JP2602968B2 - 肺胞の界面活性タンパク類 - Google Patents
肺胞の界面活性タンパク類Info
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Description
【発明の詳細な説明】 技術の分野 本発明は，一般に，ある種の呼吸器疾患の管理に有用
な，肺胞の界面活性タンパク類（ASP）に関する。
な，肺胞の界面活性タンパク類（ASP）に関する。
背景技術 ヒトの肺は，気体を血液と肺の空気空間との間で交換
する多数の小さな嚢すなわち肺胞で構築されている。健
康な個体ではこの交換は，タンパクを含有する界面活性
複合体の存在によって行われており，その複合体は,II
型肺胞細胞のミクロソーム膜で合成される。この複合体
が適切な量で存在しないと，肺は適正に機能することが
できない。すなわち肺胞は，息を吐き出す間に崩壊し，
次に息を吸うことによって再び膨張できなくなる。した
がって，この複合体が合成できない未治療の患者は，治
療せずに放置すると死に至るか，または重篤な身体の損
傷を受けることになる。
する多数の小さな嚢すなわち肺胞で構築されている。健
康な個体ではこの交換は，タンパクを含有する界面活性
複合体の存在によって行われており，その複合体は,II
型肺胞細胞のミクロソーム膜で合成される。この複合体
が適切な量で存在しないと，肺は適正に機能することが
できない。すなわち肺胞は，息を吐き出す間に崩壊し，
次に息を吸うことによって再び膨張できなくなる。した
がって，この複合体が合成できない未治療の患者は，治
療せずに放置すると死に至るか，または重篤な身体の損
傷を受けることになる。
界面活性複合体の量が不充分な場合について最もよく
報告されている例は，未熟な乳児と，複雑な妊娠状態を
経た後出生した乳児に起り，呼吸窮迫症候群（RDS）と
して広く知られている。この症候群の広く発表されてい
る形態は，ヒアリン膜病または特発生RDSと呼ばれてい
る。RDSは，現在，米国やその外の先進国での乳児の死
亡率と羅病率の主な原因であり，診断と治療に対して多
大の努力がなされている。現在の治療は機械的な（圧力
による）換気に集中されているが，この方法は，いくら
よくても，肺に対する損傷，および気管支肺異形成症と
間質性気腫と気胸症のような合併症を含む有害な副作用
を起こすことが多い，侵襲性の一時しのぎの手段にすぎ
ない。またこの治療を用いた場合，精神遅滞が時々起っ
ている（Hallman,M.ら,:Pediatric Clinics of North A
merica,29巻,1057〜1075頁,1982年）。
報告されている例は，未熟な乳児と，複雑な妊娠状態を
経た後出生した乳児に起り，呼吸窮迫症候群（RDS）と
して広く知られている。この症候群の広く発表されてい
る形態は，ヒアリン膜病または特発生RDSと呼ばれてい
る。RDSは，現在，米国やその外の先進国での乳児の死
亡率と羅病率の主な原因であり，診断と治療に対して多
大の努力がなされている。現在の治療は機械的な（圧力
による）換気に集中されているが，この方法は，いくら
よくても，肺に対する損傷，および気管支肺異形成症と
間質性気腫と気胸症のような合併症を含む有害な副作用
を起こすことが多い，侵襲性の一時しのぎの手段にすぎ
ない。またこの治療を用いた場合，精神遅滞が時々起っ
ている（Hallman,M.ら,:Pediatric Clinics of North A
merica,29巻,1057〜1075頁,1982年）。
この症候群を界面活性剤代替法によって治療する試み
がわずかであるが行われている。この治療法は，一般に
１回の投与しか必要とせず，肺が損傷する可能性が減少
するので優れた方法である。例えば,Fujiwaraらは，ウ
シの肺由来のタンパクが除去された界面活性製剤を用い
（Lancet,1巻,55頁,1980年），またHallman,M.らは，ヒ
トの羊水から単離した界面活性剤を使用し，限られた数
の乳児を治療して，ある程度の成功をおさめている（Pe
diatrics,71巻,473−482頁,1983年）。Clementsの米国
特許第4,312,860号には，タンパクを含有しておらず，
かつ上記の方法に有用であるといわれる人工の界面活性
剤が開示されているが，データは示されていない。要す
るに，界面活性剤代替法は，臨床的に広範には使われて
いない。
がわずかであるが行われている。この治療法は，一般に
１回の投与しか必要とせず，肺が損傷する可能性が減少
するので優れた方法である。例えば,Fujiwaraらは，ウ
シの肺由来のタンパクが除去された界面活性製剤を用い
（Lancet,1巻,55頁,1980年），またHallman,M.らは，ヒ
トの羊水から単離した界面活性剤を使用し，限られた数
の乳児を治療して，ある程度の成功をおさめている（Pe
diatrics,71巻,473−482頁,1983年）。Clementsの米国
特許第4,312,860号には，タンパクを含有しておらず，
かつ上記の方法に有用であるといわれる人工の界面活性
剤が開示されているが，データは示されていない。要す
るに，界面活性剤代替法は，臨床的に広範には使われて
いない。
好ましい代替界面活性剤は，肺の界面活性複合体その
ものである。この複合体は，アポタンパク，多量に存在
する２種のリン脂質（ジパルミトイルホスホコリン（DP
PC）とホスファチジルグルセロール（PG）），ごく少量
存在する数種の脂質成分，およびカルシウムイオンで構
成されている。そのアポタンパクは，分子量が約32,000
ダルトンのタンパクと，約10,000ダルトンの非常に高い
疎水性を持つタンパクとを含有している（King,R.J.ら,
Am J Physiol,224巻,788〜795頁,1973年）。32,000ダル
トンのタンパクはグルコシル化されており，ヒドロキシ
プロリンを含有している。
ものである。この複合体は，アポタンパク，多量に存在
する２種のリン脂質（ジパルミトイルホスホコリン（DP
PC）とホスファチジルグルセロール（PG）），ごく少量
存在する数種の脂質成分，およびカルシウムイオンで構
成されている。そのアポタンパクは，分子量が約32,000
ダルトンのタンパクと，約10,000ダルトンの非常に高い
疎水性を持つタンパクとを含有している（King,R.J.ら,
Am J Physiol,224巻,788〜795頁,1973年）。32,000ダル
トンのタンパクはグルコシル化されており，ヒドロキシ
プロリンを含有している。
界面活性剤代替治療法の進歩が制限されている主な理
由は，該複合体のタンパク部分が入手できないからであ
る。代替治療法は脂質成分だけを使う試みに集中し，そ
してこのような治療法の効力はアポタンパクを添加する
ことによって著しく改善できることが明らかになってい
る〔Hallman,M.ら,Pediatric Clinics of North Americ
a 1982年（前出文献）〕。しかし，現在これらのタンパ
クは，正常な成人のヒトの肺および羊水から入手できな
い。効率よく単離しても充分に供給することができな
い。したがって，アポタンパクを，単独で，または複合
体の飽和リン脂質部分とともに使用する場合の実用量を
産生する利用可能な方法が要望されている。
由は，該複合体のタンパク部分が入手できないからであ
る。代替治療法は脂質成分だけを使う試みに集中し，そ
してこのような治療法の効力はアポタンパクを添加する
ことによって著しく改善できることが明らかになってい
る〔Hallman,M.ら,Pediatric Clinics of North Americ
a 1982年（前出文献）〕。しかし，現在これらのタンパ
クは，正常な成人のヒトの肺および羊水から入手できな
い。効率よく単離しても充分に供給することができな
い。したがって，アポタンパクを，単独で，または複合
体の飽和リン脂質部分とともに使用する場合の実用量を
産生する利用可能な方法が要望されている。
関連するPCT特許出願第WO86/03408号には，約32kdの
ヒトASPタンパクの組換え産生法，種々のイヌASPタンパ
クをコードするDNA配列の取り出し法および分子量約10k
dのヒトASPタンパクグループの代表的なひとつの取り出
し法が記載されている。充分な治療に使用するために，
この「10K」グループの効率のよい産生が必要なことは
今日明らかである。
ヒトASPタンパクの組換え産生法，種々のイヌASPタンパ
クをコードするDNA配列の取り出し法および分子量約10k
dのヒトASPタンパクグループの代表的なひとつの取り出
し法が記載されている。充分な治療に使用するために，
この「10K」グループの効率のよい産生が必要なことは
今日明らかである。
別の関連するPCT特許出願第WO87/06588号（1987年11
月５日公開）には，これらの10Kタンパクとそれをコー
ドするDNAがさらに記載されている。その出願の第１図
と第２図には，イヌとヒトSP−18由来のタンパクの前駆
体をコードする全鎖長のcDNAを示している。成熟ヒトタ
ンパクは，全鎖長の配列のコドン201でコードされてい
るフェニルアラニン残基ではじまると記載されている。
哺乳類と細菌の両方の細胞中でSP−18前駆体を発現する
ベクターの構築法が詳しく記載されている。哺乳類細胞
中で全鎖長の前駆体を発現させて,SDS−PAGE法で測定し
たところ43kdと25kdの前駆体タンパクを得た。その25kd
の生成物は，この配列にコードされているPhe−201〜Gl
u−381にわたる181個のアミノ酸配列のグルコシル化さ
れた形態のものであると述べられている。前駆体の成熟
型をより均一に産生するのに役立つ切断部位を与えるた
めの，ヒトタンパクのいくつかの改変形も記載されてい
る。SP−18cDNAの細菌による発現も記載されている。
月５日公開）には，これらの10Kタンパクとそれをコー
ドするDNAがさらに記載されている。その出願の第１図
と第２図には，イヌとヒトSP−18由来のタンパクの前駆
体をコードする全鎖長のcDNAを示している。成熟ヒトタ
ンパクは，全鎖長の配列のコドン201でコードされてい
るフェニルアラニン残基ではじまると記載されている。
哺乳類と細菌の両方の細胞中でSP−18前駆体を発現する
ベクターの構築法が詳しく記載されている。哺乳類細胞
中で全鎖長の前駆体を発現させて,SDS−PAGE法で測定し
たところ43kdと25kdの前駆体タンパクを得た。その25kd
の生成物は，この配列にコードされているPhe−201〜Gl
u−381にわたる181個のアミノ酸配列のグルコシル化さ
れた形態のものであると述べられている。前駆体の成熟
型をより均一に産生するのに役立つ切断部位を与えるた
めの，ヒトタンパクのいくつかの改変形も記載されてい
る。SP−18cDNAの細菌による発現も記載されている。
PCT出願第WO87/06588号の第５図と第６図は,SP−５と
呼ばれる，低分子量の５〜8kdのタンパクの前駆体をコ
ードする２つのcDNAクローンのDNA配列と推定されるア
ミノ酸配列を示している。SP−18cDNAと同様に，これら
のクローンは，単離された小さな５〜8kdのタンパクの
前駆体をコードすることが開示されている。その推定上
のＮ末端は，これらの配列のコドン24と25におけるPhe
もしくはGlyであると述べられている。これらタンパク
の成熟Ｃ末端は,8kdのタンパクのGln−108と,5kdのタン
パクのGln−80あるいはThr−65であると仮定されてい
る。このcDNAの哺乳類と細菌の細胞中における発現につ
いても記載されている。
呼ばれる，低分子量の５〜8kdのタンパクの前駆体をコ
ードする２つのcDNAクローンのDNA配列と推定されるア
ミノ酸配列を示している。SP−18cDNAと同様に，これら
のクローンは，単離された小さな５〜8kdのタンパクの
前駆体をコードすることが開示されている。その推定上
のＮ末端は，これらの配列のコドン24と25におけるPhe
もしくはGlyであると述べられている。これらタンパク
の成熟Ｃ末端は,8kdのタンパクのGln−108と,5kdのタン
パクのGln−80あるいはThr−65であると仮定されてい
る。このcDNAの哺乳類と細菌の細胞中における発現につ
いても記載されている。
上記２件のPCT出願第WO86/03408号と第WO87/06588号
の開示内容は本出願に援用される。
の開示内容は本出願に援用される。
本出願では，肺の界面活性タンパクとして有効な各種
のSP−５類縁ペプチドを記載する。これらSP−５の類似
体とフラグメントは，化学合成法もしくは組換え法で調
製することができ，呼吸器疾患と全症候の治療に有用な
肺の界面活性タンパクのレパートリーの特定のメンバー
を提供する。
のSP−５類縁ペプチドを記載する。これらSP−５の類似
体とフラグメントは，化学合成法もしくは組換え法で調
製することができ，呼吸器疾患と全症候の治療に有用な
肺の界面活性タンパクのレパートリーの特定のメンバー
を提供する。
本願の親出願の米国特許出願第07/117/009号もまた,1
0Kグループのタンパクをある程度詳細に記載している。
その出願の開示内容もすべて本願に援用されるものであ
り，本願では，材料についての引用は，全部を記載した
り説明したりしない。本出願は，ヒトのSP−５タンパク
をさらに研究した結果に基づいたもので，特に,ASP活性
をもっていることが見出されたヒトSP−５タンパクの類
似体に関する。本出願に記載され特許請求されている類
似体は，天然のポリペプチドの安定性と生物学的活性を
保持しているのに加えて，天然の5kdのタンパクよりも
凝集しにくい。
0Kグループのタンパクをある程度詳細に記載している。
その出願の開示内容もすべて本願に援用されるものであ
り，本願では，材料についての引用は，全部を記載した
り説明したりしない。本出願は，ヒトのSP−５タンパク
をさらに研究した結果に基づいたもので，特に,ASP活性
をもっていることが見出されたヒトSP−５タンパクの類
似体に関する。本出願に記載され特許請求されている類
似体は，天然のポリペプチドの安定性と生物学的活性を
保持しているのに加えて，天然の5kdのタンパクよりも
凝集しにくい。
発明の開示 本発明は，特定の形態のヒトSP−18とヒトSP−５由来
のタンパクを提供するものである。コードされる配列の
類似体であるこれらタンパクのいくつかは，天然のタン
パクと比較して凝集性（すなわち，各種の分子内と分子
間の相互作用，主として共有結合のジスルフィド結合に
よる凝集性）が著しく減少している。それ故にこれらの
類似体は天然のポリペプチドよりも抽出と精製が非常に
容易である。
のタンパクを提供するものである。コードされる配列の
類似体であるこれらタンパクのいくつかは，天然のタン
パクと比較して凝集性（すなわち，各種の分子内と分子
間の相互作用，主として共有結合のジスルフィド結合に
よる凝集性）が著しく減少している。それ故にこれらの
類似体は天然のポリペプチドよりも抽出と精製が非常に
容易である。
本発明のSP−５由来のペプチドは，ヒトSP−５の長さ
とアミノ酸配列の両方を改変することによって得られる
が，天然ポリペプチドの，生物学的活性のみならず化学
的および物理的安定性を保持している。
とアミノ酸配列の両方を改変することによって得られる
が，天然ポリペプチドの，生物学的活性のみならず化学
的および物理的安定性を保持している。
この発明の別の局面において，呼吸障害症候群の治療
用の医薬組成物が提供されるが，その組成物は,SP−18
および／またはSP−５に類縁のペプチドを含有するよう
処方されている。本発明は,SP−18および／またはSP−
５類縁のペプチドを投与することによる呼吸障害症候群
の治療法をも包含する。
用の医薬組成物が提供されるが，その組成物は,SP−18
および／またはSP−５に類縁のペプチドを含有するよう
処方されている。本発明は,SP−18および／またはSP−
５類縁のペプチドを投与することによる呼吸障害症候群
の治療法をも包含する。
図面の簡単な説明 第１図は，ヒトSP−５由来のタンパクをコードするcD
NAのDNA配列および推定されるアミノ配列を示す。
NAのDNA配列および推定されるアミノ配列を示す。
第２図は，ヒトSP−５由来のタンパクをコードする類
似のcDNA変異体を示す。
似のcDNA変異体を示す。
第３図は,SP−5DNAのコドン１〜74でコードされるア
ミノ酸配列であって，マークで示したＮ末端およびＣ末
端を有する。
ミノ酸配列であって，マークで示したＮ末端およびＣ末
端を有する。
第４図は,SP−18前駆体タンパクをコードするヒトcDN
A＃３である。
A＃３である。
第５図は，イヌの5kdタンパクのアミノ酸配列であっ
て，マークで示したＮ末端とＣ末端を有する。
て，マークで示したＮ末端とＣ末端を有する。
第６図は,10K ASP混合物中のヒトタンパクとイヌ18kd
タンパク間の相関を示す。
タンパク間の相関を示す。
第７図は，クロラムフェニコールアミノトランスフェ
ラーゼ（CAT）とヒト心房のナトリウム排泄増加性タン
パク（hANP）のDNA配列およびアミノ酸配列とを示す。
ラーゼ（CAT）とヒト心房のナトリウム排泄増加性タン
パク（hANP）のDNA配列およびアミノ酸配列とを示す。
第８図は,pC210SP−Ｃへの挿入部をコードするタンパ
クを示す。
クを示す。
第９図は,CAT−SP−５融合タンパクをコードするpC14
9SP−ＣのBamHi/Hind III挿入部である。
9SP−ＣのBamHi/Hind III挿入部である。
第10図〜第16図は,ASP活性についての標準試験で種々
のポリペプチドについて得られたインビトロの試験結果
をグラフ表示したものである。第10図および第11図は，
全ヒト5kdタンパクで行った対照試験を示し，一方第12
図〜第16図は，上記タンパクの種々の類似体について，
得られた試験結果を示す。
のポリペプチドについて得られたインビトロの試験結果
をグラフ表示したものである。第10図および第11図は，
全ヒト5kdタンパクで行った対照試験を示し，一方第12
図〜第16図は，上記タンパクの種々の類似体について，
得られた試験結果を示す。
発明を実施する方法 定義 ここで用いる「肺胞の界面活性タンパク（ASP）」と
いう用語は，肺の界面活性複合体と関連があり，以下に
定義するASP活性を有するアポタンパクを意味する。試
験されたすべての種のASPは，ここで「32K ASP」と呼ば
れている比較的高分子量（約32kd）の１あるいはそれ以
上の構成要素と，およびここで「10K ASP」と呼ばれて
いる比較的低分子量（約５〜20kd）の１あるいはそれ以
上の全く疎水性の構成要素を含有しているようである
（King,R.J.ら,J Appl Physiol,42巻,483〜491頁,1977
年;Phizackerley,P.J.R.,Biochem J,183巻,731〜736頁,
1979年）。
いう用語は，肺の界面活性複合体と関連があり，以下に
