PT93178B

PT93178B - Agente proteico anticanceroso

Info

Publication number: PT93178B
Application number: PT93178A
Authority: PT
Inventors: Deborah D Jones; Allen Oliff; Gwynneth M Edwards
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1989-02-17
Filing date: 1990-02-16
Publication date: 1996-04-30
Also published as: CY1987A; DK0383599T3; FI102383B; EP0383599A3; CA2010256C; KR0169729B1; KR900012626A; HK15597A; DE69025211T2; JPH02276590A; EP0383599B1; CA2010256A1; EP0383599A2; IE71934B1; NO300595B1; ES2085329T3; DE69025211D1; JPH07278200A; FI900783A0; FI102383B1

Description

FUNDAMENTO DO INVENTO

A quimioterapia tradicional do cancro baseia-se na capacidade das drogas para matar células temorais em pacientes com cancro. Infelizmente, estas mesmas drogas frequentemente matam células normais do mesmo modo que as células tumurais. 0 grau em que uma droga contra o cancro mata células tumurais relativamente às células normais é uma indicação do grau de selectividade do composto para as células tumorais. Um método para aumentar a selectividade de drogas contra o cancro relativamente às células tumorais é libertar as drogas preferencialmente nas células tumorais evitando ao mesmo tempo as populações de células normais. Um outro termo para libertação selectiva de agentes quimioterapêuticos em populações específicas de células é o direccionamento. O direc cionamento de drogas para células tumorais pode ser conseguido de várias maneiras. Um método baseia-se na presença de moléculas de receptores específicos na superfície das células tumorais. Outras moléculas, referidas como agente de direccionamento podem ser reconhecidas e ligarem-se a estes receptores da superfície celular. Estes agentes de direccionamento in cluem, e.g. anticorpos, factores de crescimento ou hormonas.

Os agentes de direccionamento que reconhecem e se ligam a receptores específicos de superfície celular são referidos como alvejando as células gue possuam aqueles receptores. Por exemplo muitas células tumorais possuem uma proteína na sua superfície designada receptor do factor de crescimento epidérmico. Vários factores de crescimento incluindo o factor de crescimento epidérmico (EGF) e o factor de crescimento transformante-alfa (TGF-alfa) reconhecem e ligam-se ao receptor de EGF nas células tumorais. EGF e TGF-alfa são pois agentes de direccionamento para estas células tumorais.

Os agentes de direccionamento por si so não matam as células tumorais. Outras moléculas incluindo venenos celulares ou toxinas podem ser ligadas a agentes

-3de direccionamento para criar moléculas híbridas que possuem domínios de direccionamento para células tumorais e da toxina celular. Estas moléculas híbridas funcionam como venenos selectivos para células tumorais devido às suas capacidades para alvejar as células tumorais e depois matar estas células através do seu componente toxina. Alguns dos venenos celulares mais potante usados na construção destas moléculas híbridas são toxinas bacterianas que inibem a síntese proteica em células de mamífero. A exotoxina A de Pseudomonas (PE-A) é uma destas toxinas bacterianas e tem sido usada para construir moléculas híbridas direccionador-toxina (Patente U.S. 4.545.985)

A exotoxina A de Pseudomonas intoxica células de mamífero ligando-se primeiro à superfície celular, depois entrando no citoplasma celular e inactivando o factor de alongação 2 que é uma proteína celular necessária à síntese proteica. A exotoxina A de Pseudomonas foi usada para construir moléculas híbridas anticancerosas usando anticorpos monoclonais e hormonas proteicos. No entanto, um problema com estas moléculas híbridas é que elas apresentam toxicidade contra células normais. Pelo menos parte da toxicidade associada às moléculas híbridas contendo exotoxina A de pseudomonas é devido à capacidade da exotoxina A de pseudomonas por si só se ligar e entrar em muitos tipos de células de mamíferos. Portanto, as moléculas híbridas formadas entre a exotoxina A de pseudomonas e agente de direccionamento específicos podem ligar-se a muitas células normais além das células reconhecidas pelo agente de direccionamento. Um método para lidar com este problema é modificar a exotoxina A de pseudomonas de modo a não ter capacidade de ligação a células normais. Isto pode ser conseguido através da remoção da fracção de moléculas da exotoxina A de pseudomonas que é responsável pela sua capacidade de ligação celular. Preparou-se uma forma truncada da molécula de exotoxina A de pseudomonas que retem a capacidade para inactivar o factor de alongação 2 mas que perdeu a capacidade de ligação a células de mamíferos. Esta molécula de exotoxina A de pseudomonas modificada é designadamente exo-4toxina de pseudomonas-40 ou ΡΕ^θ (Hwang et al. , Cell 4 8 : 129-136, 1987).

ΡΕ^θ foi ligada a várias moléculas de direccionamento incluindo TGF-alfa (Chaudhary et al., PNAS USA 84 : 4583-4542 1987). No caso de TGF-alfa, as moléculas híbridas contendo domínios de ΡΕ^θ e de TGF-alfa são capazes de se ligarem especificamente a células tumorais que possuem receptores de EGF e intoxicarem estas células através da inibição da síntese proteica. Para que esta molécula híbrida se ligue eficazmente ao receptor de EGF ela deve assumir a conformação correcta. A ligação eficaz ao receptor também está dependente de ter odomínio de direccionamento correctamente exposto de modo a estar acessível para ligação. Quando moléculas híbridas de TGF-alfa e ΡΕ^θ são produzidas como proteínas de fusão em bactérias usando técnicas de DNA recombinante a maioria das moléculas híbridas apresentam uma fraca actividade de ligação ao receptor de EGF.

1. A Patente U.S. 4.5451985 ensina que a exotoxina A de pseudomonas pode ser conjugada com anticorpos ou com o factor de crescimento epidérmico. A Patente 4.545.985 ensina ainda que estes conjugados podem ser usados para matar células tumorais humanas.

2. A Patente U.S. 4.664.911 ensina gue os anticorpos podem ser conjugados com a cadeia A ou com a cadeia B de rícino que é uma toxina obtida a partir de plantas. A Patente 4.664.911 ainda ensina que estes conjugados podem ser usados para matar células tumorais humanas.

3. A Patente U.S. 4.675.382 ensina que hormonas tais como a hormona estimuladora de melanócitos (MSH) pode ser ligada a uma fracção da proteína da toxina da difteria via ligações peptídicas. A Patente 4.675.382 ensina ainda que os genes que codificam estas proteínas podem ser ligadas uns aos outros para dirigir a síntese de uma proteína de

fusão híbrida usando técnicas de DNA recombinante. Estas proteínas de fusão tem capacidade para se ligar a células que possuem receptores de MSH.

4. Murphy et al. , PNAS USA 83 : 8258-8262 1986, Genetic construction, expression and melanoma-selective-cytotoxicity of a difhtheria toxin-relatid alfha-melanocyte-stimulating hormone fusion protein. Este artigo ensina que uma proteína de fusão híbrida produzida em bactérias usando tecnologia de DNA recombinante e consistindo numa fracção da proteína da toxina da difteria ligada à hormona estimuladora de melanócitos alfa ligar-se-á e matará células de melanoma humano.

5. Kelley et al., PNAS USA 85: 3980-3984 1988, Interleukin 2-diphtheria toxin fusion protein can abolish cell-mediated immunity in vivo. Este artigo ensina que uma proteína de fusão híbrida produzida em bactérias usando tecnologia de DNA recombinante e consistindo numa fracção da proteína da toxina da difteria ligada à interleuquina 2 funciona em ratinhos labro para suprimir a imunidade celular.

