JPH02276590A - タンパク質抗ガン剤 - Google Patents

タンパク質抗ガン剤

Info

Publication number
JPH02276590A
JPH02276590A JP2037126A JP3712690A JPH02276590A JP H02276590 A JPH02276590 A JP H02276590A JP 2037126 A JP2037126 A JP 2037126A JP 3712690 A JP3712690 A JP 3712690A JP H02276590 A JPH02276590 A JP H02276590A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
hybrid protein
tgf
cysteine residues
substituted
alanine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2037126A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH07106159B2 (ja
Inventor
Allen Oliff
アレン　オリフ
Deborah D Jones
デボラ　デー．ジヨーンズ
Gwynneth M Edwards
グウイネス　エム．エドワーズ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck and Co Inc
Original Assignee
Merck and Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck and Co Inc filed Critical Merck and Co Inc
Publication of JPH02276590A publication Critical patent/JPH02276590A/ja
Publication of JPH07106159B2 publication Critical patent/JPH07106159B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 伝統的なガンの化学療法は、薬物がガン患者の腫瘍細胞
を殺す能力に依存している。不幸なことに、これらの同
じ薬物が腫瘍細胞とともに正常な細胞をも殺すことがし
ばしばある。ガン薬が正常細胞を殺さずに腫瘍細胞を殺
す程度は、その化合物の腫瘍細胞に対する選択性の度合
の指標である。ガン薬の腫瘍細胞に対する選択性を高め
る一つの方法は、薬物を腫瘍細胞に重点的に送達し、正
常細胞集団には近づけないことである。化学療法剤を特
定の細胞集団に選択的に送達することを言い表わす言葉
として、「ターゲティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）　Ｊ
という言葉もある。腫瘍細胞への薬物の゛ターゲティン
グはいくつかの方法によって行うことができる。一つの
方法は、腫瘍細胞の表面に見い出される特定の受容体（
ｒｅｃｅｐｔｏｒ）分子の存在に依存する方法である。
「ターゲティング剤」と称される他の分子がこのような
細胞表面の受容体を認識してそれに結合するのである。
これらの［ターゲテイング剤」には、たとえば抗体、成
長因子（ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）あるいはホルモ
ンなどがある。特定の細胞表面受容体を認識してそれに
結合するｒターゲティング剤」は、そのような受容体を
有する細胞を標的にするといわれている。たとえば、多
くの腫瘍細胞は、その表面に表皮性（ｅｐｉｄｅｒｍａ
ｌ）成長因子受容体と呼ばれるタンパク質を有する０表
皮性成長因子（Ｅ　Ｇ　Ｆ）および転換性（ｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍｉｎｇ）成長因子α（ＴＧＦ−α）を含むいく
つかの成長因子は、腫瘍細胞上のＥＧＦ受容体を認識し
てこれに結合する。それゆえＥＧＦやＴＧＦ−αはこれ
らの腫瘍細胞に対する「ターゲティング剤」である。
「ターゲティング剤」はそれ自身では腫瘍細胞を殺さな
い、細胞毒あるいは毒素といった他の分子が「ターゲテ
ィング剤」と結合して、腫瘍細胞ターゲティング領域と
細胞毒素領域との両方を有する複合（ｈｙｂｒｉｄ）分
子を作ることができるのである。これらの複合分子はそ
の腫瘍細胞を標的にする能力に基づく腫瘍細胞選択性の
毒物として機能し、かくしてその毒素成分によりこれら
の細胞を殺す。
これらの複合分子を作るのに最もよく用いられる細胞毒
のうちのいくつかのものは、哺乳動物細胞内におけるタ
ンパク質合成を阻害する細菌性毒素である。シュードモ
ナス外毒素（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｅｘｏｔｏｘｉ
ｎ）　Ａはこのような細菌性毒素の一つであり、複合「
ターゲティングー毒素」分子を構成するのに用いられて
きた（米国特許第４，５４５，９８５号）。
シュードモナス外毒素Ａは、まず細胞表面に結合するこ
とによって哺乳動物細胞を中毒させ、次に細胞質内に侵
入して、タンパク質合成に必要な細胞タンパク質である
延長因子（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）　２
を不活性化する。シュードモナス外毒素Ａは、モノクロ
ーナル抗体とタンパク質ホルモンを用いて抗ガン複合分
子を作るのに用いられている。しかしながら、このよう
な複合分子にまつわる一つの問題は、それらが正常細胞
に対して毒性を示すととである。シュードモナス外毒素
Ａを含む複合分子に係る毒性の少なくとも一部は、シュ
ードモナス外毒素Ａ自体が多くの種類の哺乳動物細胞に
結合してその中に侵入する能力を有することによるもの
である。それゆえ。
シュードモナス外毒素Ａと特定の「ターゲティング剤」
との間に形成された複合分子は。
その「ターゲティング剤」によって認識される細胞に加
えて、多くの正常細胞し−も結合することができる。こ
の問題に対処するための一つの方法は、シュードモナス
外毒素Ａを改変して、それがもはや正常細胞には結合で
きないようにすることである。これはシュードモナス外
毒素Ａ分子の細胞結合能力に係わる部分を除去すること
によって達成できる。シュードモナス外毒素Ａ分子の先
端を切り取った形のものが作られており、これは延長因
子２を不活性化する能力を保持しているが、もはや哺乳
動物細胞に結合することはできない。
この改変シュードモナス外毒素Ａ分子はシュードモナス
外毒素４０あるいはＰＥ４０と呼ばれている（ｌｖａｎ
ｇ他、Ｃｅ１ｌ　４８　：１２９−１３６　１９８７）
。
ＰＥ４０はＴＧＦ−αを含むいくつかのターゲティング
分子と結合されている（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ他、ＰＮＡ
Ｓ　　ＵＳＡ　　８４：４５３８−４５４２　１９８７
）、ＴＧＦ−αの場合。
ＰＥ４０領域とＴＧＦ−α領域とを含む複合分子は、Ｅ
ＧＦ受容体を有する腫瘍細胞に特異的に結合して、タン
パク質合成を阻害することによりこれらの細胞を中毒さ
せる。この複合分子が効率的にＥＧＦ受容体に結合する
ためには、それが適当なコンホメーションを有していな
ければならないと考えられる。効率的な受容体との結合
はまた、「ターゲティング領域」が適当に露出していて
結合にあやかれるようになっているかどうかということ
にも依存する。ＴＧＦ−αとＰＥ４．との複合分子を組
換えＤＮＡ法を用いて細菌中において融合タンパク質と
して産生ずる場合には、多くの複合分子は弱いＥＧＦ受
容体結合活性しか示さない。
なお、本発明に関連する文献としては、以下のものが挙
げられる。
１、　米国特許第４，５４５，９８５号は。
シュードモナス外毒素Ａを抗体や表面成長因子に結合さ
せることができることを教示する。同特許はまた、これ
らの結合体を用いてヒト腫瘍細胞を殺すことができるこ
とも教示する。
２、　米国特許第４，６８４，９１１号は、植物から得
られる毒素であるリシンのＡ鎖またはＢ鎖に抗体を結合
することができることを教示する。同特許はまた、これ
らの結合体を用いてヒト腫瘍細胞を殺すことができるこ
とも教示する。
３、　米国特許第４．６７５，３８２号は、メラニン細
胞刺激ホルモン（Ｍ　Ｓ　Ｈ）のようなホルモンをペプ