定義するASP活性を有するアポタンパクを意味する。試
験されたすべての種のASPは，ここで「32K ASP」と呼ば
れている比較的高分子量（約32kd）の１あるいはそれ以
上の構成要素と，およびここで「10K ASP」と呼ばれて
いる比較的低分子量（約５〜20kd）の１あるいはそれ以
上の全く疎水性の構成要素を含有しているようである
（King,R.J.ら,J Appl Physiol,42巻,483〜491頁,1977
年;Phizackerley,P.J.R.,Biochem J,183巻,731〜736頁,
1979年）。
哺乳類に発生することが知られている界面活性タンパ
クの性質に関する別の考察が，第WO87/06588号でなされ
ている。要するに，そこに記載されているように，「10
K」グループのタンパクは,2つの異なるDNAによってコー
ドされた前駆体由来のものである。SP−18と呼ばれる。
これらのDNAのうちの一方の組は，ゲル上の約18kdの位
置に出現するタンパクの前駆体をコードしているが，そ
のタンパクは，還元条件下では10kdの分子量を示す。他
方のSP−５と呼ばれるDNAは，ゲル上で8kdまたは5kdの
分子量を示すタンパクの前駆体をコードしている。本出
願の発明は,SP−18およびSP−５の前駆体タンパクによ
って生成されるペプチドに類縁の特定のペプチドに関す
る。
クの性質に関する別の考察が，第WO87/06588号でなされ
ている。要するに，そこに記載されているように，「10
K」グループのタンパクは,2つの異なるDNAによってコー
ドされた前駆体由来のものである。SP−18と呼ばれる。
これらのDNAのうちの一方の組は，ゲル上の約18kdの位
置に出現するタンパクの前駆体をコードしているが，そ
のタンパクは，還元条件下では10kdの分子量を示す。他
方のSP−５と呼ばれるDNAは，ゲル上で8kdまたは5kdの
分子量を示すタンパクの前駆体をコードしている。本出
願の発明は,SP−18およびSP−５の前駆体タンパクによ
って生成されるペプチドに類縁の特定のペプチドに関す
る。
タンパクの「ASP活性」は，脂質のみと結合させるか
または他のタンパクと結合した脂質と結合させると,Rob
ertson,B.のインビボアッセイ（Lung,158巻,57〜68頁,1
980年）で活性を示す能力として定義される。このアッ
セイでは，分析される試料が気管挿入管を通じて，帝王
切開術で未熟児として出生したラビットもしくはラムの
胎児に投与される（これらの「未熟児」は彼等自身のAS
Pを欠いており，換気器で維持されている）。肺のコン
プライアンス，血液ガスおよび換気器の圧力の測定値
は，活性の指数を提供する。また活性の予備的評価が，
インビトロアッセイ（例えばKing,R.J.ら,Am J Physio
l,223巻,715〜726頁,1972年によるアッセイ，またはHaw
goodらのWO87/06588号に記載され，例示されているアッ
セイ）により行われ得る。このアッセイは，タンパクを
リン脂質の小胞の製剤と混合した時の空気と水の界面の
表面張力の直接測定を利用する方法である。ここで記載
し，特許請求したSP−18由来のペプチドおよびSP−５由
来のペプチドはすべてASP活性を示す。
または他のタンパクと結合した脂質と結合させると,Rob
ertson,B.のインビボアッセイ（Lung,158巻,57〜68頁,1
980年）で活性を示す能力として定義される。このアッ
セイでは，分析される試料が気管挿入管を通じて，帝王
切開術で未熟児として出生したラビットもしくはラムの
胎児に投与される（これらの「未熟児」は彼等自身のAS
Pを欠いており，換気器で維持されている）。肺のコン
プライアンス，血液ガスおよび換気器の圧力の測定値
は，活性の指数を提供する。また活性の予備的評価が，
インビトロアッセイ（例えばKing,R.J.ら,Am J Physio
l,223巻,715〜726頁,1972年によるアッセイ，またはHaw
goodらのWO87/06588号に記載され，例示されているアッ
セイ）により行われ得る。このアッセイは，タンパクを
リン脂質の小胞の製剤と混合した時の空気と水の界面の
表面張力の直接測定を利用する方法である。ここで記載
し，特許請求したSP−18由来のペプチドおよびSP−５由
来のペプチドはすべてASP活性を示す。
本発明の「hSP−５由来のペプチド」は，第１図〜第
２図に示されるヒトSP−5DNAにより，（特に第３図に示
される前駆体アミノ酸配列の部分をコードしている部分
により）コードされるアミノ酸配列に基づいたペプチド
を含有することを意味し，そして，上で定義されたASP
活性を有するペプチドを含有することを意味する。これ
らのSP−５ペプチドは，次のアミノ酸配列により定義さ
れるSP−５ペプチドまたは薬学的に受容可能なそれらの
塩またはアミドである： Ｘ−AA28−AA29−AA30−AA31−AA32−AA33−AA34−AA
35−Leu−Leu−Ile−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Leu−Il
e−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ile−Ｚ−Gly−Ala−Leu−Leu−Met−G
ly−Leu−His−Y, ここで：AA28はCysまたはSer, AA29はCysまたはSer, AA30はProまたはAla, AA31はValまたはGln, AA32はHisまたはLys, AA33はLeuまたはAla, AA34はLysまたはGln, AA35はArgまたはGln, ＺはValまたはIle, ＹはOH,または第３図のアミノ酸の60〜74位
に対応する１〜15アミノ酸のＣ末端延長配列，そして， ＸはH,またはＨ−AA27−,H−AA26−AA27−，または
Ｘ′−AA26−AA27−でなる群から選択されるアミノ酸配
列， ここで，AA27はProまたはAla, AA26はIleまたはSer,そして， Ｘ′はH,または第３図のアミノ酸の１〜25位
に対応する１〜25アミノ酸のＮ末端延長配列であり； 但し,XがPhe−Gly−Ile−Proであり,Yがアミノ酸の60
〜66位のＣ末端延長配列であり，そしてすべてのＺがVa
lであるならば，AA28−AA35は−Cys−Cys−Pro−Val−H
is−Leu−Lys−Arg−ではあり得ない。
２図に示されるヒトSP−5DNAにより，（特に第３図に示
される前駆体アミノ酸配列の部分をコードしている部分
により）コードされるアミノ酸配列に基づいたペプチド
を含有することを意味し，そして，上で定義されたASP
活性を有するペプチドを含有することを意味する。これ
らのSP−５ペプチドは，次のアミノ酸配列により定義さ
れるSP−５ペプチドまたは薬学的に受容可能なそれらの
塩またはアミドである： Ｘ−AA28−AA29−AA30−AA31−AA32−AA33−AA34−AA
35−Leu−Leu−Ile−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Leu−Il
e−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ile−Ｚ−Gly−Ala−Leu−Leu−Met−G
ly−Leu−His−Y, ここで：AA28はCysまたはSer, AA29はCysまたはSer, AA30はProまたはAla, AA31はValまたはGln, AA32はHisまたはLys, AA33はLeuまたはAla, AA34はLysまたはGln, AA35はArgまたはGln, ＺはValまたはIle, ＹはOH,または第３図のアミノ酸の60〜74位
に対応する１〜15アミノ酸のＣ末端延長配列，そして， ＸはH,またはＨ−AA27−,H−AA26−AA27−，または
Ｘ′−AA26−AA27−でなる群から選択されるアミノ酸配
列， ここで，AA27はProまたはAla, AA26はIleまたはSer,そして， Ｘ′はH,または第３図のアミノ酸の１〜25位
に対応する１〜25アミノ酸のＮ末端延長配列であり； 但し,XがPhe−Gly−Ile−Proであり,Yがアミノ酸の60
〜66位のＣ末端延長配列であり，そしてすべてのＺがVa
lであるならば，AA28−AA35は−Cys−Cys−Pro−Val−H
is−Leu−Lys−Arg−ではあり得ない。
前記グループ内のhSP−５由来のペプチドのＹの好ま
しい実施態様は,Yが,OH,Met−Ser−OH,または第３図の6
0〜74番の15アミノ酸に対応するＣ末端延長配列であ
る。Ｘの好ましい実施態様は,Xが,H,H−AA27−,H−AA26
−AA27−,Gly−AA26−AA27−またはPhe−Gly−AA26−AA
27のペプチドである。
しい実施態様は,Yが,OH,Met−Ser−OH,または第３図の6
0〜74番の15アミノ酸に対応するＣ末端延長配列であ
る。Ｘの好ましい実施態様は,Xが,H,H−AA27−,H−AA26
−AA27−,Gly−AA26−AA27−またはPhe−Gly−AA26−AA
27のペプチドである。
あるいは、本発明のSP−５ペプチドは、ASP活性を有
し、以下の配列により定義される精製ポリペプチド、ま
たは薬学的に受容可能なそれらの塩またはアミドであ
る： Ｘ−AA31−AA32−AA33−AA34−AA35−Leu−Leu−Ile
−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Leu−Ile−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Il
e−Ｚ−Gly−Ala−Leu−Leu−Met−Gly−His−Ｙ ここで，AA31はValまたはGln、 AA32はHisまたはLys、 AA33はLeuまたはAla、 AA34はLysまたはGln、 AA35はArgまたはGln、 ＺはValまたはIle、 ＹはOH、またはアミノ酸配列Met−Ser−Gln−Lys−Hi
s−Thr−Glu−MET−Val−Leu−Glu−MET−Ser−Ile−Gl
yに対応する１−15のアミノ酸のＣ末端延長配列、そし
て、ＸはＨ、またはＨ−AA30−、Ｈ−AA29−AA30、Ｈ−
AA28−AA29−AA30、Ｈ−AA27−AA28−AA29−AA30、Ｈ−
AA26−AA27−AA28−AA29−AA30、およびＸ′−AA26−AA
27−AA28−AA29−AA30でなる群から選択されるアミノ酸
配列、 ここで、AA26はIleまたはSer、 AA27はProまたはAla、 AA28はCysまたはSer、 AA29はCysまたはSer、 AA30はProまたはAla、そして、 Ｘ′はＨ、またはアミノ酸配列のMet−Asp−Val
−Gly−Ser−Lys−Glu−Val−Leu−Met−Glu−Ser−Pro
−Pro−Asp−Tyr−Ser−Ala−Ala−Pro−Arg−Gly−Arg
−Phe−Glyに対応する１−25アミノ酸のＮ末端延長配列
であり、； ただし、ＸがPhe−Gly−Ile−Pro−Cys−Cys−Pro、G
ly−Ile−Pro−Cys−Cys−Pro、またはIle−Pro−Cys−
Cys−Proであり、ＹがOHまたはMet−Ser−Gln−Lys−Hi
s−Thrに対応するアミノ酸配列であり、そしてすべての
ＺがValであるならば、−AA31−AA35は、−Val−His−L
eu−Lys−Arg−ではあり得ない。
し、以下の配列により定義される精製ポリペプチド、ま
たは薬学的に受容可能なそれらの塩またはアミドであ
る： Ｘ−AA31−AA32−AA33−AA34−AA35−Leu−Leu−Ile
−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Leu−Ile−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Il
e−Ｚ−Gly−Ala−Leu−Leu−Met−Gly−His−Ｙ ここで，AA31はValまたはGln、 AA32はHisまたはLys、 AA33はLeuまたはAla、 AA34はLysまたはGln、 AA35はArgまたはGln、 ＺはValまたはIle、 ＹはOH、またはアミノ酸配列Met−Ser−Gln−Lys−Hi
s−Thr−Glu−MET−Val−Leu−Glu−MET−Ser−Ile−Gl
yに対応する１−15のアミノ酸のＣ末端延長配列、そし
て、ＸはＨ、またはＨ−AA30−、Ｈ−AA29−AA30、Ｈ−
AA28−AA29−AA30、Ｈ−AA27−AA28−AA29−AA30、Ｈ−
AA26−AA27−AA28−AA29−AA30、およびＸ′−AA26−AA
27−AA28−AA29−AA30でなる群から選択されるアミノ酸
配列、 ここで、AA26はIleまたはSer、 AA27はProまたはAla、 AA28はCysまたはSer、 AA29はCysまたはSer、 AA30はProまたはAla、そして、 Ｘ′はＨ、またはアミノ酸配列のMet−Asp−Val
−Gly−Ser−Lys−Glu−Val−Leu−Met−Glu−Ser−Pro
−Pro−Asp−Tyr−Ser−Ala−Ala−Pro−Arg−Gly−Arg
−Phe−Glyに対応する１−25アミノ酸のＮ末端延長配列
であり、； ただし、ＸがPhe−Gly−Ile−Pro−Cys−Cys−Pro、G
ly−Ile−Pro−Cys−Cys−Pro、またはIle−Pro−Cys−
Cys−Proであり、ＹがOHまたはMet−Ser−Gln−Lys−Hi
s−Thrに対応するアミノ酸配列であり、そしてすべての
ＺがValであるならば、−AA31−AA35は、−Val−His−L
eu−Lys−Arg−ではあり得ない。
ここで、前記の基において、hSP−５由来のペプチド
のＹの好ましい実施態様は、ＹがOH、またはアミノ酸配
列Met−Ser−Gln−Lys−His−Thr−Glu−MET−Val−Leu
−Glu−MET−Ser−Ile−Glyに対応する１−15のアミノ
酸のＣ末端延長配列である。Ｘの好ましい実施態様は、
ＸがＨ、またはＨ−AA30−、Ｈ−AA29−AA30、Ｈ−AA28
−AA29−AA30、Ｈ−AA27−AA28−AA29−AA30、Ｈ−AA26
−AA27−AA28−AA29−AA30、またはＸ′−AA26−AA27−
AA28−AA29−AA30のペプチドである。
のＹの好ましい実施態様は、ＹがOH、またはアミノ酸配
列Met−Ser−Gln−Lys−His−Thr−Glu−MET−Val−Leu
−Glu−MET−Ser−Ile−Glyに対応する１−15のアミノ
酸のＣ末端延長配列である。Ｘの好ましい実施態様は、
ＸがＨ、またはＨ−AA30−、Ｈ−AA29−AA30、Ｈ−AA28
−AA29−AA30、Ｈ−AA27−AA28−AA29−AA30、Ｈ−AA26
−AA27−AA28−AA29−AA30、またはＸ′−AA26−AA27−
AA28−AA29−AA30のペプチドである。
以下に考察するように，前記グループ内の特に好まし
いSP−５類似体は，AA28とAA29が共にSerのものであ
る。いずれの原理にも束縛されたくないが，本願の発明
者らは,2つの天然のCys残基を，その位置でSerに置換す
ると，分子内および分子間のジスルフィド結合が減少す
るので，対応して，タンパクの凝集が減少する。
いSP−５類似体は，AA28とAA29が共にSerのものであ
る。いずれの原理にも束縛されたくないが，本願の発明
者らは,2つの天然のCys残基を，その位置でSerに置換す
ると，分子内および分子間のジスルフィド結合が減少す
るので，対応して，タンパクの凝集が減少する。
本発明の「hSP−18由来のペプチド類」は，第４図に
示されたアミノ酸配列を有するペプチドを包含し，この
第４図は，ヒトクローン＃３を示し，これは201の位置
から275〜281の位置のカルボキシ末端までにわたってい
る。特に好ましいのは,201−279の位置にわたっているS
P−18タンパクである。
示されたアミノ酸配列を有するペプチドを包含し，この
第４図は，ヒトクローン＃３を示し，これは201の位置
から275〜281の位置のカルボキシ末端までにわたってい
る。特に好ましいのは,201−279の位置にわたっているS
P−18タンパクである。
タンパクの産生 本発明の,hSP−18およびhSP−５由来のポリペプチド
の短かい形態のものは，固相ペプチド合成法あるいはそ
の他の標準的なペプチド合成手段によって製造すること
ができる。またこれらのペプチドは，組換体のベクター
および宿主を用いて簡便に製造される。
の短かい形態のものは，固相ペプチド合成法あるいはそ
の他の標準的なペプチド合成手段によって製造すること
ができる。またこれらのペプチドは，組換体のベクター
および宿主を用いて簡便に製造される。
ベクターを構築し，細胞を形質転換し，形質転換され
た細胞内で発現させるなどに用いられるほとんどの技術
は，当該技術分野では広く実施されており，ほとんどの
当業者は，特定の条件と方法を記載している標準手段の
資料をよく知っている。当業者が本発明のペプチドに適
用する方法の例は，第WO86/03408号および，第WO87/065
88号に詳細に述べられている。
た細胞内で発現させるなどに用いられるほとんどの技術
は，当該技術分野では広く実施されており，ほとんどの
当業者は，特定の条件と方法を記載している標準手段の
資料をよく知っている。当業者が本発明のペプチドに適
用する方法の例は，第WO86/03408号および，第WO87/065
88号に詳細に述べられている。
特に哺乳類系と細菌系および酵母が主体の系を含む各
種の宿主系で，発現を行うことができる。さらに他の細
胞系が当該技術分野で入手できるようになった。例え
ば，バキュロウイルスのベクターが，虫の細胞中でタン
パクをコードする遺伝子を発現するのに用いられる。下
記の発現システムは例示を目的とするもので，各種の発
現システムを用いることができることは当業者にとって
明らかなことである。
種の宿主系で，発現を行うことができる。さらに他の細
胞系が当該技術分野で入手できるようになった。例え
ば，バキュロウイルスのベクターが，虫の細胞中でタン
パクをコードする遺伝子を発現するのに用いられる。下
記の発現システムは例示を目的とするもので，各種の発
現システムを用いることができることは当業者にとって
明らかなことである。
各種のhSP−５とhSP−18由来のペプチドをコードする
ヌクレオチド配列は,cDNAまたはゲノムDNAの修正取り出
しおよび／または合成法の利用によって入手でき，これ
らは，この種々の系で発現することができる。原核系が
用いられる場合，イントロンなしのコーディング配列を
適切なコントロール配列とともに用いるべきである。上
記ASPタンパクのいずれかに対応するcDNAクローンは，
適切な制限酵素で切取られ，そのような発現を行うため
