JPH07188290A - アブリンａ鎖変異体およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】配列番号１〜３に代表される天然型アブリンＡ
鎖の２０２番目のアミノ酸にセリンまたはアラニンを挿
入したアブリンＡ鎖変異体。 【効果】本発明のアブリンＡ鎖変異体が得られることに
より、活性の高いアブリンＡ鎖を大量にかつ純粋に生産
できるものである。また、抗体分子との架橋反応効率に
優れたアブリンＡ鎖変異体が得られることにより抗体毒
素複合体等の医薬品の原料としてアブリンＡ鎖を利用す
ることが可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アブリンＡ鎖を遺伝子
操作の手法を用いて製造するための、アブリンＡ鎖を暗
号化しているＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を発現可能な形
で組み込んだ発現プラスミド、該発現プラスミドで形質
転換された大腸菌、および該大腸菌形質転換株を用いた
アブリンＡ鎖の製造法に関する。ここでのアブリンＡ鎖
はアミノ酸配列を変更して得られる組換え型アブリンＡ
鎖の変異体を含み、本発明では活性、あるいは抗体分子
との架橋反応効率を改変するアブリンＡ鎖のアミノ酸配
列を提供している。この技術により抗体毒素複合体等の
医薬品の原料としてアブリンＡ鎖を利用することが可能
となる。

【０００２】

【従来の技術】近年、毒性物質をモノクローナル抗体等
と結合させた抗体毒素複合体を用いて疾病の原因となる
細胞を特異的に障害し、疾病を治療しようとするターゲ
ット療法の研究が盛んに行われている（Ｆｒａｎｋｅｌ
ら（１９８８）Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ，Ｋｌｕｗｅ
ｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐａｂｌｉｓｈｅｒｓ）。特に
腫瘍特異的モノクローナル抗体を利用した制癌剤として
の研究が盛んに行なわれ、臨床応用の試みもなされてい
る（Ｗａｗｒｚｙｎｃｎａｋ，Ｅ．Ｊ．ａｎｄＤｅｒｂ
ｙｓｈｉｒｅ，Ｅ．Ｊ．（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ Ｔｏｄａｙ１３，３８１−３８３）。

【０００３】抗体毒素複合体に用いる毒性物質として
は、一般にジフテリア毒素や植物種子中に存在する植物
毒素などの細胞障害性毒素蛋白質や、放射性物質、ある
いは抗癌剤等が用いられている。このうち、植物種子中
に存在する植物毒素であるリボソーム不活化蛋白（ＲＩ
Ｐ）は、リボソームＲＮＡ中の特定の塩基のＮ−グルコ
シド結合を切断することによってリボソームを不活化す
る酵素であることが知られている。細胞内で繰り返しリ
ボソームを不活化するため、少量で大きな細胞殺傷能力
を有しており、抗体毒素複合体の毒素部分として有用で
ある。

【０００４】抗体毒素複合体の毒素部分に用いられてい
るＲＩＰとしては、ヒマ種子に含まれるリシンＡ鎖が広
く用いられている。しかしながら、毒素部分としてリシ
ンＡ鎖を用いる場合には、リシンＡ鎖の持つ非特異的な
肝毒性が問題とされている。リシンＡ鎖の肝毒性はリシ
ンＡ鎖中に存在する糖鎖と肝細胞上のマンノースレセプ
ターとの親和性に起因すると考えられており（Ｓｋｉｌ
ｌｅｔｅｒ，Ｄ．Ｎ．らＢｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ Ａｃｔａ ８４２，１２−２１）、これを回避する
ために酵母マンナンを添加したり、酵素的、化学的にリ
シンＡ鎖の糖鎖をはずしたり、遺伝子組換え技術を用い
て作製した糖鎖を持たないリシンＡ鎖を用いる試みもな
されている（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ｌ ａｎｄＤｏｖ
ｅｙ，Ｈ．Ｆ．（１９９２）Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｍｍ
ｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ５，３７−５９）。しか
しながら、酵素的、あるいは化学的な方法では糖鎖の完
全な除去は困難であり、また、遺伝子組換え型のリシン
Ａ鎖では大腸菌菌体中で不溶化しやすいなどの問題があ
る（Ｐｉａｔａｋ，Ｍ．ら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６３，４８３７−４８４３））。

【０００５】東南アジアに自生するトウアズキ（Ａｂｒ
ｕｓ ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓ）種子中に含まれるＲＩ
ＰであるアブリンのＡ鎖は、リシンＡ鎖と類似の植物毒
素であるが、糖鎖を持たないためリシンＡ鎖に見られる
ような肝細胞への非特異的吸着が小さく、抗体毒素複合
体として用いた場合、非特異的な毒性が低減できること
から、抗体毒素複合体の毒素部分としてリシンＡ鎖より
も有用であると考えられる。

【０００６】しかしながらトウアズキは人為的にほとん
ど栽培されておらず、医薬品の原料として産業上利用す
るためには、遺伝子組換え型のアブリンＡ鎖の大量産生
技術と精製技術の確立が望まれている。遺伝子組換え型
アブリンＡ鎖においては、人為的にアミノ酸配列を変更
することが可能となるため、蛋白工学的手法により抗体
毒素複合体の毒素部分としてさらに有用な諸性質を付加
し、改良することも可能となる。例えば、抗体のＦａ
ｂ’のヒンジに存在するシステインとアブリンＡ鎖に一
つだけ存在するシステインのチオール基間をジマレイミ
ド等の架橋剤で架橋反応を行って複合体を作製するとき
システイン残基の位置を人為的に移動してチオール基を
アブリンＡ鎖分子の表面に露出させることが出来れば、
架橋反応効率を向上させることが出来よう。

【０００７】ところが、現在までアブリンａＡ鎖の大腸
菌等に於ける大量発現に成功した例はなく、遺伝子組み
換え型アブリンＡ鎖の変異体についての報告もなされて
いない。さらに、船津らによって天然型アブリンａＡ鎖
のアミノ酸配列として報告されているアミノ酸配列（船
津ら（１９８８）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５
２，１０９５−１０９７）に基づいて遺伝子を化学合成
して得られる大腸菌組換え型アブリンＡ鎖にはＲＩＰ活
性が非常に低いことが後述の実施例で示された。

