JPH06500116A - 多領域造血刺激因子類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 多領域造血刺激因子類 この発明は、リンカ−配列をもつかまたはもたない第二のリンホカインに融合さ れたインターロイキン３　［ＩＬ３］の存在を特徴とする融合分子に関する。融 合分子は、融合分子を形成する両ペプチドの通常の活性をもつことを特徴とし得 るかまたは、さらに、単にＩＬ３またはＸの存在という追加的機能をもつよりも 大きな生物学的または生理学的活性をもつことを特徴とし得る。融合分子はまた 、意外にも融合タンパク質のそれぞれの活性に大きな影響を与えるかまたはＩＬ ３またはＸの存在により期待されるものとは異なる活性を与え得る。

この発明により提供される新規ＩＬ３−ＸまたはＸ−ＩＬ３融合タンパク質は、 他のは乳類のタンパク質性の物質を実質的に随伴しない均質タンパク質である。

前記の式中のＸは、そのＤＮＡコーディング配列が直接またはリンカ−を通して ＩＬ３のＤＮＡコーディング領域とフレーム内に融合されたリンホカインを表わ す。「フレーム内に融合される」とは、ＩＬ３とＸタンパク質の読み取りフレー ム間に翻訳ターミネータ−がないことを意味する。この明細書に使用されている 「直接に」という用語は、ペプチドリンカ−をもたないＸおよびＩＬ３をコード するＤＮＡ配列の融合を定義する。Ｘなる要素は、ＩＬ３ｃＤＮＡ分子の５°ま たは３′末端に融合され得る。

ＩＬ３分子のＤＮＡおよびタンパク質配列は公表されており、様々な当技術の現 在の標準技術によって構築され得る。例えば、１９８８年、１月２８日公開され たＰＣＴ公開ＷＯ３８１００５９８参照。

Ｘの定義中に含まれるリンホカイン類は、０ＭＣ５Ｆ、ＧＣＳＦ、エリスロポエ チン、ＩＬＬ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＩ、１１ ゜またはＢ細胞刺激因子から成る群から選択される。現在包含に好ましいＸリン ホカイン類は、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬＩＩおよびＧＣＳＦから 成る群から選択される。さらに、この発明は、修飾されたＸ分子の使用またはこ れらのＸ分子をコードする突然変異されたまたは修飾されたＤＮＡ配列を含む。

これらのリンホカインのポリペプチドおよびＤＮＡ配列（天然または修飾された ）は、組み換えまたは化学合成技術によるそれの発現を得るための方法も同様だ が、当技術で開示されている。

Ｘの配列へのＩＬ３配列の融合を下記の実施例で記載された中間ベクターの使用 によって行い得る。別法として、ＩＬ３配列を直接、Ｘタンパク質コーディング 領域を含むベクターに挿入することができまた逆も同様である。ファージまたは プラスミド中のＤＮＡをクローンする技術は、当技術の熟練者に既知である。

従って、例えば、融合タンパク質ＩＬ３−ＧＣ３Ｆの遺伝子は、お互いにフレー ム内に融合され、直接またはペプチドリンカ−を通して適当な宿主細胞における 遺伝子の発現を調節することのできる調節領域に作動可能に連結された２つの領 域をコードするＤＮＡ配列を含むベクターとして構築される。融合は常法で行い 得る。［例えば、サムプルツクら、“モルキュラー・クローニング。ア・ラボラ トリ−・マニュアル”、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９ ８９年）参照。〕 リンカ−およびアダプターはＩＬ３およびＸ配列を結合したり、使用される制限 位置が関心がある領域に内在する場合、失われた配列を置き換えるのに使用され 得る。２つの分子を結合するリンカ−は、好ましくは、ＩＬ３およびＸタンパク 質がお互い独立して折りたたまれたり活動するよう作られる。この発明の実施例 において使用される１つの例示的なリンカ−の配列は、ＨＩＶ−１逆転写酵素中 に見られる配列に基づくもので、そのタンパク質のＣ−末端領域を端から２番目 の領域につなぐと考えられる。このペプチドは穏やかなタンパク質加水分解に感 受性があることが知られ、従って、タンパク質の外側表面にあると考えられてい る。この配列は高度に荷電され、それが、この配列を含むタンパク質の溶解性を 増す。ＩＬ３およびＸ分子を融合する際に、選ばれたリンカ−配列の多重複製を ２つの分子の間に挿入することができる。しかし、この発明は使用されるリンカ −配列の形、大きさ、または数によって制限されない。この発明の融合タンパク 質を製造するのに有用な別の模範的なリンカ−配列は、Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ 　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ＾ｓｐ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　 Ｇｌｙである。実際、リンカ−配列に対する唯一の必要条件は、それが機能的に 、融合分子の個々の成分を折りたたむことに有害な妨害をしないことである。さ らに、このようなリンカ−は、［Ｖに融合されたＩＬ３−ＸまたはＸ−ＩＬ３分 子では完全に欠は得る。

融合分子の構築および新規ＩＬ３−ＸまたはＸ−ＩＬ３融合タンパク質の発現の 方法中での使用のためのベクターもまた、この発明の一部を形成する。この発明 の融合タンパク質をコードするＩＬ３−ＸまたはＸ−ＩＬ３ＤＮＡ配列を含むベ クターまたはこの明細書に記載されている修飾配列を組み込むベクターもまた、 この発明の具体例であり、ＩＬ３−ＸまたはＸ−ＩＬ３タンパク質の製造に有用 である。

この方法で使用されるベクターはまた、この発明のＤＮＡコード配列と作動可能 に関連している選択された調節配列を含み、選択宿主細胞中でのその複製および 発現を指示することができる。融合遺伝子の転写を調節するための調節領域の使 用により、宿主細胞を、融合遺伝子の発現がないかまたは低水準の状態で高密度 にまで育成させ、その後栄養、温度その他のような環境条件を変化させることに より発現を誘導することができる。組み換えＩＬ３−ＸまたはＸ−ＩＬ３を製造 するのに使用するこのようなベクターにより形質転換された宿主細胞もまた、こ の発明によって提供される。