に原核ベクターに連結されるか，または合成のコーディ
ング配列が用いられる。ASPゲノムDNAを原核系で発現さ
せるためには,DNAは，特定部位の変異誘発か，またはcD
NAに対応する部分を修復して，イントロン含有のゲノム
配列を置換することによってイントロンを除去する修飾
を行わねばならない。このイントロンなしのコーディン
グDNAは，次に発現ベクターに連結され，原核系での発
現がなされる。
ヌクレオチド配列は,cDNAまたはゲノムDNAの修正取り出
しおよび／または合成法の利用によって入手でき，これ
らは，この種々の系で発現することができる。原核系が
用いられる場合，イントロンなしのコーディング配列を
適切なコントロール配列とともに用いるべきである。上
記ASPタンパクのいずれかに対応するcDNAクローンは，
適切な制限酵素で切取られ，そのような発現を行うため
に原核ベクターに連結されるか，または合成のコーディ
ング配列が用いられる。ASPゲノムDNAを原核系で発現さ
せるためには,DNAは，特定部位の変異誘発か，またはcD
NAに対応する部分を修復して，イントロン含有のゲノム
配列を置換することによってイントロンを除去する修飾
を行わねばならない。このイントロンなしのコーディン
グDNAは，次に発現ベクターに連結され，原核系での発
現がなされる。
例示するように，ゲノム配列,cDNA配列あるいは合成
の（あるいは一部合成の）ASPをコードする配列は，イ
ントロンをプロセッシングすることができる発現系，通
常哺乳類の宿主細胞培養系に直接用いることもできる。
このような発現を行うために，ゲノム配列あるいはその
他の配列は，適合性の細胞内においてその配列の発現を
調節する制御可能な哺乳類のプロモーターの下流に連結
され得る。
の（あるいは一部合成の）ASPをコードする配列は，イ
ントロンをプロセッシングすることができる発現系，通
常哺乳類の宿主細胞培養系に直接用いることもできる。
このような発現を行うために，ゲノム配列あるいはその
他の配列は，適合性の細胞内においてその配列の発現を
調節する制御可能な哺乳類のプロモーターの下流に連結
され得る。
組換え体の産生に加えて,SP−５がコードするタンパ
クに類縁のタンパクのような長さが充分に短かい本発明
のタンパクを，標準のタンパク合成法により調製するこ
とができる。
クに類縁のタンパクのような長さが充分に短かい本発明
のタンパクを，標準のタンパク合成法により調製するこ
とができる。
タンパクの回収 ASPタンパクは，成熟タンパクもしくは融合タンパク
として産生され得，または分泌のためにシグナル配列を
プロセッシングすることができる細胞内で該シグナル配
列とともに産生され得る。タンパクが分泌されれば，精
製における困難が最小になるので，時には有利である。
したがって，適切なプロセッシングができる細胞内で，
天然シグナル配列のコドンを含むヒトASP遺伝子を発現
することが好ましい。培養された哺乳類の細胞は，シグ
ナル配列を含む非相同の哺乳類タンパクを切断・プロセ
ッシングして，それを培地中に分泌し得ることが示され
ている（McCormick,F.ら,Mol Cell Biol,4巻,166頁,198
4年）。
として産生され得，または分泌のためにシグナル配列を
プロセッシングすることができる細胞内で該シグナル配
列とともに産生され得る。タンパクが分泌されれば，精
製における困難が最小になるので，時には有利である。
したがって，適切なプロセッシングができる細胞内で，
天然シグナル配列のコドンを含むヒトASP遺伝子を発現
することが好ましい。培養された哺乳類の細胞は，シグ
ナル配列を含む非相同の哺乳類タンパクを切断・プロセ
ッシングして，それを培地中に分泌し得ることが示され
ている（McCormick,F.ら,Mol Cell Biol,4巻,166頁,198
4年）。
ASPタンパクは，培地に分泌された場合，標準のタン
パク精製法を用いて回収される。精製法は簡単である，
というのは比較的少数のタンパクが培地に分泌され，し
かも分泌されたタンパクの大部分がASPだからである。
その方法は面倒であるけれども，融合もしくは成熟の形
態で細胞内に産生されるような細胞の音波処理物もしく
は細胞溶解物からこのタンパクを精製することは，当該
技術分野では公知の手段である。このような方法の１つ
を以下に示す。
パク精製法を用いて回収される。精製法は簡単である，
というのは比較的少数のタンパクが培地に分泌され，し
かも分泌されたタンパクの大部分がASPだからである。
その方法は面倒であるけれども，融合もしくは成熟の形
態で細胞内に産生されるような細胞の音波処理物もしく
は細胞溶解物からこのタンパクを精製することは，当該
技術分野では公知の手段である。このような方法の１つ
を以下に示す。
ASP活性のアッセイ 表面張力を減少させて（表面圧を増大させるのと同じ
意味），水と空気との界面にフィルムを生成することに
よって機能するASPタンパクの性質を評価するインビト
ロでの試験法が考案されている。これらの方法を用いた
研究が，単離された天然の10KイヌASPについて実施され
ている（Benson,B.J.ら，Prog Resp Res,18巻,83〜92
頁,1984年;Hawgood,S.ら，Biochemistry,24巻,184〜190
頁,1985年）。これらの方法はまた，個々の合成および
組換え体のペプチドに適用される。インビボでは，界面
活性複合体の機能は，表面張力を減少させるため空気と
水との界面にフィルムを形成することであるので，イン
ビトロでのモデルにおいて，このような表面に脂質ある
いはリポタンパクを広げて生成するフィルムの形成を促
進するASPタンパクの能力は，その効用に適合している
ことは明らかである。
意味），水と空気との界面にフィルムを生成することに
よって機能するASPタンパクの性質を評価するインビト
ロでの試験法が考案されている。これらの方法を用いた
研究が，単離された天然の10KイヌASPについて実施され
ている（Benson,B.J.ら，Prog Resp Res,18巻,83〜92
頁,1984年;Hawgood,S.ら，Biochemistry,24巻,184〜190
頁,1985年）。これらの方法はまた，個々の合成および
組換え体のペプチドに適用される。インビボでは，界面
活性複合体の機能は，表面張力を減少させるため空気と
水との界面にフィルムを形成することであるので，イン
ビトロでのモデルにおいて，このような表面に脂質ある
いはリポタンパクを広げて生成するフィルムの形成を促
進するASPタンパクの能力は，その効用に適合している
ことは明らかである。
国際特許出願公開第WO87/06588号のD.10項に詳細に記
載されているインビボモデルも用いられる。
載されているインビボモデルも用いられる。
投与および使用 精製されたタンパクと類似体は，単独もしくは組み合
わせて，小児あるいは成人の呼吸窮迫症候群を治療する
ために投与する適切な薬剤組成物に用いることができ
る。また，この発明の組成物は，肺炎および気管支炎の
ような類縁の呼吸器疾患を治療するのに有用てある。こ
の複合体は，約50％からほぼ100％（wt/wt）の脂質と,5
0％から１％より少ないASPとを含有し,ASPは複合体の５
〜20％が好ましい。脂質部分は,70〜90％（wt/wt）がDP
PCであり，残りが，不飽和のホスファチジルコリン，ホ
スファチジルグリセロール，トリアシルグリセロール
類，パルミチン酸，パルミトイルオレイルホスホグリセ
リド（POPG），あるいはその混合物で構成されているの
が好ましい。複合体は,ASPの溶液と脂質リポソームの懸
濁液を混合することにより，または洗浄剤もしくは有機
溶媒の存在下で，脂質タンパクの溶液を直接混合するこ
とによって調製される。次いで洗浄剤または溶媒は，透
析あるいは蒸発で除去される。
わせて，小児あるいは成人の呼吸窮迫症候群を治療する
ために投与する適切な薬剤組成物に用いることができ
る。また，この発明の組成物は，肺炎および気管支炎の
ような類縁の呼吸器疾患を治療するのに有用てある。こ
の複合体は，約50％からほぼ100％（wt/wt）の脂質と,5
0％から１％より少ないASPとを含有し,ASPは複合体の５
〜20％が好ましい。脂質部分は,70〜90％（wt/wt）がDP
PCであり，残りが，不飽和のホスファチジルコリン，ホ
スファチジルグリセロール，トリアシルグリセロール
類，パルミチン酸，パルミトイルオレイルホスホグリセ
リド（POPG），あるいはその混合物で構成されているの
が好ましい。複合体は,ASPの溶液と脂質リポソームの懸
濁液を混合することにより，または洗浄剤もしくは有機
溶媒の存在下で，脂質タンパクの溶液を直接混合するこ
とによって調製される。次いで洗浄剤または溶媒は，透
析あるいは蒸発で除去される。
複合体を構築する際に肺洗浄物由来の天然の脂質成分
を利用し，適切な量のASPタンパクをこれに補充するこ
とが可能であるが，合成の脂質を使用することが好まし
いのは明らかである。第一に，当然のことであるが供給
量が充分である。第二に，調製物の純度，および伝染性
のタンパクを含めて，天然の脂質が単離されるべき肺に
依存する外来のタンパクによる汚染がないということ
は，合成の調製物にだけ保証される。勿論，有効な複合
体の再調製は，合成の成分を使用する場合の方が困難で
ある。
を利用し，適切な量のASPタンパクをこれに補充するこ
とが可能であるが，合成の脂質を使用することが好まし
いのは明らかである。第一に，当然のことであるが供給
量が充分である。第二に，調製物の純度，および伝染性
のタンパクを含めて，天然の脂質が単離されるべき肺に
依存する外来のタンパクによる汚染がないということ
は，合成の調製物にだけ保証される。勿論，有効な複合
体の再調製は，合成の成分を使用する場合の方が困難で
ある。
好ましいASP組成物は，単離された10K混合物,SP−５
あるいはSP−18がコードするタンパク単独，活性SP−５
類似体の単独あるいは組合せを有する複合体,10Kおよび
32K混合物の複合体，またはSP−18あるいはSP−５類縁
タンパクと32K混合物との複合体を含有する。後者の場
合，タンパクの比率として好ましいのは，すなわち32K:
10Kまたは32K:SP−18または32K:SP−５は，典型的には,
3:1〜200:1の範囲であり，好ましくは，約10:1〜5:1の
範囲である。32Kタンパクは，リン脂質小胞の水性懸濁
液に，水溶液で直接添加してもよい。10Kタンパクは非
常に疎水性が高いので，クロロホルムのような有機溶媒
の溶液中の脂質に添加され，溶媒を蒸発させ，次いで水
和させて小胞を再形成させる。
あるいはSP−18がコードするタンパク単独，活性SP−５
類似体の単独あるいは組合せを有する複合体,10Kおよび
32K混合物の複合体，またはSP−18あるいはSP−５類縁
タンパクと32K混合物との複合体を含有する。後者の場
合，タンパクの比率として好ましいのは，すなわち32K:
10Kまたは32K:SP−18または32K:SP−５は，典型的には,
3:1〜200:1の範囲であり，好ましくは，約10:1〜5:1の
範囲である。32Kタンパクは，リン脂質小胞の水性懸濁
液に，水溶液で直接添加してもよい。10Kタンパクは非
常に疎水性が高いので，クロロホルムのような有機溶媒
の溶液中の脂質に添加され，溶媒を蒸発させ，次いで水
和させて小胞を再形成させる。
界面活性複合体を投与するのに,32Kタンパクを10Kタ
イプに添加すると，相乗効果があるようである。すなわ
ち32Kと10Kタイプのタンパクの組合せは,10Kタンパク単
独の場合に必要なタンパク濃度より低い濃度で所望の活
性を発揮する。したがって，この発明の好ましい方法で
は，投与される界面活性複合体は,10K混合物，または個
々のSP−５もしくはSP−18のタンパク，または本発明の
hSP−５もしくはhSP−18由来のペプチドと32KASPとの混
合物の有効量を含有している。もちろん，個々のhSP−
５もしくはhSP−18由来のペプチドの混合物が使用され
得る。特に好ましい組成物は，上記のような32K:10Kタ
イプの比率のタンパクと，適切な量の脂質成分，（典型
的には，全組成物の50％からほぼ100％の範囲）とを含
有している。
イプに添加すると，相乗効果があるようである。すなわ
ち32Kと10Kタイプのタンパクの組合せは,10Kタンパク単
独の場合に必要なタンパク濃度より低い濃度で所望の活
性を発揮する。したがって，この発明の好ましい方法で
は，投与される界面活性複合体は,10K混合物，または個
々のSP−５もしくはSP−18のタンパク，または本発明の
hSP−５もしくはhSP−18由来のペプチドと32KASPとの混
合物の有効量を含有している。もちろん，個々のhSP−
５もしくはhSP−18由来のペプチドの混合物が使用され
得る。特に好ましい組成物は，上記のような32K:10Kタ
イプの比率のタンパクと，適切な量の脂質成分，（典型
的には，全組成物の50％からほぼ100％の範囲）とを含
有している。
複合体を含有する組成物は，気管内投与に適した組成
物が好まし。すなわち，一般に懸濁液，乾燥粉末“ダス
ト”またはエアロゾルが挙げられる。気管内に直接投与
される場合には，複合体は，例えば水，生理食塩水，デ
キストロースもしくはグリセロールなどのような適切な
賦形剤とともに液体に懸濁される。この複合体はまた，
例えば酢酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウムであるpH
緩衝剤のような非毒性の補助物質を少量含有していても
よい。“ダスト”を調製するには，複合体は，必要に応
じて上記のように混合され，凍結乾燥され，次いで乾燥
粉末として回収される。
物が好まし。すなわち，一般に懸濁液，乾燥粉末“ダス
ト”またはエアロゾルが挙げられる。気管内に直接投与
される場合には，複合体は，例えば水，生理食塩水，デ
キストロースもしくはグリセロールなどのような適切な
賦形剤とともに液体に懸濁される。この複合体はまた，
例えば酢酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウムであるpH
緩衝剤のような非毒性の補助物質を少量含有していても
よい。“ダスト”を調製するには，複合体は，必要に応
じて上記のように混合され，凍結乾燥され，次いで乾燥
粉末として回収される。
エアロゾル投与に使用する場合には，複合体は，添加
物の界面活性剤および推進剤（プロペラント）とともに
微細分散形態で供給される。投与され得る典型的な界面
活性剤は脂肪酸類とエステル類であるが，この場合に
は，界面活性複合体のその他の成分であるDPPCとPGを利
用することが好ましい。典型的には，有用なプロペラン
トは，常態においては気体であり，加圧下で凝縮され
る。低級アルカン類および，フレオン（Freon）のよう
なフッ素化アルカン類が使用できる。エアロゾルは，適
切なバルブを設けた容器に充填され，有効成分は放出さ
れるまで加圧下で保持される。
物の界面活性剤および推進剤（プロペラント）とともに
微細分散形態で供給される。投与され得る典型的な界面
活性剤は脂肪酸類とエステル類であるが，この場合に
は，界面活性複合体のその他の成分であるDPPCとPGを利
用することが好ましい。典型的には，有用なプロペラン
トは，常態においては気体であり，加圧下で凝縮され
る。低級アルカン類および，フレオン（Freon）のよう
なフッ素化アルカン類が使用できる。エアロゾルは，適
切なバルブを設けた容器に充填され，有効成分は放出さ
れるまで加圧下で保持される。
界面活性複合体は，その投与形態に応じて，気管内挿
入管により，エアロゾル投与により，または懸濁液もし
くはダストを吸気中に噴霧化することによって投与され
る。約0.1mg〜200mg/kg体重，好ましくは50〜60mg/kg体
重の量の複合体が１回の投与で投与される。新生児に用
いる場合，一般に１回の投与で充分である。成人に用い
る場合は，充分に再調製された複合体を，示された不足
量を補充するのに用いられる（Hallman,M.ら，J Clinic
al Investigation,70巻,673−682頁,1982年）。
入管により，エアロゾル投与により，または懸濁液もし
くはダストを吸気中に噴霧化することによって投与され
る。約0.1mg〜200mg/kg体重，好ましくは50〜60mg/kg体
重の量の複合体が１回の投与で投与される。新生児に用
いる場合，一般に１回の投与で充分である。成人に用い
る場合は，充分に再調製された複合体を，示された不足
量を補充するのに用いられる（Hallman,M.ら，J Clinic
al Investigation,70巻,673−682頁,1982年）。
さらに，ここに記載したhSP−18およびhSP−５由来の
ペプチドを含む１種またはそれ以上のASPタンパクは，
他の生物学的に活性で重要な分子を，肺におよび／また
は肺を介して血液脈管構造に分配するための担体もしく
はビヒクルとして使用できる。後者の場合，体内の他の
器官に対して重要である薬剤を分配することができる。
ペプチドを含む１種またはそれ以上のASPタンパクは，
他の生物学的に活性で重要な分子を，肺におよび／また
は肺を介して血液脈管構造に分配するための担体もしく
はビヒクルとして使用できる。後者の場合，体内の他の
器官に対して重要である薬剤を分配することができる。
本発明を，その好ましい特定の実施態様と関連させて
記載したが，上記記載と次の実施例とは，本発明を例示
するためのものであり，本発明の範囲を限定するもので
はないことが理解されるべきである。本発明の範囲に含
まれるその他の局面，利点および改変は，この発明が属
している分野の当業者には明らかなことである。
記載したが，上記記載と次の実施例とは，本発明を例示
するためのものであり，本発明の範囲を限定するもので
はないことが理解されるべきである。本発明の範囲に含
まれるその他の局面，利点および改変は，この発明が属
している分野の当業者には明らかなことである。
実施例 調製Ａ 哺乳類ASPタンパクの分離 イヌ，ヒトおよびウシのASPタンパクを,WO86/03408お
よびWO87/06588に述べられているようにして精製した形
態で得，ヒトおよびイヌの32KタンパクをコードするDN
A,ならびにヒトおよびイヌのSP−18タンパクをコードす
るDNAをこれらの明細書中に述べられているようにして
回収した。ヒトASPのSP−５前駆体タンパクをコードす
る完全なcDNA配列の２つの変異株を,WO87/06588に述べ
られているようにして回収した。これらを本願の第１図
および第２図に再度示す。
よびWO87/06588に述べられているようにして精製した形
態で得，ヒトおよびイヌの32KタンパクをコードするDN
A,ならびにヒトおよびイヌのSP−18タンパクをコードす
るDNAをこれらの明細書中に述べられているようにして
回収した。ヒトASPのSP−５前駆体タンパクをコードす
