NO177309B - Analogifremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt polypeptid - Google Patents

Description

Beskrivelse

Kryssreferanse til beslektet søknad

Foreliggende patentsøknad er en delvis fortsettelse

av løpende patentsøknad med serienr. 141.200, innsendt 6. januar 1988, med tittel Lunge-overflateaktivt protein og beslektet polypeptid (Cochrane et al.), hvis søknad herved inkorporeres ved referanse.

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av SP18-monomerbeslektede polypeptider anvendelige ved dannelse av syntetiske lungeoverflateaktive midler.

Bakgrunn

Lunge-overflateaktivt middel (PS) dekker det alveolære epitel av fullt utviklede pattedyrlunger. Naturlig. PS er beskrevet som et "lipoproteinkompleks" fordi det inneholder både fosfolipider og apoproteiner som påvirker hverandre til reduksjon av overflatespenning på lungens luft-væske-grenseflate.

Etterfølgende oppdagelsen av lunge-overflateaktivt middel og det påfølgende funn at mangelen på dette stoff var den primære årsak til neonatal respiratorisk lidelse-syndrom (RDS), har et antall undersøkelser vært rettet mot utvikling av en effektiv terapi for erstatning av overflateaktivt middel hos berørte individer, spesielt barn, ved anvendelse av eksogent PS. F.eks. er det demonstrert forbedringer i lungefunksjon målt ved en forminskelse av gjennomsnittlig luftveistrykk og oxygenbehov hos humane for tidlig fødte barn. Se Hallman et al., Pediatrics, 71:473-482 (1983); Merritt et al., J. Pediatr., 108:741-745 (1986); Hallman et al.,

J. Pediatr., 106:963-969 (1985); Morley et al., Lancet, i:64-68 (1981); Merritt et al., New England J. Med., 315:785-790 (1986), Smyth et al., Pediatrics, 71:913-917

(1983); Enhorning et al., Pediatrics, 76:145-153 (1985); Fujiwara et al., The Lancet, 1:55-59 (1980); Kwong et al., Pediatrics, 76:585-592 (1985); Shapiro et al., Pediatrics, 76:593-599 (1985); Fujiwara, i "Pulmonary Surfactant", Robertson, B., Van Golde, L.M.G., Batenburg J. (red.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam, s. 479-503 (1984).

Fra et farmakologisk synspunkt ville det optimale eksogene PS for anvendelse ved behandling av RDS være et PS fullstendig syntetisert i laboratoriet, under kontrollerte og sterile betingelser, med ubetydelig porsjonrtil-porsjon-variabilitet i egenskaper. For å minisere muligheten for immunologiske komplikasjoner bør apoproteinbestanddelen av et eksogent PS være identisk med bestanddelen funnet hos mennesker. Beklageligvis er sammensetningen av naturlig forekommende PS kompleks, og kjent teknikk har ikke til nå identifisert alle de biokjemiske bestanddeler som frembringer de biofysiske egenskaper påkrevet for høy fysiologisk aktivitet i lunger. Spesielt har kjent teknikk mislykkes i å karakterisere alle tilstedeværende apoproteiner i naturlig PS, eller identifisere funksjonen av PS-apoproteinene som for tiden er kjent.

Det bør bemerkes at litteraturen angående PS-apoproteiner og deres rolle i overflateaktiv funksjon er kompleks, inkonsekvent og noen ganger selvmotsigende, fordi heterogene apoproteinpreparater ble anvendt i mange undersøkelser. Til dags dato har teknikken ikke definitivt fastslått antall forskjellige apoproteiner tilstede i naturlig PS.

Av spesiell interesse for den foreliggende oppfinnelse er anvendelsen av et lavmolekylvekt (LMW) humant PS-asso-siert apoprotein som en bestanddel i et eksogent overflateaktivt middel. Flere undersøkelser har forsøkt å isolere eller definere humane PS-LMW-apoproteiner ved anvendelse av biokjemiske teknikker. Se f.eks. Phizackerley et al., Biochem. J., 183:731-736 (1979), Revak et al., Am. Rev. Resp. Dis., 134-1258-1265 (1986), Suzuki et al., Eur. J. Respir. Dis., 69:335-345 (1986), Taeusch et al., Pediatrics, 77:572-581 (1986), Yu et al., Biochem. J., 236:85-89 (1986), Whitsett et al., Pediatric Res., 20:460-467 (1986), Whitsett et al., Pediatric Res., 20:744-749 (1986), Takahashi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 135:527-532 (1986), Suzuki

et al., Exp. Lung. Res., 11:61-73 (1986), Curstedt et al.,

Eur. J. Biochem., 168:255-262 (1987), Notter et al., Chem. Phys. Lipids, 44:1-17 (1987) og Phelps et al., Am. Rev. Respir. Dis., 135:1112-1117 (1987).

Nylig har teknikken begynt å anvende fremgangsmåtene ifølge rekombinant DNA-teknologi for å overvinne problemene med ikke å være i stand til å isolere til homogenitet de individuelle LMW-PS-apoproteiner. F.eks. rapporterte Glasser et al., Proe. Nati. Acad. Sei., U.S.A., 84:4007-4011 (1987),

en cDNA-avledet sekvens av aminosyrerester som danner minst en del av et humant forløperprotein fra hvilket minst ett modent LMW-apoprotein som ble betegnet SPL(Phe), dannes.

Fordi Glasser et al. ikke var i stand til å bestemme carboxy-terminalresten av SPL(Phe), og derfor ikke var i stand til å identifisere dens fullstendige sekvens, forutsa de at modent SPL(Phe) besto av 60 aminosyrer.

Jacobs et al., J. Biol. Chem., 262:9808-9811 (1987), har beskrevet et cDNA og en avledet aminosyrerestsekvens for et humant forløperprotein lignende proteinet beskrevet av Glasser et al., ovenfor. Ifølge Jacobs et al. ville imidlertid det modne LMW-apoprotein som ble betegnet PSP-B, dannet fra forløperen, bestå av 76 aminosyrerester. I tillegg bemerket Jacobs et al. at det ikke var klart at ethvert PS-apoprotein, avledet fra det rapporterte forløperprotein,

var til stede i preparatene av overflateaktivt middel som hadde vært studert klinisk av andre.

Fra det foregående kan det sees at litteraturen inneholder mangfoldig nomenklatur for det som tilsynelatende er det samme PS-apoprotein. For å lette diskusjonen vil derfor det modne apoprotein avledet fra forløperproteinet beskrevet av Glasser et al. ovenfor, og Jacobs et al. ovenfor, heri refereres til som "SP18", med de monomere og dimere former referert til som hhv. "SPl8-monomer" og "SP18-dimer", når hensiktsmessig.

Hunde-SPl8-forløperen er beskrevet av Hawgood et al., Proe. Nati. Acad. Sei., U.S.A., 84:66-70 (1987) og Schilling et al., international patentsøknad WO 86/03408. Imidlertid bør det anmerkes at begge disse undersøkelser led av den samme manglende evne til å definere den modne, biologisk aktive form av SP18, på samme måte som undersøkelsene ifølge Glasser et al., ovenfor, og Jacobs et al., ovenfor.

Warr et al., Proe. Nati. Acad. Sei., U.S.A., 84:7915-7919 (1987), beskriver en cDNA-avledet sekvens med 197 aminosyrerester som danner et forløperprotein fra hvilket et modent LMW-apoprotein, betegnet SP5, dannes. På samme måte som studiene som forsøkte å beskrive SP18, var Warr et al. ikke i stand til å bestemme den carboxy-terminale rest av det modne protein dannet fra forløperproteinsekvensen,

og var således ikke i stand til å definitivt karakterisere SP5.

Fordi aminosyrerests.ekvensen av forløperproteinet rapportert av Warr et al. er forskjellig fra sekvensen rapportert av Glasser et al. og Jacobs et al., synes det derfor at kjent teknikk har bestemt at naturlig PS inneholder minst to LMW-apoproteiner. Imidlertid har de biologisk aktive former av disse proteiner forblitt ubestemt.

SP18 kan fremstilles som en SP18-monomerholdig blanding hvori SP18-monomeren er til stede i enten i det vesentlige isolert eller i det vesentlige ren form. Ved "isolert" er ment at SP18-monomer og SP18-dimer er til stede som en del av en blanding som er fri for andre alveolære overflateaktive proteiner.

Ved "i det vesentlige ren" er ment at SPl8-monomer

er til stede som en del av en blanding fri for andre alveolære overflateaktive proteiner og hvori mindre enn 20%, fortrinnsvis mindre enn 10% og helst mindre enn 5%, av den tilstedeværende SP18-monomer foreligger i en homodimer

form, dvs. tilstedeværende som en del av SPl8-dimer.

Fortrinnsvis inneholder en SP18-monomerholdig blanding human SP18-monomer. Helst inneholder en SP18-monomerholdig blanding SP18-monomer med en aminosyrerestsekvens tilsvarende aminosyrerestsekvensen vist i figur 1 fra tilnærmet restposisjon 1 til minst tilnærmet restposisjon 75, fortrinnsvis til minst tilnærmet posisjon 81. Helst korresponderer SP18-monomer i sekvens til sekvensen vist i figur 1 fra restposisjon 1 til restposisjon 81.

Fortrinnsvis korresponderer aminosyrerestsekvensen av en SP18-monomer i en SP18-monomerholdig blanding til sekvensen av en nativ SP18-monomer. Imidlertid bør det forstås at en SP18-monomer anvendt for å danne proteinblandingen, ikke be-høver å være identisk med aminosyrerestsekvensen av en nativ SP18-monomer, men kan være utsatt for forskjellige endringer, slik som de beskrevet i det etterfølgende for et polypeptid fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, så lenge som slike modifikasjoner ikke ødelegger overflateaktiviteten. Slikt modifisert protein kan fremstilles, som er velkjent i teknikken, gjennom f.eks. genomisk sete-styrt mutagenese.

"Overflateaktivitet" for et protein eller polypeptid er definert som evnen, når kombinert med lipider, enten alene eller i kombinasjon med andre proteiner, til å utvise aktivitet i in vivo-analysebestemmelsen ifølge Robertson, Lung, 158:57-68 (1980). I denne analysebestemmelse administreres prøven som skal vurderes, gjennom et endotrachealt rør til kaninfostere eller til lam født for tidlig ved keisersnitt.

(Disse "for tidlig fødte" mangler sitt eget PS og hjelpes ved en ventilator.) Målinger av lungeettergivenhet, blodgasser og ventilatortrykk tilveiebringer indikasjoner på aktivitet. Preliminær vurdering av aktivitet kan også utføres ved en in vitro analysebestemmelse, f.eks. den ifølge King et al., Am. J. Physiol., 223:715-726 (1972), eller den nedenfor illu-strerte som anvender en måling av overflatespenning på en vann-luft-grenseflate når et protein eller polypeptid blandes med et fosfolipid.

I levende organismer står aminosyrerestsekvensen av et protein eller polypeptid direkte, via den genetiske kode, i forbindelse med deoxyribonucleinsyre (DNA)-sekvensen av det strukturelle gen som koder for proteinet. Således kan et strukturelt gen defineres ved aminosyrerestsekvensen, dvs. protein eller polypeptid, som det koder for.

Et viktig og velkjent trekk ved den genetiske kode er dens overflod. Dvs. at for de fleste aminosyrer anvendt for å danne proteiner, kan mer enn en kodende nucleotidtriplett

(kodon) kode for eller betegne en spesiell aminosyrerest. Derfor kan flere forskjellige nucleotidsekvenser kode for en spesiell aminosyrerestsekvens. Slike nucleotidsekvenser er betraktet som funksjonelt ekvivalente fordi de kan føre til produksjonen av den samme aminosyrerestsekvens i alle organismer. En gang i blant kan en methylert variant av et purin eller pyrimidin inkorporeres i en gitt nucleotidsekvens. Imidlertid påvirker ikke slike methyleringer kodingsforholdet på noen måte.