【０００８】

【本発明が解決しようとする課題】本発明は、前に述べ
た問題点を解消し、活性の有るアブリンＡ鎖を大量かつ
純粋に生産する系を構築することを目的に、大腸菌を宿
主としたアブリンＡ鎖の発現系を開発したものである。
この方法を用い、アミノ酸配列を変更して得られる組換
え型アブリンＡ鎖の変異体を作製することでＲＩＰ活性
のみならず他分子との相互作用を改変する物性を添加す
ることを可能とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、遺伝子操作の
手法を用いてアブリンＡ鎖変異体を製造するための、ア
ブリンＡ鎖変異体を暗号化する合成遺伝子、該遺伝子を
組み込んだ大腸菌を宿主とするアブリンＡ鎖発現プラス
ミド、該プラスミドによる大腸菌形質転換体、該大腸菌
形質転換体を用いたアブリンＡ鎖の製造法、およびアブ
リンＡ鎖複合体を提供するものである。

【００１０】アブリンＡ鎖変異体を暗号化する遺伝子断
片として、既に知られている天然のアブリンａＡ鎖のア
ミノ酸配列（船津ら（１９８８）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．５２，１０９５−１０９７）を暗号化す
るように作られた合成ＤＮＡ断片を用いることが可能で
ある。この場合、大腸菌における使用頻度に合うように
ＤＮＡ配列を設計すれば好ましい。また、等変異体作製
が容易であるよう、特有な制限酵素切断部位が遺伝子内
および両端に散在するようにＤＮＡ配列を設計するとよ
り好ましい。ただし、アブリンＡ鎖のリボゾーム不活化
活性（ＲＩＰ活性）を発現するためには２０２番目に配
列番号１に示すようにセリン、もしくは配列番号２に示
すようにアラニンを暗号化する配列を添加するのがよ
い。また、このように合成されたＤＮＡ断片の前にメチ
オニンあるいは大腸菌体外への分泌を指令するペプチド
等を暗号化するＤＮＡ断片を連結することでアブリンＡ
鎖の発現部位をコントロールすることが可能である。

【００１１】化学合成されたＤＮＡオリゴマーから蛋白
質を暗号化するＤＮＡ断片を作る技術は既に幾つかの報
告が有る（大塚、岩井（１９８６）細胞工学５．４０２
−４１１）。これらの方法に準じれば上に示したアブリ
ンＡ鎖変異体を暗号化するＤＮＡ断片を得ることが出来
る。

【００１２】上で述べたアブリンＡ鎖変異体を暗号化す
るＤＮＡ断片を、大腸菌を宿主として発現させるために
は、その前にｍＲＮＡ合成とｍＲＮＡから蛋白質翻訳を
行わせるための遺伝子発現系を連結しておく必要があ
る。この発現系は産生物質が宿主の増殖に対して不利に
はたらかないよう、添加物質や温度などの培養条件を変
化させることで誘導することが可能であるものの方が好
ましい。このような例としては、ラクトースプロモータ
ー、トリプトファンプロモーター、ＰＬプロモーターな
どがあるが、Ｔ７ファージプロモーター下に挿入したア
ブリンＡ鎖遺伝子を、ラクトースプロモーター下に制御
されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより発現させる系
（Ｆ．Ｗｉｌｌｉａｍら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ１８９．１１３〜１３０）が好ましい。このＴ７の
系のプラスミドベクターであるｐＥＴ８ｃに配列番号１
のアブリンＡ鎖変異体を暗号化するＤＮＡ断片を挿入し
たｐＥＴ８−ＡＡ（＋Ｓｅｒ）、あるいは配列番号２の
アブリンＡ鎖変異体の配列を暗号化するＤＮＡ断片を挿
入したｐＥＴ８−ＡＡ（＋Ａｌａ）を用いることは活性
のある組換え型アブリンＡ鎖を得るのに適している。

【００１３】上に述べたアブリンＡ鎖変異体を発現でき
るように構成されたプラスミドベクターで大腸菌を形質
転換する。Ｔ７発現系を用いる場合はＢＬ２１株の様な
ラックプロモーター下流にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝
子を持つλファージλＤＥ３の溶原菌を用いるのが好ま
しい。

【００１４】得られた形質転換体を公知の培地を用いて
発現すれば、アブリンＡ鎖変異体を得ることが出来る。
Ｔ７発現系を用いる場合には、例えば５０ｍｇ／ｌのア
ンピシリンを含むＬＢ 培地で菌体をＯＤ（６００ｎ
ｍ）で０・９まで増殖した後、０．４ｍＭとなるように
イソプロピルチオガラクトピラノシドを添加し更に３時
間培養することでアブリンＡ鎖変異体の発現を誘導する
ことが出来る。菌体内に蓄積されたアブリンＡ鎖変異体
は、大腸菌を超音波や凍結融解により破壊した後クロマ
トグラフィー、塩析、限外漉過、電気永動等の通常の蛋
白質精製法で純粋なアブリンＡ鎖変異体を得ることが出
来る。クロマトグラフィーはＢｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ
やＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの様なＢｌｕｅ色素架
橋担体とＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）やＱＡＥ
（第四級アミノエチル）等の陰イオン交換体を組み合せ
ることで天然からの抽出精製より少工程で高純度のアブ
リンＡ鎖変異体を得ることが出来る。このとき、大腸菌
破壊物を硫安沈殿やゲル濾過等によって１０〜１００ｍ
Ｍ程度の濃度でｐＨを中性領域としたリン酸緩衝液等の
溶液とし、同緩衝液で平衡化した培養液のおよそ１／２
０倍容以下のＢｌｕｅ色素架橋担体カラムに添加後洗浄
し、０．５〜１Ｍ程度のＮａＣｌ等で塩濃度を上昇させ
た同緩衝液で効率良くアブリンＡ鎖変異体を溶出して濃
縮することができる。更にこのアブリンＡ鎖変異体溶液
を透析等によって、アブリンＡ鎖の等電点よりアルカリ
領域、例えばｐＨ８前後とした１０ｍＭ程度のリン酸緩
衝液等の溶液とし、培溶液のおよそ１／５０倍容以下の
陰イオン交換樹脂カラムに添加後洗浄し、例えばＮａＣ
ｌ等による塩濃度勾配上昇させた同緩衝液あるいはｐＨ
の低化でカラムから溶出されるアブリンＡ鎖の画分を分
取することでアブリンＡ鎖変異体を純化できる。このカ
ラム操作中は２−メルカプトエタノ−ルを共存させるこ
とが精製アブリンＡ鎖変異体の安定上更にのぞましい。

【００１５】得られるアブリンＡ鎖は既報の配列では活
性が無く、配列番号１あるいは配列番号２のように既報
の配列にセリンやアラニンを２０２番目に加えた組換え
型ではじめて天然型のアブリンＡ鎖と同等以上のＲＩＰ
活性を持つことが示された。

