ES2230549T3 - Produccion de proteina neurotrofica recombinadabiologicamente activa. - Google Patents
Produccion de proteina neurotrofica recombinadabiologicamente activa.Info
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- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
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Abstract
SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCION DE FACTOR NEUROTROFICO RECOMBINANTE BIOLOGICAMENTE ACTIVO DE LA FAMILIA NGF/BDNF. EL PROCEDIMIENTO SE COMPONE DE: A) CONSTRUCCION DE UN GEN NEUROTROFICO SINTETICO ADECUADO PARA EXPRESION EN UN SISTEMA DE EXPRESION BACTERIANO; B) EL GEN DE FACTOR NEUROTROFICO SINTETICO SE EXPRESA EN UN SISTEMA DE EXPRESION BACTERIANO; C) EL FACTOR NEUROTROFICO ES SOLUBILIZADO Y SULFONILADO; D) SE PERMITE QUE EL FACTOR NEUROTROFICO SULFONILADO SE VUELVA A PLEGAR EN PRESENCIA DE UN POLIETILENGLICOL Y UREA; Y E) EL FACTOR NEUROTROFICO BIOLOGICAMENTE ACTIVO ES AISLADO Y PURIFICADO.
Description
Producción de proteína neurotrófica recombinada
biológicamente activa.
Esta invención se refiere a procesos para la
producción de factores de crecimiento nervioso recombinantes de la
familia de NGF/BDNF. Específicamente, la presente invención
describe un método para producir NGF, BDNF, NT3 y NT4 recombinantes
biológicamente activos.
Los factores neurotróficos son proteínas
naturales encontradas en el sistema nervioso o en tejidos no
nerviosos inervados por el sistema nervioso, cuya función es
estimular la supervivencia y mantener la diferenciación fenotípica
de las células nerviosas y/o gliales (Varon y Bunge (1978) Ann. Rev.
Neurosc. 1:327; Thoenen y Edgar (1985) Science
229:238). Estudios in vivo han mostrado que una
variedad de factores neurotróficos endógenos y exógenos presentan
un efecto trófico sobre células neuronales después de un daño
isquémico, hipóxico u otro daño inducido por una enfermedad.
Ejemplos de factores neurotróficos específicos incluyen el factor
de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), el factor de
crecimiento de fibroblastos ácido (aFGF), el factor de crecimiento
nervioso (NGF), el factor neurotrófico ciliar (CNTF), el factor
neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), la neurotrofina 3 (NT3),
la neurotrofina 4 (NT4) y los factores de crecimiento similares a
insulina I y II (IGF-I, IGF-II).
Se cree que algunos factores neurotróficos, tales
como bFGF y CNTF, tienen amplios efectos tróficos, estimulando la
supervivencia o proporcionando una función de mantenimiento para
muchos tipos diferentes de células neuronales. Otros factores
neurotróficos tienen un efecto trófico más estrecho, más
específico, y estimulan la supervivencia de un menor número de tipos
de células. Por ejemplo, en el sistema nervioso periférico NGF
estimula la supervivencia neuronal y la extensión axonal de ciertos
tipos celulares neuronales específicos tales como las neuronas
sensoriales y simpáticas (Ebendal y col. (1984) Celular and
Molecular Biology of Neuronal Development, Capítulo 15, ed.
Black, I.B.). Sin embargo, en el sistema nervioso central (SNC),
NGF apoya también la supervivencia de neuronas colinérgicas en el
complejo del cerebro anterior basal (Whittemore y col. (1987) Brain
Res. Rev. 12:439-464).
El BDNF, una proteína básica de peso molecular
12.300, apoya a algunas neuronas sensoriales que no responden a NGF
(Barde y col. (1982) EMBO J. 1:549-553 y
Hofer y Barde (1988) Nature 331:261-262). La
neurotrofina 3 (NT3) apoya la supervivencia de neuronas de los
ganglios de la raíz dorsal y de neuronas propioceptivas del núcleo
mesencefálico trigeminal. El CNTF, una proteína de peso molecular
23.000 aproximadamente, apoya a las neuronas de los ganglios
ciliares del sistema nervioso parasimpático, a las neuronas
simpáticas, a las neuronas de los ganglios de la raíz dorsal del
sistema nervioso sensorial y a las neuronas motoras del SNC (Kandel
y col. (1991) Principles of Neural Science, 3ª Ed., Elsevier
Science Publishing Co., Inc., NY).
Algunos factores neurotróficos constituyen una
familia de factores neurotróficos caracterizados por una homología
de aminoácidos del 50% aproximadamente. Una familia tal es la
familia de NGF/BDNF, que incluye BDNF, NGF, NT3 y NT4 (Hohn y col.,
WO 91/03569; Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 07/680.681).
NGF y BDNF son sintetizados ambos aparentemente como formas
precursoras más grandes que son procesadas posteriormente, mediante
cortes proteolíticos, para producir el factor neurotrófico maduro
(Edwards y col. (1986) Nature 319:784; Leibrock y col.
(1989) Nature 319:149). Existe una similitud significativa
entre las secuencias de aminoácidos de los NGFs maduros y del BDNF
maduro, incluyendo la posición relativa de los seis residuos del
aminoácido cisteína, que es idéntica en los NGFs maduros y en el
BDNF maduro de todas las especies examinadas (Leibrock y col. (1989)
supra). Ver la Figura 2, que compara y enfatiza las
similitudes de las formas humanas de BDNF (SEC ID Nº:3) y NGF (SEC
ID Nº:4). Esto sugiere que las estructuras tridimensionales de las
proteínas maduras, determinadas por la posición de los enlaces
disulfuro, son similares. Las proteínas NGFs y BDNF maduras
comparten también un punto isoeléctrico (pI) básico.
NGF es un factor neurotrófico al menos para las
neuronas colinérgicas del cerebro anterior basal (Hefti y Will
(1987) J. Neural Transm. [Suplemento] (AUSTRIA) 24:309). Se
cree que la inactivación funcional y la degeneración de las
neuronas colinérgicas del cerebro anterior basal sensibles a NGF en
el curso de la enfermedad de Alzheimer son la causa inmediata de
los déficits cognitivos y de memoria asociados con esa enfermedad
(Hefti y Will (1987) supra). Se ha demostrado que el NGF
impide la degeneración y restaura la función de las neuronas
colinérgicas del cerebro anterior basal en modelos animales
relacionados con la enfermedad de Alzheimer, y sobre esta base se
ha propuesto como tratamiento para prevenir la degeneración y
restaurar la función de estas neuronas en la enfermedad de
Alzheimer (Williams y col. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83:9231; Hefti (1986) J. Neuroscience 6:2155; Kromer
(1987) Science 235:214; Fischer y col. (1987) Nature
329:65).
El BDNF es un factor neurotrófico para las
neuronas sensoriales del sistema nervioso periférico (Barde (1989)
Neuron 2:1525). Sobre esta base, el BDNF puede demostrar ser
útil para el tratamiento de la pérdida de sensación asociada con el
daño a las células nerviosas sensoriales que tiene lugar en
diferentes neuropatías periféricas (Schaumberg y col. (1983) en
Disorders of Peripheral Nerves, F.A. Davis Co.,
Philadelphia, PA).
Para que un factor neurotrófico particular sea
potencialmente útil en el tratamiento del daño nervioso, debe estar
disponible en cantidad suficiente para ser utilizado como
tratamiento farmacéutico. Además, como los factores neurotróficos
son proteínas, es deseable administrar a pacientes humanos
solamente la forma humana de la proteína con el fin de evitar una
respuesta inmunológica hacia una proteína foránea. Como los factores
neurotróficos están presentes típicamente en los tejidos en
pequeñas cantidades efímeras (por ejemplo, Hofer y Barde (1988)
Nature 331:261; Lin y col. (1989) Science 246:1023) y
como los tejidos humanos no están fácilmente disponibles para
extracción, sería poco práctico preparar cantidades farmacéuticas
de factores neurotróficos humanos a partir de tejidos humanos
directamente. Como alternativa, es deseable utilizar el gen humano
aislado que codifica el factor neurotrófico en un sistema de
expresión recombinante para producir cantidades potencialmente
ilimitadas de la proteína humana.
Pueden producirse factores neurotróficos maduros,
biológicamente activos, cuando los genes de factores neurotróficos
humanos o animales son expresados en sistemas de expresión de
células eucarióticas (por ejemplo, Edwards y col. (1988) Molec.
Cell. Biol. 8:2456). En tales sistemas, se sintetiza
primeramente el precursor del factor neurotrófico de longitud
completa y luego se procesa proteolíticamente para producir el
factor neurotrófico maduro, que es plegado tridimensionalmente de
manera correcta y que es totalmente activo biológicamente. Sin
embargo, los sistemas de expresión de células eucarióticas producen
a menudo rendimientos de proteína por gramo de células
relativamente bajos y son relativamente caros para utilizarlos en la
fabricación.