この発明はまた、他の霊長層のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を随伴せず、 ＩＬ３−ＸまたはＸ−ＩＬ３融合タンパク質をコードする、新規融合ＤＮＡ配列 を含む。ＤＮＡ配列は、お互いに好ましい近距離内に配列を置くように直接また コードするＤＮＡ配列の変形物もまたこの発明の融合分子およびその類似体また は誘導体に含まれる。ＩＬ３およびＸポリペプチド類をコードするが、遺伝子コ ードの同義性のためまたは対立遺伝子の変形（アミノ酸変化を起し得るかまたは 起し得ない種の集団における天然発生の塩基の変化）のために、コドン配列にお いて天然のＩＬ３またはＸと異なるＤＮＡ配列もまた、この発明に含まれる。点 突然変異によるかまたはその際コードされた融合タンパク質の活性、半減期また は製造を増強するために誘導された修飾によって起るＩＬ３またはＸのＤＮＡ配 列における変形もまたこの発明に含まれる。

この発明の融合分子を形成するペプチドまたはＤＮＡ配列における修飾は、既知 の技術を使う当技術の熟練者によって作られ得る。ＩＬ３またはＸ配列における この修飾は、それのコーディング配列における選択アミノ酸残基の置換、挿入ま たは欠失、グリコジル化位置または他の既知のペプチド修飾の挿入または分解を 含み得る。このような修飾はそれの生物学的特性を増大するために融合分子の成 分中でなされ得る。このような置換、挿入または欠失のための突然変異誘発技術 は、当技術の熟練者に既知である。［例えば、米国特許４５１８５８４号参照。

コその分子の全体的または部分的な生物学的または生理学的活性を保持すること が期待されるであろうＩＬ３またはＸの配列の他の類似体および誘導体もまた、 この明細書で開示されたこの発明の融合分子における使用のために当技術の熟練 者の１人によって容易に作られ得る。１つのこのような修飾は、既存の残基の置 換または１９９０年１１月１日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ９０／１２８７４号 に記載された挿入によってＩＬ３に、またはＸにまたはリンカ−ペプチド領域に おいて加えられたシスティン残基へのポリエチレングリコールの添加であり得る 。このような修飾はこの発明に含まれると思われる。

この発明はまた、ＩＬ３−ＸまたはＸ−ＩＬ３融合分子の製造方法を提供する。

この方法は、（１）融合タンパク質の発現をさせる条件下で、発現調節配列と作 動可能に連携したＩＬ３−ＸまたはＸ−ＩＬ３融合分子の発現をコードするＤＮ Ａ配列により形質転換された、適当な細胞または細胞系を培養培地中に培養し、 （２）培養培地からそのように製造された融合タンパク質を収穫することを含む 。

適当な好ましい細胞は細菌細胞である。例えば、大腸菌の様々な菌株（例えば、 ＨＢＩＯＩ、ＭＣ１０６１および後記の実施例中で使用された菌株）はバイオテ クノロン−の分野における宿主細胞として既知である。枯草菌、プソイドモナス 、他のかん菌その他もまた、この方法中で使用され得る。他の適当な細胞は、例 えばＣＯ８およびＣＨＯなどのは乳類の細胞である。

適当な細胞の選択および形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび製品製造 および精製の方法は当技術で既知である。例えば、ゲシングおよびサムプルツク 、ネーチャー、２９３巻、６２０−６２５頁、（１９８１年）、カウフマンら、 モルキュラー・セルラー・バイオロジー９．５巻（７）　、１７５０−１７５９ 頁（１９８５年）またはハウリーら、米国特許４４１９４４６号参照。

当技術の熟練者らに既知のイースト菌細胞、真菌細胞、または昆虫細胞もまた、 この発明の融合分子の発現のための宿主として有用であり得る。例えば、ミラー ら、ジェネティック・エンジニアリング、８巻、２７７−２９８頁、（ブレナム ・プレス　１９８６年）およびその中の資料参照。

細胞溶菌液または前記の宿生細胞のいずれかの培養培地の抽出液からのこの発明 の融合タンパク質の収穫を常法のタンパク質分離法により行なうことができる。

医薬的に許容され得る媒体との混合物としての、治療上有効な量の融合タンパク 質ＩＬ３−ＸまたはＸＩＬ−３を含む医薬組成物がこの発明に含まれる。これら の医薬組成物は、多（の病理学的または疾病状態、特に、低水準の骨髄、赤芽球 、リンパ球または造血組織の巨核球またはそれの組合せを特徴とするものの処置 に適している。さらに、融合タンパク質は、成熟骨髄および／またはリンパ球細 胞活性化に遺した医薬組成物の製造に使用され得る。例えばＩＬ３−ＩＬＩＩ融 合分子を含む医薬組成物は、巨核球および血小板の生成および／または成長を刺 激するのに有用であり得る。この発明の医薬組成物による処置に感受性がある状 態の中には白血球減少症、末梢血中の循環白血球（白血球）の数の減少がある。

白血球減少症は、特定のウィルスまたは放射線にさらされることによって誘導さ れ得る。それは化学療法剤にさらされることの副作用であることも多い。この発 明の医薬組成物は、現在入手可能な薬品によって起る望ましくない副作用を避は 得る。さらに、この発明のタンパク質の多領域特性は、個別にＩＬ３またはＸリ ンパ液のみを含む医薬組成物の使用と比較して、より低い用量の医薬組成物の使 用を可能にし得る。

様々な免疫不全または免疫障害もまた、この発明の医薬組成物による処置に対し て感受性がある。これらの医薬組成物は、単独でまたは他の療法との組合せで、 例えば、ＨＩＶＳＨＴＬＶＩまたはＨＴＬＶＩ　Ｉなどのウィルス感染の結果、 放射線多量被曝、癌治療または他の医療の結果である免疫不全の処置または矯正 に有用であり得る。Ｘが何であるかによって異なるが、医薬組成物を、血小板減 少症（血小板不全）、または貧血（赤血球不全）を含む、他の血液細胞不全を処 置するのに使用し得る。他の用途は骨髄移植から回復した患者の処置における使 用である。

このような医薬組成物は、医薬的に許容され得る担体との混合物として治療上有 効な量のこの発明の融合タンパク質ＩＬ３−ＸまたはＸ−ＩＬ３を含む。この組 成物は、非経口で組織的に投与され得る。別法として、この組成物は静脈注射に より投与され得る。所望により、この組成物は皮下投与し得る。組織的に投与さ れる場合、この発明における使用のための治療組成物は、発熱物質を含まない、 非経口的に許容され得る水溶液の形態にある。ｐＨ，等強性、安定性その他に必 要な考慮を払った、このような医薬的に許容され得るタンパク質溶液は、当技術 の範囲内にある。

