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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Expressionsplasmid für Chaperone.
Spezifischer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung ein Plasmid
mit einem künstlichen
Operon, das Polynucleotide, die jedes der Chaperone DnaK, DnaJ,
GrpE codieren und einen induzierbaren Promotor sowie ein an einen
induzierbaren Promotor ligiertes groE-Operon umfaßt, wobei
das Plasmid zur Expression von DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL und GroES
befähigt
ist und die Promotoren einzeln regulierbar sind; sie betrifft eine Co-Transformante,
die durch Einschleusen des Expressionsplasmids in Escherichia coli
(nachstehend einfach als „E.
coli "bezeichnet)
gemeinsam mit einem Expressionsvektor für ein fremdes Protein hergestellt
wird; und sie betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines fremden
Proteins mit Hilfe der Co-Transformante.
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E.
coli dient in idealer Weise als Wirt zur kostengünstigen und ertragreichen Herstellung
heterologer Proteine, da es leicht zu großen Dichten gezüchtet werden
kann, da die Untersuchungen zum Wirts-Vektor-System hier am weitesten
fortgeschritten sind und da viele Hochexpressionsvektoren entwickelt
wurden. E. coli-Wirt-Vektor-Systeme sind deshalb die meistverwendeten
Expressionssysteme für
heterologe Gene.
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Wenn
sie auf hohem Spiegel in E coli exprimiert werden, lagern sich jedoch
viele heterologe Proteine, besonders Eukaryontenproteine, im Cytoplasma
aneinander und bilden biologisch inaktive, unlösliche, als „Einschlußkörper" bekannte Aggregate.
In der Bildung eines Einschlußkörpers liegt
insofern ein Vorteil, als es möglich
wird, das exprimierte Protein gegen eine Degradation durch Proteasen
in den Wirtszellen zu schützen
und den Einschlußkörper durch
Zentrifugierung leicht von anderen Zellen abzutrennen. Um jedoch
das gewünschte
biologisch aktive Protein zu erhalten, ist es nötig, die Einschlußkörper zu
denaturieren und zu solubilisieren, worauf eine Renaturierung (Zurückzufaltung)
folgt. Dieser Solubilisierungs-Renaturierungsvorgang
wird für
einzelne Proteine auf der Grundlage wiederholter Versuche und Irrtümer ausgeführt, erreicht
aber oft keine zufriedenstellenden Wiedergewinnungsraten. In einigen
Fällen
ist eine Renaturierung nicht immer möglich. Auch werden nicht wenige
heterologe Proteine durch Proteasen in E. coli degradiert und erreichen keine
hohen Expressionsspiegel. Es wurden noch kein voll etabliertes Mittel
zur Lösung
solcher Probleme von Insolubilisierung und Degradation von Expressionsprodukten
gefunden. Versuche, biologisch aktive Proteine in E. coli in großer Menge
herzustellen, waren nicht immer erfolgreich.
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Koexpression
von Chaperonen und dergleichen ist bekannt, und es sind eine Anzahl
von diesbezüglichen
Berichten erschienen. DnaK, DnaJ und GrpE sind Chaperone, die bei
der Proteinfaltung zusammenarbeiten. Es ist die Möglichkeit
in Betracht gezogen worden, dass das an DnaK gebundene ATP bei der
Bindung von DnaJ an ein ungefaltetes Proteinsubstrat zuerst hydrolysiert
wird, was zur Bildung eines ungefalteten Protein-DnaJ-DnaK-Komplexes (ADP-Bindungstyp)
führt,
und dass danach der ADP/ATP-Austausch durch GrpE stattfindet und
zur Freisetzung des Proteinsubstrates aus dem Komplex führt [Szabo,
A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10345–10349 (1994)].
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Die
dnaK- und dnaJ-Gene befinden sich im selben Operon des E. coli-Chromosoms,
während das
grpE-Gen an einem anderen Ort dieses Chromosoms liegt. Bis dato
wurde von einem Verfahren zur Koexpression eines gewünschten
Proteins mit DnaK allein oder sowohl mit DnaK als auch DnaJ berichtet [Blum,
P. et al., BioTechnol: 10, 301–304
(1992); Perez-Perez,
J. et al., Biochem, Biophys: Res. Comm. 210, 524–529 (1995)]; von einem Verfahren
zur Koexpression eines gewünschten
Proteins und DnaJ allein (offengelegtes japanisches Patent Nr. Hei 8-308564);
von einem Verfahren zur Expression von DnaK und DnaJ und von GrpE
aus jeweils verschiedenen Plasmiden [Gaspers, P. et al., Cell. Mol.
