ES2118756T5 - Estimuladores de hematopoyesis de multiples dominios. - Google Patents

Estimuladores de hematopoyesis de multiples dominios.

Info

Publication number
ES2118756T5
ES2118756T5 ES91920109T ES91920109T ES2118756T5 ES 2118756 T5 ES2118756 T5 ES 2118756T5 ES 91920109 T ES91920109 T ES 91920109T ES 91920109 T ES91920109 T ES 91920109T ES 2118756 T5 ES2118756 T5 ES 2118756T5
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
fusion
cells
protein
sequence
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES91920109T
Other languages
English (en)
Other versions
ES2118756T3 (es
Inventor
Paul Schendel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genetics Institute LLC
Original Assignee
Genetics Institute LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24298530&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2118756(T5) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genetics Institute LLC filed Critical Genetics Institute LLC
Application granted granted Critical
Publication of ES2118756T3 publication Critical patent/ES2118756T3/es
Publication of ES2118756T5 publication Critical patent/ES2118756T5/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5403—IL-3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Abstract

SE SUMINISTRAN NUEVAS PROTEINAS DE FUSION, IL3-X O X-IL3, EN DONDE X ES UNA LIMFOQUINA FUNDIDA AL IL3.

Description

Estimuladores de hematopoyesis de múltiples dominios.
La presente invención se refiere a moléculas de fusión caracterizadas por la presencia de interleuquina 3 [IL3] fusionada a IL3 con o sin una secuencia adaptadora. La molécula de fusión puede caracterizarse por tener la actividad habitual de ambos péptidos que forman la molécula de fusión o puede caracterizarse además por tener una actividad biológica o fisiológica mayor que simplemente la función aditiva de la presencia de IL3 o X. La molécula de fusión puede proporcionar también inesperadamente un efecto incrementado sobre la actividad de cada una de las proteínas de fusión o una actividad diferente de la esperada por la presencia de IL3 o X.
La nueva proteína de fusión NH_{2}-IL3-X o NH_{2}-X-IL3 proporcionada por la presente invención es una proteína homogénea sustancialmente libre de asociación con otros materiales proteicos de mamífero. La entidad IL3 es IL3 nativa. La entidad X de las fórmulas anteriores representa IL3, la secuencia de ADN codificadora de la cual está fusionada en marco con el ADN que codifica la región de IL3, bien directamente o mediante un adaptador. Por ``fusionadas en marco'' se quiere significar que no existe un terminador de la traducción entre los marcos de lectura de las proteínas IL3 y X. Según es utilizado en la presente, el término ``directamente'' define la fusión de las secuencias de ADN que codifican X e IL3 sin un adaptador peptídico. La entidad X puede estar fusionada al extremo 5' ó 3' de la molécula de ADNc de IL3.
Las secuencias de ADN y proteínas de la molécula de IL3 están publicadas y pueden ser construidas por una variedad de técnicas actualmente estándar en el oficio. Ver, por ejemplo, la publicación de PCT WO 88/00598, publicada el 28 de Enero de 1988.
La fusión de la secuencia de IL3 a la secuencia de X puede realizarse mediante la utilización de vectores intermediarios según se describe en los ejemplos posteriores. Alternativamente, la secuencia de IL3 puede ser insertada directamente en un vector que contiene la región que codifica la proteína X, o viceversa. Las técnicas para clonar secuencias de ADN en fagos o plásmidos son conocidas por los expertos en la materia.
Pueden utilizarse conectores y adaptadores para unir las secuencias de IL3 y X, así como para reemplazar secuencias perdidas, en los lugares en que el sitio de restricción empleado está interno en la región de interés. Los adaptadores que unen las dos moléculas están diseñados preferiblemente para que permitan a las proteínas IL3 y X plegarse y actuar independientemente una de otra. La secuencia de un adaptador ejemplar utilizado en los ejemplos presentes estaba basada en una secuencia encontrada en la transcriptasa inversa del VIH-1, y se cree que une el dominio C-terminal de esa proteína al penúltimo dominio. Se sabe que este péptido es susceptible a proteolisis suave y por tanto se cree que está en la superficie externa de la proteína. La secuencia está altamente cargada, lo que incrementará la solubilidad de cualquier proteína que la contenga. En la fusión de las moléculas de IL3 y X, pueden insertarse entre las dos moléculas múltiples copias de la secuencia del adaptador de elección. La presente invención no está limitada, por tanto, por la forma, tamaño o número de las secuencias adaptadoras empleadas. Otra secuencia adaptadora ejemplar útil para producir las proteínas de fusión de la presente invención es Gly Ser Gly Ser Glu Asp Cys Glu Asp Ser Gly Ser Gly. De hecho, el único requisito para la secuencia adaptadora es que no interfiera funcionalmente de manera adversa con el plegamiento de los componentes individuales de la molécula de fusión. Además, tales adaptadores pueden estar ausentes completamente en una molécula NH_{2}-IL3-X o NH_{2}-X-IL3 fusionada directamente.
Los vectores para utilizar en la construcción de las moléculas de fusión y en el método de expresión de las nuevas proteínas de fusión NH_{2}-IL3-X o NH_{2}-X-IL3, forman también parte de esta invención. Los vectores que contienen las secuencias de ADN de NH_{2}-IL3-X o NH_{2}-X-IL3 que codifican las proteínas de fusión de la invención o los vectores que incorporan secuencias modificadas según se describe en la presente, son también realizaciones de la presente invención y útiles para la producción de las proteínas NH_{2}-IL3-X o NH_{2}-X-IL3.
