JPH11262389A

JPH11262389A - 肺胞界面活性タンパク質及び関連ポリペプチド

Info

Publication number: JPH11262389A
Application number: JP11027917A
Authority: JP
Inventors: Charles G Cochrane; チャールズジーコックラーン; Susan D Revak; スーザンディレーヴァック
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1988-01-06
Filing date: 1999-02-04
Publication date: 1999-09-28
Also published as: EP0593094B1; ATE199730T1; EP0593094A3; JPH02502917A; FI102180B1; EP0593094A2; AU3960089A; US5164369A; FI102180B; JP3009690B2; EP0350506A1; ATE196298T1; DK439089A; DK174818B1; DE68929287D1; EP0350506A4; FI894187A0; EP0350506B1; DE68929248D1; DE68929248T2

Abstract

(57)【要約】【課題】合成肺胞界面活性物質において有用なＳＰ１
８モノマー関連ポリペプチドを提供すること。【解決手段】実質的に純粋なヒトＳＰ１８モノマータ
ンパク質、それを含有し合成肺胞界面活性物質を形成す
る組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願）本出願は、ここで参考として
引用する、１９８８年１月６日に出願された“肺胞界面
活性タンパク質及び関連ポリペプチド”と題する出願番
号１４1,２００の一部継続出願である。（技術分野）本発明は合成肺胞界面活性物質において有
用なＳＰ１８モノマー関連ポリペプチドに関する。また
本発明はヒトＳＰ１８モノマータンパク質をコードする
構造遺伝子を含む組換え核酸分子及び核組換え分子を用
いたヒトＳＰ１８モノマーの生産に関する。（背景）肺胞界面活性物質（ＰＳ）は成熟したホ乳類の
肺胞上皮細胞に整列している。天然のＰＳは肺の気液界
面で相互作用し表面張力を減少させるアポタンパク質及
びリン脂質の両方を含むことから、“リポタンパク質複
合体”と呼ばれている。肺胞界面活性物質の発見及びそ
の欠陥が新生児の呼吸困難症（ＲＤＳ）の第１原因であ
るという知見から、外来性のＰＳを用いた、障害をもつ
ヒト、特に幼児に対する効果的界面活性物質置換治療法
の開発に多くの研究がなされてきた。例えば、平均気道
圧及び酸素要求の低下により測定される肺機能の改善
が、ヒトの限界前の幼児において外来性界面活性物質を
用いて示された。ホールマン（Hallman)等，プディアト
リクス（Pediatrics），７１，４７３−４８２（１９８
３）；メリット（Merritt)等，ジャーナル・オブ・ヘデ
ィアトリスク（J. Pediatr）、１０８，７４１−７４５
（１９８６）；ホールマン（Hallman)等，ジャーナル・
オブ・ベディアトリスク（J. Pediatr）、１０６，９６
３−９６９（１９８５）；モーリー（Morley）等，ラン
セット（Lancet），Ｉ，６４−６８（１９８１）；メリ
ット（Merritt)等，ニューイングランドジャーナル・
オブ・メディシン（New England J. Med.)３１５，７８
５−７９０（１９８６）；スミス（Smyth)等，ペディア
トリクス（Pediatrics),７６，１４５−１５３（１９８
５）；フジワラ（Fujiwara）等，ザ・ランセット（the
Lancet),１，５５−５９（１９８０）；ウォング（Kwon
g)等、ペディアトリクス（Pediatrics),７６，５８５−
５９２（１９８５）；シャピロ（Shapiro)等，ペディア
トリクス（Pediatrics),７６，５９３−５９９（１９８
５）；フジワラ（Fujiwara），“肺胞界面活性物質”ロ
バートソン（Robertson)，Ｂ．，ファンゴルデ（van Go
lde)，L. M. G., ベーテンバーグ（Batenberg)，J,
（編），エルセビアサイエンス出版，アムステルダム，
４７９−５０３（１９８４）参照。

【０００２】薬理学的見地から、ＲＤＳの治療に使用す
るのに最適の外来ＰＳは、その性質の変化がバッチ間で
無視し得る、制御されかつ無菌的条件下、実験室で完全
合成されたものであろう。免疫学的複雑性を最小限にと
どめるため、外来ＰＳのアポタンパク質成分は、ヒト中
に存在するものと同一であるべきである。不幸なこと
に、天然のＰＳの組成は複雑であり、かつ、本分野にお
いて肺において高い生理活性に必要とするされる生物物
理学的性質を生ずる全ての生化学成分が同定されている
わけではない。特に、本分野においては、天然ＰＳ中に
存在する全てのアポタンパク質を特徴づけてはおらず、
また現在知られているＰＳアポタンパク質の機能を同定
できていない。ＰＳアポタンパク質及び界面機能におけ
るそれらの機能に関する文献は、多くの研究において不
均一なアポタンパク質調製物を用いていることから、複
雑で、一貫性がなく、またしばしば矛盾していることに
注意しなければならない。今日まで、本分野において、
天然のＰＳ中に存在する種々のアポタンパク質の数は明
確とはなっていない。

【０００３】本発明にとって、外来界面活性物質中の成
分としての低分子量（ＬＭＷ）ヒトＰＳ関連アポタンパ
ク質の使用が特に興味深い。生化学的手法を用いてヒト
ＰＳＬＭＷアポタンパク質を単離又は定義するいくつか
の研究が企てられてきた。例えばフィザカーリー（Phiz
ackerley）等，バイオケミカルジャーナル（Biochem.
J.)１８３，７３１−７３６（１９７９），レバク（Re
vak)等，アメリカンレヴューオブ・レスピレトリー・
デシーズ（Am. Rev. Resp. Dis.)１３４，１２５８−１
２６５（１９８６），スズキ（Suzuki）等，ヨーロピア
ン・ジャーナル・オブ・レスピレトリー，ディシーズ
（Eur. J. Respir, Dis,），６９，３３５−３４５（１
９８６），タエウシュ（Taeusch)等，ペディアトリクス
（Pediatrics），７７，５７２−５８１（１９８６），
ユ（Yu）等，バイオケミカルジャーナル（Biochem,
j，），２３６，８５−８９（１９８６），ウィセット
（Whitsett）等，ペディアトリック・リサーチ（Pediat
ric Res.) ２０，４６０−４６７（１９８６），ウィセ
ット（Whitsett）等ペディアトリックリサーチ（Pedi
atric Res.) ，２０，７４４−７４９（１９８６），タ
カハシ（Takahashi)等，バイオケム，バイオフィズ，リ
サーチ・コミュニケーション（Biochem. Biophys. Res.
Comm.）１３５，５２７−５３２（１９８６），スズキ
（Suzuki）等，エクスペリメンタル，ラングリサーチ
（Exp. Lung. Res.)１１，６１−７３（１９８６），カ
ーステット（Curstedt）等，ヨーロピアン・ジャーナル
・オブ・バイオケミストリー（Eur. J. Biochem.）１６
８，２５５−２６２（１９８７），ノッター（Notter）
等，ケミストリー・アンド・フィジックス・オブリピッ
ズ（Chem. Phys. Lipids）４４，１−１７（１９８７）
及びフェルプス（Phelps）等，アメリカン・レヴュ・オ
ブ・レスピレトリーディシーズ（Am. Rev. Respir,
Dis,）１３５，１１１２−１１１７（１９８７）参照。

【０００４】最近、本分野においては、個々のＬＭＷＰ
Ｓアポタンパク質を均一なまでに精製し得ないことに関
する問題を克服するために組換えＤＮＡ技術を応用しは
じめた。例えばグレーサー（Glasser)等（プロシーディ
ング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス（Proc. Natl. Acad. Sci.）ＵＳＡ，８４，４００７
−４０１１（１９８７））はＳＰＬ（Phe)と命名した少
なくとも１個の成熟ＬＭＷアポタンパク質を生成するヒ
ト前駆体タンパク質の少なくとも一部を形成するｃＤＮ
Ａ由来のアミノ配列を報告した。グレーサー（Glasser)
等は、ＳＰＬ（Phe)のカルボキシ末端残基を決定し得
ず、従って完全な配列を同定し得なかったが、彼等は成
熟ＳＰＬ（Phe)の約６０個長のアミノ酸から成ることを
予測した。

【０００５】ヤコブス（Jacobs）等（ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol, Chem.），
２６２，９８０８−９８１１（１９８７））は、グレー
サー（Glasser)等（上述）により報告されているものと
同じ、ヒト前駆体タンパク質のｃＤＮＡ及び誘導される
アミノ酸の配列を報告した。しかしヤコブス（Jacobs）
等によると、その前駆体から生成するＰＳＰ−Ｂと命名
した成熟ＬＭＷタンパク質は、７６残基長のアミノ酸か
ら成る。さらに、ヤコブス（Jacobs）等は、報告した前
駆体タンパク質に由来するＰＳアポタンパク質が彼等が
臨床的に研究した界面活性調製物中に存在することが明
確ではないと述べている。以上のことから、明らかに同
じＰＳアポタンパク質に多くの名称が文献中で用いられ
ているのが見てとれる。それゆえ、議論の便宜上、グレ
ーサー（Glasser)等（上述）及びヤコブス（Jacobs）等
（上述）により報告されている前駆体由来の成熟タンパ
ク質を総称的に“ＳＰ１８”と呼び、そのモノマー型及
びダイマー型を、適宜各々“ＳＰ１８モノマー”及び
“ＳＰ１８ダイマー”と呼ぶ。

【０００６】イヌのＳＰ１８前駆体はホーグッド（Hawg
ood)等（プロシーディング・イン・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）Ｕ
ＳＡ，８４，６６−７０（１９８７））及びシリング
（Schieling)等（国際特許出願ＷＯ８６／０３４０
８））により報告された。しかし、両研究は、グレイサ
ー（Glasser)等（上述）及びヤコブス（Jacobs）等の研
究同様、ＳＰ１８の成熟した生物学的活性型を明らかに
し得なかったことに注意すべきである。ワー（Warr）等
（プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）ＵＳＡ，
８４，７９１５−７９１９（１９８７））は、ＳＰ５と
命名する成熟ＬＭＷアポタンパク質を生成する前駆体を
形成する１９７残基のｃＤＮＡ由来のアミノ酸配列を報
告した。ＳＰ１８を説明するために企てた研究のよう
に、ワー（Warr）等はその前駆体タンパク質配列から生
成する成熟タンパク質のカルボキシ末端残基を決定し得
ず、従ってＳＰ５を明確に特徴づけることはできなかっ
た。

【０００７】ワー（Warr）等により報告された前駆体タ
ンパク質のアミノ酸残基配列は、グレーサー（Glasser)
等及びヤコブス（Jacobs）等により報告されたものと違
うため、本分野では天然ＰＳは少なくとも２個のＬＭＷ
アポタンパク質を含んでいるとしているようである。し
かし、これらタンパク質の生物学的活性型は未決定のま
まである。

【０００８】（要約）現在ヒトＳＰ１８はホモダイマー
・タンパク質（ＳＰ１８ダイマー）であり、その成熟サ
ブユニットタンパク質（ＳＰ１８モノマー）は、ドテシ
ル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ）の測定によると約９０００ダルトンの
見かけの分子量を有することが分っている。また、ヒト
ＳＰ１８は、先に同定された肺胞界面活性物質の非存在
下、合成肺胞界面活性物質中の活性成分として機能し得
ることが発見された。さらに、成熟ヒトＳＰ１８モノマ
ータンパク質のカルボキシ末端アミノ酸残基配列が決定
され、従って現在はその天然型が発見されている。この
ように本発明は、実質的に単離した、又は実質的に純粋
なヒトＳＰ１８モノマーに関する。また本発明は基本的
にヒトＳＰ１８モノマータンパク質から成るＤＮＡセグ
メントに関する。別の本発明の態様には、翻訳後のタン
パク質分解修正なしにヒトＳＰ１８モノマータンパク質
を発現しうる構造遺伝子と機能的に結合したベクターを
含む組換え核酸分子がある。

【０００９】また本発明はヒトＳＰ１８モノマータンパ
ク質の調製法で、(a) 翻訳後のタンパク質分解修正な
しにヒトＳＰ１８モノマータンパク質を発現し得る構造
遺伝子に機能的に結合したベクターを含む組換えＤＮＡ
分子でトランスホームしたホ乳類細胞の培養を栄養培地
中で開始する。(b) 該細胞が該組換えＤＮＡ分子から
ヒトＳＰ１８モノマータンパク質を発現するのに十分な
時間、該培養を維持する、及び(c) 該培養物から該タ
ンパク質を回収する、以上(a) 〜(c) のステップを含む
方法に関する。さらに本発明は、配列がヒトＳＰ１８モ
ノマーのアミノ酸残基配列に対応する少なくとも１０個
のアミノ酸残基で、かつせいぜい約６０個のアミノ酸残
基を基本的に含むポリペプチドで、医薬的に許容し得る
リン脂質と混合した時に、該リン脂質単独の場合より高
い界面活性を有する合成界面活性物質を形成するポリペ
プチドに関する。

【００１０】別の態様において、本発明はヒトＳＰ１８
モノマーのアミノ酸残基配列に対応する配列の少なくと
も１０個のアミノ酸残基で、かつせいぜい約６０個のア
ミノ酸残基を基本的に含むポリペプチドと混合した医薬
的に許容し得るリン脂質を含む合成肺胞界面活性物質に
関する。さらに本発明の態様には、配列が、ヒトＳＰ１
８モノマーのアミノ酸残基配列に対応する少なくとも１
０個のアミノ酸残基で、かつせいぜい約６０個のアミノ
酸残基を基本的に含むポリペプチドで、医薬的に許容し
得るリン脂質と混合した時、該リン脂質単独より高い界
面活性を有する合成界面活性物質を形成するポリペプチ
ドを、その効果的量混合した医薬的に許容し得るリン脂
質を含む、治療的に効果的な量の合成肺胞界面活性物質
を投与することを含む、呼吸困難症の治療法がある。本
発明の別の態様には、医薬的に許容し得るリン脂質と混
合した効果的量の、実質的に単離した、又は実質的に純
粋なヒトＳＰ１８モノマーを含む、治療に効果的な量の
合成肺胞界面活性物質を投与することを含む呼吸困難症
の治療法がある。