チド結合によりジフテリア毒素タンパク質の一部に結合
することができことを教示する。同特許はまた。これら
のタンパク質をコードする遺伝子を組換えＤＮＡ法を用
いてつなぎ合わせて複合融合タンパク質の合成を行わせ
ることができることも教示する。この融合タンパク質は
ＭＳＨ受°受体容体する細胞に結合する能力を有する。
４、　　Ｍｕｒｐｈｙ他、ＰＮＡＳ　　ＵＳＡ　　８３
：８２５８−　８２６２　１９８６　、　Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ、　　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ、　　ａｎｄ　　ｍａｌａｎｏｍａ−ｓａｌｅｃｔｉ
ｖｅ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ａ　ｄｉｐｈ
ｔｈｅｒｉａｔｏｘｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ　ａｌｐｈａ
−ｍ　ｅｌａｎｏｃｙｔｅ−ｓｔｉｍｕ−１ａｔｉｎｇ
　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ジ
フテリア毒素関連αメラニン細胞刺激ホルモン融合タン
パク質の遺伝子構成、発現、および黒色腫選択的細胞毒
性）、この文献は、組換えＤＮＡ法を用いて細菌中で産
生され、αメラニン細胞刺激ホルモンに結合したジフテ
リア毒素タンパク質の一部を成す複合融合タンパク質が
、ヒト黒色腫細胞に結合してこれを殺すことを教示する
。
５、　　Ｋｅｌｌｅｙ他、ＰＮＡＳ　　ＩＪＳＡ　　８
旦：３９８０−３９８４　１９８８　、　Ｉｎｔｅｒｌ
ｅｕｋｉｎ２−　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ　ｔｏｘｉｎ　
ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃａｎａｂｏｌｉｓｈ
　　ｃａｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　　ｉｍｍｕｎｉｔｙ
　　ｉｎ　　ｖｉｖ。
（インターロイキン　２−ジフテリア毒素融合タンパク
質は生体の細胞性免疫を破壊することができる）、この
文献は１組換えＤＮＡ法を用いて細菌中で産生され、イ
ンターロイキン２に結合したジフテリア毒素タンパク質
の一部を成す複合融合タンパク質が、ヌードマウス中に
おいて細胞性免疫を抑制する作用を呈することを教示す
る。
６、　　Ａ１１ｕｒｅｄ他、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８３：
１３２０−１３２４　１９８８　、５ｔｒｕｃｔｕｒｅ
　ｏｆｅｘｏｔｏｘｌｎ　Ａ　ｏｆ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏａａ　ａｔ３　、　ＯＡｎｇ
ｓｔｒｏｍ（３、０オングストロームでのシュードモナ
ス・エルギノーザの外毒素Ａの構造）、この文献は、シ
ュードモナス外毒素Ａタンパク質の三次元構造を教示す
る。
７、　　Ｈｗａｎｇ他、Ｃｅ１ｌ　４８　：１２９−１
　３　６　　１　９　８　７　　、　　Ｆｕｎｃｔｉｏ
ｎａｌ　　Ｄｏｍａｉｎｓｏｆ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ　Ｅｘｏｔｏｘｉｎ　Ｉｄａｎｔｉｆｉａｄ　ｂｙＤ
ｅｌｅｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇ
ｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎ　Ｅ　、　Ｃｏ１１　
（大腸菌中で発現した遺伝子の欠失分析によって同定さ
れたシュードモナス外毒素の作用領域）、この文献は、
シュードモナス外毒素Ａタンパク質が３つの異なる機能
領域に分割することができ、それらはそれぞれ、哺乳動
物細胞への結合、リソソーム膜を横切っての上記毒素タ
ンパク質の移動、および−乳動物細胞内でのＡＤＰリボ
シル化延長延長因子ｉｂｏｓｙｌａｔｉｎｇ　ｅｌｏｎ
ｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）２に関与することを教示
する。この文献はまた、これらの機能領域がシュードモ
ナス外毒素Ａタンパク質の異なる領域に対応しているこ
とも教示する。
８、　１９８８年３月３０日に公開された欧州特許出願
筒０　２６１　６７１号は、シュードモナス外毒素Ａタ
ンパク質の全体が有する細胞結合機能は欠いているがシ
ュードモナス外毒素Ａタンパク質の全体が有する前記移
動機能およびＡＤＰリボシル化機能は有するシュードモ
ナス外毒素Ａの一部分を作ることができることを教示す
る。このシュードモナス外毒素Ａタンパク質の全体が有
する移動機能およびＡＤＰリボシル化機能を保持してい
るシュードモナス外毒素Ａタンパク質の一部分は、シュ
ードモナス外毒素４０またはＰＲ−４０と呼ばれる。Ｐ
Ｅ−４０は、Ｇ　ｒａｙ他、ＰＮＡＳ　ｔＪｓＡ　８１
：２６４５−２６４９１９８４において規定されたシュ
ードモナス外毒素Ａタンパク質全体のアミノ酸残基２５
２−６１３を構成する。この特許出願はまた、組換えＤ
ＮＡ法を用いることにより、ＰＥ−４０を転換成長因子
αに結合して細菌内で産生される複合融合タンパク質を
形成することができることも教示する。
９　、Ｃｈａｎｄ１１ａｒｙ他、ＰＮＡＳ　　ＵＳＡ８
４：４５３８−４５４２１９８７．Ａｃｔｉｖｉｔｙｏ
ｆ　　ａ　　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　　ｆｕ３ｉｏｎ
　　ｐｒｏｔｅｉｎ　　ｂｅｔｗｅｅｎｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍｉｎｇ　（ｒｏｖｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｔｙｐｅ　
ａｌｐｈａａｎｄ　Ｐｓｅｕｄｏ＋＊ｏｎａｓ　ｔｏｘ
ｉｎ　　（転換成長因子α型とシュードモナス毒素との
組換え融合タンパク質の活性）、この文献は、ＰＲ−４
０と転換成長因子αとの間で形成され１組換えＤＮＡ法
を用いて細菌中で産生される複合融合タンパク質が、表
皮性成長因子受容体を有するヒト腫瘍細胞に結合してこ
れを殺すことを教示する。
１０、　　Ｂａ１ｌｏｎ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ、　Ｌ　３２６−１３２９頁１９８８年１１月、　Ｐ
　ｕｒｉｆｉ−ｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐａｒｔｉａｌ
　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆａｎ　　Ｉ
ｎｔｅｒｌａｕｋｉｎ２−　　Ｐｓａｕｄｏｍｏｎａｓ
　　ＥｘｏｔｏｘｉｎＦｕｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　
（インターロイキン２−シュードモナス外毒素融合タン
パク質の精製および部分的特徴づけ）、この文献は、Ｐ
Ｅ−４０とインターロイキン２との間で形成され。
組換えＤＮＡ法を用いて細菌中で産生される複合融合タ
ンパク質が、インターロイキン２受容体を有するヒト細
胞系に結合してこれを殺すことを教示する。
標的剤（ｔａｒｇｅｔｉＢ　ａｇｅｎｔ）と改変ＰＥ４
（１分子との間に形成されたハイブリッド分子を標的剤
を認識する細胞受容体に効果的に結合させるＰＥ４０の
改変体を提供する二七が本発明の１つの目的である。標
的剤と改変ＰＥ、。との間で産生されたハイブリッドた
ん白を細菌の融合たん白として回収する方法を提供する
ことが本発明のもう１つの目的である０本発明の別の目
的は細胞受容体結合ドメイン（すなわち、領域）及びＰ
Ｅ４０ドメイン（すなわち、領域）を有するハイブリッ
ド（すなわち、融合）たん白を提供することである、こ
こにＰＥ４．ドメインは表皮成長因子受容体へのハイブ
リッドたん白の結合、又は改変ＰＥ４０へ結合した標的
剤によって結合された受容体へのハイブリッドたん白の
結合を改良するために改変されている。さらに別の目的
は、ずっと容易に精製されるハイブリッドたん白を提供
することである０本発明のこれらの及び他の目的は以下
の記載から明らかになるであろう。