Et DNA-segment som koder for en SP18-monomer, fortrinnsvis human SP18-monomer, er kjennetegnet ved at DNA-segmentet danner et strukturelt gen som er i stand til å uttrykke en SP18-monomer. Mens kodonene av DNA-segmentet ikke behøver å være colineære med aminosyrerestsekvensen av SP18-monomer på grunn av tilstedeværelsen av et intron, er det foretrukket at det strukturelle gen er i stand til å uttrykke SP18-monomer i fullt utviklet form, dvs. uten behovet for post-translasjonen proteolytisk behandling. Fortrinnsvis er . genet til stede som en uavbrutt lineær serie av kodoner hvor hvert kodon koder for en aminosyrerest funnet i en SP18-monomer, dvs. et gen uten innhold av introner.

Et DNA-segment i det vesentlige bestående av sekvensen vist i figur 1 fra tilnærmet nucleotidposisjon 187 til tilnærmet nucleotidposisjon 426, fortrinnsvis til tilnærmet nucleotidposisjon 429, er i stand til å uttrykke SP18-monomer.

DNA-segmenter som koder for SP18-monomer, kan lett syntetiseres ved kjemiske fremgangsmåter, f.eks. fosfotri-esterfremgangsmåten ifølge Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc, 103:3185 (1981). Selvsagt kan, ved kjemisk syntetisering av kodingssekvensen, alle ønskede modifikasjoner utføres ved ganske enkelt å substituere de passende baser med de som koder for den native aminosyrerestsekvens.

Rekombinante nucleinsyremolekyler kan fremstilles ved operativt å binde en vektor til et nucleinsyresegment.

Betegnelsen "operativt bundet" betyr at nucleinsyresegmentet er festet til vektoren slik at ekspresjon av det strukturelle gen dannet av segmentet, er under kontroll av vektoren.

Betegnelsen "vektor" refererer til et nucleinsyremolekyl som er i stand til replikasjon i en celle, og til hvilket et annet nucleinsyresegment kan bli operativt bundet for å avstedkomme replikasjon av det festede segment. Vektorer som er i stand til å styre ekspresjonen av et strukturelt gen som koder for SP18-monomer, refereres til som "ekspresjonsvektorer". Således er et rekombinant nucleinsyremolekyl (rDNA eller rRNA) et hybridmolekyl som omfatter minst to nucleotidsekvenser som ikke normalt er funnet sammen i naturen.

Valget av vektor til hvilken nucleinsyresegmentet er operativt bundet, avhenger direkte, noe som er velkjent i teknikken, av de ønskede funksjonelle egenskaper, f.eks. proteinekspresjon, og av vertcellen som skal transformeres, og dette er begrensninger iboende i teknikken med konstruksjon av rekombinante nucleinsyremolekyler.

Vektoren som styrer replikasjon og ekspresjon av SP18-monomer-strukturelt gen er et prokaryotisk replikon, dvs. en DNA-sekvens med evnen til direkte autonom replikasjon og vedlikeholdelse av et rDNA-molekyl ekstrakromosomalt i en prokaryotisk vertcelle, slik som en bakteriell vertcelle transformert dermed. Typiske bakterielle medikamentresistente gener er de som gir resistens mot ampicillin eller tetra-cyclin.

De vektorer som innbefatter et prokaryotisk replikon, kan også innbefatte en prokaryotisk promotor som er i stand til å styre ekspresjonen (transkripsjon og translasjon) av et SP18-monomert gen i en bakteriell vertcelle, slik som E. coli, transformert dermed. En promotor er en ekspresjonskontroll-bestanddel dannet av en DNA-sekvens som tillater binding av RNA-polymerase og transkripsjon å forekomme. Promotorsekvenser som er forenlige med bakterielle verter, tilveiebringes typisk i plasmide vektorer inneholdende egnede restriksjonsseter for innføyelse av et DNA-segment. Typiske eksempler på slike vektorplasmider er pUC8, pUC9, pBR322 og pBR329 tilgjengelige fra Biorad Laboratories, (Richmond, CA) og pPL og pKK223 tilgjengelige fra Pharmacia, Piscataway, N.J.

Ekspresjonsvektorer forenlige med eukaryotiske celler, fortrinnsvis de som er forenlige med vertebratceller, kan også anvendes for å danne et rDNA-molekyl. Eukaryotiske celle-ekspresjonsvektorer er velkjente i teknikken og er tilgjengelige fra flere kommersielle kilder. Slike vektorer tilveiebringes typisk inneholdende egnede restriksjonsseter for innføyelse av det ønskede DNA-segment. Typiske eksempler på slike vektorer er pSVL og pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-l/pML2d (International Biotechnologies, Inc.) og pTDTl (ATCC, nr. 31255).

En eukaryotisk celle-ekspresjonsvektor anvendt for å konstruere et rDNA-molekyl innbefatter en utvelgelsesmarkør som er effektiv i en eukaryotisk celle, fortrinnsvis en medikamentresistens-utvelgelsesmarkør. En foretrukket medika-mentresistens-markør er genet hvis ekspresjon fører til neomycin-resistens, dvs. neomycin-fosfotransferase (neo)genet. Southern et al., J. Mol. Appl. Genet., 1:327-341 (1982).

Retrovirale ekspresjonsvektorer kan også anvendes for å danne et rekombinant nucleinsyremolekyl. Betegnelsen "retroviral ekspresjonsvektor" refererer til et nucleinsyremolekyl som innbefatter en promotorsekvens avledet fra det lange terminale gjentagelsesområde (LTR) av et retrovirus-genom.

Ekspresjonsvektoren kan være en retroviral ekspresjonsvektor som er replikasjonsudyktig i eukaryotiske celler. Konstruksjonen og anvendelsen av retrovirale vektorer er beskrevet av Sorge et al., Mol. Cell. Biol., 4:1730-37 (1984).

Mange forskjellige fremgangsmåter er utviklet for operativt å binde nucleinsyresegmenter til vektorer via komplementære cohesive terminaler. F.eks. kan komplementære homopolymere områder tilsettes til nucleinsyresegmentet som skal innføyes, og til en terminal del av vektornucleinsyren. Vektoren og nucleinsyresegmentet sammenføyes deretter ved hydrogenbinding mellom de komplementære homopolymere haler under dannelse av et rekombinant nucleinsyremolekyl.

Syntetiske linkere inneholdende ett eller flere restriksjonsseter, tilveiebringer en alternativ fremgangsmåte for å binde et nucleinsyresegment til vektorer. F.eks. be-handles et DNA-segment med bakteriofag T4-DNA-polymerase eller E. coli-DNA-polymerase-I, enzymer som fjerner utstikkende, 3', enkelt-trådede terminaler med deres 3'-5'-exonucleolytiske aktiviteter, og tilføyer innskårne 3'-ender med deres poly-meriserende aktiviteter. Kombinasjonen av disse aktiviteter danner derfor butt-endede DNA-segmenter. De butt-endede segmenter inkuberes deretter med et stort molart overskudd av linkermolekyler under tilstedeværelse av et enzym som er i stand til å katalysere ligeringen av butt-endede DNA-mole-kyler, slik som bakteriofag T4-DNA-ligase. Således er produkt-ene av reaksjonen DNA-segmenter som bærer polymere linker-sekvenser ved deres ender. Disse DNA-segmenter spaltes deretter med det egnede restriksjonsenzym og ligeres til en ekspresjonsvektor som er blitt spaltet med et enzym som danner terminaler som er forenlige med terminalene i DNA-segmentet.

Syntetiske linkere inneholdende en mengde restrik-sjonsendonuclease-seter, er kommersielt tilgjengelige fra et antall kilder innbefattet International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT.

For rekombinant fremstilling av SP18 kan det anvendes en vertcelle transformert med et rekombinant nucleinsyremolekyl, fortrinnsvis et rDNA som er i stand til å uttrykke en SP18-monomer. Vertcellen kan enten være prokaryotisk eller eukaryotisk.

"Celler" eller "transformerte vertceller" eller "vertceller" anvendes ofte om hverandre som det vil fremgå fra sammenhengen. Disse betegnelser innbefatter den direkte foreliggende celle, og selvsagt avkom derav. Det er å forstå at ikke alle avkom er nøyaktig identiske med morcellen på grunn av endringsmutasjoner eller forskjeller i omgivelser. Imidlertid er slike endrede avkom innbefattet når betegnelsene ovenfor anvendes.

Bakterieceller er foretrukne prokaryotiske vertceller og er typisk en stamme av E. coli som f.eks. E. coli-stammen DH5 tilgjengelig fra Bethesda Research Laboratories, Inc., Bethesda, MD. Foretrukne eukaryotiske vertceller innbefatter gjærceller og pattedyrceller, fortrinnsvis vertebratceller slik som cellene fra mus, rotte, ape eller human fibroblast-cellelinje. Foretrukne eukaryotiske vertceller innbefatter kinesisk hamsterovarium (CHO)-celler tilgjengelige fra ATCC som CCL61 og NIH sveitiske museembryoceller NIH/3T3 tilgjengelige fra ATCC som CRL 1658. Transformering av egnede celle-verter med et rekombinant nucleinsyremolekyl utføres ved hjelp av velkjente fremgangsmåter som typisk avhenger av den anvendte vektortype. Med hensyn til transformering av prokaryotiske vertceller, se f.eks. Cohen et al., Proe. Nati. Acad. Sei., U.S.A., 69:2110 (1972); og Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982). Med hensyn til transformering av vertebratceller med rekombinante nucleinsyremolekyler inneholdende retrovirusvektorer, se f.eks. Sorge et al., Mol. Cell. Biol., 4:1730-37 (1984); Graham et al., Virol., 52:456

(1973); og Wigler et al., Proe. Nati. Acad. Sei., U.S.A., 76:1373-76 (1979).

Vellykket transformerte celler, dvs. celler som inneholder et rekombinant nucleinsyremolekyl, kan identifiseres ved hjelp av velkjente fremgangsmåter. F.eks. kan celler som fremkommer fra introduksjonen av en rDNA, klones for å danne monoklonale kolonier. Celler fra disse kolonier kan høstes, lyseres, og deres DNA-innhold kan undersøkes for tilstedeværelse av rDNA ved anvendelse av en fremgangsmåte som beskrevet av Southern, J. Mol. Biol., 98:503 (1975) eller Berent et al., Biotech., 3:208 (1985).

I tillegg til direkte analyse for tilstedeværelse av rDNA kan vellykket transformering bekreftes ved hjelp av velkjente immunologiske fremgangsmåter når rDNA er i stand til å styre ekspresjonen av en SP18-monomer. F.eks. danner celler som er vellykket transformert med en ekspresjonsvektor operativt bundet til et DNA-segment, proteiner som utviser SP18-monomer antigenitet. En prøve av en cellekultur som er mistenkt for å inneholde transformerte celler, blir således høstet og analysert for human SP18 ved anvendelse av antistoffer spesifikke for dette antigen, idet produksjonen og anvendelsen av slike antistoffer er velkjente i teknikken.

Næringsmedier anvendelige for dyrkning av transformerte vertceller, er velkjente i teknikken og kan erholdes fra flere kommersielle kilder. I utførelsesformer hvori vertcellen er en pattedyrcelle, anvendes fortrinnsvis et "serumfritt" medium.

Fremgangsmåter for gjenvinning av et uttrykt protein fra en kultur er velkjente i teknikken og innbefatter fraksjo-nering av den proteinholdige del av kulturen ved anvendelse av velkjente biokjemiske fremgangsmåter. Det kan f.eks. anvendes fremgangsmåtene for gelfiltrering, gelkromatografi, ultrafil-trering, elektroforese, ionebytte, affinitetskromatografi og lignende, som er kjent for proteinfraksjoneringer, for å isolere de uttrykte proteiner funnet i kulturen. I tillegg kan immunokjemiske fremgangsmåter slik som immunoaffinitet, immunoadsorpsjon og lignende, utføres ved anvendelse av velkjente fremgangsmåter.

Sammendrag

Det er nå funnet at humant SP18 er et homodimert protein (SP18-dimer) hvis modne underenhetsprotein (SP18-monomer) oppviser en tilsynelatende molekylvekt på tilnærmet 9.000 dalton når bestemt ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE).

Det er også oppdaget at humant SP18 kan virke som en aktiv bestanddel i et syntetisk lunge-overflateaktivt stoff i fravær av andre tidligere identifiserte lunge-overflateaktive proteiner.

I tillegg er den carboxy-terminale aminosyrerestsekvens av det modne humane SP18-monomere protein bestemt, og således er dets naturlig forekommende form nå påvist.