6. Allured et al^.ÇNAS USA 83: 1320-1324 1986, Structure of exotoxin A of Pseudomonas aeruginosa et 3.0 Angstrom. Este artigo mostra a estrutura tridimensional da proteína A da exotoxina de pseudomonas.

7. Hwang et al., Cell 48: 129-136,

1987, Functional Domains of Pseudomonas Exotoxin Identified by Deletion Analysis of the Gene Expressed in E. coli. Este artigo ensina que a proteína A de exotocina de pseudomonas pode ser dividida em três domínios funcionais distintos resposáveis por: ligação a células de mamífero, translocação da proteína toxina através das membranas lisossomais e ATP-ribosilação do factor de alongação 2 dentro das células de mamífero. Este artigo ensina ainda que estes domínios funcionais correspondem a regiões distintas da proteína A da exotoxina de pseudomonas.

8. 0 pedido de patente europeia 0.261.671 publicado em 30 de Março de 1988 ensina que uma frac ção da proteína A da exotoxina de pseudomonas pode ser produzida não possuindo a função de ligaçãa às células da proteína A completa da exotoxina de pseudomonas mas tendo as funções de translocação e ATP-ribosilação da proteína A completa da exotoxina de pseudomonas. A fracção da proteína A de exotoxina de pseudomonas que mantém as funções de translocação e ribosilação com ADP da proteína A completa de exotoxina de pseudomonas é designada de aminoácidos 252-613 de proteína A complèta da exotoxina de pseudomonas como definido em Gray et al., PNAS USA 81: 2645-2649, 1984. Este pedido de patente ensina ainda que PE-40 pode ser ligada ao factor de crescimento transforman te -alfa para formar uma proteína híbrida de fusão produzida em bactérias usando técnicas de DNA recombinante.

9. Chaudhary et al., PNAS USA 84: 4538-4542, 1987, Activity of;-a recombinante fusion protein between transforming growth factor type alpha and Pseudomonas exotoxin. Este artigo ensina que as proteínas híbridas de fusão formadas entre PE-40 e o factor de crescimento transformante alfa e produzidas em bactérias usando técnicas de DNA recombinante ligar-se-ão e matarão células tumorais humanas possuidoras de receptores do factor de crescimento epidérmico.

10. Bailon et al., Biotechnology, pág 1326-1329 Nov. 1988. Purification and partial Characterization of an interleukin 2-pseudomonas exotoxin fusion protein. Este artigo ensina que as proteínas híbridas de fusão formadas entre PE-40 e interleuquina 2 e produzidas em bactérias usaando técnicas de DNA recombinante ligar-se-ão e matarão linhas de células humanas possuidoras de receptores de interleuquina .

OBJECTIVOS DO INVENTO

Constitui um objectivo do presente invento proporcionar modificações de ΡΕ₄θ que permitam ligação eficaz de moléculas híbridas formadas entre agentes de direccionamento e moléculas de ΡΕ₄θ modificadas a receptores celulares que reconheçam o agente de direccionamento. Constitui um outro objectivo deste invento proporcionar um método para a recuperação das proteínas híbridas produzidas entre agentes de direccionamento e ΡΕ₄θ modificada como proteínas de fusão em bactérias. Um outro objectivo do presente invento, é proporcionar uma proteína híbrida (ou de fusão) tendo um domínio (ou região) de ligação ao receptor celular e um domínio (ou região) de ΡΕ₄θ em que o domínio de ΡΕ^θ foi modificado para melhorar a ligação da proteína híbrida ao receptor do fac tor de crescimento epidérmico ou ao receptor ligado pelo agente de direccionamento ligado à ΡΕ^θ modificada. Um outro objec tivo é proporcionar uma proteína híbrida que seja mais fácilmente purificada. Estes e outros objectivos do presente invento serão óbvios a partir da descrição que se segue.

SUMÁRIO DO INVENTO

O presente invento proporciona uma molécula híbrida compreendendo um domínio de ΡΕ₄θ modifica do ligado a um domínio de proteína para direccionamento. O domínio de PE₄₀ modificado melhora a aetividade de ligação a receptores desta molécula híbrida. A substituição de outras aminoácidos tais como, e.g., resíduos de cisteína por alanina em PE₄₀ ou eliminação de resíduos de cisteína, melhora a ligação da molécula híbrida aos receptores recombinantes pelo domínio

de direccionamento. As moléculas híbridas do presente invento ligam-se mais eficazmente aos receptores alvejados em células de tumores humanos do que às moléculas híbridas tendo ΡΕ^θ não modif içado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

As moléculas híbridas formadas entre TGF-alfa e ΡΕ^θ são caracterizadas em três sistemas de ensaio principais. Estes ensaios incluem: 1-ADP-ribosilação do factor de alongação 2 que mede a actividade enzimática de TGF-alfa-ΡΕ^θ que inibe a síntese proteica em células de mamíferos, 2-inibição da ligação de EGF marcado radioactivamente ao receptor de EGF nas vesículas membranares de células A431 o qual mede a actividade de ligação ao receptor de EGF de TGF-alfa-ΡΕ^θ e 3-proliferação de células conforme testado pela conversão de brometo de 3-£4,5-dimetiltiazol-2-il7-2,5-difeniltetrazólio (MTT) em formazn que é usado para medir a sobrevivência de células tumorais após exposição a TGF-alfa-ΡΕ^θ.

Estes ensaios são efectuados como descrito anteriormente (Dominic et al. , Infection and Immunity 16: 832-841, 1977, Cohen et al., J. Biol. Chem. 257. 1523-1531, 1982, Riemen et al., Peptides 8g 877-885, 1987, Mosmann J. Immunol. Methods 65: 55-63, 1983).

Para criar novas moléculas híbridas de TGF-alfa-ΡΕ^θ com melhores caracteristicas de ligação a receptores produzimos primeiro uma série de moléculas de DNA recombinante que codificavam TGF-alfa-ΡΕ^θ ou versões especificamente modificadas de TGF-alfa-ΡΕ^θ. O gene original ou parenteral de TGF-alfa-ΡΕ^θ foi clonado num vector de expressão plasmídeo bacteriano TAC (pTAC TGF57-PE40) usando segmentos

distintos de DNA clonado como descrito no Exemplo 2. 0 clone de DNA pTAC TGF 57-Ρθ^θ foi usado como reagente de partida para a construção de versões especificamente modificadas de DNA de TGF-alfa-ΡΕ^θ. As modificações específicas do DNA de pTAC TGF 57-ΡΕ^θ envolvem mutações específicas de sítio na sequência codificadora do DNA necessário para substituir dois ou quatro dos codões císteina dentro do domínio de ΡΕ₄θ do DNA de pTAC TGF57-PE^g com codões para ou outros aminoácidos. Como alternativa, as mutações específicas de sítio podem ser programadas para eliminar dois ou quatro codões císteina dentro do domínio . As mutações específicas do sítio no foram construídas usando os métodos de

ΡΕ_4θ de pTAC TGF57-PE₄₀

DNA de pTAC TGF57-PE_4QWinter et al., Nature 299: 756-758 1982. No Exemplo 3 estão apresentados exemplos específicos de DNAs mutagenizados de pTAC TGF57-PE₄q. A sequência de aminoácidos da proteína híbrida codificada pelo DNA de pTAC TFG57-PE₄q está apresentada na Figura 3. Os quatros resíduos de císteina no domínio PE.„ da proteína híbrida parental TGF-alfa-PE₄g são designados Cis^z ,

