FI102180B - Menetelmä keuhkopinta-aktiivisten polypeptidien valmistamiseksi - Google Patents

Description

102180

Menetelmä keuhkopinta-aktiivisten polypeptidien valmistamiseksi Tämä on jatkohakemus rinnakkaiselle US-patenttihakemukselle 141 200, jätetty 6. 5 tammikuuta 1988, jonka nimi on Pulmonary Surfactant Protein and Related Polypeptide (Cochrane, et al).

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää SP18-monomeeriin liittyvien polypeptidien valmistamiseksi, jotka ovat käyttökelpoisia muodostettaessa synteettisiä 10 pulmonaalisurfaktantteja.

Pulmonaalisurfaktantti (PS) verhoaa keuhkorakkulan epiteeliä nisäkkään täysin kehittyneissä keuhkoissa. Luonnollista PS:a on kuvailtu "lipoproteiini-kompleksina", koska se sisältää sekä fosfolipidejä että apoproteiineja, jotka vuorovaikuttavat alen-15 taen pintajännitystä keuhkojen ilmaneste-rajapinnassa.

Pulmonaalisurfaktantin keksimisestä lähtien ja myöhemmän havainnon jälkeen, että sen puutos oli pääsyynä neonataaliseen (vastasyntyneen) hengitysahdistus syndroomaan (RDS, respiratory distress syndrome), joitakin tutkimuksia on kohdistettu te-20 hokkaan korvaavan surfaktanttihoidon kehittämiseen taudin vaivaamille henkilöille, :* , erityisesti imeväisille, käyttäen eksogeenistä PS:a. Esimerkiksi, parannuksia keuh- kotoiminnassa, mitattuna hengitystiehyeen keskipaineen alenemisena ja hapentarpeina, on osoitettu käyttäen eksogeenisiä surfaktantteja ihmislapsissa ennen synny-tyshetkeä. Katso Haliman, et ai, Pediatrics, 71:473-482 (1983); Merritt, et ai, J. 25 Pediatr., 108:741-745 (1986); Haliman, et ai, J. Pediatr., 106:963-969 (1985); [ . Morley, et ai, Lancet,i:64-68 (1981); Merritt, et ai, New England J. Med., 315:785- *·*·* 790 (1986); Smyth, et ai, Pediatrics, 71:913-917 (1983); Enhoming, et ai, Pediat rics, 76:145-153 (1985); Fujiwara, et ai, The Lancet, 1:55-59 (1980); Kwong, et ai, \V Pediatrics, 76:585-592 (1985); Shapiro, et ai, Pediatrics, 76:593-599 (1985); Fuji-

IM

v ’ 30 wara, teoksessa "Pulmonary Surfactant", Robertson, B., Van Golde, L.M.G., Ba- ^ tenburg J. (ed), Elsevier Science Publishers, Amsterdam, s. 479-503, (1984).

• M • ·

Farmakologiselta kannalta katsottuna optimaalinen eksogeeninen PS käytettäväksi ·.·.· RDS:n hoidossa on sellainen PS, joka on kokonaan syntetisoitu laboratoriossa, ; 35 hallituissa ja steriileissä olosuhteissa, ominaisuuksien vaihtelevuuksien ollessa hä viävän pieniä erästä toiseen. Immunologisten komplikaatioiden mahdollisuuden minimoimiseksi eksogeenisen PS.n apoproteiini-komponentin tulisi olla identtinen 2 102180 ihmisillä tavattavan komponentin kanssa. Luonnollisena esiintyvän PS:n koostumus on valitettavasti kompleksinen, ja tieteenalalla ei vielä ole identifioitu kaikkia biokemiallisia komponentteja, jotka synnyttävät keuhkojen korkean fysiologisen aktiivisuuden tarvitsemia biofysikaalisia ominaisuuksia. Tieteenalalla on erityisesti epä-5 onnistuttu karakterisoimaan kaikki apoproteiinit, joita on läsnä luonnollisessa PS.ssa tai identifioimaan tällä hetkellä tunnettujen PS-apoproteiinien toimintaa.

Huomattava on, että PS-apoproteiineja ja niiden merkitystä surfaktantin toiminnassa käsittelevä kirjallisuus on moninaista, ristiriitaista ja joskus vastakkaista, koska he-10 terogeenisiä apoproteiinivalmisteita käytettiin monessa tutkimuksessa. Tähän päivään mennessä tieteenalalla ei ole osoitettu täsmällisesti luonnollisessa PS:ssa läsnä olevien eri apoproteiinien lukumäärää.

Erityisen kiinnostuksen kohde esillä olevan keksinnön kannalta on ihmisen pieni-15 molekyylipainoisen (LMW) PS:ään liittyvän apoproteiinin käyttäminen kompo nenttina eksogeenisessä surfaktantissa. Useissa tutkimuksissa on yritetty eristää tai määritellä ihmisen PS-LMW-apoproteiineja käyttäen biokemiallisia menetelmiä. Katso esimerkiksi, Phizackerley, et ai, Biochem. J., 183:731-736 (1979), Revak, et ai, Am. Rev. Resp. Dis., 134:1258-1265 (1986), Suzuki, et ai, Eur. J. Respir. Dis., 20 69:335-345 (1986), Taeusch, et ai, Pediatrics, 77:572-581 (1986), Yu, et ai,

Biochem. J., 236:85-89 (1986), Whitsett, et ai, Pediatric Res., 20:460-467 (1986), Whitsett, et ai, Pediatric Res., 20:744-749 (1986), Takahashi, et ai, Biochem. Biophys. Res. Comm., 135:527-532 (1986) Suzuki, et ai, Exp. Lung. Res., 11:61-73 (1986), Curstedt, et ai, Eur. J. Biochem., 168:255-262 (1987), Notter, et ai, : 25 Chem. Phys. Lipids, 44:1-17 (1987) ja Phelps, et ai, Am. Rev. Respir. Dis., ;y. 135:1112-1117(1987).

• « . . Tieteenalalla on viime aikoina alettu käyttää yhdistelmä-DNA-tekniikan menetel- ♦ · · M miä ongelmien ratkaisemiseksi, jotka liittyvät siihen, että ei kyetä eristämään ho- • · · * 30 mogeenisina yksittäisiä LMW-PS-apoproteiineja. Glasser, et ai, Proc. Natl. Acad.

: *·. Sei., USA, 84:4007-4011 (1987) toi esille cDNA-peräisen aminohappotähdesek- :***: venssin, joka muodostaa ainakin osan ihmisen esiasteisesta proteiinista, josta vähin- /. tään yksi valmis toimiva LMW-apoproteiini, jota tutkijat nimittivät SPL(Phe):ksi, ; muodostetaan. Vaikka Glasser, et ai eivät kyenneet määrittämään SPL(Phe):n kar- • · 35 boksiterminaalista tähdettä, eivätkä sen vuoksi kyenneet identifioimaan sen täydel listä sekvenssiä, he ennustivat, että valmiin SPL(Phe):n pituus oli noin 60 aminohappoa.

102180

O

.3

Jacobs, et ai, J. Biol. Chem., 262:9808-9811 (1987) ovat kuvailleet cDNA:ta ja selvittäneet aminohappotähdesekvenssin ihmisen prekursoriproteiinille, joka on Glasser'in et ai (edellä) kuvaileman kaltainen. Jacobs et al.'n mukaan valmis LMW-apoproteiini, jota nimitettiin PSP-B:ksi, muodostuneena prekursorista, olisi kuiten-5 kin pituudeltaan 76 aminohappotähdettä. Jacobs et ai. havaitsivat lisäksi, että ei ollut selvää, että kaikki esille tuodusta prekursoriproteiinista peräisin oleva PS-apoproteiini oli läsnä surfaktanttivalmisteissa, joita muut olivat tutkineet kliinisesti.

Edellä olevasta voidaan todeta, että kirjallisuus sisältää moninaisen terminologian 10 koskien ilmeisesti samaa PS-apoproteiinia. Keskustelun helpottamiseksi valmiiseen apoproteiiniin, joka on peräisin prekursoriproteiinista, jota Glasser, et ai, edellä, ja Jacobs, et ai, edellä, ovat kuvailleet, viitataan tässä yhteydessä sen vuoksi yleisesti nimellä "SP 18", monoineerisen ja dimeerisen muodon viitenimien ollessa "SP 18-monomeeri" ja "SP18-dimeeri", vastaavasti, silloin kun se on tarkoituksenmukaista.

15

Koiran SP18-prekursoria ovat kuvailleet Hawgood, et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:66-70 (1987) ja Schilling, et ai, kansainvälinen patenttihakemus WO 86/03408. Tulee kuitenkin panna merkille, että kumpikin noista tutkimuksista sisälsi samaa kyvyttömyyttä määritellä valmis, biologisesti aktiivinen muoto SP 18-20 monomeeristä kuin Glasser’in et ai, edellä, ja Jacobs'in et ai, edellä, tutkimukset.

Wair, et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:7915-7919 (1987) kuvailee cDNA- peräistä, 197 aminohappotähdettä sisältävää sekvenssiä, joka muodostaa prekurso- riproteiinin, josta valmis LMW-apoproteiini, heidän merkitsemänään SP5, muodos- ; ; ; 25 tuu. Samoin kuin tutkimuksissa, joissa yritettiin kuvailla SP18:aa, Warr, et ai, eivät onnistuneet määrittämään prekursoriproteiinisekvenssistä muodostetun valmiin proteiinin karboksiterminaalista tähdettä, eivätkä siten kyenneet täsmällisesti karak- . . terisoimaan SP5:tä.

• · « • · · • · ·· « • · · *·1 2 30 Koska prekursoriproteiinin sisältämä aminohappotähdesekvenssi, josta Warr, et ai, on raportoinut, on erilainen kuin Glasser'in, et ai ja Jacobs'in, et ai, raportoima sek- :***: venssi, näyttää siis siltä, että tieteenalalla on ratkaistu, että luonnollinen PS sisältää • · · Λ vähintään kaksi LMW-apoproteiinia.

· 35 Noiden proteiinien biologisesti aktiiviset muodot ovat kuitenkin jääneet määrittä 2 mättä.

4 102180

Sen jälkeen on todettu, että ihmisen SP 18 on homodimeerinen proteiini (SP 18-dimeeri), jonka toimintavalmiin alayksikköproteiinin (SP18-monomeeri) näennäinen molekyylipaino näyttää olevan noin 9000 daltonia, määritettynä natriumdode-kyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE).

5

On myös havaittu, että ihmisen SP 18 voi toimia aktiivisena aineosana synteettisessä pulmonaalisurfaktantissa muiden aikaisemmin identifioitujen pulmonaalisurfäk-tanttiproteiinien poissa ollessa.

10 Ihmisen toimintavalmiin SP18-monomeeriproteiinin karboksiterminaalinen amino-happotähdesekvenssi on lisäksi määritetty, ja sen luonnossa esiintyvä muoto on siten sen jälkeen saatu selville.

Polypeptidi koostuu pääasiallisesti vähintään kymmenestä aminohappotähteestä ei-15 kä enemmästä kuin noin 60 aminohappotähteestä, joka polypeptidi vastaa sekvenssin osalta ihmisen SP18-monomeerin aminohappotähdesekvenssiä. Polypeptidi sekoitettuna farmaseuttisesti hyväksyttävän fosfolipidin kanssa muodostaa synteettisen surfaktantin, jonka surfaktanttiaktiivisuus on suurempi kuin pelkän fosfolipidin surfaktanttiaktiivisuus.

20

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

. Kuvio 1 esittää 750 nukleotidiä sisältävää cDNA-sekvenssiä (yläpuoliset rivit) ja niistä johdettua aminohappotähdesekvenssiä (alapuoliset rivit). Jokaisen nukleoti-25 dirivin oikeassa laidassa oleva numero esittää jokaisen rivin päässä olevan nukleo-tidin numeerista paikkaa sekvenssissä. Nukleotidit on ryhmitelty kodoneiksi, 15 ko-donia riviä kohti, jokaisen kodonin koodittaman aminohappotähteen ollessa esi- • · · *·*·* tettynä kolmikirjainkoodina välittömästi kodonin alapuolella. Joidenkin cDNA:n koodittamien tähteiden numeerinen asema aminohappotähdesekvenssissä on esitet- • · \v 30 tynä tähteiden alapuolella. Ihmisen valmiin SP18-monomeerin aminoterminaalinen • · · V · aminohappotähde on Phe (nukleotidien 187-189 koodittama), ja sitä merkitään täh- :·* denumerolla 1. Karboksiterminaalinen aminohappotähde on Asp tähdepaikan 81 • · · kohdalla (nukleotidien 427-429 koodittama). Valmiin SP18-monomeerin koodin si-sältävä rakennegeeni sisältää siis 81 kodonia ja sisältää nukleotidisekvenssin, joka ; : 35 vastaa nukleotidejä 187-429.

5 102180

Kuvio 2 esittää PS-apoproteiinien proteiinieluutioprofiilia Bio-Sil HA (piihappo) -kolonnista. Tulokset Pierce'n BCA-proteiinimäärityksestä (kiinteä viiva) ja fosfo-lipidianalyyseistä (katkoviiva) esitetään valikoiduista fraktioista. Kaksi millilitraa (ml) kerättiin fraktiota kohti. Positiivinen proteiinimääritys fraktioissa 28-33 johtuu 5 fosfolipidien läsnäolosta.

Kuvio 3 esittää hopeavärjättyä (Silver stained) SDS-PAGE'a pienimolekyylipainoi-sista (LMW) PS-apoproteiineista. Kaistoissa A ja D näkyy näyte piihappo- tai Sephadex LH 20 -kromatografian jälkeen; molemmat LMW-proteiinit ovat läsnä.

10 Kaistoissa B, C, E ja F näkyy SP18:aa (kaistat B ja E) ja SP9:n (kaistat C ja F) erottuminen kromatografian jälkeen Sephadex LH-60:llä. Molekyylipainostandardit näkyvät kaistalla G. Kaistoilla A-C on pelkistämättömiä näytteitä, kaistat D-F sisältävät identtiset näytteet, jotka on pelkistetty β-merkaptoetanolilla ennen elektroforeesia.

15

Kuvio 4 esittää kanin sikiön keuhkojen ilmantäytön ja ilmanpoiston paine/tilavuus-käyriä 30 minuuttia sen jälkeen kun henkitorvensisäisesti on tiputettu 100 μΐ saliinia (avoimet ympyrät), 2 mg fosfolipidejä (PL) DPPC:PG, 3:1 (umpinaiset ympyrät), PL + 10 pg SP9:ää (avoimet neliöt), PL + 10pg SP18:aa (umpinaiset neliöt) tai 2 20 mg ihmisen luonnollista surfaktanttia (umpinaiset kolmiot). Tulokset ilmaistaan 4:n eläimen keskiarvona + yksi keskipoikkeama.

Kuvio 5 esittää kanin sikiön keuhkokudosnäytteitä (125x suurennus, hematoksylii-. : ni-eosiiniväri) käsittelyn jälkeen saliinilla (A), ihmisen luonnollisella surfaktantilla 25 (B), fosfolipideillä DPPC:PG (C) tai fosfolipideillä plus LMW-apoproteiineilla (SP9 + SP18) (D).

• · • · · • · «

Kuvio 6 esittää esillä olevan keksinnön mukaisten, tyypillisen polypeptidin sisältä-. , vien synteettisten suifaktanttien suifaktanttiaktiivisuutta. Surfaktanttiaktiivisuus • a · 30 määritettiin mittaamalla paineen muutos ilma/nesterajapinnan ylitse käyttäen il- • · · V * manpulputusmenetelmää. Paineen muutos (5P) kuplapinnan poikki on paineen ab- soluuttiarvo mitattuna senttimetreinä H20:ta. Jokaiselle synteettiselle pulmonaali- • surfaktantille saadut tulokset identifioidaan surfaktantin sisältämän polypeptidin avulla. Tulokset, jotka on saatu surfaktanteille, jotka sisältävät pelkkää fosfolipidiä 35 (so. ilman, että peptidiä tai proteiinia on sekoitettu siihen), identifioidaan PL:nä.