Biol. 40, 635–644
(1994)]; und von einem Verfahren zur unabhängigen Expression von DnaK
und DnaJ und von GrpE vom gleichen Plasmid unter Verwendung des
gleichen Promotors [Stieger, M. und Gaspers, P., Immunology Methods
Manual, 39–44
(1997)]. Jedoch haben diese Verfahren die vorstehend beschriebenen
Unzulänglichkeiten.
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Namentlich
von DnaK, DnaJ und GrpE, die zusammenwirken, ist zu erwarten, dass
sie wirkungsvoller sind, wenn sie koexprimiert werden, und es ist sehr
wahrscheinlich, dass die ihnen innewohnende Chaperonfunktion nicht
voll zur Ausprägung
kommt einfach, wenn DnaK allein oder nur DnaK und DnaJ exprimiert
werden. Auch wird in dem Verfahren, bei dem DnaK und DnaJ und GrpE
von den jeweiligen verschiedenen Plasmiden exprimiert werden, das Gen
für GrpE
und das Gen für
das gewünschte
Protein auf einem einzigen Plasmid plaziert, da es schwierig ist,
dass insgesamt drei Plasmide einschließlich des Expressi onsplasmids
für das
gewünschte
Protein in E. coli gemeinsam vorhanden sind; dies erfordert wiederum
eine dem einzelnen gewünschten
Protein angepaßte
Konstruktion des Expressionsplasmids. Darüberhinaus tritt, da der gleiche
Promotor für
die Expression von GrpE und des gewünschten Proteins verwendet
wird, ein Defekt insofern auf, dass die Expression des gewünschten Proteins
nicht auf einen ausreichenden Spiegel angehoben werden kann. Weiterhin
tritt bei dem Verfahren, in dem Dank und DnaJ und GrpE unabhängig vom
gleichen Plasmid unter Verwendung des gleichen Promotors exprimiert
werden, bedingt durch das Vorhandensein zweier Einheiten desselben
Promotors, ein weiteres Problem mit der Plasmidstabilität auf.
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Die
Verwendung von Proteasemutanten von E. coli als Wirte zum Zweck
der Verringerung der Degradation fremder Proteine in E. coli ist
wohlbekannt. So werden zum Beispiel bevorzugt Deletionsmutanten
für Lon-Proteasen
verwendet. Darüberhinaus
ist ein Verfahren bekanntgeworden, das rpoH-Mutanten zur Unterdrückung von
Lon- und Clp-Proteasen verwendet, da die Induktion ihrer Expression
von σ32 gesteuert wird, das vom rpoH-Gen codiert
wird (ungeprüfte
japanische Patentveröffentlichung
Nr. Sho 61-501307, WO 85/03949). Auch ist ein Verfahren zur stabilen
Expression von fremden Proteinen bekanntgeworden, das Doppelmutanten
mit Mutationen in den clpPX- und lon-Genen verwendet (offengelegtes
japanisches Patent Nr. Hei 8-140671).
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Es
sollte aber auch festgehalten werden, dass σ32 auch
die Induktion der Expression von Chaperonen wie DnaK, DnaJ, GrpE,
GroEL und GroES steuert. GroEL und GroES sind für das Wachstum von E. coli
wesentlich und die rpoH-Deletionsmutanten können bei Temperaturen über 20°C nicht wachsen.
Deshalb wurden Missense-Mutationen üblicherweise für rpoH-Mutanten
(htpR-Mutanten) verwendet. Es ist aber erwünscht, die rpoH-Deletionsmutanten
zu vollständigeren
Unterdrückung
der Induktion der Expression von verschiedenen Proteasen wie Lon-Protease
und Clp-Protease zu verwenden.