Los vectores empleados en el método contienen también secuencias reguladoras seleccionadas en asociación operativa con las secuencias de ADN codificadoras de la invención y son capaces de dirigir la replicación y expresión de las mismas en células huésped seleccionadas. La utilización de regiones reguladoras para controlar la transcripción de los genes de fusión puede permitir el crecimiento de las células huésped hasta una densidad elevada sin o con bajos niveles de expresión del gen de fusión, y posteriormente la inducción de la expresión cambiando las condiciones del entorno, tales como nutrientes, temperatura y similares. Se proporcionan también por la presente invención células huésped transformadas con tales vectores para utilización en la producción de NH_{2}-IL3-X o NH_{2}-X-IL3 recombinantes.
La presente invención abarca también las nuevas secuencias de ADN de fusión, libres de asociación con secuencias de ADN que codifican otras proteínas de primates, y que codifican las proteínas de fusión NH_{2}-IL3-X o NH_{2}-X-IL3. Las secuencias de ADN pueden ser fusionadas en marco bien directamente o mediante un adaptador para llevar las secuencias a una proximidad entre sí preferida. Las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos IL3 y X pero que difieren de la IL3 o de X que existen de forma natural en la secuencia de los codones, debido a las degeneraciones del código genético o a variaciones alélicas (cambios de bases que tienen lugar de forma natural en la población de la especie y que pueden resultar o no en un cambio de aminoácidos) están también abarcadas por esta invención.
La presente invención proporciona también un método para producir las moléculas de fusión NH_{2}-IL3-X o
\break\hbox{NH _{2} -X-IL3}
. El método implica (1) cultivar en un medio de cultivo una célula o línea celular adecuada, que ha sido transformada con una secuencia de ADN que codifica la expresión de una molécula de fusión NH_{2}-IL3-X o 
\hbox{NH _{2} -X-IL3}
en asociación operativa con una secuencia controladora de la expresión, bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína de fusión y (2) recoger la proteína de fusión así producida a partir de los medios de cultivo. Las células adecuadas preferidas son células bacterianas. Por ejemplo, las diferentes cepas de E. coli (por ejemplo, HB101, MC1061 y las cepas utilizadas en los ejemplos siguientes) son bien conocidas como células huésped en el campo de la biotecnología. Varias cepas de B. subtilis, Pseudomonas, de otros bacilos y similares pueden ser también empleadas en este método. Otras células adecuadas son células de mamífero, por ejemplo COS y CHO.
La selección de las células adecuadas y los métodos para la transformación, cultivo, amplificación, selección y producción y purificación de los productos son conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Gething y Sambrook, Nature, 293:620-625 (1981); Kaufman y col., Mol. Cell. Biol., 5(7):1750-1759 (1985) o Howley y col., Patente de EE.UU. 4.419.446.
Células de levaduras, células fúngicas o células de insectos conocidas por los expertos en la materia, pueden ser también útiles como células huésped para la expresión de las moléculas de fusión de la presente invención. Ver, por ejemplo Miller y col., Genetic Engineering, 8:277-298 (Plenum Press 1986) y las referencias citadas en ella.
La recogida de la proteína de fusión de la invención a partir de un lisado celular o de un extracto del medio de cultivo de cualquiera de las células huésped anteriormente descritas, puede llevarse a cabo por técnicas de aislamiento de proteínas convencionales.
Composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de las proteínas de fusión
\break\hbox{NH _{2} -IL3-X}
o NH_{2}-X-IL3, mezcladas con un vehículo farmacéuticamente aceptable, están incluidas en esta invención. Estas composiciones farmacéuticas son adecuadas para el tratamiento de varios estados patológicos o de enfermedad, particularmente aquellos caracterizados por un nivel disminuido de células mieloides, eritroides, linfoides o megacariocíticas del sistema hematopoyético o combinaciones de las mismas. Además, las proteínas de fusión pueden ser utilizadas para la preparación de composiciones farmacéuticas adecuadas para activar células mieloides y/o linfoides maduras. Por ejemplo, composiciones farmacéuticas conteniendo la molécula de fusión NH_{2}-IL3-IL11 pueden ser útiles para la estimulación de la producción y/o desarrollo de megacariocitos y plaquetas. Entre las condiciones susceptibles al tratamiento con las composiciones farmacéuticas de la presente invención está la leucopenia, una reducción del número de leucocitos (glóbulos blancos) circulantes de la sangre periférica. La leucopenia puede ser inducida por exposición a ciertos virus o a radiación. Es a menudo un efecto colateral de la exposición a fármacos quimioterapéuticos. Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden evitar los efectos colaterales indeseables causados por fármacos disponibles actualmente. Adicionalmente, la faceta multidominio de las proteínas de esta invención puede permitir dosificaciones menores de las composiciones farmacéuticas a utilizar en comparación con la utilización de composiciones farmacéuticas que contienen las linfoquinas individuales IL3 o X solas.