En contraste, los sistemas de expresión que
utilizan células procarióticas, tales como bacterias, producen
generalmente cantidades relativamente grandes de proteína expresada
por gramo de células y son relativamente baratos para ser
utilizados en la fabricación. Sin embargo, la obtención de factores
neurotróficos biológicamente activos expresados en bacterias ha
sido un obstáculo importante en este campo. Las bacterias no son
capaces de procesar correctamente las proteínas precursoras, tal
como la proteínas precursora del NGF, mediante la producción de los
cortes proteolíticos apropiados para producir la proteína madura
más pequeña correcta. Por tanto, para producir un factor
neurotrófico maduro en bacterias, es necesario expresar solamente
aquella porción de la secuencia de ADN que codifica la proteína
madura y no la que codifica la forma precursora más grande. Cuando
esto se realizó en E. coli, se produjeron cantidades
relativamente grandes de la proteína NGF humana madura (ver, por
ejemplo, Iwai y col. (1986) Chem. Pharm. Bull. 34:4724; Dicou
y col. (1989) J. Neurosci. Res. 22:13; Solicitud de Patente
Europea 121.338). Desgraciadamente, la proteína expresada
bacterianamente no tenía una actividad biológica aparente.
La producción bacteriana de proteínas
recombinantes de mamífero tiene a menudo como resultado proteínas
biológicamente inactivas que forman cuerpos de inclusión. Esto
necesita la separación de los cuerpos de inclusión de los otros
componentes celulares y la solubilización de los cuerpos de
inclusión para desplegar la proteína (Spalding (1991) Biotechnology
9:229). La razón probable de esta falta de actividad
biológica es que la proteína madura es incapaz de asumir
espontáneamente la estructura tridimensional correcta y formar el
patrón correcto de enlaces disulfuro intramoleculares requerido para
la actividad biológica completa. El procesamiento incluye la
separación y solubilización de los cuerpos de inclusión, el
desplegamiento de la proteína, volviendo a plegar posteriormente la
proteína para dar la estructura terciaria correcta biológicamente
activa. Sin embargo, durante el replegamiento, la proteína puede
reagregarse, reduciendo el rendimiento de proteína activa y
complicando adicionalmente el proceso de purificación (Spalding
(1991) supra).
Se han descrito protocolos para desplegar y
replegar NGF (por ejemplo, Solicitud de Patente Europea 336.324;
Patentes de EE.UU. N^{os} 4.551.503 y 4.620.948). Sin embargo,
estos protocolos tienen serias deficiencias. Muchos protocolos
utilizan la exposición de NGF a un pH elevado para romper los
enlaces disulfuro formados incorrectamente, seguido por la
exposición a un pH más bajo para permitir la formación de los
enlaces disulfuro intramoleculares correctos. Se sabe que la
exposición de NGF a un pH elevado tiene como resultado una extensa
modificación de la proteína, incluyendo la eliminación de las
cadenas laterales de amina de la glutamina y la asparragina (de las
cuales hay 7 en el NGF humano maduro) y una extensa alteración
química de los pares adyacentes
asparragina-glicina,
asparragina-serina y
asparragina-treonina (de los cuales hay 2 en el NGF
humano maduro). Además de estas modificaciones químicas, el
procedimiento de replegamiento parecía restaurar sólo una décima
parte aproximadamente de la actividad biológica del NGF. Aunque
existen numerosos protocolos para replegar y renaturalizar proteínas
que no implican condiciones arduas, ninguno de tales procedimientos
ha sido aplicado con éxito al NGF. Para una revisión general de
procedimientos de replegamiento, ver Kohno (1990) Methods Enzymol.
185:187.
Se han utilizado varios métodos para mejorar la
recuperación de proteínas biológicamente activas producidas en un
sistema de expresión bacteriano. Un método para cortar enlaces
disulfuro formados incorrectamente es la utilización de proteínas
S-sulfonadas obtenidas mediante sulfitolisis
(Patente de EE.UU Nº 4.421.685; Gonzalez y Damodaran (1990) J.
Agric. Food Chem. 38: 149; Solicitud de Patente Europea
361.830). La adición de sulfito a una proteína corta inicialmente
los enlaces disulfuro expuestos a la solución, teniendo como
resultado la formación de un derivado
S-SO_{3}^{-} y un grupo SH libre por cada puente
disulfuro cortado. En presencia de un agente oxidante, los grupos
SH libres son oxidados de nuevo a disulfuro, que es vuelto a cortar
por el sulfito presente en el sistema. El ciclo de reacción se
repite hasta que todos los enlaces disulfuro y todos los grupos
sulfhidrilo de la proteína son convertidos en
cys-SO_{3}^{-}. Generalmente, esto permite que
la mayoría de las proteínas sean solubilizadas totalmente (Solicitud
de Patente Europea 361.830).
Otro método para mejorar la recuperación de
proteína biológicamente activa procedente de sistemas de expresión
bacterianos, incluye la utilización de polietilén glicol (PEG) en
la mezcla de replegamiento. Se ha propuesto que la adición de PEG
impide la agregación de la proteína resultante de la asociación de
productos intermedios hidrofóbicos en la ruta de replegamiento.
Cleland y col. (1990) Biotechnology 8:1274 y (1992) J. Biol.
Chem. 267:13327, describieron la recuperación mejorada de
anhidrasa carbónica B (CAB) bovina biológicamente activa con la
adición de PEG durante el proceso de replegamiento. La
concentración de PEG requerida para conseguir un incremento de la
recuperación de proteína activa era dos veces la concentración de
proteína total, y requería PEG con pesos moleculares de
1000-8000 (Cleland y col. (1992) supra).
Un sistema de expresión bacteriano para la
producción de NGF está descrito en la Patente Canadiense Nº
1.220.736 y en la Patente de EE.UU. Nº 5.169.762. Sin embargo, no
se presentan procedimientos para el replegamiento de la proteína
expresada. Un procedimiento para la producción de grandes
cantidades de NGF recombinante biológicamente activo adecuado para
uso farmacéutico, está descrito en la Solicitud de Patente de
EE.UU. Nº de Serie 08/071.912, registrada el 6 de Julio de 1993 por
Collins y col., titulada: Production of Biologically Active,
Recombinant Members of the NGF/BDNF Family of Neurotrophic
Proteins. La proteína es expuesta a un desnaturalizante, tal
como clorhidrato de guanidina o urea, y a un agente reductor
suficiente, tal como \beta-mercaptoetanol,
ditiotreitol o cisteína, con el fin de desnaturalizar la proteína,
romper las interacciones no covalentes y reducir los enlaces
disulfuro. Los tioles libres presentes en la proteína reducida son
oxidados posteriormente y se deja que la proteína forme los enlaces
disulfuro correctos. La mezcla de replegamiento contenía
preferiblemente hasta un 25% de PEG 200 ó 300.
Aunque el procedimiento descrito en la Solicitud
de Patente de EE.UU. Nº de Serie 08/087.912 consigue rendimientos
mejorados de NGF biológicamente activo, permanece la necesidad de
un medio más eficaz para replegar NGF. La producción bacteriana de
proteínas recombinantes tiene como resultado proteínas
biológicamente inactivas encontradas como cuerpos de inclusión en
la célula bacteriana. Existe la necesidad de métodos de
procesamiento mejorados para separar los cuerpos de inclusión de los
demás componentes celulares y solubilizar los cuerpos de inclusión
para desplegar la proteína. Además, existe la necesidad de métodos
mejorados para romper los enlaces disulfuro formados
incorrectamente y replegar la proteína en la estructura terciaria
correcta requerida para el rendimiento máximo de proteína totalmente
activa mientras se disminuye la modificación química de la
proteína.
La presente descripción presenta un método
extendido y mejorado para producir miembros biológicamente activos,
expresados bacterianamente, de la familia de factores neurotróficos
NGF/BDNF, incluyendo la primera utilización del proceso de
sulfitolisis para solubilizar y modificar químicamente un factor
neurotrófico.
La presente invención describe un proceso para la
producción de proteínas maduras de la familia de NGF/BDNF en una
forma totalmente activa biológicamente adecuada para uso
terapéutico, que comprende:
a) la expresión de un gen que codifica el factor
neurotrófico en un sistema de expresión bacteriano en el que se
produce dicha proteína factor neurotrófico;
b) la solubilización de dicho factor neurotrófico
en urea;
c) la sulfonilación de dicho factor
neurotrófico;
d) el aislamiento y la purificación del factor
neurotrófico sulfonilado;
e) el permitir que el factor neurotrófico
sulfonilado se repliegue para dar el factor neurotrófico
biológicamente activo; y
f) la purificación del factor neurotrófico
biológicamente activo.
El factor neurotrófico sulfonilado es purificado
mediante cromatografía de intercambio aniónico y replegado en
presencia de polietilén glicol 300 (PEG 300) al 20%. El factor
neurotrófico replegado es purificado mediante cromatografía de
intercambio catiónico.