下記の実施例は、この発明の実例となる融合タンパク質の構築および製造を記載 している。

実施例１−多領域ＩＬ３分子の構築 ＩＬ３−Ｘ融合タン融合タンパ石質めに、２つのＩＬ３　ｃＤＮＡ配列を、１９ ８８年１月２８日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ３８１００５９８号中に記載され た方法に従って得た。２つのｃＤＮＡ配列をＤＮＡの短片と共に融合した。この ＤＮＡは、２つのＩＬ３タンパク質が互いに独立して折りたたまれ作用するよう 設計されたリンカ−ペプチドをコードしていた。

このリンカ−ペプチドの配列は、前記のＨＩＶ−１逆転写酵素中に見られた配列 に基づいたものである。この融合物中で使用されたリンカ−の配列は、下記のと おりである。

ｃｌｙ　Ａｓｐ　入１ａ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｅ　Ｌ＠ｕ　 Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　ＧｌｙＩＬ３　ｃＤＮＡとリンカ−領域を融合するのに使用さ れる方式は、マニアチスら、“モルキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ− ・マニュアル１、コールド・スプリング・ハーバ−研究所、コールド・スプリン グ・ハーバ−、ニューヨーク（１９８２年）中に記載された常法の組み換え工法 を使っている。融合物の構築を図１に示した。簡単に記すと、ｒＩＬ３　ｃＤＮ Ａ配列、マイナスその分泌リーダーをコードする配列」は、下記の表Ａの上部に 見られる５°末端および３゜末端をもっていた。ＸｂａＩおよびマング・ビーン ヌクレアーゼ、またはＮｄｅ　１による消化後のこれらのＩＬ３配列は、表Ａの 下部に見られる５′末端および３°末表Ａ 遺伝子の３゛末端：　遺伝子の５゛末端：ＡＴＣＴＴＣＴＡＧ　Ａ　ＣＡＴ　Ａ ＴＧ　ＧＣＴＴＡＧ　ＡＡＧ　ＡＴＣＴ　ＧＴＡ　ＴＡＣＣＧＡｌｌｅ　Ｐｈｅ 　停止　ＭｅｔＡＩａ −−ＸｂａＩ−−−ＮｄｅＩ− 遺伝子の３°末端：　遺伝子の５°末端：ＡＴＣＴＴ　Ｔ　ＡＴＧ　ＧＣＴ ＴＡＧ　ＡＡ　ＡＣＣＧＡ 消化されたＩＬ３配列を、大腸菌中の細胞内での異型タンパク質の発現のために 設計されたプラスミド、ｐＡＬｈｌＬ３−７８１中に挿入した。このプラスミド を説明のためにだけ記載する。記載された融合分子を製造するために記載された 方法は、同一のまたは異なる成分配列、制限部位などを含む他のプラスミドを用 い得る。他の例示的なプラスミドは、別の転写ターミネータ−配列を含むｐＡＬ １８１　［ＡＴＣＣ寄託物　＃４０１３４１の修飾された型である。図Ｉに記さ れている、プラスミド　ｐＡＬｈＩＬ３−７８１は、イニシェークーメチオニン および適当に隔てられたリポソーム結合位置をフレーム中に融合した成熟ＩＬ３ の完全なｃＤＮＡ配列、ＩＬ３ｃＤＮＡの転写を制御し、推進するファージλか らのおもに左方向のプロモーター、転写を終結させるＩＩ、３配列の３°末端を 越える配列、プラスミド中の３つの独特の制限部位、を特徴とする。ＩＬ３遺伝 子およびイニシエーターメチオニンのコーディング配列を含むものに対する１つ の部位は５゛はＮｄｅＩである。別の位置が、ＩＬ３遺伝子、ＸｂａＩの３′末 端における対して５゛である。

プラスミドの２つの試料を製造した。１つはＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩおよ びＩＬ３ｃＤＮＡを含む小断片により切断し、精製した（図１の右側参照）。第 二番目はＸｂａＴで切断し、マングビーンエキソヌクレアーゼで処理し、−末鎖 ＤＮＡ尾部を除去し、ＨｉｎｄｌｌＩで消化した。より大きな断片を分離した（ 図Ｉの左側を参照）。２つの分離された断片を、前記の配列の合成リンカ−オリ ゴヌクレオチドと混合し、ＴＡ−ポリヌクレオチドリガーゼで処置した。リゲー ション後の２つのＩＬ３配列間の結合領域の配列は、下記のとおりである。

２つのＩＬ３コーディング配列および１つ以上のリンカ−配列が共に融合された プラスミドを、リンカ−配列および立証された融合結合の配列にハイブリダイズ するコロニーによって選択した。ＩＬ３配列間に挿入された１つ以上のリンカ− をもつプラスミドの存在は予期されなかった。これらの多重リンカ−プラスミド は多分、近接のリンカー二重らせんの鈍い末端に結合されるようにリンカー二重 らせんのＴＡ−末鎖尾部を除去する少量のヌクレアーゼまたはマングビーンヌク レアーゼの残り物のＤＮＡリガーゼ中への混入から生じた。

一度ブラスミドが構築されると、それらは、多領域ＩＬ３発現のための、Ｗ３１ １０（ラムダＰａａ＋ｃＩ８５７）［Ｍ、　ローゼンバーグら、メンズ・オフ・ エンザイモロジー、１０１巻、１２３−１３７頁（１９８３年）および前記、サ ムプルツクら、コなどの適当な大腸菌菌株へ形質転換された。この実験のために 選択された２つのプラスミドは、各々１つおよび３つのリンカ−配列によって分 離される２つのＩＬ３　ｃＤＮＡ配列を含んでいる。リンカ−の１つの複製を含 むｐＡＬＩＬ３１−７８１が図１の下部に示されている。これらの融合分子は、 それぞれ３１と３４キロダルトンのタンパク質を生成した。

タンパク質は、細胞内に不溶性の細胞封入体として蓄積し、標準方法によって可 溶化され、折りたたまれた［例えば、米国特許第４５１２９２２号、参照］。下 記実施例９中のＣＭＬ検定において試験されたとき、タンパク質は、天然または 組み換えＩＬ３の活性と等しいかまたはそれより大きいＩＬ３活性を示した。

実施例２−ＩＬ３／ＧＭＣ５Ｆ融合タンパク質別の融合タンパク質を、顆粒細胞 マクロファージコロニー刺激因子、ＧＭＣＳＦをコードするＤＮＡ配列とＩＬ３ 　ｃＤＮＡ配列をフレーム中に融合することによって形成した。ＧＭＣＳＦ　ｃ ＤＮＡ配列は、１９８６年１月３０日に発行された欧州特許第１８８４７９号に 記載されている。２つのｃＤＮＡ配列を、同じ方法によフて実施例１中に記載さ れたリンカ−ＤＮＡの短片と一緒に融合した。