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Es
wurde von einer großen
Anzahl erfolgreicher Fälle
von Solubilisierung von fremden Proteinen durch Koexpression des
fremden Proteins und von GroEL und GroES berichtet, die anderenfalls
unlöslich
in E. coli bleiben. Beispiele dafür sind etwa Tyrosinkinase [Caspers,
P. et al., Cell Mol. Biol. 40, 635–644 (1994); Amrein, K. E.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1048–1052 (1995)]; Glutamatracemase
[Ashiuchi, M. et al., J. Biochem. 117, 49598 (1995)]; und Dihydrofolatreduktase
[Dale, G. E. et al., Protein Eng. 7, 925–931 (1994)]. Andere Fälle, von denen
berichtet wurde, beinhalten die Verbesserung der Löslichkeit
von menschlichem Wachstumshormon durch Koexpression von DnaK [Blum,
P. et al., Biotechnol. 10, 301–304
(1992)], Transglutaminasesolubilisierung durch Koexpression von
DnaJ (offengelegtes japanisches Patent Nr. Hei 8-308564) und Tyrosinkinasesolubilisierung
durch Koexpression von DnaK, DnaJ und GrpE [Caspers, P. et al.,
Cell. Mol. Biol. 40, 635–644
(1994)]. Es bleibt jedoch schwierig, vorherzusagen, welches fremde
Protein und welches Chaperon in welchem Umfang koexprimiert werden müssen.
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Somit
war das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem,
die vorstehend aufgeführten
Probleme des derzeitigen Standes der Technik zu lösen. Die
Lösung
der technischen Probleme liefern die in den Patentansprüchen umrissenen
Ausführungsformen.
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Die
vorliegende Beschreibung beschreibt ein Operon, das Polynucleotide
umfaßt,
die Chaperone codieren, und das zur Expression eines fremden Proteins
in den Zellen von E. coli in stabilisierter und solubilisierter
Form verwendet werden kann.
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In
einer Ausführungsform
liefert die vorliegende Erfindung ein Expressionsplasmid, das ein Operon,
wie in den Ansprüchen
im Anhang spezifiziert, enthält.
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In
einer weiteren Ausführungsform
liefert die vorliegende Erfindung eine Kotransformante, die durch
Einschleusen des Expressionsplasmids gemeinsam mit einem Expressionsvektor
für ein
fremdes Protein in Escherichia coli hergestellt wird.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
eines fremden Proteins durch Verwendung der Kotransformante.
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Die
vorliegende Beschreibung beschreibt ein Plasmid zur Expression der
zu einem einzigen Operon unter der Kontrolle eines einzigen Promotors
verbundenen dnaK-, dnaJ- und grpE-Gene. Gemäß der vorliegenden Beschreibung
wird die Wirksamkeit der Proteinfaltung im DnaK/DnaJ/GrpE-Chaperonsystem
durch Expression von DnaK, DnaJ und GrpE in E. coli erhöht. Ferner
werden sowohl die Funktionen des DnaK/DnaJ/GrpE- als auch die des
GroEL/ES-Systems, der Haupt-Chaperonsysteme in E. coli, verstärkt. So
wird die Wirksamkeit der Faltung des gewünschten Proteins weiter erhöht, indem
das groESgroEL-Gen, wie vorstehend beschrieben, unter der Kontrolle
eines anderen Promotors in das gleiche Plasmid inseriert wird und
indem das Genprodukt in E. coli-Mutanten, einschließlich Protease-
und rpoH-Mutanten, exprimiert wird. Insbesondere macht es die vorliegende
Erfindung möglich,
geeignete Mengen von DnaK, DnaJ und GrpE bei Vorhandensein von zugesetztem
GroEL und GroES, die für das
Wachstum von rpoH-Mutanten essentiell sind, zu koexprimieren und
dadurch das gewünschte
Protein in stabilisierter und solubilisierter Form zu exprimieren.