る完全なcDNA配列の２つの変異株を,WO87/06588に述べ
られているようにして回収した。これらを本願の第１図
および第２図に再度示す。
実施例１ 単離した10KタンパクのＮおよびＣ末端の同定5kdタンパ
ク： 10K混合物中の5kdタンパクは，約20,500ダルトンの分
子量を持つ大きな前駆物質から誘導されるので，そのカ
ルボキシル末端を確認することは困難である。イヌ5kd
タンパクのカルボキシル末端は，第５図のイヌタンパク
に関するアミノ酸配列に示すようにHis−59であること
が，質量分析計を用いて本発明者により最終的に決定さ
れた。類推により，ヒト5kdタンパクは同じＣ末端を有
すると想定される。なぜなら，この領域でのアミノ酸の
相同性が極めて高いからである。従って，ヒト5kdタン
パクのカルボキシ末端は，第１図，第２図および第３図
に示すように,His−59であるはずである。
ク： 10K混合物中の5kdタンパクは，約20,500ダルトンの分
子量を持つ大きな前駆物質から誘導されるので，そのカ
ルボキシル末端を確認することは困難である。イヌ5kd
タンパクのカルボキシル末端は，第５図のイヌタンパク
に関するアミノ酸配列に示すようにHis−59であること
が，質量分析計を用いて本発明者により最終的に決定さ
れた。類推により，ヒト5kdタンパクは同じＣ末端を有
すると想定される。なぜなら，この領域でのアミノ酸の
相同性が極めて高いからである。従って，ヒト5kdタン
パクのカルボキシ末端は，第１図，第２図および第３図
に示すように,His−59であるはずである。
ヒト5kdタンパクのＮ末端は，直接アミノ酸配列決定
によりフェニルアラニン（第３図に示すように24位）で
あると決定されたが，代替Ｎ末端として25位のグシリン
および26位のイソロイシンを有する切形種も認められ
た。
によりフェニルアラニン（第３図に示すように24位）で
あると決定されたが，代替Ｎ末端として25位のグシリン
および26位のイソロイシンを有する切形種も認められ
た。
18kdタンパク： 10K混合物中の18kdタンパクのカルボキシ末端を，定
量的アミノ酸組成,N末端に始まるタンパクのアミノ酸配
列決定，カルボキシペプチダーゼＹ消化（タンパクのＣ
末端からアミノ酸を開裂させる酵素），および質量分析
計を使用して分析した。第６図は，ヒトおよびイヌの該
タンパクのアミノ酸配列を示す。
量的アミノ酸組成,N末端に始まるタンパクのアミノ酸配
列決定，カルボキシペプチダーゼＹ消化（タンパクのＣ
末端からアミノ酸を開裂させる酵素），および質量分析
計を使用して分析した。第６図は，ヒトおよびイヌの該
タンパクのアミノ酸配列を示す。
臭化シアンによるメチオニンでの開裂後，イヌおよび
ウシの18kdタンパクの配列分析は，イヌタンパクのＣ末
端がHis−279であり，ウシタンパクのＣ末端がSer−278
であることを示した。カルボキシペプチダーゼＹを用い
た酵素分析は，イヌおよびウシの両タンパクのＣ末端と
してLeu−275を示した。イヌタンパクの質量スペクトル
分析は，臭化シアン開裂後のアミノ酸配列決定により予
想されたように，少量の,His−279に至る配列を有する,
Arg−276のＣ末端を示した。つまり，カルボキシ末端
は，イヌタンパクにおいてはHis−279の近くにあり，類
推すると，ヒト18kdタンパクではMet−279付近にある。
前述の結果に基づき，個々の調製法および種に依存し
て，切形Ｎ末端またはスタッガードＮ末端ならびにタン
パクの切形Ｃ末端形態があると考えられる。従って本発
明者らは，おそらく個々の種について多くのＣ末端があ
ると考えられる。第６図に見られるように，ヒトタンパ
クについての推定Ｎ末端は,WO87/06588に述べられてい
るように201位のフェニルアラニンである。カルボキシ
末端は，同様に第６図に示すように,279位のメチオニン
コドンの付近に位置する。
ウシの18kdタンパクの配列分析は，イヌタンパクのＣ末
端がHis−279であり，ウシタンパクのＣ末端がSer−278
であることを示した。カルボキシペプチダーゼＹを用い
た酵素分析は，イヌおよびウシの両タンパクのＣ末端と
してLeu−275を示した。イヌタンパクの質量スペクトル
分析は，臭化シアン開裂後のアミノ酸配列決定により予
想されたように，少量の,His−279に至る配列を有する,
Arg−276のＣ末端を示した。つまり，カルボキシ末端
は，イヌタンパクにおいてはHis−279の近くにあり，類
推すると，ヒト18kdタンパクではMet−279付近にある。
前述の結果に基づき，個々の調製法および種に依存し
て，切形Ｎ末端またはスタッガードＮ末端ならびにタン
パクの切形Ｃ末端形態があると考えられる。従って本発
明者らは，おそらく個々の種について多くのＣ末端があ
ると考えられる。第６図に見られるように，ヒトタンパ
クについての推定Ｎ末端は,WO87/06588に述べられてい
るように201位のフェニルアラニンである。カルボキシ
末端は，同様に第６図に示すように,279位のメチオニン
コドンの付近に位置する。
調製Ｂ 哺乳類発現ベクターの構築 本文中に開示するhSP−18誘導タンパクおよびhSP−５
誘導タンパクは，組換え手法を使用して調製され得る。
哺乳類細胞における各種ASPコード配列の発現に適し，
イントロンを含むDNAをプロセシングすることもできる
ベクターを構築した。これらのベクターにおいては,WO8
7/06588に述べられているように，メタロチオネインII
（hMT II）コントロール配列によって発現がコントロー
ルされる。この公開された特許出願は，宿主ベクターpM
T,pMT−Apo,pMT−SV（９）,pMT−SV（10）およびpMT−A
po10の調製を詳細に述べている。これらのベクターはす
べて，コード配列をメタロチオネインプロモーターのコ
ントロール下に置く挿入部位を有している。名称の中に
“Apo"を含むベクターは，挿入部位の下流のApoAI遺伝
子に連結した３′末端調節シグナルも有している名称の
中に“9"または“10"を含むベクターは，作動可能なSV
−40スイルスエンハンサーをも有する。
誘導タンパクは，組換え手法を使用して調製され得る。
哺乳類細胞における各種ASPコード配列の発現に適し，
イントロンを含むDNAをプロセシングすることもできる
ベクターを構築した。これらのベクターにおいては,WO8
7/06588に述べられているように，メタロチオネインII
（hMT II）コントロール配列によって発現がコントロー
ルされる。この公開された特許出願は，宿主ベクターpM
T,pMT−Apo,pMT−SV（９）,pMT−SV（10）およびpMT−A
po10の調製を詳細に述べている。これらのベクターはす
べて，コード配列をメタロチオネインプロモーターのコ
ントロール下に置く挿入部位を有している。名称の中に
“Apo"を含むベクターは，挿入部位の下流のApoAI遺伝
子に連結した３′末端調節シグナルも有している名称の
中に“9"または“10"を含むベクターは，作動可能なSV
−40スイルスエンハンサーをも有する。
公開明細書に述べられているように,pMTApo10をBanHI
で消化し，平滑末端化して,SP−18前駆体をコードする1
275bpのクローン＃３から得たcDNA配列に平滑末端断片
として連結した。これは，ヌクレオチド663でBamHI部位
を避けてcDNA＃３からEcoRI/BamHI（部分）断片を単離
し,EcoRI/BamHI消化したpUC9にサブクローニングするこ
とによって実施された。所望の断片をEcoRIおよびHindI
IIで切断し，クレノウ断片によって平滑末端化して，次
にpMTApo10に挿入した。生じるベクターpMT（Ｅ）:SP−
18−40KをCHO細胞に形質転換した。これらの形質転換細
胞の培養物におけるプロモーターの誘発によって,25kd
および43kdタンパクの産生が生じた。これらのタンパク
は，ヒト18kdASPに対して生じた抗血清により免疫沈降
する。前駆物質の残基336〜353に及ぶペプチドに対して
生じた抗血清を使用してウエスタンブロット法に付した
場合,25kdおよび43kdタンパクが検出された。25kd産物
は,N結合したグルコシル化部位を含む,Phe−201:Leu−3
81にわたる181アミノ酸配列を表すと考えられる。
で消化し，平滑末端化して,SP−18前駆体をコードする1
275bpのクローン＃３から得たcDNA配列に平滑末端断片
として連結した。これは，ヌクレオチド663でBamHI部位
を避けてcDNA＃３からEcoRI/BamHI（部分）断片を単離
し,EcoRI/BamHI消化したpUC9にサブクローニングするこ
とによって実施された。所望の断片をEcoRIおよびHindI
IIで切断し，クレノウ断片によって平滑末端化して，次
にpMTApo10に挿入した。生じるベクターpMT（Ｅ）:SP−
18−40KをCHO細胞に形質転換した。これらの形質転換細
胞の培養物におけるプロモーターの誘発によって,25kd
および43kdタンパクの産生が生じた。これらのタンパク
は，ヒト18kdASPに対して生じた抗血清により免疫沈降
する。前駆物質の残基336〜353に及ぶペプチドに対して
生じた抗血清を使用してウエスタンブロット法に付した
場合,25kdおよび43kdタンパクが検出された。25kd産物
は,N結合したグルコシル化部位を含む,Phe−201:Leu−3
81にわたる181アミノ酸配列を表すと考えられる。
さらに,WO87/06587に述べられているように，標準的
な部位特異的変異誘発手法を使用して,SP−18をコード
するDNAを含む相似ベクターを構築した。この手法によ
り，完全な長さの配列空CHO細胞において明らかに産生
される前駆タンパクをインビトロで開裂するための部位
を与える。かかる構築物の１つにおいて,381アミノ酸前
駆体を修飾して,Gln−199:Gln−200およびArg−286:Ser
−187を各々Asn:Glyによって置換し，ヒドロキシルアミ
ン（AsnとGlyの間を開裂する）によって開裂されうる部
位を与えた。従ってヒドロキシルアミンによって生じる
前駆体の開裂は、アミノ末端に追加のgly残基を持ち，
さらにAsn残基に変化した推定上のカルボキシ末端Arg−
286を有する，推定上の成熟形を生成する。もう１つの
構築物では,Phe−201およびSer−87がAsp残基に変化す
る。酸による開裂（AspとProの間）は,N末端のPhe−201
を欠き，追加のカルボキシ末端Asp残基を有するSP−18
タンパクの成熟形を生じる。さらにもう１つの構築物で
は,Glu残基の後を開裂するStaph V8ペプチダーゼを使用
したより穏やかな酵素的方法により，前駆体のインビト
ロでのプロセシングが可能である。Glu−251をAspに変
えることによって,Glu−198とGlu−291との天然のGlu残
基を利用する。43kd前駆体はStaphV8により開裂され
て，アミノ末端に追加のGln−Gln,およびカルボキシ末
端にPro−Thr−Gly−Gluを有する推定上の成熟SP−18タ
ンパクを生成する。さらにもう１つの構築物では,Glu残
基を200位および／あるいは287位に置くことができる。
な部位特異的変異誘発手法を使用して,SP−18をコード
するDNAを含む相似ベクターを構築した。この手法によ
り，完全な長さの配列空CHO細胞において明らかに産生
される前駆タンパクをインビトロで開裂するための部位
を与える。かかる構築物の１つにおいて,381アミノ酸前
駆体を修飾して,Gln−199:Gln−200およびArg−286:Ser
−187を各々Asn:Glyによって置換し，ヒドロキシルアミ
ン（AsnとGlyの間を開裂する）によって開裂されうる部
位を与えた。従ってヒドロキシルアミンによって生じる
前駆体の開裂は、アミノ末端に追加のgly残基を持ち，
さらにAsn残基に変化した推定上のカルボキシ末端Arg−
286を有する，推定上の成熟形を生成する。もう１つの
構築物では,Phe−201およびSer−87がAsp残基に変化す
る。酸による開裂（AspとProの間）は,N末端のPhe−201
を欠き，追加のカルボキシ末端Asp残基を有するSP−18
タンパクの成熟形を生じる。さらにもう１つの構築物で
は,Glu残基の後を開裂するStaph V8ペプチダーゼを使用
したより穏やかな酵素的方法により，前駆体のインビト
ロでのプロセシングが可能である。Glu−251をAspに変
えることによって,Glu−198とGlu−291との天然のGlu残
基を利用する。43kd前駆体はStaphV8により開裂され
て，アミノ末端に追加のGln−Gln,およびカルボキシ末
端にPro−Thr−Gly−Gluを有する推定上の成熟SP−18タ
ンパクを生成する。さらにもう１つの構築物では,Glu残
基を200位および／あるいは287位に置くことができる。
同様にして，第１図および第２図のSP−５クローンの
平滑末端化したEcoRI挿入部をBamHI消化したpMT−Apo10
に導入してpMT（Ｅ）:SP−５ベクターを得,CHO細胞に形
質転換した。
平滑末端化したEcoRI挿入部をBamHI消化したpMT−Apo10
に導入してpMT（Ｅ）:SP−５ベクターを得,CHO細胞に形
質転換した。
実施例２ hSP−18およびhSP−５誘導ペプチドをコードするDNAの
哺乳類での発現 本文中に述べる本発明のhSP−５およびhSP−18誘導タ
ンパクをコードするDNA配列をBamHI消化したpMT−po10
に導入し，適当な発現ベクターを得る。好ましくは，所
望するタンパクをコードするDNAが,CHO細胞において有
効なシグナル配列に作動可能な結合で連結している。CH
O細胞への形質転換および挿入した配列の発現は以下に
述べるように実施される。
哺乳類での発現 本文中に述べる本発明のhSP−５およびhSP−18誘導タ
ンパクをコードするDNA配列をBamHI消化したpMT−po10
に導入し，適当な発現ベクターを得る。好ましくは，所
望するタンパクをコードするDNAが,CHO細胞において有
効なシグナル配列に作動可能な結合で連結している。CH
O細胞への形質転換および挿入した配列の発現は以下に
述べるように実施される。
チャイニーズハムスター卵巣（CHO）−KI細胞を,10％
ウシ胎児血清を含むクーンのF12培地とDME21培地の1:1
混合物から成る培地上で増殖させる。コンピテント細胞
を，該ベクターおよびpSV2:NEO（サザン,P.ら（Souther
n,Pet al,），J Mol ApplGenet（1982）1:327〜341）と
共に同時形質転換する。pSV2:NEOは，ネオマイシン類似
物G418に対する耐性を付与する機能的遺伝子を含有す
る。典型的な形質転換では,pSV2:NEO0.5μｇおよび発現
ベクターDNA5μｇまたはそれ以上を100mm皿の細胞に適
用する。ウィグラー,Mら（Wigler,Met al）,Cell（197
9）16:777〜785のプロトコールに従った。リン酸カルシ
ウム−DNAの共沈降法を使用する。この方法は、DNAに４
時間接触させた後,PBS中15％グリセロールによる２分間
の「ショック」を包含する。
ウシ胎児血清を含むクーンのF12培地とDME21培地の1:1
混合物から成る培地上で増殖させる。コンピテント細胞
を，該ベクターおよびpSV2:NEO（サザン,P.ら（Souther
n,Pet al,），J Mol ApplGenet（1982）1:327〜341）と
共に同時形質転換する。pSV2:NEOは，ネオマイシン類似
物G418に対する耐性を付与する機能的遺伝子を含有す
る。典型的な形質転換では,pSV2:NEO0.5μｇおよび発現
ベクターDNA5μｇまたはそれ以上を100mm皿の細胞に適
用する。ウィグラー,Mら（Wigler,Met al）,Cell（197
9）16:777〜785のプロトコールに従った。リン酸カルシ
ウム−DNAの共沈降法を使用する。この方法は、DNAに４
時間接触させた後,PBS中15％グリセロールによる２分間
の「ショック」を包含する。
簡単に述べると，細胞を1/10の集密性で播種し，一晩
増殖させ,PBSで２回洗浄し，CaPO4・DNA共沈降物を含む
ヘペス緩衝生理食塩水0.5ml中に15分間置き,10ml培地で
栄養補給する。吸引によって培地を取り,1.5〜３分間PB
S中15％グリセロールで置換する。ショックを与えた細
胞を洗浄し，培養培地で栄養補給する。MT−IIがコント
ロールする発現が誘発されるまで，培地は,10％FBSと共
にF12/DMEM21を1:1の割合で含有する。１日後，細胞を1
mg/mlのG418に付し,G418耐性コロニーのプールを形成す
る。所望するプラスミドの安定な遺伝形質をも有する，
成功裏に得られた形質転換体をクローナル単離株の精製
のために低密度でプレーティングする。
増殖させ,PBSで２回洗浄し，CaPO4・DNA共沈降物を含む
ヘペス緩衝生理食塩水0.5ml中に15分間置き,10ml培地で
栄養補給する。吸引によって培地を取り,1.5〜３分間PB
S中15％グリセロールで置換する。ショックを与えた細
胞を洗浄し，培養培地で栄養補給する。MT−IIがコント
ロールする発現が誘発されるまで，培地は,10％FBSと共
にF12/DMEM21を1:1の割合で含有する。１日後，細胞を1
mg/mlのG418に付し,G418耐性コロニーのプールを形成す
る。所望するプラスミドの安定な遺伝形質をも有する，
成功裏に得られた形質転換体をクローナル単離株の精製
のために低密度でプレーティングする。
形質転換体を，最初にプールとして，次にマルチウェ
ルプレートにおいて単離したクローンとして，所望する
タンパクの産生に関してアッセイした。プレートのアッ
セイレベルはいくぶんウエルのサイズに依存する。たと
えば24ウエルプレートからの結果を96ウエルプレートか
らの結果と直接比較することはできない。プレートアッ
セイにより，満足しうるレベルでタンパクを産生するこ
とが認められたクローンは，ローラーびん内での生産工
程において増殖させることができる。典型的には，規模
を大きくすれば生産レベルは上昇する。この理由から，
代表的に100〜200またはそれ以上の個々のクローンをプ
レート上で各種のスクリーニング法によってアッセイ
し，最も生産率の高い５〜10のクローンを生産条件下
（ローラーびん）でアッセイした。
ルプレートにおいて単離したクローンとして，所望する
タンパクの産生に関してアッセイした。プレートのアッ
セイレベルはいくぶんウエルのサイズに依存する。たと
えば24ウエルプレートからの結果を96ウエルプレートか
らの結果と直接比較することはできない。プレートアッ
セイにより，満足しうるレベルでタンパクを産生するこ
とが認められたクローンは，ローラーびん内での生産工
程において増殖させることができる。典型的には，規模
を大きくすれば生産レベルは上昇する。この理由から，
代表的に100〜200またはそれ以上の個々のクローンをプ
レート上で各種のスクリーニング法によってアッセイ