Varias inmunodeficiencias o trastornos inmunes pueden ser también susceptibles al tratamiento con las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Estas composiciones farmacéuticas, solas o en combinación con otros regímenes de tratamiento, pueden ser útiles para tratar o corregir inmunodeficiencias que son el resultado de infecciones víricas, por ejemplo, VIH, VLTHI o VLTHII, exposiciones severas a radiación, terapia del cáncer o el resultado de otro tratamiento médico. Dependiendo de la identificación de X, las composiciones farmacéuticas pueden ser utilizadas para tratar otras deficiencias de las células sanguíneas, incluyendo trombocitopenia (deficiencia de plaquetas) o anemia (deficiencia de glóbulos rojos). Otras utilizaciones son en el tratamiento de pacientes en recuperación de trasplantes de médula ósea.
Tales composiciones farmacéuticas contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión
\break\hbox{NH _{2} -IL3-X}
o NH_{2}-X-IL3 de la presente invención en mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta composición es preparada para ser administrada sistémicamente parenteralmente. Alternativamente, la composición es preparada para ser administrada intravenosamente. Si se desea, la composición es preparada para ser administrada subcutáneamente. Cuando se prepara para ser administrada sistémicamente, la composición terapéutica para utilización en esta invención está en forma de una solución acuosa libre de pirógenos, parenteralmente aceptable. La preparación de tal solución de proteínas farmacéuticamente aceptable, teniendo en cuenta el pH, la isotonicidad, la estabilidad y similares, está dentro de la experiencia en la materia.
Los ejemplos siguientes describen la construcción y producción de proteínas de fusión ilustrativas de esta invención.
Ejemplo 1 Construcción de moléculas de IL3 multidominio
Para obtener una proteína de fusión NH_{2}-IL3-X, se obtuvieron dos secuencias de ADNc de IL3 de acuerdo con los procedimientos descritos en la publicación de PCT WO 88/00598, publicada el 28 de Enero de 1988. Las dos secuencias de ADNc fueron fusionadas entre sí con una pieza corta de ADN. Este ADN codificaba un péptido adaptador diseñado para permitir a las dos proteínas IL3 plegarse y actuar independientemente una de otra.
La secuencia de este péptido adaptador estaba basada en una secuencia encontrada en la transcriptasa inversa del VIH-1 según se describió anteriormente. La secuencia del adaptador utilizado en esta fusión es según sigue:
\global\tabcolsep=3pt
Gly Asp Ala Asn Arg Glu Thr Lys Leu Gly Lys Gly
C GGT GAT GCT AAC CGT GAA ACT AAG CTT GGT AAA GG
G CCA CTA CGA TTG GCA CTT TGA TTC GAA CCA TTT CCA T 
\global\tabcolsep=6pt
El esquema utilizado para fusionar los ADNcs de IL3 y la región adaptadora emplea técnicas de ingeniería recombinante convencionales tales como las descritas en Maniatis y col., ``Molecular Cloning, A Laboratory Manual'', Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982). La construcción de las fusiones está esquematizada en la Fig. I. Brevemente descrita, la secuencia del ADNc de IL3, menos la secuencia que codifica su líder secretor, tenía los extremos 5' y 3' que aparecen en la porción superior de la Tabla A siguiente. Estas secuencias de IL3 después de digestión con XbaI y con nucleasa de Mung Bean, o con NdeI, tenían los extremos 5' y 3' que aparecen en la porción inferior de la Tabla A.
TABLA A
extremo 3' del gen: \hskip5cm\hbox{} extremo 5' del gen:
ATC TTC TAG A CAT ATG GCT
TAG AAG ATC T GTA TAC CGA
Ile Phe stop Met Ala
- -XbaI- - -NdeI-
extremo 3' del gen: extremo 5' del gen:
ATC TT T ATG GCT
TAG AA AC CGA
Las secuencias de IL3 digeridas fueron insertadas en un plásmido, pALhIL3-781, diseñado para la expresión de proteínas heterólogas intracelularmente en E. coli. Este plásmido se describe solamente para ilustración. Las técnicas descritas para producir las moléculas de fusión descritas pueden emplear otros plásmidos conteniendo las mismas o diferentes secuencias componentes, sitios de restricción y similares. Este plásmido ejemplar es una forma modificada de pAL181 [ATCC Depósito #40134] que contiene un secuencia terminadora de la transcripción adicional. El plásmido pALhIL3-781, según se representa en la Fig. I, se caracteriza por la secuencia de ADNc completa de la IL3 madura fusionada en marco con una metionina iniciadora y con un sitio de unión de ribosomas separado apropiadamente; el principal promotor hacia la izquierda del fago lambda para controlar y conducir la transcripción del ADNc de IL3; una secuencia más allá del extremo 3' de la secuencia de IL3 que hace que termine la transcripción y tres sitios de restricción únicos dentro del plásmido. Un sitio 5' al gen de IL3 y que abarca la secuencia codificadora de la metionina iniciadora es NdeI. Otro sitio es incorporado dentro de la secuencia de terminación de la traducción en el extremo 3' del gen de la IL3, XbaI. El sitio restante está a 5' de la secuencia de terminación de la transcripción, HindIII.
Se prepararon dos muestras del plásmido. Una fue cortada con NdeI y HindIII y el fragmento pequeño que contenía el ADNc de IL3 fue purificado (ver la parte derecha de la Fig. I). El segundo fue cortado con XbaI, tratado con exonucleasa de Mung Bean para eliminar las colas de ADN de hebra sencilla, y digerido con HindIII. Se aisló el fragmento más grande (ver parte izquierda de la Fig. I). Los dos fragmentos aislados fueron mezclados con oligonucleótidos adaptadores sintéticos de la secuencia mostrada anteriormente y tratados con polinucleótido ligasa T4.
La secuencia de la región de unión entre las dos secuencias de IL3 después de la ligadura fue según sigue:
\global\tabcolsep=3pt
Phe Gly Asp Ala Asn Arg Glu Thr Lys Leu Gly Lys Gly
TC TTC GGT GAT GCT AAC CGT GAA ACT AAG CTT GGT AAA GGT
AG AAG CCA CTA CGA TTG GCA CTT TGA TTC GAA CCA TTT CCA
Met
ATG G
TAC C 
\global\tabcolsep=6pt