ＩＬ３−ＧＭＣ３Ｆ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を構築するために使 用された仕組みを図２に図式的に示している。ＩＬ３　ｃＤＮＡを、実施例１中 に記載されたように修飾された、発現プラスミド、ｐＡＬ１８１中に挿入した。

ｒＧＭＣ３Ｆ　ｃＤＮＡ、マイナスその分泌リーダー」をコードする配列を、ｐ ＡＬ１８１の非修飾型に挿入してプラスミドｐＡＬＣ−１８１にした。ＩＬ３プ ラスミド、ｐＡＬｈＩＬ３−７８１をＸｂａＩで消化してからマングビーンエキ ソヌクレアーゼで処理して一本鎖ＤＮＡ尾部を除去した。次にプラスミドをＡｖ ａｌで消化し、ＩＬ３コーディング配列をもつ生成した小断片を分離した。ＧＭ ＣＳＦ発現プラスミド、ｐＡＬ、Ｃ−１８６をＮｄｅＩおよびＡｖａＩで消化し 、Ｃ；ＭＣ３Ｆ遺伝子をもつ大きな断片を分離する。２つの断片を、実施例１に 記載されたリンカ−ペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチド類と混合し、 ＴＡ−ポリヌクレオチド　リガーゼで処理した。Ｎ−末端領域としてＩＬ３を、 Ｃ末端領域としてＧＭＣＳＦをもつタンパク質をコードする遺伝子を形成するよ うに、ＩＬ３　ｃＤＮＡ、リンカ−オリゴヌクレオチド、ＧＭＣＳＦ　ｃＤＮＡ 配列が隣接して融合されたプラスミドを、選択した。

ＩＬ３−ＧＭＣＳＦ融合タンパク質、ｐＡＬＩＬ３−ＧＭ１８１の遺伝子をもつ プラスミドを、融合タンパク質発現のための実施例１中に記載されたような適当 な大腸菌宿主菌株に形質転換した。発現されると、融合タンパク質は、前記の標 準方法によって可溶化され折りたたまれる不溶性の細胞封入体として細胞内に蓄 積する。この融合タンパク質の活性を、実施例９中に記載された［ＣＭＬ］検定 において試験する。

実施例３−ＩＬ３／ＧＣ８Ｆ　融合タンパク質料の式ＩＬ３−Ｘの模範融合タン パク質を顆粒球コロニー刺激因子、ＧＣ８ＦをコードするＤＮＡ配列とともにＩ Ｌ３ｃＤＮＡ配列をフレーム中に融合することによって形成した。この融合のた めのＧＣ３Ｆ　ｃＤＮＡはンエネティクス・インスティチュート社から得られ、 １９８７年２月２６日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ３７１０１１３２号中の配列 をもつ。この融合分子をＩＬ３−ＩＬ３について記載したのと同様の方法で構築 した。具体的には、この融合を実施例１中に記載されたリンカ−ＤＮＡ配列によ って仲介した。

ＩＬ３−ＧＣ３Ｆ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を構築するのに使用さ れる仕組みを図式的に図３に示した。ＩＬ３およびＧＣ８Ｆ　ｃＤＮＡ、マイナ スこれらのリーダー配列を、実施例１中に記載されたように修飾された発現プラ スミド、ｐＡＬ１８１に挿入した。ＩＬ３発現プラスミドｐＡＬｈｌＬ３−７８ １をＸｂａｌで切断し、−末鎖ＤＮＡ尾部を除去するためにマング・ビーンエキ ソヌクレアーゼで処理し、ＨｉｎｃｉＩＩＩで消化した。やや大きな断片を分離 した。ＧＣＳＦ発現プラスミドｐＡＬＧ、−７８１をＮｄｅＩおよびＨｉｎ　ｄ 　ＩＩＩで切断し、ＧＣ３Ｆ遺伝子を含む小断片を精製した。２つの分離された 断片を実施例１で使用されたのと同じリンカ−ペプチドをコードする合成オリゴ ヌクレオチドと混合し、ＴＡ−ポリヌクレオチドリガーゼで処理した。Ｎ−末端 領域としてＩＬ３を、Ｃ末端領域としてＧＣ５Ｆをもつタンパク質をコードする 遺伝子を形成するようにＩＬ３　ｃＤＮＡ、リンカ−オリゴヌクレオチドおよび ＧＣ８Ｆ　ｃＤＮＡ配列が隣接して融合されたプラスミドを、選択した。

ＩＬ３−ＧＣ３Ｆ融合タンパク質、ｐＡＬＩＬ３Ｇ−７８１の遺伝子をもつプラ スミドを、融合タンパク質の発現のための実施例１に記載された適当な大腸菌宿 主菌株へと形質転換した。

発現されると、融合タンパク質は不溶性の細胞封入体として細胞内に蓄積し、前 記の標準方法によフて可溶化され折りたたまれた。生成タンパク質は下記実施例 のＭ０７Ｅ、３２ＤおよびＤＡ２増殖検定においてＩＬ３活性およびＧＣ８Ｆ活 性をもっていた。

実施例４−ＧＣ８Ｆ／ＩＬ３融合タンパク質式Ｘ−ＩＬ３の代表的融合タンパク 質を、ＩＬ３　ｃＤＮＡ配列を顆粒細胞コロニー刺激因子、ＧＣ８Ｆをコードす るＤＮＡ配列とフレーム内かつ３′で融合することによって形成した。この融合 分子を、ＩＬ３／ＧＣ３Ｆについて記載されたのと同様の方法で構築した。具体 的には、融合は、実施例１中に記載されたリンカ−ＤＮＡ配列によって仲介され た。

ＧＣ８Ｆ−ＩＬ３融合融合タンパクコードするＤＮＡ配列を構築するのに使用さ れる機構を図４に図式的に示している。ＩＬ３およびＧＣ５Ｆ　ｃＤＮＡを実雄 側１中に記載された修飾発現プラスミドｐＡＬ１８１に挿入した。ＧＣＳＦ　ｃ ＤＮＡは、３°末端に１つの５ｔｙｘ位置を、遺伝子のコーディング配列の内部 に別の１つをもつ。内部部位は位置指定突然変異導入法によって変化し、タンパ ク質配列は変わらないままであった。生成したプラスミド、ｐＡＬＧゎ−７８１ を５ｔｙｌで切断し、−末鎖ＤＮＡ尾部を除去するためにマング・ビーンエキソ ヌクレアーゼで処理し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。より大きな断片を分離した 。ＩＬ３発現プラスミド、ｐＡＬｈｌＬ３−７８１をＮｄｅｌおよびＨｉｎｄＩ ＩＩで切断し、ＩＬ３遺伝子を含む小断片を精製した。２つの分離した断片を、 実施例１で使用されたのと同じリンカ−ペプチドをコードする合成オリゴヌクレ オチドと混合し、Ｔ４−ポリヌクレオチドリガーゼで処理した。Ｎ−末端領域と してＧＣＳＦを、Ｃ末端領域としてＩＬ３をもつタンパク質をコードする遺伝子 を形成するように、ＧＣＳＦ、リンカ−オリゴヌクレオチド、およびＩＬ３　ｃ ＤＮＡ配列が隣接して融合されたプラスミドを、を選択した。