し，最も生産率の高い５〜10のクローンを生産条件下
（ローラーびん）でアッセイした。
形質転換した細胞のプールをマルチウエルプレートに
おいて増殖させ,5×10-5〜１×10-4の亜鉛イオン濃度に
接触させて所望のASPタンパクの産生を誘発する。
おいて増殖させ,5×10-5〜１×10-4の亜鉛イオン濃度に
接触させて所望のASPタンパクの産生を誘発する。
10％FBSを含むマッコイの5A培地中で増殖する個々の
細胞系の半融合性単層をリン酸緩衝食塩水（PBS）で洗
浄し,10％FBS,1×10-4塩化亜鉛，および0.25mMアスコル
ビン酸ナトリウムを含むマッコイ培地で再び増殖させ
る。（アスコルビン酸塩はプロリン残基の水銀化を仲介
するのに役立つと考えられる。）誘発から24時間後に，
細胞をPBSで洗浄し，塩化亜鉛およびアスコルビン酸塩
を含む血清不含マッコイ培地で増殖させる。12時間後，
馴化培地を分離する。
細胞系の半融合性単層をリン酸緩衝食塩水（PBS）で洗
浄し,10％FBS,1×10-4塩化亜鉛，および0.25mMアスコル
ビン酸ナトリウムを含むマッコイ培地で再び増殖させ
る。（アスコルビン酸塩はプロリン残基の水銀化を仲介
するのに役立つと考えられる。）誘発から24時間後に，
細胞をPBSで洗浄し，塩化亜鉛およびアスコルビン酸塩
を含む血清不含マッコイ培地で増殖させる。12時間後，
馴化培地を分離する。
調製Ｃ 細菌発現ベクター WO87/06588に述べられているように,ASPタンパクの非
グリコシル化形態を細菌において生成することができ
る。SP−18タンパクの場合には，遺伝子は，例えばMet
に続く残基201〜381を表す181アミノ酸前駆物質を産生
するように，あるいは15残基のβ−ガラクトシダーゼリ
ーダーを含む，ヒドロキシルアミン開裂が可能な融合タ
ンパク前駆物質として発現され得る。ATGに後続する,cD
NAのアミノ酸201〜381をコードする修飾cDNA＃３を,WO8
7/06588に述べられているように,Trpでコントロールさ
れたベクターpTrp−233のEcoRI部位とHindIII部位の間
に挿入して,pTrp−20を作製する。この構築物は分子量2
0kdのタンパクを生成する。pBGal宿主ベクターにおける
類似した構築物,pBGal−20は，ヒドロキシルアミン感受
性のAsn−Glyのダブレットを通して15残基のβ−ガラク
トシダーゼリーダーに融合したSP−18cDNA＃３と同じ配
列を含み，分子量22kdの融合タンパクを生成する。
グリコシル化形態を細菌において生成することができ
る。SP−18タンパクの場合には，遺伝子は，例えばMet
に続く残基201〜381を表す181アミノ酸前駆物質を産生
するように，あるいは15残基のβ−ガラクトシダーゼリ
ーダーを含む，ヒドロキシルアミン開裂が可能な融合タ
ンパク前駆物質として発現され得る。ATGに後続する,cD
NAのアミノ酸201〜381をコードする修飾cDNA＃３を,WO8
7/06588に述べられているように,Trpでコントロールさ
れたベクターpTrp−233のEcoRI部位とHindIII部位の間
に挿入して,pTrp−20を作製する。この構築物は分子量2
0kdのタンパクを生成する。pBGal宿主ベクターにおける
類似した構築物,pBGal−20は，ヒドロキシルアミン感受
性のAsn−Glyのダブレットを通して15残基のβ−ガラク
トシダーゼリーダーに融合したSP−18cDNA＃３と同じ配
列を含み，分子量22kdの融合タンパクを生成する。
pTrp−20およびpBGal−20プラスミドを使用して，イ
ー・コリW3110をアンピシリン耐性に形質転換する。M9
培地（１×M9塩,0.4％グルコース,2mg/mlチアミン,200
μg/mlのMgSO4・7H2O,0.5％カザミノ酸）中で速やかに
増殖するpTrp−20/W3110あるいはpBGal−20/W3110の培
養物を100μg/mlのIAA（３−β−インドールアクリレー
ト,Sigma I−1625）で処理し,trpプロモーターを誘発す
る。
ー・コリW3110をアンピシリン耐性に形質転換する。M9
培地（１×M9塩,0.4％グルコース,2mg/mlチアミン,200
μg/mlのMgSO4・7H2O,0.5％カザミノ酸）中で速やかに
増殖するpTrp−20/W3110あるいはpBGal−20/W3110の培
養物を100μg/mlのIAA（３−β−インドールアクリレー
ト,Sigma I−1625）で処理し,trpプロモーターを誘発す
る。
WO87/06588は，細菌内での発現のための開裂部位を与
える修飾SP−18タンパクの配列をコードするベクターに
ついても述べている。pTrp−20においては,Arg−286:Se
r−287をコードするコドンが，ヒドロキシルアミン感受
性開裂部位を導入するAsn−Glyをコードするように変化
するか，あるいはSer−287のコドンがAspのコドンに置
換されて，酸感受性のAsp−Pro開裂部位を生じるか，あ
るいはGlu−251のコドンが，所望するタンパクを開裂す
ることなくStaphV8によるGlu−291での開裂を可能にす
るAspのコドンに置換されていた。これらの構築物は,28
7〜381あるいは291〜381のアミノ酸配列を持つSP−18を
生成すると予想された。pTrp−20およびpBGal−20のい
ずれにおいても,3′末端から推定上のカルボキシ末端Ar
g−286までの配列が欠失して停止コドンに置換されてお
り,SP−18コドンの201〜286位を表すペプチドを生成す
ると推定された。どちらの構築物も，しかしながら，誘
発後適当な大きさの標識タンパクを生じなかった。
える修飾SP−18タンパクの配列をコードするベクターに
ついても述べている。pTrp−20においては,Arg−286:Se
r−287をコードするコドンが，ヒドロキシルアミン感受
性開裂部位を導入するAsn−Glyをコードするように変化
するか，あるいはSer−287のコドンがAspのコドンに置
換されて，酸感受性のAsp−Pro開裂部位を生じるか，あ
るいはGlu−251のコドンが，所望するタンパクを開裂す
ることなくStaphV8によるGlu−291での開裂を可能にす
るAspのコドンに置換されていた。これらの構築物は,28
7〜381あるいは291〜381のアミノ酸配列を持つSP−18を
生成すると予想された。pTrp−20およびpBGal−20のい
ずれにおいても,3′末端から推定上のカルボキシ末端Ar
g−286までの配列が欠失して停止コドンに置換されてお
り,SP−18コドンの201〜286位を表すペプチドを生成す
ると推定された。どちらの構築物も，しかしながら，誘
発後適当な大きさの標識タンパクを生じなかった。
SP−５誘導タンパクに関してWO87/06588は,pTrp−20
と同様に,ATGに続くGly−25からSP−５「前駆体」のIle
−197まで伸びるcDNA＃18の断片を,EcoRI/HindIII消化
したpTrp−233に挿入して,pTrp−５を作製し，またpBGa
l宿主ベクターに挿入してpBGal−５を作製することを述
べている。この場合SP−５配列は，ヒドロキシルアミン
感受性Asn−Glyを通してβ−ガラクトシダーゼリーダー
に融合している。これらのベクターは推定上,25〜197に
及ぶSP−５誘導タンパクを生成する。同様に，この構築
物から予想されるタンパクのStaphV8による,Phe−24に
続くGluおよびGlu−66での開裂は,24〜66位にわたるSP
−５誘導ペプチドを生じるであろう。
と同様に,ATGに続くGly−25からSP−５「前駆体」のIle
−197まで伸びるcDNA＃18の断片を,EcoRI/HindIII消化
したpTrp−233に挿入して,pTrp−５を作製し，またpBGa
l宿主ベクターに挿入してpBGal−５を作製することを述
べている。この場合SP−５配列は，ヒドロキシルアミン
感受性Asn−Glyを通してβ−ガラクトシダーゼリーダー
に融合している。これらのベクターは推定上,25〜197に
及ぶSP−５誘導タンパクを生成する。同様に，この構築
物から予想されるタンパクのStaphV8による,Phe−24に
続くGluおよびGlu−66での開裂は,24〜66位にわたるSP
−５誘導ペプチドを生じるであろう。
これらの構築物はすべてイー・コリW3110に形質転換
されて，上述したように発現される。
されて，上述したように発現される。
実施例３ 細菌におけるhSP−18およびhSP−５誘導タンパクの産生 hSP−18およびhSP−５誘導ペプチドを，上流に安定化
配列を持つ開裂可能な融合タンパクとして発現すること
は有益であると考えられる。同じ譲受人の，本文中に参
考文献として包含される,1988年８月11日出願の米国特
許出願第231,224号には,hSP−18あるいはhSP−５ペプチ
ドの特定部分をコードするDNAに結合したクロラムフェ
ニコールアセチルトランフェラーゼ（CAT）をコードす
る遺伝子の一部を含むいくつかのベクターの構築法が記
載されている。SP−５誘導ペプチドの35アミノ酸をコー
ドするベクター，すなわち６アミノ酸リンカー,Ser−As
p−Pro−Glu−Phe−Asnを通してCATに結合したhSP−５
（24〜59）を例示している。上記に引用した出願に述べ
られているように，これらのベクターは以下のようにし
て調製される。
配列を持つ開裂可能な融合タンパクとして発現すること
は有益であると考えられる。同じ譲受人の，本文中に参
考文献として包含される,1988年８月11日出願の米国特
許出願第231,224号には,hSP−18あるいはhSP−５ペプチ
ドの特定部分をコードするDNAに結合したクロラムフェ
ニコールアセチルトランフェラーゼ（CAT）をコードす
る遺伝子の一部を含むいくつかのベクターの構築法が記
載されている。SP−５誘導ペプチドの35アミノ酸をコー
ドするベクター，すなわち６アミノ酸リンカー,Ser−As
p−Pro−Glu−Phe−Asnを通してCATに結合したhSP−５
（24〜59）を例示している。上記に引用した出願に述べ
られているように，これらのベクターは以下のようにし
て調製される。
SP−18およびSP−５誘導タンパクを含むベクターを，
ヒト心房ナトリウム排泄増加性ペプチド（hANP）をコー
ドする挿入部を用いて構築した宿主ベクターから得る。
この中間ベクター,pChNF109は次のようにして構築され
る。
ヒト心房ナトリウム排泄増加性ペプチド（hANP）をコー
ドする挿入部を用いて構築した宿主ベクターから得る。
この中間ベクター,pChNF109は次のようにして構築され
る。
発現ベクターpChNF109は，エンドプロティナーゼGlu
−Ｃのタンパク分解性開裂部位を含む241アミノ酸のCAT
−hANPハイブリッドタンパクをコードする。CATおよびh
ANPのDNAならびにコードされているアミノ酸配列を第７
図に示す。CAT遺伝子の大部分（アミノ酸１〜210）は，
リンカー配列（５アミノ酸）を通してhANP（102〜126）
遺伝子および開裂部位（26アミノ酸）にフレーム内で結
合していた。このベクターは，プラスミドバックボーン
とtrpプロモーター−オペレーター;CAT遺伝子；およびh
ANP（102〜126）遺伝子と開裂部位を各々供給するプラ
スミド,pTrp233,pCAT21およびphNF75から構築された。
−Ｃのタンパク分解性開裂部位を含む241アミノ酸のCAT
−hANPハイブリッドタンパクをコードする。CATおよびh
ANPのDNAならびにコードされているアミノ酸配列を第７
図に示す。CAT遺伝子の大部分（アミノ酸１〜210）は，
リンカー配列（５アミノ酸）を通してhANP（102〜126）
遺伝子および開裂部位（26アミノ酸）にフレーム内で結
合していた。このベクターは，プラスミドバックボーン
とtrpプロモーター−オペレーター;CAT遺伝子；およびh
ANP（102〜126）遺伝子と開裂部位を各々供給するプラ
スミド,pTrp233,pCAT21およびphNF75から構築された。
プラスミドpTrp233はWO87/06588に記載された。プラ
スミドpCAT21は,trpプロモーター−オペレーターのコン
トロール下でCAT遺伝子（トランスポゾンTn9由来,Alton
とVapnek,Nature（1979）282:864〜869）をpTrp233に挿
入することによって構築された。プラスミドpAL13ATCAT
（Tn9を含むプラスミド，本文中に参考文献として包含
されている1987年９月11日付出願の同時係属中の米国特
許出願第095,742号に開示されている）をNdelおよびHin
dIIIで消化し,CAT（遺伝子を含む約750bpのNdeI−HindI
II断片（NdeI部位にコードされた開始Met残基を持つ）
を，アガロースゲル電気泳動を用いて精製した。T4 DNA
リガーゼを使用して，このCAT遺伝子をNdel/HindIII消
化したpTrp233に連結し，生じるプラスミド,pCAT21をイ
ー・コリMC1061から単離した。
スミドpCAT21は,trpプロモーター−オペレーターのコン
トロール下でCAT遺伝子（トランスポゾンTn9由来,Alton
とVapnek,Nature（1979）282:864〜869）をpTrp233に挿
入することによって構築された。プラスミドpAL13ATCAT
（Tn9を含むプラスミド，本文中に参考文献として包含
されている1987年９月11日付出願の同時係属中の米国特
許出願第095,742号に開示されている）をNdelおよびHin
dIIIで消化し,CAT（遺伝子を含む約750bpのNdeI−HindI
II断片（NdeI部位にコードされた開始Met残基を持つ）
を，アガロースゲル電気泳動を用いて精製した。T4 DNA
リガーゼを使用して，このCAT遺伝子をNdel/HindIII消
化したpTrp233に連結し，生じるプラスミド,pCAT21をイ
ー・コリMC1061から単離した。
タンパク分解性開裂部位に後続する合成hANP遺伝子を
プラスミドpBgal（Shineら，Nature（1980）285:456）
に挿入することにより，プラスミドphNF75を構築した。
８つのオリゴデオキシリボヌクレオチドを，エンドプロ
ティナーゼGlu−Ｃ開裂部位に続く合成hANP（102〜12
6）遺伝子内に組み込んだ。該合成遺伝子をBamHI消化し
たpTrp233に連結した。hANP遺伝子の３′末端に隣接す
るHindIII,BamHIおよびEcoRI部位を与える方向に挿入部
を有するプラスミド,phNF73を,HindIIIおよびPvu IIで
の消化によって生成される断片の大きさによって同定し
た。プラスミドphNF73をEcoRIで消化し，ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を用いてhANP遺伝子を精製し，さら
に該遺伝子をEcoRI消化したpBgalに連結してphNF75を得
た。
プラスミドpBgal（Shineら，Nature（1980）285:456）
に挿入することにより，プラスミドphNF75を構築した。
８つのオリゴデオキシリボヌクレオチドを，エンドプロ
ティナーゼGlu−Ｃ開裂部位に続く合成hANP（102〜12
6）遺伝子内に組み込んだ。該合成遺伝子をBamHI消化し
たpTrp233に連結した。hANP遺伝子の３′末端に隣接す
るHindIII,BamHIおよびEcoRI部位を与える方向に挿入部
を有するプラスミド,phNF73を,HindIIIおよびPvu IIで
の消化によって生成される断片の大きさによって同定し
た。プラスミドphNF73をEcoRIで消化し，ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を用いてhANP遺伝子を精製し，さら
に該遺伝子をEcoRI消化したpBgalに連結してphNF75を得
た。
CAT,hANPおよびタンパク分解性開裂部位を含むDNA断
片，ならびにリンカー配列をプラスミドpTrp233に挿入
することにより，発現ベクターpChNF109を構築した。プ
ラスミドphNF75をEcoRIおよびHindIIIで消化し,hANPを
含む約80bpのEcoRI−HindIII断片をポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によって精製し,EcoRI/HindIII消化したpT
rp233に連絡してphNF87を得た。pCAT21をScalで消化し,
BamHI合成リンカー（５′−CGGATCCG−３′）を平滑末
端に結合した。該結合物をBamHIで消化し，約740bpのBa
mHI断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した。B
amHIカセットとBamHI消化したプラスミドphNF87とを結
合して,pChNF109を得た。このpChNF109は,hANP遺伝子に
先行するエンドプロティナーゼGlu−Ｃ開裂部位にフレ
ーム内融合したCAT遺伝子を持つ。
片，ならびにリンカー配列をプラスミドpTrp233に挿入
することにより，発現ベクターpChNF109を構築した。プ
ラスミドphNF75をEcoRIおよびHindIIIで消化し,hANPを
含む約80bpのEcoRI−HindIII断片をポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によって精製し,EcoRI/HindIII消化したpT
rp233に連絡してphNF87を得た。pCAT21をScalで消化し,
BamHI合成リンカー（５′−CGGATCCG−３′）を平滑末
端に結合した。該結合物をBamHIで消化し，約740bpのBa
mHI断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した。B
amHIカセットとBamHI消化したプラスミドphNF87とを結
合して,pChNF109を得た。このpChNF109は,hANP遺伝子に
先行するエンドプロティナーゼGlu−Ｃ開裂部位にフレ
ーム内融合したCAT遺伝子を持つ。
pChNF109内のhANPをコードする配列をSP−５およびSP
−18配列に置き換えることにより，ヒトSP−５およびSP
−18誘導ペプチドが細菌CATの一部との融合物として発
現される。界面活性ペプチドは，ヒドロキシルアミン感
受性アスパラギン−グリシン結合を通して,CAT配列のカ
ルボキシ末端に結合する。細菌ベクターｐ−Trp233のト
リプトファンプロモーターから,CAT−界面活性物質融合
物が発現される。
−18配列に置き換えることにより，ヒトSP−５およびSP
−18誘導ペプチドが細菌CATの一部との融合物として発
現される。界面活性ペプチドは，ヒドロキシルアミン感
受性アスパラギン−グリシン結合を通して,CAT配列のカ
ルボキシ末端に結合する。細菌ベクターｐ−Trp233のト
