KR100475294B1 - 폐계면활성제펩타이드의가용화방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폐 계면활성제 단백질을 불소화 알콜로 처리하여 에탄올에 용해시킴으로써 에탄올 주입에 의해 단백질을 리포좀으로 제형화시키는 방법에 관한 것이다.

Description

폐 계면활성제 펩타이드의 가용화 방법

본 발명은 약제학적 조성물 및 에탄올 주입에 의한 리포좀성 폐 계면활성제 단백질 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 폐 계면활성제 단백질을 불소화 알콜로 처리하여 에탄올에 용해시킴으로써 에탄올 주입에 의해 단백질을 리포좀으로 제형화시키는 방법에 관한 것이다.

폐 계면활성제는 폐포성 공기-물 계면에서 단층 형성을 촉진하고, 표면장력을 감소시킴으로써 숨을 내쉬는 동안 폐포의 허탈을 방지하는 지질과 단백질의 복합 혼합물이다. 조산아, 및 때때로 만삭의 신생아는 충분한 내인성 폐 계면활성제의 결핍으로 인해 종종 호흡곤란증(RDS)으로 알려진 증상으로 고통받는다. 따라서, 인공 폐 계면활성제는 이러한 증상을 치료함으로써 영아 이환 및 사망을 감소시키도록 개발되어 왔다. 마찬가지로, 인공 폐 계면활성제는 또한 성인 호흡곤란증을 치료하는데 사용되었다.

KL₄로 공지된 이러한 폐 인공 계면활성제중의 하나가 미합중국 특허 제 5,164,369 호 및 제 5,260,273 호에 기재되어 있다. 이 특허에 기재되어 있는 KL₄는 약제학적으로 허용되는 인지질과 소수성 및 양전하를 띤 아미노산 잔기가 교대로 배열된 폴리펩타이드를 혼합된 상태로 함유하는 합성 폐 계면활성제 조성물이다. 임상용으로 제형화된 조성물은 디팔미토일-포스파티딜콜린(DPPC), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 팔미트산(PA), 및 완충 수성 매질중에 현탁화된 합성 펩타이드 KL₄ 를 함유하는 리포좀이다. 궁극적인 약제 생성물은 폐에 직접 점적 주입하도록 의도된 리포좀성 현탁제이다.

상기 언급한 바와 같이, 인공 폐 계면활성제 KL₄는 리포좀성 제제이다. 리포좀은 구형 이중층으로 배열된 양친매성 지질을 함유하는 작은 소포이다. 리포좀은 수성 채널로 분리된 다수의 동축성 지질 이중층을 가질 수 있거나(다층판 소포 또는 MLV), 작은 단층판 소포(SUV) 또는 큰 단층판 소포(LUV)일 수 있는 단일막 이중층(단층판 소포)을 가질 수 있다. 지질 이중층은 소수성 "꼬리"부 및 친수성 "머리"부를 갖는 두 개의 지질 단층으로 구성되어 있다. 막 이중층에서, 지질 단층중의 소수성 "꼬리"부는 이중층의 중심부를 향해 있고, 친수성 "머리"부는 수성상을 향해 있다.

리포좀은 이중층 사이에 또는 수성 내부에 친수성 화합물을 포획하거나, 또는 이중층내에 소수성 화합물을 포획함으로써 각종 물질을 캡슐화(encapsulation)하는데 사용될 수 있다. 리포좀은 그 자체로서, 불량한 수용해도를 나타내거나, 치료적 투여량에서 허용되지 않는 독성을 나타내는 화합물을 캡슐화함으로써 생물학적 활성 물질을 전달하는데 특히 유용하다.