ＧＣＳＦ−ＩＬ３融合タンパク質、ｐＡＬＧＩＬ３−７８１の遺伝子をもつプラ スミドを、融合タンパク質の発現のための実施例１中に記載された適当な大腸菌 宿主菌株へと形質転換した。

発現されると、融合タンパク質は細胞内で不溶性の細胞封入体として蓄積し、前 記の標準方法によって可溶化し、折りたたまれた。融合タンパク質は実施例９で 記載されたインビトロ細胞刺激検定ＭＯ７Ｅ、３２Ｄ、およびＤＡ２増殖検定に おいてＧＣＳＦおよびＩＬ３活性の両方をもっていた。

実施例５−ＩＬ３／ＩＬＩＩ融合タンパク質式ＩＬ３−Ｘの別の模範融合タンパ ク質を、ＩＬ３　ｃＤＮＡ配列をインターロイキン１１　［ＩＬｌｌｌの成熟型 をコードするＤＮＡ配列でフレーム中に融合することによって形成した。ＩＬｌ ｌの配列およびそれを得る方法が１９９１年５月３０日に公開されたＰＣＴ公開 Ｗ０９１１０７４９５号中に詳しく記載されている。ＩＬＩＩ　ｃＤＮＡを、ヒ トＩＬＩＩ中に見られるのと同じ第一アミノ酸配列をもつが、天然のｃＤＮＡよ り細菌の発現に適合するコドンを使ったタンパク質をコードするために、合成オ リゴヌクレオチドから構築した。この修飾ＩＬ１１遺伝子の配列を下記の表Ｂに 示している。遺伝子融合物を実施例３中に記載されたのと同様の方法で構築した 。特異的に、融合は実施例１に記載されたリンカ−ＤＮＡ配列によって仲介され た。

表Ｂ ＩＬ３−ＩＬＩＩ融合タ融合タンパク−ドするＤＮＡ配列を構築するために使用 された機構を図５に図式で示した。ＩＬ３発現プラスミド、ｐＡＬｈｌＬ３−７ ８１を実施例３に記載されたように処理した。ＩＬ１１配列を、約１５０塩基対 の断片中へ７０−９０塩基対のオリゴヌクレオチドをライゲートし、それらを逐 次発現プラスミド、ｐＡＬ１８１中に挿入することによって合成し、全遺伝子を 作り上げた。全ＩＬｌｌコーディング配列が構築されると、ｐＡＬＩＬｌｌ−７ ８１と呼ばれるプラスミドはＩＬＩＩタンパク質の合成を指定することができる 。

発現プラスミドをＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＩＬ１’ｌ遺伝子を 含む小断片を精製した。ＩＬＩＩ　ｃＤＮＡ断片および切断された実施例１中に 記載されたように製造されたＩＬ３発現ベクターを実施例１中に記載されたリン カ−ペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチドと混合し、Ｔ４−ポリヌクレ オチドリガーゼで処理した。Ｎ−末端領域としてＩＬ３、Ｃ−末端領域としてＩ ＬＩＩをもつタンパク質をコードする新しい遺伝子を形成するように、ＩＬ３　 ｃＤＮＡ。

リンカ−オリゴヌクレオチド、およびｒＬ１１遺伝子配列が隣接して融合された プラスミドを、選択した。

ＩＬ３／ＩＬ１１融合タンパク質、ｐＡＬＩＬ３１１−７８１の遺伝子をもつプ ラスミドを適当な大腸菌宿主菌株へと形質転換し、融合タンパク質を実施例１に 記載されているように発現し収穫した。収穫された融合タンパク質は、実施例９ 中に記載されているＴ１０検定およびＭＯ７ＥＯ７−おいて活性をもっていた。

実施例６−■Ｌ３／ＩＬ９　融合タンパク質式ＩＬ３−Ｘの別の代表的融合タン パク質を、インターロイキン９　［ＩＬ９］の成熟型をコードするＤＮＡ配列の フレーム中にＩＬ３　ｃＤＮＡ配列を融合することによって形成する。ＩＬ９の 配列およびそれを得る方法は１９９０年、１１月２９日に公開された、ＰＣＴ公 開ＷＯ９０／１４４３２中に詳細に記載されている。

前記の公開公報中に記載されたＩＬ９　ｃＤＮＡは、ヌクレオチド９４でＢａｍ Ｈｌによる切断部位をもち、ヌクレオチド４９０でＨｉｎｄＩＩＩによる切断部 位をもつ。この３９６塩基対断片をもとのｃＤＮＡクローンから分離する。この ＩＬ９　ｃＤＮＡ断片および実施例１中に記載したように製造した切断ＩＬ３発 現ベクターを、リンカ−配列をコードするオリゴヌクレオチドおよび成熟ＩＬ９ タンパク質の最初の７コドンと混合する。このリンカ−の配列は下記の通りであ る。

この混合物をＴ４−ポリヌクレオチドリガーゼで処理する。Ｎ−末端領域として ＩＬ３を、Ｃ−末端領域としてＩＬ９をもつタンパク質をコードする新しい遺伝 子を形成するように、ＩＬ３　ｃＤＮＡ、リンカ−オリゴヌクレオチド、ＩＬ９ ｃＤＮＡ配列が隣接して融合されたプラスミドを、選択する。

ＩＬ３／ＩＬ９融合タンパク質の遺伝子をもつプラスミドを、融合タンパク質の 発現のための実施例１中に記載された適当な大腸菌宿主菌株へと形質転換する。

この融合タンパク質の活性を実施例９中に記載されたＭ０７Ｅ検定中で試験する 。

実施例７−ＩＬ３／ＩＬ６　融合タンパク質式ＩＬ３−Ｘの別の代表的融合タン パク質を、ＩＬ３　ｃＤＮＡ配列をインターロイキン６［ＴＬ６］の成熟型をコ ードするＤＮＡ配列のフレーム中に融合することによって形成する。ＩＬ６の配 列およびそれを得るための方法は、１９８８年１月１４日に公開されたＰＣＴ公 開　ＷＯ２８１００２０６号に詳細に記載されている。

