JP3856343B2 - 肺胞界面活性物質ペプチドの可溶化法 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、製薬学的組成物の分野およびエタノール注入によるリポソーム様の肺胞界面活性物質タンパク質組成物の製造に関する。より具体的には、本発明は、肺胞界面活性物質タンパク質がエタノール注入によりリポソーム中に配合されうるようにフッ素化アルコールを用いる処理によりエタノール中に当該タンパク質を可溶化する方法に関する。
発明の背景
肺胞界面活性物質は、肺胞の空気／水界面での単層の形成を促進し、そして界面張力を低下させることにより呼息の間の肺胞の崩壊を防止する、脂質およびタンパク質の複合体混合物である。未熟な幼児、および時には妊娠期を十分経て産まれた新生児が、ときに、十分な内因性肺胞界面活性物質の欠如により呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）として知られる疾患に罹る。人工肺胞界面活性物質が、従って、この疾患を治療しそれにより幼児の罹病率および死亡率を低下させるために開発されている。同様に、人工肺胞界面活性物質はまた、成人の呼吸窮迫症候群の治療にも指示されている。
ＫＬ₄として知られる、これらの人工肺胞界面活性物質の一が米国特許第5,164,369号および同第5,260,273号に開示される。そこに記述されるように、ＫＬ₄は、交互に疎水性および正に荷電されたアミノ酸残基を有するポリペプチドと混合される製薬学的に許容できるリン脂質を含んで成る合成の肺胞界面活性物質組成物である。臨床使用のために処方されるように、当該組成物は、緩衝化された水性媒体中に懸濁されたジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、パルミトイルオレイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、パルミチン酸（ＰＡ）および合成ペプチドＫＬ₄から成るリポソームである。最終的な薬物生成物は、肺への直接点滴注入を予定されるリポソーム懸濁液である。
記載されるように、人工肺胞界面活性物質ＫＬ₄はリポソーム製剤である。リポソームは、球状二重層に配置された両親媒性脂質を含んで成る小型の小胞である。リポソームは、水性の溝により分離される多くの同一中心性脂質二重層を含有することがある（多層状小胞すなわちＭＬＶ）、または、あるいは、それらは単一膜二重層（単層状小胞）を含有することがあり、これらは小型単層状小胞（ＳＵＶ）もしくは大型単層状小胞（ＬＵＶ）でありうる。脂質二重層は、疎水性の「尾」領域および親水性の「頭」領域を有する２個の脂質単層から成る。膜二重層では、脂質単層の疎水性の「尾」は二重層の中心に向く一方、親水性の「頭」は水相に向く。
リポソームは、水性の内部もしくは二重層間に親水性化合物を捕捉する、または、二重層内に疎水性化合物を捕捉することにより、多様な物質を被包するのに使用されることがある。それ自体、それらは、不十分な水溶性を表す、もしくは治療的投薬量で許容できない毒性を表す化合物を被包することにより生物学的活性物質を送達させるのにとりわけ有用である。
リポソームおよび関連するリン脂質小胞複合体は多様な技術により調製され得る。一般には、これらの技術は、水相に導入される「乾燥」脂質で開始する（ラシック(D. Lasic)、J. Theor. Biol. (1987) 124:35-41）。脂質が水和されれば、リポソームは自発的に生じる。リポソーム中の層数を制御しそして限定される粒子径を生じさせる技術が開発されている。
