JPH07501447A - Ｍｇｆおよびｉｌ−３を含む融合タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＭＧＦおよびＩ　Ｌ−３を含む融合タンパク質発明の背景 本発明は、造血系細胞の増殖を刺激する融合タンパク質、更に詳しくは、ＭＧＦ およびＩ　Ｌ−３を含む融合タンパク質の構築に関する。

造血系成長因子（または造血素）は、種々の系統の血球の増殖および成熟を調節 する。全ての血球は、幹細胞と称される１種類の前駆細胞から発生すると考えら れる。それぞれの造血素は特定の種類の血球を分化させ且つ増殖させる。幹細胞 か骨髄中で分裂する場合、それはそれ自体を幹細胞と同様に複製することができ るしまたは特定の発生経路にゆだねられることになる。特定の発生経路にゆだね られた結果として、幹細胞は、ある種のホルモンシグナルに対してそれが応答す ることを可能にする受容体をその細胞表面上に表わす。このようなシグナルは、 最終分化をもたらす経路へと細胞を更に押し進める。

多数の造血素が識別されており、それらは造血系幹細胞および前駆細胞階層中の 種々の段階での細胞発生を調節する。識別された大部分の成長因子は、比較的遅 い段階での分化に影響を及ぼし且つ成熟分化した造血系要素の数および機能を調 節する。インターロイキン−３（ｒＩＬ−３Ｊまたは「マルチ−Ｃ３ＦＪ）は、 例えば、顆粒球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、巨核球および赤芽細胞 を含む広範囲の造血系細胞の形成を刺激する。ＩＬ−３は同定され、単離され、 そして分子クローン化されている（欧州特許公開筒２７５．５９８号明細書およ び同第２８２，１８５号明細書）。最近、造血系階層の極めて初期の前駆細胞を 調節するマスト細胞成長因子（ｒＭＧＦｊ）か同定され、単離され、そして分３ ５．１９９１）。

前臨床研究は、このような造血素が、種々の血球減少症を治療し、感染性病原体 に対する免疫応答性を強化し、そしてウィルス感染または放射線若しくは化学療 法で誘導された造血系細胞抑制後の正常な血球集団の構築を助ける場合に有用で ありうることを示している。ＭＧＦは、特に、造血系細胞に対するその初期の作 用のために、無形成貧血を治療するのに有用であると考えられる。それらの最適 の治療可能性を決定するために、造血系細胞に対するこのようなタンパク質の種 々の組合せの作用が重要な研究課題であった。

発明の概要 本発明は、ＭＧＦおよびＩＬ−３を含む融合タンパク質に関する。融合タンパク 質は、好ましくは、 Ｒｔ　Ｒ２・Ｒ２Ｒ１・ＲＩ　Ｌ　Ｒ２およびＲ２−Ｌ−Ｒ１（式中、Ｒ１はＭ ＧＦてあり：Ｒ２はＩＬ−３てあり：そしてＬはリンカ−ペプチド配列である） から成る群より選択される式を有する。本発明の最も好ましい態様において、Ｍ ＧＦおよびＩＬ−３は、ＭＧＦまたはＩＬ−３ドメインがそのそれぞれの細胞表 面受容体分子に対して結合するそれぞれのドメインの能力を保持するような方法 で折りたたまれることを可能にするリンカ−配列によって互いに結合している。

本発明の融合タンパク質は、ＭＧＦ若しくはＩＬ−３単独または組合せの場合よ りも増大したヒト骨髄細胞を刺激する能力を示す。

発明の詳細な説明 本発明は、ＭＧＦおよびｌｌ−３を含む融合タンパク質に関する。下記の用語を 以下の通り定義する。

本明細書中で用いられる「組換え体」とは、タンパク質が組換え体（例えば、微 生物または哺乳動物）発現系に由来することを意味する。「微生物体」とは、細 菌または真菌（例えば、酵母）発現系において製造された組換え体タンパク質を 意味する。生成物としての「組換え微生物体」は、天然の内因性物質を本質的に 含まない微生物発現系において生産されたタンパク質を定義している。大腸菌（ Ｅ、ｃｏｌｉ）などの大部分の最近培養物において発現されたタンパク質はグリ カンを含まない。酵母において発現されたタンパク質は、哺乳動物細胞において 発現されたものとは異なるグリコジル化パターンを有することがある。

本明細書中を通して用いられる「生物学的に活性な」とは、特定の分子が、天然 の受容体に結合することができ、細胞に対する刺激を伝達することができ、また は特定の分子に対して生じた抗体と交差反応することができるように天然の形と 同様の十分なアミノ酸配列を分担していることを意味する。

ｒＤＮＡ配列」とは、大型のＤＮＡ構築物の個別のフラグメントの形のまたは成 分としてのＤＮＡポリマーを意味する。好ましくは、ＤＮＡ配列は、標準的な生 化学的方法、例えば、クローニングベクターを用いることによって識別、操作お よび回収を可能にする量すなわち濃度で存在する。このような配列は、好ましく は、内部非翻訳配列によって中断された読み取り枠または、典型的に真核遺伝子 中に存在するイントロンの形で与えられる。適切な配列を含むゲノムＤＮＡを用 いることもできる。非翻訳ＤＮＡの配列は読み取り枠から５′または３′に存在 することができ、そこにおいてそれらはコード領域の操作または発現の妨げにな らない。

「ヌクレオチド配列」は、デオキシヌクレオチドのヘテロポリマーを意味する。

本発明の提供されたタンパク質をコードしているＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡフラグ メントおよび短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連のオリゴヌクレ オチドから組み立てられて、組換え転写単位において発現されることができる合 成遺伝子を提供することができる。

「組換え体発現ベクター」は、本発明の融合タンパク質をコードし、しかも（１ ）遺伝子発現において調節の役割を有する１種類または複数の遺伝的要素、例え ば、プロモーターまたはエンハンサ−；　（２）ｍＲＮＡに転写され且つタンパ ク質に翻訳される構造配列またはコーディング配列；並びに（３）適当な転写お よび翻訳開始および終結配列；の集合を含む転写単位を含むＤＮＡを増幅させる かまたは発現させるのに用いられる複製可能なりＮＡ構築物を意味する。酵母発 現系において用いるための構造要素は、好ましくは、宿主細胞による翻訳された タンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。或いは、組換え体タ ンパク質がリーダー配列または輸送配列を用いることなく発現されるところでは 、それはＮ末端メチオニン残基を含むことができる。この残基は、場合により、 発現された組換えタンパク質から引続き開裂して最終生成物を提供することがで きる。「組換え体微生物発現系」は、組換え体転写単位を染色体ＤＮＡ中に安定 して組込んだかまたは組換え体転写単位を内在するプラスミドの一成分として有 する適当な宿主微生物、例えば、大腸菌などの細菌またはビール酵母菌（Ｓ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母の実質的に均一の単一培養物を意味する。概 して、系を構成する細胞は単一祖先の形質転換体の子孫である。本明細書中で定 義の組換え発現系は、発現されるＤＮＡ配列または合成遺伝子に対して結合した 調節要素の誘導によって異種タンパク質を発現する。

マスト細胞成長因子 マスト細胞成長因子（ｒＭＧＦＪ　）という用語は、ＭＧＦの受容体に対して結 合しつるかまたはＭＧＦ受容体に対して結合することによって開始された生物学 的シグナルを変換しうるし、或いはＭＧＦに対して生じた抗ＭＧＦ抗体と交差反 応しつるという点でＭＧＦと同様の特性を実質的に有するタンパク質を意味する 。ＭＧＦとしては、ＩＬ−３依存マスト細胞系および造血系前駆細胞を刺激する ことができるし、しかもｃ−ｋｉｔプロトオンコジーンの遺伝子産物のリガンド として役立つ一連の哺乳動物ペプチドがある。ＭＧＦポリペプチドおよびＭＧＦ ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列は、例えば、アンダーソンら、Ｃｅ１ ｌ　６３：２３５．１９９１；７−チン（Ｍａｒｔｉｎ）ら、Ｃｅ１１６５：２ ０３，１９９１；および欧州特許出願第ＥＰ−Ａ−０４２３９８０号明細書に開 示されている。本明細書中で用いられるように、ＭＧＦという用語は、ｃ−ｋｉ ｔプロトオンコジーンによって発現されたタンパク質に対して結合し、しかもマ スト細胞、例えば、ＩＬ−３依存ネズミマスト細胞系ＭＣ６またはヒト細胞系Ｔ ＦＩの増殖を誘導する実質的に同一かまたは実質的に類似のアミノ酸ポリペプチ ド配列を有する天然の哺乳動物ポリペプチドの類似物またはサブユニットを含む 。天然の形のＭＧＦは膜に結合しており且つ細胞外、貫膜および細胞質ドメイン から成るが、本発明の融合タンパク質において用いられるＭＧＦは、好ましくは 、その細胞外部分または細胞外ドメインの４個のＣｙｓ残基全部を含むそのフラ グメントのみから成り、貫膜部分および細胞質ドメインを欠いている。

ＭＧＦの細胞外部分またはそのフラグメントは、ｃ−ｋｉｔプロトオンコジーン の遺伝子産物を結合することができる可溶性ポリペプチドである。ヒトおよびネ ズミの天然のＭＧＦ配列は両方とも２種類の変異型で見出された。一つのヒト変 異型は欧州特許出願第ＥＰ−Ａ−０４２３９８０号明細書の図４２に示されてい る。もう一方の変異型は（アミノ酸１４９〜１７７の）２８アミノ酸欠失があり 、Δ２８ｈＭＧＦと称される。

ヒトＭＧＦポリペプチドは１８５アミノ酸細胞外ドメインを有する。このポリ。

Δ２８ｈＭＧＦは４個のＣｙｓ残基全部を有しているが、５番目のグリコジル化 部位が除去されている。いくつかのアミノ酸をｈＭＧＦ細胞外ドメインのＣ末端 からＣｙｓ１３８まで、生物学的活性を保持しながら除去することができる。

同様に、最初の３個のＮ末端アミノ酸を成熟ヒトＭＧＦのＣｙｓ３まで、生物学 的活性を保持しながら除去することができる。したがって、１３６アミノ酸残基 だけを有するが、４個のＣｙｓ残基全部を有するヒトＭＧＦポリペプチドは、完 全長さの１８５アミノ酸型のｈＭＧＦまたはΔ２８ｈＭＧＦと比較して有意の生 物学的活性を保持している。Δ２８ｈＭＧＦは有意の生物学的活性を有し且つＭ ＧＦおよびＩ　Ｌ−３を含む融合タンパク質において用いるのに好ましいＭＧＦ フラグメントである。

ｈＭＧＦ分子の種々の他の類似物はＭＧＦの生物学的活性を有することが分かつ た。例えば、Ｌｙｓ　はＭＧＦに対してヒト種特異性を与え、Ｇｌｕ９１はネズ ミ種特異性を与える。グリコジル化部位は、酵母または哺乳動物細胞系における 発現を促進するように変更されることができる。Ｃｙｓ８９の周囲の部分は受容 体結合に関して重要である。しかしながら、Ｖａ１９０は、生物学的活性に影響 を及ぼすことなく任意の他のアミノ酸で置換されることができる。ヒトＭＧＦ類 似物の長さは、約１３５アミノ酸〜ｈＭＧＦポリペプチドの細胞外ドメインを構 成する約１８５アミノ酸まで変更することができる。生物学的に活性なｈＭＧＦ 類似物ポリペプチドは４個のＣｙｓ残基を含むが、下記の配列Ｘ、Ｘ、ＸｌＩ　 Ｃｙｓ　Ａｒｑ　八３ｎ　Ａｒｑ　Ｖａｌ　τｈ＝入Ｓｎり５ｎＶａｌ　Ｌｙｓ 　入ｓｐ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｙ！　Ｌ＠ｕ　Ｖａｌ　入Ｌａ　入ｓｎ　Ｌａｕ 　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　ＴｙｒＨ１工１ｅ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｔｙ ｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ＾＝ｐ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　５ｅｉ Ｈ１ｓ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　工ｌｅ　Ｓｅｔ　Ｇｌｕ　Ｈａｔ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　 Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　入ｓｐ　Ｓ＠ｔ　ＬａｕＴｈｘ　入ｓｐ　ｔ、ｔｕ　 Ｌ＠ｕ　八ｓｐ　Ｌｙｓ　ｔｈｅ　Ｓｅｔ　八ｓｎ　ＸＬｅ　Ｓｅｘ　ＧＬｕ　 Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｓａｇ入ｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ、Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｌ ｙｓ　Ｌ＠ｕ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　工ｌｅ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｅｕｖａ ｌ　ＲＩ　Ｃｙｓ　Ｒ２０Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｓ＠ｒ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　ｋｓｐ　 Ｌ＠ｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　５ｅｒＰｈｅ　Ｌｙｓ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐ ｒｏ　Ａｒｇ　Ｌ＠ｕ　Ｐｈ＠　丁ｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｐ ｈｅ入１：ｑ　工ｌｅ　Ｐｈｅ　入ｓｎ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｘｌａ　八３ｐ　入 １ａ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　八ｓｐ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｖａｌ八ｌへ　Ｓｅｙ：　Ｇ ｌｕ　τｈｒ５ｅｒＡｓｐｃｙｓ　Ｘ、Ｘ、Ｘｒ、　Ｘ、、Ｘ、Ｘ、Ｘ、Ｘ。