【００１１】（図の簡単な説明）図１は、７５０ヌクレ
オチドのｃＤＮＡ配列（上）及び推定されるアミノ酸残
基配列（下）を示している。各ヌクレオチド行の右側の
数字は各行の最後のヌクレオチドの位置を数字で表わし
たものである。ヌクレオチドは行当り１５個のコドンに
まとめられており、各コドンによりコードされるアミノ
酸はそのコドンの下に三文字コードで示してある。この
ｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸残基配列中のいく
つかの残基の位置をその残基の下に数字で示す。成熟ヒ
トＳＰ１８モノマーのアミノ末端アミノ酸残基はPhe
（ヌクレオチド１８７−１８９でコードされる）であ
り、これを残基１と命名する。残基位置８へのカルボキ
シ末端アミノ酸残基はAsp （ヌクレオチド４２７−４２
９でコードされている）である。それゆえ成熟ＳＰ１８
モノマーをコードする構造遺伝子は８１個のコドンを含
み、かつヌクレオチド１８７−４２９に対応するヌクレ
オチド配列を有する。図２は、バイオシル（Bio-Sil)Ｈ
Ａ（ケイ酸）カラムからのＰＳアポタンパク質のタンパ
ク質溶出曲線を示している。選択したフラクションのピ
アスＢＣＡタンパク質検定（実線）及びリン脂質分析
（破線）の結果を示している。フラクション当り２ミリ
リットル（ml）を採取した。フラクション２８〜３３に
おけるタンパク質検定のポジティブな結果はリン脂質に
よるものである。図３は低分子量（ＬＭＷ）ＰＳアポタ
ンパク質の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。レー
ンＡ及びＤはケイ酸又はセファデックスＬＨ−２０クロ
マトグラフィー後のサンプルを示している。両ＬＭＷタ
ンパク質が存在する。レーンＢ，Ｃ，Ｅ及びＦはセファ
デックスＬＨ−６０クロマトグラフィー後のＳＰ１８
（レーンＢ及びＥ）及びＳＰ９（レーンＣ及びＦ）の分
画を示している。分子量標準をレーンＧに示す。レーン
Ａ−Ｃは未還元サンプルであり、レーンＤ−Ｆは電気泳
動前にβ−メルカプトエタノールで還元した同サンプル
を含んでいる。図４は１００μｌの食塩水（白丸）、２
mgリン脂質（ＰＬ）ＤＰＰＣ：ＰＧ＝３：１（黒丸）、
ＰＬ＋１０μｇＳＰ９（白四角）、ＰＬ＋１０μｇＳＰ
１８（黒四角）、又は２mg天然ヒト界面活性物質（黒三
角）の気管注入後３０分におけるウサギ胎児肺の膨張収
縮圧力／体積曲線を示している。データは四匹の動物の
平均値±標準偏差で表わされている。図５は、食塩水
（Ａ）、天然ヒト界面活性物質（Ｂ）、リン脂質ＤＰＰ
Ｃ：ＰＧ（Ｃ）又はリン脂質＋ＬＭＷアポタンパク質
（ＳＰ９＋ＳＰ１８）（Ｄ）による処理後のウサギ胎児
肺組織サンプル（×１２５倍、ヘマトキシリン−エオシ
ン染色）を示している。図６は、本発明の合成界面活性
物質を含む代表的ポリペプチドの界面活性を示してい
る。界面活性は、脈動バブル法を用いて気液間の圧力勾
配を測定することにより決定した。バブル表面における
圧力勾配は水圧（センチメートル）で記録される圧力の
絶対値である。各合成肺胞界面活性物質に対して得られ
た結果は界面活性物質中のポリペプチドと同じであっ
た。リン脂質単独の界面活性物質に対して得られた結果
（すなわちペプチド又はタンパク質を混合していない場
合）はＰＬと同じである。わずか８個のアミノ酸残基を
含み、かつヒトＳＰ１８モノマー残基７４−８１（ｐ７
４−８１）に対応する配列を有するコントロールペプチ
ドを用いた結果も示す。示されているデータは、１５
秒、１分及び５分の時点に得たものである。図７は、先
にレバク（Revak)等（アメリカン・レヴュー・オブ・レ
スピレトリー・ディシーズ（Am. Rev. Respir. Di
s.），１３４，１２５８−１２６５（１９８６））によ
り報告されているウサギ胎児モデルを用いた本発明の代
表的界面活性物質の静的コンプライアンス実験の結果を
示している一連の２枚のグラフである。合成界面活性物
質又はコントロールを気管に注入後、静的コンプライア
ンス測定３０分前にそのウサギを空気置換する。“Ｘ”
軸は水柱cmで表わした圧力を表わし、一方“Ｙ”軸は体
重キログラム当りの容積（ml）を表わしている。左側の
グラフは膨張値を示し、右側グラフは収縮値を示してい
る。以下の界面活性物質のテスト結果を示してある。天
然の界面活性物質（中央に点を打った白四角）、７％ｐ
５２−８１（ＳＰ１８の残基５２から８１に対応するポ
リペプチド）を含むリン脂質（ＰＬ）（黒ダイヤモン
ド）、３％Ｐ５２−８１を含むＰＬ（中央に白黒を打っ
た黒四角）、７％Ｐ３６−８１を含むＰＬ（白ダイヤモ
ンド）、３％ｐ６６−８１を含むＰＬ（黒四角）、３％
ｐ１−１５を含むＰＬ（白四角）及びＰＬコントロール
（黒三角）。図８は本発明の代表的合成界面活性物質の
静的コンプライアンス実験の結果を示す一連の２つのグ
ラフである。この操作は別の注入操作を用いたこと以外
図７で述べたように行った。“Ｘ”及び“Ｙ”軸、及び
右及び左のグラフは図７に述べたものと同じである。以
下の界面活性物質のテスト結果を示す、天然界面活性物
質（中央に点を打った白四角）、１０％ｐ５１−８１を
含むリン脂質（ＰＬ）（黒ダイヤモンド）、１０％ｐ５
１−７６を含むＰＬ（黒四角）及びＰＬ（黒三角）。

【００１２】（本発明の詳細な説明）Ａ．定義（アミノ酸）ここで述べられているアミノ酸は天然のＬ
型のものである。標準的ポリペプチド命名法に従がい
（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J. Biol. Chem.）２４３，３５５７−５９（１９６
９）、アミノ酸の略号は以下の対応表に示した。

【００１３】

【００１４】全てのアミノ酸残基配列は従来通り左から
右へ、アミノ末端からカルボキシ末端の方向で示される
一般式で表わされることに注意せよ。さらにアミノ酸残
基配列の始め又は終りのダッシュはアミノ末端及びカル
ボキシ末端の各々Ｈ及びＯＨなどの置換基への結合又
は、１個以上のアミノ酸残基配列への結合を示している
ことに注意せよ。さらにアミノ酸配列の右端にある斜線
（／）はその配列が次の行まで続くことを示しているこ
とにも注意しなければならない。

【００１５】（ポリペプチド及びペプチド）ポリペプチ
ド及びペプチドは隣り合う残基のα−アミノ基とカルボ
キシル基の間のペプチド結合により互いに結合する一連
のせいぜい約６０個のアミノ酸残基を示して同義的に用
いられる言葉である。（タンパク質）タンパク質という言葉はポリペプチドと
同様に互いに結合する一連の約６０個以上のアミノ酸残
基を意味する。（ヌクレオチド）糖部分（ペントース）、リン酸及び窒
素ヘテロ塩基から成るＤＮＡ又はＲＮＡの単量体ユニッ
ト。塩基はグリコシド炭素（ペントースの１′炭素）を
介して糖部分に結合しており、そして塩基及び糖の組合
せはヌクレオシドと呼ばれる。ヌクレオシドがそのペン
トースの３′又は５′位に結合したリン酸基を含む場
合、これをヌクレオチドと呼ぶ。

【００１６】（塩基対（ｂｐ））二本鎖ＤＮＡ分子中の
アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、又はシトシン（Ｃ）と
グアニン（Ｇ）の組合せ。Ｂ．ＳＰ１８モノマー含有組成物本発明は、ＳＰ１８モノマーが実質的に単離した形で又
は実質的に純粋形で存在するＳＰ１８モノマー含有組成
物（本タンパク質組成物）に関する。“単離した”とい
う言葉は、ＳＰ１８モノマー及びＳＰ１８ダイマーが他
の肺胞界面活性タンパク質を含まない組成物の一部とし
て存在することを意味する。“実質的に純粋”という言
葉は、ＳＰ１８モノマーが他の肺胞界面活性タンパク質
を含まない組成物の一部として存在し、かつＳＰ１８モ
ノマーの２０パーセント以下、好ましくは１０パーセン
ト以下、より好ましくは５パーセント以下がホモ二量体
型、すなわちＳＰ１８ダイマーの一部として存在するこ
とを意味する。

【００１７】本発明のＳＰ１８モノマー含有組成物は、
ヒトＳＰ１８モノマーを含むことが好ましい。ＳＰ１８
モノマー含有組成物は、図１に示す残基位置１から少な
くとも約７５、好ましくは少なくとも約８１までのアミ
ノ酸残基配列に対応するアミノ酸残基配列を有するＳＰ
１８モノマーを含むことがより好ましい。本発明のタン
パク質組成物の形成に用いるＳＰ１８モノマーはその配
列が図１に示されている残基位置１から８１までの配列
に対応することがより好ましい。

【００１８】本発明のＳＰ１８モノマー含有組成物にお
けるＳＰ１８モノマーのアミノ酸残基配列は天然のＳＰ
１８モノマーの配列に対応することが好ましい。しか
し、本発明のタンパク質組成物を形成するのに用いるＳ
Ｐ１８モノマーは天然のＳＰ１８モノマーのアミノ酸残
基配列と同一である必要はないが、修飾が界面活性を破
壊しない限り本発明のポリペプチドに対し以下に述べる
ような種々の変化を受けうることを理解すべきである。
これらの修飾タンパク質は当分野でよく知られているよ
うに、例えばゲノムの部位指定突然変異誘発を介して生
成し得る。タンパク質又はポリペプチドの“界面活性”
とは、脂質と合せたとき、単独もしくは他のタンパク質
と組合せて、ロバートソン（Robertson)（ラング（Lun
g）、１５８、５７−６８（１９８０））のインビボ検
定法において活性を示す能力と定義される。この検定法
において、検定するサンプルは、気管を介して、帝王切
開により早産的に配給されるウサギ胎児又は子羊に投与
される。（これらの“プリーミー（Preemies）”はそれ
自体のＰＳを持たず、そのため通気により支えられてい
る。）肺コンプライアンス、血液ガス及びベンチレータ
ー圧の測定は活性の指標を提供する。また検定の予備評
価は例えばキング（King）等（アメリカンジャーナル・
オブ・フィジオロジー（Am, J, Physiol.)２２３、７１
５−７２６（１９７２））の、又はタンパク質又はポリ
ペプチドをリン脂質と混合したときの気液界面における
表面張力測定を利用する以下に説明されるインビトロ検
定法で行なわれる。

【００１９】Ｃ．核酸セグメント生きた生物において、タンパク質又はポリペプチドのア
ミノ酸残基配列はそのタンパク質をコードする構造遺伝
子のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列に遺伝子コードを
介して直接関係している。従って、構造遺伝子はアミノ
酸残基配列、すなわちそれがコードするタンパク質又は
ポリペプチドで定義し得る。遺伝子コードの重要で、か
つよく知られている特徴は縮退である。すなわち、タン
パク質を作るのに作用されるほとんどのアミノ酸につい
て、一個以上のコードヌクレオチドトリプレット（コド
ン）が１つの特定のアミノ酸残基をコード又は指定し得
る。それゆえ、多数のヌクレオチド配列が特定のアミノ
酸残基配列をコードし得る。このようなヌクレオチド配
列は、全ての生物において同じアミノ酸残基配列を生産
し得ることから機能的に等価と考えられる。ある場合に
は、プリン又はピリミジンのメチル化変異体を所定のヌ
クレオチド配列に組込み得る。しかし、いずれにしても
このようなメチル化は、そのコード関係に影響しない。
本発明のＤＮＡセグメントは基本的にＳＰ１８、好まし
いヒトＳＰ１８モノマーをコードするＤＮＡ配列から成
ることを特徴としている。すなわち、本発明のＤＮＡセ
グメントはＳＰ１８モノマーを発現し得る。構造遺伝子
を形成している。イントロンの存在のため、このＤＮＡ
セグメントのコドンはＳＰ１８モノマーのアミノ酸残基
配列と一致している必要はないが、核構造遺伝子は成熟
形の、すなわち翻訳後のタンパク質分解によるプロセッ
シングなしにＳＰ１８モノマーを発現し得ることが好ま
しい。該遺伝子は、核コドンがＳＰ１８モノマー中に存
在するアミノ酸をコードする、切断のない一連のコドン
として存在する、すなわちイントロンを含まない遺伝子
であることが好ましい。

【００２０】従って、基本的に図１で示されているヌク
レオチド位置約１８７から約４２６まで、好ましくは約
４２９までの配列を含み、かつ、ＳＰ１８モノマーを発
現し得るＤＮＡセグメントは、本発明の好ましい態様の
１つを構成している。ＳＰ１８モノマーをコードするＤ
ＮＡセグメントは化学的手法、例えばマチューシ（Matt
euccci) 等のホスホトリエステル法（ジャーナル・オブ
・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ（J. Am. Chem.
Soc.)１０３、３１８５（１９８１））により容易に合
成し得る。もちろん、コード配列を化学的に合成するこ
とにより、望みどおりの修飾は、本来のアミノ酸残基配
列をコードする塩基の代りに適当な塩基を用いることに
より容易に行うことができる。また、本発明は、上記Ｄ
ＮＡセグメントと等価なリボ核酸（ＲＮＡ）にも関す
る。

【００２１】Ｄ．組換え核酸分子本発明の組換え核酸分子は、本発明の核酸セグメントに
機能的にベクターを結合することにより生成し得る。こ
こで用いられているように、“機能的に結合する”とい
う語句は、該核酸セグメントが、ベクターの制御下、該
セグメントにより形成される遺伝子が発現されるように
ベクターに結合していることを意味する。ここで用いら
れている“ベクター”という言葉は、細胞中で複製可能
で、かつ、他の核酸セグメントが複製し得るよう機能的
に結合し得る核酸分子を意味する。ＳＰ１８モノマーを
コードする構造遺伝子の発現を指令し得るベクターは
“発現ベクター”と呼ばれる。従って、組換え核酸分子
（ｒＤＮＡ又はｒＲＮＡ）は通常自然の中では一緒に発
現されない少なくとも２個のヌクレオチド配列を含むハ
イブリッド分子である。

【００２２】本発明の核酸セグメントを機能的に結合さ
せるベクターの選択は、当分野でよく知られているよう
に、組換え核酸分子構築技術において本質的な制限とな
る、例えばタンパク質発現などの目的とする機能性及び
トランスホームする、宿主細胞に直接依存している。し
かし、本発明に関するベクターは、少なくとも複製を指
令し得、また好ましくはベクターに機能的に結合する核
酸セグメント中に含まれるＳＰ１８モノマー構造遺伝子
の発現をも指令し得る。好ましい態様において、本発明
に関するベクターは原核性レプリコン、すなわち細菌宿
主細胞等、そのベクターでトランスホームした原核性宿
主細胞中、染色体外でｒＤＮＡ分子の自己複製及び保持
を指令し得る能力を有するＤＮＡ配列を含んでいる。こ
のようなレプリコンは当分野でよく知られている。さら
に、原核性レプリコンを含むこれらの態様は、それをト
ランスホームした細菌宿主に薬剤耐性を提供する遺伝子
を含んでいる。典型的な細菌の薬剤耐性遺伝子は、アン
ピシリン又はテトラサイクリンに対する耐性を提供する
ものである。原核性レプリコンを含むこれらのベクター
は大腸菌等、それをトランスホームした細菌宿主細胞中
でのＳＰ１８モノマー遺伝子発現を指令し得る（転写及
び翻訳）原核性プロモーターも含む。プロモーターとは
ＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写を開始させるＤＮＡ
配列から形成される発現制御要素である。細菌宿主に適
合するプロモーター配列は、一般的に本発明のＤＮＡセ
グメントの挿入に便利な制限部位を含むプラスミドベク
ター中に提供される。典型的ベクタープラスミドにはバ
イオラドラボラトリー社から入手し得るｐＵＣ８、ｐＵ
Ｃ９、ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９及びファルマシア
社（N. J. ピスカタウェイ）から入手し得るｐＰＬ及び
ｐＫＫ２２３がある。真核細胞、好ましくは脊椎動物細
胞に適合する発現ベクターも本発明のｒＤＮＡ分子の形
成に使用し得る。真核細胞発現ベクターは当分野でよく
知られており、いくつかの業者から入手し得る。一般的
にこれらのベクターは目的とするＤＮＡセグメントを挿
入するのに便利な制限部位を含むものが提供されてい
る。これらの典型的ベクターにはｐＳＶＬ及びｐＫＳＶ
−１０（ファルマシア社）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ
（インターナショナルバイオテクノロジー社）及びｐＴ
ＤＴ１（ＡＴＣＣ＃３１２５５）がある。

【００２３】好ましい態様において、本発明のｒＤＮＡ
分子の構築に使用される真核細胞発現ベクターは真核細
胞中で有効な選択マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マ
ーカーを含んでいる。好ましい薬剤耐性マーカーは、ネ
オマイシン耐性を発現する遺伝子、すなわちネオマイシ
ンホスホトランスフェラーゼ（neo)遺伝子である。サウ
ザーン（Sowthern）等、ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・アンド・アプハイド・ジェネティクス（J. Mol. Ap
pl. Genet.）、１、３２７−３４１（１９８２）。