前記の開示中に記載されたプラスミドｐＡＬ３０９ｃｍ７８１中に含まれたＩＬ ６　ｃＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＮｄｅｌおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断す る。断片をコードする小ＩＬ６を精製する。このＩＬ６　ｃＤＮＡ断片および実 施例１中に記載した通りに製造した切断されたＩＬ３発現ベクターを実施例１に 記載したリンカ−ペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチドと混合し、Ｔ４ −ポリヌクレオチドリガーゼで処理する。Ｎ−末端領域としてＩＬ３を、Ｃ−末 端領域としてＩｔ６をもつタンパク質をコードする新しい遺伝子を形成するよう にＩＬ３　ｃＤＮＡ配列が隣接して融合されているプラスミドを、選択する。

ＩＬ３／ｌＬ６融合タンパク質の遺伝子をもつプラスミドを、融合タンパク質の 発現のための実施例１中に記載された適当な大腸菌宿主菌株へと形質転換する。

この融合タンパク質の活性を実施例９中に記載されたＭＯ７ＥおよびＴＩＯ検定 中で試験する。

実施例８−　組み換えＩＬ３−Ｘ融合タンパク質の発現実施例の融合タンパク質 を発現するために、融合タンパク質をコードする前記のプラスミド中のＤＮＡを 、そのうちのは乳類、昆虫、イースト菌、菌類および細菌の発現の多くの型が当 技術で既知である適当な発現ベクターに、標準分子生物学技術によって形質転換 する。

ａ、　細菌発現系 当技術の熟練者は、コーディング配列に隣接するは乳類の調節配列を削除し、細 菌細胞によるこの発明の融合タンパク質の細胞内または細胞外の発現のための細 菌ベクターをつくる細ｍｙｓｍ配列を挿入することによって、ＩＬ３−Ｘおよび Ｘ−ＩＬ３タンパク賀をコードする配列を操作することができる。融合タンパク 質をコードするＤＮＡを、当技術で既知である細菌の発現を最適化する様々なコ ドンを含むように、さらに修飾することができる。融合タンパク質をコードする 配列を、当技術で既知の方法によって融合タンパク質の細菌発現、分泌およびプ ロセシングをさせる分泌リーダーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に 作動的にフレーム内で結合させることができる。別法として、ＩＬ３−Ｘまたは Ｘ−ＩＬ３融合物を、細胞内発現および当技術で既知の方法によって分離、混合 、折りたたまれたタンパク質のために構築することができる。次に、細菌宿主細 胞内のルートを通って発現された融合タンパク質を、全て既知の方法によって、 採取し、精製するおよび／または物理化学的、生化学的および／または臨床的パ ラメーターについて確認することができる。

ｂ、は乳類細胞発現 融合タンパク質の発現を得るために、は乳類の細胞、ｐＸＭ、およびＹ、　Ｃヤ ンら、セル、４７巻、３−１０頁（１９８６年）に記載されている一般的方法を 使用し得る。また、この発明の実施に有用なベクター構築技術およびベクター成 分の記述については、カウフマン、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ デミ−・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳＡ、８２巻、６８９−６９３頁（１９ｇ ５年）、カウフマンら、ジャーナル・オブ・モルキュシー・バイオロジー、１５ ９巻、５１１−５２１１ｊ　（１９８２年）、およびカウフマン、プロシーディ ング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、ＵＳＡ、８２巻、６ ８９−６９３頁（１９８５年）参照。

当技術の熟練者はまた、例えば、各プラスミドの融合タンパク質のＤＮＡ配列に 適当な酵素を挿入したり、既知の組み換え遺伝子工学技術や他の既知のベクター を用いることによって、ｐＸＭベクターに匹敵する他のは乳類の発現ベクターを 構築することもできる。

ベクターＤＮＡの安定な一体化、および一体化されたベクターＤＮＡのそれに続 く増幅のために、常法を使ってＣＨＯ細胞を用いることができる。ＩＬ３−Ｘま たはＸ−ＩＬ３をもつこれらのベクターの適当な宿生細胞への形質転換は融合タ ンパク質の発現をもたらし得る。生成細胞系は適当な薬剤選択によって増殖され 得、生成細胞系は再クローンされ、発現の水準をＩＬ３−Ｘ融合タンパク質の成 分の適当な検定法を使って評価し得る。この方法は、Ｘが望ましくグリコジル化 された、例えばエリスロボエチンのとき、特に有用である。

Ｃ昆虫またはイースト菌細胞発現 同様の操作を、昆虫細胞中のこれらの融合タンパク質の発現のための昆虫ベクタ ーの構築のために行い得る［例えば、１９８５年９月２５日公開の欧州特許第１ ５５４７６号記載の方法を参照。］ 同様に、イースト菌ベクターを、イースト細胞内で融合タンパク質を発現して細 胞内で発現されたまたは分泌された細胞外の活性融合タンパク質を生み出すイー スト菌調節配列を使用して構築する。［例えば、１９８６年１月３０日公開のＰ ＣＴ公開ＷＯ３６１００６３９号、１９８４年１０月３１日公開の欧州特許ＥＰ Ｉ２３２８９号などを参照。］菌類のベクターもまた、これらの融合分子の発現 に使用し得る。

実施例９−ＩＬ３−Ｘの生物学的活性 記載された全ての増殖検定において、基本的な構成は下記の通りである。

検体および標準溶液を、Ｕ字底微量滴定皿中の検定培地中に、１００μｍ／ウェ ルの最終容量で希釈する。はとんどの場合５倍の連続希釈が適当である。標的細 胞を活発に成長している培養物から収穫し、遠心分離し、洗浄し、各検定用に最 適化された濃度で検定培地中に再懸濁する。即ち、１００μｍの細胞懸濁液を、 最終容量２００μｍ／ウェルになるよう各ウェルに添加する。プレートを３７℃ で完全に湿ったインキュベーター中にインキュベートし、下記の各検定中に記載 されている０、５ｕＣｉ　［３Ｈ］−チミジン／ウェルでパルスする。増殖を、 ［”Ｈ］　−チミジンの細胞への挿入によって測定する。生物活性を、ＩＬ３／ Ｘ融合１ｍ融合１赤ｌ単位の最終濃度が、検定中の［３Ｈ］−チミジンの５０％ の組み込みになる半最大希釈単位で測定する。