Debe comprenderse que la descripción general
anterior y la descripción detallada siguiente son ambas solamente
ejemplares y explicatorias, y no son limitantes de la invención,
según está reivindicada. Las figuras acompañantes, que son
incorporadas a la especificación y constituyen una parte de la
misma, ilustran varias realizaciones de la invención y, junto con la
descripción, sirven para explicar los principios de la
invención.
La Fig. 1 compara las secuencias de ácidos
nucleicos del BDNF (SEC ID Nº:1) y del NGF (SEC ID Nº:2) humanos.
Los huecos, indicados por rayas, corresponden a la posición de los
huecos utilizados para alinear las secuencias de aminoácidos.
La Fig. 2 compara las secuencias de aminoácidos
del BDNF (SEC ID Nº:3) y del NGF (SEC ID Nº:4) humanos. Las
secuencias deducidas de las proteínas maduras están en negrita. Los
huecos, indicados por rayas, fueron colocados en las secuencias
para incrementar la alineación. Las seis cisteínas encontradas en
BDNF y NGF se encuentran en las mismas posiciones y están entre
paréntesis.
La Fig. 3 muestra la secuencia del NGF sintética
(SEC ID Nº:5) insertada en E. coli y expresada como la
proteína NGF madura.
La Fig. 4 muestra las secuencias de Mut1 (SEC ID
Nº:6), Mut2 (SEC ID Nº:7) y Mut3 (SEC ID Nº:8), oligonucleótidos
utilizados para corregir la secuencia de NGF.
La Fig. 5 muestra la secuencia del
oligonucleótido Syn NGF 5P utilizado para producir una expresión
incrementada de NGF (SEC ID Nº:9).
La Fig. 6 muestra las secuencias de los
oligonucleótidos TP NGF (SEC ID Nº:10) y REP NGF (SEC ID Nº:11)
utilizados para producir la construcción TP (proteína de unión a
TNF) NGF REP.
La Fig. 7 muestra la secuencia de ácido nucleico
de TP \Delta53 (SEC ID Nº:12).
La Fig. 8 muestra la secuencia oligonucleotídica
utilizada para producir la construcción TP
NGF(2startC)REP (SEC ID Nº:13).
La Fig. 9 muestra un diagrama de flujo del
proceso de esta invención.
A continuación se hará referencia con detalle a
las realizaciones actualmente preferidas de la invención que, junto
con los ejemplos siguientes, sirven para explicar los principios de
la invención.
La presente invención es un método extendido y
mejorado para producir factores neurotróficos biológicamente
activos de la familia de NGF/BDNF expresados en bacterias, a partir
del descrito en la solicitud anterior, Solicitud de Patente de
EE.UU. Nº de Serie 08/087.912, incorporada específicamente a la
presente por referencia.
El método de producción de esta invención para
obtener el factor neurotrófico humano recombinante maduro,
totalmente activo biológicamente, de la familia de NGF/BDNF está
compuesto por:
a) la expresión del factor neurotrófico en un
sistema de expresión bacteriano;
b) la solubilización y la sulfonilación del
factor neurotrófico;
c) el replegamiento del factor neurotrófico
sulfonilado de tal manera que se obtenga la estructura terciaria
correcta necesaria para la actividad biológica completa; y
d) la purificación del factor neurotrófico
totalmente activo biológicamente.
La presente invención se refiere a un método
mejorado para la producción eficaz de factores neurotróficos
recombinantes de la familia del factor de crecimiento nervioso
(NGF) y del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF). La
invención aquí descrita es un proceso para producir una
"familia" de factores de crecimiento neurotróficos en forma
pura y biológicamente activa adecuada para uso terapéutico. El NGF
es un miembro de una familia de proteínas neurotróficas
relacionadas estructuralmente que es probable que difieran en su
papel fisiológico en el organismo, afectando cada miembro a un
grupo diferente de neuronas sensibles. Los miembros conocidos de la
familia de NGF incluyen NGF, BDNF, NT3 y NT4. Cada uno de estos
miembros tiene una homología significativa y un número idéntico de
residuos de cisteína y su posición. La presente invención incluye
proteínas recombinantes que codifican proteínas que no son
idénticas al NGF o al BDNF humanos pero que están claramente
relacionadas con NGF o con BDNF con respecto a las posibles
características que definen la familia. Tales características pueden
incluir una o más de las siguientes: actividad neurotrófica en un
bioensayo apropiado; homología significativa de la secuencia de
aminoácidos, incluyendo identidades de aminoácidos y sustituciones
conservadoras; posición conservada de residuos de cisteína en la
secuencia de aminoácidos; secuencias señal hidrofóbicas para la
secreción de la proteína; secuencias señal para el procesamiento
proteolítico hacia una forma madura y/o un punto isoeléctrico
básico de la proteína procesada.
Según se utiliza en la descripción, el término
"actividad biológica", cuando se aplica a NGF, indica
proteínas que tienen la actividad biológica del NGF, esto es, por
ejemplo, la capacidad de estimular la supervivencia de las neuronas
de los ganglios de la cadena simpática y de la raíz dorsal del
embrión de pollo en el bioensayo descrito en el Ejemplo 3. Para
otros miembros de la familia de NGF/BDNF, "actividad biológica"
indica actividad neurotrófica en el bioensayo apropiado.
Esta invención incluye la producción de proteínas
neurotróficas de cualquier origen que sean equivalentes
biológicamente a las proteínas neurotróficas de la familia de
NGF/BDNF. En la realización preferida, esta invención incluye
proteínas neurotróficas humanas maduras. A lo largo de toda esta
especificación, cualquier referencia a una proteína neurotrófica
debe ser considerada como una referencia a las proteínas
identificadas y descritas en la presente como miembros de la
familia de proteínas neurotróficas NGF/BDNF.
Por el término "biológicamente
equivalentes", utilizado a lo largo de la especificación y de
las reivindicaciones, queremos indicar composiciones de la presente
invención que son capaces de estimular la supervivencia y el
mantenimiento de la diferenciación fenotípica de las células
nerviosas o gliales, pero no necesariamente en el mismo grado que
las proteínas neurotróficas nativas descritas en la presente. Las
composiciones biológicamente equivalentes incluyen fragmentos de
proteínas que presentan una actividad neurotrófica similar a la de
la familia de NGF/BDNF. Están también abarcadas por la presente
invención las secuencias de aminoácidos mostradas en la Figura 2 y
aquéllas sustancialmente homólogas con 1, 2 3 ó 4 cambios o
deleciones de residuos de aminoácidos que no alteran
sustancialmente la actividad neurotrófica. Esta invención incluye
además secuencias modificadas químicamente sustancialmente homólogas
a las mostradas en la Figura 2, por ejemplo, mediante la adición de
polietilén glicol.
Por "sustancialmente homólogas", según se
utiliza a lo largo de la presente especificación y de las
reivindicaciones, se indica un grado de homología con las proteínas
neurotróficas nativas superior al presentado por cualquier proteína
neurotrófica previamente descrita. Preferiblemente, el grado de
homología es superior al 70%, más preferiblemente superior al 80% e
incluso más preferiblemente superior al 90%, al 95% o al 99%. Un
grupo particularmente preferido de proteínas neurotróficas son más
de un 95% homólogas a las proteínas nativas. El porcentaje de
homología, según se describe en la presente, se calcula como el
porcentaje de residuos de aminoácidos encontrados en la más pequeña
de las dos secuencias que se alinean con residuos de aminoácidos
idénticos de la secuencia que está siendo comparada, cuando pueden
introducirse cuatro huecos en una longitud de 100 aminoácidos para
ayudar a esa alineación, según está descrito por Dayhoff, en
Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5, p. 124
(1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C.,
que se incorpora específicamente a la presente por referencia. Están
también incluidas como sustancialmente homólogas aquellas proteínas
neurotróficas que pueden ser aisladas en virtud de su reactividad
cruzada con anticuerpos hacia la proteína descrita o cuyos genes
pueden ser aislados mediante hibridación con el gen o con segmentos
de la proteína descrita.
Los miembros de la familia de factores
neurotróficos NGF/BDNF son producidos naturalmente como formas
precursoras más grandes que son procesadas posteriormente mediante
cortes proteolíticos para producir la proteína "madura"
(Edwards y col. (1986) supra; Leibrock y col. (1989)
supra). Debido a que los sistemas de expresión bacterianos
son incapaces de procesar correctamente la forma precursora de la
proteína, solamente aquella porción de la secuencia de ADN que
codifica la proteína madura es expresada en un sistema de expresión
bacteriano.