リプトファンプロモーターから,CAT−界面活性物質融合
物が発現される。
発現ベクターpC210SP−Ｂ SP−18発現ベクターpC210SP−Ｂは，ヒドロキシルア
ミン感受性開裂部位を含む７個のアミノ酸のリンカーを
通してCATの210アミノ酸がSP−18の76個のアミノ酸に結
合している,293残基の融合タンパクをコードする。ヒド
ロキシルアミンによる融合物の開裂によって,SP−18の7
6残基を含む77アミン酸のSP−18産物およびアミノ末端
のグリシン残基が放出れる。
ミン感受性開裂部位を含む７個のアミノ酸のリンカーを
通してCATの210アミノ酸がSP−18の76個のアミノ酸に結
合している,293残基の融合タンパクをコードする。ヒド
ロキシルアミンによる融合物の開裂によって,SP−18の7
6残基を含む77アミン酸のSP−18産物およびアミノ末端
のグリシン残基が放出れる。
pC210SP−Ｂを構築するために,hANP配列を含む短いEc
oRI−HindIIIセグメントをpChNF109から除去し，ヌクレ
オチド（nt）643noPstI部位からnt804のSphI部位まで伸
びるヒトSP−18cDNA＃３の一部（第３図）によって置換
した。EcoRI部位を，ヒドロキシルアミン感受性開裂部
位ならびに成熟SP−18のアミノ末端残基をコードする２
つの相補的オリゴヌクレオチド（オリゴ＃2307:5′−AA
T TCA ACG GTT TCC CCA TTC CTC TCC CCT ATT GCT GGC
TCT GCA−３′，およびオリゴ＃2308:5′−GAC CCA GCA
ATA GGG GAG AGG AAT GGG GAA ACC GTT G−３′）を通
してPstI部位に結合させた。SphI部位を,SP−18ペプチ
ドのカルボキシ末端残基をコードする２組目の相補的ヌ
クレオチド（オリゴ＃3313:5′−AGC TTA CCG GAG GAC
GAG GCG GCA GAC CAG CTG GGG CAG CAT G−３′および
オリゴ＃3314:5′−CTG CCC CAG CTG GTC TGC CGC CTC
GTC CTC CGG TA−３′）を通してpTrp233のHindIII部位
に結合させた。
oRI−HindIIIセグメントをpChNF109から除去し，ヌクレ
オチド（nt）643noPstI部位からnt804のSphI部位まで伸
びるヒトSP−18cDNA＃３の一部（第３図）によって置換
した。EcoRI部位を，ヒドロキシルアミン感受性開裂部
位ならびに成熟SP−18のアミノ末端残基をコードする２
つの相補的オリゴヌクレオチド（オリゴ＃2307:5′−AA
T TCA ACG GTT TCC CCA TTC CTC TCC CCT ATT GCT GGC
TCT GCA−３′，およびオリゴ＃2308:5′−GAC CCA GCA
ATA GGG GAG AGG AAT GGG GAA ACC GTT G−３′）を通
してPstI部位に結合させた。SphI部位を,SP−18ペプチ
ドのカルボキシ末端残基をコードする２組目の相補的ヌ
クレオチド（オリゴ＃3313:5′−AGC TTA CCG GAG GAC
GAG GCG GCA GAC CAG CTG GGG CAG CAT G−３′および
オリゴ＃3314:5′−CTG CCC CAG CTG GTC TGC CGC CTC
GTC CTC CGG TA−３′）を通してpTrp233のHindIII部位
に結合させた。
該発現プラスミドを使用してイー・コリ株W3110をア
ンピシリン耐性に形質転換した。M9培地中で速やかに増
殖するpC210SP−B/W3110の培養物を25μg/mlIAA（３β
−インドールアクリレート，シグマＩ−1625）とし,trp
プロモーターを誘発した。誘発から１時間後までに，な
お増殖し続けている細胞内部の位相差顕微鏡検査によ
り，屈折性の細胞質封入体が認められた。誘発の５時間
後,10.D.550に相当する細胞を遠心分離によってペレッ
ト化し,12％SDS−ポリアクリルアミドゲル中での電気泳
動に用いるために,SDSサンプル緩衝液中で５分間煮沸し
て，さらにクーマシーブルーで染色した。CAT:SP−18融
合タンパクの推定分子量は45,000ダルトンである。ハイ
ブリッドCAT:SP−18タンパクは，誘発した培養物中に15
〜20％の総細胞タンパクを含有すると推定された。
ンピシリン耐性に形質転換した。M9培地中で速やかに増
殖するpC210SP−B/W3110の培養物を25μg/mlIAA（３β
−インドールアクリレート，シグマＩ−1625）とし,trp
プロモーターを誘発した。誘発から１時間後までに，な
お増殖し続けている細胞内部の位相差顕微鏡検査によ
り，屈折性の細胞質封入体が認められた。誘発の５時間
後,10.D.550に相当する細胞を遠心分離によってペレッ
ト化し,12％SDS−ポリアクリルアミドゲル中での電気泳
動に用いるために,SDSサンプル緩衝液中で５分間煮沸し
て，さらにクーマシーブルーで染色した。CAT:SP−18融
合タンパクの推定分子量は45,000ダルトンである。ハイ
ブリッドCAT:SP−18タンパクは，誘発した培養物中に15
〜20％の総細胞タンパクを含有すると推定された。
pC210SP−Ｃ 251残基の融合タンパクのアミノ酸配列がプラスミドp
C210SP−Ｃ内にコードされている。CATの210個のアミノ
酸は,6個のアミノ酸のリンカーを通して成熟SP−５の35
個のアミノ酸に結合している。SP−５は総融合物の14％
を含む。
C210SP−Ｃ内にコードされている。CATの210個のアミノ
酸は,6個のアミノ酸のリンカーを通して成熟SP−５の35
個のアミノ酸に結合している。SP−５は総融合物の14％
を含む。
第８図には,pC210SP−Ｃ内の挿入部のヌクレオチド配
列が示されている。このヌクレオチド配列では,SP−18
配列を含むpC210SP−ＢのEcoRI−HindIII断片が，ヌク
レオチド123のApaL I部位からヌクレオチド161のAvaII
部位までにわたるヒトSP−5cDNA＃18のセグメントによ
って置換されている。CATベクターのEcoRI部位を，ヒド
ロキシルアミン感受性開裂部位ならびに成熟SP−５のア
ミノ末端残基をコードする２つの相補的オリゴヌクレオ
チド（オリゴ＃2462:5′−AAT TCA ACG GCA TTC CCT GC
T GCC CAG−３′，およびオリゴ＃2463:5′−TGC ACT G
GG CAG CAG GGA ATG CCG TTG−３′）を通してSP−５の
ApaL I部位に結合させた。SP−５のAva IIを，成熟SP−
５のカルボキシ末端残基および停止コドンをコードする
２組目の相補的ヌクレオチド（オリゴ＃2871:5′−AGC
TTA GTG GAG ACC CAT GAG CAG GGC TCC CAC AAT CAC CA
C GAC GAT GAG−３′およびオリゴ＃2872:5′−GTC CTC
ATC GTC GTG GTG ATT GTG GGA GCC CTG CTC ATG GGT C
TC CAC TA−３′）を通してpC210SP−ＢのHindIII部位
に結合させた。
列が示されている。このヌクレオチド配列では,SP−18
配列を含むpC210SP−ＢのEcoRI−HindIII断片が，ヌク
レオチド123のApaL I部位からヌクレオチド161のAvaII
部位までにわたるヒトSP−5cDNA＃18のセグメントによ
って置換されている。CATベクターのEcoRI部位を，ヒド
ロキシルアミン感受性開裂部位ならびに成熟SP−５のア
ミノ末端残基をコードする２つの相補的オリゴヌクレオ
チド（オリゴ＃2462:5′−AAT TCA ACG GCA TTC CCT GC
T GCC CAG−３′，およびオリゴ＃2463:5′−TGC ACT G
GG CAG CAG GGA ATG CCG TTG−３′）を通してSP−５の
ApaL I部位に結合させた。SP−５のAva IIを，成熟SP−
５のカルボキシ末端残基および停止コドンをコードする
２組目の相補的ヌクレオチド（オリゴ＃2871:5′−AGC
TTA GTG GAG ACC CAT GAG CAG GGC TCC CAC AAT CAC CA
C GAC GAT GAG−３′およびオリゴ＃2872:5′−GTC CTC
ATC GTC GTG GTG ATT GTG GGA GCC CTG CTC ATG GGT C
TC CAC TA−３′）を通してpC210SP−ＢのHindIII部位
に結合させた。
pC179SP−Ｃ pC179SP−Ｃによってコードされる217残基の融合タン
パクのアミノ酸配列は、第８図に示す配列をわずかに変
更したものである。pC179SP−Ｃにおいて,CATの179個の
アミノ酸を,3個のアミノ酸（Glu,Phe,Asn）のリンカー
を通して成熟SP−５の35アミノ酸に結合させる。SP−５
は総融合物の16％を含む。
パクのアミノ酸配列は、第８図に示す配列をわずかに変
更したものである。pC179SP−Ｃにおいて,CATの179個の
アミノ酸を,3個のアミノ酸（Glu,Phe,Asn）のリンカー
を通して成熟SP−５の35アミノ酸に結合させる。SP−５
は総融合物の16％を含む。
pC179SP−Ｃを構築するために,CAT配列の一部を,pC21
0SP−Ｃから除去した。pC210SP−Ｃから出発して,nt603
のNcol部位（第８図）からnt728のEcoRI部位まで延びる
DNA断片を除去し,NcoIおよびEcoRIの粘着末端を,2つの
相補的オリゴヌクレオチド（オリゴ＃3083:5′−CAT GG
G CAA ATA TTA TAC GCA AG−３′，およびオリゴ＃308
4:5′−AAT TCT TGC GTA TAA TAT TTG CC−３′）によ
って再び結合させた。実際には、ベクターpC179SP−Ｃ
によってコードされる新しい融合タンパクにおいては,C
ATの31残基およびリンカーポリペプチドの３残基が欠失
している。
0SP−Ｃから除去した。pC210SP−Ｃから出発して,nt603
のNcol部位（第８図）からnt728のEcoRI部位まで延びる
DNA断片を除去し,NcoIおよびEcoRIの粘着末端を,2つの
相補的オリゴヌクレオチド（オリゴ＃3083:5′−CAT GG
G CAA ATA TTA TAC GCA AG−３′，およびオリゴ＃308
4:5′−AAT TCT TGC GTA TAA TAT TTG CC−３′）によ
って再び結合させた。実際には、ベクターpC179SP−Ｃ
によってコードされる新しい融合タンパクにおいては,C
ATの31残基およびリンカーポリペプチドの３残基が欠失
している。
pC149SP−Ｃ pC149SP−Ｃによってコードされる187残基の融合タン
パクのアミノ酸配列は，第８図に示す配列をわずかに変
更したものである。プラスミドpC149SP−Ｃにおいて,CA
Tの149アミノ酸を,3アミノ酸（Glu,Phe,Asn）のリンカ
ーを通してSP−５の35アミノ酸に結合させる。SP−５は
総融合物の18.7％を含む。
パクのアミノ酸配列は，第８図に示す配列をわずかに変
更したものである。プラスミドpC149SP−Ｃにおいて,CA
Tの149アミノ酸を,3アミノ酸（Glu,Phe,Asn）のリンカ
ーを通してSP−５の35アミノ酸に結合させる。SP−５は
総融合物の18.7％を含む。
pC149SP−Ｃを構築するために,nt523のDdeI部位（第
８図）からnt728のEcoRI部位までにわたるpC210SP−Ｃ
のCATセグメントの一部を除去し,2つの相補的オリゴヌ
クレオチドオリゴ＃3082:5′−TCA GCC AAT CCC G−
３′およびオリゴ＃3081:5′−AAT TCG GGA TTG GC−
３′）のセットによって置換した。生じる配列を第９図
に示す。
８図）からnt728のEcoRI部位までにわたるpC210SP−Ｃ
のCATセグメントの一部を除去し,2つの相補的オリゴヌ
クレオチドオリゴ＃3082:5′−TCA GCC AAT CCC G−
３′およびオリゴ＃3081:5′−AAT TCG GGA TTG GC−
３′）のセットによって置換した。生じる配列を第９図
に示す。
pC106SP−Ｃ pC106SP−Ｃによってコードされる144残基の融合タン
パクのアミノ酸配列は，第８図に示す配列をわずかに変
更したものである。プラスミドpC106SP−Ｃにおいて,3
個のアミノ酸（Glu,Phe,Asn）のリンカーを通してCATの
106アミノ酸をSP−５の35アミノ酸に結合させる。SP−
５は総融合物の24％を含む。
パクのアミノ酸配列は，第８図に示す配列をわずかに変
更したものである。プラスミドpC106SP−Ｃにおいて,3
個のアミノ酸（Glu,Phe,Asn）のリンカーを通してCATの
106アミノ酸をSP−５の35アミノ酸に結合させる。SP−
５は総融合物の24％を含む。
pC210SP−ＣのEcoRI断片（nt302〜nt728,第８図）を
アニーリングした後，相同領域を通して結合した２組の
相補的オリゴヌクレオチド（オリゴ＃3079:5′−AAT TC
C GTA TGG CAA TGA AAG ACG GTG AGC TGG TGA TAT GGG
ATA GTG TTC ACC CTT GT−３′を，オリゴ＃3085:5′−
ACA CTA TCC CAT ATC ACC AGC TCA CCG TCT TTC ATT GC
C ATA CGG−３′でアニーリングしたもの；オリゴ＃308
0:5′−TAC ACC GTT TTC CAT GAG CAA ACT GAA ACG TTT
TCA TCG CTC TGG G−３′を，オリゴ＃3078:5′−AAT
TCC CAG AGC GAT GAA AAC GTT TCA GTT TGC TCA TGG AA
A ACG GTG TAA CAA GGG TGA−３′でアニーリングした
もの）を置換することにより,pC106SP−Ｃを構築した。
アニーリングした後，相同領域を通して結合した２組の
相補的オリゴヌクレオチド（オリゴ＃3079:5′−AAT TC
C GTA TGG CAA TGA AAG ACG GTG AGC TGG TGA TAT GGG
ATA GTG TTC ACC CTT GT−３′を，オリゴ＃3085:5′−
ACA CTA TCC CAT ATC ACC AGC TCA CCG TCT TTC ATT GC
C ATA CGG−３′でアニーリングしたもの；オリゴ＃308
0:5′−TAC ACC GTT TTC CAT GAG CAA ACT GAA ACG TTT
TCA TCG CTC TGG G−３′を，オリゴ＃3078:5′−AAT
TCC CAG AGC GAT GAA AAC GTT TCA GTT TGC TCA TGG AA
A ACG GTG TAA CAA GGG TGA−３′でアニーリングした
もの）を置換することにより,pC106SP−Ｃを構築した。
各々のSP−５発現ベクターを使用して，イー・コリ株
W3110をアンピシリン耐性に形質転換した。発現菌株の
速やかに増殖する培養物を上述のようにして誘発した。
誘発から１時間後までに，なお増殖し続けている細胞内
部の位相差顕微鏡検査により，屈折性の細胞質封入体が
認められた。誘発から５時間後に,10.D.550に相当する
細胞を遠心分離によってペレット化し,12％SDS−ポリア
クリルアミドゲル中での電気泳動に用いるためにSDSサ
ンプル緩衝液中で５分間煮沸して，さらにクーマシーブ
ルーで染色した。これらのベクターから適切な分子量の
タンパクを得た。各ベクターによって生成されるハイブ
リッドCAT:SP−５タンパクは，誘発した培養物中に総細
胞タンパクの15〜20％を含むと推定される。
W3110をアンピシリン耐性に形質転換した。発現菌株の
速やかに増殖する培養物を上述のようにして誘発した。
誘発から１時間後までに，なお増殖し続けている細胞内
部の位相差顕微鏡検査により，屈折性の細胞質封入体が
認められた。誘発から５時間後に,10.D.550に相当する
細胞を遠心分離によってペレット化し,12％SDS−ポリア
クリルアミドゲル中での電気泳動に用いるためにSDSサ
ンプル緩衝液中で５分間煮沸して，さらにクーマシーブ
ルーで染色した。これらのベクターから適切な分子量の
タンパクを得た。各ベクターによって生成されるハイブ
リッドCAT:SP−５タンパクは，誘発した培養物中に総細
胞タンパクの15〜20％を含むと推定される。
SP−5DNAの修飾 hSP−５類似体をコードする修飾配列を得るには，部
位特異的変異が使用できる。例えば,pC149SP−Ｃから出
発して，第９図に示すBamHI/HindIII断片を切り出し,mp
8にクローニングする。次に，図に示すようにプライマ
ー５′−GTG−CAC−TGG−GGA−GGA−GGG−AAT−GCC−
３′を使用して，該挿入部を部位特異的変異に付す。こ
れにより，成熟タンパクの28位および29位のシスティン
のコドンが，同じ位置でセリンのコドンに変換される。
変異を誘発されたBamHI/HindIII断片を単離し，再び発
現ベクターpTrp233内に連結する。
位特異的変異が使用できる。例えば,pC149SP−Ｃから出
発して，第９図に示すBamHI/HindIII断片を切り出し,mp
8にクローニングする。次に，図に示すようにプライマ
ー５′−GTG−CAC−TGG−GGA−GGA−GGG−AAT−GCC−
３′を使用して，該挿入部を部位特異的変異に付す。こ
れにより，成熟タンパクの28位および29位のシスティン
のコドンが，同じ位置でセリンのコドンに変換される。
変異を誘発されたBamHI/HindIII断片を単離し，再び発
現ベクターpTrp233内に連結する。
該構築物，たとえばC149SP−Ｃあるいは対応する変異
誘発したベクターをイー・コリに形質転換し，形質転換
した細胞を標準的手法によって培養する。培養物をIAA
で処理してtrpプロモーターを誘発し，所望のSP−５誘
導ペプチドをコードする遺伝子を発現させる。
誘発したベクターをイー・コリに形質転換し，形質転換
した細胞を標準的手法によって培養する。培養物をIAA
で処理してtrpプロモーターを誘発し，所望のSP−５誘
導ペプチドをコードする遺伝子を発現させる。
hSP−５誘導ペプチドの精製 次いでホモジナイザーを通過させることにより細菌細
胞を溶解させる。この処理によって放出される不溶性封
入体を,5000rpmで30分間の遠心分離あるいは0.1ミクロ
ンのミリポア・デュラポア膜を通しての濾過によって回
収する。得られる封入体を,1％トリトンＸ−100によっ
て３回洗浄するか，あるいは1.0M塩酸グアニジン,10mM
EDTA,20mMトリス−HCl,pH8.0中で３回洗浄し，上述のよ
うに遠心分離あるいは濾過によって100mMを採集する。
封入体を,15〜25ng/mlの濃度で,20mMトリス−HCl（pH8.