本発明はたん白標的ドメインに結合した改変ＰＥ４０ド
メインを含むハイブリッド分子を提供する。この改変Ｐ
Ｅ、。ドメインはこのハイブリッド分子の受容体結合活
性を改良する。
ＰＥ４０中のシスティン残基に替えて他のアミノ酸、例
えばアラニンの使用、又はシスティン残基の除去は、標
的ドメインによって認識された受容体へのハイブリッド
分子の結合を改良する０本発明のハイブリッド分子は非
改変ＰＥ４＠を有するハイブリッド分子よりもずっと効
果的に、ヒト腫瘍の標的とされる受容体へ結合する。
ＴＧＦ−αとＰＥ、。との間で形成されたハイブリッド
分子は三つの主なアッセイによって特徴付けられる。こ
れらのアッセイは次のものを含む。
ｌｊｉ乳類細胞たん白金酸を阻害する ＴＧＦ−α−ＰＥ４０の酵素活性を評価する延長因子２
のＡＤＰリボシル化。
２　　ＴＧＦ−α−ＰＥ４０のＥＧＦ受容体結合活性を
評価するＡ４３１からの膜ベシクルのＥＧＦ受容体に結
合する放射能標識したＥＧＦの阻害。
３　　ＴＧＦ−α−ＰＥ４０への暴露に続いて腫瘍の生
存を評価するために使用されるホルマザンへの３−［４
，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，・５−ジ
フェニルテトラゾリウムプロミド（ＭＴＴ）の変換によ
って評価される細胞の増殖。
これらのアッセイは前記の通り行なわれる（Ｄｏｍｉｎ
ｉｃ　ａｔ　ａｌ、、　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　
Ｉａ＋ａｕｎｉｔｙ１６　：　８３２−８４１１９７７
．　Ｃｏｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ＋＋＠Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　
Ｃｈｅｗ、　２５７　：１５２３−１５３１１９８２　
、　　Ｒｉｅｍｅｎ　ａｔ　ａｌ、、　Ｐｅｐｔｉｄｅ
ｓ　８　：８７７−８８５　１９８７．　　Ｍｏｓｍａ
ｎｎ　　Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　　６５：　５５−６
３　１９８３）。
優れた受容体結合特性を有する新規な ＴＧＦ−α−ＰＥ、。ハイブリッド分子を造るために、
我々はまずＴＧＦ−α−ＰＥ、。
か又はＴＧＦ−α−ＰＥ４０の特異的改変体（ｓｐｅｃ
ｉｆｉｃａｌｌｙ　＋ｗｏｄｉｆｉｅｄ　ｖｅｒｓｉｏ
ｎｓ）かのいずれかをコードする一連の組換ＤＮＡ分子
を製造した。原又は親ＴＧＦ−α−ＰＥ４０遺伝子は、
実施例２に記載されるクローン化ＤＮＡの別個のセグメ
ントを使用して細菌のＴＡＣ発現プラスミドベクター（
ｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０）に分子的にクローン化
された。
このｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ、、ＤＮＡクローンを、
ＴＧＦ−α−ＰＥ、。ＤＮＡの特異的な改変体を構造す
るための出発試薬として使用した。ｐＴＡＣＴＧＦ５７
−ＰＥ４０ＤＮＡの特異的改変は、ｐＴＡＣＴＧＦ５７
−ＰＥ４０ＤＮＡのＰＥ４０ドメイン内のシスティンコ
ドンの２又は４を他のアミノ酸のためのコドンで置換す
るために必要なりＮＡコード配列中に部位特異的変異を
含んでいる。また１部位特異的変異をうまく処理して、
ｐ　Ｔ　Ａ　ＣＴ　Ｇ　Ｅ　５７−　Ｐ　Ｅ　４０のＰ
Ｅ、。ドメイン内のシスティンコドンの２又は４を除去
することができる。ＰＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ、、ＤＮ
Ａ中の部位特異的変異はＷｉｎｔｅｒｓｔ　ａｌ、、　
　Ｎａｔｕｒｅ　２９９　：　７５６−７５８１９８２
の方法を使用して構造される。変異させられたｐＴＡＣ
ＴＧＦ５７−ＰＥ、。
ＤＮＡの具体例が実施例３に示されている。
ｐＴＡＣＴＦＧ５７−ＰＥ、、ＤＮＡによってコードさ
れるハイブリッドたん白のアミノ酸配列が第３図に示さ
れている。親ＴＧＦ−α−ＰＥ、、ハイブリッドたん白
のＰＥ、。中の４つのシスティン残基は残基Ｃｙｓ”’
Ｃｙ　ｓ”’、　Ｃｙ　ｔｓ””、及び０１ｍ３７”で
表わされる（第３図）、アミノ酸残基はＧｒａｙａｔ　
ａｌ、、　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８１　：　２６４５−２
６４９　（１９８４）において定義されたように番号が
付けられている。特異的に変異させられたｐＴＡＣＴＧ
Ｆ５７−ＰＥ４．ＤＮＡからの改変ＴＧＦ−α−ＰＥ、
。ハイブリッドたん白は、残基［Ｃｙｓ”’及びＣ，、
２＠７］又は［Ｃｙｓ３？！及びＣｙｓ”’］、又は［
Ｃｙ　ｓ”’、　Ｃｙ　ｓ”’、　Ｃｙ　ｓ””、及び
にｙｓ３’ｌＪの置換又は除去を含む、これらの変異ｐ
　Ｔ　Ａ　ＣＴ　Ｇ　Ｆ　５７　　Ｐ、Ｅ４０ＤＮＡが
ら産生された改変ハイブリッドたん白°を記述するため
の命名を簡単にするために、我々は位置２６５及び２８
７のアミノ酸残基にｒＡＪ座を指定しそして位置３７２
及び３７９の残基に「Ｂ」座を指定する。システィンが
親ＴＧＦ−α−ＰＥ４０ハイブリッド分子におけるよう
にアミノ酸残基２６５及び２８７に存在する場合、座は
大文字（すなわち、ｒＡＪ）で表わされる。システィン
が他アミノ酸、例えばアラニ゛ン、フェニルアラニン、
バリン。
ロイシン又はインロイシンで置換されているか又は残基
２６７及び２８７がら除去されている場合、座は小文字
ｒａＪによって表わされる。同様に、位置３７２及び３
７９のアミノ酸残基がシスティンである場合、座は大文
字のｒ１３Ｊによって表わされるが、一方１位置３７２
及び３７９のアミノ酸残基が他のアミノ酸で置換されて
いるか又は除去されている場合には小文字のｒｂＪがこ
の座を表わす、従って、ＴＧＦ−α−ＰＥ、。のＰＥ４
０ドメインの４つのシススティン残基すべてがアラニン
で置換されている場合、改変ハイブリッドたん白はＴＧ
Ｆ−α−ＰＥ４０ａｂと表わされる。同様な方法におい
て、アミノ酸残基の位置２６５，２８７，３７２及び３
７９にシスティンを有する親ＴＧＦ−α−ＰＥ４０ハイ
ブリッドたん白をＴＧＦ−α−ＰＥ４０ＡＢと表わすこ
とができる。
ＴＧＦ−α−ＰＥ、。ＡＢハイブリッドたん白及び改変
ＴＧＦ−α−ＰＥ４０ハイブリッドたん白は、Ｌｉｎｅ
ｍｅｙｅｒ　ａ　ｔ　　ａ　１．、　Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ　５　：　９６０−９６５　１９８７によ
って記載されたＴＡＣ発現ベクター系を使用してＥ、Ｃ
ｏ１１において産生される。これらの細菌において産生
された組換ハイブリッドたん白は収集され、そしてグア
ニジンヒドロクロリド中で細菌を溶解させた後、亜硫酸
ナトリウム及び四チオン酸ナトリウムを添加することに
よって精製される０次に、この反応混合物を透析しそし
て尿素を加えて溶液から沈澱したたん白を可溶化する６
次に、この混合物を遠心して不溶性たん白を除去し。
そしてイオン交換クロマトグラフィー、次にサイズ除外
クロマトグラフィー、次に再びイオン交換クロマトグラ
フィーを使用して組換ハイブリッドＴＧＦ−α−ＰＥ４
０たん白を分離する。精製されたＴＧＦ−α−ＰＥ４０
雑種たん白を次に、ハイブリッドたん自白に対のシステ
ィン残基の間でジスルフィド結合を形成させるために還
元剤、例えばβ−メルカプトエタノールに暴露する。最
後に、折りたたんだ状態に戻された雑種たん白をサイズ
除外及びイオン交換クロマトグラフィーにかけて高純度
のＴＧＦ−α−ＰＥ４０たん白を単離する。この精製の
概要の詳細は実施例２に記載されている。ひとたび精製
され、折りたたんだ状態に戻されたこれら雑種たん白の
生物学的活性は、前記ＡＤＰリボシル化、ＥＧＦ受容体
結合、及び細胞増殖アッセイを使用して特徴づけるられ
ることかできる。
ＴＧＦ−α−ＰＥ４０の重要な実用性はＥＧＦ受容体を
所有する細胞に結合しそして細胞を殺すその能力にある
。多くのヒト腫瘍細胞はＥＧＦ受容体をもっており、従
って、ＴＧＦ−α−ＰＥ４０の細胞を殺す効力に対して
感受性が強い、ケラチン生成細胞を含む他の癌にかかっ
ていないζトの細胞はＥＧＦ受容体をもっていて、やは
り、ＴＧＦ−α−ＰＥ４Ｉｌの細胞を殺す活性に対して
感受性が強い、いくつかのヒトの病気は、乾癖及び痣贅
を含むケラチン生成細胞の増加された増殖によって特徴
づけられる。
以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、本