【００１６】上に述べた技術を用い、合成ＤＮＡの配列
を遺伝子操作によりさらに置換・削除・挿入することで
アミノ酸配列を変異させたアブリンＡ鎖変異体を得るこ
とが出来る。これは一般的な遺伝子組換え技術により行
い得るが、設計された制限酵素認識配列部位を利用し、
両端に対応する制限酵素部位を配した合成ＤＮＡ断片あ
るいはＰＣＲによる増幅断片を置換挿入することにより
容易に達成することが出来る。この変異体作製により、
アブリンＡ鎖にターゲット療法薬としてより有利な物性
を付与することも可能となる。例えば、特定の生体物質
と親和性を持つ抗体等の分子と架橋反応を行うとき、ア
ブリンＡ鎖にただ一つ存在するシステインのチオール基
を架橋剤の反応対象として利用することは一般的だが、
このシステインは疎水性度の高いカルボキシル末端付近
に存在し高い反応効率は得られない。これに対して、ア
ミノ末端の様な親水性が高く分子表面への露出度が高い
部位にシステインを移行させたアブリンＡ鎖では架橋効
率を増進させ得る。配列番号３に示したアミノ酸配列は
この例であり、２４７番目（天然型アブリンＡ鎖の２４
６番目にあたる）のシステイン残基をアラニンに置換
し、Ｎ末端から２番目にシステイン残基を挿入した変異
体である。このアミノ酸配列を暗号化するＤＮＡ断片を
ｐＥＴ８ｃ挿入したプラスミドｐＥＴ８−ＡＡ（Ｃｙｓ
² ）を用いて得られたアブリンＡ鎖は、抗体のＦａｂ’
とジマレイミドリンカーで架橋反応（反応条件は実施例
８に示した）を行ったときの反応効率を従来の２倍に向
上させることを可能とした。この時、アブリンＡ鎖変異
体と架橋する分子は実施例８で示した様なガン細胞表面
抗原を認識し、速やかに細胞内に取り込まれるモノクロ
−ナル抗体であるＸＦ−８（ヒト肺癌株化細胞を用いて
作製された（Ｈ．Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９８９）Ｈ
ｅｐａｔｏｌｏｇｙ９．６２５）のＦａｂ´以外の抗体
またはその断片、さらには標的細胞表面に特異的に発現
している受容体に対するリガンドを用いることも可能で
ある。これらの分子には望ましくは１つ、あるいはそれ
以上のチオ−ル基が存在しているか組換えＤＮＡ技術を
用いたり化学的に導入されていると、変異型アブリンＡ
鎖のチオ−ル基との間の架橋をメチルエ−テルの両端に
マレイミド基を持つＢＭＭＥ（ビスマレイミドメチルエ
−テル）等のジマレイミドリンカ−の様なチオ−ル基反
応性二価性架橋剤により、例えば０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ６．２）の様な中性付近から弱酸性の水溶液中、
４℃〜３７℃程度の温和な反応条件下で行うことができ
る。架橋剤にＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２
−ピリジルジチオン）プロピオネイト）やＥＭＣＳ（Ｎ
−（ε−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド）
等を用いて抗原結合性分子のアミノ基と変異型アブリン
Ａ鎖のチオ−ル基間で連結する際も同様の効果が期待で
きる。

【００１７】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明する。以下に述べる遺伝子操作の一般的手法は、マニ
ュアル書（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）および試薬の仕様に従っ
た。

【００１８】実施例１ アブリンＡ鎖を暗号化するＤＮＡ断片の合成 公知のアブリンａＡ鎖アミノ酸配列（船津ら（１９８
８）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５２，１０９５
−１０９７）を基に、それを暗号化するＤＮＡ断片を図
１，２の様に設計した。（図１，２は第１段は塩基番
号、第２段＜＞はセンスＤＮＡ合成オリゴマー番号、第
３段はセンスＤＮＡ配列、第４段／は制限酵素切断部位
と制限酵素名、第５段はアンチセンスセンスＤＮＡ配
列、第６段＜＞はアンチセンスＤＮＡ合成オリゴマー番
号、第７段はアミノ酸配列を示す。）このＤＮＡ断片に
は成熟型アブリンａＡ鎖の蛋白質を暗号化する部分に加
え、前部にメチオニン（アミノ酸配列上１番とした）を
暗号化するＤＮＡ、後部には終止コドンＴＧＡ ＴＡＧ
を連結して付加した。更に全ＤＮＡ断片の５’側および
３’側にはそれぞれＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩおよびＢａｍ
ＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、また遺伝子の随意に特有の制限
酵素切断部位を設けた。設計にあたってコドンの使用頻
度が大腸菌のそれに近くなるよう留意した。

【００１９】このように設計したＤＮＡ断片を図１，２
に示す様に＜ＡＢＲ１＞から＜ＡＢＲ２６＞および＜Ａ
ＢＲａ＞から＜ＡＢＲｚ＞の計５２本のＤＮＡオリゴマ
ーに分けて合成した。このうち＜ＡＢＲ１＞から＜ＡＢ
Ｒ１１＞および＜ＡＢＲａ＞から＜ＡＢＲｋ＞の２２本
と＜ＡＢＲ１２＞から＜ＡＢＲ２６＞および＜ＡＢＲｌ
＞から＜ＡＢＲｚ＞の３０本を各々別個にアニーリン
グ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるライゲーション反応を行
った。反応液をアガロースゲル電気泳動により分離後、
各々約３３０ｂｐと４７０ｂｐ付近のＤＮＡバンドを切
り出しＤＮＡを溶出精製した。これら２つの断片とＥｃ
ｏＲＩとＸｂａＩで完全に消化したプラスミドｐＵＣ１
９を混合しＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーション
した。このライゲーション混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９を形質転換した。得られたアンピシリン耐性
を示す形質転換株の中で、抽出したプラスミドがＥｃｏ
ＲＩとＸｂａＩ消化により約８００ｂｐのＤＮＡ断片を
生じたｐＵＣＡＡ−４を選択した。ｐＵＣＡＡー４のＥ
ｃｏＲＩからＸｂａＩまでの塩基配列を決定したところ
図１，２に示す配列と完全に一致し、目的のアブリンａ
Ａ鎖を暗号化するＤＮＡ断片を取得することが出来た。