リポソームを調製する一方法は、ここで引用することにより本明細書に組み込まれる（バツレ(S. Batzre)ら、Biochem. Biophys. Acta (1973) 298:1015-1019；クレマー(J. Kremer)ら、Biochemistry (1977) 16:3932-3935）に記述されるようなエタノール注入法として知られる。この方法では、脂質および有効成分がエタノールに溶解され、そして、場合によっては緩衝溶液を含有する水相に注入される。この方法は限定される大きさの単層状小胞を生成させ、また、とりわけ、ＫＬ₄肺胞界面活性物質の製造に十分適する。
従って、現在、このリポソームＫＬ₄組成物は、前述のエタノール注入法により配合される。この配合方法は、ＫＬ₄ペプチド成分がリポソームへの製造のために95％エタノールに溶解されることを必要とする。しかしながら、固相合成により調製されるＫＬ₄ペプチドは、95％エタノール中でおよそ１mg/mlの極めて乏しいエタノール中の溶解性を表す。このペプチドの溶解性を高めるのに小スケールで使用されている一方法は、混合された水／有機溶媒系中での低濃度のペプチドの凍結乾燥を必要とする。しかしながら、この方法は、費用および原料の処理量が考慮される場合に、大スケールでの使用に特に適するわけではない。
従って、リポソームへの製造のためエタノールにＫＬ₄ペプチドを可溶化するための改善された方法の必要が存在する。
発明の要約
本発明は、エタノール注入によるリポソーム肺胞界面活性物質組成物の調製方法の改善に関連する。当該組成物はポリペプチドおよび製薬学的に許容できるリン脂質から成る。この改善は、
（ａ）フッ素化アルコール中の約５ないし40mg/mlの濃度のポリペプチドまたはその塩もしくはエステルの溶液を調製すること、
（ｂ）0.06未満の450ナノメートルでの光学濃度を達成するのに十分な時間の期間インキュベーションすること、
（ｃ）濾過すること、そして
（ｄ）フッ素化アルコールを除去して固形の可溶性ポリペプチドを回収すること、
の段階を含んで成る、エタノール中の高められた溶解性を表すポリペプチドまたはその塩もしくはエステルの形態を調製することを含んで成る。
本発明で有用なポリペプチドは米国特許第5,164,369号および同第5,260,273号に開示されている。それは、式（Ｚ_aＵ_b）_cＺ（式中、
ＺはＲおよびＫから成る群から独立に選択される親水性アミノ酸残基であり、
ＵはＶ、Ｉ、Ｌ、ＣおよびＦから成る群から独立に選択される疎水性アミノ酸残基であり、
ａは約１ないし約５の平均値を有し、
ｂは約３ないし約20の平均値を有し、
ｃは１ないし10であり、そして
ｄは１ないし３である）により表される、互い違いになる疎水性および親水性アミノ酸残基を有する配列を包含する、最低10アミノ酸残基かつ60を越えないアミノ酸残基を含んで成る直鎖状ポリペプチドである。アミノ酸配列ＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫを有するポリペプチドＫＬ₄がとりわけ好ましい。
ＫＬ₄を包含するこれらの合成ポリペプチドが、αヘリックス、βプリーツ、βシートもしくはランダムコイルの二次構造を包含する多様な二次構造を採用し得ることが既知である。αヘリックスの形態がエタノール中での最大の溶解性を表すようである。従って、本発明の方法が、当該ポリペプチドにαヘリックスの二次構造を導入することにより当該ポリペプチドの溶解性を高めることが推定される。本発明に従ったフッ素化アルコールでの処理により調製されるポリペプチドは、95％エタノール中での高められた溶解性を表し、そして、かように、リポソーム肺胞界面活性物質組成物を調製するエタノール注入法での使用に適するようにされる。
本発明の別の局面において、当該ポリペプチドはフッ素化アルコール中で可溶化され得、そして、生じる溶液が、直接、エタノール注入法での使用のためエタノール溶媒と混合され得る。フッ素化アルコールは、その後、リポソーム製造過程で透析もしくは蒸発によりエタノール溶媒とともに除去され得る。トリフルオロエタノール（「ＴＦＥ」）が好ましいフッ素化アルコールである。