리포좀 및 관련 인지질 소포 복합체는 다양한 기술에 의해 제조할 수 있다. 일반적으로, 이러한 기술은 "무수" 지질을 수성상에 도입하는 것으로 시작된다(참조: D. Lasic, J. Theor. Biol. (1987) 124:35-41). 일단 지질이 수화되기만 하면, 리포좀은 자발적으로 형성된다. 리포좀중의 층판(lamellae)수를 조절하고, 규정된 입자 크기를 만들기 위한 기술이 개발되었다.

리포좀을 제조하는 한 방법이 문헌[S. Batzre et al., Biochem. Biophys Acta (1973) 298:1015-1019; J. Kremer et al., Biochemistry (1977) 16:3932-3935)에 에탄올 주입 방법으로서 공지되어 있으며, 이는 본출원에 참고로 인용된다. 이 방법에서는, 지질 및 활성성분을 에탄올에 용해시키고, 이를 완충용액을 임의로 함유하는 수성상에 주입시킨다. 이 방법에 따라 규정된 크기의 단일판층 소포가 형성되며, 이는 KL₄ 폐 계면활성제를 제조하는데 특히 적합하다.

따라서, 이 리포좀성 KL₄ 조성물은 현재 상기 언급된 에탄올 주입 방법에 의해 제형화된다. 이 제형 방법은 리포좀의 제조를 위해 95%의 에탄올중에 용해되는 KL₄ 펩타이드 성분을 필요로 한다. 그러나, 고체상 합성에 의해 제조된 KL₄ 펩타이드는 95% 에탄올중에 ㎖ 당 약 1 ㎎의 극히 저조한 에탄올 용해성을 나타낸다. 펩타이드의 용해성을 증진시키기 위해 소규모로 사용되고 있는 방법중 하나는 혼합 수성/유기 용매 시스템에서 펩타이드를 저농도로 동결건조시키는 것을 포함한다. 그러나, 이 방법은 비용 및 물질의 생산량을 고려할 때 특히 대규모로 사용하기에는 적합하지 않다.

따라서, KL₄ 펩타이드를 에탄올에 용해시켜 리포좀을 제조하는 개선된 방법이 요구된다.

도 1은 본 발명에 따라 처리된 것으로 TFE에서 인큐베이션하는 동안의 폴리펩타이드 KL₄-아세테이트의 FR-IR 스펙트럼을 나타낸다.

도 2는 본 발명에 따라 처리된 것으로 TFE에서 인큐베이션하는 동안의 폴리펩타이드 KL₄-아세테이트의 CD 스펙트럼을 나타낸다.

도 3A 및 3B는 본 발명에 따라 처리된 고체 폴리펩타이드 KL₄-아세테이트의 FR-IR 스펙트럼을 나타낸다.

도 4A 및 4B는 본 발명에 따라 처리된 고체 폴리펩타이드 KL₄-아세테이트의 FT-RAMAN 스펙트럼을 나타낸다.

도 5는 본 발명에 따른 처리전 및 후의 고체 KL₄-아세테이트의 폴리펩타이드 이차 구조를 FT-IR 분석한 것이다. 아미드 I, II, III 영역의 이차 유도화된 스펙트럼.

도 6은 본 발명에 따른 처리전 및 후의 고체 KL₄-아세테이트의 폴리펩타이드 이차 구조를 FT Raman 분석한 것이다. 아미드 I, II, III 영역의 이차 유도화된 스펙트럼.

도 7은 95%의 EtOH에 용해된 TFE(5 ㎎/㎖, 45 ℃)로 처리한 후의 고체 폴리펩타이드의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸다.

도 8은 95%의 EtOH에 용해된 TFE(5 ㎎/㎖, 45 ℃)로 처리한 후의 고체 폴리펩타이드의 원평광 이색성(CD) 스펙트럼을 나타낸다.

본 발명은 이후 실시예로 더욱 상세히 설명된다.

