JPS63503222A

JPS63503222A - 肺の疎水性界面活性物質に結合した分子量６，０００ダルトンのタンパク質及びその多量体

Info

Publication number: JPS63503222A
Application number: JP50590586A
Authority: JP
Inventors: ウイツトセツト，ジエフリー・エイ．
Original assignee: サイオス　ノバ　インコーポレイテッド
Priority date: 1986-05-06
Filing date: 1986-10-24
Publication date: 1988-11-24
Also published as: EP0273916A1; WO1987006943A1; EP0273916A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】肺の疎水性界面活性物質に結合した分子量６，０００ダルトンのタンパク質及びその多量体１１へ１１肺胞硝子腹痛ＨＭＤは未熟児に多く見られる疾患であり、広汎性無気肺、低酸素症及びその結果生じる呼吸障害に係わりがある。より特定的には、ＩＩＭＤは肺胞の気道における表面張力の低下に必要な肺の極めて重要な物質の欠失に関係がある。そのため、）ＩＭＤ患者の肺胞即ち末端呼吸嚢は通常漬れてしまう。また、ＨＭＤ患者においては気体−液体界せることが極めて難しい。従って１（ＨＤは、特に未熟児に関して、著しい罹患率及び死亡率につながり得る。

現在のＩ（ＨＤ治療は適切な酸素付加状態を維持するために高濃度酸素、陽圧及び／又は機械的通気を使用することが主流となっている。このような療法は酸素を使用し、圧力に関連した障害及び気道への機械的アクセスに気管内管が必要であるために生じる障害を伴うため複雑である。しがしながら最近の研究によって、ＨＭＤ及び他の肺界面活性物質の欠失に関連した症状の治療に肺界面活性物質の代替物質を使用することが注目されるようになった。この種の療法ではこれまでのところ、エアロゾール状又は液体状の合成リン脂質混合物、天然肺界面活性物質及び動物の肺がら製造した種々の界面活性剤組成物が使用されている。天然の物質から誘導された組成物は通常合成脂質組成物より大きい表面張力低下能力を有する。改質ウシ界面活性物質を使用する予偏実験も有望視されてきた。しかしながら、ヒト及び動物の肺に由来する組成物の使用には、バッチ毎の可変性、感染の可能性及び免疫学的危険性という問題が伴ってきた。　ＨＭＤを含む何等かの病気にかかった患者を治療する場合には、その療法の患者に対する免疫学的結果を最小限に抑えるために必要な活物質のみを含むことが重要なことは明白である。残念ながら、天然の肺界面活性物質及び既存の組成物は未精製状態であるため、特異性に劣り、それに伴う免疫学的危険性も大きい。

天然肺界面活性物質は主にリン脂質と界面活性剤結合タンパク質即ちアポリポタンパク質とからなる複合物質である。リン脂質、特にホスファチジルコリン（ＰＣ）、二飽和ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）及びホスファチジルグリセロール（ｐｃ）は、天然の肺界面活性物質が肺胞の表面張力低下において果たす生理学的役割にとって極めて重要な物質である。　ＤＳＰＣを主成分とするリン脂質はＩＩ型上皮細胞の小胞体内で合成され、層板体状にパッケージされ、次いでエクソサイトーシス作用によって肺胞内のスペースに分泌される。

これらのリン脂質の一部は明らかに異化作用を受けて再合成されるのではなく、主に完全分子として再使用され天然に存在する肺界面活性物質の主成分を構成すると考えられている。

界面活性物質結合タンパク質即ちアポリポタンパク質に関しては、その正体及び有用性についてかなり異なる見解が示されている。しかしながら、この分野における医学専門家の間では、肺界面活性リン脂質の他に少なくとも幾つかのアポリポタンパク質が肺胞の表面張力低下における天然肺界面活性物質の十分な生物学的活性にとって極めて重要な意味をもつという点で合意が見られつつある。

界面活性物質結合タンパク質即ちアポリポタンパク質は血清と肺に特異的なタンパク質とを含む。ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ＾ｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　Ｃａｎ１ｎｅ　５ｕｒｆａｃｔａｎｔ　Ｍａｔｅｒｉａｌ、＾ｍ−−シー門■ ｊシｌ−２４４ニア８８−７９５．１９７３に記載のようにＫｉｎＢ他によって肺界面活性剤中で同定された肺に特異的な界面活性剤に結合したＭｒ＝３０〜４０，０００ダルトンの主要タンパク質は、グリシンに富み且つヒドロキシプロリンに富んだコラーゲン様領域を含むグリコタンパク質である０本明細書で５ＡＰ −３５と称するこのタンパク質はＭｒ・２８〜３０，０００ダルトンの翻訳生成物から合成される。この翻訳生成物は、気道で検出できる大きいオリゴマーを形成すべく、グリコジル化とプロリン残基のヒドロキシル化とスルフヒドリル依存架橋結合とにかけられる。５ＡＰ−３５のタンパク贋加水分解フラグメントは、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　５ｕｒｆａｃｔａｎｔ− ＾５ｓｏｃｉａｔｅｄＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ｓ）＾、　Ｐｅｄｉａｔｒ　Ｒｅ５１９：５０１−５０８．１９８５に記載のようにｌ’ｔｈｉｔｓｅｔｔ他によって、肺胞タンパク症患者の洗浄物質から単離したタンパク質組成物、及び低分子！タンパク質として泳動する他の動物の界面活性剤から単離したタンパク質組成物中で同定された。グリコタンパク質５ＡＰ−３５はリン脂質に結合し且つ界面活性脂質に管状ミニリンの構造１ａ楕を付与し得るが、５ＡＰ−３５が界面活性剤の生物物理的活性に必要であるか否かは未だ不明である。これに関しては、Ｋｉｎｇ他著、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ＰｕｌｍｏｎａｒｙＳｕｒｆａｃｔａｎｔ、Ｊ＾　ｌＰｈ５ｉｏ１４２　：４８３−４９１　、１９７７を参照されたい。

肺に特異的な界面活性物質に結合したより小さいタンパク質も種々の哺乳類の界面活性物質から同定された。　Ｋｉｎｇ等は往１１旺仕廷２２３ニア１５−７２６．１９７２で、肺胞洗浄物質中の１０，０００−１２，０００ダルトンのタンパク質を開示したが、このタンパク質の起源又は他のタンパク質との相違点は明らかにしていない。Ｋｉｎｇ等によって報告されたこのタンパク質は主要グリコタンパク質５ＡＰ−３５と考えられる。　Ｋｉｎｇ等のタンパク質以外にも、より小さい界面活性剤結合タンパク質が様々な種からの肺胞洗浄物質中で同定された。これらのタンパク質の分子量はイヌ及びウサギの場合が約１０．０００ダルトン、ラットの場合が１０，５００〜１４，０００ダルトン、ブタが１１，５００〜１６，５００ダルトン、ウシの場合が約１０，０００ダルトンである。