’· ' ' Tulokset, jotka on saatu käyttäen kontrollipeptidiä, joka sisältää vain 8 aminohappo tähdettä, ja joka sisältää sekvenssin, joka vastaa ihmisen SP18-monomeerin tähteitä 6 102180 74-81 (p74-81), esitetään myös. Tulosten aikapisteet saatiin 15 sekunnin, 1 minuutin ja 5 minuutin kohdalla.

Kuvio 7 käsittää kahden diagrammin ryhmän, jossa esitetään tuloksia staattisesta 5 mukautumistutkimuksesta koskien tämän keksinnön mukaisia tyypillisiä synteettisiä suifaktantteja, käyttäen aikaisemmin kuvailtua kanin sikiön mallia julkaisusta Re-vak, et ai, Am. Rev. Respir. Dis., 134:1258-1265 (1986). Synteettisen surfaktantin tai kontrollin henkitorveen tiputtamisen jälkeen kania keuhkotuuletettiin 30 minuutin ajan ennen staattisten mukautumismittausten suorittamista. "x"-akseli esittää 10 painetta cm:inä vettä, kun taas "y "-akseli esittää tilavuutta ml:ina/kg kehonpainoa. Vasemmalla puolella oleva graafinen esitys kuvaa arvoja ilmantäytössä, ja oikealla puolella oleva graafinen esitys kuvaa ilmanpoistoon liittyviä arvoja. Tuloksia kuvataan seuraavien testattujen suifaktanttien osalta: luonnollinen surfaktantti (avoimet neliöt, joissa piste keskellä), fosfolipidi (PL), joka sisältää 7 % p52-81:tä 15 (polypeptidi, joka vastaa SP18:ssa tähteitä 52-81) (umpinaiset vinoneliöt); PL, joka sisältää 3 % p52-81 :tä (umpinaiset neliöt, joissa valkoinen piste keskellä); PL, joka sisältää 7 % p36-81:tä (avoimet vinoneliöt); PL, joka sisältää 3 % p66-81:tä (umpinaiset neliöt); PL, joka sisältää 3 % p 1-15:tä (avoimet neliöt) ja PL-kontrolli (umpinaiset kolmiot).

20

Kuvio 8 käsittää kahden diagrammin ryhmän, jossa esitetään tuloksia staattisesta mukautumistutkimuksesta koskien keksinnön mukaisia tyypillisiä synteettisiä sur- faktantteja. Menettely suoritettiin kuten kuviossa 7 on kuvailtu, paitsi että käytettiin . ; eri tiputustapaa. "x"- ja "y"-akselit ja oikeanpuoleinen ja vasemmanpuoleinen graa- • ·· 25 fmen esitys ovat kuten kuviossa 7 on kuvailtu. Tuloksia kuvataan seuraavien testat- ·«·· tujen suifaktanttien osalta: luonnollinen surfaktantti (avoimet neliöt, joissa piste keskellä); fosfolipidi (PL), joka sisältää 10 % p51-81 :tä (umpinaiset vinoneliöt); PL, joka sisältää 10 % p51 -76:ta (umpinaiset neliöt); ja PL (umpinaiset kolmiot).

« · • · « ****.’ 30 A. Määritelmiä • « · • · ·

Aminohappo: Kaikki tässä identifioidut aminohappotähteet ovat luonnollisessa L-konfiguraatiossa. Noudattamalla polypeptidien standardinimistöä, J. Biol. Chem., 243:3557-59, (1969), aminohappotähteiden lyhenteet ovat seuraavassa vas-’;*·* 35 taavuustaulukossa esitetyn mukaiset:

Vastaavuustaulukko 7 102180

Symboli Aminohappo 1-kirjaiminen 3-kirjaiminen 5 Y Tyr L-tyrosiini G Gly L-glysiini F Phe L-fenyylialaniini M Met L-metioniini A Ala L-alaniini 10 S Sei' L-seriini I Ile L-isoleusiini L Leu L-leusiini T Thr L-treoniini V Vai L-valiini 15 P Pro L-proliini K Lys L-lysiini H His L-histidiini Q Gin L-glutamiini E Glu L-glutamiinihappo 20 W Tip L-tiyptofaani R Arg L-arginiini D Asp L-asparagiinihappo N Asn L-asparagiini ; C Cys L-kysteiini :· 25 ···· :*·*: Tulee panna merkille, että kaikki aminohappotähdesekvenssit esitetään tässä yhtey- dessä kaavoilla, joiden vasemmalta oikealle suuntautuvuus on tavanomaiseen • « # suuntaan aminopäästä karboksipäähän. Lisäksi tulee huomata, että viiva ammohap- potähdesekvenssin alussa tai lopussa esittää sidosta ryhmään, kuten H ja OH (vety *.*. 30 ja hydroksyyli), amino-ja karboksipäissä, vastaavasti, tai yhden tai useamman ami- *\ * nohappotähteen sisältävää lisäsekvenssiä. Lisäksi tulee huomata, että vino pystyvii- : *.· va (/) tähdesekvenssin oikeanpuoleisessa päässä osoittaa, että sekvenssi jatkuu seu- : laavalla rivillä.

! 35 Polypeptidi ja peptidi: Polypeptidi ja peptidi ovat ilmaisuja, joita tässä on käytetty ' · : vaihtovuoroisesti tarkoitettaessa enintään noin 60 aminohappotähteen muodostamaa 8 102180 lineaarista jaksoa, jotka tähteet ovat kytkeytyneet toisiinsa peptidisidoksilla vierekkäisten tähteiden alfa-amino-ja karboksiryhmien välillä.

Proteiini: Proteiini on ilmaisu, jota tässä on käytetty tarkoitettaessa enemmän kuin 5 noin 60 aminohappotähdettä käsittävää lineaarista jaksoa, jotka ovat kytkeytyneet toisiinsa kuten polypeptidissä.

Nukleotidi: DNA:n tai RNA:n monomeeriyksikkö, joka koostuu sokeriosasta (pentoosi), fosfaatista ja typellisestä heterosyklisestä emäksestä. Emäs on kytkeyty-10 nyt sokeriosaan glykosidisen hiilen (pentoosin 1 ’-hiili) välityksellä, ja tuo emäksen ja sokerin yhdistelmä on nukleosidi. Kun nukleosidi sisältää fosfaattiryhmän sitoutuneena pentoosin 3'- tai 5'-asemaan, sitä nimitetään nukleotidiksi.

Emäspari (ep): Adeniinin (A) tymiinin (T) kanssa, tai sytosiinin (C) guaniinin (G) 15 kanssa muodostama vastinpari kaksijuosteisessa DNA-molekyylissä.

B. Polypeptidin "surfaktanttiaktiivisuus" määritellään kykynä, ollessaan yhdistettyinä lipideihin, joko yksin tai yhdessä muiden proteiinien kanssa, osoittaa aktiivisuutta Robertson'in in vivo -määrityksessä, Lung, 158:57-68 (1980). Tässä määri-20 tyksessä määritettävää näytettä annetaan henkitorvensisäisen putken kautta sikiö-kautisille kaneille tai karitsoille, jotka on vapautettu ennenaikaisesti keisari-leikkauksella. (Näiltä "keskosilta" puuttuu oma PS, ja niitä ylläpidetään keuhkotuu-letuskoneessa.) Mittaukset, jotka kohdistuvat keuhkojen mukautumiseen, veren kaasuihin ja tuuletuskoneen paineeseen, antavat käyttöön aktiivisuuden vertauslukuja. 25 Alustava arviointi aktiivisuudesta voidaan myös suorittaa in vitro -määrityksen :1·1: avulla, esimerkiksi King'in et ai, määrityksellä, Am. J. Physiol., 223:715-726 (1972), tai määrityksellä, jota kuvataan jäljempänä, jossa käytetään hyväksi pinta- • · jännityksen mittaamista ilma-vesi-rajapinnassa, kun polypeptidi sekoitetaan fos-folipidin kanssa.

• · · 3o • · · • · · 1·· C. Poly peptidit c · .'. Esillä olevan keksinnön mukaiselle polypeptidille (kohteena oleva polypeptidi) on 35 tunnusomaista sen aminohappotähdesekvenssi ja uudet toiminnalliset ominaisuudet. Kohteena oleva polypeptidi, sekoitettuna farmaseuttisesti hyväksyttävän fosfolipi-din kanssa, muodostaa synteettisen pulmonaalisurfaktantin, jonka surfaktanttiaktii- 9 102180 visuus on suurempi kuin pelkän fosfolipidin suifaktanttiaktiivisuus (kuten alhaisempi 5P osoittaa, kuten on esitetty kuviossa 6, ja suurempi tilavuus tiettyä painetta kohti osoittaa, kuten on esitetty kuvioissa 7 ja 8).

5 Kuten kuviosta 1 nähdään, SP 18 sisältää laajan hydrofobisen alueen (tähteet 1 -noin 75), jonka jälkeen tulee suhteellisen lyhyt hydrofiilinen alue karboksipäässä (tähteet 76-80, tai -81). Viitattaessa SP18-sekvenssin aminohappotähdenumeroihin, nuo tähteet ovat kuten kuviossa 1 on esitetty.

10 Yhden suoritusmuodon mukaan esillä oleva polypeptidi sisältää pääasiallisesti vähintään noin 10, edullisesti vähintään 11 aminohappotähdettä, eikä enempää kuin noin 60, tavallisemmin vähemmän kuin noin 35 ja edullisesti vähemmän kuin noin 25 aminohappotähdettä, jotka vastaavat SP18-monomeerin sekvenssiä.

15 Tämän keksinnön mukaisen polypeptidin aminohapposekvenssi vastaa tavallisesti yhtä viereisiä tähteitä sisältävää ryhmää lineaarisessa SP18-sekvenssissä. Polypep-tidejä, jotka kuitenkin vastaavat useampaa kuin yhtä SP18-sekvenssin osaa, tarkastellaan myös. Peptidissä on tavallisesti läsnä vähintään yksi sekvenssi, joka vastaa vähintään kymmentä, edullisesti vähintään viittätoista, SP18:n hydrofobisen 20 alueen viereistä tähdettä. Suuri määrä hydrofobisen alueen aminohapposekvensseistä voi olla läsnä.

Kohteena oleva polypeptidi sisältää edullisesti karboksiterminaalisena sekvenssinään vähintään 5 viereistä tähdettä lineaarisessa SP18-sekvenssissä, mukaan lukien 25 tähde80. Tämän keksinnön mukaiset polypeptidit voivat täten sisältää yhden tai useamman aminohappotähderyhmän, joka vastaa osia SP18:sta niin, että sekvenssi, joka vastaa ensimmäistä, viereisiä tähteitä sisältävää ryhmää SP18-monomeerissä, • · voi olla sekvenssin vieressä, joka vastaa toista, viereisiä tähteitä sisältävää ryhmää samasta tai toisesta SP18-monomeerin osasta polypeptidisekvenssissä. Peptidejä, • ♦ ♦ 30 jotka sisältävät kaksi tai useampia sekvenssejä, jotka vastaavat yhtä, viereisiä ami- » « · \ nohappotähteitä sisältävää ryhmää lineaarisesta SP 18-sekvenssistä, tarkastellaan ·· • 1·· myös.

• « « . · ’ ·. Tyypillisiä edullisia kohteena olevia polypeptidejä, jotka vastaavat aminohappotäh- 35 desekvenssiltään ihmisen SP18-monomeerin hydrofobista aluetta, esitetään taulu- ‘ ' kossa 1.

Taulukko 1 102180 ΙΟ

Merkintä1 Aminohappotähdesekvenssi pl-15 FPIPLPYCWLCRAL1

5 p 11-25 C RALIKRIQ AMIPKG

p21-35 MIPKGALAVAVAQVC

p31-45 VAQVCRVVPLVAGGI

p41 -55 VAGGICQCLAERYS V

p46-76 CQCLAERYSVILLDTLLGRMLPQLVCRLVLR

10 p51-65 ERYSV1LLDTLLGRM

p51 -72 ERYS VILLDTLLGRMLPQLVCR

p51 -76 ERYSVILLDTLLGRMLPQLVCRLVLR

p54-72 S VILLDTLLGRMLPQLVCR

p54-76 SVILLDTLLGRMLPQLVCRLVLR

15 p61-75 LLGRMLPQLVCRLVL

1 Jokaisen peptidin merkintä osoittaa sen osan ihmisen SP18-monomeerin amino-happotähdesekvenssistä, kuten kuviossa 1 on esitetty, jota peptidisekvenssi vastaa, so. se osoittaa peptidisekvenssin sijainnin proteiinisekvenssissä.

20

Edullisissa suoritusmuodoissa kohteena olevalle polypeptidille on edelleen tunnusomaista se, että se sisältää karboksiterminaalisen aminohappotähdesekvenssin, jota edustaa kaava: 25 -RLVLRCSMDDZ, »««« ·«· • · · • · · ljossa kaavassa Z on kokonaisluku, jonka arvo on 0-1 siten, että kun Z on 0, D-tähde, jonka alaindeksi Z on, ei ole läsnä, ja kun Z on 1, D-tähde, jonka alaindeksi Z on, on läsnä. Tyypillisiä edullisia "karboksiterminaalisia polypeptidejä" esitetään 30 taulukossa 2.

• · · • · · • · · 1 · • · « · ♦ 11 102180

Taulukko 2

Merkintä Aminohappotähdesekvenssi

p71-81 CRLVLRCSMDD

5 p66-81 LPQLVCRLVLRCSMDD

p59-81 DTLLGRMLPQLVCRLVLRCSMDD

p52-81 RYS VILLDTLLGRMLPQLVCRLVLRCSMDD

p51-81 ERYSVILLDTLLGRMLPQLVCRLVLRCSMDD

p51 -80 ERYSVILLDTLLGRMLPQLVCRLVLRCSMD

10 p36-81 RVVPLVAGGICQCLAERYSVILLDTLLGRMLPQLVCRLVLRCSMDD

p32-81 AQVCRVVPLVAGGICQCLAERYSVILLDTLLGRMLPQLVCRLVLRCSMDD

1 Merkintä on sama kuin taulukossa 1.

15 Kohteena oleva polypeptidi sisältää edullisesti aminohappotähdesekvenssin, joka vastaa osaa kuviossa 1 esitetystä sekvenssistä. Tulisi kuitenkin ymmärtää, että esillä olevan keksinnön mukaisen polypeptidin ei tarvitse olla identtinen natiivin SP 18-monomeerin aminohappotähdesekvenssin kanssa. Esillä olevan keksinnön mukainen polypeptidi voi sen vuoksi olla kohteena erilaisille muutoksille, kuten liittämi-20 set, poistamiset ja korvaamiset, joko säilyttäville tai ei-säilyttäville, missä sellaiset muutokset tuovat tiettyjä etuja niiden käytössä.

Säilyttävät korvaamiset ovat niitä, joissa yksi aminohappotähde korvataan toisella, : biologisesti samanlaisella tähteellä. Esimerkkeihin säilyttävistä korvaamisista lukeu- ·· 25 tuvat yhden hydrofobisen tähteen korvautuminen, kuten esimerkiksi isoleusiinin, • · · · valiinin, leusiinin tai metioniinin, toisella, tai yhden polaarisen tähteen korvautumi-nen toisella, kuten esimerkiksi arginiinin ja lysiinin kesken, glutamiini-ja aspara- • · ♦ giinihappojen kesken tai glutamiinin ja asparagiinin kesken ja vastaavien kesken. . . Ilmaisu "säilyttävä korvaaminen" sisältää myös substituoidun aminohapon käyttä- 30 misen substituoimattoman alkuperäisen aminohapon paikalla edellyttäen, että sei- φ · i *·] ’ lainen polypeptidi myös osoittaa tarvittavaa sitoutumisaktiivisuutta.