287

72 3 79

Cis”', Cis e Cis . (Figura 3). Os resíduos de aminoácidos são numerados como definido em Gray et al . , PNAS USA 81: 2645-2649 (1984). As proteínas híbridas modificadas TGF-alfa-PE„„ geradas a partir do DNA de pTAC TGF57-PE._n especificamente mu40

265 tagenizado contêm substituições ou deleções dos resíduos /Cis'

287- _ . 372 379_{7 rr},. 265 287 „. 372 e Cis J ou /Cis e Cis J ou /Cis , Cis , Cis e

79

Cis ] . Para simplificar a nomenclatura na descrição das proteínas híbridas modificadas produzidas a partir destes DNAs de pTAC TGF57-PE₄q mutagenizados designámos os resíduos de aminoácidos nas posições 265 e 287 como o locus A e os resíduos nas posições 372 e 379 como o locus B. Quando as cisteínas estão presentes nos resíduos de aminoácidos 265 e 287 tal como na molécula híbrida parental de TGF-alfa-PE₄g, o locus é designado por maiúsculas (i.e.

Quando as cisteínas são substituídas com outras aminoácidos tais como por exemplo, alanina, fenilalanina, valina, leucina ou isoleucina ou eliminadas dos resíduos 265 e 287 o locus é representado por uma letra pequena a. De modo semelhante, se o resíduo de aminoácido nas posições 372 e 379 fôr císteina o locus é representado por uma

-10letra maiúscula B enquanto uma letra pequena b representa este locus quando com os resíduos de aminoácidos nas posições 372 e 379 são substituídos com outros aminoácidos ou eliminados. Assim, quando os quatro resíduos de cisteína no domínio ΡΕ^θ de TGF-alfa-PE^g são substituídos com alaninas a proteína híbrida modificada é designada TGF-alfa-ΡΕ^θ ab. De modo semelhante a proteína híbrida parental TGF-alfa-ΡΕ^θ com cisteínas nas posições de resíduos de aminoácidos 265, 287, 372 e 379 pode ser designada TGF-alfa-ΡΕ^θ AB.

A proteína híbrida TGF-alfa-PE^g AB e as proteínas híbridas modificadas TGF-alfa-PE^g são produzidas em E. coli usando o sistema vector de expressão TAC descrito por Linemayer et al . , Bio-Technology 5_: 960-965 1987. As proteínas híbridas recombinantes produzidos nestas bactérias são colhidas e purificadas através da lise das bactérias em hidrocloreto de guanidina seguido da adição de sulfato de sódio e tetrationato de sódio. Esta mistura de reacção é subsequentemente dialisada e adicionada ureia para solubilizar as proteínas que precipitaram na solução. A mistura é em seguida centrifugada para remover proteínas insolúveis e as proteínas TGF-alfa-PE^g híbridas recombinante são separadas usando cromatografia de permuta iónica seguido de cromatografia de exclusão por tamanho, seguido novamente de cromatografia de permuta iónica. As proteínas híbridas TGF-alfa-PE^g purificadas são em seguida expostas a agentes redutores tais como beta-mercaptoetanol de modo a permitir que se formem partes dissulfureto dentro da proteína híbrida entre pares de resíduos císteina: Finalmente, as proteínas híbridas reenroladas são sujeitas a cromatografia de exclusão por tamanho e a cromatografia de permuta iónica para isolar a proteína TGF-alfa-PE^g altamente pura. Os detalhes precisos deste esquema de purificação estão descritos no Exemplo 2. Uma vez purificada e reenrolada a actividade biológica desta proteínas híbridas pode ser caracterizada usando ensaios de ADP-ribosilação ligação ao receptor de EGF e de proliferação celular como descrito atrás.

-11Uma utilidade importante de TGF-alfa-ΡΕ^θ baseia-se na sua capacidade para se ligar e matar células possuidoras de receptores EGF. Muitas células tumorais humanas possuem receptores EGF e são portanto susceptiveis aos efeitos de morte celular de TGF-alfa-ΡΕ^θ. Outras células humanas não cancerosas incluindo queratinócitos possuem receptores EGF e são também susceptiveis à actividade de morte celular de TGF-alfa-ΡΕ^θ. Várias doenças humanas são caracterizadas por um aumento de proliferação de queratinócitos incluindo psoríase e verrugas.

Os exemplos que se seguem ilustram o presente invento sem, no entanto, o limitar. Todas as reacções enzimáticas necessárias às manipulações de biologia molecular, a menos que de outro modo seja especificado, foram efectuadas como descrito em Maniatis et al (1982) Em: Molecular Clonig: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press.

EXEMPLO 1

Produção e isolamento de proteínas de fusão recombinantes TGF-alfa-PE . _n40

Produção da proteína de fusão

Células de E. coli JM-109 transformadas foram cultivadas em frascos de agitação de 1 1 em 500 ml de LB-Broth na presença de 100 jjg/ml de ampicilina a 37°C. Após atingido o valor de absorção da espectofotométrica Αθθθ de 0,6 adicionou-se B-D-tio-galactopiranosido para uma concentra-12ção final de 1 mM. Após 2 horas as células foram colhidas por centrifugação.

S-sulfonação da proteína de fusão

As células foram lisadas em hidrocloreto de guanidina 8M, 50mM Tris pH 8,0, lmM EDTA foi agitado à temperatura ambiente durante 2 horas. A mistura de lise foi levada até sulfito de sódio 0,4M e tetrationato de sódio O,1M pela adição de reagentes sólidos e o pH foi ajustado a 9,0 com 1M NaOH. Deixou-se a reacção prosseguir à temperatura ambiente durante 16 horas.

Preparação para cromatografia

A solução de proteína foi dialisada contra um excesso de volume de 10000 vezes de lmM EDTA a 4SC. A mistura foi então levada até ureia 6M, 50mM Tris pH 8,0, 50mM NaCl à temperatura ambiente e agitada durante 2 horas. O material não dissolvido foi removido por centrifugação a 32000 x g durante 30 minutos.

Cromatografia em DEAE F.F. Sepharose

O sobrenadante clarificado do passo anterior foi aplicado numa coluna de DEAE Fast Flow de 26 x 40 cm (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) equilibrada com ureia 6M , 50mM Tris pH 8,0, 50mM NaCl a um fluxo de 1 ml/minuto. A coluna foi lavada com tampão de equilíbrio até os materiais não absorvidos serem removidos conforme evidenciado por uma absorvância espectrofotométrica de UV 280 abaixo de 0,1 no tam-13pão de equilibrio tal como sai da coluna. A proteína de fusão adsorvida foi eluida da coluna com um gradiente de 1000 ml de 50-350 mM NaCl e depois concentrada numa concentração Amicon de célula com agitação a que se adapta uma membrana YM-30.

Sephacryl S-300

A proteína de fusão concentrada (8 ml) foi aplicada numa coluna de Sephacryl S-300 de 2,6 x

100 cm (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) equilibrada com ureia

6M, 50 mM Tris pH 8,0, 50mM NaCl a um fluxo de 0,25 ml/minuto.

A coluna foi eluida com mais tampão de equilibrio e colheram-se fracções de 3 ml. Reuniram-se fracções contendo actividade de TGF-alfa-PE._n.