これら種々の界面活性剤結合タンパク質（ＳＡＰ）の性質及び相互間の関係、並びにより大きいタンパク質５ＡＰ−３５又はそのフラグメントとの関係は未だ樹立されていない。しかしながら、５ｕｚｕｋｉ他の研究、Ｌ」ｊＬＩ−シ＝ｓ　２３：５３−６１．１９８２では、ブタ肺胞洗浄物質中の１５，０００ダルトンの低分子量タンパク質が５ＡＰ−３５より大きい親和力を脂質に対して示すことが示唆されている。残念ながら５ｕｚｕｋｉ等は、このタンパク質と５ＡＰ−３５又はそのフラグメントとの差異を明らかにすることも、又は純粋な状態で界面活性作用が存在するか否かを示すこともしていない、　５ｕｚｕｋｉ等はこの１５，０００ダルトンのタンパク質が肺胞のリン脂質のクリアランスに関する生理学的調節物質であり得ることを示唆しているにすぎない、　Ｃ１ａｙｐｏｏｌ他はＪ　Ｃ１１ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　７４：６７７−６８４．１９８４で、ラット肺胞洗浄物質から単離した未同定の小さいタンパク質が培養ＩＩ型上皮細胞によるリポソームの取込みを増加させることを示唆している。　ｌｌｌａｎｇ他の研究＾ｉ＋ｉｎｏ＾ａｉｄ　ＣｏＢｏｓｉ−ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｏｕ＋　Ｍｉｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｗｅｉｇｈｔ　Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉａ　５ｕｒｆａｃｔａｎｔ＾ｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ、　Ｆｅｄ　Ｐｏｃ　４４：１０２４（ａｂｓｔｒａｃｔ）、１９８５には、ラットからの界面活性物質中の２つの異なる低分子量活性タンパク質が開示されている。１つはエタノールに溶解し得、もう１つはエーテル／エタノールに溶解し得るが、この場合も５ｕｚｕｋｉ等と同様に、これらのタンパクを精製してその界面活性作用を調べたり、又はその特性を分析することはしていない、　Ｈａｎｇ等はこれらの低分子量タンパク質が界面活性剤のリサイクルに関与し得ることを示唆しているにすぎない、その他、前述のごとき低分子量タンパク質がより大きい５ＡＰ−３５分子のタンパク質加水分解フラグメントとして出現する可能性も示唆された。しかしながら、これまでのところは、５ＡＰ−３５が、前記低分子量タンパクのいがずれか一方、又はこれらタンパク質の総てが天然の呻乳類肺界面活性物質に活性を与える活性成分であるが否がは不明である。

Ｆｕｊｉｗａｒａ他はＢｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　１３５：５２７−５３２．１９８６で５，０００ダルトンのタンパク脂質の単離を報告している。この物質はリン脂質と混合すると生物物理的テストで界面活性作用を示した。しかしながら、このタンパク質は特性も精製状態での作用も明らかにされていない。

Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ他は−ｏｒｌｄ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ＮｏＪＯ８６１０３４０８で３５，０００ダルトンのヒトタンパク質及び１０，０００ダルトンのヒト以外のタンパク質を開示している。これらのタンパク質はいずれも、界面活性リン脂質に十分な生物物理活性を付与するのに必要であるとされている。また、３５．０００ダルトンのタンパク質をコードする完全ＤＮＡ配列及びヒト以外の１０，０００ダルトンのタンパク質に関するＮＨ２−末端アミノ酸配列も開示されている。しかしながら、前記１０．０００ダルトンのタンパク質は残念なこと精製せずに単独で又は３５，０００ダルトンのタンパク質と組み合わせてリン脂質での生物物理的アッセイに使用されている。Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ等は組換えＤＮＡ法により誘導した３５，０００ダルトンのタンパク質をヒト以外の１０，０００ダルトンの天然タンパク質と組み合わせて使用したと思われる。５ｃｈｉｌｌｉｎ６等はまた、１０．０００ダルトンのタンパク質であると推定されるヒトｃＤＮ＾クローンに関する予備的（８１ｂｐ）部分配列も開示している。

これはイヌｃＤＮ＾クローンに対するホモロジーに基づいて選択されたものである。　当業界の現状から見ると、界面活性物質に結合した肺に特異的なタンパク質の性質及び役割を明らかにし、ＨＭＤ及び他の肺界面活性物質の欠失又はその量の不足に起因する症状を治療し且つ予防する最も効果的な手段、即ちＩ（ＨＤ治療の効果を最大にし且つ従来のＩ（ＭＤ治療に伴う欠点を解消するような手段を発見することは明らかに必要である。

（以下余白）光１し久薦ＪＬ要約すれば、本発明の目的は前記のごとき従来技術の問題及び欠点を緩和是正することである。この目的は、単純分子量６，０００ダルトンをもつ新規な単離された実質的に純粋な疎水性界面活性剤結合タンパク質の知見によって達成された。該タンパク質は、動物組織から単離されると、各々が分子ｉ６，０００ダルトンの２つの疎水性タンパクを含み、更にそのより大きい多量体（以後ｒＳＡＰ− ６Ｊと摺移）を含む。

５ＡＰ−６は脂質と結合すると有意な肺生物物理的界面活性をもち、この活性がＨＭＤ及び天然界面活性物質の欠如又は不足に関連するその他の症候群の治療及び予防に有効に利用され得る。現在では５ＡＰ−６は肺特異的であると考えられているが、肺生物物理界面活性は種特異的ではないと考えられている。従って、５ＡＰ−８は、種々の動物、例えばイヌ、ウシ、ヒト、ブタ、ウサギ、ラット等から抽出された動物組織特に肺組織もしくは羊水から精製されるか、又は組換ＤＮ八へ法又は直接ペプチド合成によって製造される。肺組織及び洗浄（Ｉａｖａｇｅ）中の５ＡＰ−６の濃度は羊水中の濃度より高いと予想される。しかしながら別の動物組織又は流体に関しては、５ＡＰ−６は実質的により少ない量もしくは検出不能な量で存在するが又は全く存在しないと考えられる。ＳへＰ−６は脂質と結合すると脂質の界面活性特性を増強する。

従って該結合物は有意な肺生物物理界面活性を生じる。この顕著な特性の結果、かがる結合物は、肺、特にＨＮＤ患者及び天然肺界面活性物質の欠如又は不足に関連するその他の症候群の患者の肺における天然の肺界面活性物質の代替もしくは補充のため又は肺の正常表面張力の低減もしくは維持のために極めて有用である。また、５ＡＰ−６は動物組織から高度に精製されるが又は組換ＤＮ＾技術もしくは直接ペプチド合成によって産生できるので、ＨＭＤ又は結合症候群の治療又は予防にこれまで利用されている純度の低い調製物に結合する免疫学的危険はがなり低減される。

本文中で、「疎水性界面活性剤結合タンパク質」及びｒＳＡＰ−６」なる用語は互換的に使用されており、この用語は、界面活性剤様活性をもちドデシル硫酸ナトリウム含有ポリアクリルアミドゲル中で測定すると約６，０００ダルトンの単純分子量をもちプロテアーゼ、エンドグリコシダーゼＦ及びコラゲナーゼに実質的に耐性であるような疎水性界面活性剤結合タンパク質をいかに少量でも含有する物質を意味するものと理解されたい。

本発明は更に、動物組織を粒子分画と液体分画とに分離し、液体分画から実質的に純粋な状態の５ＡＰ−６を抽出する工程を含む動物組織からの５ＡＰ−６の分離方法を提供する。

本発明は更に、より大きい新規な疎水性多量体から５ＡＰ−６を分離する方法に係る。前記のごとくこれは、例えばゲル電気泳動又はその他の適当な技術によって行なわれる。

本発明は更に、［ＩＨＤ及び天然肺界面活性物質の欠如又は不足に関連するその他の症候群に罹患したヒト幼児を含む動物の治療に使用される新規な医薬組成物、調製物及びその使用方法に係る０本発明は更に、５ＡＰ−６に対する新規な抗体及び抗血清に係る。

従って本発明が、天然肺界面活性物質の研究における当分野での長年の課題を解決し、ＨＭＤ及び天然肺界面活性物質の欠如又は不足に関連するその他の症候群の治療又は予防に有効な手段を提供することが理解されよう。

前記特徴及び利点は、図面、詳細説明及び実施例に関する以下の記載より明らかにされるであろう、また、記載の組成物及び方法は本発明の単なる例であり本発明がこれらに限定されないことは理解されよう。