図面の簡単な記述
図１は、本発明に従って処理された、インキュベーションの間のＴＦＥ中のポリペプチドＫＬ₄酢酸エステルのＦＴ−ＩＲスペクトルを示す。
図２は、本発明に従って処理された、インキュベーションの間のＴＦＥ中のポリペプチドＫＬ₄酢酸エステルのＣＤスペクトルを示す。
図３Ａおよび３Ｂは、本発明に従って処理された固形ポリペプチドＫＬ₄酢酸エステルのＦＴ−ＩＲスペクトルを示す。
図４Ａおよび４Ｂは、本発明に従って処理された固形ポリペプチドＫＬ₄酢酸エステルのＦＴ−ラマンスペクトルを示す。
図５は、本発明に従った処理の前および後の固形のＫＬ₄酢酸エステルのポリペプチドの二次構造のＦＴ−ＩＲ分析を示す。アミドＩ、II、III領域の二次導関数スペクトル。
図６は、本発明に従った処理の前および後の固形のＫＬ₄酢酸エステルのポリペプチドの二次構造のＦＴラマン分析を示す。アミドＩ、II、III領域の二次導関数スペクトル。
図７は、95％エタノールに溶解された（５mg/mL、45℃）、ＴＦＥでの処理後の固形ポリペプチドのＦＴ−ＩＲスペクトルを示す。
図８は、95％エタノールに溶解された（５mg/mL、45℃）、ＴＦＥでの処理後の固形ポリペプチドの円二色性（ＣＤ）スペクトルを示す。
詳細な記述
本明細書で同定される全アミノ酸残基は天然のＬ配置にある。標準的なポリペプチド命名法すなわちJ. Biol. Chem. 243:3557-59 (1969)に一致して、アミノ酸残基の略語は以下の対応表に示されるようである：

式により本明細書で表されるアミノ酸残基は、アミノ末端からカルボキシル末端の慣習的な方向で左から右の向きにある。
本発明での使用のための人工肺胞界面活性物質ポリペプチドは、当業者に十分に既知であるいずれかの技術、例えば固相合成、組換えＤＮＡ技術もしくは古典的な溶液合成により調製されうる。当該ポリペプチドの調製方法は、これにより本明細書に引用により組み込まれる米国特許第5,164,369号に記述されている。
これらの多様な技術により調製される場合、とりわけ、ポリペプチドの固相合成が採用される場合、生じるポリペプチドは、変わりやすい二次構造およびエタノール中の変わりやすい溶解性を表し得る。固相合成が採用される場合、主たる二次構造は、エタノール中で乏しい溶解性を表す逆平行βシートであるようである。しかしながら、当該ポリペプチドが、本発明に従ってフッ素化アルコールで処理される場合、このポリペプチドにより表される支配的な二次構造はαヘリックスであり、そして、このポリペプチドのエタノール中の溶解性が改善される。さらに、フッ素化アルコールでのポリペプチドの処理は、溶液中のポリペプチドの凝集を最小限にしそして加工を向上させる。
当該方法は、フッ素化アルコールの溶液に肺胞界面活性物質ポリペプチドを５〜40mg/mlの濃度で添加することにより実施される。生じる懸濁液を、その後、攪拌しながら、ポリペプチドを溶解させるのに十分な時間インキュベーションする。インキュベーション時間はバッチごとに変動してもよい。十分なインキュベーション時間が、澄明な非粘性溶液を生じるポリペプチドの脱凝集(de-aggregation)を可能にするために採用されるべきである。十分な脱凝集は、この溶液が、0.06未満好ましくは0.03もしくはより小さい450ナノメートルでの光散乱の光学密度測定値を表す場合に達せられる。
凝集は、サンプル内の凝集物(aggregates)の光散乱から生じる450nmでの見かけの吸光度（ＯＤ450）を測定することによりモニターされる。450nmに設定された波長をもつＵＶ／可視分光光度計がこの測定に使用される。この器具のサンプル室の配置は、光散乱の正確な測定を可能にするようなものでなくてはならない。試験されておりかつ要件に合致する器具は、パーキン エルマー(Perkin Elmer)ラムダ(LAMBDA)１４ＵＶ／可視分光計および島津(Shimadzu)ＤＵ２６０ ＵＶ／可視分光計である。