Cromatografia em Q-sepharose

As fracções reunidas da coluna

S-300 foram aplicadas numa coluna de Q-sepharose de 1,6 x 40 cm (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.) equilibrada com ureia 6M, 50mM Tris pH 8,0, 50mM NaCl a um fluxo de 0,7 ml/minuto. A coluna foi lavada com o tampão de equilibrio e depois eluida com um gradiente de 600 ml de 50-450mM NaCl. As fracções contendo a actividade de TGF-alfa-ΡΕ^θ foram reunidas e depois dialisadas contra 50mM glicina pH 9,0 e guardadas a -20°C.

Reenrolamento

Descongelou-se uma amostra de proteína e diluiu-se para uma absorvância espectofotométrica a UV ^Α280⁼θΊ ^em SOmM glicina pH 10,5. Adicionaram-se beta-mercapto-

etanol para dar uma proporção molar de 4:1 relativamente ao número teórico de grupos S-sulfonato presentes na amostra de proteína. A reacção decorreu durante 16 horas a 42C após o que a solução foi dialisada contra um excesso de 10000 vezes de tampão fisiológico e guardado a -20°C.

EXEMPLO 2

Construção de clones de DNA recombinante contendo DNA de TGF-alfa-PE_4Q

O segmento de DNA de TGF-alfa foi construído usando três séries de oligonucleotídeos sintéticos como descrito por Defeo-jones et al., Molecular and Cellular Biology 8_: 2999-3007 1988. Este gene sintético de TGF-alfa foi clonado em pUC-19. O DNA do clone pUC-19 contendo TGF-alfa humano recombinante foi digerido com Sphl e Eco RI. A digestão deu origem a um fragmento de DNA de 2,8 kb contendo todo o p(JC-19 e a fracção 51 de TGF-alfa. 0 fragmento de 2,8 kb foi purificado e isolado por electroforese em gel. Sintetizou-se uma cassete oligonucleotídica Eco RI a Sph I. Esta cassete sintética tinha a sequência indicada abaixo:

5'-CGGACCTCCTGGCTGCGCATCTAGG-3'

3'-GTACGCCTGGAGGACCGACGCGTAGATCCTTAA-5'

Por conveniência, esta cassete oligonucleotídica foi designada 57. A cassete 57 foi emparelhada e ligada ao fragmento de 2,8 kb contendo TGF-alfa formando um plasmídeo circularizado. Os clones que continham a cassete foram identificados por hibridação com DNA da cassete 57 marcado radioactivamente. A presença de TGF-alfa humana foi confirmada por sequênsiação de DNA. A sequênciação também confirmou a presença de um sítio Fsp I introduzido de novo no extremo 3' da sequência de TGF-alfa. Este plasmídeo, designado TGF-alfa-57/pUC-19 foi digerido com Hind III e Fsp I que deu origem a um fragmento de 168 pb contendo o gene TGF-alfa (TGF-alfa-57). Uma preparação separada de pUC-19 foi digerida com Hind III e Eco RI dando origem a um DNA vector pUC-19 de 2,68 kb. 0 DNA de ΡΕ^θ foi isolado a partir do plasmídeo pUC 8 (Chandhary et al. , PNAS USA 84: 4538-4542 1987). pUC8 foi digerido usaando Nde I. Gerou-se então um extremo cerse neste DNA usando as condições convencionais da reacção Klenow (Maniatis et al., supra p. 113). 0 DNA extremos cerses foi então sujeito a uma segunda digestão com Eco RI para gerar um fragmento de 1,3 kb Eco RI-Nde I (extremo cerse) contendo ΡΕ^θ. 0 fragmento Hind III-Fsp I (168 pb) contendo TGF-alfa-57 foi ligado ao vector pUC-19 de 2,68 kb. Após incubação durante a noite, o fragmento de DNA Eco RI-Nde I (extremo cerse) de 1,3 kb foi adicionado à mis tura de ligação. A segunda ligação decorreu durante a noite. 0 produto da reacção de ligação foi então usado para transformar células JM 109. Os clones contendo TGF-alfa-57 ΡΕ^θ em pUC-19 foram identificados por hibridação com DNA de TGF-alfa-57 ΡΕ^θ marcado radioactivamente e o DNA deste clone foi isolado. O TGF-alfa-57 ΡΕ^θ foi removido do vector pUC-19 e transferido para um sistema vector TAC descrito por Linemeyer et al., Bio-Technnology 5_: 960-965 1987). O TGF-alfa-57 ΡΕ^θ em pUC-19 foi digerido com Hind III e Eco RI para gerar um fragmento de 1,5 kb contendo TGF-alfa-57 ΡΕ^θ. Gerou-se um extremo cerse neste fragmento de DNA usando condições convencionais de reacção com Klenow (Maniatis et al., loc. cit.). O vector TAC foi digerido com Hind III e Eco RI. Gerou-se um extremo cerse no DNA vector TAC digerido usando condições convencionais de reac-16-

ção com Klenow (Maniatis et al., loc. cit.). 0 vector de 2,7 kb com extremos cerses foi isolado usando electroforese em gel. 0 fragmento com extremos cerses contendo TGF-alfa-57 ΡΕ^θ foi então ligado ao vector TAC com extremos cerses. O plasmídeo gerado por esta ligação foi usado para transformar células JM 109. Os clones candidatos contendo TGF-alfa-57 ΡΕ^θ foram identificados por hibridação conforme indicado atrás e sequenciados. 0 clone contendo a construção pretendida foi designada pTAC TGF57ΡΕ^θ. O plasmídeo gerado por estas manipulações está descrito na Tabela 1. A sequência de nucleotídeos dos codões de aminoácidos da proteína de fusão TGF-alfa-ΡΕ^θ codificada no DNA de pTAC TGF-57-ΡΕ^θ está descrito na Tabela 2. A sequência de aminoácidos codificada pelo gene TGF-57-ΡΕ^θ está apresentada na Tabela 3.

EXEMPLO 3

Construção de versões modificadas de clones de DNA contendo TGF-alfa-PE^g recombinante:

Substituição de cisteína por alaninas

TGF-alfa-ΡΕ^θ aBc

O clone pTAC TGF57-PE^g foi digerido com Sph I e Bam HI e isolado o fragmento Sph I-Bam HI de 750 pb (especificando os 5 aminoácidos C-terminais de TGF-alfa e os 243 aminoácidos N-terminais de ΡΕ^θ) . O DNA vector M13 mpl9 foi cortado com Sph I e Bam HI e isolado o DNA vector. O fragmento Sphl-BamHI de TGF-alfa-ΡΕ^θ de 750 pb foi ligado ao DNA vector MB durante a noite a 15°C. As células hospedeiras bacterianas foram transformadas com esta mistura de ligação.

clones candidatos foram isolados e o seu DNA de plasmídeo foi sequênciado para assegurar que estes clones continham os DNAs recombinante adequados. Preparou-se DNA de cadeia simples para mutagênese.

Sintetizou-se um oligonucleotídeo e usou-se na mutagênese dirigida para introduzir um sítio Hpa I no DNA de TGF-alfa-ΡΕ^θ na posição do aminoácido 272 de ΡΕ^θ:

5' CTGGAGACGTTAACCCGTC 3' (oligo $ 132)

Uma consequência desta mutagênese dirigida foi a conversão do resíduo número 272 em ΡΕ^θ de fenilalanina para leucina. A mutagenese foi efectuada como descrito por Winter et al., Nature, 299: 756-758 1982.