Los plásmidos en los que las dos secuencias codificadoras de IL3 y una o más secuencias adaptadoras se habían fusionado, fueron seleccionados por las colonias que hibridaban con las secuencias adaptadoras y se verificó la secuencia de las uniones de la fusión. La presencia de plásmidos con más de un adaptador insertado entre las secuencias de IL3 fue inesperada. Estos plásmidos con adaptadores múltiples provienen probablemente de una pequeña cantidad de contaminación de nucleasa en la ADN ligasa o de alguna nucleasa de Mung Bean sobrante que eliminó la cola de hebra sencilla TA del adaptador dúplex permitiéndole ligarse al extremo romo de un adaptador dúplex adyacente.
Una vez que se construyeron los plásmidos, fueron transformados en cepas de E. coli apropiadas, tales como W3110 (lambda PamcI857) [M. Rosenberg y col., Meth. Enzymol., 101:123-137 (1983) y Sambrook y col., citada anteriormente] para la expresión de la IL3 multidominio. Los dos plásmidos seleccionados para este experimento contenían dos secuencias de ADNc de IL3 separadas por una y tres secuencias adaptadoras respectivamente. El pALIL31-781 que contiene una copia del adaptador está ilustrado en la porción inferior de la Fig. I. Estas moléculas de fusión producían proteínas de 31 y 34 kilodaltons, respectivamente.
Las proteínas se acumulaban dentro de las células como cuerpos de inclusión insolubles y fueron solubilizadas y replegadas por métodos estándar [ver, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.512.922]. Cuando se analizaron en el ensayo con CML descrito posteriormente en el Ejemplo 9, las proteínas demostraron una actividad IL3 igual o mayor que la actividad de la IL3 natural o recombinante.
Ejemplo 2 Expresión de las proteínas de fusión IL3-X recombinantes
Para expresar las proteínas de fusión de los ejemplos, los ADNs de los plásmidos descritos anteriormente que codifican las proteínas de fusión son transferidos a vectores de expresión apropiados, de los que se conocen numerosos tipos en la técnica, para la expresión en mamíferos, insectos, levaduras, fúngica y bacteriana, por técnicas estándar de biología molecular.
a. Sistemas de expresión bacterianos
Una persona experta en la materia puede manipular las secuencias que codifican las proteínas NH_{2}-IL3-X y 
\hbox{NH _{2} -X- IL3}
eliminando cualquier secuencia reguladora de mamífero que flanquee las secuencias codificadoras, e insertando secuencias reguladoras bacterianas con el fin de crear vectores bacterianos para la expresión intracelular o extracelular de las proteínas de fusión de la invención por células bacterianas. El ADN que codifica las proteínas de fusión puede ser modificado posteriormente para que contenga codones diferentes con el fin de optimizar la expresión bacteriana según se conoce en el oficio. Las secuencias que codifican las proteínas de fusión pueden ser unidas operativamente en marco a secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido líder secretor, permitiendo la expresión bacteriana, secreción y procesamiento de las proteínas de fusión por métodos conocidos en el oficio. Alternativamente, las fusiones NH_{2}-IL3-X o NH_{2}-X-IL3 pueden ser construidas para expresión intracelular y la proteína puede ser aislada, mezclada y replegada por procedimientos bien conocidos en la técnica. La proteína de fusión expresada a través de cualquier ruta en células huésped bacterianas, puede ser luego recuperada, purificada y/o caracterizada con respecto a los parámetros físicoquímicos, bioquímicos y/o clínicos, todo por métodos conocidos. b. Expresión en células de mamífero
Para obtener la expresión de la proteína de fusión puede utilizarse un vector para células de mamífero, pXM, y los procedimientos generales descritos en Y.C. Yang y col., Cell, 47:3-10 (1986). Ver, también, Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:689-693 (1985), Kaufman y col., J. Mol. Biol., 159:511-521 (1982); y Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:689-693 (1985) para las descripciones de las técnicas de construcción de vectores y los componentes vectoriales útiles en la práctica de esta invención.
Una persona experta en la materia puede construir también otros vectores de expresión de mamífero comparables al vector pXM insertando, por ejemplo, las secuencias de ADN de las proteínas de fusión de los plásmidos respectivos con enzimas apropiados y empleando técnicas bien conocidas de ingeniería genética recombinante y otros vectores conocidos.
Para la integración estable de los ADNs vectoriales y para la posterior amplificación de los ADNs vectoriales integrados, pueden emplearse células CHO utilizando métodos convencionales. La transformación de estos vectores con NH_{2}-IL3-X o NH_{2}-X-IL3 en células huésped apropiadas puede tener como resultado la expresión de las proteínas de fusión. Las líneas celulares resultantes pueden ser amplificadas posteriormente mediante selección con fármacos apropiados, las líneas celulares resultantes clonadas de nuevo y el nivel de expresión determinado utilizando en ensayo apropiado para los componentes de la proteína de fusión NH_{2}-IL3-X.
c. Expresión en células de insectos o levaduras
Pueden realizarse manipulaciones similares para la construcción de un vector de insectos para la expresión de estas proteínas de fusión en células de insectos. [Ver, por ejemplo, los procedimientos descritos en la patente Europea 155.476, publicada el 25 de Septiembre de 1985].
De forma similar se construyen vectores de levaduras empleando secuencias reguladoras de levaduras para expresar la proteína de fusión en células de levadura con el fin de producir la proteína de fusión activa expresada intracelularmente o secretada extracelularmente. [Ver, por ejemplo, los procedimientos descritos en la publicación de PCT WO 86/00639, publicada el 30 de Enero de 1986, y la patente Europea EP 123.289, publicada el 31 de Octubre de 1984]. Pueden emplearse también vectores fúngicos en la expresión de estas moléculas de fusión.