0）,6M塩酸グアニジン,50mM DTT中に溶解させる。
胞を溶解させる。この処理によって放出される不溶性封
入体を,5000rpmで30分間の遠心分離あるいは0.1ミクロ
ンのミリポア・デュラポア膜を通しての濾過によって回
収する。得られる封入体を,1％トリトンＸ−100によっ
て３回洗浄するか，あるいは1.0M塩酸グアニジン,10mM
EDTA,20mMトリス−HCl,pH8.0中で３回洗浄し，上述のよ
うに遠心分離あるいは濾過によって100mMを採集する。
封入体を,15〜25ng/mlの濃度で,20mMトリス−HCl（pH8.
0）,6M塩酸グアニジン,50mM DTT中に溶解させる。
遠心分離によって不溶性物質を除去した後,6M塩酸グ
アニジン中等容量のヒドロキシルアミン（2M）,0.2M K2
CO3を含む50mM DTTを添加して,SP−５誘導ペプチドを含
む融合タンパクを開裂させる。48時間開裂を進行させ
る。溶液を,10mMトリス（pH8.0）20mM DTTで1.2M塩酸グ
アニジン（５倍）に希釈する。これによって開裂反応混
合物中のタンパクが沈降し；この沈降物を遠心分離によ
って回収する。
アニジン中等容量のヒドロキシルアミン（2M）,0.2M K2
CO3を含む50mM DTTを添加して,SP−５誘導ペプチドを含
む融合タンパクを開裂させる。48時間開裂を進行させ
る。溶液を,10mMトリス（pH8.0）20mM DTTで1.2M塩酸グ
アニジン（５倍）に希釈する。これによって開裂反応混
合物中のタンパクが沈降し；この沈降物を遠心分離によ
って回収する。
次いで,100mM DTTを含むクロロホルム：メタノール
（1:1,容積比）溶液で多量の残りのタンパクからSP−５
誘導ペプチドを抽出する。SP−５誘導ペプチドが1mg/ml
となるように，十分な量のこの溶液を沈降物に添加す
る；該物質を室温で６時間抽出する。次に抽出物を遠心
分離にかけて不溶性物質を除去する。
（1:1,容積比）溶液で多量の残りのタンパクからSP−５
誘導ペプチドを抽出する。SP−５誘導ペプチドが1mg/ml
となるように，十分な量のこの溶液を沈降物に添加す
る；該物質を室温で６時間抽出する。次に抽出物を遠心
分離にかけて不溶性物質を除去する。
この遠心分離からの上清を，抽出物中のSP−５ペプチ
ドのmg/当たりスルホプロピルセルロース（スルホプロ
ピルセルロース0.04ml）と混合する。抽出物をHClで酸
性化し，濃度を5mMにする。SP−５を一晩結合させた
後，スルホプロピルセルロースを,19部のクロロホルム,
19部のメタノール，および２部の0.1N HClを含む緩衝液
（洗浄緩衝液）でよく洗浄する。固体DTTで50mM DTTに
調整し,2M酢酸ナトリウムの原液を加えて20mM酢酸ナト
リウム（pH4）とした洗浄緩衝溶液でさらに洗浄を実施
する。次に,50mM DTTを含み,2M酢酸ナトリウム（pH6）
の原液を加えて50mM酢酸ナトリウム（pH6）に調整した
洗浄緩衝液でSP−５ペプチドを溶出する。SP−セルロー
スを濾過によって除去する。精製の最終ステップは，上
述した洗浄緩衝液を溶出剤として使用した。セファデッ
クスLM−60でゲル浸透クロマトグラフィーである。
ドのmg/当たりスルホプロピルセルロース（スルホプロ
ピルセルロース0.04ml）と混合する。抽出物をHClで酸
性化し，濃度を5mMにする。SP−５を一晩結合させた
後，スルホプロピルセルロースを,19部のクロロホルム,
19部のメタノール，および２部の0.1N HClを含む緩衝液
（洗浄緩衝液）でよく洗浄する。固体DTTで50mM DTTに
調整し,2M酢酸ナトリウムの原液を加えて20mM酢酸ナト
リウム（pH4）とした洗浄緩衝溶液でさらに洗浄を実施
する。次に,50mM DTTを含み,2M酢酸ナトリウム（pH6）
の原液を加えて50mM酢酸ナトリウム（pH6）に調整した
洗浄緩衝液でSP−５ペプチドを溶出する。SP−セルロー
スを濾過によって除去する。精製の最終ステップは，上
述した洗浄緩衝液を溶出剤として使用した。セファデッ
クスLM−60でゲル浸透クロマトグラフィーである。
実施例４ 合成ペプチド ヒトSP−５でコードされた混合物に基づく種の合成ペ
プチドを，標準的手法を用いて合成した。第３図を参照
して，固相ペプチド合成を使用して以下のペプチドを合
成した： （１）hSP−５（24〜74），すなわちPhe−24に始まり,G
ly−74で終わる； （２）hSP−５（34−74），すなわちLys−34に始まり,G
ly−74で終わる；および （３）hSP−５（24〜61），すなわちPhe−24に始まり,S
er−61で終わる； hSP−５（24−74）： Phe−Gly−Ile−Pro−Cys−Cys−Pro−Val−His−Leu−
Lys−Arg− Leu−Leu−Ile−Val−Val−Val−Val−Val−Leu−Ile− Val−Val−Val−Ile−Val−Gly−Ala−Leu−Leu−Met−
Gly−Leu−His−Met−Ser−Gln−Lys−His− Thr−Glu−Met−Val−Leu−Glu−Met−Ser−Ile−Gly. hSP−５（34−74）： Lys−Arg−Leu−Leu−Ile− Val−Val−Val−Val−Val−Leu−Ile−Val−Val−Val−
Ile−Val−Gly−Ala−Leu−Leu−Met−Gly−Leu−His−
Met− Ser−Gln−Lys−His−Thr−Glu−Met−Val−Leu−Glu−
Met−Ser−Ile−Gly. hSP−５（24−61）： Phe−Gly−Ile−Pro−Cys−Cys−Pro−Val−His−Leu−
Lys−Arg− Leu−Leu−Ile−Val−Val−Val−Val−Val−Leu−Ile−
Val−Val−Val−Ile− Val−Gly−Ala−Leu−Leu−Met−Gly−Leu−His−Met−
Ser. 合成ペプチドは，アプライド・バイオシステムズ430A
ペプチド合成装置を使用し，標準ｔ−BOC固相ペプチド
合成法によって調製された。使用した保護基は次の通り
であった:Cys−−４−メチルベンジル;His−−Boc;Lys
−−２−クロロCBZ;Arg−−トシル。Boc−Ser（OBzl）
−Ｏ−PAM樹脂（0.5mmol,0.72mcq/g負荷）上で樹脂を構
築した。Boc−His（Boc）−OHを対称的な無水物として
使用して，すべての残基を，二重に結合したHOBTエステ
ルおよびHis残基と単独で結合させた。残基12にArgを添
加する前に樹脂を取り出した。この樹脂は，ほとんどの
側鎖が保護されておらず，真性PTHアミノ酸として働く
ので，この時点で気相シーケンサーにおいて直接配列決
定することができる。配列が妥当に相同であることを確
認した後，合成が完了した。樹脂を開裂し，標準的HF開
裂条件を使用してすべての保護基を除去した。ペプチド
樹脂1gに，アニソール1.5ml,硫化メチルエチルの0.25ml
および蒸留したHF15mlを添加し，標準的Kel−F HF開裂
装置において開裂を実施した。開裂は103Cで30分間，次
いで03Cでさらに30分間行なった。凝集を最小限に抑え
るために,Hfをただちに且つ速やかに除去した。しかし
ながら，極めて少量の選択ペプチドだけが開裂混合物か
ら再溶解しうるので，やはりある程度凝集が発生する。
HFの除去後，樹脂−ペプチド混合物をエーテルとクロロ
ホルムで交互に洗浄し，そのあと乾燥した。ペプチド
は，標準的な水抽出を用いて可溶化することはできない
が,MeOH/クロロホルム/HCl中に溶解することによって樹
脂から分離しなければならない。
プチドを，標準的手法を用いて合成した。第３図を参照
して，固相ペプチド合成を使用して以下のペプチドを合
成した： （１）hSP−５（24〜74），すなわちPhe−24に始まり,G
ly−74で終わる； （２）hSP−５（34−74），すなわちLys−34に始まり,G
ly−74で終わる；および （３）hSP−５（24〜61），すなわちPhe−24に始まり,S
er−61で終わる； hSP−５（24−74）： Phe−Gly−Ile−Pro−Cys−Cys−Pro−Val−His−Leu−
Lys−Arg− Leu−Leu−Ile−Val−Val−Val−Val−Val−Leu−Ile− Val−Val−Val−Ile−Val−Gly−Ala−Leu−Leu−Met−
Gly−Leu−His−Met−Ser−Gln−Lys−His− Thr−Glu−Met−Val−Leu−Glu−Met−Ser−Ile−Gly. hSP−５（34−74）： Lys−Arg−Leu−Leu−Ile− Val−Val−Val−Val−Val−Leu−Ile−Val−Val−Val−
Ile−Val−Gly−Ala−Leu−Leu−Met−Gly−Leu−His−
Met− Ser−Gln−Lys−His−Thr−Glu−Met−Val−Leu−Glu−
Met−Ser−Ile−Gly. hSP−５（24−61）： Phe−Gly−Ile−Pro−Cys−Cys−Pro−Val−His−Leu−
Lys−Arg− Leu−Leu−Ile−Val−Val−Val−Val−Val−Leu−Ile−
Val−Val−Val−Ile− Val−Gly−Ala−Leu−Leu−Met−Gly−Leu−His−Met−
Ser. 合成ペプチドは，アプライド・バイオシステムズ430A
ペプチド合成装置を使用し，標準ｔ−BOC固相ペプチド
合成法によって調製された。使用した保護基は次の通り
であった:Cys−−４−メチルベンジル;His−−Boc;Lys
−−２−クロロCBZ;Arg−−トシル。Boc−Ser（OBzl）
−Ｏ−PAM樹脂（0.5mmol,0.72mcq/g負荷）上で樹脂を構
築した。Boc−His（Boc）−OHを対称的な無水物として
使用して，すべての残基を，二重に結合したHOBTエステ
ルおよびHis残基と単独で結合させた。残基12にArgを添
加する前に樹脂を取り出した。この樹脂は，ほとんどの
側鎖が保護されておらず，真性PTHアミノ酸として働く
ので，この時点で気相シーケンサーにおいて直接配列決
定することができる。配列が妥当に相同であることを確
認した後，合成が完了した。樹脂を開裂し，標準的HF開
裂条件を使用してすべての保護基を除去した。ペプチド
樹脂1gに，アニソール1.5ml,硫化メチルエチルの0.25ml
および蒸留したHF15mlを添加し，標準的Kel−F HF開裂
装置において開裂を実施した。開裂は103Cで30分間，次
いで03Cでさらに30分間行なった。凝集を最小限に抑え
るために,Hfをただちに且つ速やかに除去した。しかし
ながら，極めて少量の選択ペプチドだけが開裂混合物か
ら再溶解しうるので，やはりある程度凝集が発生する。
HFの除去後，樹脂−ペプチド混合物をエーテルとクロロ
ホルムで交互に洗浄し，そのあと乾燥した。ペプチド
は，標準的な水抽出を用いて可溶化することはできない
が,MeOH/クロロホルム/HCl中に溶解することによって樹
脂から分離しなければならない。
75％トリフルオロ酢酸中に溶解した後，各々のペプチ
ドを精製した。好ましい精製方法は,0.5％HClを含むク
ロロホルムとメタノール（1:1,容積比）の溶液中でのLH
−60カラムを使用したゲル濾過である。各々の合成ペプ
チドを，実施例５のようにしてインビトロおよびインビ
ボ活性に関して試験した。
ドを精製した。好ましい精製方法は,0.5％HClを含むク
ロロホルムとメタノール（1:1,容積比）の溶液中でのLH
−60カラムを使用したゲル濾過である。各々の合成ペプ
チドを，実施例５のようにしてインビトロおよびインビ
ボ活性に関して試験した。
実施例５ 合成ペプチドの活性 前記に引用したPCT出願WO87/06588号のD.9およびD.10
章に各々記載されている方法を用いて，インビトロおよ
びインビボ活性を評価した。
章に各々記載されている方法を用いて，インビトロおよ
びインビボ活性を評価した。
ペプチド34〜74は，インビトロでのリン脂質フィルム
拡散において効果がなく，この結果から予想されたよう
に，未成熟ウサギ肺においても効果がなかった。従って
活性を最大にするにはＮ末端アミノ酸が必要であると考
えられる。
拡散において効果がなく，この結果から予想されたよう
に，未成熟ウサギ肺においても効果がなかった。従って
活性を最大にするにはＮ末端アミノ酸が必要であると考
えられる。
Ｃ末端延長ペプチドであるペプチド24〜74は，インビ
トロでの空気−水界面の界面張力の低下および動物にお
ける適度の肺機能作用のいずれにおいても極めて有効で
あった。表１において，Pinsは，界面活性製剤が肺にお
ける表面張力の低下にどの程度有効であるかの尺度であ
る。この張力低下は，吸気酸素圧の低下によって示され
る。ペプチド24〜74は，対照生理食塩水と比較して極め
て有効であり，ウサギ界面活性剤の陽性対照とほぼ同程
度に有効であった。天然5kdタンパクが界面活性剤対照
と同程度に有効であることに留意しておかねばならな
い。
トロでの空気−水界面の界面張力の低下および動物にお
ける適度の肺機能作用のいずれにおいても極めて有効で
あった。表１において，Pinsは，界面活性製剤が肺にお
ける表面張力の低下にどの程度有効であるかの尺度であ
る。この張力低下は，吸気酸素圧の低下によって示され
る。ペプチド24〜74は，対照生理食塩水と比較して極め
て有効であり，ウサギ界面活性剤の陽性対照とほぼ同程
度に有効であった。天然5kdタンパクが界面活性剤対照
と同程度に有効であることに留意しておかねばならな
い。
10,20および30分でのPins価は，肺における一回換気容
量を６〜67ml/kg体重に維持するのに必要な吸気圧（cm
H2O）を示す。（ベンチレータへの圧力が低いほど良好
である。） ペプチド24〜61は，インビボで天然界面活性剤と同程
度に有効であることが認められた。実際に，いくつかの
動物実験において,24〜61で処置した動物では界面活性
剤対照におけるよりもPinsが低かった。全例において，
リン脂質混合物はDPPC:卵PG（7:3,重量比）であり,PLと
タンパクとの比率は10:1であった。ペプチドは，下記に
述べるように別の脂質と共に投与されることが好まし
く，それ故，表２に要約した試験においては,10重量％
のパルミチン酸を処方物中に入れた。従って，処方物
は，約10:1:1:1の重量比のDPPC:PG:ペプチド：脂肪酸で
あった。
量を６〜67ml/kg体重に維持するのに必要な吸気圧（cm
H2O）を示す。（ベンチレータへの圧力が低いほど良好
である。） ペプチド24〜61は，インビボで天然界面活性剤と同程
度に有効であることが認められた。実際に，いくつかの
動物実験において,24〜61で処置した動物では界面活性
剤対照におけるよりもPinsが低かった。全例において，
リン脂質混合物はDPPC:卵PG（7:3,重量比）であり,PLと
タンパクとの比率は10:1であった。ペプチドは，下記に
述べるように別の脂質と共に投与されることが好まし
く，それ故，表２に要約した試験においては,10重量％
のパルミチン酸を処方物中に入れた。従って，処方物
は，約10:1:1:1の重量比のDPPC:PG:ペプチド：脂肪酸で
あった。
表２ ５つの異なる実験をインビトロで実施した。数字は30
分の時点での圧力，Pinsを表わす。
分の時点での圧力，Pinsを表わす。
試験番号 界面活性剤 NaCl 24−61 119 22 0* 22 120 16.5 26 15 121 19 33 16 122 16.5 33 15 123 0* 32 15.5 平均 18.5 31 16.7＊ ０は実験終了前の気胸を表わす。
全例において,24〜61合成ペプチドを,PL:パルミチン
酸：合成ペプチド（10:1:1）の重量比で混合した。リン
脂質（PL）は重量比でDPPC:PG（7:3）である。
酸：合成ペプチド（10:1:1）の重量比で混合した。リン
脂質（PL）は重量比でDPPC:PG（7:3）である。
実施例６ 追加のhSP−５ペプチド 次のような本発明のSP−５誘導ペプチドを，実施例３
のCAT融合法を用いて，あるいは固相合成によって合成
し,ASP活性に関して試験した： （１）hSP−５（28〜59），すなわちCys−28に始まり,H
is−59で終わる； （２）hSP−５（30〜59），すなわちPro−30に始まり,H
is−59で終わる；および （３）D5K＃1:（S28S29−hSP−５（24〜59）），すなわ
ちhSP−Ｃ（24〜59）に相当するが,28位および29位にシ
ステインの代わりにセリンを有する； （４）D5K＃2:（A27S28S29A30−hSP−５（24〜59）），
すなわちPhe−24に始まってHis−59で終わり,28位と29
位のシステインを置換したセリン,27位と30位のプロリ
ンを置換したアラニンを有する； （５）D5K＃3:（S26A27S28S29A30Q31K32，A33−hSP−５
（25〜59），すなわちGly−25に始まってHis−59で終わ
り，指示されているように置換されたアミノ酸26〜33を
有する。
のCAT融合法を用いて，あるいは固相合成によって合成
し,ASP活性に関して試験した： （１）hSP−５（28〜59），すなわちCys−28に始まり,H
is−59で終わる； （２）hSP−５（30〜59），すなわちPro−30に始まり,H
is−59で終わる；および （３）D5K＃1:（S28S29−hSP−５（24〜59）），すなわ
ちhSP−Ｃ（24〜59）に相当するが,28位および29位にシ
ステインの代わりにセリンを有する； （４）D5K＃2:（A27S28S29A30−hSP−５（24〜59）），
すなわちPhe−24に始まってHis−59で終わり,28位と29
位のシステインを置換したセリン,27位と30位のプロリ
ンを置換したアラニンを有する； （５）D5K＃3:（S26A27S28S29A30Q31K32，A33−hSP−５
（25〜59），すなわちGly−25に始まってHis−59で終わ
り，指示されているように置換されたアミノ酸26〜33を
有する。
可溶化した後，各々のペプチドを上述のように精製し
た。各合成ペプチドを，上述の工程を使用してインビト
ロおよびインビボ活性に関して試験した。
た。各合成ペプチドを，上述の工程を使用してインビト
ロおよびインビボ活性に関して試験した。
第10図は対照を表わしており,DPPC:PGおよびパルミチ
ン酸塩と共に処方された完全な長さのヒト5kdタンパク
（DPPC:PG:パルミチン酸塩：タンパクの比率はおよそ7:
3:1:0.5）に関して得られた表面圧対時間をグラフで示
したものである。第11図も同様で，同じ成分で共に処方
した完全な長さのヒト5kdタンパク（7:3:1:1）に関し
て,7.5のpHおよび37℃の温度で試験した結果を表わして
いる。