発明はそれに限定されない８分子生物学上の取り扱いの
ために必要な酵素反応のすべては、特に断わりのない限
り、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８２
）　　Ｉｎ：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：
　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ＭａｎｕａｌｓＣｏｌｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　　に記載
されている通りに行なわれた。
形質転換された旦、ＧｏはＪＭ−１０９細胞を１００μ
ｇ　／　ｍ　ｎのアンピシリンの存在下５００ｍｎＬＢ
−ブロス（Ｌ　Ｂ　−Ｂ　ｒｏｔｈ）入りの１リツトル
振動フラスコ中で培養した。Ａ６００分光光度吸収値が
０．６に達した後で、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオ−ガ
ラクトピラノシドを最終濃度１ｍＭになるまで加えた。
２時間後、細胞を遠心分離して回収した。
八　　　のＳ−スルフォネート 細胞を８Ｍグアニジン塩酸塩、ｐＨ８，０の５０　ｍ　
Ｍ　トリス緩衝液、１ｍＭＥＤＴＡ中に室温で、２時間
で溶解した。溶解混合液に固体試薬を加えて、０．４Ｍ
亜硫酸ナトリウム及び０．１Ｍ四チオン酸ナトリウムと
し、そしてＩＭＮａＯＨでｐＨ９，０に調節した。
室温で１６時間反応させた。
クロマトグラフィー　の準備 蛋白質液を１０，０００倍過剰容量の１＋ｍＭＥＤＴＡ
で４℃で透析した。混合液を室温で６Ｍ尿素、５Ｑ＋ｍ
Ｍ　ｐＨ８，ｏトリス緩衝液。
５０ｍＭＮａＣＲとし、２時間撹拌した。不溶解分は３
２，０ＯＯＸＩＣ，３０分の遠心分離により除去した。
ＤＥＡＥ　　Ｆ、Ｆ、セファロースクロマトグラフィー 前工程の透明上澄み液を６Ｍ尿素、５０ｍＭｐＨ８，ｏ
トリス緩衝液、５０ｍＭ　ＮａＣ１１で平衡させた２６
Ｘ４０ｃｍ　ＤＥＡＥ　　ＦａｓｔＦｌｏｗ　　Ｃｏｌ
ｕｍｎ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　　ＬＫＢ　　Ｂｉｏ−
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ　ｆＩ！ｉ）に流速１　
ｍ　Ｑ　７分でかけた。カラムを平衡緩衝液ですべての
不吸着物がなくなるまで洗浄した。これはカラムを出た
平衡緩衝液のＵＶ２８０分光光度吸収値が０．１以下に
なったことで証明された。吸着された融合蛋白質は１０
００　ｍ　Ｑの５０〜３５０＋ｓＭ　ＮａＣＱで傾斜溶
離され、ＹＭ−３０１１１を付けた撹拌細胞アミコン（
Ａｍｉｃｏｎ）濃縮器で濃縮された。
セファクリルＳ−３００ 濃縮融合蛋白質（８ｍＡ）を６Ｍ尿素、５０ｍＭｐＨ８
，Ｏトリス緩衝液、５０ｍＭＮａＣＱで平衡させた２、
６　ｘ　１００ｃｍセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ
）　Ｓ　−３００Ｃｏｌｕｍｎ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ製）に流
速０．２５ｍ　Ｑ　７分でかけた。カラムを平衡緩衝液
で溶離し、３　ｍ　Ｑのフラクションを得た。ＴＧＦ−
アルファーＰＥ４０活性を持つフラクションがまとめら
れた。
Ｑ−セファロースクロマトグラフィー Ｓ−３００カラムからのまとめられたフラクションを６
Ｍ尿素、５０ｍＭ　ｐ）１８．ｏトリス緩衝液、　５０
　ｍ　Ｍ　ＮａＣＱで平衡させた１　、　６　ｘ　４０
ｃｍ　Ｑ　−Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｓ　Ｃｏｌｕｍｎ（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ　Ｉｎｃ製）に流速０．７ｍＡ／分でかけた。カラム
を平衡緩衝液で洗浄し、６００ｍＱの５０〜４５０ｍ＋
ＭＮａＣＱで傾斜溶離した。ＴＧＦ−アルファーＰＥ、
。活性を持つフラクションがまとめられ、ｐＨ９，０の
５０ｍＭグリシンで透析し、零下２０℃で貯蔵した。
１ホルデイング　Ｒｅｆｏｌｄｉｎ 蛋白質サンプルを解かし、ｐＨ１０，５の、５０ｍＭグ
リシン中でＵＶ　Ａ２８０での分光光度吸収値が０．１
になるまで希釈した。ベーターメルカプトエタノールを
蛋白質試料中のＳ−スルフォネート基の理論値の４：１
モル比以上になるまで加えた。４℃で１６時間反応し、
１０，０００倍過剰容量の生理緩衝食塩水で透析し、零
下２０℃で貯蔵した。
ＴＧＦ−アルファーＤＮＡセグメントをＤ　ａｆｅｏ−
Ｊ　ｏｎｅｓ他のＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌ
ｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　８　：　２９９９−３００
７．１９８８記載の三組の合成オリゴヌクレオチドを使
用して構築した。この合成ＴＧＦ−アルファー遺伝子を
ｐＵＣ−１９にクローン化した０組換えヒトＴＧＦ−ア
ルファーを含むｐＵＣ−１９クローンからのＤＮＡをｓ
ｐｈ　　Ｉ及びＥｃｏＲＩで消化した。この消化はｐＵ
Ｃ−１９とＴＧＦ−アルファーの５′部分の全てを含む
２．８ｋｂ　　ＤＮＡフラグメントを産生した。２．８
ｋｂフラグメントを精製し、ゲル電気泳動法で分離した
。ＥｃｏＲＩ乃至Ｓｐｈ　　Ｉオリゴヌクレオチド・カ
セットを合成した。この合成カセットは以下に示す配列
を有した。
５’　−ＣＧＧＡＣＣＴＣＣＴＧＧＣＴＧＣＧＣＡ丁Ｃ
ＴＡＧＧ−３’３’　−ＧＴＡＣＧＣＣ丁ＧＧＡＧＧＡ
ＣＣＧＡＣＧＣＧＴＡＧＴＡＣＣＴＴＡＡ−５’便宜上
、このオリゴヌクレオチド・カセットを５７と名付けた
。カセット５７をアニールし、環化プラスミドを形成す
る２、８ｋｂフラグメントを含むＴＧＦ−アルファーに
結紮した。カセットを含んだクローンを放射性同位元素
でラベルされたカセット　５７　　ＤＮＡに複合化（ｈ
ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）　　Ｌｌて同定した。
ヒトＴＧＦ−アルファーの存在はＤＮＡ配列することで
確認された。配列は又ＴＧＦ−アルファー配列の３″末
端に新しく導入されたＦｓｐ　　Ｉ部の存在も確認した
。ＴＧＦ−アルファー５７／ｐＵＣ−１９と名付けられ
たこのプラスミドをＴＧＦ−アルファー遺伝子（ＴＧＦ
−アルファー５７）を含む１６８ｂｐフラグメントを産
生するＦｓｐ　　Ｉ及びＨｉｎＤ■によって消化した。
ｐＵＣ−１９の別の生成物を２．６８ｋｂ　ｐＵＣ−１
９ベクターＤＮＡを産生するＥｃｏＲＩ及びＨｉｎＤ　
ｍによって消化した。ＰＥ４０ＤＮＡをプラスミドｐ　
Ｖ　Ｃ８（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ他ＰＮＡＳ　ＵＳＡ且土
：４５３８−４５４２．１９８７）から分離した。ＰＶ
ＣｓをＮｄｅＩを使用して消化した。それから平滑末端
をこのＤＮＡ上にＫ　１ｅｎｏｖ反応（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ他、同上ｐ、１１３　）の標準条件を使用して作った
。平滑末端ＤＮＡを次いでＥｃｏＲＩ　　による第２？
ｔｌ化に掛け、ＰＥ４０を含む１．３ｋｂ　Ｅｃｏ　　
ＲＩ乃至Ｎｄｅ　　Ｉ　（平滑末端）とした。ＴＧＦ−
アルフｙ−５７ＨｉｎＤ　ｍ乃至Ｆｓｐ　　Ｉフラグメ
ント（１６８ｂｐ）を２．６８ｋｂ　ｐＵＣ−１９ベク
ターに結紮した。−夜培養の後、１．３ｋｂＥｃｏＲＩ
乃至Ｎｄｓ　　Ｉ　（平滑末端）ＰＥ４０ＤＮＡフラグ
メントを結紮混合物に加えた。この第２結紮反応は一夜
行なわれた。
結紮反応生°成物をＪＭ　１０９細胞を形質転換するた
めに使用した。ＰＵＣ−１９中にＴＧＦ−アルファー５
７ＰＥ、。を含むクローンを放射性同位元素でラベルさ
れたＴＧＦ−アルファー５７　　ＰＥ４．ＤＮＡ　に複
合化して同定し、このクローンからのＤＮＡを分離した
。
ＴＧＦ−アルファー５７ＰＥ４０をｐＵＣ−１９ベクタ
ーから除去し、Ｌｉｎｅｍｅｙｅｒ他（Ｂｉｏ−Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ　５　：　９６０−９６５　。
１９８７）に記載のＴＡＣベクター系に転写した。ｐＵ
Ｃ−１９中のＴＧＦ−アルファー５７　　ＰＥ４＠をＨ