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Die
vorliegende Beschreibung beschreibt:
- (1) Ein
künstliches
Operon, das Polynucleotide umfaßt,
die die Chaperone DnaK, DnaJ und GrpE codieren;
- (2) Das vorstehend in Punkt (1) beschriebene künstliche
Operon, das ferner einen induzierbaren Promotor umfaßt;
- (3) Das vorstehend in Punkt (1) beschriebene künstliche
Operon, bei dem der induzierbare Promotor aus der Gruppe, bestehend
aus lac, trp, araB und Pzt-1 ausgewählt wird;
- (4) Ein Plasmid, das das in einem der vorstehenden Punkte (1)
bis (3) beschriebene, für
die Expression von DnaK, DnaJ und GrpE verwendbare künstliche
Operon beinhaltet;
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Die
vorliegende Erfindung betrifft:
- (5) Das vorstehend
in Punkt (4) beschriebene Plasmid, das ferner ein an einen induzierbaren Promotor
gebundenes groE-Operon umfaßt,
wobei das Plasmid zur Expression von DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL und
GroES in der Lage ist;
- (6) Das vorstehend in Punkt (5) beschriebene Plasmid, wobei
der an ein groE-Operon gebundene induzierbare Promotor aus der Gruppe,
bestehend aus lac, trp, araB und Pzt-1 ausgewählt wird;
- (7) Eine Kotransformante, die durch Einschleusen des in einem
der vorstehenden Punkte (5) bis (6) beschriebenen Plasmids gemeinsam
mit einem Expressionsvektor für
ein fremdes Protein in E. coli erhalten werden kann;
- (8) Die vorstehend in Punkt (7) beschriebene Kotransformante,
wobei E. coli eine Proteasemutante ist;
- (9) Die vorstehend in Punkt (8) beschriebene Kotransformante,
wobei die Proteasemutante eine lon-clpPX-Doppelmutante oder eine
lon-clpPX-hslV/U-Dreifachmutante ist;
- (10) Die vorstehend in Punkt (7) beschriebene Kotransformante,
wobei E. coli eine plsX-Mutante
ist;
- (11) Die vorstehend in Punkt (7) beschriebene Kotransformante,
wobei E. coli eine rpoH-Mutante ist;
- (12) Die vorstehend in Punkt (11) beschriebene Kotransformante,
wobei die rpoH-Mutante
eine rpoH-Deletionsmutante ist;
- (13) Ein Verfahren zur Herstellung eines fremden Proteins, das
die Verwendung der in einem der vorstehenden Punkte (7) bis (12)
oder in Punkt (17) beschriebenen Kotransformante umfaßt;
- (14) Ein Verfahren zur Herstellung eines fremden Proteins, umfassend:
- (a) das Züchten
der in einem der vorstehenden Punkte (7) bis (12) oder in Punkt
(17) beschriebenen Kotransformante unter Bedingungen, die die Expression
der Chaperone und des fremden Proteins bewirken; und
- (b) das Gewinnen des Proteins aus der Kultur.
- (15) Das vorstehend in Punkt (13) oder (14) beschriebene Verfahren,
wobei die Kotransformante unter den Bedingungen zur Induktion von
Chaperonen gezüchtet
wird, so dass die Expressionsspiegel von Dank, DnaJ und GrpE und
die Expressionsspiegel von GroEL und GroES auf einem Niveau liegen,
das für
die Stabilisierung und/oder Solubilisierung des fremden Proteins geeignet
ist;
- (16) Ein Kit, der das in einem der vorstehenden Punkte (5) bis
(6) beschriebene Plasmid und/oder die in einem der vorstehenden
Punkte (7) bis (12) oder in Punkt (17) beschriebene Kotransformante umfaßt; und
- (17) Die in einem der vorstehenden Punkte (7) bis (12) beschriebene
Kotransformante oder das in einem der vorstehenden Punkte (13) bis
(15) beschriebene Verfahren, wobei das fremde Protein ausgewählt ist
aus der Gruppe, bestehend aus Interferonen, Interleukinen, Interleukinrezeptoren, Interleukinrezeptor-Antagonisten,
Granulocytenkolonie stimulierenden Faktoren, Granulocyten-Makrophagenkolonie
stimulierenden Faktoren, Makrophagenkolonie stimulierenden Faktoren,
Erythropoietin, Thrombopoietin, Leukämieinhibitoren, Stammzellwachstumsfaktoren,
Tumor-Nekrosefaktoren, Wachstumshormonen, Proinsulin, insulinähnlichen
Wachtsumsfaktoren, Fibroblasten-Wachstumsfaktoren, Thrombocyten-Wachstumsfaktoren,
transformierenden Wachstumsfaktoren, Hepatocyten-Wachstumsfaktoren,
knochenmorphogenetischen Faktoren, Nervenwachstumsfaktoren, ciliaren
neurotrophen Faktoren, hirnabstammenden neurotrophen Faktoren, von
Gliazellinien abstammenden neurotrophen Faktoren, Neurotrophinen,
Prourokinase, gewebeplasminogenen Aktivatoren, Blutgerinnungsfaktoren,
Protein C, Glucocerebrosidase, Superoxiddismutase, Renin, Lysozym,
P450, Prochymosin, Trypsininhibitoren, Elastaseinhibitoren, Lipocortin,
Reptin, Immunglobulinen, einzelkettigen Antikörpern, komplementären Komponenten, Serumalbumin,
Zederblütenstaub-Allergenen, hypoxieinduzierten
Stressproteinen, Proteinkinasen, Produkten der Proto-Oncogene, Transkriptionsfaktoren
und proteinhaltigen Virusbestandteilen.