Ｘ、Ｘゎ （式中、ｎは０または１であり；Ｘは何等かの天然に存在するアミノ酸であり； ＲはＧｌｕを除く何等かの天然に存在するアミノ酸であり；Ｒ２はＶａｌを除く 何等かの天然に存在するアミノ酸であり；そしてＱは、ヒト特異性を与えるしｙ ｓまたはＡｒｇであるかまたはネズミ特異性を与えるＧｌｕである）により他の 位置で変更することができる。このようなＭＧＦタンパク質を用（て本発明の融 合タンパク質のＭＧＦドメインを提供することができる。

インターロイキン−３ ［Ｌ−３Ｊという用語は、それらがＩＬ−３の受容体に対して結合しうるかまた はＩＬ−３受容体に対して結合することによって開始された生物学的シグナルを 変換しうるし、或いはＩ　Ｌ−３に対して生じた抗ＩＬ−３抗体と交差反応しう るという点でＩＬ−３と同様の特性を実質的に有するタンパク質を意味する。

このような配列は、例えば、欧州特許公開第２７５．５９８号明細書および同第 ２８２．１８５号明細書に開示されている。具体的には、ｒｌＬ−３Ｊという用 語は、天然のＩＬ−３と同様の少なくとも若干の生物学的活性を示す実質的に同 一のまたは実質的に類似のアミノ酸ポリペプチド配列を有する天然の哺乳動物！ Ｌ−３ポリペプチドの類似物またはサブユニットを含む。典型的なＩＬ−３の類 似物は、更に、欧州特許公開第２８２．１８５号明細書に開示されて（する。本 発ｅｒＡｓｐ　Ａｓｐ　］およびｈｕｌＬ−３［５ｅｒ８］がある。本明細書中 に記載の融合タンパク質への取込みに適当なもう一つのＩ　Ｌ−３タンパク質を コードしているＤＮＡ配列は、受託番号ＡＴＣＣ６７７４７としてＡＴＣＣに寄 託されている。更に、他の形のＩＬ−３を用いて本発明の融合タンパク質のＩＬ −３ドメインを提供することができる。

ＭＧＦおよびＩＬ−３を含む融合タンパク質重明細書中で用いられる「融合タン パク質」という用語は、ＭＧＦおよびＩＬ−３のＣ末端対Ｎ末端の融合を意味す る。本発明の融合タンパク質としては、ＭＧＦのＣ末端部分がＩＬ−３のＮ末端 部分に対して融合している構築物、更には、ＩＬ−３のＣ末端部分がＭＧＦのＮ 末端部分に対して融合している構築物がある。ＭＧＦはＩＬ−３に対して、ＭＧ ＦおよびＩ　Ｌ−３の生物学的活性を保持する単一タンパク質を生じるような方 法で結合している。好ましい態様において、ＭＧＦはリンカ−配列によってＩＬ −３に結合している。

ＭＧＦおよびＩＬ−３を含む融合タンパク質の例を添付の配列表に示す。配列番 号１は、ＰＩＸＹ５２１と称するヒトＩＬ−３／ＭＧＦ融合タンパク質のヌクレ オチド配列および対応するアミノ酸配列を示す。該融合タンパク質は、ヒトＭＧ Ｆ（アミノ酸１４５〜３０１）に対してリンカ−配列（アミノ酸１３４〜１−４ ４）によって結合したヒトＩＬ−３（アミノ酸１〜１３３）を含む。配列番号３ は、ヒトＭＧＦ／ＩＬ−３融合タンパク質のヌクレオチド配列および対応するア ミノ酸配列を示す。該融合タンパク質は、ヒトＩＬ−３（アミノ酸１７１〜３゜ ３）に対してリンカ−配列（アミノ酸１５８〜１７０）によって結合したヒトＭ ＧＦ（アミノ酸１〜１５７）を含む。

同等の融合タンパク質は配列番号１および配列番号３の配列から１種類またはそ れ以上の置換、欠失または付加によって変化していてよ＜、ＭＧＦおよびＩＬ− ３を含む融合タンパク質として誘導された場合に、その正味効果は該タンパク質 の生物学的活性を保持しているはすである。或いは、（ａ）ＤＮＡ類似物配列が 天然のｌ　Ｌ−３およびＭＧＦ遺伝子の生物学的活性フラグメント由来の配列を 含むか；または（ｂ）ＤＮＡ類似物配列が高度の若しくは中程度の緊縮条件下で （ａ）のＤＮＡ配列に対してハイブリダイモーションが可能であり且つ生物学的 に活性なＭＧＦおよびＩＬ−３分子をコードしているが：或いは（ｃ）ＤＮＡ類 似物配列が遺伝コードの結果として、（ａ）若しくは（ｂ）に定義の、生物学的 に活性なＭＧＦおよびＩＬ−３分子をコードしているＤＮＡ類似物配列に縮重【 ２ている場合、該ＤＮＡ類似物配列は本明細書中に開示された独特のＤＮＡ配列 と同等である。

本明細書中に定義のおよび当業者に知られている中程度の緊縮ハイブリダイゼー ション条件は、例えば、サムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、グ・ハーバ−・ ラボラトリ−・プレス（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）１９８９）に開示された条件である。典型的な中程度緊縮 条件は、５　ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ，鉤　５％ＳＤＳ、］、ｍＭＥＤＴＡ　（ｐＨ８， ０）での予備洗浄および２ｘＳＳＣ中において５０℃で一晩中のハイブリダイゼ ーシヨンである。典型的な苛酷または高緊縮条件は、６ｘＳＳＣ溶液中において 約６８℃で一晩中のハイブリダイモーション、６ｘＳＳＣ溶液による室温での洗 浄、続いて０．６ｘＳＳＣ溶液中において約６８℃での洗浄である。

ＭＧＦおよびＩ　Ｌ−３を含む融合タンパク質をコードしているｃＤＮＡ配列の 構築 融合タンパク質をコードしているＤＮＡ配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて、Ｍ ＧＦおよびＩＬ−３をコードしている別個のＤＮＡフラグメントを適当な発現ヘ クターに組み立てるように構築される。例えば、ＭＧＦをコードしているＤＮＡ フラグメントの３′末端を、単一の生物学的に活性な融合タンパク質への配列の ｍＲＮＡ翻訳を可能にする状態での配列の読み枠によって、ＩＬ−３をコードし ているＤＮＡフラグメントの５′末端に連結する。得られたタンパク質は、ＭＧ ＦおよびＩ　Ｌ−３を含む融合タンパク質である。或いは、ＩＬ−３をコードし ているＤＮＡフラグメントの３′末端を、単一の生物学的に活性な融合タンパク 質への配列のｍＲＮＡ翻訳を可能にする状態での配列の読み枠によって、ＭＧＦ をコートしているＤＮＡフラグメントの５′末端に連結してよい。ｍＲＮＡへの ＤＮＡの転写に関与する調節要素は、二つのＤＮＡ配列の内の最初の方で保持さ れ、同時に、第二ＤＮＡ配列まで通して読み取るのを妨げると考えられる結合シ グナルまたは停止コドンは除去される。逆に、調節要素は第二ＤＮＡ配列から除 去されるが、翻訳を終結するのに必要な停止コドンは保持される。

本発明の好ましい態様において、ＭＧＦおよびＩＬ−３ドメインを、好ましくは リンカ−配列によって結合するための手段を提供する。リンカ−配列はＭＧＦお よびＩＬ〜３ドメインを、それぞれのドメインがその二次および三次構造に適当 に折りたたまれるのを確実にするように十分な間隔で隔てる。適当なリンカ−配 列は、（１）柔軟なまたは一層剛性の伸長されたコンホメーションに用いること かできるし、（２）機能性ＭＧＦおよびＩＬ−３ドメインと相互作用しつる指定 された二次構造を生しる性質を示さないし、そして（３）機能性タンパク質ドメ インとの相互作用を促進しつる最小限度の疎水性または負荷特性を有する。柔軟 なタンパク質部分の典型的な表面アミノ酸としては、ＧｌｙＳＡｓｎおよびＳｅ ｒかある。実際に、ＧｌｙＳＡｓｎおよびＳｅｒを含むアミノ酸配列の順列は、 リンカ−配列の上記基準を満足すると予想された。他の近中性アミノ酸、例えば 、ＴｈｒおよびＡｌａもリンカ−配列において用いることができる。

リンカ−配列の長さは、融合タンパク質の生物学的活性に有意に影響を与えるこ となく変更することかできる。例えば、ＭＧＦおよびＩＬ−３タンパク質はリン カ−配列を用いることなく直接的に融合することができる。融合したタンパク質 か、機能性ドメインを分離し且つ立体障害を防止するのに用いることができる非 本質的Ｎ末端またはＣ末端アミノ酸部分を有する場合、リンカ−配列は不必要で ある。本発明の一つの好ましい実施態様において、ＭＧＦのＣ末端はＩ　Ｌ−３ ＯＮ末端に直接的に融合することができる。完全長さのｈＭＧＦは、ジスルフィ ド結合に関与し且つタンパク質の適当な折りたたみに不可欠である細胞外部分の Ｃ末端システィン残基の後に４７アミノ酸を有し、Δ２８ｈＭＧＦは１９アミノ 酸を有する。ｌ　Ｌ−３は、そのＮ末端システィン残基の前に１５アミノ酸を有 する。したがって、組み合わさせた末端部分は、不必要なリンカ−配列を用いな いように十分に間隔を置くことができる。

概して、２種類のタンパク質ドメインは、ＭＧＦまたはＩ　Ｌ−３の小型の単位 寸法（すなわち、他の類似の四らせんホルモンとの相似性によって決定したとこ ろ約０．３８ｎｍ）にほぼ等しい間隔て隔てられている。本発明の好ましい態様 において、約１１アミノ酸のリンカ−配列長さを用いて機能性タンパク質ドメイ ンに適当な間隔を置くことができるが、更に長いリンカ−配列を用いてもよい。

ＭＧＦおよびＩ　Ｌ−３を隔てるリンカ−配列の長さは１〜５００アミノ酸長さ 、更に好ましくは１〜１００アミノ酸長さである。本発明の最もこのましい態様 において、リンカ−配列は約１〜２０アミノ酸長さである。本明細書中に開示さ れた具体的な実施態様において、リンカ−配列は約５〜約１５アミノ酸であり、 約１０〜約１５アミノ酸であるのが好都合である。ＭＧＦおよびＩＬ−３のリン カ−として用いるのに好ましいアミノ酸配列としては、例えば、ＧＩｙＡＩａＧ ＩｙＧｌｙＡＩａＧＩｙＳｅｒ　（Ｇｌｙ）　５Ｓｅｒ。