【００２０】２．ｐＥＴ８−ＡＡの作製 Ｔ７ファージプロモーター下に目的の遺伝子が挿入され
たプラスミドベクターで、ラックプロモーター下流にＴ
７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つλファージλＤＥ３
の溶原菌を形質転換することにより、ＩＰＴＧ（イソプ
ロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド）等を培養
液に添加したときに特異的に遺伝子産物を発現させるこ
とが可能である（Ｆ．Ｗｉｌｌｉａｍら（１９８６）
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ１８９．１１３〜１３０）。この
Ｔ７の系のプラスミドベクターであるｐＥＴ８ｃのＮｃ
ｏＩとＢａｍＨＩの切断部位に、実施例１で取得したｐ
ＵＣＡＡー４のＮｃｏＩとＢａｍＨＩ消化によって生じ
る約７５０ｂｐのアブリンａＡ鎖遺伝子部分をＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結した。反応物を用いてＥ．ｃｏ
ｌｉＨＢ１０１を形質転換し、得られたアンピシリン耐
性株の中から、抽出したプラスミドがＮｃｏＩとＢａｍ
ＨＩ消化により約７５０ｂｐのアブリンａＡ鎖遺伝子断
片を生じるｐＥＴ８−ＡＡ（図３）を保持するものを得
た。

【００２１】３．ｐＥＴ８−ＡＡ（＋Ｓｅｒ）、ｐＥＴ
８−ＡＡ（＋Ａｌａ）の作製 ｐＥＴ８−ＡＡを基に２０２番目にセリン、アラニンを
暗号化するＤＮＡ配列を添加したプラスミドを、図３で
示す概略のごとく作製した。センスプライマーとして図
４に示した２０２番にセリンを暗号化するＡＧＴを導入
した配列を持つ＜ｒＡＡ＋Ｓｅｒ＞４６ｍｅｒを合成
し、アンチセンスには図１，２で示した合成ＤＮＡ＜Ａ
ＢＲｚ＞を用いてｐＥＴ８−ＡＡを鋳型にＰＣＲを行っ
た。ＰＣＲの条件は、ｐＥＴ８−ＡＡを１ｎｇ、５０ｍ
Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％（Ｗ／Ｖ）
ゼラチン、 ２５０μＭ ｄＮＴＰｓ、センス・アンチ
センスプライマー各１．０μＭ、２．５ ｕｎｉｔｓ
ＡｍｐｌｉｔａｑＴＭＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ、宝酒造）の
組成で反応溶液１００μｌを調製し、９４℃ １分、５
０℃ ２分、７２℃ ３分インキュベーションを２５サ
イクル行った。得られた約２００ｂｐのＰＣＲ増幅ＤＮ
Ａ断片をＸｈｏＩとＢａｍＨＩ消化した後、アガロース
ゲル電気泳動によりＤＮＡバンドを切り出し溶出精製し
た。他方でｐＥＴ８−ＡＡを同様にＸｈｏＩとＢａｍＨ
Ｉ消化した後、アブリンａＡ鎖のＣ末端に相当するおよ
そ１８０ｂｐの断片を除いた。除去したＣ末端断片に代
えてＳｅｒ２０２を含むＰＣＲ断片をライゲーション反
応により挿入した。ライゲーション混合物を用いてＥ．
ｃｏｌｉＨＢ１０１を形質転換した。得られたアンピシ
リン耐性を示す形質転換株の中で、抽出したプラスミド
が＜ｒＡＡ＋Ｓｅｒ＞に導入した制限酵素ＡｆｌＩＩ
（ｐＥＴ８−ＡＡはＡｆｌＩＩ認識配列を持たない）で
切断されることで目的のプラスミドｐＥＴ８−ＡＡ（＋
Ｓｅｒ）を保持するクローンを選択した。

【００２２】ｐＥＴ８−ＡＡ（＋Ａｌａ）はセンスプラ
イマー＜＋Ａｌａ＞を図５のように合成し、ｐＥＴ８−
ＡＡ（＋Ｓｅｒ）と同様の方法で作製した。

【００２３】４．ｐＥＴ８−ＡＡ、ｐＥＴ８−ＡＡ（＋
Ｓｅｒ）、ｐＥＴ８−ＡＡ（＋Ａｌａ）を用いたアブリ
ンＡ鎖変異体の発現 ラックプロモーター下流にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝
子を持つλファージλＤＥ３の溶原菌ＢＬ２１株を、プ
ラスミドｐＥＴ８−ＡＡ、ｐＥＴ８−ＡＡ（＋Ｓｅ
ｒ）、ｐＥＴ８−ＡＡ（＋Ａｌａ）で各々形質転換し
た。５０ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬ培地で形質転
換体をＯＤ（６００ｎｍ）＝０．９まで振盪培養し、最
終０．４ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（イソプロピル−β
−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド）を添加して更に３０
℃で３時間培養を続けた。菌体を遠心分離により採取
し、培養液の１／５容のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍ
ｌｉの系）サンプルバッファーに懸濁した後、煮沸処理
してＳＤＳ−ＰＡＧＥのサンプルとした。同時に、遠心
分離により採取した菌体を培養液の１／１０容のＴＥ
（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ）に懸濁後、凍結融解及び超音波により破壊
した。これをマイクロ遠心機で１５Ｋｒｐｍ、３０分遠
心分離し、上清を可溶性蛋白質画分としてＴＥと等量の
２倍濃度ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーと混合、
沈殿を不溶性蛋白質画分としてＴＥの２倍容のＳＤＳ−
ＰＡＧＥサンプルバッファーに懸濁してＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅのサンプルとした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離後、
蛋白質をＰＶＤＦ膜にセミドライ転写しウサギ抗アブリ
ンａＡ鎖抗体、ＨＲＰ標識ヒツジ抗ウサギＩｇＧ抗体で
処理し、コニカイムノステインで抗アブリンａＡ鎖抗体
と反応するバンドを発色検出した。図６にはｐＥＴ８ー
ＡＡの形質転換体の結果を示すが、３種のプラスミドに
よる形質転換体はいずれも天然アブリンＡ鎖と等しい移
動度を持ち、アブリンａＡ鎖抗体と反応する分子を可溶
性画分に発現していることが確認された。濃度既知の天
然型のアブリンａＡ鎖（０．１μｇ）のバンドの濃度と
の比較により培養液１ｌ当りの重量に換算すると約５０
ｍｇの組換え型アブリンＡ鎖を発現していると換算され
た。（図６においてＴ：大腸菌総蛋白（全蛋白）、Ｓ：
可溶性画分（超音波破壊後の遠心上清）、Ｐ：不溶性画
分（超音波破壊後の遠心沈殿）、ｎＡ：天然型アブリン
Ａ鎖０．１μｇを示す。） ５．大腸菌生産アブリンＡ鎖の精製 図７に代表例として、ｐＥＴ８−ＡＡを用いた形質転換
体からのアブリンａＡ鎖の各精製工程におけるＳＤＳー
ＰＡＧＥの結果［ＳＤＳーＰＡＧＥ（１２％）により分
離後、クーマシー染色を行ったもの］を示したが、アブ
リンＡ鎖と親和性のあるＣｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ
３ＧＡの架橋担体（ＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−
６Ｂ：ファルマシア社製）と陰イオン交換体カラムを組
み合せることで、天然からのアブリンａＡ鎖の抽出精製
より少工程で高純度のアブリンａＡ鎖を得ることが出来
た。尚、以下に示す精製工程には常に０．１％の２−メ
ルカプトエタノールを共存させた。

