( 6) (SEQ ID NO:10) ausgewählt. Eine zweite Mutageneserunde wurde unter Verwendung des Oligonukleotids REP NGF (6) (SEQ ID NO:11) durchgeführt. Ein Plaque wurde mittels Hybridisierung mit einem ³²P-markierten REP NGF Oligonukleotid ausgewählt. RF DNA wurde hergestellt, ein ungefähr 470 Kb großes BamHI-Hindlll Fragment isoliert und in ein ungefähr 7 Kb großes BamHI-Hindlll Vektortragment ligiert, das aus Bam TP Δ53 pT3XI-2 (7) (SEQ ID NO:12) isoliert wurde. Der Stamm MCB00005 wurde transformiert und ein Isolat wurde ausgewählt, sequenziert, und es wurde festgestellt, dass es die korrekte Sequenz besitzt.
(2) TP NGF (2start-) pT3XI-2. Um eine mögliche zweite Startregion innerhalb des NGF Gens zu eliminieren, wurde eine in vitro Mutagenese unter Verwendung des Oligonukleotids 2start- (8) (SEQ ID NO: 13) und mit TP NGF REP mp18 als Template durchgeführt. Ein Isolat, das an das ³²P-markierte 2start- Oligonukleotid hybridisiert, wurde sequenziert, und es wurde festgestellt, dass es die korrekte Sequenz besitzt. RF DNA wurde präpariert, ein BamHI-Hindlll Fragment von ungefähr 470 by Länge wurde aus einem 1 %igen Agarongel isoliert und in ein ungefähr 7 Kb BamHI-Hindlll Fragment pT3XI-2 (isoliert aus Bam TP Δ53 pT3XI-2, siehe 7 (SEQ ID NO:12)) ligiert. MCB00005 wurde transformiert und das korrekte Isolat über eine Restriktionsverdauanalyse bestimmt.