Foreliggende oppfinnelse angår således en analogifremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt polypeptid vesentlig bestående av minst 10 aminosyrerester og ikke fler enn tilnærmet 60 aminosyrerester med vekslende hydrofobe og hydrofile aminosyrerestområder representert ved formelen (<Z>a<U>b)<cZ>d, hvori: Z er en hydrofil aminosyrerest uavhengig utvalgt fra R, D, E og K;

U er en hydrofob aminosyrerest uavhengig utvalgt fra V, I, L, C og F;

a har en gjennomsnittlig verdi på 1 til 5;

b har en gjennomsnittlig verdi på 3 til 10;

c er 1 til 10; og

d er 0 til 3;

kjennetegnet ved at polypeptidet fremstilles ved fast-fase-syntese hvor aminosyrerester, hvilke hver er beskyttet med en egnet beskyttende gruppe som selektivt kan fjernes, adderes sekvensielt til en voksende polypeptidkjede under betingelser

for dannelse av amidbindinger mellom suksessivt tilførte aminosyrerester.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 illustrerer en cDNA-sekvens med 750 nucleotider (øvre linjer) og den utledede aminosyrerestsekvens (nedre linjer). Tallet til høyre for hver linje av nucleotider representerer den numeriske posisjon i nucleotidsekvensen ved enden av hver linje. Nucleotidene er gruppert i kodoner,

15 kodoner pr. linje, med aminosyreresten kodet for av hvert kodon vist med tre bokstavers kode direkte under kodonet. Den numeriske posisjon av noen rester i aminosyrerestsekvens kodet for av cDNA, er vist under restene. Den amino-terminale aminosyrerest av moden human SP18-monomer er Phe (kodet for av nucleotider 187-189) og er betegnet rest nr. 1. Den carboxy-terminale aminosyrerest er Asp ved restposisjon 81 (kodet for av nucleotider 427-429) . Et strukturelt gen som koder for moden SP18-monomer, inneholder derfor 81 kodoner og har en nucleotidsekvens som tilsvarer nucleotider 187-429." Figur 2 illustrerer protein-elueringsprofilen av PS-apoproteiner fra en "Bio-Sil" HA-(kiselsyre) kolonne. Resultater av Pierce BCA-proteinanalyse (heltrukken linje) og fosfolipidanalyser (stiplet linje) er vist for utvalgte fraksjoner. To milliliter (ml) ble innsamlet pr. fraksjon. Positiv proteinbestemmelse i fraksjon 28 til 33 skyldes tilstedeværelsen av fosfolipider. Figur 3 illustrerer en SDS-PAGE av lavmolekylvekt (LMW) PS-apoproteiner farget med sølv. Feltene A og B viser en prøve etter kiselsyre- eller Sephadex<®> LH-20-kromatografi; begge LMW-proteiner er til stede. Feltene B, C, E og F viser spaltningen av SP18 (felt B og E) og SP9 (felt C og F) etter kromatografi på Sephadex<®> LH-60. Molekylvektstandarder er vist i felt G. Feltene A-C er ikke-reduserte prøver, feltene D-F inneholder identiske prøver redusert med mercaptoethanol før elektroforese. Figur 4 illustrerer innsugning og uttømning trykk/volum-kurver av kaninfosterlunger 30 minutter etter intratracheal tildrypping av 100 pl saltvann (åpne sirkler), 2 mg fosfolipider (PL) DPPC:PG, 3:1 (fylte sirkler), PL + 10 <y>gsP9 (åpne firkanter) PL + 10 ug SP18 (fylte firkanter), eller 2 mg naturlig humant overflateaktivt middel (lukkede trekanter) . Data uttrykkes som gjennomsnittet av 4 dyr - ett standardavvik. Figur 5 illustrerer lungevevsprøver fra kaninfoster (125 gangers forstørrelse, hematoxylin-eosin-farging) etterfulgt av behandling med saltvann (A), naturlig humant overflateaktivt middel (B), fosfolipider DPPCrPG (C) eller fosfolipider pluss LMW-apoproteiner (SP9 + SP18) (D). Figur 6 illustrerer overflateaktiviteten av poly-peptideksempel inneholdende syntetiske overflateaktive midler fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse. Overflateaktivitet ble bestemt ved måling av trykkgradienten gjennom en luft/væske-interfase ved anvendelse av den pulserende boble-teknikk. Trykkgradienten (AP) gjennom overflaten av boblen er den absolutte verdi av trykket registrert i centimeter H20. Resultatene erholdt for hvert syntetisk lunge-overflateaktivt middel er identifisert ved polypeptidet i det overflateaktive middel. Resultater erholdt for overflateaktive midler bestående av fosfolipider alene (dvs. uten noen tilsetning av peptid eller protein) er identifisert som PL. Resultatene erholdt ved anvendelse av et kontrollpeptid med kun 8 aminosyrerester og med en sekvens tilsvarende humane SP18-monomer-rester 74-81 (p74-81) er også vist. De viste datatidspunkter ble erholdt ved 15 sekunder, 1 minutt og 5 minutter. Figur 7 er en serie på to diagrammer som illustrerer resultatene av et studium over statisk ettergivenhet for typiske eksempler på syntetiske overflateaktive midler fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse ved anvendelse av kaninfostermodellen tidligere beskrevet i Revak et al., Am. Rev. Respir. Dis., 134:1258-1265 (1986). Etterfølgende tildrypping av

et syntetisk overf lateaktivt. middel eller en kontroll i luft-røret, ble kaninen ventilert i 30 minutter før statiske ettergivenhetsmålinger ble foretatt. "x"-aksen representerer trykket i cm vann, mens "y"-aksen representerer volumet i ml/kg kroppsvekt. Diagrammet til venstre representerer verdier ved innsugning, og diagrammet til høyre representerer uttømningsverdier. Resultatene for de følgende testede over-

flateaktive midler er illustrert: naturlig overflateaktivt middel (åpen firkant med en prikk i sentrum), fosfolipid (PL) med 7% p52-81 (et polypeptid tilsvarende rester 52 til 81 av SP18) (fylte romber); PL med 3% P52-81 (fylte firkanter med hvit prikk i midten); PL med 7% p36-81 (åpne romber);

PL med 3% p66-81 (fylte firkanter); PL med 3% pl-15 (åpne firkanter) og PL-kontroll (lukkede trekanter).

Figur 8 er en serie på to diagrammer som illustrerer resultatene av en undersøkelse over statisk ettergivenhet for typiske eksempler på syntetiske overflateaktive midler fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse. Fremgangsmåten ble ut-

ført som beskrevet i figur 7, med unntak av at en annerledes fremgangsmåte for tildrypping ble anvendt. "x"- og "y"-aksen og høyre og venstre diagrammer er som beskrevet i figur 7. Resultater for de følgende testede overflateaktive midler er illustrert: naturlig overflateaktivt middel (åpne firkanter med en prikk i sentrum); fosfolipid (PL) med 10% p51-81 (fylte romber); PL med 10% p51-76 (fylte firkanter); og PL (fylte trekanter).

Definisjoner

Aminosyre: Alle aminosyrerester identifisert heri, foreligger i den naturlige L-konfigurasjon. I overensstemmelse med standard polypeptidnomenklatur, J. Biol. Chem., 243:3557-59, (1969), er forkortelser for aminosyrerester vist i den følgende korrespondansetabell:

Det bør anmerkes at alle aminosyrerestsekvenser er representert heri ved formler hvis orientering fra venstre mot høyre foreligger i den konvensjonelle retning av amino-terminal til carboxy-terminal. Videre bør det anmerkes at en tanke-strek ved begynnelsen eller enden av en aminosyrerestsekvens indikerer en binding til et radikal som H og OH (hydrogen og hydroxyl) ved hhv. amino-terminalen og carboxy-terminalen, eller en videre sekvens av én eller flere aminosyrerester.

I tillegg bør det anmerkes at en skråstrek (/) ved den høyre ende av en restsekvens indikerer at sekvensen fortsettes på den neste linje.

Polypeptid og peptid; Polypeptid og peptid er betegnelser anvendt vekslende heri for å betegne en lineær serie av ikke fler enn 60 aminosyrerester forbundet med hverandre ved peptidbindinger mellom alfa-aminogrupper og carboxygrupper hos tilstøtende rester.

Protein; Protein er en betegnelse anvendt heri for å betegne en lineær serie av mer enn tilnærmet 60 aminosyrerester forbundet med hverandre som i et polypeptid.

Nucleotid; En monomer enhet av DNA eller RNA bestående av en sukkerdel (pentose), et fosfat og en nitrogen-holdig heterocyklisk base. Basen er bundet til sukkerdelen via det glycosidiske carbon (1' carbon av pentosen), og denne kombinasjon av base og sukker er et nucleosid. Når nucleosidet inneholder en fosfatgruppe bundet til 3'- eller 5'-posisjonen av pentosen, refereres den til som et nucleotid.

Basepar (bp): Et makkerskap av adenin (A) med thymin (T), eller av cytosin (C) med guanin (G) i et dobbelt-

trådet DNA-molekyl.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Et polypeptid fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse (foreliggende polypeptid) er karakterisert ved dets aminosyrerestsekvens og hittil ukjente funksjonelle egenskaper. Et foreliggende polypeptid danner, når blandet med et farmasøytisk akseptabelt fosfolipid, et syntetisk lunge-overflateaktivt middel med en overflateaktivitet høyere enn overflateaktiviteten av fosfolipidet alene (som vist ved en lavere AP som vist i figur 6, og et høyere volum pr. gitt trykk som vist i figur 7 og 8).

Som vist i figur 1, har SP18 et stort hydrofobt område (rester 1 til tilnærmet 75), etterfulgt av et relativt kort hydrofilt område ved carboxy-terminalen (rester 76 til 80, eller 81). Ved referanse til aminosyrerestnummere av SP18-sekvensen, er disse rester som illustrert i figur 1.

I en utførelsesform består et foreliggende polypeptid i det vesentlige av minst tilnærmet 10, fortrinnsvis minst 11, aminosyrerester, og ikke fler enn tilnærmet 60, mer vanlig færre enn tilnærmet 35 og fortrinnsvis færre enn tilnærmet 25 aminosyrerester som tilsvarer sekvensen av SP18-monomer.

Vanligvis tilsvarer aminosyresekvensen av et polypeptid fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse en enkel gruppe av tilgrensende rester i den lineære sekvens av SP18. Imidlertid angår også foreliggende oppfinnelse fremstilling av polypeptider som tilsvarer mer enn én del av SP18-sekvensen. Vanligvis vil minst én sekvens som tilsvarer minst 10, fortrinnsvis minst 15, tilgrensende rester av det hydrofobe område av SP18, være til stede i peptidet. Et stort antall hydrofobe aminosyresekvensområder kan være til stede.

Et foreliggende polypeptid vil fortrinnsvis innbefatte, som dets carboxy-terminale sekvens, minst 5 tilgrensende rester i den lineære sekvens av SP18 innbefattet rest 80. Således kan polypeptidene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatte én eller flere grupper av aminosyrerester som tilsvarer deler av SP18 slik at en sekvens som tilsvarer en første gruppe av tilgrensende rester av SP18-monomeren, kan være tilstøtende en sekvens som tilsvarer en andre gruppe av tilgrensende rester fra den samme eller en annen del av SP18-monomeren i polypeptidsekvensen. Den foreliggende oppfinnelse angår også fremstilling av peptider med to eller flere sekvenser som tilsvarer en enkel gruppe av tilgrensende aminosyrerester fra den lineære sekvens av SP18.

Typiske eksempler på foretrukne polypeptider fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse som i aminosyrerestsekvens tilsvarer human SP18-monomer hydrofobt område, er vist i tabell 1.

I foretrukne utførelsesformer er et foreliggende polypeptid videre kjennetegnet ved å ha en carboxy-terminal aminosyrerestsekvens representert ved formelen:

-RLVLRCSMDD

li

hvori Z er et helt tall med en verdi på 0 eller 1, slik at når Z er 0, er D-resten til hvilken Z er en indeks, fraværende, og når Z er 1, er D-resten til hvilken Z er en indeks, til stede. Typiske eksempler på foretrukne "carboxy-terminale polypeptider" er vist i tabell 2.