ａ、ＣＭＬ検定 白血痰芽細胞の増殖を刺激するＣＭＬ検定を、ブラッド、６３巻（４）、９０４ −１１１頁（１９８４年）記載の方法に本質的に従って行なった。細胞のストッ クを安定期のＣＭＬ患者の末梢血の凍結バッグから得た。バッグを溶がし、５０ ０アリコートの１．７Ｘ１０’細胞／バイアルとして再凍結した。検定を始める １日前に、１バイアルの細胞を溶かし、細胞を１０ｍ１のＲＰＭＩ＋５％加熱不 活性ヒトＡＢ血清（ＨｉＨＡＢ）で洗浄する。細胞を１０ｍ１の同培地に再懸濁 し、−晩にわたって３７℃で５％のＣＯ２中でインキュベートする。次の日、細 胞を培養物から除去し、フィコル処理し、洗浄し、検定培地中に再懸濁する。

検定を、ＲＰＭＩ＋１０％加熱不活性胎児ウン血清（ＨｉつＣＳ）　、２ｍＭグ ルタミン（ＧＬＮ）およびＰ／Ｓ　（１００Ｕ／ｍｌペニンジン、１００　ｕｇ ／ｍｌストレプトマイシン）中で行なう。細胞の播種密度は、２Ｘ１０’細胞／ ウエルである。プレートを４８時間５％のＣＯ□の中でインキュベートし、検定 の最後の６時間［３Ｈ］−チミジンでパルスする。ＣＭＬ細胞はｈＧＭＣＳＦと ｈＩＬ３の両方に反応する。従って、実施例２の融合タンパク質中の各サイトカ インの活性を別々に定量するためには、ｈＧＭＣＳＦまたはｈｒＬ３に対する抗 体を中和することを含むことが必要である。

ｂ、Ｍ０７Ｅ　検定 ＭＯ７ＥＯ７系を、急性血小板再生白血病の幼児の末梢血から誘導した。ＭＯ７ Ｅ細胞の成長は、ヒトＧＭＣ５Ｆ、ヒトＩＬ３またはヒトＩＬ４の存在による。

ＭＯ７Ｅ細胞を、１ミリリットル当り８単位の組み換えヒトＩＬ−３を補われた 、ＤＭＥプラス１０％加熱不活性ＦＣ５，グルタミンおよびＰ／Ｓ中に置く。

検定を、ヒトＩＬ−３を添加しない同じ培地中で行なう。細胞の播種密度は、１ ウェル当り１０’細胞である。プレートを３日間１０％ｃｏ□中でインキュベー トし、最後の４時間を［３Ｈ］−チミジンでパルスする。

ＣＭＬ検定に記載されているように、ＭＯ７Ｅ細胞は、中和抗体の使用を必要と するｈ　ＧＭＣＳ　ＦおよびｈＩＬ３の両方に対応する。

［３Ｈ］−チミジンの挿入に基づいて、全てのＩＬ−３／Ｘ融合例のＩＬ３−含 有融合タンパク質は、このＣＭＬ検定中の白血病幼若細胞の増殖を刺激すること において活性である。

ｃ、ＴＦ−１検定 ＴＦ−１細胞系を赤白血痰の患者の骨髄から誘導した［Ｔ、キタムラ、東京大学 コ。細胞を、１ｍｌにつき１００単位の組換えヒ）ＧＭＣＳＦを補ったＰＲＭＩ プラス１０％加熱−不活性ＦＣ３，グルタミンおよびＰ／Ｓ中で成育する。検定 を、ｈｃ；ＭＣＳ　Ｆを添加しない同じ培地中で行なう。細胞の播種密度は、１ ウエルにつき７．５Ｘ１０３細胞である。プレートを５％ＣＯ２中で３日間イン キュベートし、最後の４時間を３Ｈ−チミジンでパルスする。ＣＭＬ検定中に記 載されているように、ＴＦ−１細胞は、中和抗体の使用を要するｈＧＭＣＳＦお よびｈＩＬ３の両方に対応する。

チミジン捕集法に基づいて、ＩＬ３／Ｘ融合タンパク質は、これらの赤白血痰細 胞の増殖を刺激することにおいてこの検定中で活性である。

ｄ、３２Ｄ　増殖検定 ３２Ｄは、１０％加熱不活性ＦＣ５、グルタミン、および２０％ＷｅＨｉ３Ｂ条 件培地をネズミ■Ｌ３の源としてもつＰ／Ｓを含むＲＰＭＩ中で生育したネズミ ＩＬ３−依存細胞系である。これらの細胞はＧＣＳＦの存在下で増殖する。

検定を、５％加熱不活性ＦＣ５，グルタミンおよびＰ／Ｓを含むＲＰＭＩ中で行 なう。播種密度は、１ウェル当り２Ｘ１０’細胞である。プレートを５％ＣＯ２ 中で２４時間インキュベートし、最後の４時間を［”Ｈ］−チミジンでパルスす る。

ｅ、　ＤＡ２　増殖検定 ＤＡ２は、ネズミＩＬ−３中で同じようによく生育するＬＩＦ依存ネズミ細胞系 である。細胞を、５％加熱−不活性ＦＣ３、グルタミン、Ｐ／Ｓおよび５００単 位／ａｌ１組み換えヒトＬＩＦを含むＲＰＭＩ中で維持する。

ＤＡ−２検定を、３２Ｄ検定と同じ培地中で行なう。細胞の播種密度は１ウエル につき７．５Ｘ１０３細胞である。プレートを３日間インキュベートし、最後の ４時間［３Ｈ］−チミジンでパルスする。

ｆ、ＴＩＯ増殖検定 この検定は、１９９１年５月３０日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ９１１０７４９ ５中に詳細に記載されている。

ＴＩＯ細胞は、ＩＬ−１１中での生育のために選択されたＩＬ−６依存ネズミ形 質細胞細胞系Ｔ１１６５の副集団である［Ｒ，Ｐ、ノーダンら、サイエンス、２ ３３巻、５６６頁（１９８６年）、およびナショナル・インスティチュート・オ ブ・ヘルス、ノーダン博士から入手。］。ＴＩＯ細胞系は、ＩＬ６またはＩＬｌ ｌによく反応するが、ＩＬＩＩに対する反応は、もとのＴ１１６５細胞系のそれ よりずっと大きい。細胞を１０％加熱不活性ＦＣ３，グルタミン、Ｐ／Ｓ、５Ｘ １０−５Ｍベータメルカプトエタノール（シグマ・ケミカル・カンパニー、セン トルイス、ミズーリ）を含むＲＰＭＩ中で維持し、２０Ｕ／ｍｌのｒｈｕ　Ｉ　 Ｌ　１１で補う。検定をＩＬＩＩなしの同じ培地中で行なう。播種密度は１ウェ ル当り７．５Ｘ１０”細胞である。プレートを３日間インキュベートし、最後の ３時間［３Ｈ］−チミジンでパルスする。