註訓」」ＩＬ焚晟旦子離された５ＡＰ−６及びその多量体を示す添付の図面を参照する。

第１図はウシからの５ＡＰ−６である。５ＡＰ−６は本明細書中に記載したようにして精製及び脱脂し、β−メルカプトエタノールの非存在下に１０〜２０％ナトリウムドデシルスルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルに入れた。レーンＢは銀染色により検出される約２埒のタンパク質を示した。ウシからの５ＡＰ−６、レーンＢ　ハＭ　ｒ−６，０００、１４，０００，２０，０００及び２６，０００に移動した。

第２図は、ヒト、イヌ及びウシからの５ＡＰ−６である。５ＡＰ−６は本明ｌｌ１ｌ書中に記載したようにして精製および脱脂し、β−メルカプトエタノールの存在下に１０〜２０％ナトリウムドデシルスルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルに入れた。各レーンは、銀染色により検出される各タンパク質の約２埒を示（〕だ。ト１はヒト、Ｄはイヌ、Ｃはウシであり、各種からの５ＡＰ −６ハＭ　ｒ−６，０００及ヒ１４．ＯＯＯｋｍ移動Ｌり。β−メルカプトエタノール人為構造もＭｒ＝６５〜７０，０００に観察された。

標準分子量マーカーが右側に観察される。

０の！　たｆ８本発明及びそれに付随する多くの利点のより完全な説明と理解のために、以下に５ＡＰ−６，５ＡＰ−６に基づいた新規な薬剤、新規な抗体及び抗血清、及びその製造方法及びその利用について詳細に説明する。

本発明は、動物組織、特に肺１１１械及び羊水から甲部した５ＡＰ−６、組換えＤＮＡ法により製造された５ＡＰ−６、あるいは直接のペプチド合成により製造された５ＡＰ−６を提供する。

動物の組織から単ｗｉされた場合、５ＡＰ−６は、それぞれが約６０００ダルトンの単純分子量を有する２つの小さな疎水性表面活性剤結合タンパク質（以後ｒｓＡＰ−６単量体」と指称する）を含むか、あるいか５ＡＰ−６単聞休が共有的にあるいは非共有的に凝集した、より大きな疎水性タンパク質多伍体（以後「５ＡＰ−６条苗体」と指称する）を含んでいてもよく、後者は５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を使用した寸法測定に基いて約１４，０００．約２０．０００及び約２６，０００ダルトンの分子量を有している。その他の５ＡＰ−６多量体も存在し得るが、より小さな検出し得ない濃度であることを注記しておく。ここで使用する［単純分子ＦＭ　（ｓｉｍｐｌｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｕｒ　ｗｅｉｇｈｔＮとは、スルフヒドリル還元の後の最も小さなポリペプチド鎖と考えられるものの分子量を示すものであり、これは５ＡＰ−６多量体の構築繰り返しブロックとなるものである。

分子量を決定し、より大きな５ＡＰ−６多量体から５ＡＰ−６単石体を分離するためには、例えば約２％のナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）を含む約３〜２７％、特に約１５％のポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）を使用して５ＤＡ−ＰＡＧＥ中の５ＡＰ−６単量体及び多量体を分離し、分子Ｂを決定することができる（第１図参照）。例えば、トリプシンインヒビター（６，２００）、リゾチーム（１４，０００）　、β−ラクトアルブミン（１８，４００）　、α −キモトリプシン（２５，７００）及びオバルブミン（４３，０００）のような低分子量タンパク質マーカーを比較に使用できる。これ等はＢＲＬ社、ＢｅｔｈｅｓｄａＳＭ　Ｄより入手できる。

例えばβ−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）のようなスルフヒドリル還元剤の非存在下、あるいは還元及びアルキル化の後に５ＡＰ−６についてゲル分離を行なうと、５ＡＰ−６単量体に対してより大きな５ＡＰ−６多量体の増加がみられた。従って、５ＡＰ−６のフラクションのスルフヒドリル結合、非スルフヒドリル凝集及び／又はベアブード間結合が、より大きな疎水性５ＡＰ−６多量体の原因となっていると考えられる。分子量は単に相対的移動により評価されるものであり、より正確な分子間決定は他の適当な方法を使用して行ない得ることは明らかである。

本明細書中で使用する「疎水性」は、例えば３：１のエーテル／エタノール、クロロホルム、３：１のような種々の比率のクロロホルム／メタノール等の非極性溶媒中の溶解度を示し、疎水性非電荷アミノ酸を多数有するものである。本明細書中で使用する「表面活性剤結合タンパク質」の用語は、等張溶液中での遠心分離の間に哺乳動物表面活性剤のリン脂質成分に結合するか共に精製された結合タンパク質を示す。

５ＰＡ−６はさらに、プロテアーゼ酵素（トリプシン、キモトリプシン及び５ｔａｐｈ　Ｖ−８）、エンドグリコシダーゼＦ及びコラブナ−ぜに対して実質的に耐性であることによっても特徴付けられる。５ＡＰ−６はこれ等の酵素により分解されず、寸法異質性も有意には変化させられないことが判明した。

５ＡＰ−６は種々の哺乳動物種の肺■型細胞及び肺表面活性剤、並びに妊娠終期に近い頃のヒト羊水中に局在することによっても特徴付けられる。

５ＡＰ−６のアミノ酸組成決定に関しては、精製した試料を異なる２つの方法で加水分解した。第１の方法では、試料を０．３％フェノール及び０１％β−メルカプトエタノールを含む５．７ＮＨＣｊＪ中で１１０℃で約２４時間及び４８時間真空下に連続的に沸騰させて加水分解した。第２の方法では、これ等の同じ試料を０．３％フェノールを含む１２ＮＨＣｆｆｉ／Ｉ−リフルオロ酢酸（２＋１）中１５０℃で真空下に２時間、６時間、２４時間及び４８時間加水分解した。

これ等の試料のシスティン組成を、過蟻酸酸化の後、システィン酸として別々に測定した。次に酸化した試料を０．３％フェノールを含む１２ＮＨ（１！／トリフルオロ酢酸（２：１）中１５ｏ℃で３時間加水分解した。Ｂｅｃｋｍａｎ　６３００アミノ酸分析器と５ＩＣＡ　７０００＾１ｎｔｅｌｊｒａｔＯｒを使用してアミノ酸を測定した。

第１表は、ウシ及びイヌ５ＡＰ−６について測定されたアミノ酸組成を示す。Ｂｅｃｋｍａｎ　６３００分析嘉分析用してアミノ酸組成の測定を行なったので、タンパク質分子当りのアミノ酸残基組成はこの分析方法に基づいてのみ評価されるものであることは当業者に明らかであろう。

（以下余白）策−１−ロー去分子量　６５８８．０　６６２０．　Ｑ（計算値）本加水分解より得た最大値前記したように、５ＡＰ−６は分子量が６，０００の蛋白質すなわち５ＡＰ−６の七ツマ−の２つからなる。ここにいう５ＡＰ−６のモノマーを特徴づけるために、各蛋白質をそれぞれ別個に５ＡＰ−６−Ｖａｌ及び５ＡＰ−６−Ｐｈｅと称する。

ウシ、イヌおよびヒトの５ＡＰ−６−Ｖａｌ各々の最初の２５個。

最初の２３個及び最初の１９個のＮＨ２末端アミノ酸残基の配列を決定した。それらを第２表に示す。

ウシ、イヌおよびヒトの５ＡＰ−６−Ｐｈｅ各々の最初の６個。

最初の７個及び最初の１２個のＮＨ２末端アミノ酸残基の配列を決定した。それらを第３表に示す。

第　２　表５ＡＰ−６−ＶａｔＮＨ２末端アミノ酸配列イヌ：　Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−３ｅｒ−Ｌｅｕ− Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌヒト：　Ｌｅｒ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−八ｓｎ− ｌ−ｅｕ−Ｌｙｓ−（Ｉｌｅ）Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（）の上のアミノ酸は（）内のアミノ酸でもあり得る。