一般に、ＫＬ₄ペプチドは、２ないし24時間ＴＦＥ中でインキュベーションされ、その後に最終的な凝集物および粒状物質を除去するための濾過スキームが続く。
回収は、噴霧乾燥、回転蒸発もしくは沈殿を包含する多様な技術により実行され得、その全てはフッ素化アルコールを除去するようはたらく。一般には、濾過された溶液は、高真空下で37〜40℃で乾固まで回転蒸発されるか、もしくは適する溶媒を用いて溶液から沈殿される。回転蒸発が好ましい。生じる固形物は真空下37〜40℃で乾燥されて残余の溶媒が除去される。このように回収されるポリペプチドは、その後、当該技術分野で既知の技術を使用してエタノール注入によりリポソーム肺胞界面活性物質を製造するのに使用されることができる。
本発明での使用に適するフッ素化アルコールは、２，２，２−トリフルオロエタノール、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、および他のフッ素化アルコールを包含する。述べられたように、フッ素化アルコールは「ヘリックス安定化」媒体として作用することが考えられる。らせん状ポリペプチドは他の二次構造のポリペプチドより小さな凝集する傾向を示す。この効果は、ポリペプチド鎖の固有の特性よりはむしろフッ素化アルコールの特性の結果であると考えられる。
本発明の別の局面において、本発明に従って製造されるリポソームＫＬ₄肺胞界面活性物質が、本発明によるフッ素化アルコールでの処理を伴わずに配合された生成物と比較される場合に減少された粘度を表すことが観察されている。当該配合およびリポソームＫＬ₄薬物生成物の性能で遭遇される問題の一は、この薬物生成物の粘度が肺での有効な分布を制限し得、それによりインビボ活性を低下させるということである。本発明は、従って、最終的な薬物生成物の粘度を減少させることにより、ＫＬ₄リポソーム肺胞界面活性物質の性能を向上させる。
本発明の代替の方法において、肺胞界面活性物質ポリペプチドは、上述される方法でフッ素化アルコールを用いて配合され得、また、生じる溶液は、エタノール溶媒と混合され得かつエタノール注入リポソーム製造方法で直接使用され得る。フッ素化アルコールが、その後、当該技術分野で既知の技術を使用して、透析もしくは蒸発によりリポソーム製造方法でのエタノールとともに除去される。
本発明は以下の実施例によりさらに具体的に説明される。
実施例１
可溶性ＫＬ₄肺胞界面活性物質ポリペプチドの調製
攪拌機、恒温槽、温度熱電対および固形物添加漏斗を装備された5.0リットルの反応フラスコに、1.95リットルのトリフルオロエタノールを添加する。27℃の温度で穏やかに攪拌しながら、固形のＫＬ₄酢酸エステル（80.0g）を部分状の(portion wise)様式で添加する。添加が完了された後、漏斗およびフラスコの壁を0.05リットルのトリフルオロエタノールですすぐ。フラスコをその後、大気中で固定し(secured to the atmosphere)、そして生じる乳白光を放つ溶液を27℃でおよそ24時間攪拌する。乳白光を放つ溶液の代表的サンプルを、およそｔ＝０、ｔ＝５時間、ｔ＝７時間およびｔ＝24.5時間の時間間隔で採取する。これらのサンプルを、情報の目的のため、ＯＤ450nmのＵＶ、ＦＴＩＲ、ＣＤ、澄明度（ネスラー管）および粘度（落下球型(falling ball type)）の測定にかける。
ＦＴ−ＩＲスペクトル（図１）の分析は、ＴＦＥ中の二次構造がβシートからαヘリックスに変換したことを示す。1655および1548cm^-1の強い吸収帯は分子内水素結合（αヘリックス）を暗示する。この変換はＴＦＥ中のペプチドの溶解（ｔ₀＝ＫＬ₄の添加後10分）に際して完成されるようである。なぜなら、インキュベーション期間にわたり、ＦＴ−ＩＲスペクトルのアミドＩおよびII領域に変化が存在しないからである。