En una realización de la presente invención, se
construye una secuencia de ADN de NGF sintética que es optimizada
para la producción en un sistema de expresión de E. coli. El
gen sintético de NGF puede ser construido con una secuencia de ADN
que codifique NGF humano o animal. El gen sintético de NGF es
clonado en un vector capaz de ser transferido a, y replicado en, la
célula huésped, conteniendo tal vector los elementos operativos
necesarios para expresar la secuencia de ADN. La construcción de un
gen sintético de NGF preferido y el clonaje en un vector adecuado
para la transferencia a un sistema de expresión de E. coli
se describen en el Ejemplo 1. Esta invención incluye la utilización
de un gen de un factor neurotrófico sintético de la familia de
NGF/BDNF, así como un gen sintético con una homología sustancial a
un gen de la familia de NGF/BDNF.
Puede utilizarse una secuencia de ADN natural o
sintética para dirigir la producción de NGF. El gen sintético de
NGF descrito en el Ejemplo 1, mostrado en la Figura 3 (SEC ID
Nº:5), fue diseñado específicamente para dirigir la expresión de la
proteína NGF humana madura en un sistema de expresión bacteriano.
Los codones para ciertos aminoácidos fueron optimizados para la
expresión en E. coli, así como para crear sitios de
restricción con el fin de facilitar las etapas de clonaje
posteriores. El método de expresión general comprendía:
1. la preparación de una secuencia de ADN capaz
de dirigir a E. coli para que produzca NGF maduro
humano;
2. el clonaje de la secuencia de ADN en un vector
capaz de ser transferido a, y replicado en, E. coli,
conteniendo tal vector elementos operativos necesarios para
expresar la secuencia de NGF;
3. la transferencia del vector que contiene la
secuencia de ADN sintética y los elementos operativos a células
huésped de E. coli; y
4. el cultivo de las células huésped de E.
coli bajo condiciones adecuadas para la amplificación del
vector y la expresión de NGF.
Las células huésped son cultivadas bajo
condiciones apropiadas para la expresión de NGF. Estas condiciones
son generalmente específicas para la célula huésped y son
determinadas fácilmente por una persona con experiencia habitual en
la técnica a la luz de la literatura publicada concerniente a las
condiciones de crecimiento de tales células y de las descripciones
contenidas en la presente. Por ejemplo, el Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology, 8ª Ed., Williams & Wilkins Company,
Baltimore, Maryland, que se incorpora específicamente a la presente
por referencia, contiene información sobre el cultivo de bacterias.
En la realización preferida de la presente invención, NGF es
producido en un sistema de expresión de E. coli. La presente
invención incluye la utilización de este método de producción para
producir cualquier factor neurotrófico de la familia de
NGF/BDNF.
Un método para la producción de miembros
recombinantes de la familia de proteínas neurotróficas humanas
NGF/BDNF en formas biológicamente activas está descrito en la
Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 08/087.912 (Collins y
col.). Collins y col. describen un método para plegar de nuevo y
renaturalizar miembros maduros humanos recombinantes de la familia
de proteínas neurotróficas NGF/BDNF. Todos los enlaces disulfuro
intramoleculares o intermoleculares y/o todas las interacciones no
covalentes que hayan tenido lugar implicando a la proteína
neurotrófica madura producida en un microorganismo, son primeramente
alterados. Para realizar esto, la proteína es expuesta a un
desnaturalizante suficiente tal como clorhidrato de guanidina o
urea, y a un agente reductor suficiente tal como
\beta-mercaptoetanol, ditiotreitol o cisteína,
para desnaturalizar la proteína, romper las interacciones no
covalentes y reducir los enlaces disulfuro. Una vez que la proteína
neurotrófica madura ha sido desnaturalizada y reducida, los tioles
libres presentes en la proteína reducida son oxidados mediante la
adición de un exceso grande de un reactivo que contenga disulfuro,
tal como glutation o cistina. Esta reacción produce enlaces
disulfuro mixtos en los que cada residuo de cisteína de la proteína
neurotrófica madura forma un enlace disulfuro con la forma
monomérica del agente oxidante. El agente desnaturalizante y el
agente oxidante son posteriormente diluidos hasta una concentración
definitiva y se añade un reactivo que contenga tiol, tal como
cisteína, para catalizar el intercambio de disulfuros. Esto crea un
entorno en el que la concentración de desnaturalizante está
reducida suficientemente para permitir que la proteína neurotrófica
asuma varias configuraciones tridimensionales, y en el que el
potencial de oxidación/reducción es ajustado para permitir la
formación y la ruptura de enlaces disulfuro. Se asume que una
proporción significativa de la proteína neurotrófica formará el
patrón correcto de enlaces disulfuro intramoleculares y, por tanto,
la estructura tridimensional correcta, y conseguirá la actividad
biológica. Collins y col. describen además la utilización de hasta
un 25% de polietilén glicol (PEG) 200, 300 ó 1000 añadido a la
mezcla de replegamiento final. En presencia de PEG, se obtiene un
incremento mayor del 30% de la cantidad de NGF replegado
correctamente, biológicamente activo. El método de Collins y col.
representa una mejora sobre las condiciones rigurosas de los
métodos de la técnica anterior, consiguiendo proteína con hasta un
50% de actividad biológica.
El método de producción de la presente invención
representa una extensión y una mejora sobre el método descrito por
Collins y col. en varios aspectos. Se utiliza el proceso de
sulfitolisis para solubilizar la proteína insoluble producida en
E. coli. La sulfitolisis proporciona varias ventajas
importantes al proceso de purificación del NGF sobre todos los
métodos de la técnica anterior. El sulfito de sodio es un potente
reductor y funciona al menos tan bien como el
2-mercaptoetanol o el ditiotreitol para solubilizar
NGF de los sólidos lavados. El NGF totalmente reducido en presencia
de urea no se separa como un pico claro en las resinas
cromatográficas. En contraste, el NGF sulfonilado presenta una
mejora notable de la resolución en resinas de intercambio iónico.
Además, la sulfitolisis proporciona una carga negativa a la
proteína por cada cisteína que ha sido modificada. Cada monómero de
NGF contiene seis residuos de cisteína y, por tanto, la forma
monomérica totalmente sulfonilada contiene seis cargas negativas
adicionales. Esto representa varias ventajas: 1) el incremento de
la carga total de cada monómero incrementa su hidrofilicidad y su
solubilidad; 2) las cargas negativas adicionales disminuyen el
punto isoeléctrico eficaz de la proteína. Esto permite la
utilización de cromatografía de intercambio aniónico a un pH más
bajo del que es posible con la forma de la proteína totalmente
reducida. Adicionalmente, esto permite la purificación de una forma
de la proteína solubilizada con urea con un pI aparente de 7,5
aproximadamente, seguido por la purificación de la forma replegada
soluble de la proteína con un pI teórico de 10,4 aproximadamente. La
capacidad para purificar dos formas de la misma proteína que
presentan puntos isoeléctricos aparentes diferentes, proporcionó la
base del elevado nivel de separación del NGF de las proteínas de
E. coli contaminantes.
El Ejemplo 2 describe el proceso de replegamiento
y purificación de la presente invención después de la expresión de
NGF en el sistema de expresión de E. coli. Las células
huésped de E. coli son lisadas, y se aísla la fracción que
contiene NGF como la "suspensión de sólidos lavados con
NGF".
El NGF es solubilizado y sulfonilado en presencia
de urea y sulfito.
El NGF sulfonilado puede ser capturado y
purificado mediante cromatografía de intercambio aniónico mediante
varios esquemas diferentes. En una realización, descrita con
detalle en el Ejemplo 2, NGF sulfonilado es diluido con el Tampón A
(urea 8 M, Tris-HCl 20 mM, pH 9,0), aplicado a una
columna de intercambio aniónico y eluido con Tampón B (urea 8 M, MES
36 mM, pH 6,0). En otra realización, NGF sulfonilado fue eluido de
la columna con un gradiente lineal de Tampón A a Tampón B. En una
realización preferida de la invención, NGF sulfonilado fue
diafiltrado frente a Tampón A en un cartucho de ultrafiltración,
aplicado a una columna de intercambio aniónico y eluido con un
gradiente lineal de Tampón A a Tampón B. En otra realización
preferida, NGF sulfonilado fue concentrado y diafiltrado en una
membrana de ultrafiltración en una celda agitada, aplicado a una
columna de intercambio aniónico y eluido igual que
anteriormente.
El NGF sulfonilado purificado puede ser replegad
o mediante varios métodos, según se describe en el Ejemplo 2. Se
añadieron urea y PEG a una garrafa y se enfrió la solución. Se
añadió NGF, se ajustó el pH y se añadió cisteína sólida. La garrafa
fue almacenada posteriormente a 10ºC durante 4 días.
El NGF replegado correctamente fue capturado
mediante cromatografía de intercambio catiónico. El NGF replegado
fue recuperado como un único pico de proteína que contenía varias
especies cargadas alteradas de NGF. Las formas de NGF cargadas
incorrectamente fueron separadas por purificación del pico
principal de NGF y concentradas.