·· • · • · ·

Yhdessä edullisessa suoritusmuodossa kysteiini (C) -tähde korvataan seriini (S) -tähteellä, tavallisesti vähintään toinen tähdepaikoista 71 ja 77. Seriinianalogi sisäl-*;' ' 35 tää edullisesti sekvenssin, joka vastaa SP18-monomeerin tähteiden 51-76 muodos- ' tamaa sekvenssiä, korvautumisen ollessa tähde71:n kohdalla, tai tähteiden 51-81 muodostamaa sekvenssiä, seriinisubstituutioiden ollessa kohdissa 71 ja 77.

12 102180

Kun esillä olevan keksinnön mukainen polypeptidi sisältää sekvenssin, joka ei ole identtinen natiivin SP18-monomeerin sekvenssin kanssa, koska on suoritettu yksi tai useampia säilyttäviä tai ei-säilyttäviä korvaamisia, ei tavallisesti korvata enempää kuin noin 20 määräprosenttia eikä tavallisemmin enempää kuin noin 10 määrä-5 prosenttia aminohappotähteistä, paitsi siellä, missä lisätähteitä on lisätty jompaankumpaan päähän, kuten tarkoituksessa tuottaa "linkkeri", jonka avulla tämän keksinnön mukaiset polypeptidit voidaan sopivasti liittää merkkiaineeseen tai kiinteään matriisiin tai kantajaan. Merkkiaineita, kiinteitä matriiseja ja kantajia, joita voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisten polypeptidien kanssa, kuvaillaan jäljempänä.

10

Aminohappotähdelinkkerit käsittävät tavallisesti vähintään yhden tähteen, ja ne voivat käsittää 40 tähdettä tai enemmän, useammin 1-10 tähdettä, jotka eivät vastaa aminohapposekvenssiltään natiivia SP18-monomeeriä. Tyypillisiä yhdistämiseen käytettyjä aminohappotähteitä ovat tyrosiini, kysteiini, lysiini, glutamiini- ja aspa- 15 ragiinihappo tai vastaavat. Tämän keksinnön mukainen polypeptidisekvenssi voi lisäksi poiketa luonnollisesta sekvenssistä, sekvenssin ollessa modifioitu terminaalisen NH2:n asylaatiolla, esim. asetylaatiolla, tai tioglykolihappoamidaatiolla, terminaalisen karboksyylin amidaatiolla, esim. ammoniakilla, metyyliamiinilla jne.

20 Ollessaan liitettynä kantajaan linkkerin välityksellä muodostaen sen, mikä alalla tunnetaan kantaja-hapteeni-konjugaattina, esillä olevan keksinnön mukainen polypeptidi pystyy indusoimaan vasta-aineita, jotka immunoreagoivat SP18-monomee-. .: iin kanssa. Ottamalla huomioon hyvin tunnettu immunologisen ristireaktiivisuuden : toimintaperiaate esillä olevan keksinnön mukaisesti tarkastellaan sen vuoksi taulu- ·· 25 kossa 1 ja 2 esitettyjen polypeptidien antigeenisesti yhteenkuuluvia muunnoksia.

"Antigeenisesti yhteenkuuluva muunnos" on polypeptidi, joka sisältää vähintään kuusi aminohappotähdettä sisältävän sekvenssiosan taulukon 1 tai taulukon 2 mukaisesta polypeptidistä ja joka pystyy indusoimaan vasta-ainemolekyylejä, jotka >v< reagoivat immunologisesti taulukon 1 tai 2 mukaisen polypeptidin ja SP18-mono-

• · I

30 meerin kanssa.

• · « • · ·

Toisessa suoritusmuodossa tämän keksinnön mukainen polypeptidi sisältää amino-happotähdesekvenssin, jonka yhdistetty hydrofobisuus on vähemmän kuin nolla, edullisesti vähemmän tai yhtä suuri kuin -1, edullisemmin vähemmän tai yhtä suuri 35 kuin -2. Yhdistetyn hydrofobisuusarvon määrittämistä peptidille kuvaillaan yksi-• · tyiskohtaisesti esimerkissä 2. Nämä hydrofobiset polypeptidit suorittavat SP 18- monomeerin hydrofobisen alueen tehtävää. Edullisessa suoritusmuodossa amino- 13 102180 happosekvenssi jäljittelee SP18-monomeerin hydrofobisten ja hydrofiilisten tähteiden rakennemallia.

Edullinen hydrofobinen polypeptidi sisältää sekvenssin, joka sisältää vuorottelevia 5 hydrofobisia ja hydrofiilisiä aminohappotähdealueita, ja se sisältää tunnusomaisesti vähintään 10 aminohappotähdettä, joita esittää oheinen kaava: (Zaub)czd 10 Z ja U ovat aminohappotähteitä siten, että kussakin tapauksessa Z ja U valitaan toisistaan riippumatta. Z on hydrofiilinen aminohappotähde, joka on edullisesti valikoitu ryhmästä, johon kuuluvat R, D, E ja K. U on hydrofobinen aminohappotähde, joka on edullisesti valikoitu lyhmästä, johon kuuluvat V, I, L, C, Y ja F. "a", "b", "c" ja "d" ovat lukuja, jotka osoittavat hydrofiilisten tai hydrofobisten tähteiden lu-15 kumäärän. "a":n arvo on keskimäärin noin 1 - noin 5, edullisesti noin 1 - noin 3. "b":n aivo on keskimäärin noin 3 - noin 20, edullisesti noin 3 - noin 12, edullisimmin noin 3 - noin 10. "c" on 1-10, edullisesti 2-10, edullisimmin 3-6. "d" on 1-3, edullisesti 1-2.

20 Toteamalla, että Z.lla ja U.lla esitettävä aminohappotähde valitaan itsenäisesti, tarkoitetaan sitä, että kussakin tapauksessa tähde valitaan määrätystä ryhmästä. Se tarkoittaa sitä, että kun "a" on esimerkiksi 2, jokainen Z:lla esitettävistä hydrofiilisistä tähteistä valitaan itsenäisesti, ja kuhunkin voi siten lukeutua RR, RD, RE, RK, DR, . : DD, DE, DK jne. Esittämällä, että "a":n ja "b":n arvot ovat keskimääräisiä, tarkoite- ·· 25 taan sitä, että vaikka tähteiden määrä toistuvassa sekvenssissä (ZaUb) voi vaihdella • · * · jonkin veoan peptidisekvenssin sisällä, "a":n ja "b":n keskimääräiset arvot ovat noin 1 - noin 5 ia noin 3 - noin 20, vastaavasti.

• * <Vt Edellä olevan kaavan mukaisia tyypillisiä edullisia polypeptidejä esitetään taulu- 30 kossa3.

• · · • · · ·· • « • «♦ • ·

Taulukko 3 14 102180

Merkintä1 Aminohappotähdesekvenssi

DL4 DLLLLDLLLLDLLLLDLLLLD

5 RL4 RLLLLRLLLLRLLLLRLLLLR

RL8 RLLLLLLLLRLLLLLLLLRLL

RL7 RRLLLLLLLRRLLLLLLLRRL

RCL1 RLLLLCLLLRLLLLCLLLR

RCL2 RLLLLCLLLRLLLLCLLLRLL

10 RCL3 RLLLLCLLLRLLLLCLLLRLLLLCLLLR

1 Merkintä on lyhenne esitetystä aminohappotähdesekvenssistä.

Keksinnön mukaisesti tarkastellaan myös yhdistettyjä polypeptidejä, jotka sisältävät 15 10-60 aminohappotähdettä. Yhdistetty polypeptidi koostuu pääasiallisesti aminoter- minaalisesta sekvenssistä ja karboksiterminaalisesta sekvenssistä. Aminoterminaali-nen sekvenssi sisältää tämän keksinnön mukaisen hydrofobisen polypeptidialueen tai hydrofobisen peptidin aminohapposekvenssin, edullisesti hydrofobisen polypep-tidin, kuten on määritelty edellä olevassa kaavassa. Karboksiterminaalinen sekvens-20 si sisältää kohteena olevan karboksiterminaalisen peptidin aminohappotähdesek- venssin.

Esillä olevan keksinnön mukainen polypeptidi voidaan syntetisoida millä tahansa menetelmällä, joka on polypeptidialaa tuntevien tiedossa. Erinomaisen tiivistelmän 25 monesta saatavilla olevasta menetelmästä voi löytää julkaisuista J. M. Steward ja :T: J. D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W. H. Freeman Co., San Francisco, 1969, ja J. Meienhofer, "Flormonal Proteins and Peptides", Vol. 2, s. 46, Academic Press (New York), 1983, kiinteäfaasisen peptidisynteesin osalta, ja E. Schroder ja K. Kubke, "The Peptides", Voi. 1, Academic Press (New York), 1965, klassisen 30 liuossynteesin osalta.

i « « • · r **· Nämä menetelmät käsittävät yleensä yhden tai useamman aminohappotähteen tai « « < sopivasti suojatun aminohappotähteen lisäämisen kasvavaan peptidiketjuun. Joko , ·. amino- tai karboksyyliryhmä ensimmäisestä aminohappotähteestä suojataan tavalli- 35 sesti sopivan, selektiivisesti poistettavan suojaryhmän avulla. Erilaista, selektiivisesti poistettavaa suojaryhmää käytetään hyväksi aminohapoissa, jotka sisältävät reaktiivisen sivuryhmän, kuten esimerkiksi lysiinin osalta.

15 102180 Käyttämällä kiinteäfaasisynteesiä esimerkkinä suojattu aminohappo tai aminohap-pojohdannainen kiinnitetään ineittiin kiinteään kantajaan suojaamattoman karbok-syyli- tai aminoryhmän välityksellä. Amino- tai karboksyyliryhmän suojaryhmä poistetaan sen jälkeen selektiivisesti, ja seuraava aminohappo sekvenssissä, joka si-5 sältää vapaan ryhmän (amino tai karboksyyli) sopivasti suojattuna, sekoitetaan, ja sen annetaan reagoida kiinteään kantajaan jo kiinnitetyn tähteen kanssa olosuhteissa, jotka ovat sopivat amidisidoksen muodostamiseksi. Amino- tai karboksyyliryhmän suojaryhmä poistetaan sen jälkeen tästä vasta lisätystä aminohappotähteestä, ja seuraava aminohappo (sopivasti suojattu) lisätään sen jälkeen ja niin edelleen. Sen 10 jälkeen kun kaikki halutut aminohapot on liitetty oikeassa järjestyksessä, kaikki jäljellä olevat terminaaliset ja sivuryhmää suojaavat tyhmät (ja kiinteä kantaja) poistetaan perättäisesti tai samanaikaisesti, jolloin saadaan valmis polypeptidi.

D. Synteettiset surfaktantit 15

Polypeptidi voidaan sekoittaa farmaseuttisesti hyväksyttävän fosfolipidin kanssa synteettisen pulmonaalisurfaktantin (PS) muodostamiseksi, joka on käyttökelpoinen hoidettaessa hengitysahdistussyndroomaa.

20 Ilmaisu "farmaseuttisesti hyväksyttävä" tarkoittaa molekyylikokonaisuuksia ja koostumuksia, jotka eivät aiheuta allergista tai vastaavaa kiusallista reaktiota annet-taessa ihmiselle.

;. Fosfolipidit, jotka ovat käyttökelpoisia muodostettaessa synteettisiä keuhkorakku- 25 lasurfaktantteja proteiinin kanssa sekoittaen, ovat alalla hyvin tunnettuja. Katso • · ·

Notter, et ai, Clin. Perinatology, 14:433-79 (1987), katsaus sekä natiivien että syn- • · · * 1 teettisten fosfolipidien käytöstä synteettisissä surfaktanteissa.

· • · · ’·]·’ Yhdessä suoritusmuodossa esillä olevan keksinnön mukaan tarkastellaan synteettis- *.· 1 30 tä pulmonaalisurfaktanttia, joka on tehokas hoidettaessa RDS:aa, joka surfaktantti ·1·.. käsittää tehokkaan määrän kohteena olevaa polypeptidiä sekoitettuna farmaseutti- .···. sesti hyväksyttävän fosfolipidin kanssa. Vaikkakin menetelmät optimaalisten poly peptidi :fosfolipidi -painosuhteiden määrittämiseksi tietylle polypeptidi-fosfolipi-diyhdistelmälle ovat hyvin tunnettuja, terapeuttisesti tehokkaat määrät ovat alueella : 35 noin l:5-noin 1:10 000, edullisesti noin l:100-noin 1:5000, ja edullisemmin noin 1:500 - noin 1:1000. Edullisemmassa suoritusmuodossa polypeptidi:fosfolipidi -painosuhde on alueella noin 1:5 - noin 1:2000, edullisesti noin 1:7 - noin 1:1000, I6 102180 ja edullisemmin noin 1:10 - noin 1:100. Tämän keksinnön mukainen synteettinen pulmonaalisuifaktantti voi siten sisältää noin 50, tavallisesti noin 80 - noin 100 painoprosenttia lipidiä ja noin 50, tavallisesti noin 20 - alle 1 painoprosenttia polypep-tidiä. Kohteena oleva polypeptidi käsittää edullisesti noin 1 - noin 10 painoprosent-5 tia surfaktantista polypeptidien osalta, jotka vastaavat osia SP18-sekvenssistä, ja 1:100 polypeptidien osalta, jotka vastaavat koko SP18-monomeeriä.

Lipidiosa käsittää edullisesti noin 50 - noin 90, edullisemmin noin 50 - noin 75 painoprosenttia dipalmitoyylifosfatidyylikoliinia (DPPC), lopun ollessa tyydyttämä-10 töntä fosfatidyylikoliinia, fosfatidyyliglyserolia (PG), triasyyliglyseroleja, palmi-tiinihapon sfingomyeliiniä tai niiden seoksia. Synteettistä pulmonaalisuifaktanttia valmistetaan sekoittamalla kohteena olevan polypeptidin liuosta liposomisuspension kanssa tai sekoittamalla kohteena oleva polypeptidi ja lipidit suoraan orgaanisen liuottimen läsnä ollessa. Liuotin poistetaan sen jälkeen dialyysin avulla tai haihdut-15 tamalla typen alla ja/tai alipaineessa.

Kohteena oleva synteettinen pulmonaalisuifaktantti formuloidaan edullisesti henki-torvensisäistä antamista varten esim. tyypillisesti nestemäisenä suspensiona, kuivana jauhe"pölynä" tai aerosolina. Synteettinen suifaktantti (polypeptidi-lipidimisel-20 li) suspendoidaan esimerkiksi nesteeseen, joka sisältää farmaseuttisesti hyväksyttävää täyteainetta kuten vettä, saliinia, dekstroosia, glyserolia ja vastaavia. Sur-faktanttia sisältävä terapeuttinen koostumus voi myös sisältää pieniä määriä ei-tok-: sisia apuaineita kuten pH-puskuriaineet, mukaan lukien natiiumasetaatti, natrium- fosfaatti ja vastaavat. Synteettisen surfaktantin valmistamiseksi pölyn muodossa ; 25 synteettistä surfaktanttia käsitellään kuten edellä on kuvailtu, sen jälkeen lyofilisoi- daan ja otetaan talteen kuivana jauheena.

• · ♦ • « . . Jos kohteena olevaa synteettistä surfaktanttia on tarkoitus käyttää aerosoliantona, se • ♦ · toimitetaan hienojakoisessa muodossa yhdessä toisen surfaktantin ja ponneaineen • · · 30 kanssa. Tyypillisiä suifaktantteja, joita voidaan antaa, ovat rasvahapot ja -esterit. Esillä olevassa tapauksessa on kuitenkin edullista käyttää hyväksi muita surfaktant-tikompleksin, DPPC ja PG, komponentteja. Käyttökelpoiset ponneaineet ovat tavallisesti kaasuja vallitsevissa olosuhteissa, ja ne tiivistyvät paineenalaisina. Alempaa ; ’ alkaania ja Huorattua alkaania, kuten Freon, voidaan käyttää. Aerosoli pakataan as- ' · ’: 35 tiaan, joka on varustettu sopivalla venttiilillä siten, että aineosia voidaan säilyttää paineenalaisina vapauttamiseen saakka.