（Ｇｌｙ　５ｅｒ）　Ｇｌｙ　５ｅｒＧＩｙ５Ｓｅｒ、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）　２ および（ＧｌｙＴｈｒＰｒｏ）　３かある。

リンカ−配列は、下記に記載の周知の標準的突然変異誘発法によって融合タンパ ク質構築物中に組込まれる。

タンパク質および類似物 好ましい態様において、本発明は、ヒトＭＧＦおよびヒトＩＬ−３を含む融合タ ンパク質を提供する。本発明の融合タンパク質の誘導体としては、更に、生物学 的活性を保持する一層タンパク質の種々の構造体がある。イオン化しうるアミノ 基およびカルボキシル基の存在ゆえに、例えば、融合タンパク質は酸性または塩 基性塩の状態であってよいしまたは中性の状態であってよい。個々のアミノ酸残 基は酸化または還元によって修飾されていてよい。

−次アミノ酸構造は、他の化学残基、例えば、グリコジル基、脂質、リン酸塩、 アセチル基等と共有若しくは凝集結合体を形成することによってまたはアミノ酸 配列突然変異体を生成することによって修飾されていてよい。共有誘導体は、ア ミノ酸側鎖に対してまたはＮ末端若しくはＣ末端に特定の官能基を結合すること によって製造される。本発明の範囲内の融合タンパク質の他の誘導体としては、 Ｎ末端またはＣ末端融合のような組換え体培養物中ての合成によるなどの池のタ ンパク質またはポリペプチドとの融合タンパク質の共有または凝集結合体がある 。例えば、結合したペプチドは、細胞膜若しくは壁の内部若しくは外部のその合 成部位からその機能部位までのタンパク質の転移を共翻訳によってまたは翻訳後 に支配するタンパク質のＮ末端部分のシグナル（またはリーダー）ペプチド配列 であってよい（例えば、酵母α因子リーダー）。

更に、ペプチドを加えて、ＭＧＦ／ＩＬ−３融合タンパク質の精製または同定を 促進することができる（例えば、ポリ−Ｈ１ｓ）。例えば、本発明の好ましい実 施態様において、融合タンパク質のアミノ酸配列をペプチドＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌ ｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ　（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）に対し て結合する（ホップ（Ｈｏｐｐ）ら、Ｂｉｏ７’Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　旦：１ ２０４．１９８８）。後者の配列は極めて抗原性であり且つ特異的単クローン性 抗体によって可逆的に結合したエピトープを提供し、発現された組換え体タンパ ク質の迅速な検定および容易な精製を可能にする。この配列は、更に、Ａｓｐ− Ｌｙｓ対形成直後の残基においてウシ粘膜エンテロキナーゼによって特異的に開 裂する。このペプチドのキャップ付きの融合タンパク質は、更に、大腸菌におけ る細胞内分解に対して耐性でありうる。

更に、融合タンパク質誘導体は、免疫原、受容体基剤免疫検定における試薬とし てまたは結合性リガンドのアフィニティー精製法のための結合剤として用いるこ とができる。誘導体は、更に、架橋剤、例えば、Ｍ−マレイミドベンゾイルスク シンイミドエステルおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドによってシスティン残 基およびリシン残基において得ることができる。融合タンパク質は、更に、反応 性側基によって種々の不溶性基質、例えば、臭化シアン活性化、ビスオキシラン 活性化、カルボニルジイミダゾール活性化若しくはトシル活性化アガロース構造 に対して、またはポリオレフィン表面に対する吸着によって（グルタルアルデヒ ド架橋を用いるかまたは用いることな（）共有結合することができる。

本発明は、更に、関連した天然型グリコジル化を伴うかまたは伴わないタンパク 質を含む。大腸菌などの細菌における融合タンパク質をコードしているＤＮＡの 発現は、非グリコジル化分子を提供する。失活したＮ−グリコジル化部位を有す る機能性突然変異体類似物は、オリゴヌクレオチド合成および連結反応によって または部位特異的突然変異誘発技術によって製造することができる。これらの類 似タンパク質は、酵母発現系を用いて十分な収率の均一な還元炭水化物の形で製 造することができる。真核性タンパク質中のＮ−グリコジル化部位は、アミノの アミノ酸であり、ＺはＳｅｒまたはＴｈｒである。この配列において、アスパラ ギンは炭水化物の共有結合のための側鎖アミン基を提供する。このような部位は 、別のアミノ酸をＡｓｎまたは残基Ｚの代わりに置換することによって、Ａｓま たはＡｓｎとＡ　との間にＡｓｎ以外のアミノ酸を挿入することによって切除す ることができる。ヒトＭＧＦは、除去することができるアミノ酸２０９〜２１１ ．２１６〜２１８．２３７〜２３９および２６４〜２６６（配列番号１）のとこ ろに３種類の可能なグリコジル化部位を有する。グリコジル化部位が除去されお よびｈｕＩＬ−３［Ａｓｐ１５コ　（配列番号１）がある。

誘導体および類似物は、更に、融合タンパク質の突然変異によって得ることがで きる。本明細書中で称される誘導体および類似物は、ＭＧＦおよびＩＬ−３ドメ インが、配列番号１において開示された配列のＭＧＦの細胞外部分および完全長 さのＩＬ−３と実質的に相同であるが、欠失、挿入または置換に起因すると考え られるアミノ酸配列の相違を有するポリペプチドである。

融合タンパク質の生物同等類似物は、例えば、残基または配列の種々の置換を行 なうことによって構築することができる。例えば、システィン残基を欠失するか または他のアミノ酸と置き換えて、復元の際の誤った分子内ジスルフィド橋の形 成を防止することができる。突然変異誘発に対する他のアプローチは、ＫＥＸ２ プロテアーゼ活性が存在する酵母系において発現を促進するように隣接する二塩 基性アミノ酸残基を修飾することを必要とする。概して、置換は保守的に行なわ れるべきであり：すなわち、最も好ましい置換基アミノ酸は、物理化学的性質が 置き換えられる残基のそれと似ているものである。同様に、欠失または挿入計画 を用いる場合、生物学的活性に対するその欠失または挿入の可能な効果を考慮す べきである。

類似物の発現用に構築されたヌクレオチド配列における突然変異は、当然ながら 、コード配列の読み棒状態を保存する必要があるし、そしてハイブリッド形成し て二次ｍＲＮＡ構造、例えば、ＭＧＦ／Ｉ　Ｌ−３受容体ｍＲＮＡの翻訳に悪影 響を及ぼすと考えられるループまたはヘアピンを生じることがある相補的部分を 生成しないことが好ましい。突然変異部位は予め決定しうるが、突然変異自体の 性質を予め決定する必要はない。例えば、ある与えられた部位の突然変異体の最 適特性を選択するために、無作為の突然変異誘発を標的コドンにおいて行なうこ とができ、その発現された突然変異体を望ましい活性に関してスクリーンするこ とができる。

ＭＧＦおよびＩＬ−３を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列にお ける突然変異が全て最終産物中で発現されるとは限らず、例えば、ヌクレオチド 置換を行なって発現を促進することができるし、主として転写されたｍＲＮＡに おいて二次構造ループを避けることができるしく本明細書中に参考として包含さ れる欧州特許出願第７５．４４４Ａ号明細書を参照されたい）、または選択され た宿主によって一層容易に翻訳されるコドン、例えば、大腸菌発現用の周知の大 腸菌優先コドンを提供することかできる。

突然変異は、天然の配列のフラグメントに対して連結することができる制限部位 が隣接した突然変異体配列を有するオリゴヌクレオチドを合成することによって 特定の遺伝子座に導入することができる。連結反応後に、得られた再構築配列は 、望ましいアミノ酸挿入、置換または欠失を有する類似物をコードする。

或いは、オリゴヌクレオチドに支配された部位特異的突然変異誘発法を用いて、 必要な置換、欠失または挿入によって改変された特定コドンを有する改変遺伝子 を提供することができる。上記に示した改変を行なう典型的な方法は、ワルダ） ニスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；（Ｐｌ ｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）、１９８１年）；米国特許第４．５１８．５８４号明細 書および同第４，７３７，４６２号明細書に開示され且つ参考として本明細書中 に包含されている。

ＭＧＦおよびＩ　Ｌ−３を含む組換え体融合タンパク質の発現本発明は、哺乳動 物、微生物、ウィルスまたは昆虫遺伝子由来の適当な転写または翻訳調節要素に 対して機能的に結合したＭＧＦおよびＩＬ−３または生物同等類似物を含むヒト 融合タンパク質をコードしている合成またはｃＤＮＡ誘導ＤＮＡフラグメントを 含む組換え体発現ベクターを提供する。このような調節要素としては、転写プロ モーター、転写を調節する任意のオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリポソーム 結合部位をコードしている配列並びに、以下に詳細に記載の転写および翻訳の終 結を調節する配列がある。宿主において複製する能力は、通常、複製起点によっ て与えられ、そして形質転換体の認識を促進する選択遺伝子を更に組込むことが できる。ＤＮＡ部分は、それらが互いに機能的に隣接している場合に機能的に結 合する。例えば、シグナルペプチドのＤＮＡ　（分泌リーダー）は、ポリペプチ ドの分泌に関与する前駆体としてそれが発現される場合にポリペプチドのＤＮＡ に対して機能的に結合し；プロモーターは、それが配列の転写を調節する場合に コード配列に対して機能的に結合し；またはリポソーム結合部位は、それが翻訳 を可能にするように配置されている場合にコード配列に対して機能的に結合する 。概して、機能的に結合したとは相接する意味であり、分泌リーダーの場合、相 接し且つ読み枠中にある意味である。

コード縮重のために、同一のＭＧＦまたはＩ　Ｌ−３アミノ酸配列をコードして いるヌクレオチド配列中にかなりの変動が存在することがあり、典型的なりＮＡ 実施態様は、配列番号１または配列番号３で示されたヌクレオチド配列に対応す るものである。本発明の範囲内の他の実施態様としては、ＭＧＦおよびＩＬ−３ コ一ト化部分が中程度または高緊縮条件下で配列番号１または配列番号３のそれ ぞれのＭＧＦおよびＩＬ−３ヌクレオチド部分に対してハイブリッド形成するこ とかできる＞ｉＧＦおよびｒＬ−３を含む融合タンパク質をコードし且つ生物学 的に活性な融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列がある。

形質転換された宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築された融合タンパり 質ベクターによって形質転換またはトランスフェクトされた細胞である。形質転 換された宿主細胞は、通常、望ましい融合タンパク質を発現するが、ＤＮＡをク ローニングまたは増幅する目的で形質転換された宿主細胞はタンパク質を発現す る必要がない。発現された融合タンパク質は、概して、培養物上澄み中に分泌さ れる。融合タンパク質の発現に適した宿主細胞としては、適当なプロモーターの 調節下での原核生物、酵母または高等真核細胞がある。原核生物としては、グラ ム陰性またはグラム陽性微生物、例えば、大腸菌またはバチルスがある。高等真 核細胞としては、以下に記載の哺乳動物超厚の樹立細胞系がある。本発明のＤＮ Ａ構築物由来のＲＮＡを用いて融合タンパク質を製造するのに、細胞不含翻訳系 を用いることもできる。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主と一緒に用い るのに適当なりローニングおよび発現ベクターは、パラウェルズ（Ｐｏｕｗｅ　 Ｉ　ｓ）ら（Ｃ１ｏｎｉｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎ ｕａｌ）、ｓ−ルセビア、−ニーヨーク、１９８５）によって記載されており、 その関連した開示は参考として本明細書中に包含される。

原核性発現宿主は、広範囲にわたるタンパク質分解処理およびジスルフィド処理 を必要としない融合タンパク質の発現用に用いることができる。原核性発現ベク ターは、概して、１種類またはそれ以上の表現型選択可能マーカー、例えば、耐 抗生物質性を与えるかまたは独立栄養要求性を与えるタンパク質をコードしてい る遺伝子および、宿主中ての増幅を確実にするように宿主によって認識された複 製起点を含む。形質転換に適した原核性宿主としては、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔ ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、並びにンユードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ） 　、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびブドウ球菌属（Ｓ ｔａｐｈｙｏｌｏｃｏｃｃｕｓ）の中の様々な種かあるが、他のものも選択肢と して用いることができる。