Beispiel 2
Isolation von biologisch aktivem NGF
A. Zelllyse. Das humane rekombinante NGF Gen Konstrukt aus Beispiel 1 wurde in E. coli Zellen exprimiert, die in chemisch definiertem Medium bei 33°C kultiviert wurden. Eine frische oder gefrorene Aufschlämmung aus Zellen wurde mit 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,5 auf eine finale Feststoffkonzentration von etwa 20% (Gewicht/Volumen) verdünnt. Die Zellen wurden unter Verwendung von 4 Durchgängen durch einen Gaulin- oder Rannie-Homogenisierer bei einem Druck von >8000 PSI lysiert. Das Lysat wurde durch eine Kühlschlange gegeben, um die Temperatur bei weniger als 15°C zu halten.
B. Ernte und Waschen der Feststoffe der Zellen, die NGF enthalten. Die Feststoffe aus den Zellen wurden unter Verwendung einer Westphalia Zentrifuge abgetrennt. Nach der Abtrennung wurde der Prozentsatz an Feststoffen bestimmt. Ausreichend kalter Wasser/Verdünnungspuffer (20mM Tris-HCl, pH 7,5) wurde zugegeben, um den Prozentanteil der Feststoffe auf 5% zu verringern. Nach vorsichtigem Mischen wurde das Lysat für einen zweiten Durchgang in die Zentrifuge gegeben. Die finale "NGF gewaschene Zellsuspension" wurde auf ihren Prozentanteil an Feststoffen geprüft. Ungefähr 80 g an gewaschenen Feststoffen wurden pro Kg an Startzellen wiedergewonnen. Die "NGF gewaschene Feststoffsuspension" wurde entweder unmittelbar verwendet oder auf –20°C für die weitere Verwendung eingefroren.
C. Auflösung und chemische Modifizierung von NGF. Das in den gewaschenen Feststoffen vorhandene NGF wurde durch Verwendung von 8 M Harnstoff und einer Sulfitolyse-Mischung gelöst. Dies ergab ein gelöstes, denaturiertes, chemisch-modifiziertes NGF, in welchem die Cysteinreste als cys-SO₃ ^– gemischtes Disulfid vorhanden sind.
Ausreichend fester Harnstoff und Wasser wurden zu der "NGF gewaschenen Feststoffsuspension" zugegeben, um eine finale Konzentration von 8 M Harnstoff in einem Endvolumen zu erreichen, das dem zweifachen des Volumens der verwendeten Suspension an gewaschenen Feststoffen entspricht. Nach Auflsöung des Harnstoffs wurden die folgenden Endkonzentrationen an Reagenzien zum Schritt der Sulfitolyse zugegeben: 10 mM Tris Puffer, 100 mM Natriumsulfit, 10 mM Natriumtetrathionat. Die Mischung wurde auf einen finalen pH von ungefähr 7,5 mit HCl gebracht und bei Raumtemperatur für mindestens etwa 2 Stunden gerührt.
D. Abtrennung und Aufreinigung von sulfonyliertem NGF. Sulfonyliertes NGF wurde abgetrennt und auf der Sulfitolysemischung mittels Anionenaustauschchromatographie aufgereinigt. Verschiedene Beladung und Eluierungsprotokolle wurden verwendet.
In einer Ausführungsform der Erfindung wurde die Sulfitolysemischung 10-fach in Puffer A (8 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 9,0) verdünnt und auf einen endgültigen pH von 9,0 mit NaOH eingestellt. Diese Lösung wurde auf eine Säule mit Pharmacia Q-Sepharose big bead Harz gegeben, das mit Puffer A äquilibriert wurde. Ein Volumen, das 25 g von NGF gewaschenen Feststoffen repräsentiert, wurde pro Liter Harz aufgeladen. Die Säule wurde mit 3 Säulenvolumen an Puffer A gewaschen. Sulfonyliertes NGF wurde durch Erniedrigung des pHs unter Verwendung von Puffer B (8 M Harnstoff, 36 mM MES, pH 6,0) eluiert. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wurde sulfonyliertes NGF mit einem linearen Gradienten von Puffer A zu Puffer B in etwa 10 Säulenvolumen eluiert.
In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet eine alternative Beladungsprozedur die Diafiltration der Sulfitolysemischung unter Einsatz von entweder einer Amicon S1Y10 oder einer S10Y10 Ultrafiltrationskartusche mit Spiralwindung. Die Mischung wurde mit etwa 4 Volumenanteilen an Puffer A diafiltriert. Diese diafiltrierte Sulfitolysemischung wurde auf pH 9,0 eingestellt und direkt auf eine Säule mit „Q-Sepharose big bead Harz" aufgegeben. Ein Volumen, welches 125 g an NGF gewaschenen Feststoffen repräsentiert, wurde pro Liter Harz aufgegeben. Die Säule wurde gewaschen und das sulfonylierte NGF wurde wie oben beschrieben eluiert.
Das von den Säulen mit Hilfe von jedem der oben beschriebenen Verfahren eluierte Protein war hauptsächlich sulfonyliertes NGF. Das Peak des eluierten Proteins wurde vereinigt und die Proteinkonzentration wurde durch Absorbtion bei 280 nm unter Vewendung eines Extinktionskoeffizienten von 1,44 bestimmt. Säulenausbeuten von bis zu etwa 5 mg Protein pro Gramm an NGF gewaschenen Feststoffen waren typisch.