Aunque los ejemplos siguientes describen cada
etapa del proceso de la presente invención para la producción de
NGF biológicamente activo, la presente invención incluye la
producción de factores neurotróficos biológicamente activos de la
familia de NGF/BDNF, incluyendo BDNF, NGF, NT3 y NT4, así como de
factores neurotróficos que tengan una homología sustancial y una
actividad biológica similar. El grado de homología existente entre
los miembros de la familia de factores neurotróficos NGF/BDNF,
incluyendo la secuencia de aminoácidos y la posición de los enlaces
disulfuro, sugiere que estas proteínas tienen estructuras
tridimensionales similares. Además, los problemas asociados con la
formación incorrecta de enlaces disulfuro y la necesidad de métodos
mejorados para replegar y renaturalizar la proteína producida
bacterianamente, son similares para todos los miembros de la familia
de factores neurotróficos NGF/BDNF.
Se diseñó un gen de NGF sintético con el fin de
optimizar los codones para la expresión en E. coli así como
para crear sitios de restricción únicos para facilitar las etapas
de clonaje posteriores.
El gen de NGF fue ensamblado en dos fragmentos:
1) Sección A - un fragmento de ADN BamHI-SalI de
218 pares de bases (pb) que constaba de 3 pares de oligonucleótidos
complementarios sintetizados en un sintetizador de ADN de Applied
Biosystems 380A; 2) Sección B - un fragmento de ADN
SalI-KpnI de 168 pb que constaba de 2 pares de
oligonucleótidos sintéticos complementarios (Figura 3) (SEC ID
Nº:5).
A. Ensamblaje de las secciones.
Cada oligonucleótido fue fosforilado utilizando polinucleótido
quinasa de T4. Los oligonucleótidos fosforilados fueron hibridados
posteriormente a sus complementos mediante calentamiento a 80ºC y
enfriamiento lento hasta 35ºC. Los pares de oligonucleótidos (3 de
la Sección A y 2 de la Sección B) fueron ligados y digeridos
posteriormente con BamHI-SalI (Sección A) o con
SalI-KpnI (Sección B) para minimizar las inserciones
múltiples. Los fragmentos resultantes fueron aislados en un gel de
poliacrilamida al 5% y eluidos. Cada fragmento fue ligado a un
fragmento de pUC18 digerido con los enzimas apropiados (BamHI y
SalI para la Sección A; SalI y KpnI para la Sección B). Se
transformó JM109 y los aislados fueron cultivados en caldo Luria
con ampicilina añadida a una concentración de 100 \mug/ml. Se
preparó ADN plasmídico y se confirmó que tenía el fragmento del
tamaño apropiado mediante análisis de los digestos de
restricción.
B.Ensamblaje del gen de NGF sintético
completo. Se aisló un fragmento BamHI-SalI de
218 pb del pUC18 con la Sección A y se aisló un fragmento
SalI-KpnI de 168 pb del pUC18 con la Sección B según
se realizó anteriormente utilizando un gel de poliacrilamida al 5%.
Estos fragmentos fueron ligados a pUC18 cortado con
BamHI-KpnI (se utilizaron IPTG y XGal para
determinar colorimétricamente las colonias con insertos, teniendo
insertos las colonias blancas). Se eligió una colonia blanca y se
preparó ADN plasmídico. Cuando se realizó una digestión con
BamHI-KpnI se liberó un fragmento de 387 pb y se
aisló a partir de un gel de agarosa al 1%. El fragmento de 387 pb
fue ligado en un fragmento BamHI-KpnI del vector de
7 kilobases (kb) aproximadamente, REP pT3XI-2,
obtenido de un digesto del plásmido TP NGF(2start-)REP
pT2XI-2. REP es una secuencia palindrómica
extragénica repetitiva que se ha descrito que estabiliza el ARN
mensajero impidiendo la actividad exonucleolítica
3'-5' (Merino y col. (1987) Gene 58:305). Se
cultivó un transformante en caldo Luria y tetraciclina a una
concentración de 10 \mug/ml. Se preparó ADN plasmídico y se
sometió a digestión con BamHI-KpnI. Se observó un
fragmento de 387 pb, pero con el fin de asegurar que el fragmento
era el gen sintético, se realizó una segunda digestión con
BamHI-EcoRV (el sitio de EcoRV es eliminado de la
región codificadora del gen sintético). Cuando la construcción fue
secuenciada, tres áreas parecían tener la secuencia errónea y fueron
corregidas mediante mutagénesis in vitro utilizando el kit
Mutagene adquirido a Biorad. Las áreas de interés estaban entre los
nucleótidos 83-91 (Mut1) (Figura 4, SEC ID Nº:6),
el nucleótido 191 (Mut2) (Figura 4, SEC ID Nº:7) y una deleción de 2
C en los nucleótidos 258 y 259 (Mut3) (Figura 4, SEC ID Nº:8). El
gen de NGF sintético fue ligado en mp18 cortado con
BamHI-KpnI como un fragmento
BamHI-KpnI para ser utilizado como molde para la
mutagénesis. La mutagénesis fue realizada en un proceso de 2
etapas, utilizando primeramente los oligonucleótidos Mut1 y Mut2
para una mutagénesis doble. Se eligieron dos aislados con la
secuencia correcta mediante hibridación a los oligonucleótidos Mut1
y Mut2 marcados con ^{32}P (denominados Mut1,2A y Mut1,2B). Éstos
fueron posteriormente mutagenizados con el oligonucleótido Mut3 en
una segunda etapa y se eligió un aislado de cada placa por
hibridación a una sonda de Mut3 marcada con ^{32}P (Syn NGF MutA
y Syn NGF MutB). Ambos aislados tenían la secuencia correcta. Se
preparó una forma replicativa (RF - ADN de doble hebra) y se
sometió a digestión con BamHI-KpnI y se aisló un
fragmento de 387 pb a partir de un gel de agarosa al 1%. El
fragmento Syn NGF MutA fue ligado en un fragmento
BamHI-KpnI del vector de 7 kb, REP
pT3XI-2, aislado de TP NGF REP
pT3XI-2. Se transformó MCB00005, se cultivó un
aislado en caldo Luria más tetraciclina a una concentración de 10
\mug/ml y se preparó ADN plasmídico. Se realizó una digestión con
BamHI-KpnI de diagnóstico con el fin de confirmar la
presencia del inserto.
C.NGF sintético incrementado. Como
un medio para incrementar la expresión del gen sintético, la región
entre la metionina de inicio y el sitio de BamHI fue alterada
mediante mutagénesis in vitro para hacerla semejante a la de
una proteína del bacteriófago T7 altamente expresada, el gen 10,
utilizando el oligonucleótido Syn NGF 5P (Figura 5) (SEC ID Nº:9).
Se utilizó como molde mp18 con Syn NGF MutA. Se eligieron cuatro
placas por hibridación a un oligonucleótido Syn NGF 5P marcado con
^{32}P. Se produjo ADN RF y se sometió a digestión con
BamHI-KpnI. Todos tenían el fragmento del tamaño
apropiado y la secuencia de cada uno era también correcta. Se aisló
el fragmento BamHI-KpnI de 387 pb a partir de un
gel de agarosa al 1% y se ligó a un fragmento
BamHI-KpnI del vector de 7 kb aproximadamente, REP
pT3XI-2 (aislado de Syn NGF A REP
pT3XI-2 anteriormente descrito digerido con
BamHI-KpnI). Se transformó MCB00005. Las colonias
fueron sometidas a selección con el oligonucleótido Syn NGF 5P
marcado con ^{32}P y 2 colonias que hibridaban con la sonda
fueron cultivadas en caldo Luria más tetraciclina a una
concentración de 10 \mug/ml. Ambos aislados tenían la secuencia
correcta.
(1)TP NGF REP
pT3XI-2. DH5\alpha que llevaba un fragmento
BamHI-HindIII del gen de NGF de British
Biotechnology (British Biotechnology, Limited, Oxford, Inglaterra)
fue digerida con BamHI-HindIII, se aisló un
fragmento de 380 pares de bases y se ligó a mp18 digerido con
BamHI-HindIII. El ADN fue mutagenizado in
vitro en un proceso de 2 etapas. La primera etapa implicaba la
inserción de un sitio de BamHI inmediatamente 3' al sitio de
HindIII en el extremo 5' del gen y también la inserción de una
secuencia de Shine-Delgarno (S/D) con una
separación "óptima" para la expresión eficaz entre S/D y el
codón de Met de inicio (ver el oligonucleótido TP NGF, Figura 6)
(SEC ID Nº:10). Se eligió una placa después de la hibridación con el
oligonucleótido TP NGF marcado con ^{32}P (Figura 6) (SEC ID
Nº:10). Se realizó una segunda ronda de mutagénesis utilizando el
oligonucleótido REP NGF (Figura 6) (SEC ID Nº:11). Se eligió una
placa mediante la hibridación con el oligonucleótido REP NGF
marcado con ^{32}P. Se preparó ADN RF y se aisló un fragmento
BamHI-HindIII de 470 pb aproximadamente y se ligó en
un fragmento del vector BamHI-HindIII de 7 kb
aproximadamente aislado de Bam TP \Delta53
pT3XI-2 (Figura 7) (SEC ID Nº:12). Se transformó la
cepa MCB00005 y se eligió un aislado, se secuenció y se encontró
que tenía la secuencia correcta.