Fortrinnsvis har et foreliggende polypeptid en aminosyrerestsekvens som tilsvarer en del av sekvensen vist i figur 1. Imidlertid bør det oppfattes at et polypeptid fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse ikke behøver å være identisk med aminosyrerestsekvensen av en nativ SP18-monomer. Derfor kan et polypeptid fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse utsettes for forskjellige endringer som innføyelser, utslett-elser og substitusjoner, enten konserverende eller ikke-konserverende, der hvor slike endringer tilveiebringer visse fordeler i deres anvendelse.

Konserverende substitusjoner er slike hvor en aminosyrerest erstattes av en annen, biologisk lignende rest. Eksempler på konserverende substitusjoner innbefatter substitusjonen av en hydrofob rest som isoleucin, valin, leucin eller methionin med en annen, eller substitusjonen av en polar rest med en annen, slik som arginin med lysin, glutaminsyre med asparaginsyre eller glutamin med asparagin og lignende. Betegnelsen "konserverende substitusjon" innbefatter også anvendelsen av en substituert aminosyre istedenfor en opphavelig usubstituert aminosyre, forutsatt at et slikt polypeptid også utviser den nødvendige bindingsaktivitet.

I en foretrukket utførelsesform substitueres en serinrest (S) med en cysteinrest (C), vanligvis ved minst en av restposisjoner 71 og 77. Fortrinnsvis har serinanalogen en sekvens som tilsvarer sekvensen av rester 51-76 av SP18-mono-meren med substitusjonen ved rest 71, eller med sekvensen av restene 51-81 med serinsubstitusjoner ved 71 og 77.

Når et polypeptid fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse har en sekvens som ikke er identisk med sekvensen til en nativ SP18-monomer fordi én eller flere konserverende eller ikke-konserverende substitusjoner er utført, er vanligvis ikke mer enn tilnærmet 20 antallsprosent og mer vanlig ikke mer enn 10 antallsprosent av aminosyrerestene substituert, unntatt der hvor ytterligere rester er tilført ved den ene eller andre terminal, med den hensikt å tilveiebringe en "linker" ved hjelp av hvilken polypeptidene passende kan festes til et merkestoff eller en fast matriks, eller et bærerstoff. Merke-stoffer, faste matrikser og bærerstoffer som kan anvendes med polypeptidene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, er beskrevet i det følgende.

Aminosyrerest-linkere er vanligvis minst en rest og kan være 40 eller flere rester, ofte 1 til 10 rester som ikke korresponderer i aminosyrerestsekvens med en nativ SP18-monomer. Typiske aminosyrerester anvendt som linkere, er tyrosin, cystein, lysin, glutaminsyre og asparaginsyre, eller lignende. I tillegg kan en polypeptidsekvens fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse være forskjellig fra den naturlige sekvens ved at sekvensen er modifisert ved terminal-NH2-acylering, f.eks. acetylering, eller thioglycolsyreamidering, terminal-carboxylamidering, f.eks. ammoniakk, methylamin, etc.

Når koplet til en bærer via en linker for å danne det som er kjent i teknikken som et bærer-hapten-konjugat, er et polypeptid fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse i stand til å indusere antistoffer som immunreagerer med SP18-monomer. I betraktning av det veletablerte prinsipp for immunologisk kryssreaktivitet, angår foreliggende oppfinnelse derfor fremstilling av antigenisk beslektede varianter av polypeptidene vist i tabellene 1 og 2. En "antigenisk beslektet variant" er et polypeptid som innbefatter minst en seks aminosyrers restsekvens-del av et polypeptid fra tabell 1 eller tabell 2, og som er i stand til å indusere antistoffmolekyler som immunreagerer med et polypeptid fra tabell 1 eller 2 og en SP18-

monomer.

I en annen utførelsesform har et polypeptid fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse en aminosyrerestsekvens som har en sammensatt hydrofobitet på mindre enn null, fortrinnsvis mindre enn eller lik -1, helst mindre enn eller lik -2. Bestemmelse av den sammensatte hydrofobitetsverdi for et peptid er beskrevet i detalj i eksempel 2. Disse hydrofobe polypeptider utfører funksjonen til det hydrofobe område av SP18. I en foretrukket utførelsesform etterligner aminosyresekvensen mønsteret av hydrofobe og hydrofile rester av SP18.

Et foretrukket hydrofobt polypeptid innbefatter en sekvens med vekslende hydrofobe og hydrofile aminosyrerestområder og er kjennetegnet ved å ha minst 10 aminosyrerester representert ved formelen:

Z og U er aminosyrerester slik at ved hver forekomst er Z og U uavhengig utvalgt. Z er en hydrofil aminosyrerest, fortrinnsvis utvalgt fra gruppen bestående av R, D, E og K. U er en hydrofob aminosyrerest, fortrinnsvis utvalgt fra gruppen bestående av V, I, L, C, Y og F. "a", "b", "c" og "d" er tall som indikerer antall hydrofile eller hydrofobe rester, "a" har en gjennomsnittlig verdi på tilnærmet 1 til tilnærmet 5, fortrinnsvis tilnærmet 1 til tilnærmet 3. "b" har en gjennomsnittlig verdi på tilnærmet 3 til tilnærmet 20, fortrinnsvis tilnærmet 3 til tilnærmet 12, helst tilnærmet 3 til tilnærmet 10. "c" er 1 til 10, fortrinnsvis 2 til 10, helst 3 til 6. "d" er 1 til 3, fortrinnsvis 1 til 2.

Ved å angi at aminosyreresten representert ved Z og U er uavhengig utvalgt, menes at ved hver forekomst er en rest fra den spesifiserte gruppe utvalgt. Dvs. når f.eks. "a" er 2, vil hver av de hydrofile rester representert ved Z, være uavhengig utvalgt og kan således innbefatte RR, RD, RE, RK, DR, DD, DE, DK, etc. Ved å angi at "a" og "b" har gjennomsnittlige verdier, er det ment at selv om antallet rester innen den repeterende sekvens (ZaUb) kan variere noe innen peptid-sekvensen, vil de gjennomsnittlige verdier av "a" og "b" være hhv. tilnærmet 1 til tilnærmet 5 og tilnærmet 3 til tilnærmet 20.

Typiske eksempler på foretrukne polypeptider av den ovenfor angitte formel er vist i tabell 3.

Den foreliggende oppfinnelse angår også fremstilling av sammensatte polypeptider med 10 til 60 aminosyrerester. Et sammensatt polypeptid består vesentlig av en amino-terminal sekvens og en carboxy-terminal sekvens. Den amino-terminale sekvens inneholder en aminosyresekvens av et hydrofobt poly-peptidområde eller et hydrofobt peptid fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, fortrinnsvis hydrofobt polypeptid, som definert i den ovenfor angitte formel. Carboxy-terminalsekven-sen har aminosyrerestsekvensen ifølge et foreliggende carboxy-terminalpeptid.

Et polypeptid fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan syntetiseres ved hjelp av enhver fremgangsmåte som er kjent for den dyktige polypeptidtekniker. Et utmerket sammendrag av de mange tilgjengelige fremgangsmåter kan finnes i J.M. Steward og J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969, og J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", vol. 2, s. 46, Academic Press (New York), 1983, for fast fase-peptidsyntese, og E. Schroder og K. Kubke, "The Peptides", vol. 1, Academic Press (New York), 1965, for klassisk oppløsningssyntese.

I alminnelighet omfatter disse fremgangsmåter den sekvensielle addisjon av en eller flere aminosyrerester eller passende beskyttede aminosyrerester til en voksende peptid-kjede. Vanligvis beskyttes enten amino- eller carbokylgruppen av den første aminosyrerest ved hjelp av en egnet, beskyttende gruppe som selektivt kan fjernes. En annen beskyttende gruppe som selektivt kan fjernes, anvendes for aminosyrer inneholdende en reaktiv sidegruppe slik som lysin.

Ved anvendelse av en fast fase-syntese som et typisk eksempel, festes den beskyttede eller derivatiserte aminosyre til et inert, fast støttemateriale gjennom dens ubeskyttede carboxyl- eller aminogruppe. Den beskyttende gruppe for amino-eller carboxylgruppen fjernes deretter selektivt, og den neste aminosyre i sekvensen med den komplementære (amino eller carboxyl)-gruppe passende beskyttet, blandes og omsettes under betingelser egnet for dannelse av amidforbindelsen med resten allerede festet til det faste støttemateriale. Den beskyttende gruppe for amino- eller carboxylgruppen fjernes deretter fra denne nylig tilsatte aminosyrerest, og den neste aminosyre (passende beskyttet) tilsettes deretter, osv. Etter at alle de ønskede aminosyrer er forbundet i den riktige sekvens, fjernes alle gjenværende terminal- og sidegruppe-beskyttende grupper (og fast støttemateriale) sekvensielt eller samtidig, for å gi det endelige polypeptid.

Rekombinant fremstilt SP18 og/eller et foreliggende polypeptid kan blandes med et farmasøytisk akseptabelt fosfolipid for å danne et syntetisk lunge-overflateaktivt middel (PS) anvendelig i behandlingen av respiratorisk lidelse-syndrom.

Betegnelsen "farmasøytisk akseptabel" refererer til molekylære entiteter og blandinger som ikke frembringer en allergisk eller lignende uheldig reaksjon når administrert til et menneske.

Fosfolipider anvendelige ved dannelse av syntetiske, alveolære overflateaktive midler ved blanding med protein, er velkjente i teknikken. Se Notter et al., Clin. Perinatology, 14:433-79 (1987), for en oversikt over anvendelsen av både native og syntetiske fosfolipider for syntetiske overflateaktive midler.

Eksempler

Eksempel 1 - Isolering og karakterisering av nativ SP18

A. Fremgangsmåter

Rensing av LMW- apoproteiner

Humant lunge-overflateaktivt middel ble isolert fra fullt utviklet fostervann og anbrakt på en kolonne av DEAE-Sephacel<®> A-50 (Pharmacia, Uppsala, Sverige) under anvendelse av 4 milliliter (ml) pakket volum pr. 200 milligram (mg) overflateaktivt middel i en tris-EDTA-buffer inneholdende 1% n-octyl-beta-D-glucopyranosid som beskrevet av Revak et al.,

Am. Rev. Respir. Dis., 134:1258-1265 (1986) og Hallman et al.,-Pediatrics, 71:473-482 (1983). Denne spesielle kolonne og betingelser ble anvendt for å isolere 35.000 dalton apoproteinet (for anvendelse i andre studier) uten å utsette det for potensielt denaturerende organiske oppløsningsmidler. Hulromsvolumet inneholdende lipidene og proteinene som ikke bandt seg til kolonnen under disse betingelser, ble sammenslått og ekstrahert med et like stort volum av 2:1 kloroform: me thanol.

Etter sentrifugering for å adskille fasene ble den øvre fase (vann + methanol) reekstrahert med 1/2 volum kloroform. Etter sentrifugering ble den dannede nedre organiske fase tilsatt til den opprinnelig lavere fase og inndampet til tørrhet under en nitrogenstrøm. Dette ekstrakt som inneholdt 100-180 mg fosfolipid, LMW-apoproteiner og octylglycopyranosid, ble gjenoppløst i 2,5 ml kloroform:methanol, 2:1.

Etterfulgt av fremgangsmåten ifølge Takahashi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 135:527-532 (1986) som ble funnet å gi en god adskillelse av octylglucopyranosid fra LMW-proteinene og fosfolipidene, ble en glasskolonne med diameter 2,5 cm pakket ved 4°C til en høyde på 38 cm med Sephadex<®> LH-20 (Pharmacia, Uppsala, Sverige) i 2:1 kloroform : methanol . Prøven ble påsatt, og 2 ml fraksjoner ble innsamlet idet kloroform:methanol, 2:1, ble eluert gjennom ved en gjennomstrømningshastighet på 8,5 ml/time. Fosfolipider eluerte etter at 40 ml buffer hadde passert gjennom kolonnen. Octylglycopyranosid viste seg ved 56-116 ml-området.