실시예 1

가용성 KL ₄ 폐 계면활성제 폴리펩타이드의 제조

교반자, 항온조, 온도 열전쌍 및 고체 부가 깔때기가 장치된 5.0 ℓ의 반응 플라스크에 트리플루오로에탄올 1.95 ℓ를 첨가한다. 27 ℃의 온도에서 온화하게 교반하면서 고체 KL₄-아세테이트(80.0 g)를 조금씩 첨가한다. 첨가를 완료한 후, 깔때기 및 플라스크 벽을 트리플루오로에탄올 0.05 ℓ로 헹군다. 그후, 플라스크를 공기와 차단하고, 생성된 우유빛 용액을 27 ℃에서 약 24 시간동안 교반한다. 우유빛 용액의 대표적인 샘플을 약 t=0, t=5h, t=7h 및 t=24.5h 시간 간격을 두고 취한다. 이 샘플에 대해 정보 목적으로 OD 450 ㎛ UV, FTIR, CD, 투명도(네슬러(Nessler)관) 및 점도(침구(falling ball) 타입)를 측정한다.

FT-IR 스펙트럼 분석(도 1)결과는 TFE 에서의 이차 구조가 β-시트에서 α-나선으로 전환되었음을 나타낸다. 1655 및 1548 ㎝^-1에서의 강한 흡수 밴드는 분자내 수소결합(α-나선)을 나타내는 것이다. 인큐베이션 기간동안 FT-IR 스펙트럼에서 아미드 I 및 II 영역에 변화가 없기 때문에 전환은 TFE에 펩타이드가 용해될 때 완료(KL₄ 첨가후 t=10 분)되는 것으로 보인다.

표 2 에 나타난 OD450 분석결과는 0.08 미만의 비교적 낮은 OD450 값을 갖는 t_o포인트(KL₄ 첨가후 10 분)에서 응집이 거의 없음을 나타낸다. 인큐베이션 전 과정을 통해 OD450 값은 t_o후 0.01 내지 0.03 범위내에서 일정하게 변한다. 이것은 시스템의 평형화 및 상이한 응집 상태간의 진동에 의한 결과일 수 있다.

[표 2]

OD450 및 최소 평균 엘리피서티(ellipicity) 값

CD 스펙트럼(도 2)은 -25000 내지 -33000[θ](deg·㎝²/dmole)사이에서 최소 엘리피서티를 갖고, 200 nm에서 이소베스틱 포인트(isobestic point)를 가지면서 유사한 패턴을 나타내는데, 이는 이차 구조가 인큐베이션 과정동안에 거의 차이가 없음을 의미하는 것이다. 최소 평균 몰 엘리피서티가 차이나는 것은 펩타이드의 상이한 응집 상태 때문인 것으로 보인다. IR 데이터는 펩타이드의 이차 구조에 변화가 없고 거의 예외없이 나선형임을 시사한다. CD 및 OD450 데이터는 펩타이드가 다이머, 트리머 등의 나선 "번들(bundle)"을 형성하고, TFE에서 인큐베이션하는 동안에 일정하게 어느정도 변함을 시사한다.

24.5 시간의 인큐베이션 기간후, 생성된 용액을 와트만 #1 여과지를 통해 진공여과한다. 그후, CD 및 OD450 측정을 위해 여액 샘플을 꺼낸다. 여액을 고진공(24 내지 28 인치 Hg)하에 37 내지 38 ℃에서 회전 증발에 의해 농축시켜 고체 잔류물을 수득한다.

그후 형성된 고체를 60 메쉬 스크린에 통과시키고, 상기와 동일한 온도 및 압력 조건하에 회전 증발기상에서 TFE의 함량이 10% 미만으로 될 때까지 더 건조시킨다.

적당한 환기 및 먼지 보호하에서 생성물을 폴리프로필렌 용기로 옮겨 -20 ℃에서 보관한다. 최종 매스(mass)를 82.64 g 수율로 수득한다. 분석 조정된 수율이 68.4 g(91.7%)인 TFE 처리된 KL-4를 백색 내지 회백색 분말로 수득한다([α]_D ²⁰(c=0.1, 10% Hac), -40.79; MW=2470.2).