(2)TP NGF (2start-)
pT3XI-2. Con el fin de eliminar una supuesta
segunda región de inicio en el gen de NGF, se realizó una
mutagénesis in vitro utilizando el oligonucleótido 2start-
(Figura 8) (SEC ID Nº:13) y mp18 con TP NGF REP como molde. Se
secuenció un aislado que hibridaba con el oligonucleótido 2start-
marcado con ^{32}P y se encontró que tenía la secuencia correcta.
Se preparó ADN RF, se aisló un fragmento
BamHI-HindIII de 470 pb aproximadamente de un gel
de agarosa al 1% y se ligó en un fragmento
BamHI-HindIII de 7 kb aproximadamente,
pT3XI-2 (aislado de Bam TP \Delta53
pT3XI-2, ver la Figura 7 (SEC ID Nº:12)). Se
transformó MCB00005 y se determinó el aislado correcto mediante
análisis de los digestos de restricción.
A.Lisis de las células. La
construcción del gen de NGF recombinante humano del Ejemplo 1 fue
expresada en células de E. coli cultivadas en un medio
químicamente definido a 33ºC. Una suspensión de células fresca o
congelada fue diluida con Tris-HCl 50 mM, EDTA 10
mM, pH 8,5, hasta una concentración final de sólidos del 20%
aproximadamente (peso/volumen). Las células fueron lisadas
utilizando 4 pases a través de un homogeneizador de Gaulin o Rannie
a una presión de >8000 PSI. El lisado fue pasado a través de un
serpentín de refrigeración para mantener la temperatura a menos de
15ºC.
B.Recogida y lavado de los sólidos
celulares conteniendo NGF. Los sólidos celulares fueron
capturados utilizando una centrífuga Westphalia. Después de la
captura se determinó el porcentaje de sólidos. Se añadió suficiente
tampón de lavado/dilución frío (Tris-HCl 20 mM, pH
7,5) para disminuir el porcentaje de sólidos hasta el 5 por ciento.
Después de un mezclado suave el lisado fue sometido a un segundo
pase a través de la centrífuga. La "suspensión de células lavadas
con NGF" final fue analizada para determinar el porcentaje de
sólidos. Se recuperaron aproximadamente 80 g de sólidos lavados por
kg de células de partida. La "suspensión de sólidos lavados con
NGF" fue utilizada inmediatamente o se congeló a -20ºC para una
utilización posterior.
C.Solubilización y modificación
química de NGF. El NGF presente en los sólidos lavados fue
solubilizado mediante la utilización de urea 8 M y una mezcla de
sulfitolisis. Esto tuvo como resultado NGF modificado químicamente,
desnaturalizado, solubilizado, en el que los residuos de cisteína
estaban presentes como un disulfuro mixto
cys-SO_{3}^{-}.
Se añadieron a la "suspensión de sólidos
lavados con NGF" urea sólida y agua suficientes para conseguir
una concentración final de urea de 8 M en un volumen final igual a
dos veces el volumen de la suspensión de sólidos lavados utilizado.
Después de la disolución de la urea, se añadieron las
concentraciones finales de reactivos siguientes para la etapa de
sulfitolisis: tampón Tris 10 mM, sulfito de sodio 100 mM,
tetrationato de sodio 10 mM. La mezcla se llevó a un pH final de
7,5 aproximadamente con HCl y se agitó a temperatura ambiente
durante al menos 2 horas aproximadamente.
D.Captura y purificación de NGF
sulfonilado. El NGF sulfonilado fue capturado y purificado a
partir de la mezcla de sulfitolisis mediante cromatografía de
intercambio aniónico. Se utilizaron varios esquemas de carga y
elución.
En una realización de la invención, la mezcla de
sulfitolisis fue diluida 10 veces en Tampón A (urea 8 M,
Tris-HCl 20 mM, pH 9,0) y se ajustó a un pH final
de 9,0 con NaOH. Esta solución fue aplicada a una columna de resina
Q-Sefarosa de esferas grandes de Pharmacia
equilibrada con Tampón A. Se cargó un volumen que representaba 25
gramos de sólidos lavados con NGF por litro de resina. La columna
fue lavada con 3 volúmenes de columna de Tampón A. El NGF
sulfonilado fue eluido por disminución del pH utilizando el Tampón B
(urea 8 M, MES 36 mM, pH 6,0). En otra realización de la invención,
se eluyó NGF sulfonilado con un gradiente lineal de Tampón A a
Tampón B en 10 volúmenes de columna aproximadamente.
En la realización preferida de la invención, un
procedimiento de carga alternativo utilizó la diafiltración de la
mezcla de sulfitolisis utilizando un cartucho de ultrafiltración de
arrollamiento espiral Amicon S1Y10 o S10Y10. La mezcla fue
diafiltrada con 4 volúmenes aproximadamente de Tampón A. Esta
mezcla de sulfitolisis diafiltrada fue ajustada a pH 9,0 y aplicada
directamente a una columna de resina Q-Sefarosa de
esfera grande. Un volumen que representaba 125 gramos de sólidos
lavados con NGF fue cargado por litro de resina. La columna fue
lavada y el NGF sulfonilado fue eluido según se describió
anteriormente.
La proteína eluida de las columnas por cualquiera
de los métodos anteriormente descritos era principalmente NGF
sulfonilado. Se agruparon los picos de proteína eluida y se
determinó la concentración de proteínas por absorbancia a 280 nm
utilizando un coeficiente de extinción de 1,44. Eran típicos
rendimientos de la columna de hasta 5 mg de proteína por gramo de
sólidos lavados con NGF aproximadamente.
E.Replegamiento de NGF. El NGF
sulfonilado purificado en Q-Sefarosa puede ser
replegado mediante varios métodos. En la realización preferida, el
NGF sulfonilado fue replegado a una concentración final de proteína
de 0,1 mg/ml. El volumen de replegamiento final requerido fue
calculado sobre la base de la cantidad de proteína a replegar. Se
combinaron urea 8 M desionizada, filtrada, polietilén glicol 300
(PEG 300), fosfato de potasio dibásico y agua en una garrafa de tal
manera que se alcanzaron concentraciones finales de urea 5 M, PEG
300 20% y fosfato de potasio dibásico 100 mM en el volumen de
replegamiento final. La solución fue enfriada a 10ºC
aproximadamente. Se añadió suavemente el NGF sulfonilado a una
concentración final de 0,1 mg/ml. El pH de esta mezcla se llevó a
8,7 aproximadamente con HCl 5 M. Se paró la agitación y se añadió
L-cisteína a una concentración final de 3 mM. La
fase gaseosa fue rociada durante 5 minutos aproximadamente con una
corriente vigorosa de argón y la garrafa fue cerrada herméticamente.
La solución fue agitada hasta que se disolvió la
L-cisteína, y la garrafa fue almacenada a 10ºC
aproximadamente durante 4 días.
La eficacia del replegamiento fue estudiada con
concentraciones de la proteína NGF que variaban entre 0,02 y 0,2
mg/ml. La eficacia de replegamiento mejoraba al disminuir la
concentración de proteína, sin embargo los volúmenes requeridos y
el coste de los reactivos de replegamiento impidieron la
optimización basada únicamente en el rendimiento. Concentraciones de
urea entre 4,5 y 5,5 M demostraron ser óptimas para el
replegamiento. Los rendimientos disminuyen bruscamente por debajo
de urea 4 M, mientras que concentraciones por encima de 5,5 M
resultaron poco prácticas.
El replegamiento óptimo se consiguió utilizando
PEG 300 al 20% aproximadamente. El PEG 200 funcionaba casi tan bien
como el PEG 300. Niveles más bajos de PEG 300, o de PEG 200, o la
sustitución del PEG por etilén glicol, daban lugar a eficacias de
replegamiento mucho más bajas.
Las eficacias de replegamiento fueron examinadas
con concentraciones de fosfato entre 0 y 0,5 M. El replegamiento de
NGF presentaba un óptimo amplio entre fosfato 100 mM y 200 mM. Una
comparación de fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio
dibásico, fosfato de potasio monobásico y fosfato de potasio
dibásico mostró solamente pequeñas diferencias en las eficacias de
replegamiento del NGF. Se prefirió el fosfato de potasio dibásico
por su pH de partida en solución y por su solubilidad incrementada
sobre la sal de sodio comparable.
El NGF se replegaba óptimamente a 10ºC
aproximadamente, aunque temperaturas entre 4ºC y 15ºC funcionaban
casi igual de bien. El replegamiento disminuía bruscamente por
encima de 15ºC, teniendo lugar un replegamiento despreciable a
temperatura ambiente. Incrementos del pH de la solución de
replegamiento daban lugar a grandes cambios de la velocidad de
replegamiento. Por ejemplo, a pH 8,3 el replegamiento tardó
8-9 días en finalizar casi completamente, mientras
que a pH 8,7 el replegamiento fue casi completo después de 4 días.