表１に示されるようなＯＤ450分析は、0.08未満である比較的低いＯＤ450値をもつｔ₀点（ＫＬ₄の添加後10分）でのわずかの凝集を示す。インキュベーションの経過を通じ、ＯＤ450値は、ｔ₀後、0.01ないし0.03の範囲内で絶えず変化している。これは、系の平衡化の結果および異なる凝集状態の間のゆらぎであり得るとみられる。

ＣＤスペクトル（図２）は、二次構造に関して、インキュベーション期間の間に非常に小さく異なることを示す、−25000と−33000［Θ］（deg・cm²/dmole）との間の報告された最小楕円率および200nmでの変曲点をもつ類似のパターンをたどる。最小平均分子楕円率での差異はおそらくペプチドの異なる凝集状態による。ＩＲのデータは、当該ペプチドの二次構造が変化しておらずそしてほとんど独占的にらせん状であることを示唆する。ＣＤおよびＯＤ450のデータは、このペプチドが二量体、三量体などのヘリックスの「束」を形成しており、そしてＴＦＥ中でのインキュベーションの間に若干の程度絶えず変化していることを示唆する。
24.5時間のインキュベーション期間の後、生じる溶液を、その後、ワットマン(Whatman)＃１濾紙上で真空濾過する。濾液のサンプルをその後、ＣＤおよびＯＤ450の評価のため取り出す。濾液をその後、回転蒸発により37〜38℃で真空（24〜28インチHg）下に固形残渣まで濃縮する。
生じる固形物を、その後、60メッシュの篩を通過させ、そして、10％未満のＴＦＥ含量が存在するまで、同じ温度および圧力の条件下でロータリーエバポレーターでさらに乾燥する。
適正な換気および粉塵保護指針の下で、生成物をポリプロピレン容器に移し、そして−20℃で保存する。82.64gの最終的な全体的収量が得られる。ＴＦＥ処理されたＫＬ₄のアッセイで補正された68.4g（91.7％）の収量が、白色ないし灰白色の粉末として得られる。［α］_D ²⁰（ｃ＝0.1、10％Ｈａｃ）、−40.79；分子量＝2470.2。
本発明に従って処理された固形ペプチドのＦＴ−ＩＲスペクトル（図３Ａおよび３Ｂ）の分析は、1656〜1657cm^-1（アミドＩ）および1537〜1548cm^-1（アミドII）の領域に強い吸収帯をもつ分子内水素結合（αヘリックス）の大きな寄与を示す。固形状態のサンプルのＦＴ−ラマン分析（図４Ａおよび４Ｂ）もまた、このペプチドが、1656cm^-1に強いアミドＩのバンドおよび1313cm^-1のアミドIIIのバンドをもつ、支配的にらせん状であることを示す。
図５はＴＦＥ処理の前および後のポリペプチドＫＬ₄のＦＴ−ＩＲスペクトルの拡大（二次構造を暗示するアミドＩ、II、III領域）である。処理前のポリペプチドのスペクトルは、分子間水素結合（βシート）を暗示する、ＩＲスペクトル中の1694および1628cm^-1の強いシグナルを有する。1658cm^-1および1546cm^-1の弱い吸収帯は、これらのサンプル中の若干の分子内水素結合（αヘリックス）の存在を示唆する。ＴＦＥでの処理後の固形ポリペプチドのスペクトルは、存在するβシート構造の非常にわずかな証拠を伴うヘリックス構造の大きな寄与を示す、1656〜1657cm^-1（アミドＩ）および1537〜1548cm^-1（アミドII）の領域に強い吸収帯を有する。
図６は、ラマンスペクトルのアミドＩ（1640〜1680cm^-1）およびアミドIII（1220〜1300cm^-1）領域の分析である。ＴＦＥでの処理前のポリペプチドのスペクトルは、ＩＲのデータと一致する分子間水素結合（βシート）を暗示する1671cm^-1の強いシグナルを表す。1239および1213cm^-1（アミドIII）のシグナルもまた、分子間水素結合（βシート）の存在を示唆する。ＴＦＥでの処理後の固形ポリペプチドのスペクトルは、このポリペプチドが、1656cm^-1に強いアミドＩのバンドおよび1313cm^-1にアミドIIIのバンドをもつ、支配的にらせん状であることを示す。