【００２４】本発明は、本発明の組換え核酸分子を形成
するためのレトロウィルス発現ベクターの使用にも関す
る。ここで用いている“レトロウィルス発現ベクター”
という語句はレトロウィルスゲノムのロングターミナル
リピート（ＬＴＲ）由来のプロモーター配列を含む核酸
分子を意味する。好ましい態様において、この発現ベク
ターは真核細胞中で複製能をもたないレトロウィルス発
現ベクターである。レトロウィルスベクターの構築及び
使用法はソージ（Sovge)により報告されている（モレキ
ュラー・アンド・セルラーバイオロジー（Mol. Cell. B
iol.）４、１７３０−３７（１９８４）。相補的粘着末
端を介してベクターに核酸セグメントを機能的に結合さ
せるための多くの方法が開発されてきている。例えば、
相補的ホモポリマー領域を挿入する核酸セグメント及び
ベクター核酸の末端部分に付加することができる。それ
からこのベクター及び核酸セグメントを相補的ホモポリ
マー末端間の水素結合により結合して組換え核酸分子を
生成する。１個以上の制限部位を含む合成リンカーはベ
クターに核酸セグメントを結合させる別の方法を提供す
る。例えば、本発明のＤＮＡセグメントを３′−５′エ
クソヌクレアーゼ活性で突出する３′一本鎖末端を除去
し、並びに、ポリメラーゼ活性で窪んでいる３′末端を
充填する酵素であるバクテリオファージＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼ又は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼで処理する。従
ってこれらの活性の組合せにより平滑末端ＤＮＡセグメ
ントが生成する。それから、この平滑末端セグメントを
バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼのような平滑末
端ＤＮＡ分子のライゲーションを触媒し得る酵素の存在
下、大過剰量のリンカー分子とインキュベートする。従
って、この反応の産物は末端に多重合リンカー配列をも
つＤＮＡセグメントである。これからこのＤＮＡセグメ
ントを適当な制限酵素で切断し、これらのＤＮＡセグメ
ントの末端に適合する末端を生成する酵素で切断した発
現ベクターにライゲーションする。種々の制限エンドヌ
クレアーゼ部位を含む合成リンカーは、インターナショ
ナルバイオテクノロジー社（ＣＴ．ニューヘブン）を含
む多くのメーカーから市販されている。また本発明は上
述の組換えＤＮＡ分子のＲＮＡ等価物に関する。

【００２５】Ｅ．形質転換細胞及びその培養また本発明は本発明の組換え核酸分子、好ましくは、Ｓ
Ｐ１８モノマーを発現し得るｒＤＮＡでトランスホーム
した宿主細胞に関する。この宿主細胞は原核性でもよい
し、又真核性でもよい。“細胞”又は“形質転換宿主細
胞”又は“宿主細胞”は、前後関係から明らかなように
しばしば同義的に用いられる。これらの言葉は、直接処
理された細胞及びもちろんその子孫を含む。突然変異を
起こす機会及び環境の差から、全ての子孫が親細胞と全
く同一であるとは限らないことは理解される。しかし、
上述の言葉を用いたとき、このような修正を受けた細胞
も含まれている。細菌細胞は、原核性宿主細胞であるこ
とが好ましく、一般的には、例えばベセスダリサーチラ
ボラトリーズ社（ＭＤ、ベセスダ）から入手し得る大腸
菌ＤＨ５株等の大腸菌である。好ましい真核性宿主細胞
には、イースト及び好ましくはマウス、ラット、サル又
はヒトの繊維芽細胞系列などの脊椎細胞のようなホ乳類
細胞が含まれる。好ましい真核性宿主細胞にはＣＣＬ６
１としてＡＴＣＣから入手し得るチャイニーズハムスタ
ー卵巣（ＣＨＯ）細胞及びＣＲＬ１６５８としてＡＴＣ
Ｃから入手し得るＮＩＨスイスマウス胎児細胞ＮＩＨ／
３Ｔ３が含まれる。

【００２６】本発明の組換え核酸分子による適当な細胞
宿主のトランスホーメーションは、一般的に使用するベ
クターの種類に依存した従来法により行なう。原核性宿
主細胞のトランスホーメーションに関しては、例えばコ
ーエン（Cohen)等、プロシーディング・イン・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Aca
d. Sci.）ＵＳＡ、６９、２１１０（１９７２）、及び
マニアチス（Maniatis)）等、モレキュラークローニン
グ、ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハー
バーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ＮＹ
（１９８２）参照。レトロウィルスベクターを含む組換
え核酸分子による脊椎動物細胞のトランスホーメーショ
ンに関しては、例えば、ソージ（Sorge)等、モレキュラ
ー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol. Cell. Bio
l.）４、１７３０−３７（１９８４）、グラハム（Grah
am）等、ヴィロロジー（Virol.）５２、４５６（１９７
３）、及びウィグラー（Wigler）等、プロシーディング
・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc. Natl. Acad. Sci.）ＵＳＡ、７６、１３７３−
７６（１９７６）参照。

【００２７】うまく形質転換（トランスホーム）した細
胞、すなわち、本発明の組換え核酸分子を含む細胞は、
よく知られている手法で同定し得る。例えば本発明のｒ
ＤＮＡの導入から生成した細胞はクローン化して、モノ
クローナルコロニーを生成し得る。これらのコロニーに
由来する細胞を収穫し、溶菌後、そのＤＮＡ含有物をサ
ウザーン（Southern）（ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー（J.Mol. Biol.)９８、５０３（１９
７５））又はベレント（Berent）等（バイオテクノロジ
ー（Biotech)、３、２０８（１９８５））により報告さ
れているような方法を用いｒＤＮＡの存在を試験した。
ｒＤＮＡ存在の直接検定に加え、トランスホーメーショ
ンの成功は、そのｒＤＮＡがＳＰ１８モノマーの発現を
指令し得る場合、従来の免疫学的方法によっても確認し
得る。例えば、本発明のＤＮＡセグメントを機能的に結
合した発現ベクターでうまくトランスホームした細胞は
ＳＰ１８モノマー抗原性を示すタンパク質を生産する。
従って、形質転換細胞を含む細胞培養物サンプルを収穫
し、その抗原に特異的な抗体を用いヒトＳＰ１８を検定
する。このような抗体の生産法及び使用法は、当分野で
よく知られている。

【００２８】このように、形質転換宿主細胞自身に加え
て、本発明は栄養培地中のこれら細胞の培養物、好まし
くはモノクローナル（クローン的に均一な）培養物、又
はモノクローナル培養物由来の培養物にも関する。この
培養物はＳＰ１８モノマー抗原性を示すタンパク質、よ
り好ましくは生物学的に活性なＳＰ１８モノマーを含む
ことが望ましい。形質転換宿主細胞の培養に有用な栄養
培地は当分野でよく知られており、またいくつかのメー
カーから入手し得る。宿主細胞がホ乳類である態様にお
いては、“無血清培地”を用いることが望ましい。Ｆ．ＳＰ１８生産を目的とした組換え法本発明の別の特徴には、ＳＰ１８、好ましくはヒトＳＰ
１８モノマーの生産法がある。この方法はＳＰ１８モノ
マーを発現し得る本発明のｒＤＮＡ分子でトランスホー
ムした宿主細胞、好ましくはヒト細胞を含有する栄養培
地の培養を開始することを必要とする。この培養を形質
転換細胞がＳＰ１８モノマーを発現するのに十分な時間
維持する。その後発現したタンパク質を培養物から回収
する。

【００２９】培養物から発現タンパク質を回収する方法
は当分野でよく知られており、それは、従来の生化学的
手法を用いたその培養物のタンパク質含有部分の分画を
含んでいる。例えば、タンパク質の分画によく知られて
いるゲル濾過、ゲルクロマトグラフィー、超遠心、電気
泳動、イオン交換、アフィニティクロマトグラフィーな
どの方法を使用してその培養物中に存在する発現タンパ
ク質を単離し得る。さらに、免疫アフィニティー、免疫
吸着などの免疫化学的方法も、従来法を用いて行うこと
ができる。

【００３０】また本発明はここで述べた組換え核酸法を
用いて生産したＳＰ１８モノマーに関する。Ｇ．ポリペプチド本発明のポリペプチド（本ポリペプチド）は、そのアミ
ノ酸残基配列及び新しい機能に特徴をもつ。本ポリペプ
チドを医薬的に許容し得るリン脂質と混合した時、その
リン脂質単独の界面活性より大きい界面活性を有する合
成肺胞界面活性物質が生成する（図６で示されるように
より低いΔＰ値及び、図７及び図８に示されるように所
定の圧力当りより大きい容積値で示される）。

【００３１】図１から分るように、ＳＰ１８は大きい疎
水性領域（残基１〜約７５）と、それにつづくカルボキ
シ末端の比較的短かい親水性領域（残基７６〜８０又は
８１）を有している。ＳＰ１８配列のアミノ酸残基番号
に関しては図１に示されているとおりである。ある態様
において、本ポリペプチドは基本的にＳＰ１８モノマー
の配列に対応する、少なくとも約１０個、好ましくは少
なくとも１１個のアミノ酸残基で、かつせいぜい約６０
個、一般的には約３５個以下、好ましくは約２５個以下
のアミノ酸残基より成る。一般に、本発明のポリペプチ
ドのアミノ酸配列は、ＳＰ１８の線型配列中で単一グル
ープの連続する残基に対応している。しかし、本発明
は、ＳＰ１８の１個以上の領域に対応するポリペプチド
にも関する。通常、ＳＰ１８の疎水性領域の少なくとも
１０個、好ましくは少なくとも１５個の連続する残基に
対応する少なくとも１個の配列が本ペプチドに存在す
る。多くの疎水性領域アミノ酸配列も存在し得る。

【００３２】本ポリペプチドは残基８０を含むＳＰ１８
の線型配列中の少なくとも５個の連続する残基をカルボ
キシ末端配列として含むことが好ましい。従って、本発
明のポリペプチドはＳＰ１８の一部に対応する１個以上
のアミノ酸残基グループを含み、その結果ＳＰ１８モノ
マーの連続する残基の最初のグループに対応する配列が
そのポリペプチド配列中のＳＰ１８モノマーの同じ部分
又は別の部分に由来する連続する残基の第２のグループ
に対応する配列に隣接することになる。また本発明は、
ＳＰ１８の線型配列由来の連続するアミノ酸残基の単一
グループに対応する２個以上の配列を有するポリペプチ
ドに関する。アミノ酸残基配列が、ヒトＳＰ１８疎水性
領域に対応する代表的ポリペプチドを表１に示す。

【００３３】

【表１】表１名称¹ アミノ酸残基配列ｐ１ −１５ FPIPLPYCWLCRALI ｐ１１−２５ CRALIKRIQAMIPKG ｐ２１−３５ MIPKGALAVAVAQVC ｐ３１−４５ VAQVCRVVPLVAGGI ｐ４１−５５ VAGGICQCLAERYSV ｐ４６−７６ CQCLAERYSVILLDTLLGRMLPQLVCRLVLR ｐ５１−６５ ERYSVILLDTLLGRM ｐ５１−７２ ERYSVILLDTLLGRMLPQLVCR ｐ５１−７６ ERYSVILLDTLLGRMLPQLVCRLVLR ｐ５４−７２ SVILLDTLLGRMLPQLVCR ｐ５４−７６ SVILLDTLLGRMLPQLVCRLVLR ｐ６１−７５ LLGRMLPQLVCRLVL ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

【００３４】１．各ポリペプチドの名称は、そのポリペ
プチド配列が対応する、図１に示されているヒトＳＰ１
８モノマーのアミノ酸残基配列の部分を示している。す
なわち、それは、そのタンパク質配列中のポリペプチド
配列の位置を示している。好ましい態様において、本発
明のポリペプチドは、一般式： −ＲＬＶＬＲＣＳＭＤＤ_z （式中、Ｚは０又は１の値をもつ整数で、Ｚが０のとき
そのサブスクリプトがついているＤ残基は存在せず、Ｚ
が１のとき、サブスクリプトがついているＤ残基は存在
する）で表わされるカルボキシ末端アミノ酸残基配列を
有することを特徴とする。代表的な好ましい“カルボキ
シ末端ポリペプチド”を表２に示す。

【００３５】

【表２】表２名称¹ アミノ酸残基配列ｐ７１−８１ CRLVLRCSMDD ｐ６６−８１ LPQLVCRLVLRCSMDD ｐ５９−８１ DTLLGRMLPQLVCRLVLRCSMDD ｐ５２−８１ RYSVILLDTLLGRMLPQLVCRLVLRCSMDD ｐ５１−８１ ERYSVILLDTLLGRMLPQLVCRLVLRCSMDD ｐ５１−８０ ERYSVILLDTLLGRMLPQLVCRLVLRCSMD ｐ３６−８１ RVVPLVAGGICQCLAERYSVILLDTLLGRMLPQLVCRLVLRCSMDD ｐ３２−８１ AQVCRVVPLVAGGICQCLAERYSVILLDTLLGRMLPQLVCRLVLRCSMDD ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ １．名称は表１と同様である。

【００３６】本ポリペプチドは図１に示した配列の一部
に対応するアミノ酸残基配列を有することが好ましい。
しかし、本発明のポリペプチドは本来のＳＰ１８モノマ
ーのアミノ酸残基配列と同一である必要はないことを理
解しなければならない。それゆえ、本発明のポリペプチ
ドは、その使用に際し特定の利点を提供する、保存的又
は非保存的な、挿入、欠失及び置換などの種々の変化を
受け得る。保存的置換とは１個のアミノ酸が別の生物学
的に類似するアミノ酸残基に置き換るものである。保存
的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン又は
メチオニン等の１個の疎水性残基の別の疎水性残基への
置換、又はアルギニンとリジン間、グルタミン酸とアス
パラギン酸間、又はグルタミンとアスパラギン間などの
極性残基同志の置換を含む。また、“保存的置換”とい
う語句は、もしそのポリペプチドが必要とする結合活性
を示すならば、本来の未置換アミノ酸の代りに置換アミ
ノ酸を使用することも含む。

【００３７】１つの好ましい態様においては、残基部位
７１及び７７のうちの少なくとも１つのシステイン
（Ｃ）残基の代りにセリン（Ｓ）残基が用いられる。こ
のセリン類似体は、残基７１に置換を有するＳＰ１８モ
ノマーの残基５１−７６の配列又は、残基７１及び７７
にセリン置換をもつ残基５１−８１の配列に対応する配
列を有することが好ましい。本発明のポリペプチドが１
個以上の保存的又は非保存的置換が行なわれたため、本
来のＳＰ１８モノマーと同一ではない配列を持つ場合、
本発明のポリペプチドに簡便にラベル又は固体マトリク
ス又はキャリヤーを固定化し得る。“リンカー”を提供
する目的で別の残基を末端に付加する場合を除いて、通
常せいぜい約２０パーセント（残基数）、より一般的に
はせいぜい１０パーセント（残基数）のアミノ酸残基が
置換される。本発明のポリペプチドと使用し得るラベ
ル、固体マトリクス又はキャリヤーを以下に説明する。

【００３８】通常、アミノ酸残基リンカーは、少なくと
も１個で、多いときは４０個以上のアミノ酸残基からな
り、より一般的には本来のＳＰ１８モノマーのアミノ酸
残基配列に対応しない１個〜１０個の残基からなる。リ
ンキングに用いられる典型的アミノ酸残基には、チロシ
ン、システイン、リジン、グルタミン酸及びアスパラギ
ン酸がある。さらに、本発明のポリペプチド配列は、ア
シル化などの末端NH₂-アシル化、又はチオグリコール酸
アミド化、又はアンモニア、メチルアミン等による末端
カルボキシルアミド化による修飾配列により、天然の配
列と異なり得る。リンカーを介してキャリヤーと結合
し、当分野でキャリヤー・ハプテン結合体として知られ
ているものを形成したとき、本発明のポリペプチドは、
ＳＰモノマーと免疫反応する抗体を誘導し得る。免疫学
的交叉反応性の確立された原則から見て、本発明は、表
１及び表２に示したポリペプチドの抗原的関連変異体に
関する。“抗原的関連変異体”とは表１又は表２のポリ
ペプチドの少なくとも６個のアミノ酸残基配列部分を含
み、かつ表１又は表２のポリペプチド及びＳＰ１８モノ
マーと免疫反応する抗体分子を誘導し得るポリペプチド
である。