いずれをとり得るかはＴＮ　Ｆ＆していない。

肛−−−ユーーー人５ＡＰ−６−ＰｈｅＮＨ２末端アミノ酸配列ウシ：　Ｐｉｅ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｐｒ。

イヌ：　ｌ１ｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｐｒｏ−丁ｈｒヒト：　Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−＾Ｉａ−Ｌｅｕ配列決定に際しては、Ｓ　Ａ　Ｐ−６サンプルを、先ずサンプルを水で透析するエドマン配列分析法によって調製した。サンプルをメタノール中にとり、ガラス繊維フィルターにか番プた。

分析は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｉｓ　ｍｏｄｅｌ　４７ＱＡ　Ｇａｓ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｒで行なった。得られたフェニルチオヒダントイン（Ｐ　Ｔ　Ｈ）　＋７）分析は、５０℃でＡｌｔｅｘ逆相ＰＴＨ−Ｃ１８カラムＦでの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）で行なった。酢酸アンモニウム緩衝アセトニトリル（ｐＨ４，５）の二成分緩衝システムを用いた。

クロマトグラフィーの操作は、約１０％のアセトニトリルを含有するバッファーＡと約９０％のアセトニトリルを含有するバッファーＢとを用いて行なった。最初のクロマトグラフィー条件は、７０％のバッファー八と３０％のバッファーＢであって１．Ｏｄ／分の流速である。インジェクションから１分経過すると、バッファーＢの濃度が３分間に渡り５０％まで直線的に増加し、その後８分間のこのレベルにあった。次いでバッファーＢの濃度は１分間に３０％まで減少した。

約１０分間か（プて再び平衡状態に戻した後、別のＰ　Ｔ　Ｈサンプルをインジェクトした。この分離法の詳細は、Ｊｏｓｐｅｐｈ　Ｌ、　Ｈｅｕｔｈ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｌａｗｒｅｎｃｅ　Ｆｏｘ、　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄ　Ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏｈｙｄａｎｔｏｉｎ　Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ　ｂｙＨｉｇｈ−Ｐｒｅｓｓｕｒｅ　１ｊｑｕｉｄ　ＣｈｒｏＩＩｌａｔｏｇｒａｐｈｙ、　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

Ｖｏｌ、１５４．　Ｉ）ｐ、　４７８−４８４．１９８６に述べられている。なお、この技術文献の内容は参照により本明細内中に含める。

すでに指摘したように、５ＡＰ−６は６．０００ダルトンの疎水性界面活性剤関連蛋白質２つからなる。これらの５ＡＰ−６モノマーについて、次のことが観察された。先ず第１に、イヌ。

ウシおよびヒトのＳΔＰ−６”−ＶａｌのＮ）１２末端アミノ酸残基配列はそれぞれ上記に示したように相互に似たものではあるが、これら３つの種すべての５ＡＰ−６−ＰｈｅのＮＨ２末端アミノ酸残基配列とは非常に異なるものである。

同様に、３つの種すべての５ＡＰ−６−ＰｈｅのＮＨ２末端アミノ酸残基配列は相互に似たものではあるが、５ＡＰ−６−Ｖａｌ配列とは非常に異なるものであった。第２に、５ＡＰ−６をβ−メルカプトエタノールの非存在下でゲル電気泳動にかけ移動させると、スルフヒドリル還元剤１人けおよび少ヱの蛋白質が出現した。このことは第１図を参照すればより良く理解される。すなわち、第１図において、人品の銀染色蛋白質が分子量６，０００および１４，０００の移動領域に表われ、小量の銀染色蛋白質が分子量２０，０００および２６、０００の移動領域に表われている。第３に、５ＡＰ−６をβ−メルカプトエタノールの存在下でゲル電気泳動にかけ移動させると、第２図に示すように銀染色蛋白質は分子１６，０００および１４．０００の移動領域にのみ表われる。これらから、２つのハツキリした６、　０００ダルトンの５ＡＰ−６モノマーが存在することが判る。これらは、共溶出性であり、ゲル電気泳動移動により共に精製され得るものであり、ドデシル硫酸ナトリウムを含有するポリアクリルアミドゲル上でめた約６．０００ダルトンの同じような分子量を有しており、同じような生物物理的界面活性剤様活性を有しており、同じような酵素耐性を有しているものと思われる。

更に、１つ又はそれ以上の６，０００ダルトンの５ＡＰ−６モノマーから得られるより大きな５ＡＰ−６マルチマー、すなわちＭ　ｒ　＝　２０，０００および２６，０００の５ＡＰ−６フルチマーは、第１図および第２図に示したように、 β−メルカプトエタノールの非存在下および存在下におけるそれらの移動パターンに鑑み、スルフヒドリル結合を介しておそらく相互に結合している。

それゆえ、６，０００ダルトンの疎水性界面活性剤関連蛋白質はいずれも、すなわち５ＡＰ−６は本発明の範囲内にあるものと理解すべきである。５ＡＰ−６Ｐｈｅが分子ｆｆｉ　６，０００〜１４，０ＯＯｆ７）領域を移動する可能性があるが、このことはペプチドの加水分解の結果として生じ得るのである。すなわち、ｓ、ｏｏｏ〜１４，０００の間に形態の上で若干の異質性があることに留意すべきであり、このことは５ＡＰ−６−Ｐｈｅプレカーサーの種々の加水分解を反映するものである。

本発明は、更に、新規な５ＡＰ−６の単離法にも係る。５ＡＰ−６は、例えば動物組織、流体、細胞、培養細胞、適当な肺界面活性剤置換調製物たとえばＣＬＳＥ若しくは５ｕｒｆａｃｔａｎｔ−Ｔへ等々から精製することができる。ここにいう［＠物組織Ｊとは広い意味を有しており、５ＡＰ−６に対するすべての適当な源を含んでいるものであり、例えば動物組織、流体、細胞、培養細胞、ＣＬＳＥおよび５ｕｒｆａｃｔａｎｔ−Ｔへのような肺界面活性置換調製物等々を指すがかならずしもこれらに限定されるものではない。しかしながら、動物肺組織又は羊水から５ＡＰ−６を分離するのが好ましい。より好ましくはヒトの肺組織から５ＡＰ−６を単離する。５ＡＰ−６含有溶液は、５ＡＰ−６が存在する動物組織の抽出によって得られる。例えば、吐乳動物の肺を切開し、好ましくは気管にカニユーレを挿入し、数倍容量の水冷緩衝溶液たとえば０，９％ＮａＣρ　（ｐＨ７，０〜７．４）で何回も洗浄して肺胞から界面活性剤を取り出す。洗浄液を低速たとえばｉｏｏｏｇで１０分間遠心分離し、汚染原因となる血液および白血球すなわちマクロファージを除去するために必要に応じ前記遠心分離を繰り返す。すべての操作は好ましくは約２〜４℃で行う。次いでこの界面活性物質を高速で肺胞洗浄液から遠心分離し、約３０分間もしくはそれ以上かけて約１０．０００９で粒状物質を沈澱させる。このペレットを好ましくは再懸濁し、繰り返し遠心分離で洗浄し、上記したような適当な緩衝液中で必要に応じ複数回超音波処理若しくは凍結融解し、前記物質を均一に再懸濁させる。