細菌利用に有用な発現ベクターは、周知のクローニンク入りターｐＢＲ３２２（ ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝要素を含む商業的に入手可能なプラスミド由来の選 択可能マーカーおよび複製起点を含むことができる。このような市販のへフタ− としては、例えば、ｐＫＫ２２３−３　（ファーマシア・ファイン・ケミカルズ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ウプサラ、スウェー デン）およびｐＧＥＭｌ　（プロメガ・バイオチク（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅ ｃ）、マディソン、Ｗｌ、米国）がある。これらのｐＢＲ３２２ｒ主鎖」部分は 、適当なプロモーターと発現される構造配列とが組み合わされている。大腸菌は 、典型的に、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形 質転換される（ポリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ）ら、Ｇｅｎｅ　２：９５．１９７７ 年）。ｐＢＲ３２２はアンピシリン耐性およびテトラサイクリン耐性の遺伝子を 含み、したがって、形質転換細胞を同定するための簡単な手段が提供される。

組換え体微生物発現ベクターにおいて一般的に用いられるプロモーターとしては 、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（チャ ン（Ｃｈａｎｇ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　２ヱ５：６１５．１９７８年；およびゴＲ ｅｓ、８：４０５７，１９８０年；および欧州特許出願第３６，７７６号明細書 ）並びにｔａｃプロモーター（マニアティス（Ｍａｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　ｓ）、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ＋Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−１４１２頁、１９８２年） がある。特に有用な細菌発現系は、ファージλＰ　プロモーターおし よびＣｌ８５７ｔｓ熱誘導性リプレツサーを用いる。アメリカン・タイプ・カル チャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌ ｅｃｔｉｏｎ）から入手可能な、λＰＬプロモーターの誘導体を取込むプラスミ ドベクターとしては、大腸菌株ＪＭＢ９　（ＡＴＣＣ３７０９２）中に内在する プラスミドｐＨＵＢ２および大腸菌ＲＲＩ　（ＡＴＣＣ５３０８２）中に内在す るｐＰＬｃ２８がある。

組換え体融合タンパク質は、更に、酵母宿主において、好ましくは、サツカロミ セス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、例えば、ビール酵母菌（Ｓ。

ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）から発現することができる。他の属の酵母、例えば、ピキ ア属（Ｐｉｃｈｉａ）またはクルイヴエロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅ　ｒｏｍｙｃ ｅｓ）も用いることができる。酵母ベクターは、概して、２μ酵母プラスミドま たは自律複製配列（ＡＲ３）由来の複製起点と、プロモーター、融合タンパク質 をコードしているＤＮＡ、ポリアデニル化および転写終結のための配列並びに選 択遺伝子を含む。好ましくは、酵母ベクターは、酵母および大腸菌両方の形質転 換を可能にする複製起点および選択可能マーカー、例えば、大腸菌のアンピシリ ン耐性遺伝子およびビール酵母菌ｔ　ｒｐｌ遺伝子を含み、トリプトファン中で 増殖する能力を欠失した酵母の突然変異株に関する選択マーカーと、構造配列下 流の転写を誘導する高度に発現された酵母遺伝子由来のプロモーターとが提供さ れる。次に、酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔ　ｒｐｌ損傷の存在は、トリプトフ ァン不存在下での増殖によって形質転換を検出するのに有効な環境を提供する。

酵母ベクター中の適当なプロモーター配列としては、メタロチオネイン、３−ホ スホグリセレートキナーゼ（ヒララマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）ら、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５５：２０７３．１９８０年）または他の解糖酵素（へ １９７８年）、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロ ゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキ ナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムター ゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコ ースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのプロモーターがある。酵母発現におい て用いるのに適したベクターおよびプロモーターは、更に、Ｒ，ヒラマンら、欧 州特許出願筒ＥＰ−Ａ−００７３６５７号明細書に記載されている。

好ましい酵母ベクターは、大腸菌における選択および複製に関するｐＢＲ３２２ からのＤＮＡ配列（Ａｍｐｒ遺伝子および複製起点）と、グルコース抑制ＡＤＨ ２プロモーターおよびα因子分泌リーダーを含む酵母ＤＮＡ配列とを用いて組み 立てることができる。該ＡＤＨ２プロモーターはラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）（ Ｂｅｉｅｒ）ら（Ｎａｔｕｒｅ　３００ニア２４．１９８２年）によって記載さ れた。異種タンパク質の分泌を支配する酵母α因子リーダーは、発現されるプロ モーターと構造遺伝子との間に挿入することができる。例えば、クリセン（Ｋｕ ｒｊａｎ）ら、Ｃｅ１ｌ　３０：９３３，１９８２年；およびビター（Ｂ　ｉ　 ｔ　ｔ　ｅ　ｒ）　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８ 工：５３３０．１９８４年を参照されたい。リーダー配列は、その３′末端付近 に１個またはそれ以上の有用な制限部位を含むように修飾されて、異種遺伝子に 対するリーダー配列の融合を容易にすることができる。典型的な酵母発現ベクタ ーは、下記の実施例１および２に記載されたＰＩＸＹ５２１およびＰＩＸＹ５２ ３である。

適当な酵母形質転換プロトコルは当業者に周知であり；典型的な技術は、ヒンネ ン（Ｈｉｎｎｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　ヱ５ ：１９２９．１９７８年に記載されている、０．６７％酵母窒素基材、０．５％ カザミノ酸、２％グルコース、アデニン１０μｇ／ｍｌおよびウラシル２０μ＋ ｇ／ｍ１から成る選択性培地中においてＴｒｐ　形質転換体を選択することであ る。

ＡＤＨ２プロモーターを含むベクターによって形質転換された宿主菌株は、１％ 酵母エキスと、２％ペプトンと、アデニン８０μｇ／ｍｌおよびウラシル８０μ ｇ／ｍＩを補足した１％グルコースとから成る富栄養培地中において発現させる ために増殖させることができる。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除は、培地グル コースの消耗によって引起こされる。粗酵母上澄みを濾過または遠心分離によっ て集め、そして４℃で保持した後に更に精製する。本発明の最も好ましい実施態 様において、栄養培地が発酵中に連続量で加えられて高細胞密度増殖を可能にす る高細胞密度発酵法で酵母宿主細胞を培養する。典型的な高細胞密度発酵法を下 記の実施例３に記載する。

種々の哺乳動物または昆虫細胞培養系を用いて組換え体タンノくり質を発現する ことができる。昆虫細胞中における異種タンノ々り質の生産用のノくキュロウイ ルス系は、ラッコウ（Ｌｕｃｋｏｗ）およびサマーズ（Ｓｕｍｍｅｒｓ）、Ｂｉ ｏ／物宿主細胞系の例としては、グルラマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）（Ｃｅ　Ｉ　ｌ 　２３　：１７５，１９８２年）によって記載されたサル腎細胞のＣＯ３−７系 統並びに適当なベクターを発現することができる他の細胞系、例えば、Ｌ細胞、 ｃ１２７．３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）　、ＨｅＬａおよび ＢＨＫ細胞系などがある。哺乳動物発現ベクターは、非転写要素、例えば、複製 起点、発現される遺伝子に結合した適当なプロモーターおよびエンハンサ−並び に他の５′または３′フランキング非転写配列と、５′または３′非翻訳配列、 例えば、不可欠なリポソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー および受容体部位並びに転写終結配列を含むことができる。

を推動物細胞を形質転換する場合に用いられる発現ベクター中の転写および翻訳 調節配列は、ウィルス源によって提供されることができる。例えば、一般的に用 いられるプロモーターおよびエンハンサ−は、ポリオーマ、アデノウィルス２、 ンミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）およびヒトサイトメガロウィルス由来であ る。ＳＶ４０ウィルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０複製起点、初 期および後期プロモーター、エンハンサ−、スプライスおよびポリアデニル化部 位を用いて、異種ＤＮＡ配列の発現に必要とされる他の遺伝要素を提供すること ができる。初期および後期プロモーターは、両方とも、ＳＶ４０ウィルス複製起 点を更に含むフラグメントとしてウィルスから容易に得られるので特に有用であ る（フィアーズ（Ｆｉｅｒｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　２ヱ旦：１１３．１９７８年 ）。更に小型のまたは更に大型のＳＶ４０フラグメントは、ウィルス複製起点に 位置するＢｇＩ／１部位に対してＨ４ｎｄｌ　１１部位から伸長した約２５０ｂ ｐの配列が含まれるという条件付きて用いることができる。典型的なベクターは 、オカヤ７　（Ｏｋａｙａｍａ）およびベルブ（Ｂｅ　ｒｇ）　（Ｍｏ　Ｉ、Ｃ ｅ　ｌ　Ｉ。

Ｂｉｏｌ、３・２８０．１９８３年）によって記載されたように構築することが できる。

Ｃ１２７ネズミ咄乳動物上皮細胞における哺乳動物受容体ｃＤＮＡの適当な高水 準発現に有用な系は、実質的には、コスマン（Ｃｏｓｍａｎ）ら（Ｍｏｌ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、２３：１９８６年）によって記載されたように構築することが できる。

ＭＧＦ／Ｉ　Ｌ−３ＤＮＡの発現に特に好ましい真核性ベクターとしてはｐｌＸ Ｙ５２１およびｐｌＸＹ５２３があり、それらは両方とも、ｐＢｃ１０２．に２ ２　（ＡＴＣＣ６７，２５５）由来の酵母発現ベクターであり、しかも下記の実 施例１および２に記載のように、大腸菌（Ａｐｒ遺伝子および複製起点）および 酵母における選択および複製に関するｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列を含む。

精製された哺乳動物タンパク質または類似物は、本発明のＤＮＡの組換え体翻訳 産物を発現させるのに適した宿主／ベクター系を培養した後に、培地または細胞 抽出物から精製することによって製造される。

例えば、最初に、組換え体タンパク質を培地中に分泌する系からの上澄みを、商 業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、アミコン（Ａｍ　ｉ　ｃ 　ｏ　ｎ）またはミリポア・ペリコン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＰｅｌｌｉｃｏｎ） 限外濾過装置を用いて濃縮することができる。濃縮工程後、濃縮物を適当な精製 マトリックスに適用することができる。例えば、適当な親和性マトリックスは、 適当な支持体に結合したＭＧＦ若しくはＩ　Ｌ−３受容体またはレクチン若しく は抗体分子を含むことができる。或いは、陰イオン交換樹脂、例えば、ジエチル アミノエチル（Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ）側基を有するマトリックスまたは基質用いるこ とができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セ ルロースまたはタンパク質精製において一般的に用いられる他の種類でありうる 。或いは、陽イオン交換工程を用いることができる。適当な陽イオン交換体とし ては、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリッ クスがある。スルホプロピル基が好適である。

最後に、疎水性逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）媒質、例え ば、メチルまたは他の脂肪族側基を有するシリカゲルを用いる１種類またはそれ 以上のＲＰ−ＨＰＬＣ工程を用いて融合タンパク質組成物を更に精製することが できる。前述の精製工程のいくつかまたは全部を様々な組合せで用いて、均一な 組換え体タンパク質を提供することができる。

細菌培養において生産された組換え体タンパク質は、通常、細胞ペレットから最 初に抽出した後、１回またはそれ以上の濃縮、塩析、水性イオン交換またはサイ ズ排除クロマトグラフィ一工程によって単離される。最終的に、高速液体クロマ トグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）を最終精製工程として用いることができる。組換 え体融合タンパク質の発現において用いられる微生物は、凍結融解サイクル、音 波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含む何等かの従来の方法によって 破壊することができる。

融合タンパク質を分泌タンパク質として発現する酵母の発酵は、精製を極めて簡 単にする。大規模発酵から得られた分泌組換え体タンパク質は、アーダル（Ｕｒ ｄａｌ）ら（Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏ　、２９６：１７１，１９８４年）によって 開示されたのと同様の方法によって精製することができる。この参考文献には、 分離用）ＩＰＬＣカラムでの組換え体ネズミＧＭ−Ｃ８Ｆの精製のための２種類 の逐次的逆相ＨＰＬＣ工程が記載されている。