【００３９】別の態様において、本発明のポリペプチド
は、ゼロ以下、好ましくは−１又はそれ以下、より好ま
しくは−２又はそれ以下の混成疎水性を有するアミノ酸
残基配列を有する。ペプチドの混成疎水性値の測定は例
２で詳しく説明する。これらの疎水性ポリペプチドは、
ＳＰ１８の疎水性領域の機能を果す。好ましい態様にお
いては、アミノ酸配列がＳＰ１８の疎水性及び親水性残
基を真似ている。好ましい疎水性ポリペプチドには、別
の疎水性及び親水性アミノ酸残基配列を有する配列を含
み、かつ一般式（Ｚ_aＵ_b）_cＺ_d で表わされる少なくとも１０個のアミノ酸残基を有する
ことを特徴とするものがある。

【００４０】Ｚ及びＵは、各場所においてＺ及びＵが独
立に選択されるアミノ酸残基である。Ｚは親水性アミノ
酸残基であり、Ｒ．Ｄ．Ｅ及びＫからなる群から選ばれ
ることが望ましい。Ｕは疎水性アミノ酸残基であり、
Ｖ．Ｉ．Ｌ．Ｃ．Ｙ及びＦからなる群から選ばれること
が望ましい。“ａ”、“ｂ”、“ｃ”及び“ｄ”は疎水
性又は親水性残基の数を示す数字である。“ａ”は約１
から約５、好ましくは約１から約３の平均値を持つ。
“ｂ”は約３から約２０、好ましくは約３かち約１２、
最も好ましくは約３から約１０の平均値を持つ。“ｃ”
は１から１０、好ましくは２から１０、最も好ましくは
３から６の値を持つ。“ｄ”は１から３、好ましくは１
から２の値を持つ。

【００４１】Ｚ及びＵにより表わされるアミノ酸残基が
独立に選択されると記述したことは、各場所において、
特定のグループからの残基の選択されることを意味す
る。すなわち、例えば、“ａ”が２のとき、Ｚで表わさ
れる各疎水性残基は、独立に選択され、つまり、ＲＲ、
ＲＤ、ＲＥ、ＲＫ、ＤＲ、ＤＤ、ＤＥ、ＤＫ等を含み得
る。“ａ”及び“ｂ”が平均値を持つと記述したこと
は、反復配列内の残基（Ｚ _aＵ_b）の数がそのペプチド
配列中でいくぶん変化し得るが、“ａ”及び“ｂ”の平
均値は各々約１から約５及び約３から約２０の値である
ことを意味している。上述の一般式の代表的な好ましい
ポリペプチドを表３に示す。

【００４２】

【表３】１．この名称は示されているアミノ酸残基配列の略号で
ある。

【００４３】また、本発明は、１０から６０個のアミノ
酸残基からなる混成（Composite)ポリペプチドに関す
る。基本的に混成ポリペプチドはアミノ末端配列及びカ
ルボキシ末端配列からなる。アミノ末端配列は上述の一
般式で定義されるような本発明の疎水性領域ポリペプチ
ド又は疎水性ペプチドのアミノ酸配列を有する。カルボ
キシル末端配列は、カルボキシ末端ペプチドのアミノ酸
残基配列を有する。本発明のポリペプチドは、ポリペプ
チド分野で知られている手法により合成し得る。使用し
得る多くの手法の秀れた摘要書が出ている。固相ペプチ
ド合成に関しては、Ｊ．Ｗ．スチワード（Steward)及び
Ｊ．Ｄ．ヤング（Young)“固相ペプチド合成”Ｗ．Ｈ．
フリーマン社、サンフランシスコ、１９６９及びＪ．メ
イエンホーファー（Meienhofer) “ホルモン性タンパク
質及びペプチド”２巻、４６頁、アカデミックスプレス
（ニューヨーク）、１９８３、及び古典的液相合成に関
してはＥ．シュローダー（Schroder）及びＫ．クブケ
（Kubke)“ペプチド”１巻、アカデミックプレス（ニュ
ーヨーク）、１９６５参照。

【００４４】一般に、これらの方法は、１個以上のアミ
ノ酸残基又は適当に保護したアミノ酸残基を成長するペ
プチド鎖に順次付加していくことを含む。通常、最初の
アミノ酸残基のアミノ基又はカルボキシル基は、適当
な、選択的に除去し得る保護基で保護しておく。リジン
のような反応性側鎖官能基を含むアミノ酸には、別の選
択的に除去し得る保護基を用いる。例として、固相合成
を用いる時、保護又は誘導アミノ酸を、その未保護カル
ボキシル基又はアミノ基を介して不活性固体サポートに
結合する。そのアミノ基又はカルボキシル基の保護基を
選択的に除去後、適当に保護した相補的（アミノ又はカ
ルボキシル）基を有する、配列中の次のアミノ酸を混合
し、固体サポートにすでに結合している残基とアミド結
合を形成するのに適した条件下で反応させる。それから
アミノ又はカルボキシル基の保護基を新しく付加したア
ミノ酸残基から除去し、同様に次のアミノ酸を付加して
いく。最終的に望ましいアミノ酸が正しい配列に結合さ
れ、残存する末端及び側鎖基の保護基（及び固体サポー
ト）を順次又は一度に除去し、最終的ポリペプチドが与
えられる。Ｈ．合成界面活性物質組換え的に生成したＳＰ１８及び、又は本ポリペプチド
は医薬的に許容し得るリン脂質と混合し、呼吸困難症の
治療に有用な合成肺胞界面活性物質を生成し得る。

【００４５】“医薬的に許容し得る”という語句は、ヒ
トに投与したとき、アレルギー又は、同様の不都合な反
応を起こさない分子及び組成物に用いられる。タンパク
質と混合することにより合成肺胞界面活性剤を生成する
のに有用なリン脂質は当分野ではよく知られている。ノ
ッター（Notter）等、クリニカルペリナトロジー（Cli
n. Perinatology) 、１４、４３３−７９（１９８７）
（合成界面活性物質への天然及び合成リン脂質の使用に
関するレヴュー）参照。１つの態様において、本発明
は、医薬的に許容し得るリン脂質と混合した効果的な量
の本ポリペプチドを含む、ＲＤＳの治療に効果的な合成
肺胞界面活性物質に関する。所定のポリペプチド−リン
脂質の組合せに対する至適ポリペプチド：リン脂質重量
比の測定法はよく知られているが、治療に効果的な比
は、約１：５から約１：１0,０００、好ましくは約１：
１００から約１：５０００、及びより好ましくは約１：
５００から約１：１０００の範囲である。より好ましい
態様において、ポリペプチド：リン脂質重量比は約１：
５から約１：２０００、好ましくは約１：７から約１：
１０００及びより好ましくは約１：１０から約１：１０
０の範囲である。従って、本発明の合成肺胞界面活性物
質は約５０、通常約８０からほとんど１００重量パーセ
ントの脂質及び約５０、通常約２０から１以下の重量パ
ーセントのポリペプチドを含み得る。本ポリペプチド
は、ＳＰ１８配列の一部に対応するポリペプチドについ
ては界面活性物質の約１から約１０重量パーセント、及
び全ＳＰ１８モノマーに対応するポリペプチドについて
は１：１００の割合で存在することが好ましい。

【００４６】脂質部分は、不飽和ホスファチジルコリ
ン、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、トリアシル
グリセロール、パルミチン酸スフィンゴミエリン又はこ
れらの混合物と混合した、約５０から約９０、より好ま
しくは約５０から約７５重量パーセントのジパルミトイ
ルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）であることが好ま
しい。合成肺胞界面活性物質は本ポリペプチド溶液をリ
ポソームサスペンジョンと混合する、又は、有機溶媒の
存在下、直接本ポリペプチド及び脂質を混合することに
より調製する。その後、溶媒は透析又は窒素雰囲気下、
及び、又は減圧下のエバポレーションにより除去する。
本合成肺胞界面活性物質は、例えば一般的に液体サスペ
ンジョン、乾燥粉末又はエアロゾルのように、気管内投
与用に調合するのが好ましい。例えば、合成界面活性剤
（ポリペプチド−脂質ミセル）を水、食塩水、デキスト
ロース、グリセリンなどの医薬的に許容し得る賦形剤と
液体状態で懸濁する。また、界面活性物質含有治療組成
物は、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどを含むpH
緩衝剤のような少量の非毒性補助物質を含み得る。粉末
状の合成界面活性物質を調製するためには、合成界面活
性物質をここで述べているように調製し、凍結乾燥して
から乾燥粉末として回収する。

【００４７】もし、本合成界面活性物質をエアロゾルと
して使用する場合は界面活性物質及びプロペラントを一
緒にし、しっかり密封した形で供給される。投与される
界面活性物質は脂肪酸及びエステルである。しかし、本
発明の場合、界面活性物質複合物ＤＰＰＣ及びＰＧを成
分として用いることが好ましい。一般的に有用なプロペ
ラントは、室温におけるガスを圧縮したものである。ま
た低級アルカン及びフレオン等のフッ素化アルカンも使
用し得る。エアロゾルは適当なバルブを備えた容器にパ
ッケージし、その内容物は放出されるまで加圧下に維持
される。合成界面活性物はその投与型に応じ、気管チュ
ーブにより、又はエアロゾル投与により、又はサスペン
ジョン又は粉末のの吸入ガスへの噴霧により投与され
る。合成ＰＳ量は１回の投与に約1.０から約４００mg／
kg、好ましくは約５０mgから約５００mg／kgの範囲で投
与される。新生児に対しては、一般に１〜３回の投与で
十分である。成人の場合は十分に再構成した複合体を投
与し、正常な範囲内のPO₂を生成させる（ホールマン
（Hallman)等、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベ
スチゲーション（J. Clinical Investigation)、７０、
６７３−６８２、１９８２）。

【００４８】以下の例は本発明を説明するためのもので
あり、これを制限するものではない。（例．）（例１）天然ＳＰ１８の単離及び特性化Ａ．方法（ＬＭＷアポタンパク質の精製）ヒト肺胞界面活性物質
を全期半膜液から単離し、レバク（Revak)等（アメリカ
ンレヴューオブレスピラトリーデシーズ（Am. Rev. Res
pir. Dis.)、１３４、１２５８−１２６５（１９８
６））及びホールマン(Hallman）等（ペディアトリクス
（Pediatrics）、７１、４７３−４８３（１９８３））
により報告されている、１％ｎ−オクチル−β−Ｄ−グ
ルコピラノシドを含むトリス−ＥＤＴＡバッファ中、２
００ミリグラム（mg）界面活性物質当り４ミリリットル
（ml）充填容積のＤＥＡＥ−セファセルＡ−５０（ファ
ルマシア、アプサラ、スウェーデン）カラムにかけた。
この特定のカラム及び条件は、激しい変性を起こす有機
溶媒にさらすことなく３５０００ダルトンのアポタンパ
ク質（他の実験に使用する）を単離するために使用し
た。この条件下でカラムに結合しない脂質及びタンパク
質を含むボイドボリュームフラクションを回収し、等容
量の２：１クロロホルム：メタノールで抽出した。

【００４９】相分離を行なう遠心後、上層を（水＋メタ
ノール）1/2 容積のクロロホルムで再抽出した。遠心
後、生じた下の有機相に最初の下層を加え、窒素気流中
乾燥するまでエバポレートした。１００〜１８０mgのリ
ン脂質、ＬＭＷアポタンパク質及びオクチルグルコピラ
ノシドを含むこの抽出物を2.５mlのクロロホルム：メタ
ノール（２：１）に再び溶解した。ＬＭＷタンパク質及
びリン脂質からオクチルグルコピラノシドをうまく分離
できることが分っているタカハシ（Takahashi)等（バイ
オケム．バイオフィズ．リサーチ．コミュニケーション
（Biochem. Biophys Res. comm.)１３５、５２７−５３
２（１９８６）の方法に従がい、直径2.5 cmのガラスカ
ラムに４℃で、２：１クロロホルム：メタノール溶液
中、３８cmの高さとなるようセファデックスＬＨ−２０
を充填した。

【００５０】クロロホルム：メタノール（２：１）溶液
とした２mlのフラクションをカラムに乗せ、8.５ml／ｈ
の流速で溶出した。４０mlバッファをカラムに流した
後、リン脂質が溶出してきた。オクチルグリコピラノシ
ドは５６〜１１６ml領域に現れた。リン脂質領域を回収
し、窒素雰囲気下で乾燥後、１mlのクロロホルムに溶解
した。室温でガラスカラムにクロロホルム中９mlのバイ
オシル（Bio-Sil)ＨＡ（バイオラド社、リッチモンド、
ＣＡ州）を充填しケイ酸カラムを作製した。サンプル
（およそ５０mlのリン脂質を含む）をカラムに乗せ、１
１mlのクロロホルムで洗浄した。オンラインモデル１２
０ＡＨＰＬＣを用い、等重量のクロロホルム及びメタノ
ール（３8.８ｇ）（２6.５mlクロロホルム及び５０mlメ
タノール）を使用してメタノールの直線濃度勾配を作
り、これで溶出した。勾配をカラムにかけつつ各２mlの
フラクションを採取した。図１は得られたタンパク質及
びリン脂質の溶出曲線を示している。リン脂質分析はフ
ラクション１７−２０に小さなピーク及びフラクション
３０に大きなピークを示した。ピアスＢＣＡタンパク質
検定はフラクション１２−１９及び２８−３３がポジテ
ィブであったが、後者のピークはこの領域に存在するリ
ン脂質によるものであるらしいことに注意せよ。ドデシ
ル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動はＳ
Ｐ９及びＳＰ１８の間にいくらか離れて生ずるフラクシ
ョン１３〜１９に存在するＬＭＷアポタンパク質を示し
た。別に、ホーグッド（Hawgood)等により考案された方
法（プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）ＵＳＡ
８５、６６−７０（１９８７）は、ＰＳのブタノール抽
出及びそれにつづく酸性クロロホルム／メタノールバッ
ファ中のセファデックスＬＨ−２０クロマトグラフィー
を用いており、ＬＭＷアポタンパク質の単離に使用し得
る。さらにいくつかの実験のため、２個のＬＭＷアポタ
ンパク質の分離をセファデックスＬＨ−６０を用いて行
った。１cm径のガラスカラムに、５％0.１N HCl を含む
クロロホルム／メタノール（１：１）中のセファデック
スＬＨ−６０（ファルマシァ社、アプサラ、スウェーデ
ン）を４０cm充填した。流速は１〜２ml／ｈを使用し
た。0.５mlバッファ中の、バイオシル（Bio-Sil)ＨＡカ
ラム又はホーグッド（Hawgood)等の報告したＬＨ−２０
カラム由来の約２００〜７００マイクログラムのタンパ
ク質を含むＬＭＷアポタンパク質混合物をカラム上端に
乗せ、0.５ml毎のフラクションを回収した。一般的にＳ
Ｐ１８タンパク質はフラクション１６〜１９に、そして
ＳＰ９はフラクション２４−２９に溶出した。適当なフ
ラクションを集め、窒素雰囲気下グラス中で乾燥した。
短時間の凍結乾燥でHCl の完全な除去が保証された。タ
ンパク質は使用前にメタノールに溶解した。