Ejemplo 3 Actividades biológicas de NH_{2}-IL3-X
En todos los ensayos de proliferación descritos, el formato básico es según sigue:
Las muestras y los estándares son diluidos en medio de ensayo en placas de microvaloración con fondo en U, en un volumen final de 100 \mul/pocillo. Diluciones seriadas de cinco veces son apropiadas en la mayoría de los casos. Las células diana son recogidas a partir de cultivos que crecen activamente, centrifugadas, lavadas y resuspendidas en medio de ensayo a concentraciones que han sido optimizadas para cada ensayo; se añaden 100 \mul de la suspensión de células a cada pocillo de tal forma que el volumen final es de 200 \mul/pocillo. Las placas son incubadas a 37ºC en un incubador completamente humidificado y sometidas a un pulso con 0,5 \muCi de [^{3}H]-timidina/pocillo según se describe en cada ensayo posteriormente. La proliferación es medida por la incorporación de [^{3}H]-timidina a las células. La bioactividad es medida en unidades mitad de la dilución máxima, en las que una concentración final de 1 unidad por ml de la fusión IL3/X tiene como resultado una incorporación de [^{3}H]-timidina del 50% en el ensayo.
a. Ensayo con CML
El ensayo con CML para estimular la proliferación de células blásticas leucémicas se realizó esencialmente de acuerdo con los procedimientos descritos en Blood, 63 (4):904-111 (1984). Una solución madre de células fue obtenida a partir de una bolsa congelada de sangre periférica de un paciente con CML en fase estable. La bolsa fue descongelada y vuelta a congelar en 500 alícuotas de 1,7 x 10^{7} células/vial. Un día antes del establecimiento del ensayo se descongela un vial de células y se lavan las células dos veces con 10 ml de RPMI + un 5% de suero Humano AB inactivado por calor (HiHAB). Las células son resuspendidas en 10 ml del mismo medio e incubadas durante una noche en un 5% de CO_{2} a 37ºC. El día siguiente las células son extraídas del cultivo, tratadas con Ficoll, lavadas y resuspendidas en el medio de ensayo.
El ensayo es realizado en RPMI + un 10% de suero de ternera fetal inactivado por calor (HiFCS), glutamina (GLN) 2 mM y P/S (100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina). La densidad de siembra de las células es de 2 x 10^{4} células/pocillo. Las placas son incubadas durante 48 horas en un 5% de CO_{2} y sometidas a un pulso con [^{3}H]-timidina durante las 6 horas finales del ensayo. Las células CML responden a hGMCSF y a hIL3. Por tanto, para cuantificar la actividad de cada citoquina de la proteína de fusión del Ejemplo 2 de forma separada, es necesario incluir anticuerpos neutralizantes hacia hGMCSF o hacia hIL3.
b. Ensayo con MO7E
La línea celular MO7E derivaba de la sangre periférica de un niño con leucemia megacarioblástica aguda. El crecimiento de las células MO7E es dependiente de la presencia de GMCSF humano, de IL3 humana o de IL4 humana.
Las células MO7E son mantenidas en DME más un 10% de FCS inactivado por calor, glutamina y P/S suplementado con 8 unidades por mililitro de IL3 humana recombinante. El ensayo se realiza en el mismo medio sin la adición de IL3 humana. La densidad de siembra de las células es de 10^{4} células por pocillo. Las placas son incubadas durante 3 días en un 10% de CO_{2} y sometidas a un pulso con [^{3}H]-timidina durante las 4 horas finales.
Según se describió en el ensayo con CML, las células MO7E responden a hGMCSF y a hIL3, requiriendo la utilización de anticuerpos neutralizantes.
Sobre la base de la incorporación de [^{3}H]-timidina, las proteínas de fusión que contienen IL3 de todos los ejemplos de fusión IL3/X son activas en la estimulación de la proliferación de células blásticas leucémicas en este ensayo con CML.
c. Ensayo con TF-1
La línea celular TF-1 derivaba de la médula ósea de un paciente con eritroleucemia [T. Kitamura, Universidad de Tokio]. Las células son cultivadas en RPMI más un 10% de FCS inactivado por calor, glutamina y P/S, suplementado con 100 unidades por ml de GMCSF humano recombinante. El ensayo es realizado en el mismo medio sin la adición de hGMCSF. La densidad de siembra de las células es de 7,5 x 10^{3} células por pocillo. Las placas son incubadas durante 3 días en un 5% de CO_{2} y sometidas a un pulso con [^{3}H]-timidina durante las 4 horas finales. Según se describió en el ensayo con CML, las células TF-1 responden a hGMCSF y a hIL3 requiriendo la utilización de anticuerpos neutralizantes.
Sobre la base de la medida de incorporación de timidina, las proteínas de fusión IL3/X son activas en este ensayo estimulando la proliferación de estas células de eritroleucemia.
d. Ensayo de proliferación de 32D
32D Es una línea celular murina dependiente de IL3 cultivada en RPMI con un 10% de FCS inactivado por calor, glutamina y P/S con un 20% de medio condicionado de WeHi 3B como fuente de IL3 murina. Estas células proliferan en presencia de GCSF.
El ensayo es realizado en RPMI, conteniendo un 5% de FCS inactivado por calor, glutamina y P/S. La densidad de siembra es de 2 x 10^{4} células por pocillo. Las placas son incubadas durante 24 horas en un 5% de CO_{2} y sometidas a un pulso con [^{3}H]-timidina durante las 4 horas finales.
e. Ensayo de proliferación de DA2
DA2 Es una línea celular murina dependiente de LIF que crece igualmente bien en IL3 murina. Las células son mantenidas en RPMI con un 5% de FCS inactivado por calor, glutamina, P/S y 500 unidades/ml de LIF humano recombinante.
El ensayo de DA2 es realizado en el mismo medio que el ensayo de 32D. La densidad de siembra de las células es de 7,5 x 10^{3} células por pocillo. Las placas son incubadas durante 3 días y sometidas a un pulso con [^{3}H]-timidina durante las 4 horas finales.