組換え体培養において合成された融合タンパク質は、融合タンパク質を培養物か ら回収するのに採用された精製工程に応じた量および性質の、タンパク質を含む 非ヒト細胞成分の存在を特徴とする。これらの成分は、通常、酵母、原核生物ま たは非ヒト高等真核生物超厚によるものであり、好ましくは、デンシトメトリー またはクロマトグラフィーの走査による約５％未満程度の無害の混入物量で存在 している。更に、組換え体細胞培養は、それぞれのタンパク質種の超厚、例えば 、細胞、細胞滲出物または体液中に本来見出されるような、ＭＧＦまたはＩＬ− ３と通常関与しうるタンパク質を含まない融合タンパク質の生産を可能にする融 合タンパク質組成物は、望ましい精製度の融合タンパク質と生理学的に許容しう る担体とを混合することによって投与用に製造される。このような担体は、用い られる用量および濃度において受容者に対して無毒性である。通常、このような 組成物の製造は、融合タンパク質を緩衝剤、アスコルビン酸などの酸化防止剤、 低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース 、スクロースまたはデキストランを含む炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、 グルタチオン並びに他の安定剤および賦形剤と混合することを行なう。

融合タンパク質組成物を用いて、骨髄細胞などの造血系前駆細胞の増殖、分化お よび機能活性化を促進することができる。具体的に、融合タンパク質含有組成物 を用いて、骨髄抑制患者において末梢血液白血球数を増加させ且つ循環性顆粒球 計数を増加させることができる。この成果を達成するために、有効量の融合タン パク質組成物を薬剤担体または希釈剤と組合せて哺乳動物、好ましくは、ヒトに 対して投与する。

以下の実施例を例示のために与えるが、制限するためのものではない。

大施撚 実施例Ｉ ＭＧＦ／Ｉ　Ｌ−３融合タンパク質をコードしている発現ベクターの合成Ａ、中 間体プラスミドＰＩＸＹ３２１の構築末梢血液リンパ球を、フィコールーノゾパ ク密度遠心分離により、全血（ポートランド・レッド・りｏス（Ｐｏｒｔｌａｎ ｄ　Ｒｅｄ　Ｃｒｏｓｓ）、ポートランド、オレゴン州、米国）から調製された バフィーコートから単離した。Ｔ細胞を、臭化２−アミノーエチルチオウロニウ ムで処理したヒツジ赤血球とロゼツト形成させることによって単離した。細胞を 、１７５０ｍ２フラスコ中のＲＰＭｌｌｏｏｍｌ、１０％ウシ胎児血清、５０μ Ｍ　β−メルカプトエタノール、１％フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）およびホ ルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）１０ｎｇ／ｍｌ中 において細胞５ｘ１０５個／ｍｌで１８時間培養した。ＲＮＡをグアニジニウム ＣｓＣ１法によって抽出し、そしてポリＡ　ＲＮＡをオリゴ−ｄＴセルロースク ロマトグラフィーによって製造した（マニアナイスら、ｙ旦±ユニ且よａｒ−９ ±立旦エユ（二Δ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、：ｌ−ルド・スプ リング・ハーバ−１１９８２年）。ｃＤＮＡをポリＡ　ＲＮＡから、本質的には グブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）およびホフマン（Ｈｏ　ｆ　ｆｍａｎ）　、Ｇｅｎｅ 　２５　：　２６３〜２６９　（１９８３）に記載されたように製造した。ｃＤ ＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖にし、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼを 用いてプラント末端付きにし、ＥｃｏＲ４メチラーゼによってメチル化してｃＤ ＮＡ中のＥｃｏＲＩ開裂部位を保護し、そしてＥｃｏＲＩリンカ−に対して連結 させた。これらの構築物を、ｃＤＮＡの各末端のリンカ−の一つのコピーを除く 全部を除去するようにＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩカットに対して連結し、 そして製造者の指示にＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａ ｃｈ）、グラバ−（Ｇｌｏｖｅｒ）監修、ＩＲＬプレス（Ｐｒｅｓｓ）　、４９ 〜７８頁）のアームを脱リン酸化し且つλフアージ抽出物（ストラタンーン（Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅ）、サン・ディエゴ、ＣＡ、米国）中にパッケージした。組 換え体５００．００個を大腸菌菌株Ｃ６００ｈｆｌ−上に置き、そして下記のプ ローブを用いる標準的なプラークハイプリダイセーション技術によってスクリー ニングした。

２種類のオリゴヌクレオチドを、ｈｕｌＬ−３遺伝子の選択された５′および３ ′配列に対して相補的な配列を用いて合成した。ｈｕｌＬ−３リーダーの一部分 をコードしている配列に相補的な５′プローブの配列は、５’　−ＧＡＧＴＴＧ ＧＡＧＣＡＧＧＡＧＣＡＧＧＡＣ−３’　であツタ。成熟タンパク質のアミノ酸 １２３〜１３０をコードしている部分に対応する３′プローブの配列は、５’　 −ＧＡＴＣＧＣＧＡＧＧＣＴＣＡＡＡＧＴＣＧＴ−３’　であツタ２４４９　（ １９７８）に開示されたのと実質的に同様の標準的な自動トリエステル法であっ た。合成後、オリゴヌクレオチドを脱保護し且つ分離用ゲル電気泳動法によって 精製した。スクリーニングプローブとして用いるために、マニアティスらによっ て開示されたのと同様の技法を用いて、オリゴヌクレオチドを３２Ｐ−ＡＴＰお よびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによって末端に放射性標識した。

ライブラリースクリーニングに用いられた大腸菌菌株はＣ６００ｈｆｌ−てあっ た（ホインら、１９８５年、上記）。

１３個の正のプラークを精製し且つ２種類のハイブリダイモーションプローブに よって別個に再プローブした。１１のクローンか双方のオリゴヌクレオチドにハ イブリダイズした。いくつかの正の組換え体ファージからのｃＤＮＡインサート を、独特のＥｃｏＲ１部位、ＢａｍＨ１部位および多数の他の独特の制限部位を 有するポリリンカーを含む標準的なりローニングベクターｐＢＲ３２２のＥｃ○ Ｒ１カット誘導体（ｐＧＥＭＢＬ１８）中にサブクローン化した。この種類のい て、ＳＦ３およびＴ７ボリメラーゼのプロモーターは多数のクローニング部位に 隣接している。選択されたクローンのヌクレオチド配列は連鎖終結法によって決 定された。具体的には、λＧＴ１０・ＩＬ３クローン２．３．４および５の部分 的ＥｃｏＲＩ消化により、ｐＧＥＭＢＬ１８のＥｃｏＲ１部位中に別個にサブク ローン化される８５０ｂｐ〜１，０００ｂｐの寸法のフラグメントが生じた。

ｐＧＥＭＢＬ　：　ｒｈｕ　ＩＬ−３サブクローンのインサートは、ｐＧＥＭＢ Ｌ１８の多数のクローニング部位に隣接して結合する普遍プライマーと、ｈｕｌ Ｌ−３配列由来の合成オリゴヌクレオチドとを用いて配列決定された。

−ドするコドンに変更することによって変化させた。これにより、酵母細胞によ って分泌されたタンパク質のＮ結合グリコジル化（しばしば高グリコジル化）が 妨げられ、一層均一の生成物が得られる。これらの変更は、以下に記載したよう に、ｈｕ　ＩＬ−３ｃＤＮＡを酵母発現ベクターｐｌＸＹ１２０中にサブクロー ニングする際に行なわれた。

酵母発現ベクターｐｌＸＹ１２０は、多数のクローニング部位を含む下記の合成 オリゴヌクレオチドが、α因子シグナルペプチドの３′末端付近のＡｓｐ７１８ 部位（アミノ酸７９）から２μ配列中に含まれた５ｐｅ１部位まで挿入されたこ とを除き、欧州特許第２４３，１５３号明細書に記載されたｐＢｃ１０２−に２ ２と実質的に同一である。

更に、複製起点および遺伝子間部分を含む一木組バクテリオファージｆ１由来の ５１４ｂｐのＤＮＡフラグメントを、ｐＢＲ３２２ＤＮＡ配列のＮｒｕ１部位に 挿入した。ｆ１複製起点の存在は、大腸菌の適当な（雄性）菌株に形質転換され 且つバクテリオファージｒ１によって重感染した場合に、ベクターの一本鎖コピ ーの生成を可能にする。この能力は、ベクターのＤＮＡ配列決定を容易にし且つ インビトロ突然変異誘発を可能にする。

酵母発現ベクターｐｌＸＹ１２０を、α因子リーダーペプチドの３′末端付近（ ヌクレオチド２３７）で開裂する制限酵素Ａｓｐ７１８および、ポリリンカーに おいて開裂するＢａｍＨｌによって消化した。大型のベクターフラグメントを精 製し、そして以下のＤＮＡフラグメント、すなわち、（１）Ｃｌａｌ部位（成熟 ｈｕｌＬ−３のヌクレオチド５８）からＢａｍ８１部位（ポリリンカー中のｈｕ ＩＬ−３ｃＤＮＡに対する３′）までのプラスミドＧＥＭＢＬ１８：ｈｕｌＬ− ３由来のｈｕｌＬ−３ｃＤＮＡフラグメントおよび（２）下記の合成オリガノに 対して連結した。オリゴヌクレオチドＡは、α因子リーダーペプチドのＣ末端を コードしていて且つそれを枠中においてオクタペプチドＤＹＫＤＤＤＤＫに融合 している配列を再生し、それか順次に、成熟ｒｈｕｌＬ−３のＮ末端に対して融 合する。ｒｈｕｌＬ−３タンパク質に対するこの融合は、オクタペプチドに特異 的な抗体による検出を可能にし、ｒｈｕＩＬ−３の発現および精製を監視するの に最初に用いられた。このオリゴヌクレオチドは、更に、このＮ結合グリコジル 化部位を変化させるように１５位でのアミノ酸変化（Ａｓｎ１５をＡｓｎ１５に ）をコードする。オリゴヌクレオチド八において下線を施したヌクレオチドは、 野生型ｃＤＮＡ配列からの変化を示す。ヌクレオチド４３および４５（成熟ｈｕ ＩＬ−，３分子のＮ末端アラニンに対応するコドンがら数えて）においてそれぞ れＡをＧにおよびＣをＴに変更することによってのみアミノ酸変化（Ａｓｎ１５ に）が生しる。他の塩基変化は、アミノ酸配列を変化させることなく好都合な制 限部位（ＡｈａｌｌおよびＰｖｕ　Ｉ　Ｉ）を導入する。得られたプラスミドは ｐＩＸＹ１３９と称されており、ｈｕ　ＩＬ−３ｃＤＮＡを一つの残りのＮ結合 グリコノル化共通配列（Ａｓｎ７０）と−緒に含んでいる。

プラスミドｐＩＸＹ１３９を用いてオリゴヌクレオチドに支配された突然変異誘 発を行なって、Ａｓｎ　をＡｓｎ７０に変更することにより第二のＮ結合グリコ ノル化共通配列を除去した。インビトロ突然変異誘発は、ワルダー（Ｗａ　ｌ　 ｃｌ　６　ｒ）およびワルダー、Ｇｅｎｅ　４２：１３３　（１，９８６）に記 載されたのと同様の方法によって実施された。酵母ベクターｐｌＸＹ１３９は、 −木組バクテリオファージｆ１の複製起点を含み、そして大腸菌の適当な（雄性 ）菌株中に存在し且つヘルパーファージに重感染した場合に一本鎖ＤＮＡを生成 することができる。