Fosfolipidområdet ble sammenslått, tørket under nitrogen og gjenoppløst i 1 ml kloroform. En kiselsyre-kolonne ble tillaget ved å pakke 9 ml av "Bio-Sil" HA (BioRad, Richmond, CA) i kloroform i en glasskolonne ved romtemperatur. Prøven (som inneholdt tilnærmet 50 mg fosfolipid) ble anbrakt og vasket med 11 ml kloroform. En lineær gradient med økende methanolinnhold ble tilveiebrakt ved anvendelse av en like stor vektdel kloroform og methanol (38,8 g, 26,5 ml kloroform og 50 ml methanol). Fraksjoner på 2 ml ble innsamlet idet gradienten ble anvendt på kolonnen.

Figur 2 viser de erholdte proteinprofiler og fosfolipid-profiler.

Fosfolipidanalyser viste en liten topp i fraksjonene 17-20 og en hovedtopp etter fraksjon 30. Pierce BCA-proteinanalysen var positiv i fraksjonene 12-19 og 28-33, men det bør bemerkes at den siste topp sannsynligvis skyldes fosfolipidet til stede i dette område. Elektroforese i natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgeler viste at LMW-apoproteinene var til stede i fraksjonene 13-19 med forekomst av noe adskillelse mellom SP9 og SP18.

Alternativt kan en fremgangsmåte utarbeidet av Hawgood et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 85:66-70 (1987) som anvender en butanolekstraksjon av PS etterfulgt av kromatografi på Sephadex<®> LH-20 i en surgjort kloroform/methanol-buffer, anvendes for å isolere LMW-apoproteinblandingen. I noen studier ble en adskillelse av de to LMW-apoproteiner ut-ført ved anvendelse av Sephadex<®> LH-60. En glasskolonne med diameter 1 cm ble pakket til 40 cm med Sephadex<®> LH-60 (Pharmacia, Uppsala, Sverige) i kloroform/methanol, 1:1, inneholdende 5% 0,1 N HC1. En gjennomstrømningshastighet på 1-2 ml/time ble anvendt. En blanding av LMW-apoproteinene inneholdende tilnærmet 200-700 mikrogram (yg) protein fra enten "Bio-Sil" HA-kolonnen eller LH-20-kolonnen beskrevet av Hawgood et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 85:66-70 (1987),

i et 0,5 ml buffervolum, ble påsatt på toppen av kolonnen, og fraksjoner på 0,5 ml ble innsamlet. SP18-protein eluerte typisk i fraksjoner 16-19 og SP9 i fraksjoner 24-29. Egnede fraksjoner ble sammenslått og tørket i glassrør under nitrogen. En kort periode med lyofilisering sikret fullstendig fjernelse av HC1. Proteiner ble re-oppløst i methanol før anvendelse.

SDS- gelelektroforese

Gelelektroforese i 16% polyacrylamid ble utført under tilstedeværelse av natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE) i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge Laemmli, Nature, 227:680-685 (1970), ved anvendelse av 3x7 cm miniskive-geler. 1% Ø-mercaptoethanol ble tilsatt til prøvene hvor angitt, som et disulfid-reduserende middel. Etter elektroforese ble gelene fiksert over natten i 50% methanol + 12% eddiksyre, vasket i vann i 2 timer og farget med sølv i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge Wray et al., Anal. Biochem., 118:197-203 (1981).

Octylglucopyranosid- analysebestemmelse

En analysebestemmelse for mengdebestemmelse av n-octyl-beta-D-glycopyranosid, basert på anthron-fremgangsmåten ifølge Spiro, Methods Enzymol., 8:3-5 (1966), er tidligere beskrevet av Revak et al., Am. Rev. Respir. Dis., 134:1258-1265 (1986).

ProteinbestemmeIser

Organiske prøver inneholdende opptil 5 ug protein, ble tørket i 12x75 ml glassrør under nitrogen. Femten mikroliter (ul) av 1% SDS i H20 og 300 ul BCA proteinanalyse-reagens (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) ble blandet med proteinet i hvert rør. Rørene ble dekket og inkubert ved 60°C i 30 minutter. Etter avkjøling ble prøvene overført til en 96-brønners polystyren mikrotiterplate og 0D^^Q ble målt. Bovint serumalbumin ble anvendt som en standard.

Det bør bemerkes at noen fosfolipider reagerer i BCA-proteinanalysen, noe som gjør mengdebestemmelsene av protein unøyaktig når lipid er til stede (dvs. før "Bio-Sil" HA-kromatografi). I tillegg reagerer de hydrofobe LMW-apoproteiner i seg selv, når de først er renset, dårlig med BCA-reagensene, og alle mengdebestemmelser av de isolerte proteiner ble derfor basert på aminosyresammensetninger.

Fosfolipider

Dipalmitoylfosfatidylcholin (DPPC, beta, gamma-dipalmitoyl-L-alfa-lecithin) og L-alfa-fosfatidyl-DL-glycerol (PG, derivat av egglecithin) ble innkjøpt fra enten Calbio-chem-Behring (La Jolla, CA) eller Avanti Polar-Lipids, Inc.

(Birmingham, AL). DPPC ble tilsatt til PG i kloroform i

et vektforhold på 3:1.

Blanding av LMW- apoproteiner med fosfolipider

For analysebestemmelser in vitro ble en methanol-oppløsning inneholdende 4 ug SP9 eller SP18, tilsatt til 400 ug DPPC:PG i kloroform i et 12x75 mm glassrør. Etter en kort blanding ved opphvirvling, ble prøvene tørket under N2» Nitti mikroliter vann ble tilsatt til hvert rør, og rørene ble plassert i et vannbad ved 3 7°C i 15 minutter, med periodisk forsiktig omrøring. Isotonitet ble gjenopprettet med tilsetningen av 10 yl 9% NaCl til hver prøve før analysebestemmelse. For in vivo kaninstudier ble 50 yg LMW-apoproteiner (inneholdende både SP9 og SP18) eller 25 yg SP9 eller 25 yg SP18 tørket under N2. Fem mg fosfolipider (DPPC:PG, 3:1) ble tilsatt i kloroform. Prøvene ble blandet, tørket og resuspendert i 250 yl 100 millimolar (mM) saltvann inneholdende 1,5 mM CaCl2, for å gi et rekonstruert overflateaktivt middel ved 20 mg/ml med 0,5-1% protein.

Analysebestemmelser av aktivitet av det overflateaktive middel

In vitro-analysebe.stemmelser av aktivitet av det overflateaktive middel, vurdert som dets evne til å senke overflatespenningen av en pulserende boble, og in vivo-analysebestemmelser ved anvendelse av kaninfostre, er begge tidligere beskrevet i detalj av Revak et al., Am. Rev. Respir. Dis., 134:1258-1265 (1986).

Morfometriske analyser

Kaninfosterlunger, oppblåst til 30 cm H20 og deretter utblåst til 10 cm H20, ble nedsenket i 10% formalin i 72 timer. Paraffinsnitt ble orientert fra lungespiss til base og 5 mikron snitt ble tatt forfra og bakover. Etter farging med hematoxylin og eosin ble 10 felter (100 x) punkt-tellet fra spiss til base på multiple snitt. Standardiserte morfometriske fremgangsmåter (Weiber, i "Stereological Methods", vol. I, Academic Press, New York, s. 33-58, 1979) ble anvendt for å bestemme forhold mellom lunge-mellomvev og luftrom for hver behandlingsgruppe. Mellomsnitt av alveolære områder ble også bestemt.

Fosfolipid- fosfor- analysebestemmeIser

Fosfolipider ble mengdebestemt i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge Bartlett, J. Biol. Chem., 234:466-468

(1959) .

Aitiinosyreanalyse

Prøver i tre eksemplarer for bestemmelse av amino-syresammensetning ble hydrolysert med HC1 ved 110°C i 24 timer, med HC1 ved 150°C i 24 timer, eller i permaursyre ved 110°C i 24 timer etterfulgt av hydrolyse med HC1 ved 110°C i 24 timer. Analyser ble utført på en Beckman modell 121-M aminosyreanalysator (Beckman Instruments, Fullerton, CA). Tryptofan ble ikke bestemt.

Aitiinosyresekvens- bestemmelse

Dampfase-proteinsekvens-bestemmelse ble utført på en Applied Biosystems 470A aminosyresekvens-bestemmer (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) med en direktekoblet modell 120A HPLC.

Isolering av cDNA- klonér for human SP18

RNA ble fremstilt i overensstemmelse med Chirgwin

et al., Biochemistry, 18:5294-5299 (1979) fra en prøve av ikke angrepet voksent lungevev erholdt under kirurgisk fjerning av en neoplastisk skade. Fremstilling av dobbelttrådet cDNA ble utført ved anvendelse av standardfremgangsmåter (Chirgwin et al., supra, og Efstratiadis et al., i "Genetic Engineering", red. Stelow og Hollaender, Plenum, New York, 1:15-49 (1979), og et bibliotek ble oppbygget i lambda NM607 som beskrevet av Le Bouc et al., F.E.B.S. Letts., 196:108-112

(1986). SP18-kloner ble identifisert ved screening av fag-plakker med syntetiske oligonucleotidprober (Benton et al., Science, 196:180-182 (1977) som ble fremstilt ved anvendelse av et Applied Biosystems automatisert syntetiseringsapparat og renset ved HPLC. Startkandidat-kloner ble erholdt ved anvendelse av probe TG996 (5'CATTGCCTGTGGTATGGCCTGCCTCC 3') som ble avledet fra nucleotid-delsekvensen av et lite, humant overflateaktivt apoprotein-cDNA (Schilling et al., international patentsøknad WO 86/03408). Større kloner (opptil 1,5 kb) ble isolert ved anvendelse av probe TG1103 (5'TCGAGCAGGATGACGGAGTAGCGCC 3') som var basert på 5'-sekvensen av en av de originale kloner. Nucleotidsekvensen av cDNA-klonene ble bestemt ved kjedetermineringsfremgangsmåten (Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei., U.S.A., 74:5463-5467

(1977) ved anvendelse av EcoRI-restriksjonsfragmenter sub-klonet i en egnet Ml3-vektor.

B. Resultater

Karakteristika av LMW- apoproteinene

LMW-apoproteinene isolert fra humant fostervann, viste seg etter kiselsyrekromatografi, eller etter Sephadex<® >LH-20 kolonnekromatografi figur 2 beskrevet av Hawgood et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 85:66-70 (1987), som to proteinbånd i SDS-polyacrylamidgelelektroforese under ikke-reduserende betingelser. Det øvre bånd med en tilsynelatende molekylvekt på 18.000 dalton er en dimer, og derfor betegnet SP18-dimer. Med tilsetningen av 6-mercaptoethanol ble SP18-dimer redusert til 9.000 dalton og ble betegnet SP18-monomer (fig. 3). Det andre LMW-apoprotein, betegnet SP9, viser seg som et diffust bånd mellom 9 og 12.000 dalton under tilstedeværelse eller fravær av reduserende midler. SP9 ble adskilt fra SPl8-dimer og SPl8-monomer ved kromatografi på Sephadex<® >LH-60. De resulterende, rensede proteiner er vist i fig. 3.

Aminosyresammensetninger ble bestemt for SPl8-monomer og SP9. På grunn av den ytterst hydrofobe natur av disse proteiner ble HCl-hydrolyse utført ved 150°C i 24 timer, i tillegg til standardhydrolysen ved 110°C i 24 timer, og verdier for valin, leucin og isoleucin ble kalkulert fra analyser av hydrolysatene utført under de ekstreme betingelser. Som vist i tabell 3, er begge proteiner ytterst hydrofobe med høye nivåer av valin og leucin.

<3> Isoleucin og leucinmnhold ble hver bestemt etter hydrolyse i 24 timer med HC1 ved 150°C. <4> Tryptofan ble ikke bestemt.

Amino-terminalsekvensanalyse av SP18-monomer ga den følgende sekvens:

Gjentatt sekvensanalyse av den rensede SP9-monomer viste multiple peptider, alle rike på leucin og inneholdende minst seks på hverandre følgende valiner. NE^-terminal-analyse viste fenylalanin, glycin og isoleucin, med de rela-tive mengder av hver varierende fra preparat til preparat.