본 발명에 따라 처리된 고체 펩타이드의 FT-IR 스펙트럼(도 3A 및 3B) 분석결과는 상당부분이 1656 내지 1657 ㎝^-1(아미드 I) 및 1537 내지 1548 ㎝^-1(아미드 II)의 영역에서 강한 흡수 밴드를 갖는 분자내 수소결합(α-나선)에 의함을 나타낸다. 고체 상태의 샘플을 FT-Raman 분석(도 4A 및 4B)한 결과 펩타이드는 1656 ㎝^-1에서 강한 아미드 I 밴드 및 1313 ㎝^-1에서 아미드 III 밴드를 갖는 주로 나선형 구조임을 알 수 있다.

도 5는 TFE 처리전 및 후의 폴리펩타이드 KL₄의 FT-IR 스펙트럼(아미드 I, II, II 영역은 이차 구조를 나타낸다)이다. 처리전 폴리펩타이드의 스펙트럼은 IR 스펙트럼의 경우에 분자간 수소결합(β-시트)을 나타내는 1694 및 1628 ㎝^-1에서 강한 시그널을 갖는다. 1658 및 1546 ㎝^-1에서의 약한 흡수 밴드는 이들 샘플내에 약간의 분자내 수소결합(α-나선형)이 존재함을 의미한다. TFE로 처리한 후의 고체 폴리펩타이드의 스펙트럼은 1656 내지 1657 ㎝^-1(아미드 I) 영역 및 1537 내지 1548 ㎝^-1(아미드 II)영역에서 강한 흡수 밴드를 가지며, 이는 β-시트구조가 거의 존재하지 않고 주로 나선형 구조로 이루어져 있음을 의미한다.

도 6은 Raman 스펙트럼의 아미드 I(1640 내지 1680 ㎝^-1) 및 아미드 III(1220 내지 1300 ㎝^-1) 영역을 분석한 결과이다. TFE로 처리하기 전의 폴리펩타이드의 스펙트럼은 분자간 수소결합(β-시트)을 나타내는 1671 ㎝^-1에서 강한 시그널을 가지며, 이는 IR 데이터와 일치한다. 1239 및 1213 ㎝^-1(아미드 III)에서의 시그널은 또한 분자간 수소결합(β-시트)이 존재함을 나타낸다. TFE로 처리한 후의 고체 폴리펩타이드의 스펙트럼은 폴리펩타이드가 1656 ㎝^-1에서 강한 아미드 I 밴드 및 1313 ㎝^-1에서 아미드 III 밴드를 갖는 주로 나선형 구조로 이루어져 있음을 의미한다.

샘플을 95% EtOH(5 ㎎/㎖)에 용해시켜 등명한 비점성 용액을 수득한다. 이 용액을 IR 및 CD 분광계로 분석한다. FT-IR 스펙트럼(도 7) 분석결과 펩타이드는 1656 내지 1657 ㎝^-1(아미드 I) 및 1537 내지 1548 ㎝^-1(아미드 II) 영역에서 강한 흡수 밴드를 가지며, 이는 (β-시트) 구조가 거의 존재하지 않고 주로 나선형 구조에 의한 것으로, 펩타이드는 95% EtOH에서 주로 나선형 구조로 이루어져 있음을 알 수 있다. 이 용액으로부터 얻은 CD 커브(도 8)는 IR 결과를 확인시켜 준다. 용액을 45 ℃에서 40 분동안 인큐베이션하고, 시간에 대한 OD450 값을 조사한다.(표 3). 0 시간에서, 낮은 OD450 값(<0.05)은 초기에 응집이 거의 없음을 의미한다. 시간이 지남에 따라 OD450 값은 점차적으로 증가하며, 이는 펩타이드가 용액에서 응집(용액은 여전히 등명하며 비점성이다)함을 의미한다.