一本鎖ＤＮＡは、大腸菌菌株ＪＭ１０７を形質転換し且っヘルパーファージ■Ｒ １によって重感染することによって生成した。−木組ＤＮＡを単離し、そして成 熟ｈｕｌＬ−３の７０位においてＡｓｐをＡｓｎにコドンスイッチ置換させる以 下の突然変異原性オリゴヌクレオチドＢ、ＧＴＣＡＡＧ　ＡＧＴ　ＴＴＡＣＡＧ 　旦ＡＣＧＣＡ　ＴＣＡ　ＧＣＡ　ＡＡＴ　Ｇにアニールした。アニーリングお よび酵母形質転換条件は、ワルダーおよびワルダー、上記に記載されたように行 なわれた。酵母形質転換体をトリプトファン欠損培地上での増殖によって選択し 、プールし、そしてホルム（Ｈｏ１ｍ）ら、Ｇｅｎｅ　４２：１６９　（１９８ ６）に記載されたようにＤＮＡ抽出した。野生型および突然変異体プラスミドＤ ＮＡの混合物を含むこのＤＮＡを用いて、大腸菌ＲＲＩをアンピシリン耐性に形 質転換した。得られたコロニーを、標準技法を用いる放射性標識オリゴヌクレオ チドＢに対するハイブリダイモーションによってスクリーンした。ｈｕｌＬ−３ Ａｓｐ７０をコートしているＤＮＡを含むプラスミドは、緊縮条件下における放 射性標識オリゴヌクレオチドＢに対するハイブリダイモーションによって識別さ れ且つヌクレオチド配列決定によって実証された。

得られた酵母発現プラスミドはｐｌＸＹ１３８と称され、Ａｓｐ１５Ａｓｐ７０ アミノ酸変化およびＮ末端のオクタペプチドＤＹＫＤＤＤＤＫをコートしている ｈｕｌＬ−３遺伝子を含んでいた。最終の酵母発現プラスミドは、それがオクタ ペプチドをコードするヌクレオチド配列を欠失していることによって生産物とし て成熟ｒｈｕ［−−３を生成することを除き、ｐｌＸＹ１３８と同一である。

Ｉ　Ｌ−３をコートしている最終酵母発現プラスミドは、下記に記載したように 構築された。酵母発現ベクターｐｌＸＹ１．２０を、上記に記載の制限酵素Ａｓ ｐ７１８およびＢａｍＨＩによって開裂させた。大型のベクターフラグメントを 、（１）（成熟ｈｕｌＬ−３のヌクレオチド１９において開裂する）Ａｈａ２部 位からｃＤＮＡに対して３′のＢａｍＨ１部位まで伸長したプラスミドｐｌＸＹ １３８由来のｈｕ　ＩＬ−３ｃＤＮＡフラグメントおよび（２）下記の合成オリ ゴヌクレオチドＣ と互いに連結させた。オリゴヌクレオチドＣは、Ａｓｐ７１８部位からのα因子 リーダーペプチドの３′末端（アミノ酸Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒ ｇ）およびＡｈａ１１部位までのｈｕｌＬ−３のＮ末端の７個のアミノ酸を再生 する。得られたプラスミドをｐｌＸＹ１５１と称した。このベクターは、酵母中 （ＧＭ−ＣＳＦ／Ｉ　Ｌ−３融合タンパク質をコードしている）プラスミドＰＩ ＸＹ３２１は以下のように構築され且つＭＧＦ／Ｉ　Ｌ−３融合タンパク質を構 築する場合の中間体として用いられた。プラスミドｐ）ＩＧ２３上に内在するヒ トＧＭ−Ｃ３Ｆをコードする野生型遺伝子を、アメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクション（ＡＴＣＣ）、パークローン・ドライブ１２３０１、ロックビル 、メリーランド州、米国に受託番号３９９００として寄託した。酵母発現ベクタ ーｐＹａｆＨｕＧＭ中に挿入された野生型遺伝子も、ＡＴＣＣに受託番号５３１ ５７として寄託された。ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆの非グリコジル化類似物を提供するた めに、オリゴヌクレオチドに支配された部位特異的突然変異誘発法を用いて、Ｐ ＣＴ公開第ＷＯ３９１０３８８１号明細書において記載されたように、可能なＮ −グのプラスミドＬ２０７−３として受託番号６７２３１として寄託した。

最初に、ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＩＬ−３をコードしているＤＮＡを、読み枠または 介在配列に関係なく互いに連結させた。非グリコジル化ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆをコー ドしているｃＤＮＡフラグメントを、９７７ｂｐの制限フラグメント（Ｓｐｈ１ 〜Ｓ　ｓ　ｐ　Ｌ）としてプラスミドＬ２０７−３から切断した。ＩＬ−３ｃＤ ＮＡをＡｓｐ７１８による消化によってｐｌＸＹ１５１から切断した後、マニア ティ４ポリメラーゼ反応を用いてプラント末端付きにし、そして更に、Ｘｈｏｌ で消化して８０３ｂｐのフラグメントを得た。次に、これらの２種類のフラグメ ントを５ｐｈｌおよびｘｈ○１によるｐＩＸＹ１５１ベクターフラグメントカッ トに対して直接的に連結した。このプラスミドをＧＭ／ＩＬ−３直接融合と称し た。

ＧＭ／ＩＬ−３直接融合プラスミドは、ワルダーおよびワルダー、上記によって 記載されたのと同様の方法を用いるオリゴヌクレオチドに支配された突然変異誘 発における鋳型として用いられた。次に、下記のオリゴヌクレオチドを合成した 。

ＧＣＣＡＧ？ＣＣＡＧＧＡＧＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧ ＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣbＡＴＧＡＣＣに のオリゴヌクレオチドはＧＭ−Ｃ３Ｆの３′末端に１３ｂｐが重複するが、停止 コドンを含まないし、Ｇｌｙ　Ｓｅｒリンカ−を含み、そしてＩＬ−３の５′末 端に１３ｂｐが重複する。リンカ−配列は、ヒユーストン（Ｈｕｓｔｏｎ）ら（ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５：５８７９〜５８８３． １９８８年）によって記載されたリンカ−の修飾変型であったが、ベネツエン（ Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ）ら０．　Ｂｔｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５７：３０２６．１ ９８２年）による酵母でのコドン使用に最適化された。

−重鎖プラスミドＤＮＡは、Ｒ４０８ヘルパーフアージ（ストラタジーン）およ びラッセル（Ｒｕｓｓｅｌ）らの方法（Ｇｅｎｅ　４５：３３３〜３３８．１９ ８６年）を用いてＧＭ／ＩＬ−３直接融合から製造された。次に、ワルダーおよ びワルダー、上記に記載されたように上記オリゴヌクレオチドを一本鎖プラスミ ドＤＮＡにアニーリングし且つアニールされたＤＮＡによって酵母菌株ＸＶ２１ ８１を形質転換することにより、オリゴヌクレオチドに支配された突然変異誘発 を行なった。酵母ベクターは一重鎖バクテリオファージｆ１の複製起点を含み、 大腸菌の適当な（雄性）菌株中に存在し且つヘルパーファージに重感染した場合 に一本鎖ＤＮＡを生成させることができる。酵母形質転換体をトリプトファン欠 損培地上での増殖によって選択し、プールし、そしてホルムら（Ｇ　ｅ　ｎ　ｅ 　±２：１６９，１９８６年）によって記載されたようにＤＮＡを抽出した。突 然変異体および野生型プラスミドＤＮＡの混合物を含むこのＤＮＡを用いて大腸 菌ＲＲ１をアンピシリン耐性に形質転換した。得られたコロニーを、標準技法を 用いる放射性標識オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによって スクリーンした。ＧＭ−Ｃ３Ｆ／リンカ−／ＩＬ−３をコードしているＤＮＡを 含むプラスミドは、緊縮条件下においてリンカ−含有放射性標識オリゴヌクレオ チドに対するそれらのハイブリダイゼーションによって識別され且つヌクレオチ ド配列決定によって実証された。

ヌクレオチド配列決定中に、リンカ一部分内で突然変異が生じたことが発見され た。ヌクレオチド配列ＴＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧを欠失しく配列を参照されたい ）、その結果としてアミノ酸配列（，１ｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙを欠失したタンノ （り質を発現しこ。この突然変異は、読み枠を変化させなかったしまたは生物学 的に活性なタンパク質の発現を妨げなかった。得られたプラスミドはｐＩＸＹ３ ２ＩＬ−３を含む融合タンパク質を構築する場合の中間体プラスミドとして用０ た？ｖＩＧＦをコードしている酵母発現ベクターを、ｈｕＭＧＦ−２ＤｃＤＮＡ 配列を前記に記載のｐｌＸＹ−１２０ベクター中に挿入することによって構築し た。

ｐＡｓｐＬｙｓ）をコードしている配列を相接して且つＭＧＦに関する読み枠中 に含み、発現されたタンパク質の生成を容易にする。得られたベクターをｐＩＸ Ｙ４９０と称した。

Ｃ，ＭＧＦおよびＩＬ−３を含む融合タンパク質をコードしているベクターの用 ペプチド、ＭＧＦおよびＩＬ−３をコードしているＤＮＡ配列とを組合せること によって構築した。第一のｃＤＮＡフラグメントはプラスミド主鎖およびＡＤＨ ２プロモーターの一部分を含み、ＰＩＸＹ４９０からＳｐＨ１−ＢａｍＨＩ７ラ グメントとして切断された。

ＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧ）およびヒトＭＧＦの細胞外部分の５′末端を含み、上 記に記載のｐＩＸＹ４９０の５ｐＨＩ−ＥｃｏＲＩ制限フラグメントとして切断 された。

第三フラグメントは、ヒトＭＧＦの細胞外部分の３′末端をコードしている配列 を含んでいた。ＭＧＦコーディング部分およびＩ　Ｌ−３コーディング部分を結 合しているリンカ−配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ＭＧＦの コーディング部分（配列番号３のヌクレオチド３３４〜３５７）に対応し且つＥ ｃｏＲＩ制限部位を含む下記の５’　ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーおよ び、一部分がＭＧＦの３′末端（配列番号３のヌクレオチド４６０〜４７１）に 対して相捕的であり且つＭＧＦの３′末端に相接する５ｆｉＩおよびＢａｍｌ− １１制限部位を含むリンカ−配列（配列番号のヌクレオチド４７２〜４９２）の 一部分を導入する下記の３’　ＰＣＲオリゴヌクレオチドアンチセンスブライマ ーを用いて生成された。合成後、オリゴヌクレオチドを脱保護し且つ分離用ゲル 電気泳動によって精製した。スクリーニングプローブとしての使用には、マニア ナイスらによって開示されたのと同様の技法を用いてオリゴヌクレオチドをＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼによってキナーゼ処理した。Δ２８ヒトＭＧＦの細胞 外部分（欧州特許出願第ＥＰ−Ａ−０４２３９８０号明細書、図４４に記載され たアミノ酸１〜１５７）をコードするヒトＭＧＦ−２ＤをコードしているｅＤＮ Ａ配列を、ｐブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＳＫ　（−）クローニ ングベクター（ストラタジーン、ラホヤ、ＣＡ）中にサブクローン化した。得ら れたｐブルースクリプト：ｈｕＭＧＦ２−Ｄプラスミドを鋳型として用いて、ヒ トＭＧＦの３′末端を増幅させ且つヒトＭＧＦおよびＩ　Ｌ−３を結合するリン カ−配列を加えるのに上記プライマーを用いた。各プライマー５０ｐＭおよび鋳 型５０ｎｇを、水２９．７５μＬ　１０ｘ標準ＰＣＲ緩衝液（５００ｍＭ　ＫＣ Ｉ、１００ｍＭトリス−ＣＩ　（ｐＨ８，３）、１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０．１ ％（ｗ／Ｖ）ゼラチン）５μｍ、ＩＯＸ低マグネシウム緩衝液（５００ｍＭ　Ｋ ＣＬ　１００ｍＭ）リス＝ＣＩ　（ｐ　Ｈ８−３）　、５　ｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ 　２．０．１％ゼラチン）（対照用）５μｌまたは１０Ｘ低カリウム緩衝液（５ ０ｍＭ　ＫＣＩ、１００ｍＭトリス−ＣＩ　１１５　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２ ．０．１％ゼラチン）５μＬ　１．２５ｍＭ　ｄＮＴＰ８μｌおよびＴａｑポリ メラーゼ０．２５ｍ１を含む反応緩衝イエゴ、ＣＡ）において９４℃で３０秒間 、３７℃で４５秒問および７２℃で３０秒間を６サイクル行なった後、９４℃で ３０秒間、６０℃で４５秒問および７２℃で３０秒間を約２５サイクル行ない、 そして７２℃で更に５分間延長した。