Claims (9)

1. Una proteína de fusión de fórmula NH_{2}-IL3-X o NH_{2}-X-IL3 sustancialmente libre de asociación con otros materiales proteicos, en la que IL3 es IL3 nativa, X es IL3, y ``-'' entre ``IL3'' y ``X'' representa un enlace peptídico o una secuencia adaptadora peptídica.
2. Una secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión de la reivindicación 1.
3. Un vector plasmídico que contiene la secuencia de ADN de la reivindicación 2 en asociación operativa con una secuencia de control de la expresión capaz de dirigir la expresión de la secuencia de ADN de la reivindicación 2 en una célula huésped.
4. Una célula huésped transformada con el vector plasmídico de la reivindicación 3.
5. Un proceso para producir una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende (1) cultivar la célula huésped de la reivindicación 4 en un medio de cultivo bajo condiciones que permitan la expresión de la proteína y (2) recoger la proteína de fusión a partir de los medios de cultivo.
6. Una composición farmacéutica que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión de la reivindicación 1 opcionalmente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
7. La composición farmacéutica de la reivindicación 6 para el tratamiento de leucopenia.
8. Utilización de la proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de leucopenia.
9. Un proceso para la preparación de la composición farmacéutica de la reivindicación 6 ó 7 que comprende la combinación de la proteína de fusión de la reivindicación 1 con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
ES91920109T 1990-08-29 1991-08-29 Estimuladores de hematopoyesis de multiples dominios. Expired - Lifetime ES2118756T5 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US57500390A 1990-08-29 1990-08-29
US575003 1990-08-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ES2118756T3 ES2118756T3 (es) 1998-10-01
ES2118756T5 true ES2118756T5 (es) 2004-01-16