【００２４】ｐＥＴ８−ＡＡ、ｐＥＴ８−ＡＡ（＋Ｓｅ
ｒ）あるいはｐＥＴ８−ＡＡ（＋Ａｌａ）による大腸菌
ＢＬ２１の形質転換体について、実施例４で示したよう
に発現誘導を行った後、菌体を遠心分離により採取し、
培養液の１／１０容のＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し、凍結
融解・超音波により菌体を破壊した。１５Ｋｒｐｍ、３
０分の遠心分離で未破壊の菌体及び破壊断片を除き、上
清をＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５（ファルマシア）により５
０ｍＭリン酸緩衝（ｐＨ６．８）溶液とした。培養液の
１／２０容のＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂ
（ファルマシア）カラムに一晩循環添加後、５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を用いて未吸着画分を洗浄し
た。吸着画分を１ＭのＮａＣｌを含む同リン酸緩衝液に
より溶出させ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に
対して透析を行った。透析後培養液の１／５０容のＤＥ
ＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ（ファルマシア）に添加し、１
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、０−
２５０ｍＭ ＮａＣｌ濃度勾配溶出を行い、純粋なアブ
リンａＡ鎖の溶出画分を得た。最終精製収率は収率は培
養液１ｌ当り４０〜４３．７ｍｇであった。ｐＥＴ−Ａ
Ａ（＋Ｓｅｒ），ｐＥＴ８−ＡＡ（＋Ａｌａ）およびｐ
ＥＴ８−ＡＡ（Ｃｙｓ² ）を用いた形質転換体からのア
ブリンＡ鎖変異体は同様に精製され、ｐＥＴ８−ＡＡ
（＋Ｓｅｒ）産生アブリンＡ鎖変異体についてはアミノ
酸分析とＮ末端配列解析により、実施例１〜３で設計し
たＤＮＡに従って蛋白質が発現されていることを確かめ
た。

【００２５】６．大腸菌生産アブリンＡ鎖のリボゾーム
不活化活性の測定 リボゾーム不活化活性測定は、ウサギ網状赤血球の系を
用いた蛋白合成の阻害度を計量することにより行った。
網状赤血球ライセートの調製、無細胞翻訳反応の条件は
Ｏｌｉｖｅｒ等の方法（Ｐｒｅｓｓ，Ｏ．Ｗ．，Ｍａｒ
ｔｉｎ，Ｐ．Ｊ．ら（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅ
ｔｔ．１４．３７−４１）に従った。反応終了後、グラ
スフィルターに吸着した蛋白質に取り込まれた³ Ｈ−Ｌ
ｅｕを液体シンチレーションカウンターにて測定し、ア
ブリンＡ鎖非共存時のカウントを１００％として蛋白合
成度を表した。図８に示したごとく既報の天然のアブリ
ンａＡ鎖のアミノ酸配列（船津ら（１９８８）Ａｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５２，１０９５−１０９７）
に従って作製されたｐＥＴ８−ＡＡ組換え体によって生
産されるアブリンＡ鎖より、ｐＥＴ８−ＡＡ（＋Ｓｅ
ｒ）あるいはｐＥＴ８−ＡＡ（＋Ａｌａ）組換え体によ
って生産されるアブリンＡ鎖変異体の方が高いリボゾー
ム不活化活性を持っていた。

【００２６】７．ｐＥＴ８−ＡＡ（Ｃｙｓ² ）の作製と
大腸菌による産生 アブリンＡ鎖アミノ酸２４７番（Ｓｅｒ２０２を付加し
た時）のシステインをシステインをアラニンに置換し、
同時に２番にシステインを導入（Ｎ末端配列をＭｅｔ−
Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−−−とし）した組換え型アブ
リンＡ鎖を発現させるためのプラスミドｐＥＴ８−ＡＡ
（Ｃｙｓ² ）を実施例３と同様に作製した。センスプラ
イマー＜＋Ｃｙｓ＞、アンチセンスプライマー＜−Ｃｙ
ｓ＞を図９のように合成し、鋳型ＤＮＡにｐＥＴ８−Ａ
Ａ（＋Ｓｅｒ）を用いてＰＣＲを行った。得られた約７
７０ｂｐのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をＮｃｏＩとＢａｍＨ
Ｉ消化した後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡバ
ンドを切り出し溶出精製した。これをｐＥＴ８ｃのＮｃ
ｏＩとＢａｍＨＩの切断部位にＴ４ＤＮＡリガーゼを用
いて連結した。ライゲーション混合物を用いてＥ．ｃｏ
ｌｉＨＢ１０１を形質転換した。得られたアンピシリン
耐性を示す形質転換株の中から、抽出したプラスミドが
ＰＣＲプライマーに導入した制限酵素で切断されること
で目的のプラスミドｐＥＴ８−ＡＡ（Ｃｙｓ² ）を保持
するクローンを選択した。実施例４、５に示したように
ｐＥＴ８−ＡＡ（Ｃｙｓ² ）を用いて大腸菌ＢＬ２１に
よりシステインをＣ末端からＮ末端に移行したアブリン
Ａ鎖を得てｒＡＡ（Ｃｙｓ² ）とした。

【００２７】８．ｒＡＡ（Ｃｙｓ² ）とＦａｂ’の架橋
反応 毒素を抗体等と結合させてターゲット療法に用いる際の
架橋反応は、専らＲＩＰのＡ鎖に存在するシステインの
チオール基を架橋剤の反応対象にするが、このシステイ
ンのアブリンＡ鎖における存在位置を上述の技術を用い
て移行することにより架橋反応の効率を向上させること
が出来ることを示す。

【００２８】実施例３〜５で得た天然型と同様にＣ末端
の疎水性領域に唯一システインを持つｐＥＴ８−ＡＡ
（＋Ｓｅｒ）による大腸菌産生アブリンＡ鎖変異体（ｒ
ＡＡ（＋Ｓｅｒ））と、実施例７で得たＮ末端の親水性
領域に唯一システインを持つｒＡＡ（Ｃｙｓ² ）を抗体
のＦａｂ’と架橋反応した。架橋反応はアブリンＡ鎖と
Ｆａｂ’のヒンジに存在するシステインのチオール基間
を二価性架橋剤であるビスマレイミドメチルエーテル
（ＢＭＭＥ、ベーリンガー・マンハイム山之内）を用い
て行った。Ｆａｂ’は文献（Ｈ．Ｔａｋａｈａｓｈｉら
（１９８９）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ９，６２５）記載の
方法に従って作製されたヒト肝癌株化細胞ＦＯＣＵＳの
表面抗原に対するモノクローナル抗体ＸＦ−８を用い
た。