ＰＣＲ増幅生成物のアガロースゲル電気泳動は、ヒトＭＧＦの３′末端に対応す るバントを示した。

第四フラグメントはＩ　Ｌ−３をコードしている配列およびリンカ−配列の一部 分を含んでおり、上記に記載のｐｌＸＹ３２１からＢａｍＨＩ制限フラグメント として切断された。このフラグメントを子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ベ ーリンガー−７ンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で処理し て５′　リン酸を除去した。

チドは示されていない）を配列番号３に示す。

実施例２ ＩＬ−３／ＭＧＦ融合タンパク質の構築Ｉ　Ｌ−３の後にＭＧＦを含む融合タン パク質を、酵母発現に関する調節配列と、ｌ、−３およびＭＧＦに関するコーデ ィング配列を含むフラグメントとを組合せることによって構築した。第−ｃＤＮ Ａフラグメントは、Ｐｓ　ｔ　１−８ｎａＢ１制限フラグメントをｐｌＸＹ４９ ０から切断することによって得られた。このフラグメントは、ヒトＭＧＦの細胞 外部分の５′末端の大部分を含んでいた。

第二フラグメントは、ＳｎａＢｌ−ＢａｍＨ１制限フラグメントをプラスミドＰ ＩＸＹ３４４から切断することによって得られ、ＩＬ−３をコードしている配列 およびリンカ−配列の一部分を含んでいた。Ｉ　Ｌ−３／ＧＭ−Ｃ３Ｆ融合タン パク質をコードする中間体プラスミドＰＩＸＹ３４４は以下のように構築された 。酵母発現ベクターｐｌＸＹ１２０（上記実施例１に記載された）を、α因子リ ーダーペプチド（ヌクレオチド２３７）の３′末端付近を開裂する制限酵素Ａｓ ｐ７１８と、ポリリンカーで開裂するＮｃｏｌとによって消化した。大型ベクタ ーフラグメントを精製し、そしてＬ２０７−３　（ＡＴＣＣ６７２３１）の部分 消化による約５００ｂｐのＡｓｐ７１８−Ｎｃｏｌフラグメント（ＧＭ−Ｃ８Ｆ 　（Ｌｅｕ２３ＡＳｐ２７Ｇ１ｕ３９）をコードしている）に連結してｐｌＸＹ ２７３を生成した。次に、ｐＩＸＹ２７３の９ｋｂのＡｓｐ７１８−８ｇ１２フ ラグメント（ＧＭ−Ｃ５Ｆ　（Ｌｅｕ２３Ａｓｐ”７Ｇｌｕ３９）ｃＤＮＡをな お含んでいる）を、ｐｌＸＹ１５１　（実施例ＩＢに記載された）からのヒト■ Ｌ−３（Ｐｒｏ８Ａｓｐ１５Ａｓｐ７０）をコードしているＡｓｐ７１８−Ｎｒ ｕｌフラグメントおよび下記の二本鎖オリゴヌクレオチドに連結した。このオリ ゴヌクレオチドは、ＩＬ−３の３′末端に８ｂｐが重複するが、停止コドンを含 まないし、ＧＩＶ　Ｓｅｒリンカ−を含み、そしてＧＭ−Ｃ３Ｆの５′末端に１ ０ｂｐが重複する。得られたベクターはｐｌＸＹ３４４と称されており、Ｎ末端 ＩＬ−３およびＣ末端ＧＭ−Ｃ３Ｆをコードしている配列を含む。

第三フラグメントはリンカ−配列を含んでおり、下記の２種類のオリゴヌクレオ チド を合成し、キナーゼ処理し、そしてアニーリングすることによって生成された。

上記に記載の第三ｃＤＮＡフラグメントを３通りの連結反応で組合せて、１１− −３およびＭＧＦを含む融合タンパク質をコードする酵母発現ベクターｐｌＸＹ ５２１を生成した。このＩＬ−３／ＭＧＦ融合タンパク質の配列を配列番号１に 示す。

実施例３ ＭＧＦ／１１−３融合タンパク質の発現および精製半数体のビール酵母菌菌株［ ａ、ｔｒｐｌ−Δ、ｈｉｓ３−Δ２００．ｕｒａ３−５２，１ｙｓ２−８０１　 、ａｄｅ２−１０］である宿主菌株ＹＮＮ２８１は、イースト・ジエネティック ・ストック・センター（ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ ）、カルフォルニア大学、バークレー、ＣＡ、米国から入手された。宿主菌株を 、ジャーマン（Ｓ　ｈ　ｅ　ｒｍａ　ｎ）ら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｕｒ ｓｅ　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔ ｉｃｓ、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−，１９８６年の方法に より発現プラスミドを用いて形質転換した。

発現プラスミドＰ　ＩＸＹ５２３　（ＭＧＦ／Ｉ　Ｌ−３融合タンパク質をコー ドしている）を含む酵母をＹＮＢ−ｔｒｐ寒天平板上において４℃で維持した。

いくつかの単離された組換え体酵母コロニーをＹＮＢ−ｔｒｐ増殖培地（ディフ コ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ブト０イト、 Ｍｌシン２００ｍｇ／Ｌ）５０ｍｌ中に接種することによって予備培養を開始し 、そして振とうフラスコ中において３０℃で激しく振とうしながら２１時間増殖 させた。朝までに培養物を定常期において０Ｄ５５ｏが１，２の状態で飽和させ た。

Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ノリッジ、ＮＹ）（６０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（ディフコ ・ラボラトリーズ、デトロイト、Ｍｌ）（２００ｇ／Ｌ）、ペプトン（ディフコ ・ラボラトリーズ、デトロイト、Ｍｌ）（２００ｇ／Ｌ）　、酵母飼料塩（硫酸 アンモニウム２５０ｇ／Ｌ、−塩基性リン酸カリウム無水物１２５ｇ／Ｌ、硫酸 マグネシウム２８．　５　ｇ／Ｌ）　、エタノール（９５％）、ビタミン（ビオ チン領０２　ｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム２ｇ／Ｌ、　ミオ−イノシトール ２５ｇ／Ｌ、ニアシン５ｇ／Ｌ、ピリドキシンＨＣｌ０．４ｇ／Ｌ、葉酸０．１ ｇ／Ｌ、塩化コリン０．５ｇ／Ｌ）、微量元素（ホウ酸５ｇ／Ｌ、硫酸第二銅２ ｇ／Ｌ、塩化第二鉄１０ｇ／Ｌ、硫酸マンガンＬｏｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリ ウム０．　５ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛Ｌｏｇ／Ｌ、塩化コバルト０．５ｇ／Ｌ）　、ア デニン（１０ｇ／Ｌ）、チアミン（１０ｇ／Ｌ）、ウラシル（１０ｇ／Ｌ）　、 ヒスタジン（１０ｇ／Ｌ）、リシン（１５ｇ／Ｌ）。

１リットル発酵槽用の増殖培地を、リン酸カリウム５．０ｇ、硫酸アンモニウム ２０．０ｇ、硫酸マグネシウム１．０ｇ、塩化カルシウム０．１ｇ、Ｌ６１消泡 剤０．２ｍｌおよび全容ｆｆ１６５０ｍ１までの水を混合することによって調製 した。次に、この培地を発酵槽中において１２１℃で３０分間のオートクレーブ にｌ１チアミンＨＣＩが３．５ｍｌ、ビタミン２．５ｍｌ、微量元素２．５ｍＬ アデニン２５ｍ１ウラシル１５ｍ１．酵母エキス１２．５ｍｌおよびペプトン１ ２．５ｍｌを混合することによって栄養飼料を調製した。次に、酵母種を発酵ト ン２２．５ｍｌ、酵母飼料塩３１．２５ｍ１、エタノール２２．５ｍｌ、ビタミ ン１．２５ｍ１．微量元素１．２５ｍ１、アデニン２５ｍ１．チアミン３．Ｏｍ ｌ、ウラシル１０ｍ１．ヒスタジン］、Ｏｍｌおよびリシン１０ｍ１を含む栄養 飼料（上記のように調製された）を０．１１ｍ１／分の量で２０時間連続的に加 えた後、０．２ｍｌ／分の量で更に２４時間加えた。最終生産培地組成は下記の 通りであった。

得られた酵母ブイヨンを９．ＯＯＯｒｐｍで１０分間遠心分離した。遠心分離し た上澄みを０．４５μフイルターによって濾過し、透明な酵母ブイヨンを集めい て製造者（インターナショナル・バイオチクノロシーズ・インコーホレーテッド （Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ。

し且つ１ｍＭ　ＣａＣｌ２、Ｏ，ＬＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，５で平衡させた。

ＦＬＡＧ−ＭＧＦ／Ｉ　Ｌ−３融合タンパク質を、０．１Ｍクエン酸ナトリウム 、ｐＨ３，０によってアフィニティーカラムから溶離した。

実施例４ ヒト骨髄コロニー検定におけるＭＧＦ／ＩＬ−３融合タンパク質の活性ＭＧＦと 、ＩＬ−３と、ＭＧＦおよびＩＬ−３を含む融合タンパク質とのコロニー形成を 誘導する能力を下記の検定において比較した。最初の検定において、ウィリアム スら、Ｅｘｐ、Ｈｅｍａｔｏｌ、１５：２４３　（１９８７）に記載されたのと 実質的に同様の方法により、顆粒球マクロファージコロニーおよびクラスター形 成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）を検定した。簡単にいうと、必須および非必須アミノ酸 、グルタミン、セリン、アスパラギンおよびピルビン酸ナトリウム（ギブコ（Ｇ ｉｂｃｏ））を２０％ウシ胎児血清と一緒に補足したマツコイ（ＭｃＣｏｙ’　 ５）５Ａ培地を含む０．　３％寒天（ディフコ、デトロイト、ＭＩ）または０． ４％アガロース（ＦＭＣ，ロックランド、ＭＥ）培地０．５ｍｌ中）およびクラ スター（３〜４９個細胞）を、倒立顕微鏡を用いて３２Ｘで計数した。

第二の検定において、ウィリアムスら、上記に記載された方法により、赤血球系 バースト形成単位（ＢＦＵ−Ｅ）および多能性コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＥ ＭＭ）を検定した。簡単にいうと、二重反復試験の３５ｘｌＯｍｍ培養物を、バ ースト促進活性源として、組換え体ヒトエリトロポエチン（ハイクローン（Ｈｙ ｃｌｏｎｅ））２単位／ｍｌ、０．１ｍＭヘミン（コダック（Ｋｏｄａｋした。

ネズミＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＥＭＭによる最大のコロニー形成は、前述の 培養条件を用いて１４日目に観察された。ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＥＭＭは 、倒立型顕微鏡を用いて８０Ｘにおいて、赤血球系要素のヘモグロビン化、特有 の赤色発生並びに前者および後者それぞれに関する骨髄性要素の不存在または存 在の基準で評点された。

前述の検定を用いて、本発明者は、ＭＧＦ、ＩＬ−３、ＭＧＦおよびＩＬ−３並 びにＭＧＦおよびＩＬ−３を含む融合タンパク質のコロニー形成活性を対照培地 に対して比較した。結果を下記の表に示す。

表Ａ ＭＧＦ　３　Ｑ＋” ６２±２０．８±０．５＋ ＩＬ−３２８”ｌ　１０４±２５．３±０．６ＭＧＦ＋ＩＬ−３　２＋３　１４ ±１　９８±４　６±０．５本 ＰＩＸＹ５２３　４　１０”２　１３６”４　１４”ｌ”１２３６±２１５８± ５＊３１±２＊ ＝培地対照に等しい値 ８　培地対照と比較されたｐ＜０．　０５これらのデータは、ＭＧＦ／ＩＬ−３ 融合タンパク質が赤血球系および初期混合コロニー形成を刺激することを示して いる。ＰＩＸＹ５２３は、対照にまさる且つＭＧＦおよびＩ　Ｌ−３単独並びに ＭＧＦおよびｒＬ−３組合せにまさる有意のＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＥＭＭ 刺激活性を有していた。