Um clone candidato contendo o sítio Hpal criado de novo foi isolado e sequenciado para confirmar a presença de sequência genética mutagenizada. Este clone foi então cortado com Sphl e Sall. Um fragmento de 210 pb especif icamente os 5 aminoácidos C-terminais de TGF-alfa e os 70 aminoácidos N-terminais de ΡΕ^θ e contendo o sítio Hpal recentemente introduzido foi isolado e subclonado de novo no plasmídeo parental pTAC TGF57-PE^g nos sítios Sphl-Sall. As células hospedeiras bacterianas foram transformadas, um clone candidato foi isolado e o seu DNA de plasmídeo foi sequeciado para assegurar que este clone continha o DNA recombinante correto. Por conveniência este clone foi designado pTAC TGF57-PE^q-132. pTAC TGF57-PE^q-132 foi digerido com Sphl e Hpal e isolado um fragmento de DNA de 3,96 kb. Uma cassete oligonucleotídica sintética (oligo $153) abrangendo os 5 aminoácidos C-terminais de TGF-alfa e os 32 aminoácidos N-terminais de ΡΕ^θ e contendo extremos compatíveis Sphl e Hpal foi sintetizado e ligada ao pTAC TGF57-PE₄₀-132 digerido:

5' CGGACCTCCTGGCCATGGCCGAAGAGGGCGGCAGCCTGGCCGCGCTGACCGCGCA

3’ GTACGCCTGGAGGACCGGTACCGGCTTCTCCCGCCGTCGGACCGGCGCGACTGGCGCGT

CCAGGCTGCACACCTGCCGCTGGAGACGTT 3'

GGTCCGACGTGTGGACGGCGACCTCTGCAA 5' (olígo #153)

Esta cassete oligonucleotídica incorporou uma alteração no DNA de TGF-alfa-ΡΕ^θ de tal forma gue o codão especificando císteina no resíduo 265 passou a especificar alanina. Por conveniência este DNA de plasmídeo foi designado pTAC TGF57-PE^θ-132, 153. Células hospedeiras bacterianas foram transformadas com DNA de pTAC TGF57-ΡΕ^θ-132, 153. Os clones candidatos foram identificados por hibridação, isolados e o seu DNA de plasmídeo foi seguênciado para assegurar gue continha o DNA recombinante adeguado.

O DNA de pTAC TGF57-PE_4Q-132, 153 foi digerido com Hpal e Sall e isolado um DNA vector de 3,95 kb. Uma cassete oligonucleotídica sintética (oligo =142) abrangendo os resíduos de aminoácidos 272 a 309 de ΡΕ₄θ e contendo extremos compatíveis Hpal e Sall foi sintetizado e ligada ao DNA de pTAC TGF/ΡΕ^θ 132, 153 de 3,95 kb

-195' AACCCGTCATCGCCAGCCGCGCGGCTGGGAACAACTGGAGCAGGCTGGCTATCCGGTGC

3’ TTGGGCAGTAGCGGTCGGCGCGCCGACCCTTGTTGACCTCGTCCGACCGATAGGCCACG

AGCGGCTGGTCGCCCTCTACCTGGCGGCGCGGCTGTCGTGGAACCAGG 3¹

TCGCCGACCAGCGGGAGATGGACCGCCGCGCCGACAGCACCTTGGTCCAGCT 5’ (oligo #1«)

Esta cassete oligonucleotídica altera o codão que específica cisteina no resíduo 287 de tal modo que este codão passou a especificar alanina. Por conveniência este DNA de plasmídeo mutagenizado foi designado pTAC TGF57-PE40-132, 153, 142. As células hospedeiras bacterianas foram transformadas com este plasmídeo e os clones candidatos foram identificados por hibridação. Estes clones isolados e o seu DNA de plasmídeo foi sequênciado para assegurar que continha o DNA recombinante correcto. 0 plasmídeo pTAC TGF57-ΡΕ^θ-132,

153, 142 codifica a variante TGF-alfa-ΡΕ^θ com ambas as cisternas no locus A substituídos por alaninas. Portanto, seguindo a nomenclatura descrito anteriormente esta versão modificada de TGF-alfa-PE^g foi designada TGF-alfa-ΡΕ^θ aB. A sequência de aminoácidos codificada pelo gene TGF-alfa-PE^g aB está apresentada na Tabela 4.

TGF-alfa-PE._n Ab:

O clone pTAC TGF57-PE^g foi digerido com Sphl e BamHI e o fragmento Sphl-BamHI de 750 pb (es-20pecificando os 5 aminoácidos C-terminais de TGF-alfa e os 252 aminoácidos N-terminais de ΡΕ^θ) foi isolado. O DNA vector M13 mp 19 foi cortado com Sphl e BamHl e isolado o DNA vector. O fragmento Sphl-BamHI de 750 pb de TGF-alfa-ΡΕ^θ foi ligado ao DNA do vector M13 durante a noite a 15SC. Células haspodeiras bacterianas foram transformadas com esta mistura de ligação, os clones candidatos foram isolados e o seu DNA de plasmídeo foi sequenciado para assegurar que estes clones continham os DNAs recombinante correctos. Preparou-se DNA de cadeia simples para mutagénese.

Sintetizou-se um oligonucleotídeo (oligo #133) e usou-se um mutagénese dirigida para introduzir um sítio BstII no DNA de TGF-alfa-ΡΕ^θ na posição do aminoácido 369 de PE. ·

5' GACGTGGTGACCCTGAC 3' (oligo #133)

Uma consequência desta mutagénese foi a conversão do resíduo serina na posição 369 de ΡΕ^θ numa treonina.

Um clone de DNA contendo o sítio BstII criado de novo foi identificado, isolado e sequenciado para assegurar a presença do DNA recombinante correcto. Este clone foi em seguida digerido com as enzimas de restrição Apal e Sall. Isolou-se um fragmento de DNA inserção de 120 pb contendo o sítio BstelI criado de novo e ligou-se a pTAC TGF57-PE^ que também tinha sido digerido com AspI e Sall. Células hospedeiras bacterianas foram transformadas e um clone candidato foi isolado e sequenciado para assegurar que o DNA recombinante correcto estava presente. Este DNA de plasmídeo recentemente criado foi designado pTAC TGF57-PE_4Q-133. Ele foi digerido com BstelI e Apal e o fragmento de DNA vector de 2,65 kb foi isolado.

-21Uma cassete oligonucleotídica Bste II-Apal (oligo #155) foi sintetizada abrangendo a região de TGF-alfa-PE^Q eliminado do clone pTAC TGF57-PE^q-133 digerido com as enzimas de restrição BstelI e Apal. Esta cassete também especificou a sequência de nucleotídeos para os extremos compatíveis BstelI e Apal.

5' GTGACCCTGACCGCGCCGGTCGCCGCCGGTGAAGCTGCGGGCC 3'

3’ GGACTGGCGCGGCCAGCGGCGGCCACTTCGACGC 5' (oligo #155)

Esta cassete oligonucleotídica mudou os codões das cisteínas nos resíduos 372ie 379 de ΡΕ.„ para codões especificadores de alaminas. A cassete oligonucleotídica #155 foi ligada ao fragmento de DNA vector de 2,65 kb. Células hospedeiras bacterianas foram transformadas e os clones candidatos foram isolados e sequenciados para assegurar que o DNA recombinante correcto estava presente. Este clone de DNA criado de novo foi designado pTAC TGF57-PE₄g-133, 155. Ele codifica a variante TGF-alfa-PE^g com ambas as cisteínas no locus B substituído por alaninas. Portanto, seguido a nomenclatura descrita anteriormente esta versão modificada de TGF-alfa-PE^g é designada TGF-alfa-PE^g Ab. A sequência de aminoácidos codificada pelo gene TGF-alfa-PE^g Ab está apresentada na Tabela 5.