Se evitó un pH más elevado debido a la urea presente en la solución
de replegamiento, a la duración del replegamiento y a la
susceptibilidad incrementada de las proteínas a la carbamilación al
aumentar el pH.
Se utilizaron L-cisteína o
cisteamina con igual eficacia para iniciar el replegamiento de NGF.
La cisteamina clorhidrato fue ligeramente menos eficaz. Una
concentración final de L-cisteína 3 mM fue óptima.
Concentraciones de L-cisteína por debajo de 2 mM o
por encima de 5 mM daban lugar a una disminución sustancial del
replegamiento.
F.Captura del NGF replegado. El
NGF replegado correctamente presente en la solución de
replegamiento fue capturado utilizando cromatografía de intercambio
catiónico. El tamaño de la columna fue elegido sobre la base de la
capacidad de la columna para manejar la velocidad de flujo requerida
y la contrapresión encontrada cuando se carga un volumen grande de
una mezcla de replegamiento viscosa, en lugar de sobre la base de
la capacidad de carga de proteínas de la resina. Un replegamiento
típico de 70 litros fue capturado utilizando un volumen de lecho de
la resina de 750 ml.
En la realización preferida para la captura de
NGF replegado, la garrafa fue abierta después de ser almacenada a
10ºC aproximadamente durante 4 días, y la solución de replegamiento
se llevó a pH 5,0 con HCl 5 M o con ácido acético. Esta solución fue
aplicada a una columna de resina SP-Sefarosa de
esfera grande de Pharmacia que había sido equilibrada en acetato de
sodio 20 mM, pH 5,0. Una vez cargada, la columna fue lavada con 4
cuatro volúmenes de columna de acetato de sodio 20 mM, pH 5,0. El
NGF replegado, soluble, fue eluido de la columna utilizando acetato
de sodio 20 mM, NaCl 750 mM, pH 5,0. La velocidad de flujo fue de
0,5 volúmenes de columna por minuto (v.c./minuto) durante el
equilibrado, la carga y el lavado, y fue disminuida hasta 0,25
v.c./minuto durante la elución.
Se recuperó un único pico de proteína que estaba
compuesto por NGF replegado correctamente. Aunque este material
parecía casi homogéneo por determinación de tamaños,
SDS-PAGE y HPLC de fase reversa estándar, se
demostró posteriormente que contenía varias especies cargadas
alteradas de NGF mediante enfoque isoeléctrico y HPLC de
intercambio catiónico. Las principales especies separadas mediante
HPLC de intercambio catiónico fueron identificadas como variantes
truncadas o carbamiladas de NGF utilizando espectroscopía de masas
con electropulverización. Fue por tanto necesario incluir una
columna adicional en el proceso de purificación para eliminar estas
variantes del NGF.
G.Eliminación de las variantes de NGF
mediante cromatografía de intercambio iónico. En la realización
preferida de esta invención, el conjunto de proteínas eluidas de la
columna de S-Sefarosa de esfera grande fue diluido
dos veces utilizando acetato de sodio 20 mM, pH 5,0, y cargado en
una columna de resina de alto rendimiento
SP-Sefarosa de Pharmacia equilibrada en acetato de
sodio 20 mM, pH 5,0. La columna fue cargada hasta 5 mg de NGF/ml de
resina aproximadamente. La columna fue lavada primeramente con 2
volúmenes de columna aproximadamente de acetato de sodio 20 mM, pH
5,0, posteriormente con 2 volúmenes de columna aproximadamente de
Tris-HCl 20 mM, NaCl 75 mM, pH 7,5, y eluida con 12
volúmenes de columna de un gradiente lineal de NaCl de 125 a 300 mM
en Tris-HCl 20 mM, pH 7,5. En una realización
alternativa de la invención, la columna fue lavada con 3 volúmenes
de columna aproximadamente de tampón fosfato de sodio 20 mM, NaCl
150 mM, pH 7,0. La proteína fue eluida de la columna utilizando 10
volúmenes de columna de un gradiente de pH desde fosfato de sodio
20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0, hasta Tris-HCl 20 mM,
NaCl 150 mM, pH 8,0. Los dos esquemas de elución anteriores
condujeron a la separación de formas de NGF de carga incorrecta del
pico principal de NGF.
Realizaciones adicionales de la invención
incluyen la utilización de otras resinas de intercambio catiónico,
tales como Mono-S de Pharmacia, o la elución de la
proteína con diferentes sistemas de tampones y/o a un pH diferente.
Éstos incluían glicilglicina 20 mM, pH 8,5, gradiente de NaCl
50-200 mM; borato 20 mM, pH 8,0-8,5,
gradiente de NaCl 50-300 mM;
Tris-HCl 20 mM, pH 7,0-8,5,
gradiente de NaCl 50-400 mM; y fosfato de sodio 20
mM, pH 7,0, gradiente de NaCl 100-500 mM. El NGF
fue también eluido de la columna anterior utilizando tampón acetato
de sodio 20 mM, pH 5,0, gradiente de NaCl 450-800
mM, y con citrato de sodio 20 mM, pH 5,0, gradiente de NaCl
400-700 mM.
H.Concentración/diafiltración. Las
fracciones que contenían NGF purificado procedentes de la columna
de SP-Sefarosa HP fueron agrupadas, concentradas e
intercambiadas en una formulación voluminosa final que contenía
citrato y NaCl a un pH de 5,2 aproximadamente, utilizando una
membrana Amicon YM10 en una celda agitada. Esta etapa fue realizada
a temperatura ambiente, con la concentración de proteína mantenida
por debajo de 5 mg/
ml.
ml.
I.Precipitación de NGF. El NGF
purificado presentaba una tendencia a precipitar bajo ciertas
condiciones. Los factores que conducían a una precipitación
incrementada incluían una concentración de proteína incrementada,
una concentración incrementada de NaCl, un pH incrementado y una
temperatura disminuida. Por tanto, en la realización preferida de
esta invención, la concentración de proteína de las soluciones de
NGF es mantenida por debajo de 5 mg/ml, y las soluciones no son
enfriadas por debajo de 10ºC aproximadamente excepto para congelar
la solución madre voluminosa formulada purificada.
La actividad biológica del NGF purificado fue
determinada analizando su capacidad para estimular la supervivencia
de neuronas de la cadena simpática del embrión de pollo in
vitro.
Se prepararon cultivos de ganglios de la cadena
simpática y de la raíz dorsal de embrión de pollo según se ha
descrito previamente (Collins y Lile (1989) Brain Research 502:99).
Brevemente, los ganglios simpáticos o de la raíz dorsal fueron
extraídos de huevos de pollo fértiles, libres de patógenos, que
habían sido incubados 8-11 días a 38ºC en una
atmósfera humidificada. Los ganglios fueron disociados químicamente
mediante exposición primeramente a Solución Salina Equilibrada de
Hanks sin cationes divalentes, que contenía tampón HEPES 10 mM pH
7,2, durante 10 minutos a 37ºC, y posteriormente mediante
exposición a una solución de bactotripsina al 0,125% 1:250 (Difco,
Detroit, Michigan) en Solución Salina Equilibrada de Hanks
modificada igual que anteriormente, durante 12 minutos a 37ºC. La
tripsinización fue parada por la adición de suero de ternera fetal
a una concentración final del 10%. Después del tratamiento, los
ganglios fueron transferidos a una solución que constaba de Medio de
Eagle Modificado con una concentración elevada de glucosa de
Dulbecco sin bicarbonato que contenía un 10% de suero de ternera
fetal y HEPES 10 mM, pH 7,2, y disociados mecánicamente por
trituración 10 veces aproximadamente a través de una pipeta Pasteur
de vidrio cuya abertura había sido pulida al fuego y estrechada
hasta un diámetro tal que se tardaran 2 segundos en llenar la
pipeta. Los ganglios disociados fueron sembrados posteriormente en
medio de cultivo (Medio de Eagle Modificado de Dulbecco suplementado
con un 10% de suero de ternera fetal, glutamina 4 mM, 60 mg/l de
penicilina-G, HEPES 25 mM, pH 7,2) en placas de
cultivo de tejidos de 100 mm de diámetro (40 ganglios disociados
por placa) durante tres horas. Esta presiembra fue realizada con el
fin de separar las células no neuronales, que se adhieren a la
placa, de las células nerviosas, que no se adhieren. Después de
tres horas, las células nerviosas no adherentes fueron recogidas
por centrifugación, resuspendidas en medio de cultivo y sembradas
en 50 \mul por pocillo en placas de cultivo de tejidos de
microvaloración de 96 pocillos de media área a una densidad de 1500
células nerviosas por pocillo. Los pocillos de microvaloración
habían sido expuestos previamente a una solución de 1 mg/ml de
poli-L-ornitina en borato de sodio
10 mM, pH 8,4, durante una noche a 4ºC, lavados en agua destilada y
secados al aire.