17 102180

Synteettistä suifaktanttia annetaan, annosmuotoon sopivana, henkitorvensisäisen putken avulla, aerosoliantona tai sumuttamalla suspensiota tai tomua sisäänhengi-tyskaasuun. Synteettistä PS:a annetaan yhtenä annoksena määrällisesti välillä noin 5 1,0 - noin 400 mg/kg, edullisesti noin 50 mg - noin 500 mg/kg. Käytettäessä vasta syntyneille lapsille yhdestä kolmeen antoa on yleensä riittävä. Aikuisille annetaan riittävästi käyttövalmiiksi liuotettua kompleksia normaalialueisen P02:n aikaansaamiseksi (Haliman, et ai, J. Clinical Investigation, 70:673-682, 1982).

10 Natiivin SP18:n eristäminen ja karakterisointi A. Menetelmät LMW-apoproteiinien puhdistaminen

Ihmisen pulmonaalisuifaktanttia eristettiin täysiaikaisesta lapsivedestä ja applikoi-15 tiin (sijoitettiin) DEAE-Sephacel A-50-kolonniin (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi), käyttäen 4 millilitraa (ml) täytetilavuutta 200 milligrammaa (mg) kohti surfaktant-tia, Tris-EDTA-puskurissa, joka sisälsi 1 % n-oktyyli-beeta-D-glukopyranosidia kuten ovat kuvailleet Revak, et ai, Am. Rev. Respir. Dis., 134:1258-1265 (1986) ja Haliman, et ai, Pediatrics, 71:473-482 (1983). Tätä erityistä kolonnia ja erityisiä 20 olosuhteita käytettiin 35 000 daltonia käsittävän apoproteiinin eristämiseksi (muissa : tutkimuksissa käytettäväksi) altistamatta sitä mahdollisesti denaturoiville orgaanisil- : le liuottimille. Välisijatilavuus, joka sisälsi lipidejä ja proteiineja, jotka eivät sitou tuneet kolonniin näissä olosuhteissa, koottiin yhteen ja uutettiin yhtä suurella tila-;: ’ vuudella 2:1 kloroformi :metanolia.

25

Faasien erottamiseksi suoritetun sentrifugoinnin jälkeen ylempi faasi (vesi + meta- • ♦ noli) uutettiin jälleen 1/2:11a tilavuudella kloroformia. Sentrifugoinnin jälkeen tulok-sena saatu alempi orgaaninen faasi lisättiin ensimmäiseen alempaan faasiin ja haih- • « · 1.1 dutettiin kuivaksi typpivirrassa. Tämä uute, joka sisälsi 100-180 mg fosfolipidiä,

• · I

\ 30 LMW-apoproteiineja ja oktyyliglukopyranosidia, liuotettiin uudelleen 2,5 ml:aan • · : *·· kloroformi:metanolia, 2:1.

··· • · « · • · · .·*·. Noudattamalla Takahashi'n, et ai menetelmää, Biochem. Biophys. Res. Comm., 135:527-532 (1986), jonka todettiin antavan oktyyliglukopyranosidille hyvän erot-' 1 35 tumisen LMW-proteiineista ja fosfolipideistä, halkaisijaltaan 2,5 cm:n lasikolonni pakattiin 4°:ssa 38 cm:n kerroskorkeuteen Sephadex LH-20 -täytteellä (Phaimacia, Uppsala, Ruotsi) 2:1 klorofoimi:metanolissa. Näyte ladattiin, ja 2 ml:n fraktioita 18 102180 kerättiin talteen, kun kloroformi:metanolia, 2:1, ajettiin läpi virtausnopeudella 8,5 ml/h. Fosfolipidit eluoituivat sen jälkeen kun 40 ml puskuria oli läpäissyt kolonnin. Oktyyliglukopyranosidia esiintyi 56-116 ml:n alueella.

5 Fosfolipidivyöhyke koottiin yhteen, kuivattiin typen alla, ja liuotettiin uudelleen 1 ml:aan kloroformia. Piihappokolonni valmisteltiin pakkaamalla 9 ml Bio-Sil HA -täytettä (Bio-Rad, Richmond, CA) kloroformissa lasikolonniin huoneen lämpötilassa. Näyte (joka sisälsi suunnilleen 50 mg fosfolipidiä) sijoitettiin kolonniin ja pestiin 11 ml:lla kloroformia. Metanolin suhteen kasvava lineaarinen gradientti valio niistettiin käyttämällä yhtä suurta painomäärää kloroformia ja metanolia (38,8 g, 26,5 ml kloroformia ja 50 ml metanolia). 2 ml.n fraktioita kerättiin, kun gradientti sijoitettiin kolonniin. Kuvio 1 esittää saatuja proteiinin ja fosfolipidin profiileja.

Fosfolipidianalyysit osoittivat pienen piikin fraktioissa 17-20 ja suuren piikin frak-15 tion 30 jälkeen. Pierce'n BCA-proteiinimääritys oli positiivinen fraktioissa 12-19 ja 28-33, mutta tulisi huomata, että jälkimmäinen piikki johtuu todennäköisesti tällä alueella läsnä olevasta fosfolipidistä. Elektroforeesi natriumdodekyylisulfaattipo-lyakryyliamidigeeleissä osoitti, että LMW-apoproteiineja oli läsnä fraktioissa 13-19, jonkin verran erottumista esiintyessä SP9:n ja SP18:n välillä.

20 • ’ Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää Hawgood'in, et ai menetelmää, Proc. Natl. Acad.

Sei., 85:66-70 (1987), jossa käytetään PS:n butanoliuuttoa, jota seuraa kromatogra-; fointi Sephadex LH-20 -kolonnissa happamaksi tehdyssä kloroformi/metanoli- puskurissa, LMW-apoproteiiniseoksen eristämiseksi. Joidenkin tutkimusten kohdal-: 25 la saatiin aikaan kahden LMW-apoproteiinin erottuminen käyttäen Sephadex LH-60 -kolonnia. Halkaisijaltaan 1 cm:n lasikolonni pakattiin 40 cm:iin Sephadex LH-60:llä (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi) kloroformi/metanolissa, 1:1, joka sisälsi 5 % HCl:a. Virtausnopeutta 1-2 ml/h käytettiin. LMW-apoproteiiniseosta, joka sisälsi noin 200-700 mikrogrammaa (pg) proteiinia joko Bio-Sil HA -kolonnista tai • · m 30 LH-20-kolonnista, jota Hawgood et ai. on kuvaillut, Proc. Natl. Acad. Sei., 85:66- • · : *·· 70 (1987), 0,5 ml:n puskuritilavuudessa, sijoitettiin kolonnin yläosaan, ja 0,5 ml:n • · · :„.ϊ fraktioita kerättiin. SP 18-proteiini eluoitui tyypillisesti fraktioissa 16-19 ja SP9 .·!·. fraktioissa 24-29. Sopivat fraktiot koottiin yhteen ja kuivattiin lasiputkissa typen alla. Lyhyt lyofilisointijakso varmisti HCl:n poistamisen. Proteiinit liuotettiin uu-35 delleen metanoliin ennen käyttöä.

19 102180 SDS-geelielektroforeesi

Geelielektroforeesi 16-%:isessa polyakryyliamidissa suoritettiin natriumdodekyyli-sulfaatin läsnä ollessa (SDS-PAGE) Laemmlin menetelmän mukaan, Nature, 5 227:680-685 (1970), käyttäen 3x7 cm:n minilevygeelejä. 1 % β-merkaptoetanolia lisättiin näytteisiin disulfidipelkistysaineiksi ilmaistaessa. Elektroforeesin jälkeen geelejä kiinnitettiin yli yön 50-%:isessa metanolissa + 12-%:isessa etikkahapossa, pestiin vedessä 2 tuntia ja hopeaväijättiin Wray'n et ai. menetelmän mukaisesti, Anal. Biochem., 118:197-203 (1981).

10

Oktyyliglukopyranosidimääritys

Revak, et ai, Am. Rev. Respir. Dis., 134:1258-1265 (1986), on kuvaillut aikaisemmin määritystä n-oktyyli-beeta-D-glukopyranosidin kvantitoimiseksi, joka pe-15 rustuu Spiro'n antronimenetelmään, Methods Enzymol., 8:3-5 (1966).

Proteiinimäaritykset

Orgaanisia näytteitä, jotka sisälsivät 5 pg:aan saakka proteiinia, kuivattiin 20 12x75 mm:n lasiputkissa typen alla. Viisitoista mikrolitraa (μΐ) 1 % SDS:a H20:ssa : ja 300 μΐ BCA-proteiinimääritysreagenssia (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) se koitettiin proteiinin kanssa jokaisessa putkessa. Putket peitettiin, ja niitä inkuboitiin 60 °C:ssa 30 min. Jäähdytyksen jälkeen näytteet siirrettiin 96-kuoppaiselle tasopoh-. jäiselle polystyreeniselle mikrotiitterilevylle, ja OD550 mitattiin. Naudan seerumin : 25 albumiinia käytettiin standardina. Tulisi huomata, että osa fosfolipideistä reagoi BCA-proteiinimäärityksessä, mikä tekee proteiinin kvantitoinneista epätarkkoja, kun lipidiä on läsnä (so. ennen Bio-Sil HA -kromatografointia). Sen lisäksi, hydro-fobiset LMW-apoproteiinit, tultuaan puhdistetuiksi, itse reagoivat heikosti BCA- ,·*:*. reagenssien kanssa, ja kaikki eristettyjä proteiineja koskevat kvantitoinnit perustui- • · · 30 vat sen vuoksi aminohappokoostumuksiin.

• · • · • · ·

Fosfolipidit

Dipalmitoyylifosfatidyylikoliini (DPPC, beeta, gamma-dipalmitoyyli-L-alfa-35 lesitiini) ja L-alfa-fosfatidyyli-DL-glyseroli (PG, munan lesitiinin johdannainen) ostettiin joko Calbiochem-Behring'ltä (La Jolla, CA) tai Avanti Polar-Lipids, Inc.'lta (Birmingham, AL). DPPC lisättiin PG:hen kloroformissa painosuhteessa 3:1.

20 102180 LMW-apoproteiinien sekoittaminen fosfolipidien kanssa

In vitro -määritysten osalta metanoliliuosta, joka sisälsi 4 pg SP9:ää tai SP 18:ta, lisättiin 400 μg:aan DPPC:PG:tä klorofonnissa 12x75 mm:n lasiputkissa. Lyhyen 5 pyörresekoituksen jälkeen näytteet kuivattiin N2:n alla. Yhdeksänkymmentä mik-rolitraa vettä lisättiin jokaiseen näytteeseen ja putket asetettiin 37 °C:iseen vesihauteeseen 15 minuutin ajaksi sekoittaen kevyesti ajoittain. Isotonisuus säädettiin kohdalleen lisäämällä 10 μΐ 9 % NaCl:a jokaiseen näytteeseen ennen määritystä. In vivo -kanimääritysten osalta, 50 pg LMW-apoproteiineja (jotka sisälsivät sekä SP9:ää 10 että SP18:aa) tai 25 pg SP9:ää tai 25 pg SP18:ta kuivattiin N2:n alla. Viisi pg fos-folipidejä (DPPC:PG, 3:1) lisättiin klorofonnissa. Näytteet sekoitettiin, kuivattiin ja resuspendoitiin 250 pl:aan 100 millimolaarista (rnM) saliinia, joka sisälsi 1,5 mM CaCl2:a, jolloin saatiin käyttövalmiiksi tehtyä surfaktanttia pitoisuudessa 20 mg/ml, sisältäen proteiinia 0,5-1 %.

15

Surfaktanttiaktiivisuuden määritykset

Surfaktanttiaktiivisuuden in vitro -määrityksiä, määritettynä sen kyvykkyytenä alentaa sykkivän kuplan pintajännitystä, ja in vivo -määrityksiä, joissa käytetään 20 hyväksi sikiökautisia kaneja, on kumpiakin kuvailtu yksityiskohtaisesti aikaisemmin Revak'in, et ai, toimesta, Am. Rev. Respir. Dis., 134:1258-1265 (1986).

Morfometriset analyysit v ; 25 Sikiökautisen kanin keuhkot, täytettynä ilmalla paineeseen 30 cm H20:ta ja sen jäl- keen säädettynä ilmaa poistamalla paineeseen 10 cm H20:ta, upotettiin 10-%:iseen formaliiniin 72 tunnin ajaksi. Parafiinileikkeet suunnattiin käijestä tyveen, ja 5 p:n ;y. leikkeitä otettiin etuosasta takaosaan. Värjäyksen jälkeen hematoksyliinillä ja eo- • · siinilla 10 kenttää (100 x) pistelaskettiin kärjestä tyveen moninkertaisilla leikkeillä. 30 Standardoituja morfometrisiä menetelmiä (Weiber, teoksessa "Stereological Met-·* ** hods", Voi. I, Academic Press, New York, s. 33-58, 1979) käytettiin keuhkojen ku- dosvälitilan suhteen määrittämiseksi ilmatilaan kunkin käsittelyryhmän osalta.

;; Keuhkorakkulan kehän leikkauskohdat määritettiin myös.

35 21 102180

Fosfolipidin fosforimääritykset

Fosfolipidien määrä määritettiin Bartlett'n menetelmän mukaisesti, J. Biol. Chem., 234:466-468 (1959).

5

Aminohappoanalyysi

Kolminkertaiset aminohappokoostumusnäytteitä hydrolysoitiin HCl:n kanssa 110 °C:ssa 24 tunnin ajan, HCl:n kanssa 150 °C:ssa 24 tunnin ajan, tai permuurahais-10 hapossa 110 °C:ssa 24 tunnin ajan, minkä jälkeen hydrolysoitiin HCkllä 110 °C:ssa 24 tunnin ajan. Analyysit suoritettiin Beckman'in model 121-M amino-happoanalysaattorilla (Beckman Instruments, Fullerton, CA). Tiyptofaania ei määritetty.

15 Aminohapposekvensointi Höyryfaasinen proteiinin sekvensointi suoritettiin Applied Biosystems'n 470A ami-nohapposekvensointilaitteella (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) suoraan kytketyn Model 120A HPLC-laitteen kanssa.

20 cDNA-kloonien eristäminen ihmisen SP18:ta osalta RNA.ta preparoitiin Chirgwin'n et ai. mukaan, Biochemistiy, 18:5294-5299 (1979) teineen aikuisen keuhkokudosnäytteestä, joka oli saatu neoplastisen vamman kirur- ; 25 gisen poistamisen aikana. Kaksijuosteisen cDNA:n valmistaminen suoritettiin ίV: käyttäen standarditekniikkaa (Chirgwin et ai., edellä) ja Efstratiadis et ai., "Genetic

Engineering", toim. Stelow ja Hollaender, Plenum, New York, 1:15-49 (1979), ja kiijasto konstruoitiin lambda NM607 -faagissa, kuten Le Bouc, et ai, on kuvaillut, .·*·, F.E.B.S. Letts., 196:108-112 (1986). SP18-kloonit identifioitiin seulomalla fagi- • · · 30 plakkeja synteettisten oligonukleotidikoettimien kanssa (Benton, et ai, Science, : **' 196:180-182 (1977), joita valmistettiin käyttäen Applied Biosystems'n automaattis- ··· ta synteesilaitetta ja puhdistettiin HPLC:n avulla. Ensimmäiset klooniehdokkaat saatiin käyttäen koetinta TG996 (5’ CATTGCCTGTGGTATGGCCTGCCTCC 3’), joka oli peräisin ihmisen suifaktanttiapoproteiinin pienen cDNA.n nukleotidiosa- 35 sekvenssistä (Schilling et ai., International Patent Application WO 86/03408). Suurempia klooneja (1,5 ke:een saakka) eristettiin käyttäen koetinta TG1103 (5' TCG-AGCAGGATGACGGAGTAGCGCC 3'), joka perustui yhden alkuperä!skloonin 5- 22 102180 sekvenssiin. cDNA-kloonien nukleotidisekvenssi määritettiin ketjunpysäytysmene-telmällä (Sanger, et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 74:5463-5467 (1977) käyttäen EcoRl-restriktiopaloja subkloonattuna sopivaan M 13-vektoriin.