【００２９】図１０に示したように、まずｒＡＡ（＋Ｓ
ｅｒ）、ｒＡＡ（Ｃｙｓ² ）を各々６％（Ｖ／Ｖ）のＢ
ＭＭＥ／ジメチルホルムアミド溶液（２．５ ｍｇ／ｍ
ｌ）で処理した後、未反応のＢＭＭＥをセファデックス
Ｇー２５（ファルマシア社製）により除き等重量のＦａ
ｂ’と室温で一晩反応させた。反応は全て１００ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６．２）中で行った。架橋反応効率は
アブリンＡ鎖とＦａｂ’架橋体（Ｆａｂ’−ｓ−ＡＡ）
の生成量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離後、バンド濃度をデン
シトメーターで測定し比較した。その結果架橋体が総反
応物質に占める割合（Ｆａｂ’−Ｓ−ｒＡＡ÷（ｒＡＡ
＋Ｆａｂ’＋Ｆａｂ’−Ｓ−ｒＡＡ）×１００（％））
が従来のシステインをＣ末端に持つｒＡＡ（＋Ｓｅｒ）
を用いたときは２５．５％であるのに対して、ｒＡＡ
（Ｃｙｓ² ）を用いたときは５２．８％であった。

【００３０】

【発明の効果】本発明により、活性の高い組換え型アブ
リンＡ鎖を大量にかつ純粋に生産できるものである。ま
た、抗体分子との架橋反応効率に優れたアブリンＡ鎖変
異体が得られることにより抗体毒素複合体等の医薬品の
原料としてアブリンＡ鎖を利用することが可能となっ
た。