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Die
Figuren zeigen:
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1 ist
eine schematische Ansicht des Plasmids pG-KJE6;
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2 zeigt
die Resultate der Elektrophorese von NK284 und NK287, wobei die
linke Tafel die Ergebnisse der SDS-PAGE einer Induktion der Expression
eines Chaperons durch 1 mg/ml L-Arabinose zeigt; und die rechte
Tafel zeigt die Ergebnisse eines Western-Blot-Tests, der die Löslichkeit von Prourokinase
(proUK) belegt, wobei S eine lösliche
Fraktion und I eine unlösliche
Fraktion bezeichnet;
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3 zeigt
die Ergebnisse der SDS-PAGE, die eine Induktion der Expression eines
Chaperons von pG-KJE6 in JM109 belegt, wobei die Zahlen über jeder
Bahn die Konzentration von L-Arabinose (Ara) und Tetracyclin (Tc)
angeben;
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4 zeigt
die Ergebnisse der Elektrophorese von NK241, wobei die linke Tafel
die Induktion der Expression eines Chaperons durch verschiedene Konzentrationen
von Ara und Tc zeigt, und die rechte Tafel die Expression von CryjII
zeigt;
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5 zeigt
Ergebnisse der Elektrophorese, die eine Eigenschaft (die Löslichkeit)
von CryjII in einer Fraktion zeigen, die durch Fraktionierung der gleichen
Proben wie in den Bahnen von 4 zu einer
löslichen
und zu einer unlöslichen
Fraktion hergestellt wurde; hierbei bezeichnet S eine lösliche Fraktion
und I eine unlösliche
Fraktion.
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6 ist
ein Graph der Stabilität
von CryjII, das mit verschiedenen Chaperonen koexprimiert wird;
dabei wird der Spiegel des CryjII bei 0 Minuten als 1 definiert,
und die Halbwertszeit des CryjII-Spiegels wird als jene Zeitspanne
definiert, nach deren Ablauf der verbleibende CryjII-Spiegel 0,5
des Anfangsspiegels beträgt;
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7 zeigt
die Ergebnisse einer Elektrophorese, die die Expression von CryjII
in verschiedenen Chaperonmutanten belegt, hierbei bezeichnet MC
einen Elternstamm MC4100, K– bezeichnet C4100 ΔdnaK52, J– bezeichnet
MC4100 ΔdnaJ259,
E– bezeichnet
MC4100 grpE280, L– bezeichnet MC4100 groEL44,
und S– bezeichnet
MC4100 groES72, wobei S eine lösliche
Fraktion und I eine unlösliche Fraktion
bezeichnet.
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8 zeigt
die Ergebnisse einer Elektrophorese, wobei die obere Tafel die Induktion
der Expression eines Chaperons und die untere Tafel die Expression
von CryjII zeigt, wie sie bei verschiedenen Ara- und Tc-Konzentrationen
in einer rpoH-Deletionsmutante gemessen werden;
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9 zeigt
die Ergebnisse einer Elektrophorese, die die Löslichkeit von CryjII durch
Fraktionieren der gleichen Proben wie in den Bahnen von 8 in
eine lösliche
und in eine unlösliche
Fraktion zeigt; hierbei bezeichnet S eine lösliche Fraktion und I eine
unlösliche
Fraktion; und
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10 zeigt
die Ergebnisse einer Elektrophorese, wobei die obere Tafel eine
Induktion der Expression eines Chaperons und die untere Tafel die Expression
von ORP150 zeigt, wie sie bei verschiedenen Ara- und Tc-Konzentrationen
in einer rpoH-Deletionsmutante gemessen werden, wobei an beiden
Endbahnen in jeder Tafel Molekulargewichtsmarker angegeben sind
und in der rechten Tafel S eine lösliche und I eine unlösliche Fraktion
bezeichnet.
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In
der vorliegenden Erfindung kann das Chaperon jedes beliebige Protein
sein, solange es an der Proteinfaltung beteiligt ist. Inder vorliegenden
Erfindung werden aus E. coli abgeleitete Chaperone bevorzugt. Zu
den Beispielen für
solche Chaperone zählen
DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL, GroES, HscA/Hsc66, CbpA, HtpG und ähnliche.
DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL und GroES sind unter dem Gesichtspunkt der
Expression fremder Proteine in einer stabilisierten und solubilisierten
Form in E. coli stärker
vorzuziehen. Vom Gesichtspunkt des Zusammenwirkens solcher Chaperone
her ist die Verwendung in Verbindung mit den Chaperonsystemen Dna/DnaJ/GrpE
und GroEL/GroES besonders vorzuziehen.
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Die
vorliegende Beschreibung beschreibt ein Operon, das das Chaperon
codiert. Der Begriff „Operon", wie er in der vorliegenden
Erfindung verwendet wird und wie er in den Ansprüchen im Anhang spezifiziert
wird, ist als Gruppe von Genen definiert, von denen jedes das vorstehend
beschriebene Chaperon codiert und die eine Transkriptionseinheit
unter der Kontrolle eines einzigen Promotors bilden, was ein natürliches
oder künstliches
Operon beinhaltet. In der vorliegenden Beschreibung wird die Verwendung eines
künstlichen,
aus E. coli abgeleiteten Operons beschrieben, das Polynucleotide
enthält,
die DnaK, DnaJ und GrpE codieren, und das als dnaK/dnaJ/grpE-Operon
bezeichnet wird. Die vorliegende Erfindung betrifft das dnaK/dnaJ/grpE-Operon in
Verbindung mit einem Operon, das Polynucleotide umfaßt, die
GroEL und GroES codieren, und das als groE-Operon bezeichnet wird,
wobei GroEL und GroES für
das Wachstum von E. coli erforderlich sind.
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Das
dnaK/dnaJ/grpE-Operon, wie in den Ansprüchen im Anhang spezifiziert,
ist in der Lage, die Funktion von exprimierten Chaperonen wirksamer auszuüben als
bekannte dnaK/dnaJ-Operons. Konkrete Beispiele zur Verwendung von
Prourokinase als fremdes Protein werden nachstehend gebracht.
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Vom
Gesichtspunkt der Regulation des Expressionsspiegels des Chaperons
der vorliegenden Erfindung her ist es vorzuziehen, dass der Promotor, der
die Transkription des vorstehend beschriebenen Operons steuert,
ein induzierbarer Promotor ist. Beispiele für einen induzierba ren Promotor
sind unter anderen lac, tac, trc, trp, araB, Pzt-1, λPL und dergleichen. Die lac-, tac- und trc-Promotoren
können
durch die Verwendung von Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosid (IPTG) induziert werden;
die trp-, araB- und Pzt-1-Promotoren können durch die Verwendung von 3-Indolacrylsäure (IAA),
L-Arabinose bzw. Tetracyclin induziert werden; und der λPL-Promotor kann bei hoher Temperatur (42°C) induziert
werden. Ebenfalls verwendbar ist ein T7-Promotor, der spezifisch
und stark von einer T7-RNA-Polymere transkribiert wird. In der Transkription
durch T7-RNA-Polymerase wird die Induktion dieser T7-RNA-Polymerase
durch Verwendung von IPTG ermöglicht,
indem ein E. coli-Stamm verwendet wird, der einen lysogenisierten λ-Phagen enthält, der
das T7-RNA-Polymerasegen in Stromabwärtsrichtung des lac-Promotors
enthält.
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Die
vorstehend beschriebenen Promotoren sind in bekannten Vektoren enthalten
und können verwendet
werden, nachdem sie in angemessener Weise mit Restriktionsendonucleasen
oder dergleichen aus den betreffenden Vektoren herausgeschnitten
wurden.
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Das
Plasmid, wie in der Beschreibung beschrieben, hat eines der vorstehend
beschriebenen Operons und exprimiert nach seiner Einschleusung in
E. coli eines der vorstehend beschriebenen Chaperone. Dementsprechend
werden Plasmide beschrieben, die ein dnaK/dnaJ/grpE-Operon enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft Plasmide, die sowohl das dnaK/dnaJ/grpE-Operon
als auch das groE-Operon enthalten.
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Wie
vorstehend beschrieben, exprimieren diese Plasmide vorzugsweise
Chaperone, d. h. DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL und GroES unter der Steuerung
eines induzierbaren Promotors.