【００５１】（ＳＤＳゲル電気泳動）１６％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動は、３×７cmミニスラブゲルを用
い、レムリ（Laemmli)（ネイチャー（Neture）、２２
７、６８０−６８５（１９７０））の方法に従がってド
デシル硫酸ナトリウムの存在下で行った（ＳＤＳ・ＰＡ
ＧＥ）。サンプルには、ジスルフィド還元剤である１％
のβ−メルカプトエタノールを添加した電気泳動後、そ
のゲルを５０％メタノール＋１２％酢酸中に一晩浸して
固定し、水で２時間洗浄後、レイ（Wray）等の方法（ア
ナリティカルバイオケミストリー（Anal. Biochem.）１
１８、１９７−２０３（１９８１））に従って銀染色し
た。（オクチルグルコピラノシド検定）スピロ（Spiro)（メ
ソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymo
l.）、８、３−５（１９６６））のアンスロン法に基づ
くｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドの定量法
は、レバク（Revak)等（アメリカンレヴュー・オブ・レ
スピラトリー・デシーズ（Am. Rev. Respir. Dis.)、２
３４、１２５８−１２６５（１９８６）により先に報告
されている。（タンパク質測定）５μｇまでのタンパク質を含む有機
サンプルを窒素雰囲気下で１２×７５mmガラス管中で乾
燥した。１５マイクロリットル（μｌ）の１％ＳＤＳ水
溶液及び３００μｌのＢＣＡタンパク質検定試薬（ピア
スケミカル社、ロックフォード、ＩＬ州）を各ガラス管
のタンパク質に混合した。ガラス管にカバーをし、６０
℃３０分間インキュベートした。冷却後、サンプルを９
６穴平底ポリスチレン製マイクロプレートに移し、ＯＤ
５５０を測定した。標準試料としてウシ血清アルブミン
を用いた。脂質が存在するとき（すなわちバイオシル
（Bio-Sil)ＨＡクロマトグラフィー前）いくらかのリン
脂質はこのBcA タンパク質検定で反応し、タンパク質定
量に誤差を生じさせることに注意せよ。一度精製してし
まえば、疎水性ＬＭＷアポタンパク質自体はＢＣＡ試薬
との反応性が低く、それ故単離タンパク質の全定量値は
アミノ酸組成物に基づくものとなる。

【００５２】（リン脂質）ジパルミトイルホスファチジ
ルコリン（ＤＰＰＣ、β，γ−ジパルミトイル−Ｌ−α
−レシチン）及びＬ−α−ホスファチジル−ＤＬ−グリ
セロール（ＰＧ、卵レシチンの誘導体）は、カルバイオ
ケム−ベーリング（Calbiochem-Behring)（ラジョラ、
ＣＡ州）又はアバンチポーラ−リピッズ（Avanti Polar
-Lipids)（バーミンガム、ＡＬ州）から購入した。ＤＰ
ＰＣはクロロホルム中のＰＧに重量比３：１の割合で添
加した。（ＬＭＷアポタンパク質とリン脂質との混合）インビト
ロ検定用に、１２×７５mmガラス管中、４μｇのＳＰ９
又はＳＰ１８を含むメタノール溶液をクロロホルム中の
４００μｇＤＰＰＣ：ＰＧに添加した。簡単なボルテッ
クス攪拌後、サンプルをＮ₂雰囲気下で乾燥した。各々
のガラス管に９０マイクロリットルの水を加え、周期的
に緩やかに攪拌しながら、３７℃の水浴中で１５分間イ
ンキュベートした。イオン強度は検定前に各サンプルに
１０μｌの９％NaClを加えて保持した。インビボのウサ
ギ実験用に、５０μｇのＬＭＷアポタンパク質（ＳＰ９
及びＳＰ１８の両方を含む）、又は２５μｇＳＰ９又は
２５μｇＳＰ１８をＮ₂雰囲気下で乾燥した。クロロホ
ルム中に５mgのリン脂質（ＤＰＰＣ：ＰＧ、３：１）を
加えた。サンプルを添加し、乾燥後、1.５mMCaCl₂を含
む１００ミルモル濃度（mM) の食塩水２５０μｌ中に懸
濁して0.5〜１％タンパク質を含む２０mg／mlの再構成
界面活性物質を生成した。（界面活性検定）脈動バブルの表面張力を低める能力と
して検定する界面活性のインビトロ検定及びウサギ胎児
を用いたインビボ検定は両方共レバク（Revak)等（アメ
リカンレヴュー・オブ・レスピラトリーデシーズ（Am.
Rev. Respir. Dis.)、１３４、１２５８−１２６５（１
９８６））により先に詳細に報告されている。（形態測定検定）水柱３０cm圧で膨張させた後、水柱１
０cm圧で収縮させたウサギ胎児の肺を１０％ホルマリン
に７２時間浸した。パラフィンセクションの上下を正し
く配置し、前後に５ミクロン毎に切断した。ヘマトキシ
リン及びエオシン染色後、多くの断片について、上から
下へ１０個の視野（１００×）を計数した。各処理グル
ープの空洞体積に対する肺間隙組織の比を測定するため
標準化形態測定法（ウェイバー（Weiber) 、“立体学的
方法”１巻、アカデミックプレス版；ニューヨーク、ｐ
３３−５８、１９７９）を用いた。肺胞周囲の交点も測
定した。

【００５３】（リン脂質リン酸検定）リン脂質はバート
レット（Bartlett）の方法（ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.) 、２３４、
４６６−４６８（１９５９））に従がって定量した。（アミノ酸分析）アミノ酸組成物に対し３個のサンプル
をHCl との１１０℃、２４時間のインキュベーション、
HCl との１５０℃、２４時間のインキュベーション、又
は過ギ酸との１１０℃、２４時間のインキュベーション
とそれにつづく１１０℃、２４時間のHCl とのインキュ
ベーションにより加水分解した。分析はベックマンモデ
ル１２１−Ｍアミノ酸分析機（ベッマンインスツルメン
ト社、フラートン、ＣＡ州）を用いた。トリプトファン
は測定しなかった。（アミノ酸配列決定）蒸気相タンパク質配列決定はアプ
ライドバイオシステムズ４７０Ａアミノ酸シークエンサ
ーを用いて行った（アプライドバイオシステムズ社、
フォスターシティ、ＣＡ州）を使用してメタノールの直
線濃度勾配を作成し、これで溶出を行った。

【００５４】（ヒトＳＰ１８のｃＤＮＡクローンの単
離）新生物障害の外科的切除の際に得られた非罹患成人
肺組織サンプルからＲＮＡをチャーグウィン（Chirgwi
n）等の方法（バイオケミストリー（Biochemistry）１
８、５２９４−５２９９（１９７９））に従がい調製し
た。二本鎖ｃＤＮＡの調製は標準的手法を用いて行ない
（チャーグウィン（Chirgwin）等、上述及びエフストラ
チアジス（Efstratiadis）等“遺伝子工学”ステロー
（Stelow）及びホレンダー（Hollaender）編プレナムプ
レス版、ニューヨーク、１、１５−４９（１９７９）、
またライブラリーは、レボク（Le Bouc)等の方法（Ｆ．
Ｅ．Ｂ．Ｓ．レターズ（Letters)、１９６、１０８−１
１２（１９８６））に従がいラムダＮＭ６０７で構築し
た。ＳＰ１８クローンはアプライドバイオシステムズ社
の自動合成機を用いて合成し、かつＨＰＬＣで精製した
合成オリゴヌクレオチドプローブでファージプラークを
スクリーニングすることにより同定した（ベントン（Be
nton）等、サイエンス（Science)、１９６、１８０−１
８２（１９７７）。最初のクローン候補は小さいヒト界
面活性アポタンパク質ｃＤＮＡの部分的ヌクレオチド配
列に由来する（シリング（Schilling)等国際特許出願Ｗ
Ｏ８６／０３４０８）プローブＴＧ９９６（５′CATTGC
CTGTGGTATGGCCTGCCTCC３′）を用いて得た。より大きい
クローン（1.５kbまで）は大元のクローンの１つの５′
側配列に基づくプローグＴＧ１１０３（５′TCGAGCAGGA
TGACGGAGTAGCGCC ３′）を用いて単離した。ｃＤＮＡク
ローンのヌクレオチド配列は適当なＭ１３ベクターにサ
ブクローニングしたEco R1制限フラグメントを用いチェ
ーンターミネーション法（サンガー（Sanger）等、プロ
シーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）ＵＳＡ、７４、
５４６３−５４６７（１９７７））により決定した。

【００５５】Ｂ．結果（ＬＭＷアポタンパク質の特性）ヒト羊水から単離した
ＬＭＷアポタンパク質はケイ酸クロマトグラフィー又は
ホーグッド（Hawgood)等により報告されているセファデ
ックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー（プロシー
ディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）ＵＳＡ、８５、６６
−７０（１９８７））の後、非還元条件下のＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動において２個のタンパク質
バンドとして出現する。見かけの分子量１8,０００ダル
トンの上側バンドはダイマーであり、従ってＳＰ１８ダ
イマーと命名した。β−メルカプトエタノールの添加に
よりＳＰ１８ダイマーは還元されて９０００ダルトンの
ものになり、これをＳＰ１８モノマーと命名した（図
３）。ＳＰ９と命名したもう１つのＬＭＷアポエタンパ
ク質は還元剤の存在下又は非存在下、９及び１2,０００
ダルトンの間に分散した形のバンドとして出現する。Ｓ
Ｐ９はセファデックスＬＨ−６０のクロマトグラフィー
によりＳＰ１８ダイマー及びＳＰ１８モノマーと分離し
た。これらの精製タンパク質を図３に示す。

【００５６】ＳＰ１８モノマー及びＳＰ９のアミノ酸組
成を測定した。これらタンパク質が極端に疎水性のた
め、HCl 加水分解は標準の１１０℃２４時間の加水分解
に加え、さらに１５０℃で２４時間行ない、そして、そ
の加水分解物の分析由来のバリン、ロイシン及びイソロ
イシンの計算値はこの激しい条件下で測定したものを使
用した。表３に示されているように、両タンパク質は高
密度にバリン及びロイシンを含む極端に疎水性のもので
ある。

【００５７】

【表４】表４ヒトＳＰ９及びＳＰ１８モノマーのアミノ酸組成及びＳＰ１８の理論的組成との比較¹ ＳＰ９ＳＰ１８ＳＰ１８アミノ酸（モル％）（モル％）（モル％)¹ アスパラギン酸（又はアスパラギン） 1.1 3.4 3.7 スレオニン 0.8 1.5 1.2 セリン 1.8 2.7 2.5 グルタミン酸（又はグルタミン） 1.5 6.7 6.2 プロリン 8.3 7.8 7.4 グリシン 10.6 6.1 4.9 アラニン 4.9 10.2 9.9 システイン² 9.1 7.2 8.6 バリン³ 12.2 11.7 11.1 メチオニン 3.4 3.2 3.7 イソロイシン³ 6.8 6.4 7.5 ロイシン³ 22.4 17.4 17.3 チロシン 0.7 2.2 2.5 フェニルアラニン 2.6 1.5 1.2 ヒスチジン 5.4 0.0 0.0 リジン 4.7 3.0 2.5 アルギニン 3.9 9.0 8.6 トップトファン N.D.⁴ N.D.⁴ 1.2 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

【００５８】１．理論的組成は残基８１までの配列デー
タに基づく。２．システイン含量は過ギ酸及びHCl 加水分解後に測定
した。３．イソロイシン及びロイシン含量は各々、２４時間、
１５０℃のHCl 加水分解後に測定した。４．トリプトファンは測定しなかった。ＳＰ１８モノマーのアミノ末端配列分析は以下の配列を
示した。 NH₂-Pho-Pro-Ile-Pro-Leu-Pro-Tyr- 精製ＳＰ９モノマーの反復配列決定は、全てがロイシン
に富み、かつ少なくとも６個の保存的バリンを含む多重
ペプチドを示した。NH₂末端分析は、調製毎に各々異な
る量比でフェニルアラニン、グリシン及びイソロイシン
を示した。

【００５９】（ＳＰ１８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列分
析）ＳＰ１８モノマーｃＤＮＡクローンのヌクレオチド
配列を図１に示す。この配列はイヌのＳＰ１８ｃＤＮＡ
と８３％の相同性を有していた（ホーグッド（Hawgood)
等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）ＵＳ
Ａ、８５、６６−７０（１９８７）。大きい読み枠配列
中の配列は、単離したタンパク質のエドマン分解で測定
されたように、ＳＰ１８モノマーのアミノ末端と完全に
一致するものが同定された（図３の下線部分）。このこ
とは成熟ＳＰ１８モノマーが、より大きい前駆体分子の
プロセシングにより生ずることを意味している。成熟配
列においては、単一の強力なＮ−グリコシル化部位（As
nllo）は存在するが、チロシン硫酸化部位及び３５００
０ダルトンアポタンパク質中にみられＧ−Ｘ−Ｙ反復配
列（ホワイト（White)等、アドバーンスドペディアト
リクスリサーチ（A. Pediatrics Research) １９、５
０１−５０８（１９８５））は存在しない。

【００６０】還元型ＳＰ１８ダイマーのＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより得られた９０００ダルトンの分子量は、アミノ
末端にNH2-Pho-Pro-Ile-Pro-Leu-Pro-Tyr を持つ完全な
前駆体タンパク質配列に対して予想されていたもの（１
９７７２ダルトン) よりも低く、このことは、アミノ酸
７０〜９０個の範囲でさらにプロセシングされているこ
とを意味している。これに基づき、残基１から８１を含
む推定上の９０００ダルトンタンパク質の理論的アミノ
酸組成（表１）は、精製したＳＰ１８モノマーの測定値
とよく一致する。前駆体タンパク質のアミノ末端部分
（残基１−８１）はアルカリ性でＣＯＯＨ末端部分（残
基８２−１８１）よりも疎水性が大きい。残基１−８１
のカイト・ドゥーリトル指標は９１００（ｐＩ８．６）
であり、また残基８２−１８１の値は−３０００（ｐＩ
５．９１）である（カイト(Kyte)等、ジャーナル・オブ
・ペディアトリクス（J. Pediatrics)、１００、６１９
−６２２（１９８２））。イヌの配列におけるのと同様
に（ホーグッド(Hawgood) 等、プロシーディング・イン
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.
Natl. Acad. Sci.）ＵＳＡ、８５、６６−７０（１９８
７））アミノ末端（残基１−８１）は三個の疎水性ドメ
インを含む（１〜１１、２２−４９及び５３−７４）。
これらは、１個の荷電性ドメイン（残基１２〜２１）及
び２個の親水性かつ荷電性配列（残基４７〜５４及び７
２〜８１）中に点在している。

【００６１】（ＬＭＷアポタンパク質を用いた界面活性
の再構成）４００μｇ／１００μｌのリン脂質（ＤＰＰ
Ｃ：ＰＧ３：１（重量））、リン脂質＋４μｇＳＰ９、
又はリン脂質＋４μｇＳＰ１８を含むサンプルを調製し
た。各サンプルを脈動バブルサーファクトメーターを用
い、表面張力を低める能力について検定した。その結果
を、１５秒、１分（min)及び５分の時点における平均最
小表面張力として表４に示した。満期羊水から単離し、
４mg／mlに希釈した天然のヒト界面活性物質を比較とし
て示した。リン脂質も、ＬＭＷアポタンパク質も単独で
は有意な表面張力低下能を有していなかったが、リン脂
質とＳＰ９又はＳＰ１８との混合物は有意な活性を示し
た。

【００６２】１重量パーセントのＳＰ１８をリン脂質と
合わせると、等量の天然のヒト界面活性物質で得られる
値と同等のレベルにまで表面張力測定値を低下させた
（１５秒間でリン脂質＋ＳＰ１８については6.３±0.２
dyne／cm、天然の界面活性物質については2.０±1.２dy
ne／cm）。等重量で比較するとＳＰ９は表面張力の低下
を効果的に行なわなかった（１５秒で１6.７±0.８dyne
／cm）。

【００６３】

【表５】表５脈動バブルにおける最小表面張力１５秒１分５分ＰＬ² 42.9±1.4 41.6±1.6 34.9±4.9 ＰＬ＋ＳＰ９³ 16.7±0.8 14.1±1.2 12.2±1.0 ＰＬ＋ＳＰ１８³ 6.3±0.2 5.1±1.0 4.9±0.6 天然ヒト界面活性物質⁴ 2.0±1.2 2.4±1.4 0.4±0.4 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