ｉｎＤｍ及びＥｃｏＲＩによって消化し、ＴＧＦ−アル
ファー５７ＰＥ、。を含む１．５ｋｂフラグメントを産
生した。このＤＮＡフラグメントを上にＫ　１ｅｎｏｖ
反応（Ｍａｎｉａｔｉａ他、同上）の標準条件を使用し
て平滑末端を作った。ＴＡＣベクターをＨｉｎＤ　ｍ及
びＥｃｏＲＩで消化した。平滑末端をＫｌｅｎｏｖ反応
（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、同上）の標準条件を使用して消
化したＴＡＣベクターＤＮＡ上に作った。２．７ｋｂ平
滑末端を持つベクターをゲル電気泳動法で分離した。平
滑末端を持つＴＧＦ−アルファー５７ＰＥ４０フラグメ
ントを次で平滑末端ＴＡＣベクターに結紮した。この結
紮で得たプラスミドをＪＭ　　１０９細胞を形質転換す
るために使用した。ＴＧＦ−アルファー５７ＰＥ４．　
　を含む候補クローンを上記複合化で同定し配列した。
所期の構成を持つクローンをｐ　ＴＡＣＴＧＦ−５７−
ＰＥ４０と命名した。これらの操作で得られたプラスミ
ドを図面に掲げる。ＰＴＡＣＴＧＦ−５７−ＰＥ４０中
にコード化されたＴＧＦ−アルファー５７ＰＥ４０のア
ミノ酸コドンのヌクレオチド配列を第２表に掲げる。Ｔ
ＧＦ−５７−ＰＥ４０遺伝子によってコード化されたア
ミノ酸配列を第３表に示すゆ スＪＪＬ且 ＴＧＦ−α−ＰＥ４０を有する組換えＤＮＡクローンの
修飾変換体の構築ニジスティンに対してのアラニン置換 ＴＧＦ＝（Ｅ−ＰＥ、。ａＢ クローンｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０はｓｐｈ　　Ｉ
　　およびＢ　ａ　ｍ　ＨＩで消化され、−そして　７
５０ｂｐ　　ＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＴＧＦ−αの
Ｃ末端５アミノ酸と　ＰＥ４０のＮ末端２４３アミノ酸
を特定する）は単離された。Ｍ１３　ｍｐ１９ベクター
ＤＮＡは５ｐｈＩおよびＢ　ａ　ｍ　ＨＩにより切断さ
れ、ベクターＤＮＡは単離された。　７５０　ｂ　ｐ　
　Ｓｐｈ　Ｉ　−Ｂａｍ　ＨＩ　　Ｔ　Ｇ　Ｆ　−ａ　
−Ｐ　）ｉ：４ｔｌ断片は１５℃で一晩中Ｍ１３ベクタ
ーに継ぎ合わされた。
バクテリア宿主細胞はこの継ぎ合せ混合物によって形質
転換され、候補クローンは単離され、そしてそれらのプ
ラスミドＤＮＡはこれらクローンが適切な組換えＤＮＡ
５を含むように確実に配列された。１本鎖ＤＮＡは突然
変異生成のため調製された。
オリゴヌクレオチド（オリゴ＃１３２）は合成され、突
然変異生成を指示する部位で使用され、そしてＨｐ　ａ
　ＩはＴＧＦ−α−ＰＥ、。ＤＮＡにＰＥ、。のアミノ
酸位置２７２で導入された： ５’　ＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＴＡＡＣＣＣＧＴＣ３’　
（オリゴ＄１３２）突然変異生成を指示するこの部位の
１つの配列は、ＰＥ４０中の残基数２７２をフェニルア
ラニンからシスティンへの変換であった。この突然変異
生成はウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）らのＮａｔｕｒｅ、
第２９９巻：第７５６−７５８頁１９８２年で記載され
るように行なわれた。
新しく生成されたＨｐａＩ部位を有する候補クローンは
単離、配列され、突然変異した遺伝子配列の存在を有効
にした０次にこのクローンは５ｐｈＩとＳａｌ　Ｉによ
り切断される。ＴＧＦ−αのＣ末端５アミノ酸およびＰ
Ｅ、。のＮ末端７０アミノ酸を特定し、そして新しく導
入されたＨｐａＩ部位を有する２１０ｂｐ断片は単離さ
れ、モしてもとのｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０プラス
ミドにＳｐｈ　ｌ−８ａｌ　Ｉ部位でサブクローンされ
た。バクテリア宿主細胞は形質転換され、候補クローン
は単離され、そしてそのプラスミドＤＮＡは配列され、
このクローンが適切な組換えＤＮＡを有するように確実
にした。
便宜上、このクローンをｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０
−１３２と名付けた。ｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０−
１３２は５ｐｈＩとＨｐａＩにより消化され、３．９６
　ｋｂ　ＤＮＡ断片が単離された。ＴＧＦ−αのＣ末端
５アミノ酸およびＰＥ、。のＮ末端３２アミノ酸を継ぎ
、５ｐｈＩとＨｐａＩに融和な末端を有する合成オリゴ
ヌクレオチドカセット（オリゴ＃　１５３）は合成され
、そして消化されたｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１
３２に継ぎ合わされた： ５’　　（オリゴ＃　１５３） このヌクレオチド　カセットはＴＧＦ−α−ＰＲ，，Ｄ
ＮＡ中の変化と関係があり、残基２６５で特定するコド
ンを今度はアラニンを５′ 特定した。
便宜上、このプラスミドＤＮＡはｐ　ＴＡＣＴＧＦ５７
−ＰＥ４０−１３２，１５３と名付けた。バクテリア宿
主細胞はｐ　ＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２，１
５３ＤＮＡにより形質転換された。候補クローンは交雑
形成により確認され、単離され、そしてそれらのプラス
ミドＤＮＡは配列され、適切な組換えＤＮＡを有するよ
うに確実にされた。
ｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２゜１５３ＤＮＡ
はＨｐａＩと５ａｌＩにより消化され、そして３．９５
ｋｂベクターＤＮＡは単離された。ＰＥ４１１のアミノ
酸残基２７２から３０９を継ぎ合せ、ＨｐａＩと５ａｌ
Ｉに融和な末端を有する合成オリゴヌクレオチドカセッ
ト（オリゴ＃１４２）は合成され、そして３．９５ｋｂ
　　ｐＴＡＣＴＧＦ／ＰＥ４Ｏ−１３２，１５３ＤＮＡ
に継ぎ合わされた：３′ （オリゴ＃１４２） このオリゴヌクレオチドカセットは残基２８７でシステ
ィンを特定するコドンを変化させ、二のコドンが今度は
アラニンを特定した０便宜上、この突然変異したプラス
ミドＤＮＡはｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２．
１５３，１４２と名付けた。バクテリア宿主細胞はこの
プラスミドに形質転換され、そして候補クローンは交雑
形成により確認された。これらのクローンは単離され、
そしてこれらプラスミドＤＮＡは配列され、適切な組換
えＤＮＡを有するように確実にされた。ｐＴＡＣＴＧＦ
５７−ＰＥ４０−１３２゜・１５３，１４２プラスミド
はアラニンにより座１１　Ａ　＃ｊで置き換えられた両
方のシスティンをもちいてＴＧＦ−α−ＰＥ４０変異体
をエンコードした。そのため、前述した名命法に従うと
、ＴＧＦ−α−ＰＥ４．のこの修飾変換体はＴＧＦ−α
−ＰＥ、、ａＢと名付けられた。
ＴＧＦ−α−ＰＥ４．ａＢ遺伝子によりエンコードされ
たアミノ酸配列は表４に示す。
ＴＧＦ−α−ＰＥ４＠Ａｂ： クローン　ｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０はｓｐｈ　Ｉ
とＢ　ａ　ｍ　ＨＩにより消化されて、そして７５０ｂ
ｐ　　ＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ　断片（ＴＧＦ−αのＣ末
端５アミノ酸とＰＥ４０のＮ末端２５２アミノ酸を特定
する）は単離された。Ｍ１３ｍｐ１９ベクターはｓｐｈ
　ＩとＢ　ａ　ｍ　ＨＩにより切断され、そしてベクタ
ーＤＮＡは単離された。　７５０　ｂ　ｐ　　Ｓｐｈ　
Ｉ−ＢａｍＨＩ　ＴＧＦ−ａ−ＰＥ４１１断片は１５℃
で一晩中Ｍ１３ベクターＤＮＡへ継き合わされた。バク
テリア宿主細胞は継き合った混合物により形質転換され
、候補クローンは単離され、そしてそれらのプラスミド
ＤＮＡは配列され、これらクローンが適切な組換えＤ　
Ｎ　Ａ　ｓを有するように確実にされた。
−本鎖ＤＮＡは突然変異生成のために調製された。
オリゴヌクレオチド（オリゴ＄１３３）は合成され、そ
して突然変異生成を指示する部位に使用され、Ｂ　ｓ　
ｔ　ａＩＩ部位がＰＥ４．のアミノ酸位置３６９でＴＧ
Ｆ−α−ＰＥ４０に導入された： ５′ＧＡＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣ３′（オリゴ
＃１３３）この突然変異生成の１つの配列はセリン残基