[표 3]

95% EtOH에 용해된 펩타이드(5 ㎎/㎖)에 대한 OD 450 값

상기 언급된 방법에 의해 제조된 가용성 KL₄ 폐 계면활성제 폴리펩타이드는 상기 및 당 업계에 공지된 방법에 따라 리포좀성 약제 생성물을 제조하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 에탄올 주입에 의해 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 인지질을 함유하는 리포좀성 폐 계면활성제 조성물을 제조하는 개선된 방법을 포함한다. 이 개선 방법은

a) 약 5 내지 40 ㎎/㎖의 농도로 불소화 알콜중의 폴리펩타이드, 또는 그의 염 또는 에스테르 용액을 제조하고;

b) 450 nm 에서 0.06 미만의 광밀도를 나타내기에 충분한 시간동안 인큐베이션한 후;

c) 여과하고;

d) 불소화 알콜을 제거하여 가용성 고체 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 에탄올에서 향상된 용해성을 나타내는 폴리펩타이드, 또는 그의 염 또는 에스테르 형태를 제조함을 특징으로 한다.

본 발명에 유용한 폴리펩타이드는 미합중국 특허 제 5,164,369 호 및 5,260,273 호에 기재되어 있다. 이것은 소수성 및 친수성 아미노산 영역이 교대로 배열되어 있는 하기 화학식의 서열을 포함하고, 적어도 10 개 내지 60 개 이하의 아미노산 잔기를 함유하는 선형 폴리펩타이드이다:

(Z_aU_b)_cZ_d

상기식에서,

Z 는 R 및 K 로 구성된 그룹중에서 독립적으로 선택된 친수성 아미노산 잔기이고;

U 는 V, I, L, C 및 F 로 구성된 그룹중에서 독립적으로 선택된 소수성 아미노산 잔기이며;

a 는 약 1 내지 약 5의 평균값을 갖고;

b 는 약 3 내지 약 20의 평균값을 가지며;

c 는 1 내지 10이고;

d 는 1 내지 3이다.

KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 KL₄ 가 특히 바람직하다.

KL₄ 를 포함한 상기 합성 폴리펩타이드는 α-나선형, β-주름형, β-시트형 또는 불규칙한 코일형 이차 구조를 포함한 각종 이차 구조를 가질 수 있는 것으로 공지되어 있다. α-나선 형태가 에탄올에 대한 용해성이 가장 좋은 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 방법은 폴리펩타이드에 α-나선형 이차 구조를 도입함으로써 폴리펩타이드의 용해성을 증진시키는 것으로 예상된다. 본 발명에 따라 불소화 알콜로 처리하여 제조한 폴리펩타이드는 95% 에탄올에서 향상된 용해성을 나타내며, 따라서, 리포좀성 폐 계면활성제 조성물을 제조하는 에탄올 주입방법에 사용하기에 적합하다.

본 발명의 다른 일면으로, 폴리펩타이드를 불소화 알콜에 용해시키고, 생성된 용액을 에탄올 용매와 혼합하여 에탄올 주입 방법에 직접 사용할 수 있다. 그후, 리포좀 제조 과정중에 불소화 알콜을 투석 또는 증발에 의해 에탄올 용매와 함께 제거할 수 있다. 트리플루오로에탄올("TFE")이 바람직한 불소화 알콜이다.

본 원에 언급된 모든 아미노산은 자연 L-배열로 존재한다. 아미노산 잔기에 대한 약어를 문헌[J. Biol. Chem. 243:3557-59 (1969)]에 기재된 표준 폴리펩타이드 명명법에 따라 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

본 원에 언급된 아미노산 잔기는 왼쪽(아미노-말단)에서 오른쪽(카복실-말단) 방향으로 통상적인 방식으로 기재된다.