得られた白色の界面活性剤を遠心分離によりベレットにし、水性物質を除去し、１０〜１００容量の約２：１のエーテル／エタノール、３：１のクロロホルム／メタノール又は他の適当な有機溶媒を用いて約−３０℃で抽出し５ＡＰ−６を含有する上清を得る。抽出は一晩中続ける。次いで該物質を再び約１０，０００ｇで約２０分間若しくはそれ以上遠心分離する。得られた液体画分には脂質および本発明の５ＡＰ−６が含まれている。その後この液体画分を例えばＮ２気流を用いて乾燥（ｌｌｉ縮）し、クロロホルム又は他の適当な有機溶媒のごとき有機溶媒中に再懸濁し、室温でクロロホルム又は他の適当な有機溶媒で予め平衡化しておいたサイズが約５０１×２．５ｃｍの珪酸カラムすなわちＬ　Ｈ−２０カラムに通す。次いで、このカラムを、例えば５０〜２００　ｄのクロロホルムとメタノールのようなアルコールとの混合物を用い、アルコール濃度を段階的に又は勾配的に０％から約１００％に増加させながら溶出する。５ＡＰ−６は、アルコール濃度が約４０％以上で約１００％までの溶媒中に、特に約４０％以上８０％の溶媒中に溶出する。５ＡＰ−６中に存在するすべての脂質はこの段階で蛋白質から分離する。前記珪酸カラムはまた本発明の５ＡＰ−６を抽出することのできる任意の他の適当な溶媒でも溶出し得ることを当業者は理解すべきである。５ＡＰ −６を単離する具体例を以下の実施例に示す。

（以下余白）実施例 ■、′　の゛殺した成体イヌ及びウシから得た肺洗浄物質から、界面活性物質と結合したタンパク質を単離する。また、解剖したヒト死体からかあるいは同性愛者の肺洗浄物から得たヒト界面活性物質からもタンパク質を単離する。動物試験では気管にカニユーレ挿入し、氷冷した０、９％ＮａＣｌ、５０ｚＭＮａＪＰＯ＜及び５ｚＭ　ＥＤＴ＾、　ｐＨ７，２数容量で肺を３回洗浄する。

細胞及び挫滅組織片を８０×ｓでの約１０分間の遠心分！（２回）により除去し、各フラクションを、４ｏ、ｏｏｏｘｙでの遠心分離を４℃で約３０分間行なうことにより収集する０次に、ベレット化した物質を１ｚＭフェニルメチルスルホニルフルオライド含有の上記緩衝液中に再び懸濁させ、Ｂｒａｎｓｏｎソニファイアーで１０秒間超音波処理する。４℃で約３０分間行なう約４０，０００ｘｙでの遠心分離を繰り返すことによって、界面活性物質をベレット化する。

ｌエ　Ｓ＾Ｐ−６タンパク　の　゛か　の　１界面活性物質ベレットを、約３：１のエーテル／エタノールあるいはクロロホルム／メタノール中で約−３０℃で約１６時間抽出することによって更に処理する。５ＡＰ−６を含有するエーテル／エタノールあるいはクロロホルム／メタノール抽出物を、Ｎ、ガスでほぼ乾燥状態となるまで蒸発させた後再びクロロホルム中に溶解する。クロロホルム中の再溶解残渣をＢｉｏＳｉｌＨ＾カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ製の寸法２　、５ｃｖ　Ｘ　４０ｃｍのシリカカラム）に付与し、クロロホルム中で平衡させる。クロロホルム−メタノール混合物で、クロロホルム中のメタノール濃度を（１０％間隔で）連続的に高めつつ段階的に溶離する（混合物量は毎回２００ｚ１）ことにより、脂質−タンパク質フラクションを回収する。３：２から１：４のクロロホルム／メタノール溶剤での溶離において、もしくはクロロホルム中のメタノール濃度約４０％〜約８０％において５ＡＰ−６タンパク質が溶離できる。

今や、本発明の５ＡＰ−６を含有するフラクションを、例えばフルオレサミンアッセイによって、あるいはゲル電気泳動の後銀での染色かあるいはクーマシーブリリアントブルー染色を実施することによって検出し得る。この時点で単離した５ＡＰ−８を、実質的に純粋かつ均質であると看做す。

“実質的に純粋”という語句は本明細書では、５ＡＰ−６が細胞、細胞破片、ＤＮＡ、ＲＮＡ、並びに主な界面活性糖タンパク質あるいはそのフラグメントといった汚染物質を実質的に有しないということを意味する。しかし、実質的に純粋となった５ＡＰ−６になお幾分かの脂質が残留することが認識されるべきである。最も好ましい形態において、実質的に純粋な５ＡＰ−６は汚染物質を約１０％以下のオーダーで含有する。

所望であれば、単離した、実質的に５ＡＰ−６単量体並びに比較的大きい５ＡＰ −６多量体から成る実質的に純粋な５ＡＰ−６から更に脂質を除去するべく、溶離５ＡＰ−６を含有するフラクションを好ましくは貯溜し、蒸発させてほぼ乾燥状態とし、更に例えばセルロース透析バッグで、約２＝１のクロロホルム／メタノール混合物その他の適当な混合物か、あるいは［ＩＣＩその他の適当な酸で酸性化した酸性化クロロホルム／メタノール混合物約１００〜５００容量を用いて、はぼ室温で繰り返し透析する。この手続きは、５ＡＰ−６が汚染物質としての脂質を実質的に有しなくなるまで続行するべきである。実質的に精製したこの５ＡＰ−６も、フルオレサミンアッセイ及びゲル電気泳動によって検出し得る。脂質の除去のために、上述以外の適当な脂質除去ステップを用いることも可能であることが認識されるべきである。クーマシーブリリアントブルー染色、銀染色その他の標準的な染色技術でのＰＡＧＥ後、おおよそのアミノ酸組成も決定し得、タンパク質を同定し得る。上述の方法は概略的に説明してあり、この方法を、５ＡＰ−６を適当なソースから分離及び複製する他の適当な溶剤及び方法と共に用いることも可能であることが認識されるべきである。５ＡＰ−６タンパク質については、その全体が本明細書に参考として含まれるＪｅｆｆｒｅｙ＾、Ｗｈｉｔｓｅｔｔｅｔ　ａｌ、、　Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉａ　５ｕｒｆａｃｔａｎｔ−＾５ｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＡＰ６−１４）　Ｉｎ　Ｗｈｏｌｅ　Ｌｕｎｇ　５ｕｒｆａｃｔａｎｔ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ｉ輸ｐｏｒｔａｎ−ｃｅ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ＾ｃｔｉｖｉｔｙ　Ｉｎ　Ｌｕｎｇ　５ｕｒｆａｃｔａｎｔ　Ｅｘ−ｔｒａｃｔｓ　Ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ｔｈｅｒａｐｙ、　Ｐｅｄｉａｔｒ　Ｒｅｓ　２０：４６０−４６７、１９８６、及びＪｅｆｆｒｅｙ　八、　Ｗｈｉｔｓｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｍｍｕ−ｎｏｌｏｇｉｃ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｐｕｌ＋＊ｏｎａｒｙ　５ｕｒｆａｃｔａｎｔ−＾５ｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｒ　Ｍｒ＝６，０００　Ｄａｌｔｏｎｓ、　Ｐｅｄｉａｔｒ　Ｒｅ５２０：　７４４−７４９．１９８６において検討されている。

本発明の５ＡＰ−６は、有用な“′界面活性剤様活性”を有すると考えられる０本明細書において用いられる“界面活性剤様活性”という語句は、リン脂質その他の脂質と相互に作用して、表面に広がる表面張力を低下させ、及び／または空気−液体界面での表面張力を低下させる能力を意味する。また、５ＡＰ−６、即ち５ＡＰ−６単量体か、あるいは５ＡＰ−６多量体と組み合わせた５ＡＰ−６単量体を脂質と混合すると、ＳＡＰ＝６の界面活性剤様活性が混合物に著しい生物物理学的肺胞界面活性を付与すると考えられる。この活性を有する上記のような混合物は、肺、特にＨＭＤ及び自然の肺胞界面活性物質の欠如あるいは不足に関連するその他の症候群に冒された動物の肺において表面張力を低下させ、あるいは正常の表面張力を維持するべく自然の肺胞界面活性物質と置き換え、あるいは該物質に補足するのに非常に有用である。