5 B. Tulokset LMW-apoproteiinien ominaisuuksia

Ihmisen lapsivedestä eristetyt LMW-apoproteiinit tulivat näkyviin piihappokroma-tografian jälkeen tai Sephadex LH-20 -kolonnikiomatografian jälkeen, kuvio 2, 10 Hawgood'n, et ai, kuvailemana, Proc. Natl. Acad. Sei. 85:66-70 (1987), kahtena proteiinivyöhykkeenä SDS-polyakiyyliamidigeelielektroforeesissa ei-pelkistävissä olosuhteissa. Ylempi vyöhyke, jonka näennäinen molekyylipaino on 18000 dalto-nia, on dimeeri, ja merkittynä sen vuoksi SP18-dimeerillä. Lisättäessä B-merkap-toetanolia, SP 18 pelkistyi 9000 daltoniseksi ja sitä merkittiin SP18-monomeeri'llä 15 (kuvio 3). Toinen LMW-apoproteiini merkittynä SP9:llä, tulee näkyviin diffuusina vyöhykkeenä välillä 9000-12000 daltonia pelkistävien aineiden läsnä ollessa tai poissa ollessa. SP9 erotettiin SP18-dimeeristä ja SP18-monomeeristä kromatogra-foimalla Sephadex LH-60:lla. Tuloksena olevia puhdistettuja proteiineja esitetään kuviossa 3.

20

Aminohappokoostumukset määritettiin SP18-monomeerille ja SP9:lle. Johtuen näiden proteiinien äärimmäisen hydrofobisesta luonteesta, HCl-hydrolyysi suoritettiin 150 C:ssa 24 tunnin aikana, standardihydrolyysin lisäksi 110 C:ssa 24 tunnin aikana, ja valiinin, leusiinin, ja isoleusiinin arvot laskettiin hydrolysaattien analyyseistä, ‘ 25 tehtyinä äärimmäisissä olosuhteissa. Kuten taulukossa 3 on esitetty, molemmat pro- v.: teiinit ovat äärimmäisen hydrofobisia ja sisälsivät suuret määrät valiinia ja leusiinia.

• « • · · • · « * · • · · • · « • · · • · • · • · · • · · • · • · • · · t I · • < · « 4 · 23 102180

Taulukko 3

Ihmisen SP9-ja SP18-monomeerien aminohappokoostumus ja vertailu SP181 :n teoreettiseen koostumukseen 5 SP9 SP18 SP181

Aminohappo (mooli-%) (mooli-%) (mooli-%)

Asparagiinihappo 10 (tai asparagiini) 1,1 3,4 3,7

Treoniini 0,8 1,5 1,2

Seriini 1,8 2,7 2,5

Glutamiinihappo (tai glutamiini) 1,5 6,7 6,2 15 Proliini 8,3 7,8 7,4

Glysiini 10,6 6,1 4,9

Alaniini 4,9 10,2 9,9

Kysteiini2 9,1 7,2 8,6 Väliini 12,2 11,7 11,1 20 Metioniini 3,4 3,2 3,7

Isoleusiini3 6,8 6,4 7,5

Leusiini3 22,4 17,4 17,3

Tyrosiini 0,7 2,2 2,5 • Fenyylialaniini 2,6 1,5 1,2 ' 25 Histidiini 5,4 0,0 0,0

Lysiini 4,7 3,0 2,5

Arginiini 3,9 9,0 8,6 :V: Tryptofaani E.M4 E.M.4 1,2 • · · • · · • · · ./ 30 1 Teoreettinen koostumus perustuu sekvenssituloksiin tähde81:een saakka.

2 Kysteiinipitoisuus määritettiin toteuttamalla peimuurahaishappo- ja HCl-hydro- • · *·:** lyysejä.

:Y: 3 Isoleusiinin ja leusiinin pitoisuudet määritettiin kumpikin toteuttamalla 24-tunnin HCl-hydrolyysiä 150°C:ssa.

35 4 Tryptofaania ei määritetty.

24 102180 SP18-monomeerin aminoterminaalinen sekvenssianalyysi tuotti seuraavan sekvenssin: NH2-Phe-PiO-Ile-Pro-Leu-PiO-Tiy-.

5

Puhdistetun SP9-monomeerin toistettu sekvensointi osoitti monenlaisia peptidejä kaikkien sisältäessä mnsaasti leusiinia ja vähintään kuusi perättäistä valiinia. NH2-terminaalinen analyysi toi esille fenyylialaniinin, glysiinin, ja isoleusiinin, kunkin suhteellisten määrien vaihdellessa valmisteesta toiseen.

10 SP18 cDNA:n nukleotidisekvenssianalyysi SP18-monomeerin cDNA-kloonin nukleotidisekvenssi esitetään kuviossa 1. Sekvenssi on 83-%:isesti homologinen koiran SP 18 cDNA.n suhteen (Hawgood, et ai, 15 Proc. Natl. Acad. Sei., 85:66-70 (1987). Suuren avoimen lukukehyksen sisällä oleva sekvenssi identifioitiin, joka sopii täydellisesti yhteen SP18-monomeerin amino-pään kanssa, määritettynä eristetyn proteiinin (alleviivattu kuviossa 3) Edman-hajo-tuksen avulla. Tämä viittaa siihen, että valmis SP18-monomeeri saa alkunsa suuremman prekursorimolekyylin prosessoinnin kautta. Valmis sekvenssi sisältää yh-20 den potentiaalisen N-glykosylaatio-paikan (Asn 110), se ei sisällä kohtia tyrosiinin sulfatoitumista varten eikä G-X-Y-kerrannaisjaksoja, joita todetaan 35000 daltoni-sessa apoproteiinissa (White, et ai, A. Pediatrics Research, 19:501-508; 1985).

; ; Pelkistetylle SP18-dimeerille SDS-PAGE:lla saatu 9000 daltonin molekyylipaino ' · 25 on alhaisempi kuin mikä on ennustettu valmiille prekursoriproteiinisekvenssille, jo- ·.·.· ka sisältää aminopään NH2-Phe-Pro-Ile-Pro-Leu-PiO-Tyr (19772 daltonia), mikä edellyttää lisäprosessointia aminohappojen 70-90 alueella. Tätä seikkaa tukien ole-:V: tetun 9000 daltonisen proteiinin teoreettinen aminohappokoostumus (taulukko 1), :*·*; joka sisältää tähteet 1-81, on hyvin verrattavissa puhdistetun SP18-monomeerin 30 määritettyjen arvojen kanssa. Prekursoriproteiinin aminoterminaalinen osa (tähteet 1-81) on alkalinen ja hydrofobisempi kuin COOH-terminaalinen osa (tähteet 82-*·♦·* 181): Kyte-Doolittle-indeksi tähteillä 1-81 on 9100 (pl 8,6), ja se on -3000 (pl 5,91) tähteillä 82-181 (Kyte, et ai, J. Pediatrics, 100:619-622; 1982). Aminopää (tähteet 1-81), koiran sekvenssin tavoin (Hawgood, et ai, Proc. Natl. Acad. Sei., 85:66-70; 35 1987), koostuu kolmesta hydrofobisesta alueesta: tähteet 1-11, 22-49 ja 53-74. Nä mä on sijoitettuna joukkoon, joka sisältää varauksellisen alueen (tähteet 12-21) ja kaksi hydrofiilistä ja varauksellista jaksoa (tähteet 47-54 ja 72-81).

25 102180

Surfaktanttiaktiivisuuden palauttaminen LMW-apoproteiinien avulla Näytteitä valmisteltiin, jotka sisälsivät 400 pg/100pl fosfolipidejä (DPPC:PG, 3:1 painon mukaan), fosfolipidejä + 4 pg SP9:ää, tai fosfolipidejä + 4 pg SP18:aa. Jo-5 kaisesta näytteestä määritettiin sykkiväkuplasurfaktometrissä kyky alentaa pintajännitystä. Tulokset esitetään taulukossa 4 keskimääräisenä minimaalisena pintajännityksenä 15 s, 1 minuutin (min), ja 5 min kohdalla. Ihmisen luonnollinen suifaktant-ti, joka on eristetty synnytyshetken lapsivedestä, laimennettuna tasolle 4 mg/ml, esitetään vertailun vuoksi. Vaikkei fosfolipideillä eikä LMW-apoprotelineillä yksinään 10 ollut merkittäviä pintajännitystä alentavia ominaisuuksia, fosfolipidien seos joko SP9:n tai SP18:aa kanssa osoitti merkittävää aktiivisuutta. Fosfolipidien yhdistäminen 1 paino-%:isen SP18:aa kanssa alensi mitattavat pintajännitykset tasoille, jotka ovat venattavissa niihin, jotka on saatu yhtä suurella määrällä ihmisen luonnollista surfaktanttia (6,3 + 0,2 mN/m fosfolipideillä + SP 18 15 sekunnin kohdalla, 2,0 15 ±1,2 mN/m luonnollisella surfaktantilla). Perustuen vastaavaan painoon SP9 alensi pintajännitystä vähemmän tehokkaasti (16,7 + 0,8 mN/m 15 s kohdalla).

Taulukko 4 20 Minimipintajännitykset sykkivässä kuplassa1 15 s 1 min 5 min PL2 42,9+1,4 41,6+1,6 34,9 + 4,9 PL + SP93 16,7 + 0,8 14,1 + 1,2 12,2+1,0 : 25 PL + SP 183 6,3 + 0,2 5,1 + 1,0 4,9 + 0,6 • · ihmisen luonnollinen suifaktantti4 2,0+ 1,2 2,4+ 1,4 0,4 + 0,4 :V: 1 Sykintä 20 jaksoa/min aloitettu 10 s kuplamnuodostuksen jälkeen. Kaikki arvot on : ilmoitettu mN/m (dyneä/cm), ja ne ovat vähintään kolmen määrityksen keskiarvoja.

30 2 Fosfolipidejä DPPC:PG, 3:1,4 mg/ml 3 1 paino-% venattuna fosfolipideihin • · .

’···* laimennettuna 4 mg/ml:ksi.

I • · · « « « • «

Eksogeenisen (synteettisen) surfaktanttiaktiivisuuden in vivo -määritykset suoritet- • · 35 tiin tiputtamalla epäkypsien sikiökautisten kanien hengitystiehyeisiin saliiniliuoksia, jotka sisälsivät pelkkää Ca2+:a tai sen lisäksi fosfolipidejä, fosfolipidejä + LMW-apoproteiineja, tai ihmisen luonnollista surfaktanttia. Eläimiä tuuletettiin 30 min, ja 26 102180 sen jälkeen niistä poistettiin ilmaa sijoittamalla lasikupuun alipaineessa. Keuhkoihin lisättiin sen jälkeen ilmaa tietyille painetasoille, ja ilmatilavuus, joka tarvittiin kutakin painetta varten, noteerattiin. Tilavuudet, jotka tarvittiin tiettyjä paineita varten ilmanpoiston aikana paineesta 30 cm H20:ta, määritettiin samalla tavoin.

5 Tuloksena olevat paine/tilavuuskäyrät esitetään kuviossa 4 eläimillä, jotka vastaanottivat synteettistä surfaktanttia, jota oli valmistettu puhdistetun SP9:n tai SP18:n avulla (0,5 paino-% verrattuna kokonaisfosfolipidipitoisuuteen), ja sopivilla kontrollieläimillä. Keuhkomukautumisen parantuminen näkyy selvästi niillä eläimillä, joita on käsitelty luonnollisella tai jommallakummalla synteettisellä surfaktantil-10 la, venattuna niihin eläimiin, jotka saavat saliinia tai fosfolipidejä, SP18:n ollessa tehokkaampi kuin SP9, perustuen vastaaviin painoihin. Samanlainen tutkimus suoritettiin käyttäen seosta, joka sisälsi SP9:ää ja SP18:aa. Tulokset olivat melkein samanlaiset fosfolipidi + SP 18 -käyrän suhteen, joka on esitetty kuviossa 4.

15 Mukautumismittausten jälkeen keuhkoihin lisättiin ilmaa paineeseen 30 cm H20:ta, poistettiin ilmaa takaisin paineeseen 10 cm H20:ta, puristettiin kiinni, leikattiin pois ja fiksoitiin formaliinissa. Ohutleikkeet värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla ja tutkittiin mikroskooppisesti. Kuten kuviossa 5 on esitetty, keuhkot, joita oli käsitelty saliinilla (A) tai fosfolipideillä (C), näyttivät ilmattomilta, kun taas keuhkoissa, 20 jotka olivat eläimistä, jotka saivat luonnollista (B) tai uudelleen koottua (rekonstitu-oitua) (D) surfaktanttia, esiintyi normaalia keuhkorakkulan laajentumaa. Morfomet-riset analyysit ohutleikkeistä osoittivat kudosvälitilan suhteeksi ilmatilaan 4,70 sa-liinikäsittelyn osalta ja 3,29 pelkkien fosfolipidien osalta venattuna suhteen arvoon 0,498 luonnollisen suifaktantin kohdalla ja 0,538 rekonstituoidun surfaktantin koh-i . 25 dalla. Nämä tulokset esitetään taulukossa 5 ja ne vahvistavat kuviossa 5 havaitun *,v ilmatilan merkitsevän (p<0,001; Mann-Whitneyn U-testi) lisääntymisen. Keuhko- rakkuloiden ympäiysten vertailu osoitti samalla tavoin merkitsevästi (p<0,003) suu-’·’·* rempaa keuhkorakkuloiden rajapintojen leikkausten määrää saliinilla tai fosfolipi- : dillä käsitellyissä sikiöissä venattuna surfaktantilla käsiteltyihin eläimiin.

30 • * · ·»· • · • ♦ ·♦· « 27 102180

Taulukko 5

Ilmatilan morfometrinen analyysi kanisikiön käsittelyn jälkeen 5 Keuhkoputkitiputus Kudosvälitila/Ilmatila saliini 4,70 fosfolipidejä1 3,29 fosfolipidejä1 + LMW-apoproteiineja2 0,538 ihmisen luonnollinen suifaktantti3 0,498 10 1 2 mg 3:1 DPPC:PG eläintä kohti 2 20 pg LMW-apoproteiineja lisätty fosfolipideihin 3 2 mg eläintä kohti 15 C. Pohdinta Tässä tutkimuksessa kuvaillaan kahta molekyylipainoltaan pientä apoproteiinia, jotka on eristetty ihmisen lapsiveden suifaktantista, joita voidaan lisätä tunnettuihin fosfolipideihin biologisesti aktiivisen pulmonaalisurfaktantin muodostamiseksi. 20 Vaikkakin tämänhetkisessä tutkimuksessa proteiineja on merkitty nimillä SP 18-dimeeri, SP18-monomeeri ja SP9, viimeaikaisesta kirjallisuudesta käy selville, että on olemassa moninainen nimistö ja raportoitujen molekyylipainojen valikoima koskien LMW-PS-apoproteiineja (vaihtelualue 5-18000 daltonia). Näkyvät eroavuudet fysikaalisissa ominaisuuksissa voidaan selittää monen eri tekijän avulla, ; , 25 mukaan lukien lajieroavuudet, vaihtelevat puhdistus- ja käsittelytekniikat, vaihtelut • · · *·*·* määrityksissä koskien pieniä molekyylipainoja perustuen standardeihin SDS- polyakryyliamidigeeleissä, ja potentiaalinen lipidien häiritsevä vaikutus pienimole- ·.·.· kyylipainoiSten proteiinien vyöhykkeisiin geeleissä. Aminohappokoostumusten ja «·· V : -sekvenssien ja immunologisten analyysien vertailu, joissa analyyseissä käytetään :·. 30 monospesifisiä vasta-aineita, auttaa luokittelemaan LMW-apoproteiineja.