をＰＥ４０の位置３６９でのセレオニンへの変換であっ
た。
新しく生成したＢｓｔｅＩＩ部位を有するＤＮＡクロー
ンは確認され、単離され、そして配列され、適切な組換
えＤＮＡが存在するように確実にされた。このクローン
は次にＡｐａＩと５ａｌｌの制限酵素により消化された
。新しく生成し九Ｂ　ｓ　ｔ　ｅＩＩ部位を有する１２
０ｂｐ挿入Ｉ）ＮＡ断片は単離され、そしてまたＡ　ｐ
　ａ　Ｉと５ａｌＩにより消化されたｐＴＡＣＴＧＦ５
７−ＰＥ４０に継き合わされた。バクテリア宿主細胞は
形質転換され、候補クローンは単離され、そして配列さ
れ、適切な組換えＤＮＡが存在するように確実にされた
。この新しく生成したプラスミドＤＮＡはｐＴＡＣＴＧ
Ｆ５７−ＰＥ４０−１３３と名付けられた。それはＢｓ
ｔｅＩＩとＡ　ｐ　ａ　Ｉにより消化され、そして２．
６５Ｋｂベクタ−ＤＮＡ断片は単離された。
ＢｓｔｅＩＩからＡ　ｐ　ａ　Ｉへのオリゴヌクレオチ
ドカセット（オリゴ＃１５５）は合成され、Ｂ　ｓ　ｔ
　ｅＩＩとＡ　ｓ　ａ　Ｉの制限酵素により消化された
　ｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３３から除去され
たＴＧＦ−α−ＰＦ、。領域を継いだ、このカセットは
またＢｓｔｅ　ＩＩとＡ　ｐ　ａ　Ｉの融和な末端に対
してヌクレオチド配列を特定した。
（オリゴ＃１５５） このヌクレオチドカセットはＰＥ４０の残基３７２と３
７９でシスティンに対するコドンをアラニンで特定され
るコドンに変化させた。オリゴヌクレオチドカセット＃
１５５は２．６５Ｋｂ　　ベクターＤＮＡ断片に継き合
わされた。バクテリア宿主細胞は形質転換され、候補ク
ローンは単離され、そして配列され、適切な組換えＤＮ
Ａが存在するように確実にされた。この新しく生成した
ＤＮＡはｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３３゜１５
５と名付けられた。それはアラニンにより座“Ｂ”で両
方のシスティンをもちいてＴＧＦ−α−ＰＥ４０変異体
をエンコードした。そのため、前述の名命法に従うとＴ
ＧＦ−α−ＰＥ、。のこの修飾変換体をＴＧＦ−α−Ｐ
Ｅ４０Ａｂと名付けた。ＴＧＦ−α−ＰＥ４０Ａｂ遺伝
子にエンコードされたアミノ酸配列は表５に示される。
ＴＧＦ−ａ−ＰＥ４．ａｂ： ＴＧＦ−α−ＰＥ４０ａＢをエンコードするｐＴＡＣＴ
ＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２゜１５３．１４２プラスミ
ドは５ａｌＩとＡｐａＩによって消化され、そしてその
結果生じた３、８Ｋｂベクタ−ＤＮＡ断片は単離された
。
ＴＧＦ−α−ＰＥ、。ＡｂをエンコードするｐＴＡＣ−
ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３３゜１５５プラスミドはま
た５ａｌＩとＡｐａＩにより消化され、モしてＰＥ４０
のアミノ酸残基３７２と３７９でシスティンからアラニ
ンへの変化を有するその結果生じた１４０ｂｐＤＮＡ断
片は単離された。これらの２つのＤＮＡは一緒に継ぎ合
わされ、そしてバクテリア宿主細胞に形質転換されるの
に使用された。候補クローンはｐＴＡＣＴＧＦ５７ＰＥ
４０−１３３，１５５からの放射性同位元素を使用して
識別された１４０ｂｐ　ＤＮＡを用いた交雑形成により
確認された。候補クローンからのプラスミドＤＮＡは単
離され。
そして配列され、適切な組換えＤＮＡの存在を確実にす
るようにされた。この新しく生成したＤＮＡクローンは
　ｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２，１５３，１
４２，１３３゜１５５と名付けられた。このプラスミド
はアラニンによって座１ｊＡ”と“Ｂ”で置き換えられ
たすべての４個のシスティンを用いてＴＧＦ−α−ＰＥ
４０変異体をエンコードした。
そのため、前述した名命法に従うと、ＴＧＦ−α−ＰＥ
４０のこの修飾変換体はＴＧＦ−α−ＰＥ、。ａｂと名
付けられた。ＴＧＦ−α−ＰＥ、。ａｂ遺伝子によりエ
ンコードされたアミノ酸配列を表６に示す。
夫１１土 ＤＮＡクローンを含む組換え体ＴＧＦ−α−ＰＥ４０の
変換形の構造ニジスティン残基の選択 Ｔ　Ｇ　Ｆ　−ａ　−Ｐ　Ｅ　４　＠　ａ　Ｂ　、Ｔ　
Ｇ　Ｆ　−ａ　−ＰＥ、。Ａｂ、及びＴＧＦ−ａ−ＰＥ
４．ａｂはまた座“Ａ”及び／又は座＃　Ｂ　＃＃にお
けるシスティン残基の除去によって構成されることもで
きる。ＴＧＦ−α−ＰＥ、。のこれらの変形の構造は次
のことを除いては実施例３に述べられたと全く同じに遂
行される。ＴＧＦ−α−ＰＥ４０ａＢに関してはオリゴ
ヌクレオチドカセット１５３を換えて位置２６５に与え
られるアラニンコドンが削除される。そしてオリゴヌク
レオチドカセット１４２を換えて位置２８７に与えられ
るアラニンコドンが削除される。ＴＧＦ−α−ＰＥ４０
Ａｂに関してはオリゴヌクレオチドカセット１５５を換
えて残基３７２及び３７９に与えられるアラニンコドン
が削除される。ＴＧＦ−α−ＰＥ、。
ａｂに関してはこの組換え体遺伝子を構成するために使
われるＤＮＡ断片がこの実施例に記載されたＴＧＦ−ａ
−ＰＥ４．ａＢとＴＧＦ−α−ＰＥ４０Ａｂ遺伝子から
引用される。
実施例５ ＴＧＦ−α−ＰＥ４．ＡＢ、ＴＧＦ−α−ＰＥ４０Ａｂ
、ＴＧＦ−ａ−ＰＥ、。ａＢ、及びＴＧＦ−α−ＰＲ，
。ａｂ蛋白質の生物学的活性 雑種融合蛋白質ＴＧＦ−α−ＰＥ４０ＡＢ。
ＴＧＦ−α−ＰＥ、、Ａｂ、、ＴＧＦ−ａ　−ＰＥ、、
ａＢ、ＴＧＦ−ａ−ＰＥ４．ａｂは細菌宿主内で発現さ
れ実施例１で述べられたように単離された。そして各蛋
白質はＡ４３１細胞膜小胞上の表皮成長因子レセプター
への放射能ラベルされた表皮成長因子の結合を阻害する
能力及び前述のＭＴＴ細胞増殖アッセイにおいて測定さ
れるようなＡ４３１細胞を殺す能力について特徴付けら
れる０次の表はこれらの蛋白質の生物学的活性を要約し
ている。
ＴＧＦ−α−ＰＥ、。ＡＢ ＴＧＦ−α−ＰＥ４０Ａｂ ＴＧＦ−ａ−ＰＥ４．ａＢ ＴＧＦ−ａ−ＰＥ、。ａ　ｂ 表皮成長因子 レセプター結合 ＩＣ，。ｎＭ Ａ４３１細胞 殺し ＥＣ，。ｐＭ 去」１乳−１ ＴＧＦ−ａ−ＰＥ４．ａｂのＴＧＦ−ａ領域の表皮成長
因子レセプターへ結合する他の「ターゲット試薬」への
置換 ＴＧＦ−α−ＰＥ、、の有用性はその表皮成長因子レセ
プターを有する細胞へ結合し殺す能力にある。他の「タ
ーゲット試薬」は、ＥＧＦレセプターに結合する本願発
明の改質されたＰＥ４ｏで雑種分子を作るのに用いるこ
とができる。例えば、表皮成長因子又はウロガストロン
又はショーブ（Ｓ　ｈｏｐｅ）ファイブローマウィルス
成長因子、又はバクシニア（ｖａｃｃｉｎｉａ）ウィル
ス成長因子のための遺伝子は、ＰＥ４０のための遺伝子
に連結され表皮成長因子−ＰＥ４０、又はウロガストロ
ン−ＰＥ４０、又はショープファイブローマウイルス成
長因子−ＰＥ４１１、又はバクシニアウイルス成長因子
−ＰＥ４．雑種融合蛋白質の合成を支配することに用い
られることができる。しかしながら、夫々の場合に於い
てここで述べられたＰＥ４１１への変形の一つ以上は１
表皮成長因子レセプターを有する細胞へのこれらの他の
雑種融合蛋白質の結合を改善する。
失１１ユ ＴＧＦ−α−ＰＥ、。のＴＧＦ−α領域の噴孔類細胞上
の他のレセプターへ結合する他の「ターゲット試薬」へ
の置換 本発明は；ＰＥ、ｌｌと他の「ターゲット試薬」との間
の雑種融合蛋白質のＰＥ、。領域の変形に関するもので
あると理解される６例えば、蛋白質と本願発明の変形Ｐ
Ｅ、。どの間に形成された、Ｘがインターロイキン２．
又はインターロイキン３、又はインターロイキン４、又
はインターロイキン６、又は成長因子から誘導された血
小板、又は特定の哺乳類細胞レセプターを認識し結合す
る何が他の蛋白質である一般弐Ｘ−ＰＥ、。の融合蛋白
質はそれら、の夫々の細胞レセプターに対しての改良さ
れた結合特性を有する。
叉１１−１ ヒトのケラチノサイトに対するＴＧＦ−α−ＰＥ、。ａ
ｂの生物学的活性 モスマン、ジェー・インミュノル・メソーズ６５　（Ｍ
ｏｓｓｍａｎｎ＊　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ−庄５）５５−６３頁（１９８３）の細胞増殖ア
ッセイを用いたところ、ＴＧＦ−α−ＰＥ４０ａｂは、
そのアッセイにおいて用いられるヒトのケラチノサイト
を容易に殺した。ケラチノサイトの５０％を殺すのに必
要なＴＧＦ−α−ＰＥ４０の濃度（ＥＤ５０）は１１ｎ
Ｍであった。