５ＡＰ−６及び脂質を含有する薬用調製物を製造するために、単離した５ＡＰ− ６を、脂質との再結合前に約−３０℃で窒素あるいは空気の存在下にクロロホルム中に貯蔵することが可能である。上記調製物はまた、アルコールを用いても製造できる。中性その他の脂質並びにリン脂質を含めた用いることが可能な脂質は、ホスファチジルコリン、二飽和ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール等の適当なリン脂質及びこれらの混合物、コレステロールあるいはコレステロールエステル及びこれらの混合物等から誘導し得る０例えば、精製５ＡＰ−６を約０．１〜約２．０％の量で、約６５％のジパルミトイルホスファチジルコリン、約２０％の卵ホスファチジルコリン、約７．５％の大豆ホスファチジルイノシトール並びに約７．５％の卵ホスファチジルグリセロールのような合成リン脂質と混合し得る。所望であれば、このような薬剤の調製において混合物は更に０．９％塩化ナトリウム含有の生理緩衝液を、場合によっては約０．５ａＭ〜約１．５ａＭ塩化カルシウムその他の、医薬的に許容される任意の適当な基剤と共に含有し得る。再結合もしくは混合の後に、物質を超音波処理し、あるいは攪拌して、表面張力低下能力並びにウィルヘルミーバランスその他の表面張力測定装置での吸着について試験する。吸着試験は、その全体が本明細書に参考として含まれるＮｏｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｔ、。

Ｃｈｅｗ、　Ｐｈ　ｓ、　Ｌｉ　ｉｄｓ　３３：　６７−８０．１９８３、及びＲｏｓｓ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆＰｕｌｍｏｎａｒｙ　５ｕｒｆａｃｔａｎｔ−＾５ｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ＡＰ−３５ａｎｄＩｔｓ　Ｎｏｎ−ＣｏＮｏｎ−Ｃｏ１１ａ　Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｄｏｍａｉｎｓ、　Ｉｎ　Ｐｒｅｓｓ。

１９８６に開示されている方法で実施し得る。

約６５％のシアルミドイルホスファチジルコリン（ＤＤＰＣ）、約２０％の卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）、約７．５％の卵ホスファチジルグリセロール（Ｐに）並びに約７．５％の大豆ホスファチジルイノシトール（ｐｒ）を含有するリン脂質混合物（ＳＮ）を、脂質を除去した５ＡＰ−６と組み合わせ、ウィルヘルミーバランス及び窒素気泡サーフアクトメーターで試験する。　５ＡＰ−６−リン脂質混合物は、急激に吸収されて表面張力を約３０〜４７ダイン／ｃｚ低下させ、同じ脂質と混合して同様に試験した、主要な界面活性物質結合糖タンパク質である５ＡＰ−３５のリン脂質混合物より大きい活性を有することが判明した。

表■〜■を参照されたい０表■〜■の作成に用いた方法は、先に言及したＮｏｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、及びＲｏｓｓ　ｅｔ　ａｌ、の論文に詳細に記載されている。

老」し合成脂質混合物（ＳＭ）　＊　、５ＡＰ−３５結合合成脂質混合物及び５ＡＰ− ６結合合成脂質混合物の吸着効果脂質濃度　吸着表面圧力良釦割　島■ｌ！ｂ山画韮上　堕刈た　野Ｌ　脂分］Σ形ＳＭ　Ｏ，６Ｂ／＋ａｌ　１　ダイン／ｃｍ　１　１　３ＳＭ＋５ＡＰ−３５＊＊　０．６１１１１／ＩＩＩ　２０　ダイン７ｃｍ　２２　２２　２２（イヌ）ＳＮ＋　５ＡＰ−６＊零　０．６　＋＊Ｈ／＋＊ｌ　４３　ダイン／ｃｍ　４５　４５　４５＊ＳＨは、ＤＰＰＣ：卵−ＰＣ：卵−ＰＧ：ダイズーＰＩが６５：２０ニア、５ニア、５がら成る合成脂質混合物である。

木本プロティン５ＡＰ−３５及び５ＡＰ−６を同様のモル比で加えた。

表Ｎ− 合成リン脂質混合物と結合させた、脱脂５ＡＰ−３５及び種々のセグメント並びに５ＡＰ−６の吸着界面活性剤　本本表面圧力（ダイン／ａｍ）２、ＳＮ＋１　２　４　５　５卵アルブミン３、ＳＮ＋５ＡＰ−３５９１３１４１５１８４、ＳＮ＋５ＡＰ−１８８１６１７１７１８５、ＳＮ＋５ＡＰ−２１２４６７９６、天然ＬＳ　１７　４６　４６　４７　４７７、ＳＭ＋イヌ　１９　２６　２９　３１　３３　３７ＳＡＰ−６（２５ｕｇ）８、ＳＭ＋イヌ　３７　４７−４８　４７−４８　４７−４８４７−４８ＳＡＰ −６（５０ｕｇ）９、ＳＭ＋イヌ　４６　４７　４７　４７　４７ＳＡＰ−６（ｌｏｏｕｇ）本試験した脱脂タンパク質はグリコプロティン５ＡＰ−３５、Ｓ＾Ｐ−２１及び５ＡＰ−１８とイヌ５ＡＰ−６とである。これらのタンパク質ノ各々を、ＤＰＰＣ：卵−ＰＣ：卵−ＰＧ：ダイズーＰＩが６５：２０ニア、５ニア、５から成る合成リン脂質混合物（ＳＮ）と結合させる。天然ＬＳ（脂質−表面活性剤）は最適な活性表面活性剤を代表する。

卵アルブミンは非特異的なタンパク質ｌコントロールとして使用する。

全吸着実験におけるリン脂質濃度は、約１．４＋ａＭ　ＣａＣｌ２を有する約０．０６３ｍｇ／ｓ＋Ｉ　Ｏ，１５８ＮａＣｌである。

温度は３５〜２℃であり、ケース２〜うでは、タンパク質に対する脂質の比は、（重量７重＠）９９／１から９８／２である。

天然ＬＳを除いた全混合物を室温で渦動させることによって分散する（再懸濁液）０木本表面圧力は、時点０で撹拌しである並相に表面活性剤の丸塊を分散してから１０秒以内に測定する量である。ケース１〜６で得られた値は、常に３ダイン／Ｃ−未満のＳＥＭ（測定の標準誤差）を有する４〜１０回の実験の平均値である。但し５ＡＰ−１８については、平均値の近傍０゜５ダイン７ｃｍの偏差を有する２回の実験の平均値である。