【００６４】１．バブル形成から１０秒後に２０サイク
ル／分の脈動を開始した。全ての値はdyne・cm^-1で表わ
され、それらは少なくとも３回の測定の平均値である。２．リン脂質ＤＰＰＣ：ＰＣ、３：1.４mg／ml ３．リン脂質と比較して１％（重量）４．４mg／mlに希釈外因性（合成）界面活性物質活性のインビボ検定は、Ca
単独又はリン脂質、リン脂質＋ＬＭＷアポタンパク質、
又は天然ヒト界面活性物質を合せて含む食塩水を未熟胎
児ウサギの気道に注入することにより行った。この動物
に３０分間通気してから吸引鐘中減圧下で脱気した。そ
の後肺に圧力を与えて膨張させ、各圧力で必要とされる
空気容積を記録した。水柱３０cmの圧力からの収縮の際
の所定の圧力で必要とされる容積も同様に測定した。こ
の圧力／容積曲線を精製ＳＰ９又はＳＰ１８で作った合
成界面活性物質（全リン脂質濃度の0.５％（重量））を
与えた動物及び適当なコントロール動物について図４に
示した。天然の界面活性物質又は、食塩水又は、等重量
で比べてＳＰ９より効果的であると思われるＳＰ１８を
含むリン脂質を与えた動物の比較から分るように各合成
界面活性物質で処理した動物においては、肺コンプリア
ンスの改善は明白である。ＳＰ９及びＳＰ１８の混合物
を用いて同様の実験を行った。この結果は、図４におけ
るリン脂質＋ＳＰ１８の曲線とほとんど同じであった。

【００６５】コンプリアンス測定につづいて、その肺を
水柱３０cmの圧力で膨張させ、ついで水柱１０cmの圧力
で収縮させた後、固定して切断しホルマリン固定した。
この断片をヘマトキシリン及びエオシンで染色して顕微
鏡観察した。図５に示したように、食塩水（Ａ）又はリ
ン脂質（Ｃ）で処理した肺は拡張不全であるが、天然の
界面活性物質（Ｂ）又は再構成した界面活性物質を投与
した動物の肺は正常な肺胞拡張を示した。薄い断片の形
態測定分析は、食塩水処理では、間質／空洞比が4.７０
でありリン脂質単独では3.２９であったのに対し、天然
の界面活性物質では0.４９８、再構成界面活性物質では
0.５３８となることを示した。これらのデータを表５に
示し、図５に見られるような空洞の有意な増加（Ｐ＜0.
００１、マン・ウィットニー（Mann-Whitney）Ｕテス
ト）と一致した。同様に肺胞周囲の比較は、界面活性物
質処理動物と比較して、食塩水又はリン脂質処理した胎
児における肺胞境界交点数に有意な増加（Ｐ＜0.００
３）があることを示した。

【００６６】

【表６】表６ウサギ胎児処理後の空洞の形態測定分析気管注入物間質／空洞食塩水 4.７０リン脂質¹ 3.２９リン脂質¹＋ＬＭＷアポタンパク質² 0.５３８天然ヒト界面活性物質³ 0.４９８ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ １．動物当り２mgのＤＰＰＣ：ＰＧ（３：１）２．リン脂質を添加した２０μｇのＬＭＷアポタンパク質３．動物当り２mg Ｃ．討論本実験は、既知のリン脂質に添加して生物学的に活性な
肺胞界面活性物質を作り得る、ヒト羊水界面活性物質か
ら単離した２個の低分子アポタンパク質について述べて
いる。本実験のタンパク質はＳＰ１８ダイマー、ＳＰ１
８モノマー及びＳＰ９と命名したが、最近の文献から、
ＬＭＷＰＳアポタンパク質（５〜１8,０００ダルトンの
範囲）について多くの名称及び分子量の分類が存在する
ことは明白である。物理的性質の見かけの相違は、種の
相違、精製度の相違、及び取扱い技術の相違、ＳＤＳポ
リアクリルアミドゲルにおける標準物質に基づく低分子
量測定のバラツキ及びゲル中の低分子量タンパク質バン
ドの脂質による強力な妨害等を含む種々の因子によって
説明し得る。

【００６７】アミノ酸組成及びアミノ酸配列の比較及び
特異的抗体を用いた免疫学的分析は、ＬＭＷアポタンパ
ク質の分類に役立つであろう。ここで述べられている、
還元又は非還元条件下で９〜１2,０００ダルトンの範囲
でＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に拡散したバンドを
示すＳＰ９タンパク質はおそらくフィセット（Whitset
t）等のＳＡＰ−６（ペディアトリクスリサーチ（Pedia
trics Research)、２０、７４４−７４９（１９８
６））、（ホーグッド（Hawgood)等のＳＰ５−８（プロ
シーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）ＵＳＡ、８５、
６６−７０（１９８７）、フェルプス（Phelps）等のＰ
ＳＰ−６（アメリカンレヴューオブ・レスピラトリ
ーデシーズ（Am. Rev. Respir. Dis.)、１３５、１１１
２−１１１７（１９８７））及びタカハシ（Takahashi)
等の５kDa の脂質タンパク質（バイオケムバイオフィ
ズリサーチコミュニケーション（Biochem. Biophy
s.Res. Comm.) 、１３５、５２７−５３２（１９８６）
と同じタンパク質であると思われる。このタンパク質の
極端な疎水性は、そのアミノ酸組成（表３）及びロイシ
ンリッチ領域に先行する少なくとも６個の保存的バリン
を示す配列データから明らかである。羊水界面活性物質
から誘導したＳＰ９調製物中の３個のアミノ末端残基
（フェニルアラニン、グリシン及びイソロイシン）の存
在は、そのアミノ末端から１個又は２個の残基は欠けて
いるが、同一の配列を有する一群のペプチドを示してい
る。最近、フェルプス（Phelps）等は仔牛のＰＳＰ−６
アポタンパク質について同様の知見を報告している。

【００６８】ＳＰ１８ダイマーはジスルフィド結合して
いる２個の同一の９０００ダルトンペプチド（ＳＰ９の
９０００ダルトンペプチドとは異なる）から成る。ＳＰ
１８モノマーのアミノ酸組成（表３）は、多数の疎水性
残基を示している。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにＳＰ１８
タンパクをオーバーロードしたとき、徐々に染色強度が
弱くなるバンドが３６０００及び５６０００ダルトンの
ところに見られる。このことは、タンパク質のオリゴマ
ー化を示している。還元条件では単一の９０００ダルト
ンバンドのみが見られた。先に述べたように単離したＳ
Ｐ９及びＳＰ１８ダイマーは、リン脂質と組合せること
により生物学的活性をもつことが示された。リン脂質Ｄ
ＰＰＣ：ＰＧに対して１％（重量）のＳＰ１８の添加は
直ちに表面圧を増加し、１５秒間で１０dyne／cm以下に
表面張力を低下させた。ＤＰＰＣ：ＳＰに対し１％のＳ
Ｐ９の添加はわずかに低い効果を示し、１５秒、１分及
び５分間で各々１6.７、１４．１及び１2.２dyne／cmに
まで表面張力を低下させた。ＳＰ１８ダイマー及びＳＰ
９の混合物も有効であったが、その合成効果が付加的な
ものか、相乗的なものかを決定するにはさらに実験する
ことを必要とする。ウサギ胎児モデルを用いた（シュナ
イダー（Schneider)等、ジャーナル・オブ・ペディアト
リクス（J. Pediatrics)、１００、６１９−６２２、
（１９８２）を用いた再構成界面活性物質のインビボ実
験は、各タンパク質同様、ＳＰ１８ダイマー及びＳＰ９
の混合物についても行った。肺コンプリアンスの著しい
改善は、リン脂質単独又は食塩水を投与した動物と比較
して、天然の界面活性物質又は、ＳＰ１８ダイマーアポ
タンパク質で調製した再構成界面活性物質で処理した動
物について見られた（図４）。ＳＰ９を用いたときは中
間の改善がみられた。再構成界面活性物質を調製するの
にＳＰ１８ダイマー及びＳＰ９の混合物を用いた同様の
実験は、ＳＰ１８ダイマーのみを用いたときの結果と同
様の結果を示した（図４黒四角）。しかし、この実験に
おけるＳＰ１８ダイマーとＳＰ９の正確な比は確認し得
なかった。図５は界面活性物質注入後の拡張不全を含ま
ないことを示す肺胞の代表的顕微鏡視野を示している。

【００６９】スズキ（Suzuki）等（ヨーロピアン・ジャ
ーナル・オブ・レスピラトリーデシーズ（Eur. J. Resp
ir. Dis.），６９，３３６−３４５（１９８６））は、
ブタのＬＭＷ（＜１5,０００ダルトン）界面活性物質ア
ポタンパク質をＤＰＰＣ：ＰＧ混合物に、５：８０：２
０（タンパク質：ＤＰＰＣ：ＰＧ）の重量比で添加した
ときの表面張力の減少（ウィルヘルムバランス又は脈動
バブルで測定）及び水柱２５cmの通気圧における未成熟
ウサギの吸入容積の５倍の増加を報告した。このシステ
ム中に存在するタンパク質が１個なのか多数なのかは不
明である。また３５０００ダルトンのアポタンパク質を
用いた以前の実験は（レバク（Revak)等、アメリカン
レヴュー・オブ・レスピラトリーディシーズ（Am. Rev.
Respir, Dis.），１３４，１２５８−１２６５、１９
８６）は、先に述べた実験においてＳＰ９を用いた場合
と同様に、表面張力の中程度の減少を示した。ＳＰ１
８、ＳＰ９及び３５０００ダルトンアポタンパク質、さ
らにはCa⁺⁺及びおそらく種々のリン脂質をも含めて、こ
れらの種々の組合せ及び種々の濃度を用い、これら界面
活性物質の種々の成分間の相互作用を説明し、生物学的
活性を示す外的界面活性物質に最適な条件を決定するた
めの実験をしさらに行わなければならないことは明らか
である。

【００７０】例２ポリペプチドの界面活性のインビトロにおける評価Ａ．方法（界面活性の測定）最小気泡半径時の気液界面の表面圧
の測定（水柱の高さ（cm）で示される負圧で表現され
る）は、エンホーニング（Enhorning)（ジャーナル・オ
ブ・アプライドフィジオロジー（J. Appl. physiol.)、
４３、１９８−２０３、（１９７７））により報告され
ている脈動バブル法を用い、経時的に測定した。簡単に
言うと、エンホーニング・サーファクトメーター（Enho
rning Surfactometer ）（サーファクトメーターインタ
ーナショナル、トロント、オンタリオ州）で、最大（0.
５５mm）及び最小（0.４mm）径の間で、２０サイクル／
min の速度で脈動する気泡の気液界面の圧力勾配（Δ
Ｐ）を測定する。３７°の水で囲まれた２０μｌサンプ
ル室中で生成した気泡を顕微鏡で観察する一方、その圧
力変化を、０及び−２cm H₂Oで校正したチャートレコー
ダーで記録した。（混成疎水性値の測定）各ペプチドの混成疎水性値は、
ペプチド中の各アミノ酸残基に、ここで参考として引用
しているホップ（Hopp）等（プロシーディング・イン・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Na
tl. Acad. Sci.）ＵＳＡ，７８，３８２４−３８２９
（１９８１））の表１に記述されている各親水性値を割
振ることにより決定した。所定のペプチドに対し、その
親水性値を加算し、その合計が混成疎水性値を表わして
いる。

【００７１】（合成界面活性物質の調製）各ペプチドを
溶媒と混合した後、リン脂質（ＤＰＰＣ：ＰＧ）３：１
と合せて、以下に示す方法の１つに従がい合成界面活性
物質を作った。方法Ａでは、まず４００μｇのリン脂質
を含むクロロホルム１００μｌと、１６μｌのペプチド
／溶媒混合物（４０μｇペプチド）を混合し、３７℃で
約１０分間その混合物を攪拌してペプチド／リン脂質混
合物を作った。窒素雰囲気下の乾燥により、そのペプチ
ド／リン脂質混合物からクロロホルムを除去した。この
ようにして生成した合成界面活性物質を９０μｌの H₂O
と混合し、３７℃で約１０分間緩やかに攪拌した。つづ
いて、１０μｌの９％NaClを界面活性物質含有溶液に添
加した。方法Ｂでは、まずガラス管中に４００μｇのリ
ン脂質を含む１００μｌのクロロホルムを入れ、３７℃
で約１０分間、Ｎ₂下で乾燥することによりクロロホル
ムを除去した。ペプチド／溶媒混合物１６μｌ及びH₂O
７４μｌを、その乾燥リン脂質に混合し、３７℃で約１
０分間緩やかに攪拌した。このようにして生成した合成
界面活性物質に１０μｌの９％NaClを混合した。

【００７２】方法Ｃでは、まずポリペプチド−ＰＬ混合
物を４３℃に１０分間維持し、その後Ｎ₂下の乾燥によ
りその混合物からクロロホルムを除去した。必要な場合
は、さらにその混合物を減圧下で１５分間乾燥し、乾燥
ポリペプチド−ＰＬ混合物を作った。それから４又は１
０mg／ml（表７に指示されている）の最終ＰＬ濃度を与
えるのに必要とされる体積の９０％に等しいと計算され
る量の水を、各乾燥混合物に混合し、第２の混合物を作
った。この第２混合物を攪拌しながら４３℃に１時間維
持した。つづいて望ましいＰＬ濃度を与えるのに必要と
される体積の１０％に等しい体積の６％NaClをその第２
混合物に混合し、この最終混合物を４３℃に１０分間維
持した。ほとんどの場合、この最終混合物は、３回の凍
結融解サイクルからなる最終ステップ操作を行った。Ｂ．結果表７に示されている合成界面活性物質は、表中に指示さ
れているように調製した。

【００７３】

【表７】表７ (2) (3) (1) リン脂質混成疎ペプチド溶媒生成混合物混合法水性値 n-プロピルアルコールサスペンジョンＡ −16.7 H₂O 溶液Ｂ＋ 1.7 クロロホルムサスペンジョンＡ − 9.2 H₂O 溶液Ｂ − 9.9 H₂O 溶液Ｂ − 5.4 H₂O サスペンジョンＢ − 2.2 メタノールサスペンジョンＡ − 9.9 H₂O サスペンジョンＢ＋ 3.9 H₂O 溶液Ｂ＋ 3.7 メタノール：H₂O サスペンジョンＡ − 1.0 メタノール：H₂O サスペンジョンＡ − 6.2 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

【００７４】(1) 各ポリペプチドは、溶媒μｌ当り2.５
μｇペプチド濃度となるように指定の溶媒と混合した。 (2) 文字は、使用した合成界面活性物質調製法を示して
いる。 (3) 各ペプチドの混成疎水性値は、先に述べたように測
定したものである。表６に示されている合成界面活性物質は、各々、先に述
べたエンホーニング（Enhorning)の“バブル検定法”を
用いインビトロで表面張力を減少させる能力により証明
される界面活性の検定を行った。図６に示されているよ
うに、本実験結果は、医薬的に許容し得るリン脂質と混
合した時、本ポリペプチドは、より低いΔＰ値により証
明されるように、リン脂質単独よりも、より大きい界面
活性を有する合成肺胞界面活性物質を生成する。一般的
に、ポリペプチドを用いると、１０％〜８０％より低い
ΔＰ値が得られる。本発明の範囲に従がわない８個のア
ミノ酸残基からなるコントロールペプチドｐ７４−８１
は、リン脂質単独の場合よりもより大きい活性を有する
合成ＰＳを生成せず、このことは、アミノ酸残基長が重
要な性質であることを示していることに注意が必要であ
る。

【００７５】本発明の別の代表的ポリペプチドの界面活
性も上述の“バブル検定法”を用いて測定した。この実
験結果を以下の表７に示す。各ポリペプチドを、溶媒ml
当り2.５mgポリペプチドの濃度となるように指示されて
いる溶媒と混合した。生じた混合物について、溶液又は
不溶性ポリペプチドのサスペンジョンのいずれが生成し
ているかを観察した。サスペンジョンを生成している混
合物についてはさらに１０秒間の水浴超音波処理を行な
い。ガラスピペットを用いたピペッティングに適した微
細サスペンジョンにした。各ペプチドを溶媒と混合後、
ガラス管中で、クロロホルム中のリン脂質（ＰＬ）、Ｄ
ＰＰＣ：ＰＧ、３：１と混合し、その結果添加したポリ
ペプチド量は、添加したＰＬ量の１０分の１（１０％
（重量））となり、以下方法Ａ．Ｂ又はＣに従って合成
界面活性物質を生成した。