« · · • · • · *!* Vaikuttaa siltä, että tässä yhteydessä kuvailtu SP9-proteiini, joka tuottaa diffuusin • · :.v vyöhykkeen alueella 9-12000 daltonia SDS-polyakryyliamidigeeleillä pelkistävissä tai ei-pelkistävissä olosuhteissa, on luultavasti sama proteiini kuin se, jota Whitsett, 35 et ai, nimitti SAP-6:ksi, Pediatric Research, 20:744-749 (1986), Hawgood, et ai, SP5-8:ksi, Proc. Natl. Acad. Sei., 85:66-70 (1987), Phelps, et ai, PSP-6:ksi, Am. Rev. Respir. Dis., 135:1112-1117 (1987), ja sama kuin Takahashi'n, et ai, 5 kDa:n 28 102180 proteolipidi, Biochem. Biophys. Res. Comm., 135:527-532 (1986). Tämän proteiinin äärimmäisen hydrofobinen luonne käy selville sen aminohappokoostumuksesta (taulukko 3) ja sekvenssitiedoista, jotka osoittavat vähintään kuusi perättäistä va-liinitähdettä, joita edeltää leusiini-rikas alue. Kolmen amino-terminaalisen tähteen 5 (fenyylialaniini, glysiini,, ja isoleusiini) läsnäolo SP9-valmisteissa, jotka tässä yhteydessä on saatu lapsiveden surfaktantista, viittaa peptidivalikoimaan, jolla on identtinen sekvenssi, mutta joka on sisältänyt yhden tai kaksi aminopäästä poistettua tähdettä. Phelps, et ai, Am. Rev. Respir. Dis., 135:1112-1117 (1987) ovat raportoineet äskettäin samanlaisesta havainnosta koskien naudan PSP-6 -apoproteiinia.

10 SP18-dimeeri koostuu kahdesta identtisestä 9000 daltonin peptidistä (mutta jotka ovat erilaisia kuin 9000 daltonin SP9-peptidi), joita yhdistää disulfidisidos. SP 18-monomeerin aminohappokoostumus (taulukko 3) sisältää suuren määrän hydrofobisia tähteitä. Kun pelkistämättömälle SDS-PAGE:lle ladattiin SP18-proteiinia, 15 perättäisesti vähemmän voimakkaasti värjäytyviä vyöhykkeitä havaittiin välillä 36000 ja 56000 daltonia, mikä viittasi proteiinin oligomeerisiin muotoihin; pelkistettäessä havaittiin vain yksi 9000 daltonin vyöhyke.

Sekä SP9- että SP18-dimeeriapoproteiinien, jotka oli eristetty kuten edellä on ku-20 vailtu, voitiin osoittaa sisältävän biofysikaalista aktiivisuutta fosfolipidien kanssa yhdistämisen kanssa. l-paino-%:isen SP18-dimeerin lisääminen fosfolipideihin DPPC:PG johti välittömään pintapaineen lisääntymiseen, mikä johti pintajännityksiin, jotka olivat alle 10 mN/m 15 sekunnissa. l-%:isen SP9:n lisääminen : DPPC:PG:hen oli jonkin verran vähemmän tehokasta, alentaen pintajännityksen ta- 25 soihin 16,7, 14,1, ja 12,2 mN/m 15 sekunnin, 1 ja 5 minuutin kohdalla vastaavasti.

Sekä SP18-dimeeriä että SP9:ää sisältävät seokset olivat myös tehokkaita, mutta li- * · · ’·'/ sätutkimuksia tarvitaan sen määrittämiseksi onko yhteisvaikutus additiivinen vaiko * 1 1 *.1«1 synergistmen.

· v.1· 30 In vivo -tutkimuksia rekonstituoidulla suifaktantilla käyttäen kanin sikiön mallia (Schneider, et ai, J. Pediatrics, 100:619-622; 1982) suoritettiin käyttäen SP 18-di-meerin ja SP9:n seoksia kuin myös kumpaakin proteiinia yksittäisesti. Selvä paraneminen keuhkojen mukautumisessa havaittiin eläimillä, joita oli käsitelty luonnolli-sella suifaktantilla tai rekonstituoidulla suifaktantilla, jota oli valmistettu SP 18-di-Cv 35 meeriapoproteiinin avulla, venattuna niihin eläimiin, jotka saivat pelkästään fosfoli-pidejä tai saliinia (kuvio 4). Kohtalaista paranemista havaittiin, kun käytettiin SP9:ää. Identtisissä tutkimuksissa, joissa käytettiin SP18-dimeerin ja SP9:n seosta 29 102180 rekonstituoidun surfaktantin valmistamiseksi, saatiin hyvin samankaltaisia tuloksia kuin pelkän SP18-dimeerin avulla saadut tulokset (umpineliöt, kuvio 4); SP 18-dimeerin ja SP9:n tarkkaa suhdetta noissa tutkimuksissa ei kuitenkaan voitu tarkalleen todeta. Kuvio 5 esittää tyypillisiä mikroskooppisia näkökenttiä keuhkorakku-5 loista, mikä osoittaa ilmattomuuden puuttumisen keuhkokudoksesta surfak-tanttitiputuksen jälkeen.

Suzuki, et ai, (Eur. J. Respir. Dis., 69:336-345; 1986) ovat raportoineet pintajännityksen alenemisesta (mitattuna Wilhelmyn vaa'alla tai sykkivässä kuplassa) ja vii-10 sinkertaisesta lisääntymisestä ennenaikaisesti syntyneiden kanien hengitysilmatila-vuuksissa sisäänpuhaltamispaineissa 25 cm H20:ta, kun sian LMW (<15000 dalto-nia) -suifaktanttiapoproteiineja lisätään DPPC:PG-seoksiin painosuhteessa 5:80:20 (proteiini:DPPC:PG). Se, onko yksi tai useampi proteiini läsnä tässä systeemissä, on epäselvää.

15

Myös aikaisemmat tutkimukset, joissa käytettiin 35000 daltonin apoproteiinia (Revak, et ai, Am. Rev. Respir. Dis., 134:1258-1256; 1986) osoittivat kohtalaista pintajännityksen alenemista, samankaltaista kuin SP9:llä saatu aleneminen tässä yhteydessä kuvailluissa tutkimuksissa. Lisätutkimuksia on epäilemättä tehtävä 20 käyttäen erilaisia yhdistelmiä ja pitoisuuksia koskien SP18:ta, SP9:ää ja 35000* daltonin apoproteiinia kuin myös Ca+:a ja ehkä erilaisia fosfolipidejä näiden eri sur-faktanttikomponenttien välisten vuorovaikutusten selventämiseksi ja parhaiden olosuhteiden määrittämiseksi biologisesti aktiiviselle eksogeeniselle suifaktantille.

25 Polypeptidisurfaktanttiaktiivisuuden in vitro -määrittäminen • · · •••t A. Menetelmät ··· * Surfaktanttiaktiivisuuden mittaaminen • · I I i • · • ·

Pintapainemittauksia ilma-nesterajapinnan poikki (ilmaistuna negatiivisena cm 30 H20:ta paineena) kuplasäteen ollessa minimaalinen suoritettiin eri ajankohdissa • · käyttäen Enhomingin kuvailemaa sykkiväkuplatekniikkaa, J. Appi. Physiol., .*· 43:198-203 (1977).

Lyhyesti, Enhomingin surfaktometri (Surfactometer International, Toronto, Onta-35 rio) mittaa paine-eroa (5P) kuplan neste-ilmarajapinnan poikki, joka kupla sykkii . . : nopeudella 20 jaksoa/min. maksimaalisen (0,55 mm) ja minimaalisen (0,4 mm) sä teen välillä. Kuplaa, joka muodostetaan 37 °C:ssa, vesisisältöisessä 20 μ1:η näyte- 30 102180 kammiossa, seurataan mikroskooppioptiikan välityksellä samalla kun paineen muutokset rekisteröidään rullapiirturilla, joka on kalibroitu paineeseen -2 cm H20.

Yhdistetyn hydrofobisuusarvon määrittäminen 5

Kunkin peptidin muodostama yhdistetty hydrofobisuusarvo määritettiin osoittamalla kullekin peptidissä olevalle aminohappotähteelle sitä vastaava hydrofiilisyysarvo, kuten on kuvailtu Hopp et alin. taulukossa 1, Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 78:3824-3829 (1981), joka julkaisu on tässä yhteydessä liitettynä viitteenä. Tietyn 10 peptidin kohdalla hydrofiilisyysarvot summattiin summan edustaessa yhdistettyä hydrofobisuusarvoa.

Synteettisten surfaktanttien valmistaminen 15 Liuottimen kanssa sekoittamisen jälkeen kukin peptidi yhdistettiin fosfolipidien kanssa (DPPCiPG), 3:1, synteettisen surfaktantin muodostamiseksi yhden seuraa-vista menetelmistä mukaisesti.

Menetelmä A toteutettiin sekoittamalla 16 μΐ peptidi/liuotinseosta (40 pg peptidiä) 20 100 μ1:η kanssa kloroformia, joka sisälsi 400 pg fosfolipidejä, sekoittamalla seosta noin 10 minuutin ajan 37 °C:ssa, peptidi/fosfolipidiseoksen muodostamiseksi. Kloroformi poistettiin peptidi/fosfolipidiseoksesta kuivaamalla N2:n alla. Siten muodostettu synteettinen surfaktantti sekoitettiin sen jälkeen 90 μ1:η kanssa H20:ta ja se-; koitettiin kevyesti noin 10 minuuttia 37 C:ssa. Sen jälkeen 10 μΐ 9-%:ista NaCl li- . 25 sättiin surfaktanttia sisältävään liuokseen.

• · · • · · · • · · • t · *;’/ Menetelmä B toteutettiin laittamalla ensin 100 μΐ kloroformia, joka sisältää 400 pg • · · *·*·* fosfolipidejä lasiputkeen ja poistamalla kloroformi kuivaamalla N2:n alla noin 10 minuutin aikana 37°C:ssa. Kuusitoista μΐ peptidi/Iiuotin-seosta ja 74 μΐ H20:ta se- • · V.! 30 koitettiin kuivattujen fosfolipidien kanssa ja sekoitettiin sen jälkeen noin 10 minuu- :T: tin ajan 37 °C:ssa. Siten muodostettuun synteettiseen surfaktanttiin lisättiin 10 μΐ 9-%:ista NaCl.

• · · 'Menetelmä C toteutettiin pitämällä ensin polypeptidi-PL-seosta 43 °C:ssa 10 mi-35 nuutin ajan, minkä ajan jälkeen liuottimet poistettiin seoksesta kuivaamalla N2:n . alla. Seoksia kuivattiin talsittaessa lisää saattamalla 15 minuutin ajaksi alipainee seen kuivatun polypeptidi-PL-seoksen muodostamiseksi. Vettä sekoitettiin sen jäi- 31 102180 keen kuhunkin kuivattuun seokseen määränä, jonka laskettiin vastaavan 90 % tilavuudesta, joka tarvitaan antamaan PL:n loppupitoisuudeksi joko 4 tai 10 mg/ml (kuten on osoitettu taulukossa 7), toisen seoksen muodostamiseksi. Tätä toista seosta pidettiin yksi tunti 43 °C:ssa sekoituksessa. Sen jälkeen lisättiin 6-%:ista NaCl 5 tilavuus, joka vastaa 10 % tilavuudesta, joka tarvitaan antamaan haluttu PL-pitoisuus, toiseen seokseen, ja muodostunutta lopullista seosta pidettiin 10 minuutin ajan 43 °C:ssa. Useimmissa tapauksissa lopullinen seos saatettiin viimeiseen, 3 jäädytys-ja sulatusjaksoa sisältävään vaiheeseen.

10 B. Tulokset

Taulukossa 6 kuvattavia synteettisiä surfaktantteja valmistettiin kuten taulukossa on osoitettu.

15 Taulukko 6 (2) (3) (1) Fosfolipidi- Yhdistetty

Muodostettu sekoitus- hydrofobi- 20 Peptidi Liuotin seos menetelmä suusarvo . ’ ,. p 1 -15 n-propyyli- alkoholi suspensio A -16,7 pii -25 H20 liuos B +1,7 25 p21 -35 kloroformi suspensio A -9,2 ::: p31-45 h2o liuos b -9,9 l . p41-55 H20 liuos B -5,4 I I r *·*·* p51 -65 H20 suspensio B -2,2 p61-75 metanoli suspensio A -9,9 v.· 30 p71-81 H20 suspensio B +3,9 : p74-81 H20 liuos B +3,7 :·. p66-81 metanoli: '··>, H20 suspensio A - 1,0 p52-81 metanoli: \v 35 H20 suspensio A -6,2 32 102180 (1) Jokainen polypeptidi sekoitettiin esitetyn liuottimen kanssa pitoisuuden saamiseksi tasolle 2,5 pg peptidiä/μΐ liuotinta.

(2) Kirjaimet osoittavat synteettisen surfaktantin valmistusmenetelmän, jota käytettiin. Kyseisiä menetelmiä kuvaillaan edellä.

5 (3) Jokaisen peptidin muodostama yhdistetty hydrofobisuusarvo määritettiin kuten edellä on kuvailtu.

Jokaisesta taulukossa 6 esitetystä synteettisestä suifaktantista määritettiin surfak-tanttiaktiivisuus, osoitettuna niiden kyvykkyytenä alentaa pintajännitystä in vitro, 10 käyttäen Enhomingin "kuplamääritystä", kuten edellä on kuvailtu.

Tämän tutkimuksen tulokset, jotka on esitetty kuviossa 6, osoittavat, että kohteena oleva polypeptidi, joka on sekoitettu farmaseuttisesti hyväksyttävien fosfolipidien kanssa, muodostaa synteettisen pulmonaalisurfaktantin, jonka surfaktanttiaktiivi-15 suus on suurempi kuin fosfolipideillä yksistään, kuten alemmat δΡ-arvot osoittavat. Polypeptidejä käyttämällä saatiin tyypillisesti 10-80 % alempia 5P-arvoja. Tulisi panna merkille, että 8 aminohappotähdettä sisältävä kontrollipeptidi p74-81, joka ei ole yhdenmukainen esillä olevan keksinnön mukaisten oppien kanssa, ei muodostanut synteettistä PS:ää, jonka aktiivisuus on suurempi kuin pelkällä fosfolipidillä, 20 mikä osoittaa, että aminohappotähteen pituus on ratkaiseva tekijä.

Tämän keksinnön mukaisten muiden tyypillisten polypeptidien surfaktanttiaktiivi-suus tutkittiin käyttäen "kuplamääritystä" kuten edellä on kuvailtu. Tutkimuksen ...,: tuloksia kuvataan jäljempänä taulukossa 7.

25

Jokainen polypeptidi sekoitettiin esitetyn liuottimen kanssa pitoisuudessa 2,5 mg • · · ; . polypeptidiä/ml liuotinta. Muodostunutta seosta tarkasteltiin sen määrittämiseksi, • · · *·1·’ muodostuiko liuos vaiko liukenemattoman polypeptidin sisältämä suspensio. Niitä seoksia, jotka muodostivat suspension, sekoitettiin edelleen sonikoimalla vesihau- • · 30 teessä 10 sekunnin ajan hyvin hienojakoisen suspension muodostamiseksi, mikä • · · V : riitti pipetointiin käyttäen lasipipettejä.

·· « · « « < , · ·' Liuottimeen sekoittamisen jälkeen, jokainen peptidi sekoitettiin fosfolipidien (PL) '1' kanssa, DPPC:PG, 3:1, kloroformissa lasiputkessa siten, että lisätyn polypeptidin 35 määrä vastasi yhtä kymmenettä osaa (10 paino-%) lisätyn PL:n määrästä, synteetti-:.' , sen surfaktantin muodostamiseksi joko menetelmän A, B tai C mukaisesti.

33 102180

Jokaisesta synteettisestä surfaktantista määritettiin sen jälkeen surfaktanttiaktiivi-suus, osoitettuna niiden kyvykkyytenä alentaa pintajännitystä in vitro kuplamääri-tyksessä, joka suoritettiin kuten edellä on kuvailtu. Paine-ero (δΡ) on surfaktantti-aktiivisuuden mitta lopullisessa polypeptidi-PL-seoksessa, joka määritettiin käyttä-5 en Enhoming Surfactometer -laitetta kuten edellä on kuvailtu. Mittaustuloksia saatiin ajanhetkillä 15 sekuntia (15"), 1 minuutti (Γ) ja 5 minuuttia (5'), ja ne ilmaistaan osoitetun polypeptidi-PL-seoksen kolmen toisistaan riippumattoman mittauksen keskiarvona. Paine-eromittaukset vertailunäytteille PL yksinään (PL) ja ihmisen luonnolliset surfaktantit määritettiin kontrolleina.