ａ　　２　　ａ　　ａ　　２　　’５　５　　’；ｊコ
　　　　　ロ、　　　　　コ　　　　　ｃｏ　　　　　
　Φ　　　　　Ｉ−１＋＞Ｑ己　　！　　５　　場　　
；　　召　　口　　勾ＪＬＵ−珈ｍ ＴＧＦ　−ａｌｐｈａ−ＰＥ４．ａｂアミノ酸シーケン
スＴｙｒ　Ｖａｌ　Ｐｈａ　Ｖａｌ　Ｇｈ　Ｔｙｒ　ｔ
ｕｓ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｌ
ａ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｓａｒ　ｎａ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　
ＧｌｙＧｌｙＶａｌＡｒｇＡｌａＡｎＳｅｒＧｉｎＡｓ
ｐＬａｕＡｓｐＡｌａＩＩｓＴｒｐムｒｇＧｌｙＰｈｅ
丁ｙｒＩＩｓＡｈＧｌｙ＾５ｐＰｒｏ＾１６　Ｌａｕ　
Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｇｉｎ＾ｓ
ｐ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ＾ｌａ　Ａｒｇ　
Ｇｌｙ　Ａｒｇ　ｌ１ｅＡｒｇ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｌ
ａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ
　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　
Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　ＡｒｇＴｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｓ
ｕ　ＴｈｒしＩ＾ｌａ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｌ
ａ　Ａｌａ　Ｇｂ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｒｇし
＊ｌ１ｅＧ＆旧１５４３　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　艮迫Ｐｒｏ　Ｌ＃ｕ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ａ
ｒｇし胆んｓｐ　Ａｌａ　ｎａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒ
ｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ
　Ｌａｕ　ＧｌｕＳ６３　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　５７３Ｔｈｒ　ｎａ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｔｒ
ｐ　Ｐｒｏ　Ｌｓｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ
　Ｖａｌ　Ｖａｌ　ｎａ　Ｐｒｏ　ＳｗにＬａ　ＩＩｓ
　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ＾ｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｖ
ａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｐｒ
ｏ　Ｓｅｒ　ｋｒ　Ｉｌａ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　
ｍｕ　Ｑｎ　Ａｌａ１１ｅ　Ｓｅｒ　ＡｌａＬａｕ　Ｐ
ｒｏ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ａｈ　Ｓａｒ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ
　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ｋｇ　Ｇニーんｙ
　Ｌａｕ　Ｌｙｓ図面の浄８（内容に変更なし）
【図面の簡単な説明】
図面は、実施例２の操作で得られたプラスミドを示す図
である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、少なくとも２つのシステイン残基 を、ジスルフィド結合を形成しない条件で同じか又は異
    なっていてもよい２つのアミノ酸で置換又は除去するこ
    とにより改変され、ターゲティング剤により認識された
    受容体に結合するタンパク質ターゲティング領域に結合
    した、ＰＥ＿４＿０領域よりなるハイブリッドタンパク
    質。 ２、ターゲティング剤が生長因子、ホル モン、又は抗体である請求項１記載のハイブリッドタン
    パク質。 ３、少なくとも２つのシステイン残基が 置換されている請求項１記載のハイブリッドタンパク質
    。 ４、４つのシステイン残基が置換されて いる請求項３記載のハイブリッドタンパク 質。 ５、少なくとも１つのシステイン残基が アラニンで置換されている請求項３記載のハイブリッド
    タンパク質。 ６、少なくとも２つのシステイン残基が アラニンで置換されている請求項３記載のハイブリッド
    タンパク質。 ７、４つのシステイン残基がアラニンで 置換されている請求項４記載のハイブリッドタンパク質
    。 ８、少なくとも１つのシステイン残基が、 ジスルフィド結合を形成しないアラニン以外のアミノ酸
    で置換されている請求項３記載のハイブリッドタンパク
    質。 ９、少なくとも２つのシステイン残基が、 ジスルフィド結合を形成しないアラニン以外のアミノ酸
    で置換されている請求項３記載のハイブリッドタンパク
    質。 １０、４つのシステイン残基が、ジスルフ ィド結合を形成しないアラニン以外のアミノ酸で置換さ
    れている請求項４記載のハイブリッドタンパク質。 １１、少なくとも２つのシステイン残基が 除去されている請求項１記載のハイブリッドタンパク質
    。 １２、４つのシステイン残基が除去されて いる請求項１１記載のハイブリッドタンパク質。 １３、２つのシステイン残基が、ジスルフ ィド結合を形成しないアミノ酸で置換されており、２つ
    のシステイン残基が除去されている請求項１記載のハイ
    ブリッドタンパク質。 １４、請求項１のハイブリッドタンパク質 をコードするＤＮＡを含有し、そして適切な原核生物又
    は真核生物宿主にハイブリッドタンパク質を発現させる
    のに適合したプラスミド。 １５、請求項１のハイブリッドタンパク質 をコードするＤＮＡを含有するプラスミドを、適切な原
    核生物又は真核生物宿主細胞に挿入し、ハイブリッドタ
    ンパク質が産生される条件下で宿主細胞を生長させるこ
    とよりなる請求項１のハイブリッドタンパク質を産生す
    る方法。 １６、細胞毒有効量の請求項１記載のハイ ブリッドタンパク質と、生理学的に許容される担体とを
    含有する組成物。 １７、請求項１のハイブリッドタンパク質 の細胞毒有効量からなる組成物を投与することよりなる
    、哺乳動物種に選択的細胞毒的活性を産生する方法。 １８、ハイブリッドタンパク質を、生理学 的に許容される担体を含有する組成物において投与する
    請求項１７記載の方法。 １９、ケラチン生成細胞の増殖を阻止する のに効果的な量の請求項１記載のハイブリッドタンパク
    質で、増殖細胞を処理することよりなるケラチン生成細
    胞の増殖を処理する方法。 ２０、ターゲティング剤が生長因子、ホル モン、又は抗体である請求項１９記載の方法。
JP2037126A 1989-02-17 1990-02-17 タンパク質抗ガン剤 Expired - Fee Related JPH07106159B2 (ja)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31254089A 1989-02-17 1989-02-17
US38909289A 1989-08-03 1989-08-03
US44918789A 1989-12-21 1989-12-21
US449,187 1989-12-21
US312,540 1989-12-21
US389,092 1989-12-21