TGF-alfa-PE_4Q ab:

O plasmídeo pTAC-TGF57-PE_4Q-132, 153, 142 codificador de TGF-alfa-PE₄g aB foi digerido com Sall e Apal e isolado o fragmento de DNA vector resultante de 3,8 kb. O plasmídeo pTAC-TGF57-PE₄g-133, 155 codificador de TGF-22-alfa-PE^Q Ab foi também digerido com Sall e Apal e isolado o fragmento de DNA resultante de 140 pb contendo alterações de cisteina para alamina nos resíduos de aminoácidos 372 e 379 de PE_4Q. Estes dois DNAs foram ligados um ao outro e usados para transformar células hospedeiras bacterianas. Os clones candidatos foram identificados por hibridação com um DNA de 140 pb marcado radioactivamente derivado de TGF57-PE₄g-133 , 155. O DNA de plasmídeo dos clones candidatos foi isolado e sequênciado para assegurar a presença do DNA recombinante correcto. Esté clone de DNA criado de novo foi designado pTAC TGF57-PE₄g-132, 153, 142, 133, 155. Este plasmídeo codifica a variante de TGF-alfa-PE^g com as quatro cisteínas nos loci A e B substituídos por alaminas. Portanto, seguindo a nomenclatura descrita anteriormente esta versão modificada de TGF-alfa-PE„„ 40 é designada TGF-alfa-PE^g ab. A sequência de aminoácidos codificada pelo gene TGF-alfa-PE^g está apresentada na Tabela 6.

EXEMPLO 4

Construção de versões modificadas de clones de DNA contendo TGF-alfa-PE^g recombinante. Selecção de resíduos cisteina

TGF-alfa-PE._ aB, TGF-alfa-PE . _n40 ' 40

Ab e TGF-alfa-PE^Q ab podem também ser construídos por remoção dos resíduos císteinas no locus A e/ou B. A construção destas versões de TGF-alfa-PE^g é conseguida de modo idêntico ao descrito no Exemplo 3 exceptuando: para TGF-alfa-PE^g aB a cassete oligonucleotídica 153 é mudada de tal forma que o codão alenina destinado à posição 265 é eliminado e a cassete oligonucleotídica 142 é alterada de modo que o codão alanima destinado à posição 287 é eliminado. Para TGF-alfa-PE^g Ab a cassete

-23oligonucleotídica 155 é mudada de tal modo que os codões alani na destinados aos resíduos 372 e 379 são eliminados. Para TGF-alfa-PE^Q ab os fragmentos de DNA usados para construir este gene recombinante são retirados do gene TGF-alfa-ΡΕ^θ aB e TGF

-alfa-PE._n Ab descrito neste exemplo.

EXEMPLO 5

Actividades biológicas das proteínas TGF-alfa-ΡΕ^θ AB, TGF-alf

-PE,„ Ab, TGF-alfa-PE._n aA e TGF—alfa—PE._n ab 40 '40 40

As proteínas híbridas de fusão

TGF-alfa-PE_4Q AB, TGF-alfa-PE_4θ Ab, TGF-alfa-PE_4Q aB, TGF-alfa -ΡΕ₄θ ab foram expressas em hospedeiros bacterianos e isolados como descrito no Exemplo 1. Cada uma das proteínas foi então caracterizada quanto à sua capacidade para inibir a ligação do factor de crescimento epidérmico marcado radioactivamente ao receptor do factor de crescimento epidérmico nas vesículas mem branares de células A431 e quanto à sua capacidade para matar células A43 conforme medido em ensaios de proliferação celular com MTT descritos anteriormente. A tabela que se segue as actividades biológicas destas proteínas:

resume

LIGAÇAO AO RECEPTOR DO MORTE DAS

FACTOR DE CRESCIMENTO CÉLULAS A431

EPIDÉRMICO

EC₅₀ pM

TGF-alfa-PE_4Q	AB	346	47
TGF-alfa-PE_4Q	Ab	588	25
TGF-alfa-PE_4Q	aB	27	151
TGF-alfa-PE.„ 40	ab	60	392

EXEMPLO 6

Substituição do domínio TGF alfa de TGF-alfa-ΡΕ^θ ab por outros agentes de direccionamento que se ligam ao receptor do factor de crescimento epidérmico.

A utilidade de TGF-alfa-PE._n ba40 seia-se na sua capacidade para se ligar e matar células possuidoras de receptores do factor de crescimento epidérmico. Outros agentes de direccionamento podem ser usados para criar moléculas híbridos com ΡΕ₄θ do presente invento que se ligarão aos receptores de EGF. Por exemplo, os genes do factor de crescimento epidérmico ou urogastrona ou o factor de crescimento do vírus do fibroma de Shope ou o factor de crescimento do vírus da vacina podem ser ligados ao gene de ΡΕ₄θ e usados para dirigir a síntese de proteínas híbridas de fusão do factor de crescimento epidérmico-PE^Q ou urogastrona -ΡΕ^θ, ou factor de crescimento do vírus do fibrom de Shope-PE^g ou factor de crescimento do vírus da vacina-PE

No entanto, em cada caso uma

40' ί

ou mais das modificações de ΡΕ^θ aqui descrita melhora a ligação destas proteínas de fusão híbridas a células possuidoras de receptores do factor de crescimento epidérmico.

EXEMPLO 7

Substituição do domínio TGF-alfa do TGF-alfa-ΡΕ^θ por outros agentes direccionamento que se liguem a outros receptores nas células de mamíferos

Deve ser entendido que este invento é dirigido para a modificação do domínio ΡΕ^θ de proteínas híbridas de fusão entre ΡΕ^θ e outros agentes de direccionamento que reconhecem receptores específicos em células de mamíferos. Por exemplo, as proteínas de fusão formadas entre proteínas e PE^q modificada do presente invento da fórmula geral: proteína Χ-ΡΕ^θ onde a proteína X é interleuquina-2; interleuquina-3, interleuquina-4, interleuquina-6 ou factor de crescimento derivado de plaquetas ou a qualquer outra proteína que reconheca e se ligue a um receptor específicos de células de mamíferos melhorou as propriedades de ligação aos receptores celulares.

-26EXEMPLO 8

Aetividade biológica de TGF-alfa-ΡΕ^θ ab contra queratinócitos humanos

Usando o ensaio de proliferação celular de Mossman, J. Immunol. Methods 65: 55-63 (1983), TGF-Alfa-ΡΕ^θ ab fácilmente matou os queratinócitos humanos usados no ensaio. A concentração de TGF-alfa-PE₄g necessária para matar 50% dos queratinócitos (Εϋ^θ) foi de llmM.