본 발명에 사용되는 인공 폐 계면활성제 폴리펩타이드는 당 업계에 공지된 기술에 의해, 예를 들어 고체상 합성, 재조합 DNA 기술 또는 고전적인 용액 합성에 의해 제조할 수 있다. 폴리펩타이드의 제조방법은 미합중국 특허 제 5,164,369 호에 기재되어 있으며, 이의 내용은 본 출원에 참고로 인용된다.

이와 같은 여러 기술에 의해 제조되는 경우, 특히 고체상 합성을 이용하여 폴리펩타이드를 제조하는 경우, 생성된 폴리펩타이드는 가변(variable) 이차 구조를 나타낼 수 있고, 에탄올중의 용해도가 일정치 않을 수 있다. 고체상 합성이 이용되는 경우, 주요 이차 구조는 에탄올에 대한 용해도가 좋지 않은 반평행 β-시트형태를 나타낼 수 있다. 그러나, 폴리펩타이드를 본 발명에 따라 불소화 알콜로 처리하게 되면, 폴리펩타이드에 의해 나타나는 주요 이차 구조는 α-나선형을 이루고, 에탄올에 대한 폴리펩타이드의 용해도가 향상된다. 또한, 폴리펩타이드를 불소화 알콜로 처리하면 용액에서 폴리펩타이드의 응집이 최소화되어 공정이 개선된다.

본 방법은 불소화 알콜 용액에 폐 계면활성제 폴리펩타이드를 5 내지 40 ㎎/㎖ 농도로 첨가함으로써 수행된다. 그후, 생성된 현탁액을 교반하면서 폴리펩타이드를 용해시키기에 충분한 시간동안 인큐베이션시킨다. 인큐베이션 시간은 배치에 따라 달라질 수 있다. 폴리펩타이드가 탈응집되어 등명한 비점성 용액으로 되기에 충분한 시간동안 인큐베이션시켜야 한다. 충분한 탈응집 시점은 용액이 450 nm에서의 광 산란을 측정하여 얻은 것으로 0.06 미만, 바람직하게는 0.03 이하의 광밀도를 나타낼 때이다.

응집은 450 nm(OD450)에서 샘플내 응집물의 광 산란에 의한 겉보기 흡광치(apparent absorbance)를 측정함으로써 검사한다. 이를 측정하기 위하여 파장이 450 nm로 고정된 UV/Vis 분광광도계가 사용된다. 장치의 샘플 격벽 구조는 광 산란을 정확히 측정하도록 구성된다. 이러한 요구조건을 만족하며 테스트되어온 장치는 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) LAMDA 14 UV/Vis 분광계 및 Shimadzu DU 260 UV/Vis 분광계이다.

일반적으로, KL₄ 펩타이드를 TFE중에서 2 내지 24 시간동안 인큐베이션한 후, 여과하여 최종 응집물 및 미립자 물질을 제거한다.

분무 건조, 회전 증발 또는 침전을 포함한 다양한 기술에 의해 회수를 수행할 수 있으며, 이들 기술은 모두 불소화 알콜을 제거할 목적으로 제공된다. 일반적으로, 여과용액을 고진공하에 37 내지 40 ℃에서 회전증발시켜 건조시키거나, 적합한 용매를 사용하여 용액으로부터 침전시킨다. 회전증발이 바람직하다. 수득한 고체를 진공하에 37 내지 40 ℃에서 건조시켜 잔류 용매를 제거한다. 그후, 회수한 폴리펩타이드를 당 업계에 공지된 기술을 이용하여 에탄올 주입에 의한 리포좀성 폐 계면활성제의 제조에 사용할 수 있다.

본 발명에 사용하기에 적합한 불소화 알콜은 2,2,2-트리플루오로에탄올, 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 및 그밖의 다른 불소화 알콜이다. 설명한 바와 같이, 불소화 알콜은 "나선 안정화" 매질로서 작용하는 것으로 판단된다. 나선형 폴리펩타이드는 다른 이차 구조의 폴리펩타이드보다 응집이 덜 일어난다. 이러한 효과는 폴리펩타이드 사슬의 고유성질이라기 보다는 불소화 알콜의 성질에 의한 것으로 보인다.