【００７６】それから各合成界面活性物質について、先
に述べたバブル検定におけるインビトロでの表面張力の
減少能で証明される界面活性の検定を行った。圧力勾配
（ΔＰ）は先に述べたエンホーニングサーファクトメー
ターを用いて計測されるポリペプチド−ＰＬ最終混合物
の界面活性の尺度となる。測定値は１５秒（１５″）、
１分（１′）及び５分（５′）の時点で計測し、指示し
たポリペプチド−ＰＬ混合物の３回の独立した測定値の
平均値として示されている。ＰＬ単独（ＰＬ）及び天然
のヒト界面活性物質の同様なサンプルについての圧力勾
配測定値もコントロールとして計測した。本実験結果を
表８に示す。

【００７７】

【表８】表８ (1) (2) (3) 生成リン脂質 PL濃度ペプチド溶媒混合物混合法 mg／ml p1 -15 N-プロパノールサスペンジョンＡ４ p36-81 50％クロロホルムサスペンジョンＣ＋１０ 50％メタノール p44-80 68％クロロホルム溶液Ｃ− １０⁵ 32％メタノール p46-76 64％クロロホルム溶液Ｃ＋１０ 36％メタノール p51-72 75％クロロホルムサスペンジョンＣ＋１０ 25％メタノール p51-76 37％クロロホルム溶液Ｃ＋１０ 63％メタノール p51-80 45％クロロホルム溶液Ｃ＋１０ 55％メタノール p51-81 50％クロロホルムサスペンジョンＣ＋１０ 50％メタノール p52-81 67％ＤＭＦ溶液Ａ４ 33％クロロホルム p54-72 76％クロロホルムサスペンジョンＣ＋１０ 24％メタノール p54-76 71％クロロホルムサスペンジョンＣ＋１０ 24％メタノール p59-80 32％クロロホルムサスペンジョンＣ− １０⁵ 68％メタノール p59-81 68％クロロホルム溶液Ｃ− ４ 32％メタノール p64-80 48％クロロホルム溶液Ｃ− １０⁵ 52％メタノール p66-81 40％ＤＭＦサスペンジョンＡ４ 60％クロロホルム p74-81 水溶液Ｂ４ DL4 47％クロロホルム溶液Ｃ− ４ (31mer) 53％メタノール RL4 32％クロロホルム溶液Ｃ− ４ 68％メタノール RL8 19％クロロホルムサスペンジョンＣ＋１０ 81％メタノール RRL7 49％クロロホルム溶液Ｃ− ４ 51％メタノール RCL-1 79％クロロホルムサスペンジョンＣ＋１０ 21％メタノール RCL-2 67％クロロホルムサスペンジョンＣ＋１０ 33％メタノール RCL-3 75％クロロホルムサスペンジョンＣ＋１０ 25％メタノール PL Ｃ＋１０天然ヒト界面活性物質１０ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

【００７８】表８続き (4) 圧力勾配ペプチド１５″ １′ ５′ p1 -15 0.９４ 0.８２ 0.４８ p36-81 0.９０ 0.８７ 0.７９ p44-80 0.７７ 0.６４ 0.２４ p46-76 0.９０ 0.８０ 0.６２ p51-72 1.１５ 0.７６ 0.３３ p51-76 0.９９ 0.９１ 0.４２ p51-80 0.９２ 0.８９ 0.４８ p51-81 0.９４ 0.８６ 0.６４ p52-81 1.３３ 1.１９ 0.９６ p54-72 1.２８ 0.９２ 0.３８ p54-76 0.９２ 0.８２ 0.２３ p59-80 1.１０ 0.９６ 0.６４ p59-81 1.０８ 1.０２ 0.７５ p64-80 1.０７ 0.８７ 0.１１ p66-81 1.２２ 1.１１ 0.８４ p74-81 2.３７ 2.３２ 2.３１ DL4 2.００ 1.８０ 1.３０ (31mer) RL4 0.５８ 0.６５ 0.３３ RL8 0.６８ 0.６９ 0.１９ RRL7 1.６５ 1.２５ 1.００ RCL-1 0.５０ 0.５９ 0.０６ RCL-2 0.００ 0.００ 0.００ RCL-3 0.５５ 0.５１ 0.３３ PL ＞2.５０＞2.５０ 2.３３天然ヒト界面活性物質 1.０６ 0.８９ 0.７９ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

【００７９】(1) ペプチド、溶媒及びＰＬの当初の混合
物が溶液又はサスペンジョンのいずれであるかが示され
ている。 (2) 文字は、使用した合成界面活性物質調製法を示して
いる。“＋”は、その最終混合物を、３回の凍結融解サ
イクルからなる最終ステップ操作を行ったことを示して
おり、“−”はその操作を行なわなかったことを示して
いる。 (3) 最終混合物のリン脂質（ＰＬ）濃度（“Conc”，）
は、混合物ミリリットル当りのＰＬミリグラム（mg／m
l）で表わされている。 (4) 圧力勾配は、例２で述べたエンホーニングサーファ
クトメーターを用いて計測したポリペプチド−ＰＬ最終
混合物の界面活性の尺度である。測定値は１５秒（１
５″）、１分（１′）及び５分（５′）の時点で計測
し、指示されているポリペプチド−ＰＬ混合物の３回の
独立した測定値の平均値として表わされている。またＰ
Ｌ単独及び天然のヒト界面活性物質に関する同様のサン
プルについての圧力勾配測定値も示してある。 (5) これらの溶液は２０mg／mlＰＬ濃度となるように調
製し、テスト前に１０mg／mlに希釈した。これらの結果は、医薬的に許容し得るリン脂質と混合し
た場合、本ポリペプチドが所定の圧力当りより高い体積
で示されるように、リン脂質単独よりもより大きい界面
活性を有する合成肺胞界面活性物質を生成することを示
している。例３合成界面活性のインビボにおける評価

【００８０】Ａ．方法（合成界面活性物質の調製）まず本ポリペプチドを例２
に述べたように溶媒と混合した。さらにこの混合物をリ
ン脂質（ＰＬ）と混合し、その結果添加したポリペプチ
ド量が以下に示されているように添加したＰＬ量の３
％、７％又は１０％（重量）となるようにした。最終的
ポリペプチド−ＰＬ混合物（合成界面活性物質）は、こ
の最終混合物が、最終混合物ml当り２０mgリン脂質を含
むこと以外、例２の“合成界面活性物質の調製”セクシ
ョンに詳しく述べたように最終凍結融解ステップを用
い、方法Ｃに従って生成した。（注入プロトコール１）（プロトコール）：ウサギ胎児を、気管に例３Ａで調製
した合成界面活性物質又は例１で述べたように調製した
天然界面活性物質（ＮＳ）２mg又は２mgのＰＬを含む0.
１mlの溶液を注入することにより処理した。（プロトコール２）：各成分を次に示す順序（１）0.０
５ml空気、(2) 0.１mlの例３Ａで調製した合成界面活性
物質、又は２mlＰＬ又は２mg天然界面活性物質を含む溶
液、(3) 0.1 mlの空気、で含む一本のシリンジからの気
管への注入により、合成界面活性物質をウサギ胎児に注
入する。（プロトコール３）：１つのシリンジから例３Ａで述べ
たように調製した合成界面活性物質の0.１ml部分標本
（又は２mgＮＳ又は２mgＰＬ）を先に述べたようにウサ
ギの気管に注入し、つづいて第２のシリンジから0.０５
mgのラクテートリンガーズ溶液及び0.２ml空気を注入し
た。（プロトコール４）：１つのシリンジから例３Ａで述べ
たように調製した合成界面活性物質0.１ml、0.１５ml空
気、0.１ml食塩水及び0.３ml空気を先に述べたように気
管に注入した。つづいて、0.３ml空気を２回注入した。（プロトコール５）：ウサギ胎児を、気管に、次に示す
注入順序（１）例３Ａで調製した合成界面活性物質又は
４mg天然界面活性物質又は４mgＰＬを含む0.２ml溶液、
(2) 0.１５ml空気、(3) 0.１ml生理食塩水及び(4) 0.３
ml空気、で４成分を含む１本のシリンジから、注入する
ことにより処理した。それから上述の注入を第１の注入
から１５分後に繰り返した。（プロトコール６）：ウサギを、第１注入につづいて連
続して２回0.３mlの空気を注入し、かつ１５分合成の第
２の注入を行なわないこと以外、プロトコール５で述べ
たのと同様に処理した。（界面活性を研究するためのウサギ胎児モデル）本発明
の代表的ポリペプチドの界面活性を、以下に示す例外は
別に、先にレバク（Revak)等により詳細に報告されてい
る方法（アメリカン・レヴュー・オブ・レスピラトリー
・ディシーズ（Am. Rev. Respir. Dis.)，１３４，１２
５８−１２６５（１９８６））に従がい測定した。

【００８１】２７日間妊娠ウサギ胎児を帝王切開により
取り出した後直ちに0.０５mlノーキュロン（Norcuron）
（オルガノン社、ＮＪ州）を注入し自然呼吸を防いだ。
その後、ウサギ胎児の体重を測定し、ついで小さなカニ
ュールを気管切開により気管内に挿入した。上述のよう
に調製した合成界面活性物質を、先の注入プロトコール
の１つを用いて、ウサギ胎児の肺に注入した。注入後そ
のウサギをベンチレーター（ベビーバード、ベビーバー
ド社、パームスプリング、ＣＡ州）に連結した特製のプ
レチスモグラフ（セレスコ伝達器を含む）に入れ、その
注入した肺を、ピーク吸入圧２５cm H₂O、最終排気圧４
cm H₂O及び吸入時間0.５秒のサイクルを毎分３０サイク
ルの速度で通気した。いくつかの実験においては、この
通気操作を通して種々の時点で動的コンプライアンス測
定を行った。他の場合には、通気後、静的・コンプライ
アンス測定を行った。

【００８２】静止コンプライアンス測定は通気から３０
分後に行った。この動物をベンチレーターから取り出
し、ついで、減圧下の吸引鐘中−２０cm H₂Oでその肺の
脱気を行った。その後、まず気管切開管に連結したＴ形
コネクターを介して肺を膨張させ、ついで収縮させた。
この膨張及び収縮相の間、５、１０、１５、２０、２５
及び３０cm H₂Oの静止圧に到達するのに必要な空気容積
を測定し、静的コンプライアンスの尺度として静止圧／
容積曲線を作った。プレチスモグラフを用い、６０分の
通気時間を通して種々の時点の動的コンプライアンス測
定を行った。コンピュータによるデータ解析で各時点に
おける、体重キログラム当りcm H₂O当りの空気容積mlで
表わされるコンプライアンスデータを作った。コンプラ
イアンスは以下の式で計算した。

【００８３】コンプライアンス＝ΔＶ／ΔＰ ΔＰ_tp＝（Ｃ^-1）・（ΔＶ）＋（Ｒ）・（Ｆ）Ｐ_tp＝移動肺胞圧Ｃ＝圧力に対する弾性成分に関する体積変化）Ｒ＝抵抗（圧力に対する流動に関する）Ｆ＝流動Ｖ＝容積＝時間に関する流動の積分値上述の式は、Ｃ及びＲに関する多重線型回帰で解ける。
コンプライアンス（Ｃ）は肺の弾性を表わしており、ま
た抵抗（Ｒ）は、肺に出入りする気体の流動に対する抵
抗に打勝つのに必要な圧力を表わしている。

【００８４】Ｂ．結果注入プロトコール１及び５を用いた静的コンプライアン
スデータを各々図７及び図８に示す。１つの例外を除い
て、リン脂質単独（ＰＬ）で処理した肺と比較して、天
然界面活性物質又はテストした合成界面活性物質で処理
した全ての肺で肺コンプリアンスの改善が見られた。ｐ
１−１５を用いて調製した合成界面活性物質（図７）
は、静的コンプライアンスで測定した場合、ＰＬ単独の
場合よりも改善された肺のコンプライアンスを示さなか
った。動的コンプリアンス実験の結果を表９に示す。

【００８５】

【表９】表９動的コンプライアンス空気容積ml／cm Ｈ₂Ｏ×１０⁴ ───────────────── 体重ｇＰＬに対するペプ界面活性物質注入後の時間（分）チドの割合１０２０３０４０ＰＬ７８７１０２４２２２３２３１５１６１７１８ ──────────────────────────────────ＮＳ２６５２５１１６８１８６４１８３８８４０５２８８１５５１７６１７２ ──────────────────────────────────ｐ３６−８１５％２５５５％２４５１０％１５４１０％２５２ ──────────────────────────────────ｐ４４−８０１０％¹ ２７８７１３８２０７１０％¹ ２０２３３５５９ ──────────────────────────────────ｐ５１−８０１０％¹ ４２１１４２４７３００１０％¹ ──────────────────────────────────ｐ５２−８１５％５１７５％４３４１０％１９５１０％４３ ──────────────────────────────────ｐ５１−７６１０％３３２２５６８７１０％１０１１１８６３５８１０％１５３６１０９２４１ ──────────────────────────────────ｐ５１−８０１０％１７４１５２７８１０％７６９４１４９１４９１０％２３７１１３０１５６１０％４２１１４２４７３８８ ──────────────────────────────────ｐ５９−８０１０％¹ ２４３４６８１０７１０％¹ ５５１１１１９０３００ ──────────────────────────────────ｐ６４−８０１０％¹ ６３１２９２３５３１８

【００８６】表９（続き）動的コンプライアンス空気容積ml／cm Ｈ₂Ｏ×１０⁴ ───────────────── 体重ｇ界面活性物質注入後の時間（分）サンプルを提供する５０６０プロトコール＃ＰＬ１１１５４２２２０４２１２９４ ─────────────────────────────────ＮＳ１７３１４７＊４２３７＊４１７２１７９４ ─────────────────────────────────ｐ３６−８１１４６＊３２９１３１，１６２２６２３２ ─────────────────────────────────ｐ４４−８０３２３６８７１３６６ ─────────────────────────────────ｐ５１−８０６６ ─────────────────────────────────ｐ５２−８１２２６＊３５５＊３１，２４３２１，６９０２ ─────────────────────────────────ｐ５１−７６１２４８５４１４１１４４＊４２６４３０１４ ─────────────────────────────────ｐ５１−８０９９２０８４２１７３０８４１８２１０９＊４６ ─────────────────────────────────ｐ５９−８０１４６１３２６３７６６ ─────────────────────────────────ｐ６４−８０６１．ウサギへの注入後、これらのサンプルは２５ミクロンフィルターで濾過した。＊時間依存のコンプライアンスの減少は気胸の発達を示している。表８に示されているように、本発明の合成界面活性物質
及び天然界面活性物質はリン脂質単独の場合と比べて動
的コンプライアンスを改善した。Ｃ．討論インビボのコンプライアンス実験は、本発明の多数の代
表的合成界面活性物質は、リン脂質単独の場合と比較し
てコンプライアンスを増加させることを示している。従
って、医薬的に許容し得るリン脂質と混合した時、本発
明のタンパク質及びポリペプチドは、リン脂質単独の場
合よりも大きい界面活性を有する合成界面活性物質を生
成する。これらの合成界面活性物質の使用は、インビボ
においてコンプライアンスを改善するのに有利である。例４肺上皮細胞へのＣ末端ペプチドの結合実験