10 Tämän tutkimuksen tulokset esitetään taulukossa 7.

* » · · • · · · • · · • · · • · · # · • · · • · · • · • « • · · • · · • · • · · • · · • · · 1 · • · • · ·

• I

• ( 34 102180

Taulukko 7 (1) (2) (3) (4)

Muodos- Fosfolipidi PL-pitoi- Paineen- muutos tettu seos sekoitus suus menetelmä mg/ml

Peptidi Liuotin 15" 1' 5' pl-15 N-propanoli suspensio A 4 0,94 0,82 0,48 p36-81 50 % kloroformi suspensio C+ 10 0,90 0,87 0,79 50 % metanoli p44-80 68 % kloroformi liuos C- 105 0,77 0.64 0.24 32 % metanoli p46-76 64 % kloroformi liuos C+ 10 0.90 0.80 0,62 36 % metanoli p51 -72 75 % kloroformi suspensio C+ 10 1,15 0,76 0.33 25 % metanoli p.51-76 37 % kloroformi liuos C+ 10 0.99 0,91 0,42 63 % metanoli p51 -80 45 % kloroformi liuos C+ 10 0,92 0,89 0,48 55 % metanoli p51-81 50 % kloroformi suspensio C+ 10 0,94 0,86 0,64 : 50 % metanoli p52-81 67 % DMF liuos A 4 1,33 1,19 0,96 ... 33 % kloroformi p54-72 76 % kloroformi suspensio C+ 10 1.28 0,92 0,38 • · « . 24 % metanoli • i · p54-76 71 % kloroformi suspensio C+ 10 0,92 0,82 0,23 24 % metanoli • ♦ *·*·1 p59-80 32 % kloroformi suspensio C- 105 1,10 0,96 0,64

• M

*.* * 68 % metanoli p59-81 68 % kloroformi liuos C- 4 1,08 1,02 0,75 ,' " , 32 % metanoli " ' p64-80 48 % kloroformi liuos C- 105 1,07 0,8 7 0.11 ' 52 % metanoli ;. 'i p66-81 40 % DMF suspensio A 4 1,22 1.11 0,84 60 % kloroformi 35 102180 (1) (2) (3) (4)

Muodos- Fosfolipidi- PL-pitoi- Paineenmuutos tettu seos sekoitus suus menetelmä mg/ml

Peptidi Liuotin 15" 1' 5' p74-81 vesi liuos B 4 2,37 2,32 2,31 DL4 47 % kloroformi liuos C- 4 2,00 1,80 1,30 (31-meeri) 53 % metanoli RL4 32 % kloroformi liuos C- 4 0,58 0,65 0,33 68 % metanoli RL8 19 % kloroformi suspensio C+ 10 0,68 0,69 0,19 RRL7 49 % kloroformi liuos C- 4 1,65 1,25 1,00 51 % metanoli RCL-1 79 % kloroformi suspensio C+ 10 0,50 0,59 0,06 21 % metanoli RCL-2 67 % kloroformi suspensio C+ 10 0,00 0,00 0,00 33 % metanoli RCL-3 75 % kloroformi suspensio C+ 10 0,55 0,51 0,33 25 % metanoli PL C+ 10 >2.50 >2.50 2.33

Ihmisen 10 1,06 0,89 0,79 ,,.,: luonnolli- « f nen sur- ‘III faktantti • · · • ♦ · • · *·*·* Taulukko 7 (selitykset) (1) Osoitetaan se, oliko peptidin ja liuottimen lähtöseos liuos tai suspensio.

• · v.: 5 (2) Kirjaimet osoittavat synteettisen surfaktantin valmistusmenetelmän, jota käy- V : tettiin. Kyseisiä menetelmiä kuvaillaan edellä. A"+" osoittaa, että lopullinen seos saatettiin viimeiseen, 3 jäädytys- ja sulatusjaksoa käsittävään vaiheeseen. A"-" • · * osoittaa, että vaihetta ei suoritettu.

(3) Fosfolipidin (PL) pitoisuus lopullisessa seoksessa ilmaistaan milligrammoina • ;: 10 PL:ää millilitraa kohti seosta (mg/ml).

• ·; (4) Paineemnuutos on smfaktanttiaktiivisuuden mitta lopullisessa polypeptidi-PL

-seoksessa, määritettynä Enhoming Surfactometer -laitetta käyttäen kuten esimer- 36 102180 kissä 2 on kuvailtu. Mittaustuloksia saatiin kolmessa ajankohdassa, 15 sekunnin (15"), 1 minuutin (Γ) ja 5 minuutin (5') kohdalla, ja ne ilmaistaan osoitetusta poly-peptidi-PL-seoksesta tehdyn kolmen toisistaan riippumattoman mittauksen keskiaivona. Veitailunäytteiden, pelkkä PL (PL) ja ihmisen luonnollinen suifaktantti, pai-5 ne-eromittaustulokset esitetään myös.

(5) Nämä liuokset valmistettiin pitoisuuteen 20 mg/ml PL:ää ja laimennettiin pitoisuuteen 10 mg/ml ennen testausta.

Nämä tulokset osoittavat, että esillä oleva polypeptidi, sekoitettuna farmaseuttisesti 10 hyväksyttävien fosfolipidien kanssa, muodostaa synteettisen puhnonaalisuifaktan- tin, jonka surfaktanttiaktiivisuus on suurempi kuin fosfolipideillä yksistään, osoitettuna suurempana tilavuutena tiettyä painetta kohti.

Synteettisen surfaktantin aktiivisuuden in vivo -määrittäminen 15 A. Menetelmät

Synteettisten surfaktanttien valmistaminen

Kohteena oleva polypeptidi sekoitettiin ensin liuottimen kanssa kuten esimerkissä 2 on kuvailtu. Muodostunut seos sekoitettiin edelleen fosfolipidin (PL) kanssa siten, 20 että lisätyn polypeptidin määrä oli joko 3, 7 tai 10 paino-% lisätyn PL:n määrästä, kuten jäljempänä on esitetty. Lopullinen polypeptidi, PL-seos (synteettinen surfak- tantti) muodostettiin menetelmän C mukaisesti käyttäen viimeistä jäädytys-sulatus -vaihetta, kuten on kuvailtu yksityiskohtaisesti jaksossa "synteettisten surfaktanttien valmistaminen" esimerkissä 2, paitsi että lopullisen seoksen pitoisuutena oli 20 mg y.'.' 25 fosfolipidiä/ml lopullista seosta.

• · · • · • I t • ** Tiputuksen toimintaohjeet • · t

Toimintaohje 1: * · * 5 30 Sikiökautisia kaneja käsiteltiin ruiskuttamalla henkitorveen 0,1 ml liuosta, joka si- :·. sälsi joko esimerkissä 3A valmistettua synteettistä surfaktanttia, tai joko 2 mg na- /··. tiivia surfaktanttia (NS), jota oli valmistettu kuten esimerkissä 1 on kuvailtu, tai 2 mg PL:ää.

35 Toimintaohje 2:

Synteettistä surfaktanttia tiputettiin sikiökautisen kanin keuhkoihin ruiskuttamalla henkitorveen yhdestä miskusta kolmea seuraavaa komponenttia siten, että kompo- 37 102180 nentit poistuvat ruiskusta seuraavassa jäijestyksessä: (1) 0,05 ml ilmaa; (2) 0,1 ml esimerkissä 3 A valmistettua synteettistä surfaktanttia, tai joko 2 mg PL:ää tai 2 mg natiivia surfaktanttia; ja (3) 0,1 ml ilmaa.

5 Toimintaohje 3: 0,1 ml:n erä synteettistä surfaktanttia, jota oli valmistettu kuten esimerkissä 3A on kuvailtu (tai 2 mg NS:ää tai PL:ää), tiputettiin yhdestä ruiskusta kanin henkitorveen kuten edellä on kuvailtu, minkä jälkeen niiskutettiin 0,05 ml laktaattia sisältävää Ringerin liuosta ja 0,2 ml ilmaa toisesta ruiskusta.

10

Toimintaohje 4: 0,1 ml synteettistä surfaktanttia, jota oli valmistettu kuten esimerkissä 3 A on kuvailtu (tai 2 mg NS:ää tai PL:ää), 0,15 ml ilmaa, 0,1 ml saliinia, ja 0,3 ml ilmaa niiskutettiin yhdestä ruiskusta henkitorveen kuten edellä on kuvailtu. Kaksi seuraavaa 0,3 15 ml:n erää ilmaa annettiin.

Toimintaohje 5:

Sikiökautisia kaneja käsiteltiin ruiskuttamalla henkitorveen yhdestä ruiskusta seu-raavat neljä komponenttia siten, että kyseiset neljä komponenttia poistuvat ruisku-20 tettaessa ruiskusta luetellussa järjestyksessä: (1) 0,2 ml liuosta, joka sisältää joko esimerkissä 3A valmistettua synteettistä surfaktanttia, tai joko 4 mg natiivia sur-faktanttia, tai 4 mg PL:ää; (2) 0,15 ml:n tilavuus ilmaa; (3) 0,1 ml normaalia salii-·; niliuosta; ja (4) 0,3 ml:n tilavuus ilmaa. Edellä oleva ruiskutus toistettiin sen jäl- ,:. keen 15 minuuttia ensimmäisen ruiskutuksen jälkeen.

25 • · · « · ·

Toimintaohje 6: * ’ Kaneja käsiteltiin kuten ohjeessa 5 on kuvailtu, paitsi että kaksi myöhempää 0,3 ml:n erää ilmaa annettiin alkutiputuksen jälkeen, eikä lisätiputusta annettu 15 mi-nuutin kohdalla.

0 1 30 « I*·.. Kanisikiömalli surfaktanttiaktiivisuuden tutkimiseksi • · · • · Tämän keksinnön mukaisten tyypillisten polypeptidien surfaktanttiaktiivisuutta tutkittiin käyttämällä menetelmiä, joita Revak, et ai, on aikaisemmin kuvaillut yksi-: 35 tyiskohtaisesti, Am. Rev. Respir. Dis., 134:1258-1265 (1986), jäljempänä mainitta vin poikkeuksin.

38 102180

Kahdenkymmenen seitsämän päiväin tiineitä sikiökautisia kaneja vapautettiin koh-dunavauksella, ja niihin ruiskutettiin välittömästi 0,05 ml Norcuronia (Organon, Inc., NJ) spontaanin hengityksen estämiseksi. Sikiökautiset kanit punnittiin sen jälkeen ja pieni kanyyli liitettiin henkitorveen henkitorvenavauksella. Edellä kuvailtuja 5 synteettisiä suifaktantteja tiputettiin sen jälkeen kanisikiön keuhkoihin yhden edellä olevan tiputusohjeen mukaisesti.

Tiputuksen jälkeen kani asetettiin varta vasten suunniteltuun pletysmografiin (joka sisälsi Celesco-muuttimen), joka oli kytketty keuhkotuuletuskoneeseen (Baby Bird, ΙΟ Baby Bird Corp., Palm Springs, CA), ja tiputuksessa ollutta keuhkoa keuhkotuu-letettiin nopeudella 30 sykliä minuutissa sisäänhengityspaineen huipun ollessa 25 cm H20:ta, positiivisen uloshengityksen loppupaineen ollessa 4 cm H20:ta ja si-säänhengitysajan ollessa 0,5 sekuntia. Joissakin tutkimuksissa tehtiin dynaamisia mukautuvuusmittauksia eri ajankohtina koko keuhkotuuletusmenettelyn aikana.

15 Muissa tutkimuksissa tehtiin staattisia mukautuvuusmittauksia keuhkotuuletuksen jälkeen.

Staattisia mukautuvuusmittauksia tehtiin 30 minuutin keuhkotuuletuksen jälkeen. Eläimet poistettiin keuhkotuuletuslaitteesta ja keuhkoista poistettiin kaasut painees-20 sa -20 cm H20:ta lasikuvussa alipaineessa. Sen jälkeen keuhkoja ensin täytettiin ilmalla ja sitten niistä poistettiin ilmaa henkitorviavanneputkeen kiinnitetyn T-kappaleen kautta. Staattisten paineiden, 5, 10, 15, 20, 25, ja 30 cm H20:ta, saavuttamiseen tarvittava ilmatilavuus mitattiin sekä ilmantäyttö- että ilmanpoistovaihei-. den aikana staattisten paine/ilma-käyrien muodostamiseksi staattisen mukautuvuu- ;;; 25 den mittana.

• · · • · · • · • · · ’·'·* Dynaamisia mukautuvuusmittauksia tehtiin pletysmografia käyttäen eri ajankohtina koko 60 minuutin keuhkotuuletusjakson ajan. Tietokoneen avulla saatu tulosana- • · :.v lyysi johti mukautuvuustietoihin, ilmaistuna ml:na ilmaa/cm H20:ta/g kehonpainoa i 30 jokaisella ajanhetkellä. Mukautuvuus laskettiin jäljempänä olevan kaavan mukaan.

• · • · • · · 39 102180

Mukautuvuus = δΥ δΡ δΡ,ρ = (C)'1 χ (SV) + (R) χ (F)

Ptp = transpulmonaalinen paine 5 C mukautuvuus (elastinen komponentti - yhdistää tilavuuden muutoksen paineeseen) R = resistenssi (yhdistää virtauksen paineeseen) F = virtaus V = tilavuus = kokonais virtaus ajan suhteen 10

Edellä oleva yhtälö ratkaistiin lineaarisen moniregression avulla C:n ja R:n osalta. Mukautuvuus (C) kuvaa keuhkojen elastista luonnetta, ja resistenssi (R) kuvaa painetta, joka tarvitaan voittamaan kaasun virtauksen resistenssi keuhkoihin ja keuhkoista.

15 B. Tulokset

Staattisen mukautumisen tulokset, käytettäessä tiputusohjeita 1 ja 5, esitetään kuvioissa 7 ja 8, vastaavasti. Parantunut keuhkomukautuvuus havaittiin kaikissa keuh-20 koissa, joita oli käsitelty luonnollisella surfaktantilla tai testatuilla synteettisillä sur-: · faktanteilla, verrattuna niihin keuhkoihin, joita oli käsitelty pelkillä fosfolipideillä (PL), yhdellä poikkeuksella. Synteettinen surfaktantti, joka oli valmistettu käyttäen p 1 -15 :ta (kuvio 7) ei saanut aikaan parantunutta keuhkojen mukautuvuutta verrattu-•:. na pelkkään PL:ään, mitattuna staattisen mukautuvuuden avulla.

··· 25 • · ·

Dynaamisten mukautuvuuskokeiden tulokset kuvataan taulukossa 8.

• · · • » • · • · · ♦ ♦ · • ♦ ♦ · ♦ • · · ♦ « · » ·· • · • · · ♦ ··« 40 102180

Taulukko 8 % peptidiä Dynaaminen mukautuvuus näyte venattuna ml ihnaa/cm H20:ta x 104 g kehonpainoa saatuna PL:ään minuuttia suifaktantin tiputuksen jälkeen ohjeella 10 20 30 40 50 60 PL 7 8 7 10 11 15 4 24 22 23 23 22 20 4 15 16 17 18 21 29 4 NS 265 251 168 186 173 147* 4 418 388 405 288 237 * 4 155 176 172 172 179 4 p36-81 5% 255 146* 3 5% 245 291 3 10% 154 1162 2 10% 252 623 2 p44-80 10%' 27 87 138 207 323 6 10%' 20 23 35 59 87 136 6 p51-80 10%' 42 114 247 300 6 10%' 6 : . p52-81 5% 517 226* 3 5% 434 55* 3 ·. 10% 195 1243 2 10% 43 1690 2 p51-76 10% 33 22 56 87 124 85 4 10% 10 11 186 358 141 144* 4 10% 15 36 109 241 264 301 4 p51-80 10% 17 41 52 78 99 208 4 :!0 10% 76 94 149 149 217 308 4 0: 10% 23 71 130 156 182 109* 4 10% 42 114 247 388 6 >.· p59-80 10%' 24 34 68 107 146 132 6 10%' 55 111 190 300 376 6 p-64-80 10 %' 63 129 235 318 6 :. 1 Ennen tiputusta kaneihin, nämä näytteet suodatettiin 25 mikronisen suotimen läpi.