Nucleotidsekvensanalyse av SP18- CDNA

Nucleotidsekvensen av SP18-monomer-cDNA-klon er vist

i figur 1. Sekvensen utviser 83% homologi med hunde-SP18-cDNA (Hawgood et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 85:66-70 (1987)). En sekvens innen en stor åpen avlesningsramme ble identifisert som perfekt tilsvarende amino-terminalen av SP18-monomer som bestemt ved Edman-nedbrytning av det isolerte protein (understreket i figur 3). Dette antyder at moden SP18-monomer oppstår ved behandling av et større forløpermolekyl. I den modne sekvens foreligger et enkelt potensielt N-glycosyler-ingssete (Asn 110), ingen seter for tyrosinsulfatering, og ingen G-X-Y-gjentagelser som funnet i 35.000 dalton apoproteinet (White et al., A. Pediatrics Research, 19:501-508; 1985) .

Molekylvekten på 9000 dalton erholdt ved SDS-PAGE

av redusert SP18-dimer er lavere enn den forutsagte for den komplette forløper-proteinsekvens med amino-terminal NH2-Phe-Pro-Ile-Pro-Leu-Pro-Tyr (19.772 dalton), som inne-bærer videre behandling i området av aminosyrer 70-90. Til støtte for dette stemmer den teoretiske aminosyresammenset-ning (tabell I) av et antatt 9000 dalton protein omfattende

rester 1 til 81, godt overens med de bestemte verdier for renset SP18-monomer. Den amino-terminale del av forløper-proteinet (rester 1 til 81) er alkalisk og mer hydrofob enn den COOH-terminale del (rester 82 til 181): Kyte-Doolittle-indeksen for rester 1 til 81 er 9100 (pl 8,6) og er -3000 (pl 5,91) for rester 82 til 181 (Kyte et al., J. Pediatrics, 100:619-622; 1982). Amino-terminalen (rester 1 til 81) er, som sekvensen for hund (Hawgood et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 85:66-70; 1987), sammensatt av tre hydrofobe områder: rester 1 til 11, 22 til 49 og 53 til 74. Disse er avbrutt av et ladet område (rester .12 til 21) og to hydrofile og ladede strekninger (rester 47 til 54 og 72 til 81).

Rekonstruksjon av aktivitet av overflateaktivt stoff med LMW- apoproteiner

Prøver ble fremstilt inneholdende 400 ug/100 yl fosfolipider (DPPC:PG, 3:1 vektdeler), fosfolipider pluss 4 yg SP9, eller fosfolipider pluss 4 yg SP18. Hver prøve ble analysert i det pulserende boble-surfactometer for evnen til å nedsette overflatespenning. Resultatene er vist i tabell 4 som den gjennomsnittlige minimale overflatespenning ved 15 sekunder, 1 minutt (min.) og 5 minutter. Naturlig humant overflateaktivt middel, isolert fra fullt utviklet fostervann fortynnet til 4 mg/ml, er vist for sammenligning. Mens hverken fosfolipider eller LMW-apoproteiner alene hadde vesentlige overflatespennings-nedsettende kapasiteter, viste en blanding av fosfolipider med enten SP9 eller SP18 vesentlig aktivitet. Rekombinering av fosfolipidene med 1 vekt% SP18 nedsatte de målte overflatespenninger til nivåer sammenlignbare med de erholdt med en like stor mengde naturlig humant overflateaktivt middel (6,3 - 0,2 dyn/cm for fosfolipider + SP18 ved 15 sekunder, 2,0 - 1,2 dyn/cm for naturlig overflateaktivt middel). På basis av lik vekt nedsatte SP9 overflatespenning mindre effektivt (16,7 - 0,8 dyn/cm ved 15 sekunder).

In vivo-analysebestemmelser av exogen (syntetisk) aktivitet av overflateaktivt middel ble utført ved innføring i luftveiene til umodne kaninfostere-saltvannsoppløsninger inneholdende Ca<++> alene eller med tilsetning av fosfolipider, fosfolipider pluss LMW-apoproteiner, eller naturlig humant overflateaktivt middel. Dyrene ble ventilert i 30 minutter og deretter avgasset ved plassering i en glassklokke under vakuum. Lungene ble deretter oppblåst til gitte trykk, og luftvolumet påkrevet for hvert trykk, ble notert. De påkrevede volumer for gitte trykk i løpet av uttømning fra 30 cm H^O

ble bestemt på samme måte. De resulterende trykk/volum-kurver er vist i fig. 4 for dyr som mottok syntetisk overflateaktivt middel fremstilt med renset SP9 eller SP18

(0,5 vekt% sammenlignet med total fosfolipidkonsentrasjon)

og egnede kontrolldyr. Forbedret lungeettergivenhet er tydelig hos dyrene behandlet enten med naturlig eller syntetisk

overflateaktivt middel sammenlignet med dyrene som mottok saltvann eller fosfolipider, med SP18 fremtredende som mer effektiv enn SP9 på basis av lik vekt. En lignende undersøk-else ble utført ved anvendelse av en blanding av SP9 og SP18. Resultatene ble nesten identiske med fosfolipidkurven pluss SP18-kurven vist i fig. 4.

Etterfølgende ettergivenhetsmålinger ble lungene oppblåst til 30 cm H20, utblåst tilbake til 10 cm H20, av-stengt med klemme, fjernet og fiksert i formalin. Tynne snitt ble farget med hematoxylin og eosin og undersøkt mikro-skopisk. Som vist i fig. 5, fremstår lunger behandlet med saltvann (A) eller fosfolipider (C), atelectatiske, mens lungene fra dyr som mottok naturlig (B) eller rekonstruert

(D) overflateaktivt middel, viser normal alveolær utvidelse. Morfometriske analyser av tynnsnittene viste et mellomvev til

luftrom-forhold på 4,70 for saltvannsbehandling og 3,29 for fosfolipider alene, sammenlignet med 0,49 8 for naturlig overflateaktivt middel og 0,538 for rekonstruert overflateaktivt middel. Disse data er vist i tabell 5 og bekrefter den vesentlige (p<0,001; Mann-Whitney U-test) økning i luftrom vist i fig. 5. En sammenligning av alveolære omkretser viste på lignende måte et vesentlig (p<0,003) høyere antall krys-ninger av de alveolære grenser hos saltvanns- eller fosfolipid-behandlede fostere sammenlignet med dyr behandlet med overflateaktivt middel.

C. Diskusjon

Den foreliggende undersøkelse beskriver to lavmolekylvekt-apoproteiner isolert fra humant fostervann-overflateaktivt middel som kan tilsettes til kjente fosfolipider for å danne et biologisk aktivt lunge-overflateaktivt middel. Mens proteinene i den foreliggende undersøkelse er betegnet som SP18-dimer, SPl8-monomer og SP9, fremgår det tydelig fra den nyere litteratur at det eksisterer en mangeartet nomenklatur og et utvalg av rapporterte molekylvekter for LMW PS-apoproteiner (varierende fra 5-18.000 dalton). De tydelige forskjeller i fysikalske egenskaper kan forklares ved mange faktorer innbefattet artsforskjeller, varierende fremgangsmåter for rensing og behandling, varierende bestemmelser av lave molekylvekter basert på standarder i SDS-polyacrylamidgeler, og eventuell forstyrrende innvirkning av lipider på lavmolekylvekt-proteinbånd i geler. Sammenligninger av aminosyresammensetninger og sekvenser og immunologiske analyser ved anvendelse av monospesifikke antistoffer vil hjelpe til å sortere LMW-apoproteinene.

Det synes sam am SP9-proteinet beskrevet heri, som gir et diffust bånd på SDS-polyacrylamidgeler fra 9-12.000 dalton under reduserende eller ikke-reduserende betingelser, trolig er det samme protein som proteinet betegnet SAP-6 av Whitsett et al., Pediatric Research, 20:744-749 (1986), SP5-8 av Hawgood et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 85:66-70 (1987), PSP-6 av Phelps et al., Am. Rev. Respir. Dis., 135:1112-1117

(1987), og 5 kDA-proteolipidet av Takahashi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 135:527-532 (1986). Den ekstremt hydrofobe natur av dette protein går tydelig frem fra dets amino-syresammensetning (tabell 3) og sekvensdata, som viser at minst seks på hverandre følgende valinrester forutgås av et leucin-rikt område. Tilstedeværelsen av tre amino-terminale rester (fenylalanin, glycin og isoleucin) i preparatene av SP9 erholdt heri fra fostervann-overflateaktivt middel, tyder på en samling av peptider med en identisk sekvens, men hvor en eller to rester er fjernet fra amino-terminalen. Phelps et al., Am. Rev. Respir. Dis., 135:1112-1117 (1987) har nylig rapportert et lignende funn med bovint PSP-6-apoprotein.

SP18-dimer består av to identiske 9000 dalton peptider (men forskjellig fra 9000 dalton-peptidet til SP9) som er disulfidbundet. Aminosyresammensetningen av SP18-monomer (tabell 3) viser et høyt antall hydrofobe rester. Når uredusert SDS-PAGE ble overlastet med SPl8-proteinet, ble sekvensielt mindre intense fargebånd observert ved 36.000 og 56.000 dalton, noe som tyder på oligomere former av proteinet; ved reduksjon ble kun et enkelt 9000 dalton bånd observert.

Både SP9- og SP18-dimer-apoproteiner isolert som beskrevet ovenfor, kunne vises å ha biofysisk aktivitet etter rekombinasjon med fosfolipider. Tilsetningen av 1 vekt% SP18-dimer til fosfolipidene DPPC:PG førte til en øyeblikkelig økning i overflatetrykk som resulterte i overflatespenninger mindre enn 10 dyn/cm ved 15 sekunder. Tilsetningen av 1% SP9 til DPPC:PG var ubetydelig mindre effektiv ved at overflatespenninger ble senket til 16,7, 14,1 og 12,2 dyn/cm ved hhv. 15 sekunder, 1 og 5 minutter. Blandinger av både SP18-dimer og SP9 var også effektive, men videre undersøkelser vil være påkrevet for å bestemme hvorvidt den kombinerte effekt er additiv eller synergistisk.

In vivo-undersøkelser av rekonstruert overflateaktivt middel ved anvendelse av kaninfostermodellen (Schneider et al., J. Pediatrics, 100:619-622; 1982) ble utført ved anvendelse av blandinger av SPl8-dimer og SP9 såvel som hvert protein individuelt. En markert forbedring i lunge-ettergivenhet ble observert hos dyr behandlet med naturlig overflateaktivt middel eller rekonstruert overflateaktivt middel fremstilt med SP18-dimer-apoprotein, sammenlignet med de dyr som mottok fosfolipider alene eller saltvann (fig. 4). En moderat forbedring ble observert når SP9 ble anvendt. Identiske under-søkelser ved anvendelse av en blanding av SP18-dimer og' SP9 for å fremstille det rekonstruerte overflateaktive middel viste resultat meget like de erholdt med SPl8-dimer alene (fylte firkanter, fig. 4); imidlertid kunne ikke det eksakte mengdeforhold av SP18-dimer og SP9 i disse undersøkelser nøy-aktig bringes på det rene. Fig. 5 viser representative mikroskopiske alveolære områder som viser mangelen på atelectase etter tildrypping av overflateaktivt middel.

Suzuki et al., (Eur. J. Respir. Dis., 69:336-345; 1986) har rapportert en reduksjon i overflatespenning (målt på Wilhelmy-vekten eller i en pulserende boble) og en fem gangers økning i respirasjonsvolumer hos for tidlig fødte kaniner ved innblåsningstrykk på 25 cm H20 når grise-LMW (<15.000 dalton) overflateaktive apoproteiner tilsettes blandinger av DPPC:PG ved et vektforhold på 5:80:20 (protein:DPPC:PG). Hvorvidt ett eller flere proteiner er

til stede i dette system, er uklart.

Tidligere studier med anvendelse av 35.000 dalton apoproteinet (Revak et al., Am. Rev. Respir. Dis., 134:1258-1265; 1986) viste også moderat reduksjon i overflatespenning lignende reduksjonen erholdt med SP9 i under-søkelsene beskrevet heri. Tydeligvis må videre undersøkelser utføres ved anvendelse av forskjellige kombinasjoner og konsentrasjoner av SP18, SP9 og 35.000 dalton-apoproteinet, såvel som Ca<++> og kanskje forskjellige fosfolipider, for å belyse interaksjonene mellom disse forskjellige bestanddeler av overflateaktivt middel og for å bestemme de beste betingelser for et biologisk aktivt exogent overflateaktivt middel.