본 발명의 또 다른 일면으로, 본 발명에 따라 제조된 리포좀성 KL₄ 폐 계면활성제는 본 발명에 의한 불소화 알콜의 처리없이 제형화된 생성물에 비해 감소된 점도를 나타냄이 밝혀졌다. 리포좀성 KL₄ 약제 생성물의 제형화 및 작용에 있어서 마주치게 되는 문제점중의 하나는 약제 생성물의 점성이 폐에서의 효과적인 분포를 제한하여 생체내 활성을 떨어뜨릴 수 있다는 것이다. 따라서, 본 발명은 최종 약제 생성물의 점도를 감소시킴으로써 KL₄ 리포좀성 폐 계면활성제의 성능을 향상시킨다.

본 발명의 또 다른 방법에서, 폐 계면활성제 폴리펩타이드를 상술한 방법에 의해 불소화 알콜로 처리하고, 수득한 용액을 에탄올 용매와 혼합하여 에탄올 주입에 의한 리포좀 제조공정에 직접 사용할 수 있다. 그후, 리포좀 제조 과정중에 불소화 알콜을 당 업계에 공지된 기술을 이용하여 투석 또는 증발에 의해 에탄올과 함께 제거할 수 있다.

Claims (8)

1. a) 5 내지 40 ㎎/㎖의 농도로 불소화 알콜중의 폴리펩타이드, 또는 그의 염 또는 에스테르 용액을 제조하고;

   b) 450 nm 에서 0 내지 0.06 미만의 광밀도를 나타내도록 인큐베이션한 후;

   c) 여과하고;

   d) 불소화 알콜을 제거하여 가용성 고체 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 에탄올 용해성이 증가된 폴리펩타이드, 또는 그의 염 또는 에스테르 형태를 제조하는 것을 포함하여, 에탄올 주입에 의해 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 인지질을 함유하는 리포좀성 폐 계면활성제 조성물을 제조하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 폴리펩타이드가 소수성 및 친수성 아미노산 영역이 교대로 배열되어 있는 하기 화학식의 서열을 포함하여, 10 개 내지 60 개의 아미노산 잔기를 함유하는 선형 폴리펩타이드인 방법:

   (Z_aU_b)_cZ_d

   상기식에서,

   Z 는 R 및 K 로 구성된 그룹중에서 독립적으로 선택된 친수성 아미노산 잔기이고;

   U 는 V, I, L, C 및 F 로 구성된 그룹중에서 독립적으로 선택된 소수성 아미노산 잔기이며;

   a 는 1 내지 5의 평균값을 갖고;

   b 는 3 내지 20의 평균값을 가지며;

   c 는 1 내지 10이고;

   d 는 1 내지 3이다.
3. 제 2 항에 있어서, 폴리펩타이드가 KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK의 아미노산 서열을 갖는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 불소화 알콜이 2,2,2-트리플루오로에탄올인 방법.
5. 폴리펩타이드를 에탄올 용액에 첨가하기 전에 5 내지 40 ㎎/㎖의 농도로 불소화 알콜에 용해시켜 예비-처리하는 것을 포함하는, 폴리펩타이드 및 인지질을 에탄올에 용해시키고 생성된 용액을 수성상에 도입시켜 리포좀을 제조하는, 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 인지질을 함유하는 리포좀성 폐 계면활성제 조성물의 제조방법.
6. 제 5 항에 있어서, 폴리펩타이드가 KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK의 아미노산 서열을 갖는 방법.
7. 제 5 항에 있어서, 불소화 알콜이 2,2,2-트리플루오로에탄올인 방법.
8. 제 5 항에 있어서, 수성상이 완충 용액을 함유하는 방법.