実施例５に記載されたｐＡＬＩＬ３１１−７８１の形質転換からの大腸菌細胞上 澄みを前記に従って活性を検定した。ＩＬ３−ＩＬＩＩ融合タンパク質はこの検 定でＩＬ１１活性を顕した。

ｇ、ヒト血漿凝塊ｍｅｇ−Ｃ５Ｆ検定 この発明の融合分子ＩＬ３−ＩＬＩＩはまた、修飾に関するＥ、マズールら、ブ ラッド、５７巻、２７７−２８６頁（１９８１年）中に記載されている血漿凝塊 ｍｅｇ−Ｃ５Ｆ検定中でヒト血小板生成細胞コロニー形成活性を試験された。非 付着末梢血細胞をロイコパクスから分離し、分けて凍結した。試験検体を、血小 板欠乏ヒトＡＢ血漿および２４ウエルのプレート中の１．２５Ｘ１０’細胞と混 合し、カルシウムの添加によって凝結させた。１２日間のインキュベーションの 後、血小板生成細胞を、血小板塘タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対して指示され たモノクローナル抗体および西洋わさびペルオキシダーゼ／抗ペルオキシダーゼ 色素原検索システムを使って同定した。組み換えヒトＩＬ−３［ジェネティクス ・インスティチュート社コを、陽性対照として使用し、これは約６０％が純粋で ４ｏにが混合の血小板生成コロニーで１凝塊につき１２−３０血小板形成コロニ ーを製造した。

形成不全イヌ血清もまた、陽性対照として使用し、それは１凝塊にっき５−１０ の血小板生成細胞コロニーを生成し、そのうち約５０％は１０以下の細胞を含む 純粋な血小板生成細胞コロニーであり、５０％は４０以上の血小板生成細胞を含 む混合血小板生成細胞コロニーであった。陰性対照はアルファ培地であり、１凝 塊につきＯ−１の血小板生成細胞コロニーを生成した。

ＩＬ３−ＩＬＩＩ融合タンパク質をＩＬ３タンパク質およびＩＬＩＩタンパク質 の最適濃度と比較した。２シリーズの実験を行なった。第一のシリーズにおいて は、ＩＬｌｌの濃度をＩＯＵ／ｍｌのそれの最適濃度で一定に保ち、ＩＬ３濃度 を０．２から２０００／＋ｉｌまで変化させた。第二のシリーズにおいては、Ｉ Ｌ３の濃度をＩＵ／ａ＋１のそれの最適濃度で一定に保ち、ＩＬＩＩ濃度を０． ２から２０００／＋ａｌまで変化させた。最適濃度を、０．２から２００Ｕ／■ １の濃度でＩＬ３のみおよびＩＬｌｌのみの検定を実行することによって測定し た。つぎに、生成されるｍｅｇコロニー／凝塊の数が最も多くなる濃度を比較実 験の最適濃度として選択した。

結果は下記の通りである。

［ＩＬ３コＵ／ｍｌ　［ＩＬ１１］Ｕ／ｍｌ　Ｍｅｇ＝＋ｏ＝　−／凝塊１　１ ．０　３２ 前記の結果を、ＩＬ３−ＩＬＩＩ融合タンパク質の濃度を５単位の１１１１から １単位のＩＬ３の割合で変化させて得た下記の結果と比較した。この率を、Ｔ１ ０およびＭＯ７Ｅ細胞増殖検定で測定されたような、２つの融合パートナ−の相 対的特異的活性をまねて測定した。

［ＩＬ３−ＩＬＩＩ融合タンパク質コＵ　／ｍｌ　Ｍｅｇ＝＋　ｏニー／凝塊２ ５．０／１２５　１５ １２５／６２５　２に れかられかるように、ＩＬ３−ＩＬＩＩ融合タンパク質は少な（とも、血小板生 成細胞コロニー形成を刺激することにおいて一緒に加えられたＩＬ３およびＩＬ ＩＩの最適濃度と同じぐらい活性である。

この発明の実施における多くの修正および変形が、当技術の熟練者に起ることは 予期される。

ｉｇｌ Ｆｉｇ２ Ｆｉｇ３ ｉｇ４ ｉｇ５ 平成　５年　５月１３日

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）式ＩＬ３−ＸまたはＸ−ＩＬ３〔式中、Ｘは、ＩＬ３に融合され、ＩＬ３ 、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１１、エリスロポエチンおよびＧＣＳＦから成 る群から選択されたリンフォカインである〕で示される、他のタンパク質性の物 質を実質的に随伴しない融合タンパク質。
2. （２）前記リンフォカインがＩＬ１１である請求項１記載のタンパク質。
3. （３）前記リンフォカインがＩＬ３である請求項１記載のタンパク質。
4. （４）前記リンフォカインがエリスロポエチンである請求項１記載のタンパク質 。
5. （５）前記リンフォカインがＧＣＳＦである請求項１記載のタンパク質。
6. （６）前記リンフォカインがＩＬ９である請求項１記載のタンパク質。
7. （７）前記リンフォカインがＩＬ６である請求項１記載のタンパク質。
8. （８）Ｘがペプチドリンカー配列を通してＩＬ３に融合されている請求項１−６ 記載のタンパク質。
9. （９）請求項１記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列。
10. （１０）宿主細胞中で請求項９のＤＮＡ配列の発現を指示することができる発現 調節配列と作動可能に結合した、請求項９記載のＤＮＡ配列を含むプラスミドベ クター。
11. （１１）請求項１０記載のプラスミドベクターにより形質転換された適当な宿主 細胞。
12. （１２）（１）タンパク質の発現をさせる条件下で培養培地中の請求項１１記載 の適当な宿主細胞を培養し、（２）培養培地から融合タンパク質を採取すること を含む、融合タンパク質ＩＬ３−ＸまたはＸ−ＩＬ３の製造方法。
13. （１３）請求項１２の方法により製造されたタンパク質。
14. （１４）医薬的に許容され得る媒体中に治療上有効な量の請求項１−８記載の融 合タンパク質を含む医薬組成物。
15. （１５）白血病の処置のための医薬組成物の製造における請求項１４記載の組成 物の使用。