実施例５ ヒト末梢血液膨張検定におけるＭＧＦ／ＩＬ−３融合タンパク質の活性実験は、 種々の成長因子若しくは成長因子組合せを含む前駆細胞膨張培地または成長因子 を加えられなかった培地によってｅｘ　ｖｉｖｏて膨張したヒト造血系前駆細胞 の膨張比率を比較するように行なわれた。

ヒト末梢血液は、正常で健康な被験者から静脈穿刺によって得られ、そしてへ度 勾配遠心分離によって末梢血液から得られた。ヒト造血系前駆細胞の集団を含む 単核細胞をリン酸緩衝溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中で２回洗浄し、そして生存しつる細 胞をトリパンブルー色素排除によって計数した。

ｅｘ　ｖｉｖｏ培養は、２０％ウシ胎児血清を補足したスーパー・マツコイ培地 １０ｍＩ中において生存しつる細胞約１０７個から行なった。細胞を培養し、そ して７％ＣＯ２，８％０２．８５％空気の雰囲気中において３７℃でインキュベ ートされたペトリ皿中において膨張させた。培地は、４日目に１種類または複数 の新しい成長因子と取り替えられた。

成長因子を培地に対して下記の濃度、すなわち、ＰＩＸＹ３２１　（１００ｎｇ ／ｍｌ）　、ＭＧＦ　（Ｉμｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３（１００ｎｇ／ｍｌ）　、Ｐ ＩＸＹ５２３　（ｔμｇ／ｍｌ）で加えた。

培養中の前駆細胞は非付着性の傾向がある。それぞれのコロニー検定に関して、 各培養物中の非付着性細胞の５０％が得られた。細胞を遠心分離によって培地か ら分離し、２回洗浄し、そして生存しつる細胞をトリパンブルー色素排除によっ て計数した。

ＣＦＵ−ＧＭ検定（ルー（Ｌ　ｕ）ら、Ｅｘｐ、Ｈｅｍａｔｏｌ、１３：９８９ ．１９８５年）により、前駆細胞集団の骨髄性成分が測定された。生存しつる細 胞を、ＰＩＸＹ３２１　（ＧＭ−ＣＦＵ）の存在下においてメチルセルロースク ローニング培地（テリー・フォクス・ラブダ（Ｔｅｒｒｙ　Ｆｏｘ　Ｌａｂｓ） 、バンク−バー、Ｂ、Ｃ９）中に入れた。骨髄性コロニーの数を計数し、そして この数を各ウェル中に入れられた細胞数で割り、コロニー形成能力（ＣＦＣ）発 生率を決定した。ＣＦＣ発生率に全細胞数を掛けて、培養物当りのＣＦＣ数を決 定した。それぞれのＣＦＣ数を０日目のＣＦＣ数と比較して、試験された各前駆 体膨張培地に関する膨張比率を決定した。

骨髄性成分細胞膨張は、成長因子ＭＧＦ、ＩＬ−３、ＰＩＸＹ３２１、ＰＩＸＹ ５２３およびこれらの成長因子の組合せと一緒にインキュベーションして４日後 および８日後に決定された。膨張指数１は、コロニー数の膨張がなかったことを 意味し、そして膨張指数２は、コロニー数が０日の数から２倍になったことを意 味する。

表Ｂ ＣＦＵ−ＧＭ膨張指数 ＰＩＸＹ３２１　２．２　４．８ ＰＩＸＹ５２３　３．２　９．２ ＩＬ−３＋ＭＧＦ　２．　６　４．　２コレラノテータは、ＰＩＸＹ５２３が顆 粒球マクロファージコロニー形成細胞の生産を、培地対照或いはＭＧＦかまたは ＩＬ−３単独または組合せの場合よりも有意に大きい程度まで刺激することを示 している。８日月においても、ＰＩＸＹ５２３の膨張指数はＰＩＸＹ３２１およ びＭＧＦに相対して大であった。

配列表 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ・　９０６塩基対 （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数　−末鎖 （Ｄ）トポロジー・　直鎖状 （ｉｔ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｔｔｉ）ハイボセティカル：　Ｎｏ （ｔｖ）アンチセンス：ＮＯ η　（−ｉ）直接の起源・ （Ｂ）クローン名：　ＰＩＸＹ５２１ ’　（ｔｘ）配列の特徴・ （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ・　成熟タンパク質（Ｂ）存在位置：　１．、．９０３ （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置・　１．、．９０６ （尤）配列：　配列番号：１ （２）配列番号：２ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：　３０１アミノ酸残基（Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 ＯＯ配列の種類：　タンパク質 （ｘｉ）配列：　配列番号：２ ｔｈ＠　Ｔｙｔ　Ｌ＊ｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌ＠ｕ　ＧＬｕ　Ａｓｎ　＾ｌａ　 Ｇｉｎ　＾ｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌ・Ｕ１１５　１２０　’ 　１２５ （２）配列番号：４ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ・　３０３アミノ酸残基（Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・　直鎖状 （ｕ）配列の種類：　タンノ（り質 （ｘｉ）配列：　配列番号＝４ Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　 Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　５ｅｒ人ｓｎ　ＸＬ＠　Ｓ ａｆ　ＧＬｕ　ＧＬｙ　Ｌ＠ｕ　Ｓａｆ　入ｓｎ　Ｔｙｔ　Ｓｅｔ　工１θ　Ｉ ｌｅ　八ｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　ＶａＬＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｓ　Ｐｈｅ　八ｒ ｇ　Ｉｌｅ　Ｐｈａ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｓａｔ　工ｌ＠　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｐｈ ｓ　Ｌｙｓ　ＡｓｐＰｈ＠　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｌａ　５＠ｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｔ 　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｖａｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　５ｅｘ−Ｔｈｒ　Ｌａｕ Ｓｉｒ　Ｐｔｏ　ＧＬｕ　Ｌｙｓ　ＧＬｙ　Ｌｙｓ　入Ｌａ　Ｌｙｓ　入ｓｎ　 Ｐｙ：ｏ　Ｐｘｏ　Ｇｌｙ　八ｓｐ　Ｇｌｙ　八ｌａ　Ｇｌ■ １４５　１５０　Ａｓｓ　１６０ Ｇｌｙ　入１ａ　Ｇｌｙ　５ａｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　 Ｓｅｔ　Ａｌａ　ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｔｈｔ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ１６５　１７０　ｉ ｔｓ τｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌ＠ｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓ＠ｔ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　 Ｃｙｓ　Ｓａｒ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　ＧＬｕｌｌｌｏ　１８５　 １９０ １１＠ＸＬｅ　Ｔｈｒ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｐｔｏ　Ｌ ａｕ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ＾ｓｐ　Ｐｈｅ＾３ｎ人ｓｎ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　 Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　入ｓｐ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　 Ａｇｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ人ｒｇ　Ｐｌ：ｏ　入ａｎ　１−＠ｕ　Ｇｌｕ 　Ａｌａ　ｆ’ｈ＠　Ａｓｎ　ｘｒｇ　Ａｌａ　ｖａｌ　Ｌ、ｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌ ｅｕ、ＧＬｎ@Ａｓｐ 人１畠　Ｓａｒ　Ａｌａ　Ｘｌｅ　Ｇｌｕ　５＠ｒ　Ｘｌａ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　 Ａｓｎ　ｆ、ｅｕ　Ｌ４ｕ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　ＰｒB Ｌｓｕ　入１＆　でｈｔ　八１ａ　八１ａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　入ｔｇ　）ｌｉｓ 　ｔｒｏ　工１ｅ　ＨＬｓ　Ｘｉｓ　Ｌｙｓ　入ｓｐ　Ｇｌ■ Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｐｈａ　Ａｒｇ　Ａｚｇ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　 Ｔｈｒ　Ｐｈ＠τｙｔ　Ｌ４ｕ　Ｌｙｓτｈｘ　Ｌｅｕフロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１４／４７５ 　８３１８−４Ｈ１４１５４８３１８−４Ｈ １９１００８３１８−４Ｈ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｋ　９２８２−４ＢＨ９２８２−４Ｂ ／／（Ｃｌ２Ｎ　１５１０９　ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ１：９１） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：８６５） Ｉ Ａ６１Ｋ　３７１０２　ＡＢＢ ／／（Ｃｌ２Ｎ　１５１００　ＺＮＡ　ＡＣ１２Ｒ１：９１）

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．ＩＬ−３に対して結合したＭＧＦを含む融合タンパク質。
2. ２．ＭＧＦがＩＬ−３に対してリンカーペプチド配列によって結合している請求 項１に記載の融合タンパク質。
3. ３．前記リンカーペプチド配列が、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａお よびＰｒｏから成る群より選択されるアミノ酸を含む請求項２に記載の融合タン パク質。
4. ４．前記リンカー配列の長さが５〜１５アミノ酸である請求項３に記載の融合タ ンパク質。
5. ５．配列番号１に示されたアミノ酸残基１〜３０１および配列番号３に示された アミノ酸残基１〜３０３から成る群より選択されるアミノ酸配列を有する請求項 ４に記載の融合タンパク質。
6. ６．請求項１に記載のタンパク質をコードしているＤＮＡ配列。
7. ７．請求項２に記載のタンパク質をコードしているＤＮＡ配列。
8. ８．請求項３に記載のタンパク質をコードしているＤＮＡ配列。
9. ９．請求項４に記載のタンパク質をコードしているＤＮＡ配列。
10. １０．請求項５に記載のタンパク質をコードしているＤＮＡ配列。
11. １１．融合タンパク質をコードしているＤＮＡ配列が、配列番号１または配列番 号３に定義されたＤＮＡ配列に対する遺伝コードの結果として縮重している請求 項６に記載のＤＮＡ配列。
12. １２．請求項６に記載のＤＮＡ配列を含む組換え体発現ベクター。
13. １３．請求項７に記載のＤＮＡ配列を含む組換え体発現ベクター。
14. １４．請求項８に記載のＤＮＡ配列を含む組換え体発現ベクター。
15. １５．請求項９に記載のＤＮＡ配列を含む組換え体発現ベクター。
16. １６．請求項１０に記載のＤＮＡ配列を含む組換え体発現ベクター。
17. １７．請求項１１に記載のＤＮＡ配列を含む組換え体発現ベクター。
18. １８．ＭＧＦおよびＩＬ−３を含む融合タンパク質を製造する方法であって、請 求項１２に記載のベクターを含む適当な宿主細胞を、発現を促進する条件下で培 養する工程を含む上記方法。
19. １９．ＭＧＦおよびＩＬ−３を含む融合タンパク質を製造する方法であって、請 求項１３に記載のベクターを含む適当な宿主細胞を、発現を促進する条件下で培 養する工程を含む上記方法。
20. ２０．ＭＧＦおよびＩＬ−３を含む融合タンパク質を製造する方法であって、請 求項１４に記載のベクターを含む適当な宿主細胞を、発現を促進する条件下で培 養する工程を含む上記方法。
21. ２１．ＭＧＦおよびＩＬ−３を含む融合タンパク質を製造する方法であって、請 求項１５に記載のベクターを含む適当な宿主細胞を、発現を促進する条件下で培 養する工程を含む上記方法。
22. ２２．ＭＧＦおよびＩＬ−３を含む融合タンパク質を製造する方法であって、請 求項１６に記載のベクターを含む適当な宿主細胞を、発現を促進する条件下で培 養する工程を含む上記方法。
23. ２３．ＭＧＦおよびＩＬ−３を含む融合タンパク質を製造する方法であって、請 求項１７に記載のベクターを含む適当な宿主細胞を、発現を促進する条件下で培 養する工程を含む上記方法。
24. ２４．哺乳動物において免疫応答または炎症性応答を調節するための組成物であ って、有効量の請求項１に記載の融合タンパク質および適当な希釈剤または担体 を含む上記組成物。
25. ２５．哺乳動物において免疫応答を調節する方法であって、有効量の請求項２２ に記載の組成物を投与することを含む上記方法。