Se añadieron a cada pocillo 10 \mul de
diluciones seriadas de la muestra a analizar para determinar su
actividad neurotrófica y las placas se incubaron durante 20 horas a
37ºC en una atmósfera humidificada que contenía un 7,5% de CO_{2}.
Después de 18 horas, se añadieron 15 \mul por pocillo de una
solución de 1,5 mg/ml del colorante de tetrazolio MTT en Medio de
Eagle Modificado con una concentración elevada de glucosa Dulbecco
sin bicarbonato que contenía HEPES 10 mM, pH 7,2, y los cultivos se
volvieron a colocar en el incubador a 37ºC durante 4 horas.
Posteriormente se añadieron 75 \mul de una solución de 6,7 ml de
HCl 12 M por litro de isopropanol y el contenido de cada pocillo se
trituró 30 veces para romper las células y suspender el colorante.
Se determinó para cada pocillo la absorbancia a 570 nm con relación
a una referencia de 690 nm utilizando un lector automático de
placas de microvaloración (Dynatech, Chantilly, Virginia). La
absorbancia de los pocillos que no habían recibido ningún agente
neurotrófico (controles negativos) fue restada de la absorbancia de
los pocillos que contenían muestra. La absorbancia resultante es
proporcional al número de células vivas de cada pocillo, definidas
como aquellas células nerviosas capaces de reducir el colorante. La
concentración de actividad trófica en unidades tróficas (UT) por ml
fue definida como la dilución que producía el 50% de supervivencia
máxima de las células nerviosas. Por ejemplo, si la muestra daba un
50% de supervivencia máxima cuando era diluida 1:100.000, el título
era definido como 100.000 UT/ml. La actividad específica fue
determinada dividiendo el número de unidades tróficas por ml entre
la concentración de proteína por ml en la muestra no diluida.
La Figura 9 muestra el proceso de esta invención
en un diagrama de flujo.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Jack Lile
\hskip3,9cmTadahiko Kohno
\hskip3,9cmDuane Bonam
\hskip3,9cmMary S. Rosendahl
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Producción de Proteína Neurotrófica Recombinante Biológicamente Activa
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 13
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Swanson & Bratschun, L.L.C.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 8400 E. Prentice Avenue, Suite 200
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Englewood
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Colorado
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 80111
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete, 3,5 pulgadas, 1,44 MB de almacenamiento
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: WordPerfect 5.1
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/266.090
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 27-JUNIO-1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/240.122
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 09-MAYO-1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/087.912
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 06-JULIO-1993
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 07/680.681
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 04-ABRIL-1991
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 07/594.126
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 09-OCTUBRE-1990
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 07/547.750
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 02-JULIO-1990
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 07/505.441
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 06-ABRIL-1990
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL REPRESENTANTE/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Barry J. Swanson
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 33.215
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: SYNE200/PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (303) 793-3333
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (303) 793-3433
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 742 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia de ácido nucleico del BDNF humano
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 725 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia de ácido nucleico del NGF humano
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 247 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia de aminoácidos deducida del BDNF humano
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Secuencia pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 241 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia de aminoácidos deducida del NGF humano
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 389 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGATTCCGTT AGCGTTTGGG TTGGCGACAA AA
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTCTTGGAA ACCAAATCCC G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACTGGAACT CCTACTGCAC CA
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGATCCAAGA AGGAGATATA CATATGTCTA GCAGC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCCAAGCTT GGATCCAAGA AGGAGATATA CATATGTCAT CAT
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 119 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 619 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCAAGGGCAA AGAAGTGATG GTATTGGGAG AGG
\hfill33
Claims (22)
1. Un proceso para la producción de un factor
neurotrófico recombinante biológicamente activo, en el que dicho
factor neurotrófico es seleccionado del grupo que consta de NGF,
BDNF, NT3 y NT4, que comprende:
- a)
- la expresión de un gen que codifica el factor neurotrófico en un sistema de expresión bacteriano en el que se produce dicha proteína factor neurotrófico;
- b)
- la solubilización de dicho factor neurotrófico en urea;
- c)
- la sulfonilación de dicho factor neurotrófico solubilizado;
- d)
- el aislamiento y la purificación del factor neurotrófico sulfonilado mediante cromatografía de intercambio aniónico;
- e)
- el permitir que el factor neurotrófico sulfonilado se repliegue en presencia de urea 4,5-5,5 M para dar el factor neurotrófico biológicamente activo; y
- f)
- la purificación del factor neurotrófico biológicamente activo mediante cromatografía de intercambio catiónico.
2. El proceso de la reivindicación 1, en el que
el gen de dicho factor neurotrófico comprende ADN que codifica NGF
humano.
3. El proceso de la reivindicación 1, en el que
el gen de dicho factor neurotrófico comprende ADN que codifica NGF
animal.
4. El proceso de la reivindicación 1, en el que
el gen del factor neurotrófico comprende la secuencia de la Figura
1 (SEC ID Nº:1).
5. El proceso de la reivindicación 1, en el que
el gen neurotrófico comprende ADN que codifica BDNF humano.
6. El proceso de la reivindicación 1, en el que
el gen neurotrófico comprende la secuencia de la Figura 1 (SEC ID
Nº:2).
7. El proceso de la reivindicación 1, en el que
dicho factor neurotrófico es solubilizado en la etapa b) en urea 8
M.
8. El proceso de la reivindicación 1, en el que
dicho factor neurotrófico se repliega en la etapa e) en presencia
de polietilén glicol (PEG) con un peso molecular de entre
200-300.
9. El proceso de la reivindicación 8, en el que
el PEG está presente en una concentración de entre
15-20% (peso/volumen), la concentración final de
proteína del factor neurotrófico es de 0,1 mg/ml aproximadamente y
la etapa de replegamiento tiene lugar a una temperatura de 10ºC
aproximadamente.
10. El proceso de la reivindicación 1, 7 ó 8, en
el que el replegamiento se inicia con la adición de
L-cisteína o de cisteamina.
11. El proceso de la reivindicación 1, en el que
el factor neurotrófico sulfonilado es aislado y purificado
utilizando concentración y diafiltración.
12. Un proceso para la producción de un factor
neurotrófico recombinante biológicamente activo, en el que dicho
factor neurotrófico es seleccionado del grupo que consta de NGF,
BDNF, NT3 y NT4, que comprende:
- a)
- la construcción de un gen de ADN sintético del factor neurotrófico con el fin de dirigir un sistema de expresión de E. coli para que produzca un factor neurotrófico;
- b)
- la expresión de dicho factor neurotrófico en el sistema de expresión de E. coli;
- c)
- la solubilización y la sulfonilación de dicho factor neurotrófico;
- d)
- la purificación de dicho factor neurotrófico solubilizado y sulfonilado utilizando cromatografía de intercambio aniónico;
- e)
- el replegamiento de dicho factor neurotrófico purificado y sulfonilado de tal manera que se obtenga la estructura terciaria correcta necesaria para una actividad biológica completa; y
- f)
- la purificación del factor neurotrófico totalmente activo biológicamente mediante cromatografía de intercambio catiónico.
13. El proceso de la reivindicación 12, en el que
el gen de dicho factor neurotrófico comprende ADN que codifica NGF
humano.
14. El proceso de la reivindicación 12, en el que
el gen de dicho factor neurotrófico comprende ADN que codifica NGF
animal.
15. El proceso de la reivindicación 12, en el que
el gen del factor neurotrófico comprende la secuencia de la Figura
1 (SEC ID Nº:1).
16. El proceso de la reivindicación 12, en el que
el gen neurotrófico comprende ADN que codifica BDNF humano.
17. El proceso de la reivindicación 12, en el que
el gen neurotrófico comprende la secuencia de la Figura 1 (SEC ID
Nº:2).
18. El proceso de la reivindicación 12, en el que
dicho factor neurotrófico es solubilizado con urea 8 M.
19. El proceso de la reivindicación 12, en el que
dicho factor neurotrófico se repliega en presencia de polietilén
glicol (PEG) con un peso molecular de entre
200-300.
20. El proceso de la reivindicación 19, en el que
el PEG está presente a una concentración del 20% aproximadamente
(peso/volumen), la urea está presente en un rango de
concentraciones de 4,5-5,5 M, la concentración final
de proteína del factor neurotrófico es de 0,1 mg/ml aproximadamente
y la etapa de replegamiento tiene lugar a una temperatura de 10ºC
aproximadamente.
21. El proceso de la reivindicación 12, 18 ó 19,
en el que el replegamiento se inicia con la adición de
L-cisteína o de cisteamina.
22. El proceso de la reivindicación 12, en el que
el factor neurotrófico sulfonilado es aislado y purificado
utilizando concentración y diafiltración.
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