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Um
den Spiegel und die zeitliche Steuerung der Expression der vorstehend
beschriebenen Chaperone ohne Verringerung des Expressionsspiegels des
gewünschten
Proteins zu optimieren, ist es vorteilhaft, die Expression der Chaperone
und des gewünschten
Proteins unabhängig
voneinander zu steuern. Es ist vorzuziehen, dass der für die Chaperonexpression
verwendete induzierbare Promotor von dem für die Expression des gewünschten
Proteins verwendeten Promotors verschieden ist. Obwohl der für die Expression
des dnaK/dnaJ/grpE-Operons und
der für
die Expression des groE-Operons verwendete Promotor die gleichen
sein können,
können die
Spiegel und die zeitliche Steuerung von DnaK, DnaJ und GrpE und
jene der Expression von GroEL und GroES durch Verwendung verschiedener
Promotoren separat gesteuert werden. Beispielsweise ist es wünschenswert,
ein pG-KJE6-Plasmid (1) zu verwenden, wobei das Plasmid
ein araB-Promotor-dnaK/dnaJ/grpE-Operon und ein Pzt1-Promotor-groE-Operon
umfaßt.
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Das
Plasmid pG-KJE6 ist ein Plasmid, das auf der Grundlage eines pACYC-Vektors
konstruiert wurde [Chang, A. C. Y. und Cohen, S. N., J. Bacteriol. 134,
1141–1156
(1978)]. Wie in 1 gezeigt, hat pG-KJE6 eine
Struktur, die einen pACYC-Vektor abgeleiteten ori, ein Cm-Resistenzgen, das araB-Promotor-dnaK/dnaJ/grpE-Operon
und das Pzt-1-Promotor-groE-Operon
umfaßt.
Die Expression von DnaK, DnaJ und GrpE wird durch L-Arabinose und jene
von GroEL und GroES durch Tetracyclin induziert. Indem L-Arabinose
und Tetracyclin gleichzeitig, separat und zeitversetzt oder in verschiedenen
Konzentrationen hinzugefügt
werden, können
diese zwei Gruppen von Chaperonen gleichzeitig, separat und zeitversetzt
oder mit unterschiedlichen Spiegeln exprimiert werden, je nach dem,
wie es der Einzelfall gerade erfordert.
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Zwei
nahe miteinander verwandte Plasmide können im gleichen Wirt gewöhnlich nicht
stabil nebeneinander koexistieren. Dieses Phänomen ist unter der Bezeichnung
Inkompatibilität
bekannt. Jedes Plasmid kann als Plasmid der vorliegenden Erfindung
dienen, solange es ein Replikon hat, das in E. coli keine Inkompatibilität mit dem
Expressionsvektor für
das gewünschte
Protein hat. Werden zum Beispiel pBR322 oder ein anderer Expressionsvektor
mit dem Col E1-Replikon als Expressionsvektor für das gewünschte Protein verwendet, so
kann das in einem pACYC-Vektor vorkommende p15A-Replikon für das Plasmid
der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
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Das
Plasmid der vorliegenden Erfindung kann ferner, wenn im Einzelfall
erforderlich, ein Selektionsmarkergen enthalten, um die Selektion
nach der Transformation zu erleichtern. Beispiele für solche
Selektionsmarkergene sind Ampicillinresistenzgene (Ampr),
Kanamycinresistenzgene (Kmr) und Chloramphenicolresistenzgene
(Cmr). Es ist wünschenswert, dass das verwendete
Selektionsmarkergen von dem im Expressionsvektor des fremden Proteins
enthaltene Selektionsmarkergen verschieden ist.
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Die
vorstehend beschriebenen Plasmide können durch ein Verfahren konstruiert
werden, das beispielsweise in Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
2. Auflage, Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York, 1989 beschrieben ist. Die Konstruktion des vorstehend
beschriebenen Plasmids pG-KJE6 ist konkret in den nachstehend gegebenen
Beispielen beschrieben.
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Verfahren
zur Expression der Chaperone der vorliegenden Erfindung unter Verwendung
eines induzierbaren Promotors und Verfahren zur Steuerung der Expressionsspiegel
der Cha perone der vorliegenden Erfindung unter Verwendung der vorstehend beschriebenen
Plasmide werden nachstehend beschrieben.
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In
der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „eine Kotransformante" darauf, dass diese durch
Einschleusen eines der vorstehend beschriebenen Plasmide gemeinsam
mit einem Expressionsvektor für
ein fremdes Protein in E. coli erhalten werden kann.