サンプルを95％エタノールに溶解して（５mg/mL）澄明な非粘性溶液を生じさせた。この溶液をＩＲおよびＣＤ分光法により分析した。ＦＴ−ＩＲスペクトル（図７）の分析は、このペプチドが、存在する（βシート）構造の非常にわずかな証拠を伴うヘリックス構造の大きな寄与を示す1656〜1657cm^-1（アミドＩ）および1537〜1548cm^-1（アミドII）の領域に強い吸収帯をもつ、95％エタノール中で支配的にらせん状であることを示す。この溶液から生成されたＣＤ（図８）曲線の分析はＩＲの結果を確認する。この溶液を45℃で40分間インキュベーションし、そしてＯＤ450を時間にわたって(over time)モニターした。（表２）。時間０では、低いＯＤ450値（＜0.05）が、最初は非常にわずかな凝集が存在することを示す。時間にわたってＯＤ450値は次第に増大し、ペプチドが溶液中で凝集していることを示す（溶液はなお澄明かつ非粘性であった）。

上述される方法により調製される可溶性ＫＬ₄肺胞界面活性物質ポリペプチドは、当該技術分野で既知のおよび上述される方法に従って、リポソーム薬物生成物を製造するのに使用されることができる。

Claims (7)

1. （ａ）フッ素化アルコール中の５ないし40mg/mlの濃度のポリペプチドまたはその塩もしくはエステルの溶液を調製すること、
   （ｂ）0.06未満の450ナノメートルでの光学濃度を達成するのに十分な時間の期間インキュベーションすること、
   （ｃ）濾過すること、そして
   （ｄ）フッ素化アルコールを除去して、固形の可溶性ポリペプチドを回収すること、
   の段階を含んで成る、エタノール注入によるリポソーム肺胞界面活性物質組成物の改善調製方法であって、リポソーム肺胞界面活性物質組成物がポリペプチドおよび製薬学的に許容できるリン脂質から成り、この改善がエタノール中の高められた溶解性を表すポリペプチドまたはその塩もしくはエステルの形態を調製することを含んで成る方法。
2. ポリペプチドが、式（Ｚ_aＵ_b）_cＺ（式中、
   ＺはＲおよびＫから成る群から独立に選択される親水性アミノ酸残基であり；
   ＵはＶ、Ｉ、Ｌ、ＣおよびＦから成る群から独立に選択される疎水性アミノ酸残基であり；
   ａは１ないし５の平均値を有し；
   ｂは３ないし20の平均値を有し；
   ｃは１ないし10であり；そして
   ｄは１ないし３である）により表される、相互に疎水性および親水性アミノ酸残基を有する配列を包含する、最低10アミノ酸残基かつ60を越えないアミノ酸残基を含んで成る直鎖状ポリペプチドである、請求項１記載の方法。
3. ポリペプチドが、アミノ酸配列ＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫを有する、請求項２記載の方法。
4. フッ素化アルコールが２，２，２−トリフルオロエタノールである、請求項１記載の方法。
5. リポソーム肺胞界面活性物質組成物がポリペプチドおよび製薬学的に許容できるリン脂質から成り、また、リポソームが、ポリペプチドおよびリン脂質をエタノール中に溶解しそして生じる溶液を場合によっては緩衝溶液を含有する水相に注入することにより調製される、リポソーム肺胞界面活性物質組成物を調製する方法において、ポリペプチドをそれをエタノール溶液に添加する前に５〜40mg/mlの濃度でフッ素化アルコールに溶解することによりポリペプチドを前処理することを含んで成る改善された方法。
6. ポリペプチドが、アミノ酸配列ＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫを有する、請求項５記載の方法。
7. フッ素化アルコールが２，２，２−トリフルオロエタノールである、請求項５記載の方法。

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