Family

ID=24298530

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES91920109T Expired - Lifetime ES2118756T5 (es) 1990-08-29 1991-08-29 Estimuladores de hematopoyesis de multiples dominios.

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5883230A (es)
EP (1) EP0546124B2 (es)
JP (1) JP3149182B2 (es)
AT (1) ATE167896T1 (es)
AU (1) AU651152B2 (es)
CA (1) CA2089553C (es)
DE (1) DE69129697T3 (es)
DK (1) DK0546124T4 (es)
ES (1) ES2118756T5 (es)
GR (1) GR3027790T3 (es)
WO (1) WO1992004455A1 (es)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5718893A (en) * 1984-04-15 1998-02-17 Foster; Preston F. Use of G-CSF to reduce acute rejection
US5662896A (en) * 1988-03-21 1997-09-02 Chiron Viagene, Inc. Compositions and methods for cancer immunotherapy
EP0503050A4 (en) * 1990-09-28 1994-07-06 Ortho Pharma Corp Hybrid growth factors
US5738849A (en) * 1992-11-24 1998-04-14 G. D. Searle & Co. Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them
US6361977B1 (en) 1992-11-24 2002-03-26 S. Christopher Bauer Methods of using multivariant IL-3 hematopoiesis fusion protein
US6057133A (en) * 1992-11-24 2000-05-02 G. D. Searle Multivariant human IL-3 fusion proteins and their recombinant production
US6413509B1 (en) 1992-11-24 2002-07-02 S. Christopher Bauer Methods of ex-vivo expansion of hematopoietic cells using interleukin-3 mutant polypeptides with other hematopoietic growth factors
US7091319B1 (en) 1992-11-24 2006-08-15 Bauer S Christopher IL-3 variant hematopoiesis fusion protein
US5581476A (en) 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
US5501962A (en) * 1993-06-21 1996-03-26 G. D. Searle & Co. Interleuken-3 (IL-3) human/murine hybrid polypeptides and recombinant production of the same
WO1995028427A1 (en) * 1994-04-15 1995-10-26 Imclone Systems Incorporated Chimeric interleukin-3/mutein interleukin-6 lymphokine
US5536495A (en) * 1994-04-15 1996-07-16 Foster; Preston F. Use of G-CSF to reduce acute rejection
US5582821A (en) * 1994-07-22 1996-12-10 Genetics Institute, Inc. Methods for treating bleeding disorders
CA2212006A1 (en) 1995-02-03 1996-08-08 G.D. Searle & Co. Novel c-mpl ligands
JP3763846B2 (ja) * 1995-04-26 2006-04-05 協和醗酵工業株式会社 新規ポリペプチド
US6540993B1 (en) 1995-06-27 2003-04-01 Wyeth Method of treating inflammatory bowel disease using a topical formulation of IL-11
US6887461B1 (en) 1998-10-26 2005-05-03 Genetics Institute, Llc Method of using IL-11 for treating mucositis
US6066318A (en) 1995-10-05 2000-05-23 G.D. Searle & Co. Multi-functional hematopoietic fusion proteins between sequence rearranged C-MPL receptor agonists and other hematopoietic factors
US6967092B1 (en) 1996-10-25 2005-11-22 Mc Kearn John P Multi-functional chimeric hematopoietic receptor agonists
US6884419B1 (en) 1996-12-23 2005-04-26 Kyowa Hakko Kogyo, Co., Ltd. hG-CSF fusion polypeptide having c-mpl activity, DNA coding for same and methods of treating anemia using same
US6242570B1 (en) * 1997-07-10 2001-06-05 Beth Israel Deaconess Medical Center Production and use of recombinant protein multimers with increased biological activity
US6187564B1 (en) 1997-07-10 2001-02-13 Beth Israel Deaconess Medical Center DNA encoding erythropoietin multimers having modified 5′ and 3′ sequences and its use to prepare EPO therapeutics
US6953777B2 (en) 1999-03-11 2005-10-11 Genetics Indtitute LLC Use of interleukin-11 to prevent immune-mediated cytotoxicity
BR0012429A (pt) 1999-07-15 2002-09-17 Genetics Inst Fórmulações para il-11
EP1731531B1 (en) * 1999-08-09 2012-05-30 Merck Patent GmbH Multiple cytokine-antibody complexes
MXPA02001417A (es) * 1999-08-09 2002-08-12 Lexigen Pharm Corp Complejos multiples de citosina-anticuerpo.
US6555660B2 (en) * 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
US6646110B2 (en) * 2000-01-10 2003-11-11 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF polypeptides and conjugates
US6831158B2 (en) * 2000-01-10 2004-12-14 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
NZ530545A (en) 2001-07-11 2006-10-27 Maxygen Holdings Ltd Specific conjugates comprising a polypeptide exhibiting G-CSF activity and a non-polypeptide moiety
US6982080B2 (en) 2002-03-15 2006-01-03 Wyeth Hydroxyethyl starch—containing polypeptide compositions
ES2359473T3 (es) 2003-07-21 2011-05-23 Transgene S.A. Citoquinas multifuncionales.
US7220407B2 (en) 2003-10-27 2007-05-22 Amgen Inc. G-CSF therapy as an adjunct to reperfusion therapy in the treatment of acute myocardial infarction
US7597884B2 (en) 2004-08-09 2009-10-06 Alios Biopharma, Inc. Hyperglycosylated polypeptide variants and methods of use
ATE544463T1 (de) 2004-11-05 2012-02-15 Univ Northwestern Verwendung von scf und g-scf bei der behandlung von hirnischämie und neurologischen störungen
MX2007015156A (es) 2005-06-01 2008-02-15 Maxygen Holdings Ltd Polipeptidos g-csf pegilados y metodos para la produccion de los mismos.
KR200462405Y1 (ko) 2010-10-18 2012-09-11 서상기 선물용 인형다발
LT6161B (lt) * 2013-09-27 2015-06-25 Uab Profarma Granuliocitų kolonijas stimuliuojančio faktoriaus sulieti baltymai su kitais augimo faktoriais, optimaliai su kamieninių ląstelių faktoriumi, ir jų gavimo būdas