ン酸塩と共に処方された完全な長さのヒト5kdタンパク
（DPPC:PG:パルミチン酸塩：タンパクの比率はおよそ7:
3:1:0.5）に関して得られた表面圧対時間をグラフで示
したものである。第11図も同様で，同じ成分で共に処方
した完全な長さのヒト5kdタンパク（7:3:1:1）に関し
て,7.5のpHおよび37℃の温度で試験した結果を表わして
いる。
第12図に示した対照実験におけるように,DPPC:PGおよ
びパルミチン酸塩と共に処方した合成ペプチドhSP−５
（28〜59）は，天然ペプチドで観察されたのに等しい初
期拡散速度を示した。
びパルミチン酸塩と共に処方した合成ペプチドhSP−５
（28〜59）は，天然ペプチドで観察されたのに等しい初
期拡散速度を示した。
SP−５誘導合成ペプチド,hSP−５（30〜59）は，低い
活性を有している（第13図）。この活性喪失が特異的な
28位および29位のシステイン残基の欠失によるものでな
いことは，これらのシステイン残基がセリンに置き換え
られているD5K＃１合成ペプチド（S28，S29−hSP−５
（24〜59）が完全な活性を示す（第15図）という観察に
よって示唆されている。この結果は，特定残基の喪失で
はなくポリペプチドの長さの減少がASP活性の喪失を生
じることを意味している。
活性を有している（第13図）。この活性喪失が特異的な
28位および29位のシステイン残基の欠失によるものでな
いことは，これらのシステイン残基がセリンに置き換え
られているD5K＃１合成ペプチド（S28，S29−hSP−５
（24〜59）が完全な活性を示す（第15図）という観察に
よって示唆されている。この結果は，特定残基の喪失で
はなくポリペプチドの長さの減少がASP活性の喪失を生
じることを意味している。
D5K＃１ペプチド（S28，S29−hSP−５（24〜59）は，
実施例２に述べたように組換え法によって生成され，精
製された。組換えSP−５ペプチド（S28，S29−hSP−５
（24〜59）を，インビトロアッセチに関する標準的プロ
トコールに次のような修正を加えて試験した：リン脂質
処方物を７部のDPPC:3部のPOPGとした。POPGは（パルミ
トイル−オレオイルPG）である。最終処方物は,20重量
部のリン脂質混合物:1重量部のタンパクであった。Ser
−Ser類似体は，インビトロで高い活性あり，インビボ
で，精製したウサギ界面活性剤と少なくとも同程度に有
効であった。
実施例２に述べたように組換え法によって生成され，精
製された。組換えSP−５ペプチド（S28，S29−hSP−５
（24〜59）を，インビトロアッセチに関する標準的プロ
トコールに次のような修正を加えて試験した：リン脂質
処方物を７部のDPPC:3部のPOPGとした。POPGは（パルミ
トイル−オレオイルPG）である。最終処方物は,20重量
部のリン脂質混合物:1重量部のタンパクであった。Ser
−Ser類似体は，インビトロで高い活性あり，インビボ
で，精製したウサギ界面活性剤と少なくとも同程度に有
効であった。
D5K＃１合成ペプチド（S28，S29−hSP−５（24〜5
9））のペプチド類似体も，以下に示すように,WO87/065
88に述べられている工程に従って試験した場合，インビ
ボで活性であった： D5K＃１S28S29−hSP−５（24〜59）（cysがserに変
化） 組換えS28，S29−hSP−５（24〜59）もインビボで試
験し，少なくとも精製したウサギ界面活性剤と同程度に
有効であった。
9））のペプチド類似体も，以下に示すように,WO87/065
88に述べられている工程に従って試験した場合，インビ
ボで活性であった： D5K＃１S28S29−hSP−５（24〜59）（cysがserに変
化） 組換えS28，S29−hSP−５（24〜59）もインビボで試
験し，少なくとも精製したウサギ界面活性剤と同程度に
有効であった。
特異的アミノ末端配列が十分な活性のための必要条件
でないことが，さらにD5K＃２およびD5K＃３の分析によ
って示唆されている。より広範囲の置換がアミノ末端領
域においてなされているこれらのペプチドは，やはりイ
ンビトロでも完全な活性を保持している（第15図および
第16図）。
でないことが，さらにD5K＃２およびD5K＃３の分析によ
って示唆されている。より広範囲の置換がアミノ末端領
域においてなされているこれらのペプチドは，やはりイ
ンビトロでも完全な活性を保持している（第15図および
第16図）。
本発明者が本方法において有用であろうと考えるその
他のペプチドは，第３図に示すヒトSP−５がコードする
タンパクの31〜61,30〜61,28〜61および26〜61のペプチ
ドである。
他のペプチドは，第３図に示すヒトSP−５がコードする
タンパクの31〜61,30〜61,28〜61および26〜61のペプチ
ドである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 シリング ジュニア，ジェームズ ダブ リュ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94301 パロ アルト，バイロン スト リート 247 (72)発明者 バックリー，ダグラス アメリカ合衆国 カリフォルニア 94062 ウッドサイド，ブリックウッド ロード 215 (72)発明者 スカーボロー，ロバート エム. アメリカ合衆国 カリフォルニア ヘイ ワード，エイピーティ．２，クリアブル ック サークル 29831 (72)発明者 ゴーデル，バーバラ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94306 パロ アルト，ベン ロモンド 4051 (56)参考文献 特開 平１−501282（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−500350（ＪＰ，Ａ) 国際公開87／2037（ＷＯ，Ａ) 国際公開87／6588（ＷＯ，Ａ) 国際公開88／3170（ＷＯ，Ａ) 国際公開88／5820（ＷＯ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 262，Ｎｏ．20（1987．７）Ｐ．9808− 9811
Claims (13)
- 【請求項１】ASP活性を有し、以下の配列により定義さ
れる精製ポリペプチド、または薬学的に受容可能なそれ
らの塩またはアミド： Ｘ−AA28−AA29−AA30−AA31−AA32−AA33−AA34−AA35
−Leu−Leu−Ile−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Leu−Ile
−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ile−Ｚ−Gly−Ala−Leu−Leu−Met−Gl
y−Leu−His−Ｙ ここで、AA28はCysまたはSer、 AA29はCysまたはSer、 AA30はProまたはAla、 AA31はValまたはGln、 AA32はHisまたはLys、 AA33はLeuまたはAla、 AA34はLysまたはGln、 AA35はArgまたはGln、 ＺはValまたはIle、 ＹはOH、またはアミノ酸配列Met−Ser−Gln−Lys−His
−Thr−Glu−MET−Val−Leu−Glu−MET−Ser−Ile−Gly
に対応する１〜15のアミノ酸のＣ末端延長配列、そし
て、ＸはＨ、またはＨ−AA27−、Ｈ−AA26−AA27−、お
よびＸ′−AA26−AA27−でなる群から選択されるアミノ
酸配列、 ここで、AA27はProまたはAla、 AA26はIleまたはSer、そして、 Ｘ′はＨ、またはアミノ酸配列Met−Asp−Val−Gly−Se
r−Lys−Glu−Val−Leu−Met−Glu−Ser−Pro−Pro−As
p−Tyr−Ser−Ala−Ala−Pro−Arg−Gly−Arg−Phe−Gl
yに対応する１−25アミノ酸のＮ末端延長配列であ
り、； 但し、ＸがPhe−Gly−Ile−Pro、Gly−Ile−Pro、また
はIle−Proであり、ＹがOH、またはMet−Ser−Gln−Lys
−His−Thrであり、そしてすべてのＺがValであるなら
ば、AA28−AA35は、−Cys−Cys−Pro−Val−His−Leu−
Lys−Arg−ではあり得ない。 - 【請求項２】請求項１に記載のポリペプチドであって、
ＹはOH、またはアミノ酸配列Met−Ser−Gln−Lys−His
−Thr−Glu−MET−Val−Leu−Glu−MET−Ser−Ile−Gly
に対応する15のアミノ酸のＣ末端延長配列であり、そし
て、Ｘは、Ｈ、AA27−、AA26−AA27−、Gly−AA26−AA
27−、またはPhe−Gly−AA26−AA27である、ポリペプチ
ド。 - 【請求項３】請求項２に記載のポリペプチドであって、
AA28およびAA29は共にSerである、ポリペプチド。 - 【請求項４】請求項３に記載のポリペプチドであって、
AA27およびAA30は共にAlaである、ポリペプチド。 - 【請求項５】請求項４に記載のポリペプチドであって、
AA31はGln、AA32はLys、そしてAA33はAlaである、ポリ
ペプチド。 - 【請求項６】請求項１に記載のポリペプチドであって、
該ポリペプチドは、次の配列から選択されるアミノ酸配
列を有する、ポリペプチド： Phe−Gly−Ile−Pro−Ser−Ser−Pro−Val−His−Leu−
Lys−Arg−Leu−Leu−Ile−Val−Val−Val−Val−Val−
Val−Leu−Ile−Val−Val−Val−Ile−Val−Gly−Ala−
Leu−Leu−Met−Gly−Leu−His、 Phe−Gly−Ile−Ala−Ser−Ser−Ala−Val−His−Leu−
Lys−Arg−Leu−Leu−Ile−Val−Val−Val−Val−Val−
Val−Leu−Ile−Val−Val−Val−Ile−Val−Gly−Ala−
Leu−Leu−Met−Gly−Leu−His、 Gly−Ser−Ala−Ser−Ser−Ala−Gln−Lys−Ala−Lys−
Arg−Leu−Leu−Ile−Val−Val−Val−Val−Val−Val−
Leu−Ile−Val−Val−Val−Ile−Val−Gly−Ala−Leu−
Leu−Met−Gly−Leu−His、 Phe−Gly−Ile−Pro−Cys−Cys−Pro−Val−His−Leu−
Lys−Arg−Leu−Leu−Ile−Val−Val−Val−Val−Val−
Val−Leu−Ile−Val−Val−Val−Ile−Val−Gly−Ala−
Leu−Leu−Met−Gly−Leu−His−Met−Ser−Gln−Lys−
His−Thr−Glu−Met−Val−Leu−Glu−Met−Ser−Ile−
Gly、 および、 Phe−Gly−Ile−Pro−Cys−Cys−Pro−Val−His−Leu−
Lys−Arg−Leu−Leu−Ile−Val−Val−Val−Val−Val−
Val−Leu−Ile−Val−Val−Val−Ile−Val−Gly−Ala−
Leu−Leu−Met−Gly−Leu−His−Met−Ser。 - 【請求項７】哺乳類の呼吸窮迫症候群（respiratory di
stress syndrome、RDS）の治療に効果的な薬剤組成物で
あって、該組成物は、請求項１のポリペプチドを、薬学
的に受容可能な賦形剤と混合して含有する、組成物。 - 【請求項８】哺乳類の呼吸窮迫症候群（RDS）治療用
の、請求項１−６いずれかに記載のポリペプチド。 - 【請求項９】請求項１のポリペプチドをコードするDNA
を含む、単離された形態の組換えDNA。 - 【請求項１０】組換え宿主に形質転換されたときに、請
求項９の組換えDNAの発現が可能であるベクター。 - 【請求項１１】請求項10のベクターにより形質転換され
た組換え宿主細胞。 - 【請求項１２】次式のポリペプチド、または薬学的に受
容可能なそれらの塩またはアミドを製造する方法であっ
て、該方法は、請求項11の細胞を培養し、そして、該ポ
リペプチドを回収することを包含する： Ｘ−AA28−AA29−AA30−AA31−AA32−AA33−AA34−AA35
−Leu−Leu−Ile−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Leu−Ile
−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ile−Ｚ−Gly−Ala−Leu−Leu−Met−Gl
y−Leu−His−Ｙ ここで、AA28はCysまたはSer、 AA29はCysまたはSer、 AA30はProまたはAla、 AA31はValまたはGln、 AA32はHisまたはLys、 AA33はLeuまたはAla、 AA34はLysまたはGln、 AA35はArgまたはGln、 ＺはValまたはIle、 ＹはOH、またはアミノ酸配列Met−Ser−Gln−Lys−His
−Thr−Glu−MET−Val−Leu−Glu−MET−Ser−Ile−Gly
に対応する１〜15のアミノ酸のＣ末端延長配列、そし
て、ＸはＨ、またはＨ−AA27−、Ｈ−AA26−AA27−、お
よびＸ′−AA26−AA27−でなる群から選択されるアミノ
酸配列、 ここで、AA27はProまたはAla、 AA26はIleまたはSer、そして、 Ｘ′はＨ、またはアミノ酸配列Met−Asp−Val−Gly−Se
r−Lys−Glu−Val−Leu−Met−Glu−Ser−Pro−Pro−As
p−Tyr−Ser−Ala−Ala−Pro−Arg−Gly−Arg−Phe−Gl
yに対応する１−25アミノ酸のＮ末端延長配列であり； 但し、ＸがPhe−Gly−Ile−Pro、Gly−Ile−Pro、また
はIle−Proであり、ＹがOH、またはMet−Ser−Gln−Lys
−His−Thrに対応するアミノ酸配列であり、そしてすべ
てのＺがValであるならば、AA28−AA35は−Cys−Cys−P
ro−Val−His−Leu−Lys−Arg−ではあり得ない。 - 【請求項１３】ASP活性を有し、以下の配列により定義
される精製ポリペプチド、または薬学的に受容可能なそ
れらの塩またはアミド： Ｘ−AA31−AA32−AA33−AA34−AA35−Leu−Leu−Ile−
Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Leu−Ile−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ile
−Ｚ−Gly−Ala−Leu−Leu−Met−Gly−Leu−His−Ｙ ここで、AA31はValまたはGln、 AA32はHisまたはLys、 AA33はLeuまたはAla、 AA34はLysまたはGln、 AA35はArgまたはGln、 ＺはValまたはIle、 ＹはOH、またはアミノ酸配列Met−Ser−Gln−Lys−His
−Thr−Glu−MET−Val−Leu−Glu−MET−Ser−Ile−Gly
に対応する１−15のアミノ酸のＣ末端延長配列、そして Ｘは、Ｈ−AA30−、Ｈ−AA29−AA30、Ｈ−AA28−AA29−
AA30、Ｈ−AA27−AA28−AA29−AA30、Ｈ−AA26−AA27−
AA28−AA29−AA30、およびＸ′−AA26−AA27−AA28−AA
29−AA30でなる群から選択されるアミノ酸配列、 ここで、AA26はIleまたはSer、 AA27はProまたはAla、 AA28はCysまたはSer、 AA29はCysまたはSer、 AA30はProまたはAla、そして、 Ｘ′はＨ、またはアミノ酸配列のMet−Asp−Val−Gly−
Ser−Lys−Glu−Val−Leu−Met−Glu−Ser−Pro−Pro−
Asp−Tyr−Ser−Ala−Ala−Pro−Arg−Gly−Arg−Phe−
Glyに対応する１−25アミノ酸のＮ末端延長配列であ
り、； ただし、ＸがPhe−Gly−Ile−Pro−Cys−Cys−Pro、Gly
−Ile−Pro−Cys−Cys−Pro、またはIle−Pro−Cys−Cy
s−Proであり、ＹがOHまたはMet−Ser−Gln−Lys−His
−Thrに対応するアミノ酸配列であり、そしてすべての
ＺがValであるならば、−AA31−AA35は、−Val−His−L
eu−Lys−Arg−ではあり得ない。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11709987A | 1987-11-04 | 1987-11-04 | |
| US26644388A | 1988-11-01 | 1988-11-01 | |
| US117,099 | 1988-11-01 | ||
| US266,443 | 1988-11-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03502095A JPH03502095A (ja) | 1991-05-16 |
| JP2602968B2 true JP2602968B2 (ja) | 1997-04-23 |
Family
ID=26814915
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1500522A Expired - Lifetime JP2602968B2 (ja) | 1987-11-04 | 1988-11-02 | 肺胞の界面活性タンパク類 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0383837B1 (ja) |
| JP (1) | JP2602968B2 (ja) |
| KR (2) | KR960010558B1 (ja) |
| AT (1) | ATE163013T1 (ja) |
| AU (1) | AU625394B2 (ja) |
| CA (1) | CA1340461C (ja) |
| DK (1) | DK175843B1 (ja) |
| IL (1) | IL88293A0 (ja) |
| WO (1) | WO1989004326A1 (ja) |
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- 1988-11-02 EP EP89900458A patent/EP0383837B1/en not_active Expired - Lifetime
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-
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