Eksempel 2 - In vitro- vurdering av aktivitet av polypeptid-overflateaktivt middel

A. Fremgangsmåter

Måling av aktivitet av overflateaktivt middel

Målinger av overflatetrykk gjennom en luft-væske-interfase (uttrykt i negative cm av ^O-trykk) ved minimal bobleradius, ble bestemt ved forskjellige tidspunkter ved anvendelse av den pulserende boble-fremgangsmåte beskrevet av Enhorning, J. Appl. Physiol.., 43:198-203 (1977).

Kort beskrevet måler surfactometeret ifølge Enhorning (Surfactometer International, Toronto, Ontario) trykkgradienten (AP) gjennom en væske-luft-interfase av en boble som pulserer med en hastighet på 20 cykler/minutt mellom en maksimal (0,55 mm) og en minimal (0,4 mm) radius. Boblen, dannet i et vannomsluttet, 20 yl prøvekammer ved 37°C, over-våkes gjennom et mikroskop mens trykkforandringene registreres på en diagramskriver kalibrert for 0 og -2 cm 1^0.

Bestemmelse av sammensatt hydrofobitetsverdi

Den sammensatte hydrofobitetsverdi for hvert peptid ble bestemt ved å fastsette for hver aminosyrerest i et peptid dens tilsvarende hydrofilitetsverdi som beskrevet i tabell 1 ifølge Hopp et al., Proe. Nati. Acad. Sei., U.S.A., 78:3824-3829 (1981), hvilken fremleggelse er inkorporert heri ved referanse. For et gitt peptid ble hydrofilitetsverdien summert, og summen representerer den sammensatte hydrofobitetsverdi .

Fremstilling av syntetiske overflateaktive midler

Etter blanding med oppløsningsmiddel ble hvert peptid kombinert med fosfolipider (DPPC:PG), 3:1 for å danne et syntetisk overflateaktivt middel ifølge en av de følgende fremgangsmåter.

Fremgangsmåte A ble gjennomført ved å blande 16 yl av peptid/oppløsningsmiddelblanding (40 yg peptid) med 100 yl kloroform inneholdende 400 yg fosfolipider, og omrysting av blandingen i tilnærmet 10 minutter ved 37°C for å danne en peptid/fosfolipid-blanding. Kloroform ble fjernet fra peptid/fosfolipid-blandingen ved tørking under N2. Det således dannede syntetiske, overflateaktive middel ble deretter blandet med 90 yl H20 og forsiktig omrystet i tilnærmet 10 minutter ved 37°C. Deretter ble 10 yl 9% NaCl blandet med oppløsningen inneholdende det overflateaktive middel.

Fremgangsmåte B ble gjennomført ved først å plassere 100 yl kloroform inneholdende 400 yg fosfolipider i et glass-rør og deretter fjerne kloroformen ved tørking under N2 i tilnærmet 10 minutter ved 37°C. 16 yl peptid/oppløsnings-middel-blanding og 74 yl H20 ble blandet med de tørkede fosfolipider og deretter forsiktig omrystet i tilnærmet 10 minutter ved 37°C. Til det således dannede syntetiske overflateaktive middel ble det tilsatt 10 yl 9% NaCl.

Fremgangsmåte C ble gjennomført ved først å opprett-holde polypeptid-PL-blandingen ved 43°C i 10 minutter, etter hvilken tid oppløsningsmidlene ble fjernet fra blandingen ved tørking under N2. Når nødvendig, ble blandingene videre tørket ved 15 minutters utsettelse for vakuum for å danne en tørket polypeptid-PL-blanding. Vann ble deretter blandet med hver tørket blanding i en mengde beregnet å tilsvare 90% av volumet nødvendig for å gi en sluttelig PL-konsentrasjon på enten 4 eller 10 mg/ml (som vist i tabell 7) for å danne en andre blanding. Denne andre blanding ble opprettholdt i 1 time ved 43°C under omrysting. Deretter ble et volum 6% NaCl tilsvarende 10% av volumet nødvendig for å gi den ønskede PL-konsentrasjon, blandet med den andre blanding, og den dannede endelige blanding ble opprettholdt i 10 minutter ved 43°C. I de fleste tilfeller ble den endelige blanding utsatt for et siste trinn med 3 cykler av frysing og tining.

B. Resultater

De syntetiske overflateaktive midler illustrert i tabell 6, ble fremstilt som vist i tabellen.

Hvert av de syntetiske, overflateaktive midler angitt i tabell 6, ble analysert for aktivitet av overflateaktivt middel som vist ved deres evne til å redusere overflatespenning in vitro ved anvendelse av "bobleanalysen" ifølge Enhorning som beskrevet ovenfor.

Resultatene av denne undersøkelse, vist i figur 6, viser at et foreliggende polypeptid, når blandet med farma-søytisk akseptable fosfolipider, danner et syntetisk lunge-overf lateaktivt middel som har en høyere overflateaktivitet enn fosfolipidene alene, som vist ved de lavere AP-verdier. Det ble typisk erholdt 10% til 80% lavere AP-verdier ved anvendelse av polypeptidene. Det bør anmerkes at kontroll-peptidet p74-81 med 8 aminosyrerester som ikke er i overensstemmelse med erfaringene ifølge den foreliggende oppfinnelse, ikke dannet et syntetisk PS med en høyere aktivitet enn fosfolipidet alene, noe som således viser at aminosyrerest-lengden er et kritisk trekk.

Overflateaktiviteten av ytterligere typiske eksempler på polypeptider fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse ble undersøkt ved anvendelse av "bobleanalysen" som beskrevet ovenfor. Resultatene av undersøkelsen er illustrert nedenfor i tabell 7.

Hvert polypeptid ble blandet med det angitte oppløs-ningsmiddel ved en konsentrasjon på 2,5 mg polypeptid pr. ml oppløsningsmiddel. Den dannede blanding ble observert for å bestemme hvorvidt en oppløsning eller en suspensjon av uoppløselig polypeptid var dannet. De blandinger som dannet en suspensjon, ble videre blandet ved hjelp av vannbad-sonikering i 10 sekunder for å danne en meget fin suspensjon, tilstrekkelig for pipettering ved anvendelse av glass-pipetter.

Etter blanding med oppløsningsmiddel ble hvert peptid blandet med fosfolipider (PL), DPPC:PG, 3:1, i kloroform i et glassrør slik at mengden av tilsatt polypeptid tilsvarte 1/10 (10 vekt%) av mengden tilsatt PL, for å danne et syntetisk overflateaktivt middel i overensstemmelse med enten fremgangsmåte A, B eller C.

Hvert av de syntetiske overflateaktive midler ble deretter analysert for overflateaktivitet som vist ved deres evne til å redusere overflatespenning in vitro i bobleanalysen utført som beskrevet ovenfor. Trykkgradienten (AP) er et mål for overflateaktivitet i den endelige polypeptid-PL-blanding som ble bestemt ved anvendelse av et Enhorning surfactometer som beskrevet ovenfor. Målinger ble tatt ved tidspunktene 15 sekunder (15"), 1 minutt (l<1>) og 5 minutter (5<1>) og uttrykkes som et gjennomsnitt av tre uavhengige målinger av den angitte polypeptid-PL-blanding. Trykkgradientmålinger for sammenlignbare prøver av PL alene (PL) og naturlige humane overflateaktive midler ble bestemt som kontroller.

Resultatene av denne undersøkelse er vist i tabell 7.

(1) Hvorvidt den innledende blanding av peptid og oppløs-ningsmiddel var en oppløsning eller suspensjon er

angitt.

(2) Bokstavene angir den anvendte metode for fremstilling av syntetisk overflateaktivt middel. Metodene er beskrevet i det foregående. "+" angir at sluttbland-ingen ble underkastet et siste trinn med 3 fryse-/tinesykluser. "-" angir at trinnet ikke ble utført. (3) Konsentrasjon ("kons.") av fosfolipid (PL) i slutt-blandingen er angitt i mg PL pr. ml blanding (mg/ml). (4) Trykkgradienten er et mål for overflateaktivitet i den endelige polypeptid-PL-blanding, som bestemt ved anvendelse av et Enhorning surfactometer som beskrevet i eks. 2. Målinger ble utført ved tre tidspunkter; 15 sek (15''), 1 minutt og (1') og 5 minutter (5') og er uttrykt som et gjennomsnitt av 3 uavhengige målinger av den angitte polypeptid-PL-blanding. Trykkgradientmålinger for sammenligningsprøver med PL alene (PL) og naturlig, humant overflateaktivt

middel er også vist.

(5) Disse oppløsninger ble laget med en konsentrasjon på 20 mg/ml PL og ble fortynnet til 10 mg/ml før test-ing.

Disse resultater viser at et polypeptid fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, når det blandes med farma-søytisk akseptable fosfolipider, danner et syntetisk lunge-overf lateaktivt middel med høyere overflateaktivitet enn fosfolipidene alene, som vist ved det større volum pr. gitt trykk.

Eksempel 3 - In vivo- vurdering av aktivitet av syntetisk overflateaktivt middel

A. Fremgangsmåter

Fremstilling av syntetiske overflateaktive midler

Et polypeptid fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse ble blandet med et oppløsningsmiddel som beskrevet i eksempel 2. Den dannede blanding ble videre blandet med fosfolipid (PL) slik at mengden av tilsatt polypeptid var enten 3 vekt%, 7 vekt% eller 10 vekt% av mengden av tilsatt PL som vist nedenunder. Den endelige polypeptid-PL-blanding (syntetisk overflateaktivt middel) ble dannet i overensstemmelse med fremgangsmåte C ved anvendelse av det endelige fryse-tine-trinn som beskrevet i detalj i avsnittet "Fremstilling av syntetiske overflateaktive stoffer" i eksempel 2, med unntak av at den endelige blanding hadde en konsentrasjon på 20 mg fosfolipid pr. ml endelig blanding.

Inndryppingsprotokoller

Protokoll 1: Kaninfostere ble behandlet ved innføring i luftrøret av en 0,1 ml oppløsning som enten inneholdt et syntetisk overflateaktivt middel fremstilt i eksempel 3A, eller enten 2 mg nativt overflateaktivt middel (NS) fremstilt som beskrevet i eksempel 1, eller 2 mg PL.

Protokoll 2; Syntetisk overflateaktivt middel ble inndryppet i kaninfosterlunge ved å innføre i luftrøret fra en enkel sprøyte de følgende tre bestanddeler slik at be-standdelene kommer ut av sprøyten i den følgende rekkefølge: (1) 0,05 ml luft; (2) 0,1 ml av et syntetisk overflateaktivt middel fremstilt i eksempel 3A, eller enten 2 mg PL eller 2 mg nativt overflateaktivt middel; og (3) 0,1 ml luft.

Protokoll 3: Fra en sprøyte ble en 0,1 ml aliquot av et syntetisk overflateaktivt middel fremstilt som beskrevet i eksempel 3A (eller 2 mg NS eller PL), inndryppet i kaninens luftrør som beskrevet ovenfor, etterfulgt av innføring av 0,05 ml melkesur Ringers oppløsning og 0,2 ml luft fra en andre sprøyte.

Protokoll 4: Fra en sprøyte ble 0,1 ml av et syntetisk overflateaktivt middel fremstilt som beskrevet i eksempel 3A (eller 2 mg NS eller PL), 0,15 ml luft, 0,1 ml saltvann og 0,3 ml luft innført i luftrøret som beskrevet ovenfor. To etterfølgende aliquoter på 0,3 ml luft ble gitt.

Protokoll 5; Kaninfostere ble behandlet ved innfør-ing i luftrøret fra en enkel sprøyte av de følgende bestanddeler slik at de fire bestanddeler ved innføring forlater sprøyten i den oppførte rekkefølge: (1) 0,2 ml oppløsning som inneholder enten et syntetisk overflateaktivt middel fremstilt i eksempel 3A, eller enten 4 mg nativt overflateaktivt middel eller 4 mg PL; (2) et 0,15 ml volum luft; (3) 0,1 ml normal saltvannsoppløsning; og (4) et 0,3 ml volum luft.

Den ovenfor beskrevne innføring ble deretter gjentatt 15 minutter etter den første innføring.