E. Rückfaltung von NGF. Über Q-Sepharose-aufgereinigtes, sulfonyliertes NGF kann mittels verschiedener Verfahren rückgefaltet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wurde sulfonyliertes NGF bei einer Proteinendkonzentration von 0,1 mg/ml rückgefaltet. Das benötigte finale Rückfaltungsvolumen wurde auf der Basis der Menge des rückzugefaltenden Proteins berechnet. Filtrierter und deionisierter 8M Harnstoff, Polyethylenglykol 300 (PEG 300), dibasisches Kaliumphosphat und Wasser wurden in einem Säureballon in einer solchen Weise kombiniert, dass die Endkonzentrationen an 5M Harnstoff, 20% PEG 300 und 100 mM dibasischem Kaliumphosphat im finalen Rückfaltungsvolumen erreicht wurden. Die Lösung wurde auf etwa 10°C gekühlt. Sulfonyliertes NGF wurde vorsichtig zu einer Endkonzentration von 0,1 mg/ml zugegeben. Der pH dieser Mischung wurde auf etwa 8,7 mit 5 M HCl ge bracht. Das Rühren wurde unterbrochen und L-Cystein wurde zu einer Endkonzentration von 3 mM zugegeben. Durch die Gasphase wurde für etwa 5 Minuten ein kräftiger Strom an Argon geleitet und der Säureballon wurde verschlossen. Die Lösung wurde solange gerührt, bis das L-Cystein aufgelöst war, und der Säureballon wurde bei etwa 10°C für etwa 4 Tage aufbewahrt.
Die Rückfaltungseffizienz wurde mit NGF Proteinkonzentrationen untersucht, die zwischen 0,02 und 0,2 mg/ml liegen. Die Rückfaltungseffizienz wurde mit verringerter Proteinkonzentration verbessert, gleichwohl schlossen die benötigten Volumen und die Kosten für die Rückfaltungsreagentien eine Optimierung lediglich auf der Basis der Ausbeute aus. Harnstoffkonzentration zwischen 4,5 und 5,5 M erwiesen sich als optimal für die Rückfaltung. Die Ausbeuten sanken drastisch unter etwa 4 M Harnstoff, während sich Konzentrationen über 5,5 M sich als nicht praktikabel erwiesen.
Eine optimale Rückfaltung wurde unter Verwendung von etwa 20% PEG 300 erreicht. PEG 200 funktioniert nahezu so gut wie PEG 300. Geringere Werte an PEG 300 oder von PEG 200 oder der Ersatz von PEG mit Ethylenglykol führte zu viel geringeren Rückfaltungseffizienzen.
Die Rückfaltungseffizienzen wurden bei Phosphatkonzentrationen zwischen Null und 0,5 M untersucht. Die NGF Rückfaltung zeigte ein breites Optimum zwischen 100 und 200 mM Phosphat. Ein Vergleich von monobasischem Natriumphosphat, dibasischem Natriumphosphat, monobasischem Kaliumphosphat und dibasischem Kaliumphosphat erbrachte lediglich kleinere Unterschiede in den NGF Rückfaltungseffizienzen. Dibasisches Kaliumphosphat wurde für den anfänglichen pH in Lösungen bevorzugt, sowie für seine verbesserte Löslichkeit gegenüber dem vergleichbaren Natriumsalz.
NGF zeigte bei etwa 10°C eine optimale Rückfaltung, obwohl Temperaturen zwischen 4°C und 15°C nahezu genauso gut funktionieren. Über 15°C sank der Grad der Rückfaltung drastisch ab, mit einer zu vernachlässigenden Rückfaltung, die bei Raumtemperatur auftritt. Anstiege im pH der Rückfaltungslösung führten zu großen Änderungen in der Rückfaltungsrate. Beispielsweise benötigte die Rückfaltung bei pH 8,3 8–9 Tage, um nahezu vollständig zu sein, während die Rückfaltung bei pH 8,7 nach etwa 4 Tagen vollständig war. Ein höherer pH wurde aufgrund des in der Rückfaltungslösung vorhandenen Harnstoffs vermieden, sowie aufgrund der Länge der Rückfaltung und der gestiegenen Empfindlichkeit der Proteine gegen Carbamylierung bei steigendem pH.
L-Cysteine oder Cysteamin wurden zur Initiierung der NGF Rückfaltung mit gleicher Effektivität eingesetzt. Cysteaminhydrochlorid war etwas weniger effektiv. Eine Endkonzentration von ungefähr 3 mM L-Cystein war optimal. Eine L-Cysteinkonzentration unter 2 mM oder über 5 mM führten zu einer wesentlichen Verminderung der Rückfaltung.
F. Abtrennung von rückgefaltetem NGF. Sauber zurückgefaltetes NGF, das in der Rückfaltungslösung vorhanden ist, wurde unter Verwendung eines Kationenaustauschchromatographie abgetrennt. Die Größe der Säule wurde aufgrund der Fähigkeit der Säule ausge2wählt, die benötigte Fließrate und den benötigten Gegendruck bei der Beladung eines großen Volumens einer viskosen Faltungsmischung auszuhalten, und weniger aufgrund der Proteinladungskapazität des Harzes. Eine typische 70-Liter Rückfaltung wurde unter Verwendung eines 750 ml Bettvolumens eines Harzes abgetrennt.