【００３１】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２５２ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 GAATTCGTGAATCCGGAGTGTAACCC ATG GAA GAC CGT CCA ATC AAA TTT AGT 53 Met Glu Asp Arg Pro Ile Lys Phe Ser -1 1 5 ACT GAG GGT GCT ACT AGC CAA AGC TAC AAA CAG TTT ATC GAA GCT CTG 101 Thr Glu Gly Ala Thr Ser Gln Ser Tyr Lys Gln Phe Ile Glu Ala Leu 10 15 20 CGT GAA CGT TTA CGT GGT GGA CTG ATC CAT GAT ATC CCG GTG TTG CCA 149 Arg Glu Arg Leu Arg Gly Gly Leu Ile His Asp Ile Pro Val Leu Pro 25 30 35 40 GAC CCG ACT ACC CTG CAG GAA CGT AAC CGT TAC ATT ACT GTT GAA CTC 197 Asp Pro Thr Thr Leu Gln Glu Arg Asn Arg Tyr Ile Thr Val Glu Leu 45 50 55 TCA AAT TCA GAT ACT GAG TCT ATT GAA GTT GGT ATC GAT GTC ACC AAT 245 Ser Asn Ser Asp Thr Glu Ser Ile Glu Val Gly Ile Asp Val Thr Asn 60 65 70 GCA TAT GTG GTC GCC TAC CGT GCT GGA ACT CAG TCA TAT TTC CTT CGC 293 Ala Tyr Val Val Ala Tyr Arg Ala Gly Thr Gln Ser Tyr Phe Leu Arg 75 80 85 GAC GCT CCG TCA TCT GCT AGC GAT TAT CTT TTC ACT GGT ACC GAC CAA 341 Asp Ala Pro Ser Ser Ala Ser Asp Tyr Leu Phe Thr Gly Thr Asp Gln 90 95 100 CAT AGC CTG CCA TTC TAC GGT ACT TAC GGT GAC CTT GAA CGA TGG GCT 389 His Ser Leu Pro Phe Tyr Gly Thr Tyr Gly Asp Leu Glu Arg Trp Ala 105 110 115 120 CAT CAA TCT CGA CAA CAA ATC CCG TTG GGA CTG CAA GCG TTA ACC CAC 437 His Gln Ser Arg Gln Gln Ile Pro Leu Gly Leu Gln Ala Leu Thr Glu 125 130 135 GGT ATC TCA TTT TTT CGA AGT GGT GGC AAC GAC AAC GAG GAA AAA GCT 485 Glu Lys His Gly Ile Ser Phe Phe Arg Ser Gly Gly Asn Asp Asn Ala 140 145 150 CGT ACC TTA ATC GTT ATC ATC CAA ATG GTT GCA GAA GCA GCA CGA TTC 533 Arg Thr Leu Ile Val Ile Ile Gln Met Val Ala Glu Ala Ala Arg Phe 155 160 165 CGC TAT ATT AGT AAC CGT GTG CGC GTT AGT ATT CAG ACC GGC ACC GCA 581 Arg Tyr Ile Ser Asn Arg Val Arg Val Ser Ile Gln Thr Gly Thr Ala 170 175 180 TTC CAG CCA GAT GCT GCG ATG ATT AGC CTC GAG AAT AAT TGG GAC AAC 629 Phe Gln Pro Asp Ala Ala Met Ile Ser Leu Glu Asn Asn Trp Asp Asn 185 190 195 200 TTA AGT CGT GGC GTC CAA GAG TCT GTA CAA GAC ACC TTT CCG AAC CAA 677 Leu Ser Arg Gly Val Gln Glu Ser Val Gln Asp Thr Phe Pro Asn Gln 205 210 215 GTT ACC CTG ACT AAT ATT CGT AAC GAA CCG GTT ATC GTC GAC AGT CTG 725 Val Thr Leu Thr Asn Ile Arg Asn Glu Pro Val Ile Val Asp Ser Leu 220 225 230 TCC CAC CCT ACC GTA GCT GTC CTG GCA TTA ATG CTG TTC GTA TGC AAC 773 Ser His Pro Thr Val Ala Val Leu Ala Leu Met Leu Phe Val Cys Asn 235 240 245 CCT CCA AAC TGA TAG GATCCAAGCTTCTAGA 804 Pro Pro Asn *** *** 250 配列番号：２ 配列番号：１ 配列の長さ：２５２ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 GAATTCGTGAATCCGGAGTGTAACCC ATG GAA GAC CGT CCA ATC AAA TTT AGT 53 Met Glu Asp Arg Pro Ile Lys Phe Ser -1 1 5 ACT GAG GGT GCT ACT AGC CAA AGC TAC AAA CAG TTT ATC GAA GCT CTG 101 Thr Glu Gly Ala Thr Ser Gln Ser Tyr Lys Gln Phe Ile Glu Ala Leu 10 15 20 CGT GAA CGT TTA CGT GGT GGA CTG ATC CAT GAT ATC CCG GTG TTG CCA 149 Arg Glu Arg Leu Arg Gly Gly Leu Ile His Asp Ile Pro Val Leu Pro 25 30 35 40 GAC CCG ACT ACC CTG CAG GAA CGT AAC CGT TAC ATT ACT GTT GAA CTC 197 Asp Pro Thr Thr Leu Gln Glu Arg Asn Arg Tyr Ile Thr Val Glu Leu 45 50 55 TCA AAT TCA GAT ACT GAG TCT ATT GAA GTT GGT ATC GAT GTC ACC AAT 245 Ser Asn Ser Asp Thr Glu Ser Ile Glu Val Gly Ile Asp Val Thr Asn 60 65 70 GCA TAT GTG GTC GCC TAC CGT GCT GGA ACT CAG TCA TAT TTC CTT CGC 293 Ala Tyr Val Val Ala Tyr Arg Ala Gly Thr Gln Ser Tyr Phe Leu Arg 75 80 85 GAC GCT CCG TCA TCT GCT AGC GAT TAT CTT TTC ACT GGT ACC GAC CAA 341 Asp Ala Pro Ser Ser Ala Ser Asp Tyr Leu Phe Thr Gly Thr Asp Gln 90 95 100 CAT AGC CTG CCA TTC TAC GGT ACT TAC GGT GAC CTT GAA CGA TGG GCT 389 His Ser Leu Pro Phe Tyr Gly Thr Tyr Gly Asp Leu Glu Arg Trp Ala 105 110 115 120 CAT CAA TCT CGA CAA CAA ATC CCG TTG GGA CTG CAA GCG TTA ACC CAC 437 His Gln Ser Arg Gln Gln Ile Pro Leu Gly Leu Gln Ala Leu Thr Glu 125 130 135 GGT ATC TCA TTT TTT CGA AGT GGT GGC AAC GAC AAC GAG GAA AAA GCT 485 Glu Lys His Gly Ile Ser Phe Phe Arg Ser Gly Gly Asn Asp Asn Ala 140 145 150 CGT ACC TTA ATC GTT ATC ATC CAA ATG GTT GCA GAA GCA GCA CGA TTC 533 Arg Thr Leu Ile Val Ile Ile Gln Met Val Ala Glu Ala Ala Arg Phe 155 160 165 CGC TAT ATT AGT AAC CGT GTG CGC GTT AGT ATT CAG ACC GGC ACC GCA 581 Arg Tyr Ile Ser Asn Arg Val Arg Val Ser Ile Gln Thr Gly Thr Ala 170 175 180 TTC CAG CCA GAT GCT GCG ATG ATT AGC CTC GAG AAT AAT TGG GAC AAC 629 Phe Gln Pro Asp Ala Ala Met Ile Ser Leu Glu Asn Asn Trp Asp Asn 185 190 195 200 CTG GCA CGT GGC GTC CAA GAG TCT GTA CAA GAC ACC TTT CCG AAC CAA 677 Leu Ala Arg Gly Val Gln Glu Ser Val Gln Asp Thr Phe Pro Asn Gln 205 210 215 GTT ACC CTG ACT AAT ATT CGT AAC GAA CCG GTT ATC GTC GAC AGT CTG 725 Val Thr Leu Thr Asn Ile Arg Asn Glu Pro Val Ile Val Asp Ser Leu 220 225 230 TCC CAC CCT ACC GTA GCT GTC CTG GCA TTA ATG CTG TTC GTA TGC AAC 773 Ser His Pro Thr Val Ala Val Leu Ala Leu Met Leu Phe Val Cys Asn 235 240 245 CCT CCA AAC TGA TAG GATCCAAGCTTCTAGA 804 Pro Pro Asn *** *** 250 配列番号３ 配列の長さ：２５３ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 GAATTCGTGAATCCGGAGTGTAACCC ATG GAA TGC GAT CGT CCA ATC AAA TTT 53 Met Glu Cys Asp Arg Pro Ile Lys Phe -1 1 5 AGT ACT GAG GGT GCT ACT AGC CAA AGC TAC AAA CAG TTT ATC GAA GCT 101 Ser Thr Glu Gly Ala Thr Ser Gln Ser Tyr Lys Gln Phe Ile Glu Ala 10 15 20 CTG CGT GAA CGT TTA CGT GGT GGA CTG ATC CAT GAT ATC CCG GTG TTG 149 Leu Arg Glu Arg Leu Arg Gly Gly Leu Ile His Asp Ile Pro Val Leu 25 30 35 40 CCA GAC CCG ACT ACC CTG CAG GAA CGT AAC CGT TAC ATT ACT GTT GAA 197 Pro Asp Pro Thr Thr Leu Gln Glu Arg Asn Arg Tyr Ile Thr Val Glu 45 50 55 CTC TCA AAT TCA GAT ACT GAG TCT ATT GAA GTT GGT ATC GAT GTC ACC 245 Leu Ser Asn Ser Asp Thr Glu Ser Ile Glu Val Gly Ile Asp Val Thr 60 65 70 AAT GCA TAT GTG GTC GCC TAC CGT GCT GGA ACT CAG TCA TAT TTC CTT 293 Asn Ala Tyr Val Val Ala Tyr Arg Ala Gly Thr Gln Ser Tyr Phe Leu 75 80 85 CGC GAC GCT CCG TCA TCT GCT AGC GAT TAT CTT TTC ACT GGT ACC GAC 341 Arg Asp Ala Pro Ser Ser Ala Ser Asp Tyr Leu Phe Thr Gly Thr Asp 90 95 100 CAA CAT AGC CTG CCA TTC TAC GGT ACT TAC GGT GAC CTT GAA CGA TGG 389 Gln His Ser Leu Pro Phe Tyr Gly Thr Tyr Gly Asp Leu Glu Arg Trp 105 110 115 120 GCT CAT CAA TCT CGA CAA CAA ATC CCG TTG GGA CTG CAA GCG TTA ACC 437 Ala His Gln Ser Arg Gln Gln Ile Pro Leu Gly Leu Gln Ala Leu Thr 125 130 135 CAC GGT ATC TCA TTT TTT CGA AGT GGT GGC AAC GAC AAC GAG GAA AAA 485 Glu Glu Lys His Gly Ile Ser Phe Phe Arg Ser Gly Gly Asn Asp Asn 140 145 150 GCT CGT ACC TTA ATC GTT ATC ATC CAA ATG GTT GCA GAA GCA GCA CGA 533 Ala Arg Thr Leu Ile Val Ile Ile Gln Met Val Ala Glu Ala Ala Arg TTC CGC TAT ATT AGT AAC CGT GTG CGC GTT AGT ATT CAG ACC GGC ACC 581 Phe Arg Tyr Ile Ser Asn Arg Val Arg Val Ser Ile Gln Thr Gly Thr 170 175 180 GCA TTC CAG CCA GAT GCT GCG ATG ATT AGC CTC GAG AAT AAT TGG GAC 629 Ala Phe Gln Pro Asp Ala Ala Met Ile Ser Leu Glu Asn Asn Trp Asp 185 190 195 200 AAC TTA AGT CGT GGC GTC CAA GAG TCT GTA CAA GAC ACC TTT CCG AAC 677 Asn Leu Ser Arg Gly Val Gln Glu Ser Val Gln Asp Thr Phe Pro Asn 205 210 215 CAA GTT ACC CTG ACT AAT ATT CGT AAC GAA CCG GTT ATC GTC GAC AGT 725 Gln Val Thr Leu Thr Asn Ile Arg Asn Glu Pro Val Ile Val Asp Ser 220 225 230 CTG TCC CAC CCT ACC GTA GCT GTC CTG GCA TTA ATG CTG TTC GTC GCG 773 Leu Ser His Pro Thr Val Ala Val Leu Ala Leu Met Leu Phe Val Ala 235 240 245 AAC CCT CCA AAC TGA TAG GATCCAAGCTTCTAGA 807 Asn Pro Pro Asn *** *** 250