* Mukautuvuuden väheneminen ajan kuluessa saattaa osoittaa ilmarinnan kehittymisen.

41 102180

Kuten taulukossa 8 on esitetty, jokainen tämän keksinnön mukaisista suifaktanteista ja luonnollinen surfaktantti paransivat dynaamista mukautuvuutta verrattuna pelkkään fosfolipidiin.

5 C. Pohdinta

In vivo -mukautuvuustutkimukset osoittavat, että muutaman tämän keksinnön mukaisen synteettisen suifaktantin käyttäminen johti mukautuvuuden tehostumiseen venattuna pelkkään fosfolipidiin kunkin määritetyn synteettisen suifaktantin osalta. 10 Tämän keksinnön mukaiset proteiinit ja polypeptidit ollessaan sekoitettuina farmaseuttisesti hyväksyttävien fosfolipidien kanssa muodostavat synteettisiä surfaktant-teja, joiden surfaktanttiaktiivisuus on suurempi kuin pelkällä fosfolipidillä. Synteettisten surfaktanttien käyttö on edullista parannettaessa mukautuvuusarvoja in vivo.

15 Tutkimus, joka koskee C-terminaalisen peptidin sitoutumista keuhkojen epiteelisoluihin A. Menetelmät

Peptidin sitoutumisen määritys 20 Peptidi, joka sisältää tähteet 74-80 SP18:sta (VLRCSMD) leimattiin radioaktiivi-: 1 sesti Bolton-Hunter-menetelmällä (Bolton et ai, Biochem. J., 133: 529-538, 1973) 125I:llä (New England Nuclear - 34,1 moolia/ml, 28,0 ng/ml, 75 pCi/ml).

·' Ihmisen pulmonaalisia epiteelisoluja (ihmisen keuhkokarsinoomasolu, ATCC:n ; 25 viitenumero CCL 185, yleisesti tunnettu A549-soluina) kasvatettiin yhtenäiseksi kasvustoksi 6-kaivoisissa kudosviljelymaljoissa. Seuraavia liuoksia käytettiin tässä tutkimuksessa: PBS/BSA: 10 mM Na-fosfaatti + 0,15 M NaCl + 0,5 % BSA pH 7,4

Hajotuspuskuri: 1 % SDS vedessä ’ 30 Liuos-F: 5 ml PBS/BSA + 51,56 kylmää peptidiä

Liuos-D: 2,5 ml PBS/BSA + 87 μΐ 125I-peptidiä

:*··: Liuos-D 1/5: 0,5 ml D + 2,0 ml PBS/BSA

Λ Liuos-D 1/25: 0,5 ml Dl/5 + 2,0 ml PBS/BSA

: *. Liuos-E: 2,5 ml PBS/BSA + 87 μΐ 125I-peptidiä + 20,78 μg kylmää peptidiä

35 Liuos-E 1/5: 0,5 ml E + 2,0 ml PBS/BSA

Liuos-E 1/25: 0,5 ml E1/5 + 2,0 ml PBS/BSA

42 102180

Kolmea 6-kaivoista levyä esikäsiteltiin inkuboimalla 0,5 ml:n kanssa seuraavia liuoksia 15 minuutin ajan 22 °C:ssa. Parittomia kaivoja esikäsiteltiin PBS/BSA:lla ja parillisia kaivoja liuos-F:llä. Esikäsittelyliuoksen poistamisen jälkeen kaivoja inku-boitiin 0,5 ml:n kanssa seuraavia liuoksia 22 °C:ssa osoitettu ajanjakso levyjä kevy-5 esti ravistellen.

Kaivo Näyte Inkubointiaika 1 D 7 minuuttia 2 E 7 minuuttia 10 3 D1/5 7 minuuttia 4 E1/5 7 minuuttia 5 Dl/25 7 minuuttia 6 E1/25 7 minuuttia 15 7 D 30 minuuttia 8 E 30 minuuttia 9 Dl/5 30 minuuttia 10 E1/5 30 minuuttia 11 Dl/25 30 minuuttia 20 12 E1/25 30 minuuttia 13 D 143 minuuttia 14 E 143 minuuttia .:. 15 D1 /5 143 minuuttia 25 16 El/5 143 minuuttia l . 17 Dl/25 143 minuuttia • · · * 1 18 E1/25 143 minuuttia · • · · *·1· Inkubaatioajan lopussa supematantti poistettiin jokaisesta kaivosta ja säästettiin las- : 30 kentaa varten. Jokaista kaivoa pestiin neljä kertaa kylmällä (4 °C) PBS/BSA:lla. Pe- ;‘-(t suerät säilytettiin laskentaa varten. Levy vietiin sen jälkeen takaisin huoneen läm- .1·1. potilaan ja 1 ml hajotuspuskuria lisättiin jokaiseen kaivoon. Levyä ravisteltiin kevy esti kunnes kaikki solut olivat hajonneet ja irronneet levystä (3-4 minuuttia). Liuos * ··' poistettiin jokaisesta kaivosta ja laskettiin. Jokaiseen kaivoon lisättiin toinen milli- 35 litra hajotuspuskuria, sekoitettiin muutama minuutti ja poistettiin sitoutuneiden pulssien laskentaa varten. Sitoutuneiden pulssien prosenttiosuus ja absoluuttimäärät määritettiin.

43 102180

Spesifiset sitoutuneet pulssit määritettiin vähentämällä kaivoihin sitoutuneet pulssit, jotka sisälsivät leimaamatonta (kylmää) peptidiä, vastaavien kaivojen pulsseista, joissa ei ollut kylmää peptidiä. Tulokset esitetään taulukossa 9, jäljempänä.

5 Menettely toistettiin seuraavin muutoksin:

Di = 1433 μΐ PBS/BSA + 167 μΐ l25I-peptidiä [1,78 pmoolia/500 μΐ] D2 = 183,3 μΐ PBS/BSA + 366,7 μΐ Di [1,19 pmoolia/500 μΐ] D3 = 275 μΐ PBS/BSA + 275 μΐ D, [0,89 pmoolia/500 μΐ] D4 = 366,7 μΐ PBS/BSA + 183,3 μΐ [0,59 pmoolia/500 μΐ] 10 D5 = 458,3 μΐ PBS/BSA + 91,7 μΐ D, [0,30 pmoolia/500 μΐ] D6 = 513,3 μΐ PBS/BSA + 36,7 μΐ Dj [0,12 pmoolia/500 μΐ]

Ei = 1386,24 μΐ PBS/BSA + 167 μΐ 125I-peptidiä [4,676 ng] + 46,76 μΐ kylmää peptidiä pitoisuudessa 100 pg/ml [4,676 pg] 15 E2-E6 Laimennettu kuten edellä D2-D(l:n kohdalla.

F = 3,398 ml PBS/BSA + 102,29 μΐ kylmää peptidiä pitoisuudessa 100 pg/ml].

Kaksi kuusikaivoista levyä pestiin kerran 1 ml.lla PBS/BSA:ta. Parittomilla numeroilla merkittyjä kaivoja esikäsiteltiin PBS/BSA:lla ja parillisia kaivoja liuos-F:llä. 20 Esikäsittelyliuoksen poistamisen jälkeen lisättiin seuraavat liuokset.

Kaivo Näyte Kaivo Näyte 1 D, 7 D4 . 2 E[ 8 E4 25 3 D2 9 d5 V.j 4 E2 10 Es 5 D3 11 D6 6 E3 12 E6 • · • · · • · · • « ! 30 Liuoksia inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa kevyesti ravistellen.

··*, Supematantit poistettiin sen jälkeen ja säästettiin laskentaa varten. Jokainen kaivo • ·· pestiin 4 kertaa 0,5 ml:lla kylmää PBS/BSA:ta. Pesuerät säästettiin laskentaa varten.

• · 1 ml 1 -%:ista SDS:ää lisättiin jokaiseen kaivoon solujen liuottamiseksi. Kolmen :.v minuutin kuluttua kaikkien solujen voitiin todeta irronneen levystä. Hajotettuja 35 (liuotettuja) soluja sisältävä supematantti laskettiin yhdessä kaivojen toisten SDS- pesuerien kanssa. Pulssien kokonaismäärä ja sitoutuneiden pulssien prosenttisuus määritettiin. Spesifinen sitoutuminen määritettiin vähentämällä sitoutuneet pulssit 44 102180 kaivoissa, jotka sisälsivät kylmää peptidiä, vastaavan, kylmää peptidiä sisältämättömän kaivon pulsseista. Tulokset esitetään taulukossa 10.

B. Tulokset 5

Sitoutumistutkimusten tulokset esitetään jäljempänä taulukoissa 9 ja 10.

Taulukko 9

Kaivo Kokonais-CPM Kokonais- % Ero Spesifiset CPM sitou- Sitoutunut sitoutuneet tunut Ct:t* 1 1109 126 24 414 2,23 2 1087 659 17 353 1,60 0,63 % 6 930 3 223 170 4479 2,01 4 221608 4 113 1,86 0,15% 330 5 45 877 828 1,80 6 47 731 880 1,84 -0,04% -18 7 1 103 606 25 905 2,35 8 1 152 287 19 230 1,67 0,68% 7 480 % 9 227 396 4 996 2,20 . : 10 230 974 4 137 1,79 0,41% 901 ·!· 11 47 899 1 030 2,15 12 49 894 992 1,85 0,30% 132 13 1 151347 10 071 0,87 14 1108 755 9 506 0,86 0,01 % 110 15 220 340 1 692 0,77 *:!:* 16 229 253 1800 0,79 -0,02% -44 : 17 46 893 407 0,87 18 47 426 386 0,81 0,06% 26 • · · • · • · ··· Λ * Korjattu tasoon 1 100 000 cpm/laimentamaton putki.

10 45 102180

Taulukko 10

Kaivo Kokonais- CPM sitou- % Koi j. ero* pmoolia CPM tunut Sitoutunut 1 3 070 705 66 954 2,78 2 2 995 775 56 055 1,87 9 390 1,78 3 2 029 323 39 562 1,95 4 2 013 557 33 573 1,67 5 723 1,19 5 1 436 189 26 883 1,87 6 1427 731 25 073 1,76 1 755 0,89 7 994 288 15 669 1,58 8 964 481 14 776 1,53 503 0,59 9 460 317 6 513 1,41 10 479 746 6 816 1,42 -52 0,30 11 202 494 2 930 1,45 12 192 990 2 806 1,45 0 0,12 * Korjattu tasoon 1,78 pmoolia = 3 033 740 cpm C. Pohdinta ·,·!· 5 ' Kuten taulukon 9 sisältämistä tuloksista voidaan nähdä, tutkimus osoitti, että pep tidi sitoutui spesifisesti soluihin, osoitettuna leimaamattoman peptidin aiheuttaman kompetitiivisen inhibition avulla. Solut eivät kuitenkaan olleet kyllästyneet tässä ; . . tutkimuksessa käytetyn leimatun peptidin määrällä. Peptidin hajoamista esiintyi li- 10 säksi 143 minuutissa.

• · • · · ··· , , ... * ··· ·.

Toinen tutkimus suoritettiin käyttäen 30 minuutin inkubointijaksoa ja leimatun • · · ’ peptidin suurempaa määrää solujen kyllästyksen saavuttamiseksi. Kuten taulukosta 10 nähdään, spesifinen sitoutuminen osoitettiin jälleen. Edelleen, kyllästys saavu- :***: 15 tettiin kuten on osoitettu tasoittamalla sitoutuneiden pulssien määrä leimatun pep- • · · Λ tidin suurissa pitoisuuksissa.

♦ t ·

Sitoutumistutkimukset osoittavat siten, että tämän keksinnön mukainen C-teiminaalinen peptidi sitoutuu spesifisesti keuhkojen epiteelisoluihin.

20 46 102180

Edellä oleva spesifikaatio, mukaan lukien spesifiset suoritusmuodot ja esimerkit, on tarkoitettu esillä olevaa keksintöä kuvaavaksi, eikä sitä tule käsittää rajoittavana. Lukuisia muita vaihteluja ja muunteluja voidaan toteuttaa poikkeamatta esillä olevan keksinnön mukaisesta aidosta hengestä ja piiristä.

* · 1 • · · • · • · • · • · · * 1 • · · • · « • · · • · • · • ·« · t • · • · • · ·

Claims (16)

102180

1. Menetelmä terapeuttisen polypeptidin valmistamiseksi, joka käsittää oleellisesti vähintään 10 aminohappotähdettä eikä enempää kuin noin 60 aminohappotäh- 5 dettä, ja siinä on vaihtelevasti hydrofobisia ja hydrofiilisiä aminohappotähdealueita, joita edustaa kaava (ZaUb)cZd, jossa: Z on hydrofiilinen aminohappotähde, joka on itsenäisesti valittu ryhmästä R, D, E ja K; 10. on hydrofobinen aminohappotähde, joka on itsenäisesti valittu ryhmästä V, 1, L, C, Yja F; a:lla on keskimääräinen aivo 1-5; b:llä on keskimääräinen aivo 3-20; c on 1-10;ja 15 d on 0-3; sillä ehdolla, että kun Z on K ja U on L, b ei ole 16, tunnettu siitä, että polypeptidi valmistetaan kiinteäfaasisysteemillä, jossa aminohappotähteet, jotka on suojattu selektiivisesti poistettavissa olevalla suojaryhmällä, lisätään peräjälkeen polypepti-; 20 diketjuun olosuhteissa, joissa muodostuu amidisidos peräkkäin lisättyjen amino- :' happotähteiden väliin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Z on R tai K. 1 . 25

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että U on C tai L. * · · • · · • ·

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että a on 1 tai 2; b *·*·* on 4-8; c on 2-4; ja d on 0 tai 1. • · · • · · • · · :*.<t 30

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidillä .···. on aminohappotähdesekvenssi KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK. • · #

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidillä '.'•i on aminohappotähdesekvenssi KLLLLLLLLKLLLLLLLLKLL. 35

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidillä on aminohappotähdesekvenssi KKLLLLLLLKKLLLLLLLKKL. 102180

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että b:llä on keskimääräinen aivo 3-12.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että b:llä on kes-5 kimääräinen arvo 3-10.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että a:lla on keskimääräinen arvo 1-3.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että c on 2-10.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että c on arvo 3-6.

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että d on 1-3. 15

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidillä on aminohappotähdesekvenssi, joka on valittu seuraavasta ryhmästä: DLLLLDLLLLDLLLLDLLLLD, ’ ‘ . 20 RLLLLRLLLLRLLLLRLLLLR, RLLLLLLLLRLLLLLLLLRLL, RRLLLLLLLRRLLLLLLLRRL, RLLLLCLLLRLLLLCLLLR, RLLLLCLLLRLLLLCLLLRLL, ja '•v 25 RLLLLCLLLRLLLLCLLLRLLLLCLLLR. • · v.:

15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidi :T: edelleen käsittää aminopään sekvenssin ja karboksipään sekvenssin, joissa: • · • · • · · 30 mainitut vaihtelevat hydrofobiset ja hydrofiiliset amino-happotähdealueet, joita • · *:* edustaa kaava (ZaUb)0Zd käsittävät aminopään sekvenssin; ja • · mainittu karboksipään sekvenssi käsittää oleellisesti aminohappotähdesekvenssin, : ·.! jota edustaa kaava:

35 -RLVLRCSMDDZ, jossa z on kokonaisluku 0 tai 1 siten, että kun z on 0, 102180 D-tähde, jonka alaviite se on, on poissa ja kun z on 1, D-tähde, jonka alaviite se on, on läsnä.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aminopään 5 sekvenssillä on komposiittihydrofobisuus alle 0.