In einer bevorzugten Ausführungsform für die Abtrennung von rückgefaltetem NGF wurde der Säureballon, nach Lagerung bei ungefähr 10°C für 4 Tage, geöffnet und die Rückfaltlösung wurde auf einen pH von 5,0 mit entweder 5 M HCl oder mit Essigsäure gebracht. Diese Lösung wurde auf eine Säule mit „SP-Sepharose big bead Harz" von Pharmacia geladen, welche in 20 mM Natriumazetat, pH 5,0 äquilibriert wurde. Nach der Beladung wurde die Säule mit 4 Säulenvolumen an 20 mM Natriumazetat, pH 5,0 gewaschen. Lösliches, rückgefaltetes NGF wurde von der Säule unter Verwendung von 20 mM Nat riumazetat, 750 mM NaCl, pH 5,0 euliert. Die Fließrate betrug 0,5 Säulenvolumen pro Minute (c.v./min) während der Äquilibrierung, der Beladung und des Waschens; während der Elution wurde auf 0,25 c.v./min verringert.
Ein einzelner Peak des Proteins wurde wiedergewonnen, in welcher sauber rückgefaltetes NGF umfasste. Obwohl dieses Material aufgrund der Größensortierung als nahezu homogen erschien, wie auch auf der SDS-PAGE, und bei einer Standard Umkehrphasen-HPLC, wurde anschließend durch isoelektrische Fokussierung und Kationenaustausch HPLC gezeigt, dass es verschiedene, in ihrer Ladung geänderte, Spezies von NGF enthält. Die Hauptbestandteile, die mittels Kationenaustausch HPLC abgetrennt wurden, wurden als verkürzte oder carbamylierte Varianten von NGF unter Verwendung von Elektrospray-Massenspektroskopie identifiziert. Es war daher notwendig, eine weitere Säule in das Aufreinigungsverfahren mit aufzunehmen, um diese NGF Varianten zu entfernen.
G. Entfernung von NGF Varianten durch Ionenaustauschchromatographie. In der bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird der aus der mit „S-Sepharose big beads" beladenen Säule eluierte Pool an Proteinen zweifach unter Verwendung von 20 mM Natriumazetat, pH 5,0 verdünnt und anschließend auf eine Säule mit „SP-Sepharose high performance Harz" von Pharmacia gegeben, welches in 20 mM Natriumazetat, pH 5,0 äquilibriert wurde. Die Säule wurde mit etwa 5 mg NGF/ml Harz beladen. Die Säule wurde zuerst mit etwa zwei Säulenvolumen an 20 mM Natriumazetat, pH 5,0 gewaschen und anschließend mit etwa zwei Säulenvolumen an 20 mM Tris-HCl, 75 mM NaCl, pH 7,5 und mit einem 12-fachen Säulenvolumen eines linearen Gradienten von 125 zu 300 mM NaCl in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 eluiert. In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung wurde die Säule mit etwa 3 Säulenvolumen an 20 mM Tris-HCl, 125 NaCl, pH 7,0 gewaschen. Das Protein wurde von der Säule unter Verwendung eines 10-fachen Säulenvolumens eines pH Gradienten von 20 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,0, bis 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8,0 eluiert. Beide der oben erwähnten Elu tionsprotokolle führten zur Auflösung der nicht korrekten Ladungsformen von NGF abseits des Hauptpeaks von NGF.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung schließen die Verwendung anderer Kationenaustauscher-Harze wie beispielsweise Pharmacia Mono-S, oder die Elution des Proteins mit unterschiedlichen Puffersystemen, und/oder bei einem unterschiedlichen pH mit ein. Diese schließen einen 20 mM Glycylglyzin, pH 8,5, 50–200 mM NaCl Gradienten; einen 20 mM Borat, pH 8,0–8,5, 50–300 mM NaCl Gradienten; einen 20 mM Tris-HCl, pH 7,0–8,5, 50–400 mM NaCl Gradienten; und einen 20 mM Natriumphosphat, pH 7,0, 100–500 mM NaCl Gradient mit ein. NGF wurde ebenfalls aus der obigen Säule unter Verwendung von 20 mM Natriumzitratpuffer, pH 5,0, 450–800 mM NaCl Gradient, und mittels 20 mM Natriumzitrat, pH 5,0, 400–700 mM NaCl Gradienten eluiert.
H. Konzentration / Diafiltration. Fraktionen, die aufgereinigtes NGF aus der SP-Sepharose HP Säule enthalten, wurden vereinigt, konzentriert und in eine finale formulierte Menge ausgetauscht, die Zitrat und NaCl bei einem pH von 5,2 enthält, unter Verwendung einer Amicon YM10 Membran in einer gerührten Zelle. Dieser Schritt wurde bei Raumtemperatur mit einer Konzentration an Proteinen durchgeführt, die unter 5 mg/ml gehalten wurde.
I. Fällung von NGF. Aufgereinigtes NGF zeigte eine Tendenz, unter bestimmten Bedingungen auszufallen. Faktoren, die zu einer gesteigerten Fällung führten, schlossen eine gesteigerte Proteinkonzentration, eine gesteigerte Natriumchloridkonzentrationen, einen gesteigerte pH und eine gesteigerte Temperatur mit ein. In der bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wurde die Proteinkonzentration von NGF Lösungen daher unter 5 mg/ml gehalten, und die Lösungen wurden unter 10°C gekühlt, mit der Ausnahme des Einfrierens der aufgereinigten formulierten Menge.
Beispiel 3
Bestimmung der biologischen Aktivität