退Ｗ振動バブルを動的圧縮する間に低下する動的表面張力循環後最小表面張力表面活性剤　分散濃度　〈ダイン／Ｃ−）２、卵−ＰＣ１ｍｇ／ｍｌ　５３　４２　２７　２２３、ＳＮ＋５ＡＰ−３５１ｍｇ／ｍｌ　３６　３６　３６　３６４．３Ｍ＋５ＡＰ−３５２＋＊ｇ／ｍｌ　３５　２３　２１　２１５、ＳＮ＋５ＡＰ−２１１Ｔａｇ／ｍｌ　５４　４７　４７　４２６、ＬＳ　ＩＢ／ｍｌ　１６　１０　２　Ｌ７、ＳＭ＋イヌ　１１１１［１／Ｉｌ＋　１５　１５　１４　３　１ＳＡＰ−６（２５ｕｇ）８、ＳＮ＋イヌ　０．５ｍｇ／ｍｌ　１７　１６　１６　１８　１８ＳＡＰ−６（２５ｕｇ）９、ＳＮ＋イヌ　２Ｂ／ｍｌ　１６　９　４　３　１ＳＡＰ−６（２５ｕｇ）１０、Ｓ８士イヌ　０．５重ｇ／ｍｌ　１６　１５　１　１　他５ＡＰ−６（５０ｕｇ）Ｓ８士イヌ　１偽ｇｌ係１　１５　０　０　０　他５ＡＰ−６（５０ｕｇ）Ｓ８士イヌ　２Ｔａｇ／ｍｌ　１５　１３　１　他　他５ＡＰ−６（５０ｕｇ）温度約３７”Ｃ１湿度約１００％、循環速度的２０ｅｐ＋ａ及び面積圧縮約５０％の条件で振動バブルについて表面活性剤分散を試験する。濃度は表に示したように１又は２−ｇ脂質／−１バブル亜相である。天然ＬＳ（脂質−表面活性剤）は、ケース３−５及び７−１０の脂質−タンパク質結合混合物をそれと比較するための活性肺表面活性調製剤を代表する。

（以下余白）１（ＭＤ及びその他の関連疾患の治療においては、これらを治療又は予防するために５ＡＰ−６と天然又は合成リン脂質とを含有する混合物を例えば液体形態又はエアゾールスプレーとして体重１ｋｇ当たり５ＡＰ−６約０．１〜約２．０単量％及びリン脂質約２０〜約ＬＯＯｘｇの投与量で気管内に点滴注入するとよい。

５ＡＰ−６の別の用途は抗５ＡＰ−６抗体又は抗血清の調製である。

これらの抗体又は抗血清は、５ＡＰ−６を検出、定量又は精製するための免疫化学的方法で使用される０例えば、抗５ＡＰ−６抗体及び抗血清は免疫学的検出のためのイムノプロット及びＥＬＩＳ八分析へはその他の５ＡＰ−６の免疫学的アッセイに使用され得る。

このために使用できる抗５ＡＰ−８抗体及び抗血清は以下のごとく得られる６脱脂５ＡＰ−６とフロイント完全アジュバントとの反復注射によってへＩｂ１ｎｏウサギを免疫する。毎回的１００μ９の脱脂５ＡＰ−６の注射を４回反復すると有用な抗血清が得られる。−次元５ＯＳ−ＰＡＧＥ後の銀染色分析によれば、注射に使用される５ＡＰ−６は、５ＡＰ−６単量体とより少量の５ＡＰ−６多葉体とを含有していなければならない、アフィニティクロマトグラフィーによってポリクローナル抗体が抗血清から単離され得る−０ＳＡＰ−６タンパク質に対するモノクローナル抗体を産生ずるためには、かかる抗体を産生ずるための公知の標準方法が本発明にも応用できる。１つの例として、一般にはＫｏｈｌｅｒ＆　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、２５６：４９５−４９７（１９７５）の方法を用い、単離５ＡＰ−６で免疫したマウスのリンパ球を例えばポリエチレングリコールの存在下にマウスミエローマ細胞と融合させる。上記文献の記載はすべて本明細書に含まれるものとする８次に生存ハイブリッドを選択クローニングによってスクリーニングし抗５ＡＰ−６抗体を産生する細胞だけを得る。この細胞を免疫吸収によって夾雑ミエローマ抗体から分離すると、例えば組織サンプル中の５ＡＰ−６の検出のためのイムノアッセイ方法で使用できる０例えばかかる抗体は、５ＡＰ−６を含有する混合物から５ＡＰ−６に結合するか又は５ＡＰ−６を沈殿させることができ、５ＡＰ−６の沈降速度を促進し、ゲル濾過における５ＡＰ−６の溶出特性を変化させ、サンプルから５ＡＰ−６を同定又は定量し得る。

免疫学的方法による５ＡＰ−６の検出及び定量は診断的に重要である。正常状態ではＳＡＰ−８が人体のある種の組織例えば肺組織、肺洗浄及び羊水中で産生されるので５ＡＰ−６の検出が可能である。　５ＡＰ−６関連疾患ではこのタンパク質が血清、肺のごとき組織及びその他の体液中に出現しないが又は変化した濃度で出現する。これらのタンパク質の検出又は検出欠如を利用して、疾患の診断決定又は疾患の進行の追跡及び疾患の治療の細心な管理を行なうことが可能である。　５ＡＰ−６は、抗５ＡＰ−６抗体を使用するイムノプロット分析によって妊娠終期のヒト羊水から検出された。

本発明の要旨及び本質的特徴を逸脱することなく、本明細書に記載の方法以外の特定方法で本発明を実施することは勿論可能である。従って記載の具体例はすべて例示的なものであり限定的なものでないこと及び請求の範囲の要旨及び範囲と均等の変更はすべて本発明に包含されることを理解されたい。

国際調査報告１＋ＩＩｅｎ内−１電１ｎａａｌ＾ａｏｈｃｎ＋ｎ＊ｘａｐ（：＝＝！７／”Ｊ５８６７０２２５８Ｉ酎囮Ｉゆ一＾帥−１＋−ＩＩｍ、　ｐｃＴ／ワＣ’１６１０２２５ＢＰＣＴ／ｌ、ｌｓ８６１０２２５Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】