【００３２】

【図面の簡単な説明】

【００３３】

【図１】船津ら（（１９８８）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．５２，１０９５−１０９７）により報告され
ているアブリンａＡ鎖のアミノ酸配列に基づいて遺伝子
を化学合成したアブリンａＡ鎖配列図

【００３４】

【図２】図１の後半部

【００３５】

【図３】ｐＥＴ−ＡＡプラスミド構造とｐＥＴ−ＡＡ
（＋Ｓｅｒ）プラスミド作製工程の模式図

【００３６】

【図４】２０２番目にセリンを添加したアブリンＡ鎖の
配列を暗号化する遺伝子を含むｐＥＴ−ＡＡ（＋Ｓｅ
ｒ）プラスミドを作製する工程に用いたＰＣＲセンスプ
ライマー＜ｒＡＡ＋Ｓｅｒ＞の配列。上段／は制限酵素
切断部位と制限酵素名を表す。

【００３７】

【図５】２０２番目にアラニンを添加したアブリンＡ鎖
の配列を暗号化する遺伝子を含むｐＥＴ−ＡＡ（＋Ａｌ
ａ）プラスミドを作製する工程に用いたＰＣＲセンスプ
ライマー＜ｒＡＡ＋Ｓｅｒ＞の配列。上段／は制限酵素
切断部位と制限酵素名を表す。

【００３８】

【図６】抗アブリンａＡ鎖抗体を用いたイムノブロティ
ングによる、ｐＥＴ８−ＡＡを用いた大腸菌ＢＬ２１株
形質転換体のアブリンａＡ鎖発現確認。

【００３９】

【図７】ｐＥＴ８−ＡＡを用いた形質転換体からのアブ
リンａＡ鎖の各精製工程におけるＳＤＳーＰＡＧＥの結
果。

【００４０】発現誘導後の全菌体蛋白；レーン．１、Ｂ
ｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂの吸着画分（１Ｍ
のＮａＣｌ／リン酸緩衝液により溶出）；レーン．２、
ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムの０−２５０ｍＭ
ＮａＣｌ濃度勾配溶出画分；レーン．３、天然型アブリ
ンＡ鎖；レーン．４、ＢＬ２１総蛋白；レーン．６、分
子量マーカー（９２．５Ｋ、６６．２Ｋ、４５．０Ｋ、
３１．０Ｋ、２１．５Ｋ、１４．４Ｋ）；レーン．５

【００４１】

【図８】大腸菌産生アブリンａＡ鎖のＲＩＰ活性。

【００４２】

【図９】配列番号３に示されるアブリンＡ鎖変異体の配
列を暗号化する遺伝子を含むｐＥＴ８−ＡＡ（Ｃｙ
ｓ² ）プラスミドを作製する工程に用いたＰＣＲセンス
プライマーセンスプライマー＜＋Ｃｙｓ＞、アンチセン
スプライマー＜−Ｃｙｓ＞の配列を示す。上段／は制限
酵素切断部位と制限酵素名を表す。

【００４３】

【図１０】ｒＡＡ（＋Ｓｅｒ）からｒＡＡ（Ｃｙｓ² ）
にシステインの位置を移行させたことによるＦａｂ’と
の架橋効率の向上を模式的に示したものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】天然型アブリンＡ鎖の２０２番目のアミノ
   酸にセリンまたはアラニンを挿入してなるアブリンＡ鎖
   変異体。
2. 【請求項２】配列表の配列番号１から３に示したアミノ
   酸配列のいずれかからなる請求項１記載のアブリンＡ鎖
   変異体。
3. 【請求項３】請求項１記載のアブリンＡ鎖変異体をコー
   ドするＤＮＡ。
4. 【請求項４】配列表の配列番号１から３に示された塩基
   配列のいずれかからなる請求項３記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】請求項３記載のＤＮＡを大腸菌の遺伝子発
   現系制御下に連結させてなる組換えプラスミド。
6. 【請求項６】ｐＥＴ−ＡＡ（＋Ｓｅｒ），ｐＥＴ８−Ａ
   Ａ（＋Ａｌａ）またはｐＥＴ８−ＡＡ（Ｃｙｓ² ）であ
   る請求項５記載の組換えプラスミド。
7. 【請求項７】請求項５または６記載の組換えプラスミド
   により形質転換された大腸菌。
8. 【請求項８】大腸菌株がＢＬ２１株である請求項７記載
   の形質転換された大腸菌。
9. 【請求項９】請求項７または８記載の大腸菌を培養して
   アブリンＡ鎖変異体を生産せしめ、該菌体からアブリン
   Ａ鎖変異体を回収することを特徴とするアブリンＡ鎖変
   異体の製造法。
10. 【請求項１０】ブルー色素が結合した担体を用いたクロ
    マトグラフィーおよび陰イオン交換体を用いたクロマト
    グラフラフィーにより精製することを特徴とするアブリ
    ンＡ鎖変異体の製造法。
11. 【請求項１１】請求項１記載のアブリンＡ鎖変異体に他
    の分子を結合させてなるアブリンＡ鎖複合体。
12. 【請求項１２】他の分子が抗体分子または抗体分子の断
    片である請求項１１記載のアブリンＡ鎖複合体。
13. 【請求項１３】抗体分子の断片がＦａｂ´である請求項
    １２記載のアブリンＡ鎖複合体。