Die biologische Aktivität von aufgereinigtem NGF wurde durch das Testen seiner Fähigkeit bestimmt, das Überleben von Neureonen der sympathetischen Kette aus Hühnerembryo in vitro zu fördern.
Kulturen der sympathetischen Kette aus Hühnerembryo und von dorsalen Hauptganglien wurden wie kürzlich beschrieben hergestellt (Collins und Lile (1989) Brain Research 502:99). Kurz beschrieben wurden sympathetische oder dorsale Hauptganglien von fertilen, pathogenfreien Hühnereiern entfernt, die 8–11 Tage bei 38°C in einer befeuchteten Atmosphäre inkubiert wurden. Die Ganglien wurden chemisch zunächst durch Exposition mit Hank's Balanced Salt Solution ohne divalente Kationen für 10 Minuten bei 37°C dissoziiert, wobei die Lösung 10 mM HEPES Puffer pH 7,2 enthielt, und anschließend durch Exposition mit einer Lösung an 0,125% Bactotrypsin 1:250 (Difco, Detroit, Michigan) für 12 Minuten bei 37°C in Hank's Balanced Salt Solution, die wie oben modifiziert wurde. Die Trypsinierung wurde durch Zugabe von fötalem Kälberserum zu einer Endkonzentration von 10% gestoppt. Nach dieser Behandlung wurden die Ganglien auf eine Lösung von Dulbecco's Eaglemedium, das mit viel Glucose modifiziert wurde, kein Bicarbonat enthält, und 10%iges fötales Kälberserum und 10 mM HEPES, pH 7,2 enthält; anschließend wurden sie mechanisch durch ungefähr 10-maliges Verreiben mittels einer Glas-Pasteur-Pipette dissoziiert, wobei die Öffnung der Glaspipette vorher poliert und auf einen solchen Durchmesser eingeschränkt wurde, dass es 2 Sekunden benötigte, um die Pipette zu füllen. Die dissoziierten Ganglien wurden anschließend in einem Kulturmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, 4 mM Glutamin, 60 mG/L Penicillin-G, 25 mM HEPES, pH 7,2) in Gewebekulturplatten mit 100 mm Durchmesser für 3 Stunden ausplattiert (40 dissoziierte Ganglien pro Platte). Dieses Ausplattieren wurde durchgeführt, um die neuronalen Zellen, die an der Platte anhaften, von den Nervenzellen zu trennen, welche nicht anhaften. Nach drei Stunden wurden die nicht-anhaftenden Nervenzellen mittels Zentrifugation gesam melt, im Kulturmedium resuspendiert und mit 50 μl pro Vertiefung bei einer Dichte von 1500 Nervenzellen pro Vertiefung auf den halben Bereich einer Mikrotiterplatte für Gewebekulturen mit 96 Vertiefungen ausplattiert. Die Vertiefungen der Mikrotiterplatten wurden kurz zuvor einer 1 mg/ml Lösung an Poly-L-Ornithin in 10 mM Natriumborat, pH 8,4 über Nacht bei 4°C exponiert, in destilliertem Wasser gewaschen und luftgetrocknet.
10 μl einer seriellen Verdünnung der auf neurotrophe Aktivität zu untersuchenden Probe wurde zu jeder Vertiefung zugegeben und die Daten wurden 20 Stunden bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre enthaltend 7,5% CO₂ inkubiert. Nach 18 Stunden wurden pro Vertiefung 15 μl einer 1,5 mg/ml Lösung des Farbstoffs Tetrazolium MTT in mit Glukose modifiziertes Dulbecco's Eagle Medium ohne Bicarbonat hinzugegeben, welches 10 mM HEPES, pH 7,2 enthält, und die Kulturen wurden in den 37°C Inkubator für 4 Stunden zurückgestellt. Anschließend wurden 75 μl einer Lösung von 6,7 ml 12 M HCl pro Liter Isopropanol zugegeben und die Bestandteile jeder Vertiefung 30-fach zermahlen, um die Zellen aufzubrechen und den Farbstoff zu suspendieren. Die Absorbtion bei 570 nm wurde im Verhältnis zu einer Referenz bei 690 nm für jede Vertiefung unter Verwendung eines automatischen Microtiterplattenlesers (Dynatech, Chantilly, Virginia) bestimmt. Die Absorbtion der Vertiefungen, welche keinerlei neurotrophes Agenz erhielten (Negativkontrolle) wurden von der Absorbtion der Vertiefungen abgezogen, die eine Probe enthalten. Die resultierende Absorbtion ist zu der Anzahl lebenden Zellen pro Vertiefung proportional; diese werden als solche Nervenzellen definiert, die in der Lage sind, den Farbstoff zu reduzieren. Die Konzentration an trophischer Aktivität in trophischen Einheiten (TU) pro ml wurde als diejenige Verdünnung definiert, welche 50% der maximalen Überlebensrate der Nervenzellen ergibt. Falls die Probe bei einer Verdünnung von 1:100.000 eine 50%ige maximale Überlebensrate ergibt, wird der Titer beispielsweise als 100.000 TU/ml definiert. Die spezifische Aktivität wurde durch Teilung der Anzahl der trophischen Einheiten pro ml durch Konzentration an Protein pro ml in der nicht-verdünnten Probe bestimmt.
9 beschreibt das Verfahren dieser Erfindung in einem Fließdiagramm.
Sequenzprotokoll
(1) Allgemeine Information:

(i) Anmelder: Jack Lile Tadahiko Kohno Duane Bonam Man S. Rosendahl
(ii) Titel der Erfindung: Die Herstellung von biologisch aktivem, rekombinantem und neurotrophem Protein
(iii) Anzahl der Sequenzen: 13
(iv) Korrespondenzadresse: (A) Adresse: Swanson & Bratschun, L.L.C. (B) Straße: 8400 E. Prentice Avenue, Suite 200 (C) Stadt: Englewood (D) Staat: USA (E) Postleitzahl: 80111
(v) Computerlesbare Form: (A) Datenträger: Diskette, 3.50 Zoll, 1.44 MB Speicher (B) Computer: IBM kompatibel (C) Betriebssystem: MS-DOS (D) Software: WordPerfect 5.1
(vi) Daten der vorliegenden Anmeldung: (A) Anmeldenummer: (B) Anmeldetag:
(vii) Daten der früheren Anmeldung: (A) Anmeldenummer: 08/266,090 (B) Anmeldetag: 27-Juni-1994
(vii) Daten der früheren Anmeldung: (A) Anmeldenummer: 08/240,122 (B) Anmeldetag: 09-Mai-1994
(vii) Daten der früheren Anmeldung: (A) Anmeldenummer: 08/087,912 (B) Anmeldetag: 06-Juli-1993
(vii) Daten der früheren Anmeldung: (A) Anmeldenummer:07/680,681 (B) Anmeldetag:04-April-1991
(vii) Daten der früheren Anmeldung: (A) Anmeldenummer: 07/594,126 (B) Anmeldetag: 09-Oktober-1990
(vii) Daten der früheren Anmeldung: (A) Anmeldenummer: 07/547,750 (B) Anmeldetag: 02-Juli-1990
(vii) Daten der früheren Anmeldung: (A) Anmeldenummer: 07/505,441 (B) Anmeldetag: 06-April-1990
(viii) Information Anwalt/Agent: (A) Name: Barry J. Swanson (B) Registriernummer: 33,215 (C) Referenznummer: SYNE200/PCT
(ix) Telekommunikation Information: (A) Telefon: (303) 793-3333 (B) Telefax: (303) 793-3433