-26aTABELA 1

Ampr

ZecorA kHindlIiy

PE40 (NDEI ZFSPl)

fHindIIlA

VECORlJ (BAM Hl)

TABELA 2

ATGGCTGCAGCAGTGGTGTCCCATTTTAATGACTGCCCAGATTCCCACACTCAGTTCTGCTTCCATGGAACATGCAGG

TTTTTGGTGCAGGAGGACAAGCCGGCATGTGTCTGCCATTCTGGGTACGTTGGTGCGCGCTGTGAGCATGCGGACCTC

CTGGCTGCTATGGCCGAAGAGGGCGGCAGCCTGGCCGCGCTGACCGCGCACCAGGCTTGCCACCTGCCGCTGGAGACT

TTCACCCGTCATCGCCAGCCGCGCGGCTGGGAACAACTGGAGCAGTGCGGCTATCCGGTGCAGCGGCTGGTCGCCCTC

TACCTGGCGGCGCGGCTGTCGTGGAACCAGGTCGACCAGGTGATCCGCAACGCCCTGGCCAGCCCCGGCAGCGGCGGC

GACCTGGGCGAAGCGATCCGCGAGCAGCCGGAGCAGGCCCTGGCCCTGACCCTGGCCGCCGCCGAGAGCGAGCGCTTC

GTCCGGCAGGGCACCGGCAACGACGAGGCCGGCGCGGCCAACGCCGACGTGGTGAGCCTGACCTGCCCGGTCGCCGCC

GGTGAATGCGCGGGCCCGGCGGACAGCGGCGACGCCCTGCTGGAGCGCAACTATCCCACTGGCGCGGAGTTCCTCGGC

GACGGCGGCGACGTCAGCTTCAGCACCCGCGGCACGCAGAACTGGACGGTGGAGCGGCTGCTCCAGGCGCACCGCCAA

CTGGAGGAGCGCGGCTATGTGTTCGTCGGCTACCACGGCACCTTCCTCGAAGCGGCGCAAAGCATCGTCTTCGGCGGG gtgcgcgcgcgcagccaggacctcgacgcgatctggcgcggtttctatatcgccggcgatccggcgctggcctacggc tacgcccaggaccaggaacccgacgcacgcggccggatccgcaacggtgccctgctgcgggtctatgtgccgcgctcg agcctgccgggcttctaccgcaccagcctgaccctggccgcgccggaggcggcgggcgaggtcgaacggctgatcggc catccgctgccgctgcgcctggacgcatcaccggccccgaggaggaaggcgggcgcctggagaccattctcggctgg ccgctggccgagcgcaccgtggtgattccctcggcgatccccaccgacccgcgcaacgtcggcggcgacctcgacccg tccagcatccccgacaaggaacaggcgatcagcgccctgccggactacgccagccagcccggcaaaccgccgcgcgag

GACCTGAAGTAA

TABELA 3

	Sequência	de	aminoácidos de TGF-alfa-PE^	0
-4 -3	-2 -1'TGFa’		6	16
Met Ala	Ala Ala ¹ Vai Vai	Ser	His Phe Asn Asp Cys Pro Asp Ser His Thr 26	Gln Phe Cys 36
Phe His	Gly Thr Cys Arg	Phe	Leu Vai Gln Glu Asp Lys Pro Ala Cys Vai 46 TGFa⁵⁰'	Cys His Ser 'PE²⁵²
Gly Tyr	Vai Gly Ala Arg	Cys	Glu His Ala Asp Leu Leu Ala'Ala Met Ala 263	Glu'Glu Gly 273
Gly Ser	Leu Ala Ala Leu	Thr	Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu 283	Thr Phe Thr 293
Arg His	Arg Gln Pro Arg	Gly	Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro 303	Vai Gln Arg 313
Leu Vai	Ala Leu Tyr Leu	Ala	Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Vai Asp Gln 323	Vai Ile Arg 333
Asn Ala	Leu Ala Ser Pro	Gly	Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg 343	Glu Gln. Pro 353
Glu Gin	Ala Arg Leu Ala	Leu	Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe 363	Vai Arg Gln 373
Gly Thr	Gly Asn Asp G,u	Ala	Gly Ala Ala Asn Ala Asp Vai Vai Ser Leu 383	Thr Cys Pro 393
Va, A,a	Ala Gly Glu Cys	Ala	Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu 403	Glu Arg Asn 413
Tyr Pro	Thr Gly A,a Glu	Phe	Leu Gly Asp Gly Gly Asp Vai Ser Phe Ser 423	Thr Arg Gly 433
Thr Gln	Asn Trp Thr Vai	Glu	Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu 443	Glu Arg Gly 453
Tyr Vai	Phe Vai Gly Tyr	His	Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile 463	Vai Phe Gly 473
Gly Va,	Arg Ala Arg Ser	Gln	Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr 483	Ile Ala Gly 493

-29TABELA 3 Continuação

Sequência de aminoácidos de

TGF-alfa-PE ._n40

Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gin Asp Gin Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile 503 513

Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Vai Tyr Vai Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg 523 533

Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Vai Glu Arg Leu Ile Gly His 543 553

Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu 563 573

Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Vai Vai Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr

5Θ3 593

Asp Pro Arg Asn Vai Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gin Ala

603 613

Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gin Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys

-30TABELA 4

Sequência de aminoácidos de TGF-alfa-PE^-aB

-4	-3	-2	-1	' TGFa	6	16
Met	Al a	Al a	Al a	' Vai Vai	Ser His Phe Asn Asp 26	Cys Pro Asp Ser His Thr Gin Phe Cys 36
Phe	His	Gly	Thr	Cys Arg	Phe Leu Vai Gin Glu 46	Asp Lys Pro Ala Cys Vai Cys His Ser TGFa⁵⁰ ’ «PE²⁵²
Gly	Tyr	Vai	Gly	Ala Arg	Cys Glu His Ala Asp 263	Leu Leu Ala’Ala Met Ala Glu’Glu Gly 273
Gly	Ser	Leu	Ala	Ala Leu	Thr Ala His Gin Ala 283	Ala His Leu Pro Leu Glu Thr Leu Thr 293
Arg	His	Arg	Gin	Pro Arg	Gly Trp Glu Gin Leu 303	Glu Gin Ala Gly Tyr Pro Vai Gin Arg 313
Leu	Vai	Al a	Leu	Tyr Leu	Ala Ala Arg Leu Ser 323	Trp Asn Gin Vai Asp Gin Vai Ile Arg 333
Asn	Al a	Leu	Ala	Ser Pro	Gly Ser Gly Gly Asp 343	Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gin Pro 353
Glu	Gin	Al a	Arg	Leu Ala	Leu Thr Leu Ala Ala 363	Ala Glu Ser Glu Arg Phe Vai Arg Gin 373
Gly	Thr	Gly	Asn	Asp Glu	Ala Gly Ala Ala Asn 383	Ala Asp Vai Vai Ser Leu Thr Cys Pro 393
Vai	Ala	Ala	Gly	Glu Cys	Ala Gly Pro Ala Asp 403	Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn 413
Tyr	Pro	Thr	Glu	Ala Glu	Phe Leu Gly Asp Gly 423	Gly Asp Vai Ser Phe Ser Thr Arg Gly 433
Thr	Gin	Asn	Trp	Thr Vai	Glu Arg Leu Leu Gin 443	Ala His Arg Gin Leu Glu Glu Arg Gly 453
Tyr	Vai	Phe	Vai	Gly Tyr	His Gly Thr Phe Leu	Glu Ala Ala Gin Ser lie Vai Phe Gly

463 473

Gly Vai Arg Ala Arg Ser Gin Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly 403 493

-31TABELA 4 Continuação

Sequência de aminoácidos de TGF-alfa-PE_4Q-aB

Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gin Asp Gin Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg IIe 503 513

Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Vai Vai Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr 5Θ3 593

Asp Pro Arg Asn Vai Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gin Ala 603 613

Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gin Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys