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1203672B (it) * 1982-05-12 1989-02-15 Harvard College Proteina ibrida comprendente frammenti proteici collegati da legami peptidici e relativo gene di fusione composizione contenente tale proteina
WO1985004420A1 (en) * 1984-03-29 1985-10-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Novel dna and its use
US4691009A (en) * 1984-12-26 1987-09-01 Repligen Corporation Hybrid proteins produced by an ultrahigh prokaryotic expression system
ATE78262T1 (de) * 1985-06-11 1992-08-15 Ciba Geigy Ag Hybrid-interferone.
US4935233A (en) * 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
JPS63267278A (ja) * 1986-03-14 1988-11-04 Toray Ind Inc インタ−フエロン結合体を暗号化する塩基配列
US5032395A (en) * 1986-07-14 1991-07-16 Genetics Institute, Inc. Method of inducing leukocytosis with a combination of IL-3 and GM-CSF
EP0275300B1 (en) * 1986-08-01 1996-01-03 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Recombinant vaccine
EP0257406B2 (en) * 1986-08-06 1998-08-12 Ajinomoto Co., Inc. Recombinant B-cell differentiation factor
DE3879395T2 (de) * 1987-05-29 1993-06-24 Sagami Chem Res Fusionsprotein, enthaltend lymphotoxin.
EP0425536A4 (en) * 1988-07-20 1992-01-02 Immunex Corporation Nonglycosylated human interleukin-3 compositions
JPH02275714A (ja) * 1989-01-09 1990-11-09 Kao Corp 表面処理重曹粒子及びこれを含有する成型製剤
US5032396A (en) * 1989-02-17 1991-07-16 Immunex Corporation IL-7 to stimulate platelet production
CA2014473A1 (en) * 1989-04-14 1990-10-14 Hong-Ji Xu Purified, highly specific antibodies against gene products including retinoblastoma and method
AU5355790A (en) * 1989-04-19 1990-11-16 Cetus Corporation Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
CA2035868A1 (en) * 1989-07-06 1991-01-07 Richard C. Svrluga Hybrid molecules
US5073627A (en) * 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
US5108910A (en) * 1989-08-22 1992-04-28 Immunex Corporation DNA sequences encoding fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
ATE103932T1 (de) * 1989-08-22 1994-04-15 Immunex Corp Fusionsprotein bestehend aus gm-csf und il-3.
US5215895A (en) * 1989-11-22 1993-06-01 Genetics Institute, Inc. Dna encoding a mammalian cytokine, interleukin-11
US5238823A (en) * 1990-08-22 1993-08-24 Veterinary Infectious Disease Organization Interleukin-2-leukotoxin gene fusions and uses thereof
EP0503050A4 (en) * 1990-09-28 1994-07-06 Ortho Pharma Corp Hybrid growth factors

Also Published As

Publication number Publication date
DK0546124T4 (da) 2003-05-19
ATE167896T1 (de) 1998-07-15
EP0546124B1 (en) 1998-07-01
JP3149182B2 (ja) 2001-03-26
WO1992004455A1 (en) 1992-03-19
JPH06500116A (ja) 1994-01-06
CA2089553A1 (en) 1992-03-01
AU651152B2 (en) 1994-07-14
GR3027790T3 (en) 1998-11-30
CA2089553C (en) 2000-06-27
AU8917491A (en) 1992-03-30
DE69129697T2 (de) 1999-01-07
DE69129697T3 (de) 2004-01-29
DE69129697D1 (de) 1998-08-06
US5883230A (en) 1999-03-16
ES2118756T3 (es) 1998-10-01
EP0546124B2 (en) 2003-04-23
EP0546124A1 (en) 1993-06-16
DK0546124T3 (da) 1998-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2118756T5 (es) Estimuladores de hematopoyesis de multiples dominios.
RU2235729C2 (ru) Селективные агонисты и антагонисты il-2
JP2664698B2 (ja) Ｉｌ‐６の製造および用途
US4853332A (en) Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of biologically active proteins
US6955807B1 (en) IL-2 selective agonists and antagonists
US4588585A (en) Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
US4518584A (en) Human recombinant interleukin-2 muteins
US7361738B2 (en) Megakaryocyte stimulating factors
ES2314999T3 (es) Factor celular madre.
US5017692A (en) Truncated human interleukin-a alpha
KR970003518B1 (ko) 신규 영장류 조혈성장인자족(family)
KR100393508B1 (ko) 인간 인터루킨 4의 안타고니스트 또는 부분적 아고니스트로서의 신규hIL-4 변이단백질
PT772624E (pt) Interleucina-15
JPH05500211A (ja) 造巨核球因子
JPH0720431B2 (ja) ミュレル管抑制物質の活性を示すポリペプチドをコードするｄｎａ，組換ｄｎａおよび形質転換宿主
CA2041439A1 (en) Muteins of the granulocyte colony stimulating factor (g-csf)
IE61574B1 (en) Bifunctional proteins
US6319691B1 (en) Fusion proteins comprising IFN-alpha2b and TM-alpha1
Kamogashira et al. Site-specific mutagenesis of the human interleukin-1β gene: structure-function analysis of the cysteine residues
EP0517925A1 (en) Novel megakaryocyte amplifier and production thereof
US5925343A (en) Canine granulocyte macrophage colony stimulating factor
AU6767394A (en) Interleukin-15
JPH07501947A (ja) 野生インターロイキン６より改良された生物学的活性を有する突然変異インターロイキン６
KR100260350B1 (ko) 과립구 콜로니 자극인자의 유도체 단백질을 생산하는 재조합 미생물 및 그로부터 전기 재조합 단백질의 제조방법
CS273182B2 (en) Method of expressive vector production capable to give mature human leucocytic interferon in transformed strain of escherichia coli by means of expression

Legal Events

Date Code Title Description
FG2A Definitive protection

Ref document number: 546124

Country of ref document: ES