(2) Information für SEQ ID NO:1:

(i) Sequenzmerkmale: (A) Länge: 742 Basenpaare (B) Art: Nukleinsäure (C) Strangart: einzeln (D) Topologie: linear
(ix) Merkmal: (A) Name/Schlüssel: Nukleinsäure für humanes BDNF
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:1:

(2) Information für SEQ ID NO:2:

(ii) Sequenzmerkmale: (A) Länge: 725 Basenpaare (B) Art: Nukleinsäure (C) Strangart: einzeln (D) Topologie: linear
(ix) Merkmal: (A) Name/Schlüssel: Nukleinsäure für humanes NGF
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:2:

(2) Information für SEQ ID NO:3:

(ii) Sequenzmerkmale: (A) Länge: 247 Aminosäuren (B) Art: Aminosäure (C) Topologie: linear
(ix) Merkmal: (A) Name/Schlüssel: abgeleitete Aminosäuresequenz von humanem BDNF
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:3:

(2) Information für SEQ ID NO:4:

(ii) Sequenzmerkmale: (A) Länge: 247 Aminosäuren (B) Art: Aminosäure (C) Topologie: linear
(ix) Merkmal: (A) Name/Schlüssel: abgeleitete Aminosäuresequenz von humanem NGF
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:4:

(2) Information für SEQ ID NO:5:

(ii) Sequenzmerkmale: (A) Länge: 389 Basenpaare (B) Art: Nukleinsäure (C) Strangart: doppelt (D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:5:

(2) Information für SEQ ID NO:6:

(i) Sequenzmerkmale: (A) Länge: 32 Basenpaare (B) Art: Nukleinsäure (C) Strangart: einzeln (D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:6:

(2) Information für SEQ ID NO:7:

(i) Sequenzmerkmale: (A) Länge: 21 Basenpaare (B) Art: Nukleinsäure (C) Strangart: einzeln (D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:7:

(2) Information für SEQ ID NO:8:

(i) Sequenzmerkmale: (A) Länge: 22 Basenpaare (B) Art: Nukleinsäure (C) Strangart: einzeln (D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:8:

(2) Information für SEQ ID NO:9:

(i) Sequenzmerkmale: (A) Länge: 35 Basenpaare (B) Art: Nukleinsäure (C) Strangart: einzeln (D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:9:

(2) Information für SEQ ID NO:10

(i) Sequenzmerkmale: (A) Länge: 43 Basenpaare (B) Art: Nukleinsäure (C) Strangart: einzeln (D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:10:

(2) Information für SEQ ID NO:11

(i) Sequenzmerkmale: (A) Länge: 119 Basenpaare (B) Art: Nukleinsäure (C) Strangart: einzeln (D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:11:

(2) Information für SEQ ID NO:12

(i) Sequenzmerkmale: (A) Länge: 691 Basenpaare (B) Art: Nukleinsäure (C) Strangart: einzeln (D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:12:

(2) Information für SEQ ID NO:13

(i) Sequenzmerkmale: (A) Länge: 33 Basenpaare (B) Art: Nukleinsäure (C) Strangart: einzeln (D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:13:

Claims

Ein Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven rekombinanten neurotrophen Faktors, wobei der genannte neurotrophe Faktor aus der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus NGF, BDNF, NT3 und NT4, umfassend: a) Exprimieren eines für den neurotrophen Faktor kodierenden Gens in einem bakteriellen Expressionssystem, wobei das Protein des genannten neurotrophen Faktors hergestellt wird; b) Lösen des genannten neurotrophen Faktors in Harnstoff; c) Sulfonylieren des genannten gelösten neurotrophen Faktors; d) Isolieren und Aufreinigen des sulfonylierten neurotrophen Faktors mittels Anionenaustauschchromatographie; e) Ermöglichen der Rückfaltung des sulfonylierten neurotrophen Faktors in der Anwesenheit von 4.5–5.5 M Harnstoff, um den biologisch aktiven neurotrophen Faktor zu erhalten; und f) Aufreinigen des biologisch aktiven neurotrophen Faktors mittels Kationenaustauschchromatographie.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Gen des genannten neurotrophen Faktors eine DNA umfasst, die für humanes NGF kodiert.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das genannte Gen des neurotrophen Faktors eine DNA umfasst, die für tierisches NGF kodiert.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Gen des neurotrophen Faktors die Sequenz gemäß 1 umfasst (SEQ ID NO:1).
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das neurotrophe Gen die DNA umfasst, die für humanes BDNF kodiert.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das neurotrophe Gen die Sequenz gemäß 1 umfasst (SEQ ID NO:2).
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der genannte neurotrophe Faktor in Schritt b) in 8 M Harnstoff gelöst wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei sich der genannte neurotrophe Faktor in Schritt e) in der Anwesenheit von Polyethylenglykol (PEG) mit einem Molekulargewicht von 200–300 rückfaltet.
Das Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei das PEG in der Konzentration von 15–20% (Gewicht/Volumen) vorhanden ist, die finale Proteinkonzentration des neurotrophen Faktors etwa 0,1 mg/ml beträgt, und der Rückfaltungsschritt bei einer Temperatur von etwa 10°C stattfindet.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, 7 oder 8, wobei die Rückfaltung durch die Zugabe von entweder L-Cystein oder Cysteamin gestartet wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der sulfonylierte neurotrophe Faktor unter Verwendung einer Aufkonzentrierung und Diafiltrierung isoliert und aufgereinigt wird.
Ein Verfahren für die Herstellung eines biologisch aktiven rekombinanten neurotrophen Faktors, wobei der genannte neurotrophe Faktor ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus NGF, BDNF, NT3 und NT4, umfassend: a) Konstruieren eines synthetischen DNA-Gens des neurotrophen Faktors, um ein E. coli Expressionssystem dahin zu bringen, einen neurotrophen Faktor herzustellen; b) Exprimieren des genannten neurotrophen Faktors im E. coli Expressionssystem; c) Lösen und Sulfonylieren des genannten neurotrophen Faktors; d) Aufreinigen des genannten gelösten und sulfonylierten neurotrophen Faktors unter Verwendung einer Anionenaustauschchromatographie; e) Rückfaltung des aufgereinigten und sulfonylierten neurotrophen Faktors in einer solchen Weise, dass die für die volle biologische Aktivität notwendige Tertiärstruktur erhalten wird; und f) Aufreinigen des biologisch voll aktiven neurotrophen Faktors mittels Kationenaustauschchromatographie.
Das Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das genannte Gen des neurotrophen Faktors eine DNA umfasst, die für humanes NGF kodiert.
Das Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das genannte Gen des neurotrophen Faktors eine DNA umfasst, die für tierisches NGF kodiert.
Das Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das Gen des neurotrophen Faktors die Sequenz gemäß 1 umfasst (SEQ ID NO:1).
Das Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das neurotrophe Gen eine DNA umfasst, die für humanes BDNF kodiert.
Das Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das neurotrophe Gen die Sequenz gemäß 1 kodiert (SEQ ID NO:2).
Das Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei der genannte neurotrophe Faktor mit 8 M Harnstoff gelöst wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei sich der genannte neurotrophe Faktor in der Anwesenheit von Polyethylenglykol (PEG) mit einem Molekulargewicht von 200–300 rückfaltet.
Das Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei PEG in der Konzentration von etwa 20% (Gewicht/Volumen) vorhanden ist, Harnstoff im Konzentrationsbe reich von 4.5–5.5 M vorhanden ist, die finale Proteinkonzentration des neurotrophen Faktors etwa 0,1 mg/ml beträgt, und der Rückfaltungsschritt bei einer Temperatur von etwa 10°C stattfindet.
Das Verfahren gemäß Anspruch 12, 18 oder 19, wobei die Rückfaltung durch die Zugabe entweder von L-Cystein oder Cysteamin gestartet wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei der sulfonylierte neurotrophe Faktor durch Verwendung von Aufkonzentrierung und Diafiltrierung isoliert und aufgereinigt wird.