【００８７】Ａ．方法（ペプチド結合検定）ＳＰ１８の残基７４−８０（ＶＬ
ＲＣＳＭＤ）を有するペプチドを¹²⁵Ｉを用い（ニュー
イングランドニュクリア社、３4.１モル／ml、２8.０ng
／mg、７５μCi／ml）ボルトン・ハンター法（ボルトン
（Bolton）等、バイオケミカルジャーナル(Biochem.
J.）、１３３、５２９−５３８、１９７３）により放射
性ラベルした。ヒトの肺胞上皮細胞（ヒト肺がん細胞、
ＡＴＣＣ参照番号ＣＣＬ１８５、一般にＡ５４９細胞と
して知られている。）を６穴組織培養皿中集密化するま
で増殖した。本実験には以下の溶液を使用した。ＰＢＳ／ＢＳＡ１０mM リン酸ナトリウム＋0.１５Ｍ NaCl＋0.５％ＢＳＡ pH7.４溶解バッファ１％ＳＤＳ水溶液Ｆ溶液５ml ＰＢＳ／ＢＳＡ＋５1.５６μｇコールドペプチドＤ溶液 2.５ml ＰＢＳ／ＢＳＡ＋８７μｌ¹²⁵Ｉ−ペプチドＤ１／５溶液 0.５mlＤ＋2.０ml ＰＢＳ／ＢＳＡＤ／１２５溶液 0.５mlＤ１／５＋2.０ml ＰＢＳ／ＢＳＡＥ溶液 2.５ml ＰＢＳ／ＢＳＡ＋８７μｌ¹²⁵Ｉ−ペプチド＋２0. ７８μｇコールドペプチドＥ１／５溶液 0.５mlＥ＋2.０ml ＰＢＳ／ＢＳＡＥ／１２５溶液 0.５mlＥ１／５＋2.０ml ＰＢＳ／ＢＳＡ以下の溶液0.５mlと２２℃、１５分インキュベーション
することにより、３枚の６穴プレートを前処理した。偶
数番号のウェルはＰＢＳ／ＢＳＡで前処理し、また奇数
番号のウェルはＦ溶液で前処理した。前処理溶液を除去
後、以下に示す溶液0.５mlを入れ、２２℃で指示した時
間、緩やかに揺らしながらそのウェルをインキュベーシ
ョンした。

【００８８】ウェルサンプルインキュベーション時間（分）１Ｄ７２Ｅ７３Ｄ１／５７４Ｅ１／５７５Ｄ１／２５７６Ｅ１／２５７７Ｄ３０８Ｅ３０９Ｄ１／５３０１０Ｅ１／５３０１１Ｄ１／２５３０１２Ｅ１／２５３０１３Ｄ１４３１４Ｅ１４３１５Ｄ１／５１４３１６Ｅ１／５１４３１７Ｄ１／２５１４３１８Ｅ１／２５１４３インキュベーション時間の終りに、上清を各ウェルから
取り出し、計数用に保存した。各フェルは、冷（４℃）
ＰＢＳ／ＢＳＡで４回洗浄した。洗浄液は計数用に保存
した。その後プレートを室温に戻してから各ウェルに１
mlの溶解バッファを入れた。全ての細胞が溶解し、プレ
ートから遊離するまで（３〜４分間）プレートを緩やか
に振盪した。各ウェルから溶液を取り出し、計数した。
溶解バッファ２mlを各ウェルに入れ、数分間混合後、結
合カウント数の計数用に取り出した。結合カウントの割
合及び絶対値を測定した。

【００８９】特異的結合カウント値は非ラベル（コール
ド）ペプチドを含むウェル中の結合カウントをコールド
ペプチドなしの対応するウェルにおける結合カウントか
ら引くことにより求めた。この結果以下の表９に示す。
操作は以下のように条件を変化させて繰り返した。Ｄ₁＝１４３３μｌＰＢＳ／ＢＳＡ＋１６７μｌ¹²⁵Ｉ−ペプチド〔1.７８pmol／５００μｌ〕Ｄ₂＝１８3.３μｌＰＢＳ／ＢＳＡ＋３３6.７μｌＤ₁ 〔1.１９pmol／５００μｌ〕Ｄ₃＝２７５μｌＰＢＳ／ＢＳＡ＋２７５μｌＤ₁ 〔0.８９pmol／５００μｌ〕Ｄ₄＝３６6.７μｌＰＢＳ／ＢＳＡ＋１８3.３μｌＤ₁ 〔0.５９pmol／５００μｌ〕Ｄ₅＝４５8.３μｌＰＢＳ／ＢＳＡ＋９1.７μｌＤ₁ 〔0.３０pmol／５００μｌ〕Ｄ₆＝５１3.３μｌＰＢＳ／ＢＳＡ＋３6.７μｌＤ₁ 〔0.１２pmol／５００μｌ〕Ｅ₁＝１３８6.２４μｌＰＢＳ／ＢＳＡ＋１６７μｌ¹²⁵Ｉ−ペプチド〔4.６７６ng〕＋４6.７６μｌコールドペプチド（１００μｇ／ml）〔4.６７６ng〕Ｅ₂−Ｅ₆ Ｄ₂−Ｄ₆について上述したように希釈した。Ｆ＝3.３９８ml ＰＢＳ＋１０2.２９μｌコールドペプチド（１００μｇ／ ml）

【００９０】２枚の６穴プレートを１mlＰＢＳ／ＢＳＡ
で１回洗浄した。偶数番号のウェルはＰＢＳ／ＢＳＡで
前処理し、奇数番号のウェルはＦ溶液で前処理した。前
処理溶液除去後、以下の溶液を添加した。ウェルサンプルウェルサンプル１Ｄ₁ ７Ｄ₄ ２Ｅ₁ ８Ｅ₄ ３Ｄ₂ ９Ｄ₅ ４Ｅ₂ １０Ｅ₅ ５Ｄ₃ １１Ｄ₆ ６Ｅ₃ １２Ｅ₆ 緩やかに揺らしながら室温で３０分間その溶液をインキ
ュベーションした。その後上清を除去し計数用に保存し
た。各ウェルを0.５mlの冷ＰＢＳ／ＢＳＡで４回洗浄
し、その洗浄液は計数用に保存した。各ウェルに１mlの
１％ＳＤＳを加え細胞を可溶化した。３分後、全ての細
胞はプレートから遊離するのを見ることができた。溶解
細胞含有上清を、２回目のＳＤＳウェル洗浄液と合せて
計数した。全カウント数及び結合カウント数の割合を測
定した。特異的結合値はコールドペプチド含有ウェル中
の結合カウントを、コールドペプチドなしのウェル結合
カウントから引くことにより測定した。その結果を以下
の表１０に示す。Ｂ．結果結合実験の結果を以下の表１０及び表１１に示す。

【００９１】

【表１０】表１０結合総特異的結合ウェル総・ＣＰＭＣＰＭ結合率％差カウント数＊１ 1,109,126 24,414 2.23 ２ 1,087,659 17,353 1.60 0.63％ 6,930 ３ 223,170 4,479 2.01 ４ 221,608 4,113 1.86 0.15％ 330 ５ 45,877 828 1.80 ６ 47,731 880 1.84 -0.04％ -18 ７ 1,103,606 25,905 2.35 ８ 1,152,287 19,230 1.67 0.68％ 7,480 ９ 227,396 4,996 2.20 １０ 230,974 4,137 1.79 0.41％ 901 １１ 47,899 1,030 2.15 １２ 49,894 922 1.85 0.30％ 132 １３ 1,151,347 10,071 0.87 １４ 1,108,755 9,506 0.86 0.01％ 110 １５ 220,340 1,692 0.77 １６ 229,253 1,800 0.79 -0.02％ -44 １７ 46,893 407 0.87 １８ 47,426 386 0.81 0.06％ 26 ＊ 1,100,000cpm／非希釈サンプルに対して補正した。

【００９２】

【表１１】表１１結合補正したウェル総・ＣＰＭＣＰＭ結合率％差＊ｐｍｏｌ１ 3,070,705 66,954 2.78 ２ 2,995,775 56,055 1.87 9,390 1.78 ３ 2,029,323 39,562 1.95 ４ 2,013,557 33,573 1.67 5,723 1.19 ５ 1,436,189 26,883 1.87 ６ 1,427,731 25,073 1.76 1,755 0.89 ７ 994,288 15,669 1.58 ８ 964,481 14,776 1.53 503 0.59 ９ 460,317 6,513 1.41 １０ 479,746 6,816 1.42 -52 0.30 １１ 202,494 2,930 1.45 １２ 192,990 2,806 1.45 0 0.12 ＊ 1.78 pmol ＝3,033,740 cpm に対して補正した。

【００９３】Ｃ．討論表９のデータから分るように、この実験は、非ラベルペ
プチドにより競合的に阻害されることから分るように、
本ペプチドは特異的に細胞に結合することを示してい
る。しかし、この細胞は本実験で使用したラベル化ペプ
チド量では飽和していない。さらに、本ペプチドの分解
が１４３分で起こっていた。第２の実験は、細胞飽和を
起こさせるため、３０分のインキュベーション時間及び
ラベル化ペプチド量の増加条件下で行った。表１０に見
られるように、再び特異的結合が示された。さらに、高
濃度のラベル化ペプチドにおける結合カウント数の平ば
いから示されるように飽和が達成された。このように結
合実験により、本発明のＣ末端ペプチドは肺上皮細胞に
特異的に結合することが示された。特定の態様及び例を
含む以上の明細は本発明の説明を意図するものであり、
これを制限するものではない。多くの変化及び修飾が本
発明の真の精神及び範囲を逸脱することなしに行い得
る。

【図面の簡単な説明】）

【図１】７５０ヌクレオチドのｃＤＮＡ配列（上）及
び推定されるアミノ酸残基配列（下）を示している。

【図２】バイオシル（Bio-Sil)ＨＡ（ケイ酸）カラム
からのＰＳアポタンパク質のタンパク質溶出曲線を示し
ている。

【図３】低分子量（ＬＭＷ）ＰＳアポタンパク質の銀
染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。

【図４】１００μｌの食塩水（白丸）、２mgリン脂質
（ＰＬ）ＤＰＰＣ：ＰＧ＝３：１（黒丸）、ＰＬ＋１０
μｇＳＰ９（白四角）、ＰＬ＋１０μｇＳＰ１８（黒四
角）、又は２mg天然ヒト界面活性物質（黒三角）の気管
注入後３０分におけるウサギ胎児肺の膨張収縮圧力／体
積曲線を示している。

【図５】食塩水（Ａ）、天然ヒト界面活性物質
（Ｂ）、リン脂質ＤＰＰＣ：ＰＧ（Ｃ）又はリン脂質＋
ＬＭＷアポタンパク質（ＳＰ９＋ＳＰ１８）（Ｄ）によ
る処理後のウサギ胎児肺組織サンプル（×１２５倍、ヘ
マトキシリン−エオシン染色）を示している。

【図６】本発明の合成界面活性物質を含む代表的ポリ
ペプチドの界面活性を示している。

【図７】先にレバク（Revak)等（アメリカン・レヴュ
ー・オブ・レスピレトリー・ディシーズ（Am. Rev. Res
pir. Dis.），１３４，１２５８−１２６５（１９８
６））により報告されているウサギ胎児モデルを用いた
本発明の代表的界面活性物質の静的コンプライアンス実
験の結果を示している一連の２枚のグラフである。

【図８】本発明の代表的合成界面活性物質の静的コン
プライアンス実験の結果を示す一連の２つのグラフであ
る。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１１年３月８日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 14/785 ＺＮＡＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者レーヴァックスーザンディアメリカ合衆国カリフォルニア州 92122サンディエゴカスケードストリート 6561

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】実質的に純粋なヒトＳＰ１８モノマータ
ンパク質。
【請求項２】医薬的に許容し得るリン脂質と混合され
る請求項１に記載のタンパク質を含有し、合成肺胞界面
活性物質を形成することを特徴とする組成物。
【請求項３】ヒトＳＰ１８ダイマータンパク質を更に
有する請求項２に記載の組成物。
【請求項４】翻訳後のタンパク質分解的修正なしに、
成熟ヒトＳＰ１８モノマータンパク質を発現し得る構造
遺伝子と機能的に結合されたベクターを含有することを
特徴とする組換え核酸分子。
【請求項５】１０〜約６０個のアミン酸残基から実質
的になり、ヒトＳＰ１８モノマーのアミノ酸残基配列に
対応する配列を含有することを特徴とするポリペプチ
ド。
【請求項６】請求項５記載のポリペプチドであって、
さらにＳＰ１８の残基１から７５に位置する線型配列中
で少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基に対応する
配列を少なくとも１個含むことを特徴とするポリペプチ
ド。
【請求項７】請求項５記載のポリペプチドおいて、さ
らにＳＰ１８の線型配列中に少なくとも５個の連続する
アミノ酸残基に対応するカルボキシ末端配列及び残基８
０を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項８】請求項５記載のポリペプチドであって、 FPIPLPYCWLCRALI 、 CRALIKRIQAMIPKG 、 MIPKGALAVAVAQVC 、 VAQVCRVVPLVAGGI 、 VAGGICQCLAERYSV 、 CQCLAERYSVILLDTLLGRMLPQLVCRLVLR 、 ERYSVILLDTLLGRM 、 ERYSVILLDTLLGRMLPQLVCR 、 ERYSVILLDTLLGRMLPQLVCRLVLR 、 SVILLDTLLGRMLPQLVCR 、 SVILLDTLLGRMLPQLVCRLVLR 、及びLLGRMLPQLVCRLVLから
なる群から選ばれるアミノ酸残基配列を有するポリペプ
チド。
【請求項９】請求項５に記載のポリペプチドであっ
て、さらに一般式： -RLVLRCSMDD_Z （式中、Ｚは０か１の値をもつ整数であり、Ｚが０のと
き、サブスクリプト付きのＤ残基は存在せず、またＺが
１のとき、サブスクリプト付きのＤ残基が存在する）で
表わされるカルボキシ末端アミノ酸残基配列を有するこ
とを特徴とするポリペプチド。
【請求項１０】請求項９記載のポリペプチドであっ
て、かつ CRLVLRCSMDD 、 LPQLVCRLVLRCSMDD 、 DTLLGRMLPQLVCRLVLRCSMDD 、 RYSVILLDTLLGRMLPQLVCRLVLRCSMDD 、 ERYSVILLDTLLGRMLPQLVCRLVLRCSMDD、 ERYSVILLDTLLGRMLPQLVCRLVLRCSMD 、 RVVPLVAGGICQCLAERYSVILLDTLLGRMLPQLVCRLVLRCSMDD、及
びAQVCRVVPLVAGGICQCLAERYSVILLDTLLGRMLPQLVCRLVLRCSM
DD、からなる群から選ばれるアミノ酸残基配列を有する
ポリペプチド。
【請求項１１】１０〜約６０個のアミノ酸残基から実
質的になり、ＳＰ１８の疎水性及び親水性残基の形態と
類似するアミノ酸残基配列を含有することを特徴とする
ポリペプチド。
【請求項１２】１０〜６０個のアミノ酸残基のアミノ
末端及びカルボキシ末端配列から実質的になるポリペプ
チドであって、前記アミノ末端配列が、少なくとも１０
個のアミノ酸残基を有しかつ０未満の複合疎水性を有
し、前記カルボキシル末端配列が、 -RLVLRCSMDD_Z （式中、Ｚは０か１の値をもつ整数であり、Ｚが０のと
きサブスクリプト付きのＤ残基は存在せず、またＺが１
のとき、サブスクリプト付きのＤ残基が存在する）で表
わされるカルボキシ末端アミノ酸残基配列を有すること
を特徴とするポリペプチド。
【請求項１３】請求項５に記載のポリペプチドと混合
される医薬的に許容し得るリン脂質を含有し、前記リン
脂質単独の場合に比べて、界面活性が高いことを特徴と
する肺胞界面活性物質。
【請求項１４】請求項１１に記載のポリペプチドと混
合される医薬的に許容し得るリン脂質を含有し、前記リ
ン脂質単独の場合に比べて、界面活性が高いことを特徴
とする肺胞界面活性物質。
【請求項１５】請求項１２に記載のポリペプチドと混
合される医薬的に許容し得るリン脂質を含有し、前記リ
ン脂質単独の場合に比べて、界面活性が高いことを特徴
とする肺胞界面活性物質。