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP7050281A Division JP2510846B2 (ja) 1989-02-17 1995-02-02 ＰＥ４０Ａｂを含有するタンパク質抗ガン剤

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH02276590A true JPH02276590A (ja) 1990-11-13
JPH07106159B2 JPH07106159B2 (ja) 1995-11-15

Family

ID=27405603

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2037126A Expired - Fee Related JPH07106159B2 (ja) 1989-02-17 1990-02-17 タンパク質抗ガン剤
JP7050281A Expired - Fee Related JP2510846B2 (ja) 1989-02-17 1995-02-02 ＰＥ４０Ａｂを含有するタンパク質抗ガン剤

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP7050281A Expired - Fee Related JP2510846B2 (ja) 1989-02-17 1995-02-02 ＰＥ４０Ａｂを含有するタンパク質抗ガン剤

Country Status (18)

Country Link
EP (1) EP0383599B1 (ja)
JP (2) JPH07106159B2 (ja)
KR (1) KR0169729B1 (ja)
AT (1) ATE133993T1 (ja)
AU (1) AU617039B2 (ja)
CA (1) CA2010256C (ja)
CY (1) CY1987A (ja)
DE (1) DE69025211T2 (ja)
DK (1) DK0383599T3 (ja)
ES (1) ES2085329T3 (ja)
FI (1) FI102383B1 (ja)
GR (1) GR3019836T3 (ja)
HK (1) HK15597A (ja)
IE (1) IE71934B1 (ja)
IL (1) IL93425A (ja)
NO (1) NO300595B1 (ja)
NZ (1) NZ232564A (ja)
PT (1) PT93178B (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0829101B2 (ja) * 1989-04-21 1996-03-27 アメリカ合衆国 組換え抗体―毒素融合タンパク質

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU631200B2 (en) * 1989-02-17 1992-11-19 Merck & Co., Inc. Production of modified pe40
IL98528A0 (en) * 1990-06-21 1992-07-15 Merck & Co Inc Pharmaceutical compositions containing hybrid for killing bladder cancer cells
GB2246779B (en) * 1990-08-03 1994-08-17 Delta Biotechnology Ltd Tumour-associated protease inhibitors targeted to tumour cells
AUPM959894A0 (en) * 1994-11-22 1994-12-15 Crc For Biopharmaceutical Research Pty Ltd Fusion proteins with cytotoxic activity against cells overexpressing erbb2-4
EP0965597A4 (en) * 1996-12-27 2003-01-08 Mochida Pharm Co Ltd CELL MEMBRANE EFFECTIVE DRUGS
JP2001525669A (ja) * 1997-05-12 2001-12-11 ネーデルランセ オルハニサチエ フォール トゥーヘパスト−ナツールウェーテンシャッペルック オンデルズク テーエヌオー 細胞遊走の阻害のための方法および構築物
GB0008802D0 (en) * 2000-04-10 2000-05-31 Univ London Molecule
JP4940136B2 (ja) * 2004-06-28 2012-05-30 イエダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド キメラタンパク質およびその使用
CN105766069B (zh) 2013-11-20 2019-04-16 株式会社村田制作所 多层布线基板及具备该多层布线基板的探针卡
JP6795813B2 (ja) * 2015-10-05 2020-12-02 国立研究開発法人産業技術総合研究所 がん細胞の検出方法、がん細胞内に物質を導入するための試薬、及びがん治療用組成物

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5993093A (ja) * 1982-10-19 1984-05-29 シ−タス・コ−ポレイション 変形されたインターロイキン―２及びその製造方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI82266C (fi) * 1982-10-19 1991-02-11 Cetus Corp Foerfarande foer framstaellning av il-2 -mutein.
US4545985A (en) * 1984-01-26 1985-10-08 The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins
US4892827A (en) * 1986-09-24 1990-01-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects
AU641392B2 (en) * 1989-04-21 1993-09-23 Protein Design Laboratories, Inc. Recombinant antibody-toxin fusion protein

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5993093A (ja) * 1982-10-19 1984-05-29 シ−タス・コ−ポレイション 変形されたインターロイキン―２及びその製造方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0829101B2 (ja) * 1989-04-21 1996-03-27 アメリカ合衆国 組換え抗体―毒素融合タンパク質

Also Published As

Publication number Publication date
CY1987A (en) 1997-09-05
DK0383599T3 (da) 1996-08-05
FI102383B (fi) 1998-11-30
EP0383599A3 (en) 1991-03-27
CA2010256C (en) 2000-07-25
KR0169729B1 (ko) 1999-01-15
KR900012626A (ko) 1990-09-01
HK15597A (en) 1997-02-14
DE69025211T2 (de) 1996-09-19
EP0383599B1 (en) 1996-02-07
CA2010256A1 (en) 1990-08-17
EP0383599A2 (en) 1990-08-22
IE71934B1 (en) 1997-03-12
NO300595B1 (no) 1997-06-23
ES2085329T3 (es) 1996-06-01
DE69025211D1 (de) 1996-03-21
JPH07278200A (ja) 1995-10-24
FI900783A0 (fi) 1990-02-16
FI102383B1 (fi) 1998-11-30
JP2510846B2 (ja) 1996-06-26
NO900758D0 (no) 1990-02-16
JPH07106159B2 (ja) 1995-11-15
ATE133993T1 (de) 1996-02-15
NO900758L (no) 1990-08-20
AU617039B2 (en) 1991-11-14
GR3019836T3 (en) 1996-08-31
IL93425A0 (en) 1990-11-29
PT93178B (pt) 1996-04-30
NZ232564A (en) 1992-08-26
AU4994690A (en) 1990-08-23
IL93425A (en) 1999-08-17
PT93178A (pt) 1990-08-31
IE900587L (en) 1990-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0467536B1 (en) Method of treating bladder cancer cells
CA2941466C (en) Mutated pseudomonas exotoxins with reduced antigenicity
JPH05500068A (ja) 可溶性一本鎖ｔ細胞レセプター
Edwards et al. Epidermal growth factor receptor binding is affected by structural determinants in the toxin domain of transforming growth factor-alpha-Pseudomonas exotoxin fusion proteins
JPH02276590A (ja) タンパク質抗ガン剤
Kreitman Recombinant immunotoxins for the treatment of chemoresistant hematologic malignancies
CA1340805C (en) Nucleotide sequence incoding plant ribosome inactivating protein
AU632995B2 (en) Cell specific cytotoxic agents
Frankel et al. High-level expression and purification of the recombinant diphtheria fusion toxin DTGM for PHASE I clinical trials
Choe et al. B3 (Fab)-PE38M: a recombinant immunotoxin in which a mutant form of Pseudomonas exotoxin is fused to the Fab fragment of monoclonal antibody B3
Debinski et al. An immunotoxin with increased activity and homogeneity produced by reducing the number of lysine residues in recombinant Pseudomonas exotoxin
US5681810A (en) Diphtheria toxin fragments, conjugates and methods of use to inhibit tumors and leukemia
US5621078A (en) Modified pseudomonas exotoxin PE40
CA2012732C (en) Production of modified pe40
FitzGerald et al. Generation of chimeric toxins
US6207798B1 (en) Modified PE40 toxin fusion proteins
Riemen et al. Modified pseudomonas exotoxin PE 40
AU631200B2 (en) Production of modified pe40
NZ238583A (en) Targetted cytotoxic anticancer conjugates and
Cui et al. Construction and expression of novel immunotoxin cpIL-4 (13D)-PE38KDEL with increased activity
CA1271900A (en) Toxin conjugates
JPH07188290A (ja) アブリンａ鎖変異体およびその製造法

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Cancellation because of no payment of annual fees