１．脂質の界面活性剤様活性を増大し、ドデシル硫酸ナトリウム含有ポリアクリルアミドゲル中で測定した単純分子量が約６，０００ダルトンであり、ブロテアーゼ酵素，エンドグリコシダーゼＦ，及びコラゲナーゼに対して実質的に耐性である、単離され実質的に純粋な疎水性界面活性剤結合蛋白質（ＳＡＰ−６）。
２．動物組織から得られることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の単離ＳＡＰ−６。
３．その疎水性多量体を更に含有することを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の単離ＳＡＰ−６。
４．前記多量体が、ドデシル硫酸ナトリウム含有ポリアクリルアミドゲル中で測定した分子量が約１４，０００ダルトン，約２０，０００ダルトン及び約２６，０００ダルトンを有する疎水性多量体及びそれらの混合物から成る群から選択されることを特徴とする、請求の範囲第３項に記載の単離ＳＡＰ−６。
５．動物組織から抽出されることを特徴とする、請求の範囲第３項に記載の単離ＳＡＰ−６。
６．脂質の界面活性剤様活性を増大し、ドデシル硫酸ナトリウム含有ポリアクリルアミドゲル中で測定した単純分子量が約６，０００ダルトンであり、ＮＨ２− 末端アミノ酸残基配列が、【配列があります】及び【配列があります】から成る群から選択される、単離され実質的に純粋なヒトＳＡＰ−６。
７．脂質の界面活性剤様活性を増大し、ドデシル硫酸ナトリウム含有ポリアクリルアミドゲル中で測定した単純分子量が約６，０００ダルトンであり、ＮＨ２− 末端アミノ酸残基配列が、【配列があります】及び【配列があります】から成る群から選択される、単離され実質的に純粋なイヌＳＡＰ−６。
８．脂質の界面活性剤様活性を増大し、ドデシル硫酸ナトリウム含有ポリアクリルアミドゲル中で測定した単純分子量が約６，０００ダルトンであり、ＮＨ２− 末端アミノ酸残基配列が、【配列があります】及び【配列があります】から成る群から選択される、単離され実質的に純粋なウシＳＡＰ−６。
９．下記のアミノ酸残基組成を有する、単離され実質的に純粋なＳＡＰ−６：　　　　　　　タンパク質分子当りのアミノ酸残基　アミノ酸残塁概数Ｃｙｓ　　　　約３〜約６Ａｓｘ　　　　約１〜約３Ｔｈｒ　　　　０〜約１Ｓｅｒ　　　　約１〜約６Ｇｌｘ　　　　約１〜約４Ｐｒｏ　　　　約４〜約６Ｇｌｙ　　　　約４〜約７Ａｌａ　　　　約２〜約７Ｖａｌ　　　　約７〜約２５Ｍｅｔ　　　　約１〜約２Ｉｌｅ　　　　約４〜約７Ｌｅｕ　　　　約１０〜約１６Ｔｙｒ　　　　０〜約２Ｐｈｅ　　　　０〜約３Ｈｉｓ　　　　０〜約１Ｌｙｓ　　　　約２〜約３Ｔｒｐ　　　　０〜約２Ａｒｇ　　　　約２〜約５。
１０．下記のアミノ酸残基組成を有し、ヒト由来であることを特徴とする、請求の範囲第９項に記載のＳＡＰ−６：　　　　　　　タンパク質分子当りのアミノ酸残基　アミノ酸残塁概数Ｃｙｓ　　　　約５Ａｓｘ　　　　約１Ｔｈｒ　　　　約１Ｓｅｒ　　　　約１Ｇｌｘ　　　　約４Ｐｒｏ　　　　約５Ｇｌｙ　　　　約４Ａｌａ　　　　約７Ｖａｌ　　　　約７Ｍｅｔ　　　　約１Ｉｌｅ　　　　約６Ｌｅｕ　　　　約１０Ｔｙｒ　　　　約２Ｐｈｅ　　　　約１Ｈｉｓ　　　　約１Ｌｙｓ　　　　約２Ａｒｇ　　　　約５。
１１．下記のアミノ酸残基組成を有し、イヌ由来であることを特徴とする、請求の範囲第９項に記載のＳＡＰ−６：　　　　　　　タンパク質分子当りのアミノ酸残基　アミノ酸残塁概数Ｃｙｓ　　　　約２Ａｓｘ　　　　約１Ｔｈｒ　　　　約１Ｓｅｒ　　　　約４Ｇｌｘ　　　　約１Ｐｒｏ　　　　約５Ｇｌｙ　　　　約５Ａｌａ　　　　約３Ｖａｌ　　　　約２０Ｍｅｔ　　　　約１〜約２Ｉｌｅ　　　　約６Ｌｅｕ　　　　約１４Ｔｙｒ　　　　約１Ｐｈｅ　　　　約２Ｌｙｓ　　　　約２Ａｒｇ　　　　約２。
１２．下記のアミノ酸残基組成を有し、ウシ由来であることを特徴とする、請求の範囲第９項に記載のＳＡＰ−６：　　　　　　　タンパク質分子当りのアミノ酸残基　アミノ酸残塁概数Ｃｙｓ　　　　約４Ａｓｘ　　　　約３Ｓｅｒ　　　　約１Ｇｌｘ　　　　０〜約１Ｐｒｏ　　　　約５Ｇｌｙ　　　　約５Ａｌａ　　　　約３Ｖａｌ　　　　約２４Ｍｅｔ　　　　約２Ｉｌｅ　　　　約５Ｌｅｕ　　　　約１４Ｐｈｅ　　　　０〜約１Ｌｙｓ　　　　約２Ａｒｇ　　　　約２。
１３．動物組織を粒子分画及び液体分画に分離し、及び、該液体分画から実質的に純粋なＳＡＰ−６を抽出することから成る、動物組織から実質的に純粋なＳＡＰ−６を単離する方法。
１４．前記分離段階が、動物組織を遠心分離にかけて細胞分画及び液体上澄を生成し、液体上澄を遠心分離にかけてＳＡＰ−６を含有するペレット分画を生成し、ペレット分画から有機溶媒によってＳＡＰ−６含有の液体分画を得ることから成る、請求の範囲第１３項に記載の方法。
１５．前記抽出段階が、液体分画を濃縮してＳＡＰ−６含有物質を得、クロロホルム中で該物質を分散させて分散液を形成させ、該クロロホルム分散液をケイ酸カラムにかけ、該ケイ酸カラムを、アルコール及びクロロホルムを含み、このアルコール濃度が各段階的な増加に伴って連続的に０％から１００％まで増加する一連の選択溶媒で段階的増加にて溶出することから成る、請求の範囲第１３項に記載の方法。
１６．前記抽出段階の後に、更に、実質的に純粋なＳＡＰ−６を脱脂して更にそれから脂質を除去する段階を含むことを特徴とする、請求の範囲第１３項に記載の方法。
１７．前記脱脂段階を透析によって実施することを特徴とする、請求の範囲第１６項に記載の方法。
１８．請求の範囲第１３項に記載の方法にしたがって製造された実質的に純粋なＳＡＰ−６。
１９．請求の範囲第１６項に記載の方法にしたがって製造された実質的に純粋なＳＡＰ−６。
２０．更に、実質的に純粋なＳＡＰ−６を透析によって脱脂して更にそれから脂質を除去する段階を含む請求の範囲第１３項に記載の方法にしたがって製造された実質的に純粋なＳＡＰ−６。
２１．実質的に純粋なＳＡＰ−６、脂質及び医薬上許容し得るキャリアから成る、動物の肺胞に於ける正常肺表面張力を維持し又は軽減する医薬組成物であって、前記ＳＡＰ−６及び前記脂質が前記肺胞に於ける正常肺表面張力を雑持し又は軽減するに有効な量で含有されている前記医薬組成物。
２２．ＳＡＰ−６多量体を更に含有する請求の範囲第２１項に記載の医薬組成物。
２３．前記脂質が、合成脂質，天然リン脂質又はそれらの混合物である請求の範囲第２１項に記載の医薬組成物。
２４．前記脂質が、リン脂質，中性脂質，コレステロール，コレステロールエステル及びそれらの混合物，ホスファチジルコリン，二飽和ホスファチジルコリン，ホスファチジルグリセロール，ジパルミトイルホスファチジルコリン，ホスファチジルイノシトール並びにこれらの混合物から成る群から選択される請求の範囲第２１項に記載の医薬組成物。
２５．脂質と混合された単離ＳＡＰ−６を含有する、動物の肺界面活性物質に取って代わる調製物。
２６．更にＳＡＰ−６多量体を含有する請求の範囲第２５項に記載の調製物。
２７．前記脂質が、合成脂質，天然リン脂質又はそれらの混合物である請求の範囲第２５項に記載の調製物。
２８．前記脂質が、リン脂質，中性脂質，コレステロール，コレステロールエステル及ひそれらの混合物，ホスファチジルコリン，二飽和ホスファチジルコリン，ホスファチジルグリセロール，ジパルミトイルホスファチジルコリン，ホスファチジルイノシトール並びにこれらの混合物から成る群から選択される請求の範囲第２５項に記載の調製物。
２９．動物に、正常肺表面張力を維持し又は軽減するに有効量の単離ＳＡＰ−６及び脂質を投与することから成る、動物に於ける肺胞硝子膜症又は肺界面活性物質の不足に関連するその他の症候群の治療又は予防方法。
３０．前記ＳＡＰ−６及び脂質を液体又はエアゾールスプレーとして投与する請求の範囲第２９項に記載の方法。
３１．前記投与段階が更にＳＡＰ−６多量体を含有する請求の範囲第２９項に記載の方法。
３２．ＳＡＰ−６で免疫感作した動物から血清イムノグロブリン成分として得られ、ａ）ＳＡＰ−６含有混合物からのＳＡＰ−６に結合するか、又はこれを沈降させる得る能力；ｂ）ＳＡＰ−６の沈降速度を増大させ得る能力；ｃ）ＳＡＰ−６の溶出特性を変え得る能力；ｄ）試料からＳＡＰ−６を同定し又は定量し得る能力；の性質によって特徴づけられる、免疫学的に活性で特異的な抗ＳＡＰ−６抗体。