Protokoll 6: Kaniner ble behandlet som beskrevet i protokoll 5, med unntak av at to etterfølgende aliquoter på 0,3 ml luft ble gitt etterfølgende den innledende inndrypping, og ingen ytterligere inndrypping ble gitt ved 15 minutter.

Kalvefostermodell for undersøkelse av aktivitet av overflateaktivt middel

Overflateaktiviteten av typiske eksempler på polypeptider fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse ble undersøkt ved anvendelse av fremgangsmåtene beskrevet i detalj tidligere av Revak et al., Am. Rev. Respir. Dis., 134:1258-1265

(1986), med unntakene angitt i det følgende.

Kaninfostere etter 27 dagers drektighetstid ble forløst ved keisersnitt og øyeblikkelig injisert med 0,05 ml "Norcuron" (Organon, Inc., NJ) for å forhindre spontan pusting. Kaninfostrene ble deretter veiet, og en liten kanyle ble innført i luftrøret ved tracheotomi. Syntetisk overflateaktivt middel fremstilt som beskrevet ovenfor, ble deretter inndryppet i kaninfosterlungen ved anvendelse av en av de ovenfor beskrevne inndryppingsprotokoller.

Etter inndrypping ble kaninen plassert i en spesielt utformet pletysmograf (inneholdende en "Celesco"-transduktor) forbundet med en ventilator (Baby Bird, Baby Bird Corp.,

Palm Springs, CA), og den inndryppede lunge ble ventilert ved en hastighet på 30 cykler pr. minutt ved et maksimalt inn-åndingstrykk på 25 cm H20, et positivt slutt-utåndingstrykk på 4 cm f^O og en innåndingstid på 0,5 sekunder. I noen undersøkelser ble dynamiske ettergivenhetsmålinger utført ved forskjellige tidspunkter gjennom hele ventileringsfrem-gangsmåten. I andre undersøkelser ble statiske ettergivenhetsmålinger utført etter ventilering.

Statiske ettergivenhetsmålinger ble utført etter

30 minutters ventilering. Dyrene ble fjernet fra ventilatoren, og lungene ble avgasset ved -20 cm H^O i en glassklokke under vakuum. Deretter ble lungene først oppblåst og deretter utblåst gjennom et T-koblingsstykke forbundet med et tracheostomirør. Luftvolumet påkrevet for å nå statiske trykk på 5, 10, 15, 20, 25 og 30 cm 1^0, ble målt under både innblåsnings- og utblåsningsfåsene for å frembringe statiske trykk/volum-kurver som et mål for statisk ettergivenhet.

Ved anvendelse av pletysmografen ble målinger av dynamisk ettergivenhet utført ved forskjellige tidspunkter gjennom en 60 minutters ventileringsperiode. Datamaskin-assistert dataanalyse resulterte i ettergivenhetsdata uttrykt som ml luft pr. cm H^O pr. gram kroppsvekt ved hvert tids-punkt. Ettergivenhet ble beregnet ved hjelp av formelen nedenfor.

APt<p><=> (CrMAV) + (R) «(F)

Ptp = transpulmonait trykk

C = ettergivenhet (elastisk bestanddel - relaterer forandring i volum til trykk)

R = resistens (relaterer

gjennomstrømning til trykk)

F = gjennomstrømning

V = volum = integralet av gjennomstrømning med hensyn til tid)

Den ovenfor angitte ligning ble løst med en mul-tippel lineær regresjon for C og R. Ettergivenheten (C) representerer den elastiske natur av lungene, og resistensen (R) representerer trykket nødvendig for å overvinne resistensen mot gasstrømmen inn i og ut av lungene.

B. Resultater

Data for statisk ettergivenhet ved anvendelse av protokoller 1 og 5 er vist i hhv. figur 7 og 8. Forbedret lunge-ettergivenhet ble observert i alle lunger behandlet med naturlig overflateaktivt middel eller med de testede syntetiske overflateaktive midler, sammenlignet med de lunger som ble behandlet med fosfolipider (PL) alene, med ett unntak. Det syntetiske overflateaktive middel fremstilt ved anvendelse av pl-15 (figur 7), frembrakte ikke forbedret lunge-ettergivenhet i forhold til PL alene når målt ved hjelp av statisk ettergivenhet.

Resultatene av undersøkelsene over dynamisk ettergivenhet er illustrert i tabell 8.

Som vist i tabell 8, forbedret hvert av de syntetiske overflateaktive midler fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse og naturlig overflateaktivt middel, verdier for dynamisk ettergivenhet i sammenligning med fosfolipid alene.

C. Diskusjon

Ettergivenhetsundersøkelsene in vivo viser at anvendelse av et antall typiske eksempler på syntetiske overflateaktive midler fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse resulterte i forhøyet ettergivenhet sammenlignet med fosfolipid alene for hvert av de analyserte syntetiske overflateaktive midler. Således danner proteinene og polypeptidene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, når blandet med farmasøytisk akseptable fosfolipider, syntetiske overflateaktive midler som har høyere overflateaktivitet enn fosfolipid alene. Anvendelse av de syntetiske overflateaktive midler er fordelaktig ved at de produserer forbedrede ettergivenhetsverdier in vivo.

Eksempel 4 - Undersøkelse av binding av C- terminalt peptid til lungeepitelceller

A. Fremgangsmåter

Peptidbindingsanalyse

Et peptid som har rester 74-80 av SP18 (VLRCSMD), ble radiomerket ved hjelp av fremgangsmåten ifølge Bolton-Hunter (Bolton et al., Biochem. J., 133:529-538, 1973) med <125>I

(New England Nuclear - 34,1 mol/ml, 28,0 ng/ml, 75 uCi/ml).

Humane lungeepitelceller (human lungecarcinomcelle, ATCC referansenr. CCL 185, vanlig kjent som A549-celler) ble dyrket til sammenflytning i 6 brønners vevskulturskåler.

De følgende oppløsninger ble anvendt i denne undersøkelse:

Tre 6-brønners plater ble på forhånd behandlet ved inkubasjon med 0,5 ml av de følgende oppløsninger i 15 minutter ved 22°C. Brønnene nummerert med ulike tall, ble på forhånd behandlet med PBS/BSA, og brønnene nummerert med like tall, ble på forhånd behandlet med oppløsning F. Etter fjem-ning av forhåndsbehandlingsoppløsningene ble brønnene inkubert med 0,5 ml av de følgende oppløsninger ved 22°C i de angitte tidsrom under forsiktig vugging av platene.

Ved slutten av inkubasjonstiden ble supernatanten fjernet fra hver brønn og oppbevart for telling. Hver brønn ble vasket fire ganger med kald (4°C) PBS/BSA. Vaskebufrene ble oppbevart for telling. Platen ble deretter brakt tilbake til romtemperatur, og 1 ml lyseringsbuffer ble tilsatt til hver brønn. Platen ble forsiktig rystet inntil alle celler hadde lysert og løsnet fra platen (3-4 minutter). Oppløs-ningen ble fjernet fra hver brønn og tellet. En andre ml lyseringsbuffer ble tilsatt til hver brønn, blandet noen få minutter og fjernet for telling av bundne tellinger. Pros-enten og de absolutte mengder bundne tellinger ble bestemt.

Spesifikke bundne tellinger ble bestemt ved å subtrahere de bundne tellinger i brønner inneholdende umerket (kaldt) peptid fra den tilsvarende brønn uten kaldt peptid. Resultatene er illustrert i tabell 9 nedenfor.

Fremgangsmåten ble gjentatt med de følgende endringer: Dx = 1433 |il PBS/BSA + 167 jil125I-peptid [1,78

pmol/500 |il]

D2 = 183,3 jil PBS/BSA + 366,7 jil Dx [1,19 pmol/500

D3 - 275 |il PBS/BSA + 275 |tl Dx [0,89 pmol/500 jil]

D< - 366,7 jtl PBS/BSA + 183,3 |il Dx [0,59 pmol/500 |il]

D5«= 458,3 |il PBS/BSA + 91,7 |il Dx [0,30 pmol/500 |il]

Dt - 513,3 |il PBS/BSA + 36,7 |il Dx [0,12 Pmol/500 |tl]

Ej«= 1386,24 |il PBS/BSA + 167 |il <12>SI-peptid [4,676

ng] + 46,76 |tl kaldt peptid ved 100 |ig/ml [4,676

rø]

E2-Ee Fortynnet som ovenfor for D2 - D,.

F = 3,398 ml PBS/BSA + 102,29 |il kaldt peptid ved

100 |ig/ml

To seks-brønners plater ble vasket én gang med 1 ml PBS/BSA. Brønnene nummerert med ulike tall, ble på forhånd behandlet med PBS/BSA, og brønnene nummerert med like tall, ble på forhånd behandlet med oppløsning F. Etter fjerning av forhåndsbehandlingsoppløsningen ble de følgende oppløs-ninger tilsatt.

Oppløsningene ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur under forsiktig vugging. Supernatantene ble deretter fjernet og oppbevart for telling. Hver brønn ble vasket 4 ganger med 0,5 ml kald PBS/BSA. Vaskebufferne ble oppbevart for telling. 1 ml 1% SDS ble tilsatt til hver brønn for å bringe cellene i oppløsning. Etter 3 minutter kunne alle cellene observeres å ha løsnet fra platen. Den lyserte celleholdige supernatant ble tellet, sammen med en andre SDS-vask av brønnene. Totale tellinger og prosent-delen av bundne tellinger ble bestemt. Spesifikk binding ble bestemt ved å subtrahere de bundne tellinger i brønner inneholdende kaldt peptid fra de tilsvarende brønner uten kaldt peptid. Resultatene er illustrert i tabell 10.

B. Resultater

Resultatene av bindingsundersøkelsene er illustrert nedenfor i tabell 9 og 10.

C. Diskusjon

Som det kan observeres fra dataene i tabell 9, viste undersøkelsen at peptidet ble bundet spesifikt til cellene som vist ved kompetitiv inhibering av umerket peptid. Imidlertid ble cellene ikke mettet av mengden av merket peptid anvendt i denne undersøkelse. I tillegg forekom nedbrytning av peptidet ved 14 3 minutter.

Den andre undersøkelse ble utført ved anvendelse av 30 minutters-inkubasjonsperioden og en forhøyet mengde merket peptid for å oppnå metning av cellene. Som observert fra tabell 10, ble spesifikk binding vist på nytt. Videre ble metning oppnådd som vist ved utjevning av mengden av bundne tellinger ved høye konsentrasjoner av merket peptid.

Bindingsforsøkene viser således at det C-terminale peptid fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse bindes spesifikt til lungeepitelceller.

Claims (5)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt polypeptid vesentlig bestående av minst 10 aminosyrerester og ikke fler enn tilnærmet 60 aminosyrerester med vekslende hydrofobe og hydrofile aminosyrerestområder representert ved formelen (ZaUb)c<Z>d, hvori: Z er en hydrofil aminosyrerest uavhengig utvalgt fra R, D, E og K; U er en hydrofob aminosyrerest uavhengig utvalgt fra V, I, L, C og F; a har en gjennomsnittlig verdi på 1 til 5; b har en gjennomsnittlig verdi på 3 til 10; c er 1 til 10; og d er 0 til 3; karakterisert ved at polypeptidet fremstilles ved fast-fase-syntese hvor aminosyrerester, hvilke hver er beskyttet med en egnet beskyttende gruppe som selektivt kan fjernes, adderes sekvensielt til en voksende polypeptidkjede under betingelser for dannelse av amidbindinger mellom suksessivt tilførte aminosyrerester..

2. Analogifremgangsmåte følge krav 1 for fremstilling av et polypeptid hvori Z = R eller K, karakterisert ved at tilsvarende utgangs-materialer anvendes.

3. Analogifremgangsmåte følge krav 1 for fremstilling av et polypeptid hvori U = C eller L, karakterisert ved at tilsvarende utgangs-materialer anvendes.

4. Analogifremgangsmåte følge krav 1 for fremstilling av et polypeptid hvori a = 1 eller 2; b = 4-8; c = 2-4; og d = 0 eller 1, karakterisert ved at tilsvarende utgangs-materialer anvendes.

5. Analogifremgangsmåte følge krav 1 for fremstilling av et polypeptid med en aminosyresekvens utvalgt fra karakterisert ved at tilsvarende utgangs-materialer anvendes.