-32TABELA 5

	Sequência	de	aminoácidos de	TGF-alfa-PE_4QAb
-d	-3 -2 -1 'TGFa¹	6	16
Met	Ala Ala Ala ' Vai	Vai	Ser His Phe Asn Asp Cys 26	Pro Asp Ser His Thr Gin Phe Cys 36
Phe	His Gly Thr Cys	Arg	Phe Leu Vai Gin Glu Asp 46	Lys Pro Ala Cys Vai Cys His Ser TGFa⁵⁰’ ' PE²⁵²
Gly	Tyr Vai Gly Ala	Arg	Cys Glu His Ala Asp Leu 263	Leu Ala’Ala Met Ala Glu'Glu Gly 273
Gly	Ser Leu Ala Ala	Leu	Thr Ala His Gin Ala Cys 2Θ3	His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr 293
Arg	His Arg Gin Pro	Arg	Gly Trp Glu Gin Leu Glu 303	Gin Cys Gly Tyr Pro Vai Gin Arg 313
Leu	Vai Ala Leu Tyr	Leu	Ala Ala Arg Leu Ser Trp 323	Asn Gin Vai Asp Gin Vai Ile Arg 333
Asn	Ala Leu Ala Ser	Pro	Gly Ser Gly Gly Asp Leu 343	Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gin Pro 353
Glu	Gin Ala Arg Leu	Ala	Leu Thr Leu Ala Ala Ala 363	Glu Ser Glu Arg Phe Vai Arg Gin 373.
Gly	Thr Gly Asn Asp	Glu	Ala Gly Ala Ala Asn Ala 383	Asp Vai Vai Thr Leu Thr Ala Pro 393
Vai	Ala Ala Gly Glu	Ala	Ala Gly Pro Ala Asp Ser 403	Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn 413
Tyr	Pro Thr Gly Ala	Glu	Phe Leu Gly Asp Gly Gly 423	Asp Vai Ser Phe Ser Thr Arg Gly 433
Thr	Gin Asn Trp Thr	Vai	Glu Arg Leu Leu Gin Ala 443	His Arg Gin Leu Glu Glu Arg Gly 453
Tyr	Vai Phe Vai Gly	Tyr	His Gly Thr Phe Leu Glu 463	Ala Ala Gin Ser Ile Vai Phe Gly 473
Gly	Vai Arg Ala Arg	Ser	Gin Asp Leu Asp Ala Ile 483	Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly 493

-33TABELA 5 Continuação

Sequência de aminoácidos de TGF-alfa-PE_„Ab 40

Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Vai Vai Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr

583 593

Asp Pro Arg Asn Vai Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gin Ala

603 613

Ile Ser Ala Leu Pro Asp Ty. Ala Ser Gin Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys

TABELA 6

Sequência de aminoácidos de TGF-alfa-PE^ab

-4 -3 -2 -1'TGFa’ 6 16

Met Ala Ala Ala'Vai Vai Ser His Phe Asn Asp Cys Pro Asp Ser His Thr Gin Phe Cys

36

Phe His Gly Thr Cys Arg Phe Leu Vai Gin Glu Asp Lys Pro Ala Cys Vai Cys His Ser

TGFa⁵⁰' ’PE²⁵²

Gly Tyr Vai Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Asp Leu Leu Ala'Ala Met Ala Glu'Glu Gly

263 273

Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gin Ala Ala His Leu Pro Leu Glu Thr Leu Thr

283 293

Arg His Arg Gin Pro Arg Gly Trp Glu Gin Leu Glu Gin Ala Gly Tyr Pro Vai Gin Arg

303 313

Leu Vai Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gin Vai Asp Gin Vai Ile Arg

323 333

Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gin Pro

343 353

Glu Gin Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Vai Arg Gin

363 373

Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Vai Vai Thr Leu Thr Ala Pro

383 393

Val Ala Ala Gly Glu Ala Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn

403 413

Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly

423 433

Thr Gin Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gin Ala His Arg Gin Leu Glu Glu Arg Gly

443 453

Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gin Ser Ile Val Phe Gly

463 473

Gly Val Arg Ala Arg Ser Gin Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly

483 493

TABELA 6 Continuação

Sequência de

aminoácidos de TGF-alfa-PE^gab

Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Vai Tyr Vai Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg 5Z3 533

Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gin Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys

Claims

REIVINDICAÇÕES:

lã. - Processo para a preparação de uma proteína híbrida caracterizado por se incluir na referida proteína um domínio ΡΕ^θ modificado através de substituição ou delecção de pelo menos dois resíduos císteina por dois aminoácidos que podem ser iguais ou diferentes desde que não formem uma ponte dissulfureto, ligado a um domínio proteico de direccionamento que se liga ao receptor reconhecido pelo agente de direccionamento.

reivindicação ser um factor
2ã. - Processo de acordo com a 1, caracterizado por o agente de direccionamento de crescimento, uma hormona ou um anticorpo.
3ã. reivindicação teina estarem

1, caracterizado substituídos.

por

Processo de acordo com a pelo menos 2 resíduos cís
4ã . reivindicação 3, caracterizado por tarem substituídos.

Processo de acordo com a 4 resíduos de cisteína es
5â. reivindicação 3, caracterizado por na estar substituído por alanina.

Processo de acordo com a pelo menos 1 resíduo císteireivindicação teina estarem
6ã

3 , caracterizado substituídos por . - Processo de por pelo menos alanina.

acordo com a resíduos cís2
7â. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por 4 resíduos císteina estarem substituídos por alanina.
8§. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por pelo menos 1 resíduo císteina estar substituído por um aminoácido diferente de alanina que não forma uma ponte dissulfureto.
9§. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por pelo menos 2 resíduos císteina estarem substituído por um aminoácido diferente de alanina que não forma uma ponte dissulfureto.

lOã. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por 4 resíduos císteina estarem substituídos por um aminoácido diferente de alanina que não forma uma ligação dissulfureto.

reivindicação teina estarem llã. - Processo de 1, caracterizado por pelo menos 2 eliminados.

acordo com a resíduos císreivindicação 11, eliminados.
12â. caracterizado por

Processo de acordo com a 4 resíduos cisteína estarem
13a. _ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por 2 resíduos cisteína estarem substituídos por um aminoácido que não forma uma ligação dissulf ureto e por 2 resíduos cisteína estarem eliminados.

145. - Plasmídeo caracterizado por conter DNA codificador da proteína híbrida preparada de acordo com a reivindicação 1 e por estar adaptado para expressar a proteína híbrida num hospedeiro procariótico ou eucariótico adequado.

155. - Processo para a preparação de uma proteína híbrida de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a inserção de um plasmídeo contendo DNA codificador da proteína híbrida definida na reivindicação 1 numa célula hospedeira adequada procariótica ou eucariótica e cultura de célula hospedeira em condições que suportem a produção da proteína híbrida.

165. _ Processo para a preparação de uma composição caracterizado por se misturar a proteína híbrida preparada de acordo com a reivindicação 1, numa quantidade citotóxica eficaz com um veículo fisiológicamente aceitável .

175. - Método para a produção de actividade citotóxica selectiva numa espécie de mamífero, caracterizado por compreender a administração de uma composição contendo uma quantidade citotóxica eficaz de proteína híbrida preparada de acordo com a reivindicação 1, de preferência desde cerca de 10 pM e cerca de 100 nM.

185. - Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por a proteína híbrida ser administrada numa composição contendo um veículo fisiológicamente aceitável.

-3919â. - Método para o tratamento da proliferação de queratinócitos, caracterizado por compreen der o tratamento das células em proliferação com uma quantida de de uma proteína híbrida preparada de acordo com a reivindi cação 1, que é eficaz na prevenção da proliferação dos queratinócitos , de preferência desde cerca de 10 pM a cerca de 100 nM.

20â. - Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o agente de direccionamen to ser um factor de crescimento, uma hormona ou um anticorpo.