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In
der vorliegenden Erfindung ist jeder beliebige Expressionsvektor
für ein
fremdes Protein brauchbar, solange er bewirkt, dass das gewünschte fremde
Protein in E. coli exprimiert wird, und solange er keine Inkompatibilitäten zu den
vorstehend beschriebenen Plasmiden aufweist. Es wird ein Vektor bevorzugt,
bei dem die Expression des gewünschten fremden
Proteins durch einen induzierbaren Promotor induziert wird.
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Zu
den induzierbaren Promotoren für
die Expression eines fremden Proteins zählen die gleichen Promotoren
wie die vorstehend für
die Expression des Chaperons beschriebenen. Die Expression eines Chaperons
der vorliegenden Erfindung und die des gewünschten fremden Proteins können durch
Verwendung eines geeigneten Promotors, der von dem zur Induktion
der Expression des Chaperons der vorliegenden Erfindung verwendeten
Promotor verschieden ist, separat induziert werden.
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Auch
kann der Expressionsvektor für
die Expression eines fremden Proteins ein Selektionsmarkergen enthalten,
wenn dies im Einzelfall erforderlich ist. Zu diesen Selektionsmarkergenen
zählen
die gleichen wie die vorstehend für die Expression des Chaperons
beschriebenen. Eine doppelte Selektion von Kotransformanten wird
durch Verwendung eines Selektionsmarkergens ermöglicht, das von dem auf dem
Plasmid der vorliegenden Erfindung enthaltenen Selektionsmarkergen
verschieden ist.
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Zu
den E. coli-Stämmen,
die in der vorliegenden Erfindung nutzbar sind, zählen Wildstämme wie HB101,
JM109, MC4100, MG1655 und W3110 sowie verschiedene Mutanten, darunter
Proteasemutanten wie lon-Mutanten, clpPX-Mutanten, hslV/U-Mutanten,
lon-clpPX-Doppelmutanten
und lon-clpPX-hslV/U-Dreifachmutanten; plsX-Mutanten; rpoH-Deletionsmutanten
und rpoH-Missensemutanten.
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In
der vorliegenden Erfindung können
mit vorteilhaften Ergebnissen Proteasemutanten, wie lon-Mutanten,
clpPX-Mutanten, hslV/U-Mutanten, lon-clpPx-Doppelmutanten und lon-clpPx-hslV/U-Dreifachmutanten,
plsX-Mutanten und rpoH-Mutanten, wie rpoH-Deletionsmutanten verwendet
werden, um fremde Proteine stabiler zu exprimieren.
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Eine
vorzuziehende lon-clpPX-Doppelmutante ist der E. coli-Stamm KY2263
(FERM BP-6238), der aus dem E. coli-Stamm MC4100 abgeleitet ist
und hergestellt wird, indem in den lon- und clpPX-Genen doppelte
Deletionsmutationen erzeugt werden. E. coli KY2263 wurde unter der
Zugangsnummer FERM BP-6238 beim National Institute of Bioscience
and Human-Technology, Agency of Industrial Sciennce and Technology,
Ministry of International Trade and Industry hinterlegt; dessen
Adresse lautet: 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-0046,
Japan; Datum der ursprünglichen
Hinterlegung: 18. Februar 1997; Datum des Antrags auf Überführung aus
der ursprünglichen
Hinterlegung in eine internationale Hinterlegung nach dem Budapester
Vertrag: 26. Januar 1998.
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Der
Begriff „lon-clpPX-hslV/U-Dreifachmutante" bezieht sich auf
eine Mutante, die durch Einführen
einer Mutation in die vorstehend beschriebene lon-clpPX-Doppelmutante
und weiter in das hslV/U-Gen, das HslV/U-Protease codiert, hergestellt wird.
Bevorzugt wird der aus dem E. coli-Stamm MC4100 abgeleitete E. coli-Stamm
KY2266 (FERM BP-6239), der durch Einbau von Dreifachdeletionsmutationen
in die lon-, clpPX- und hslV/U-Gene hergestellt wird. E. coli KY2266
wurde unter der Zugangsnummer FERM BP-6239 beim National Institute
of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science
and Technology, Ministry of International Trade and Industry hinterlegt,
dessen Adresse lautet: 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-0046,
Japan; Datum der ursprünglichen Hinterlegung:
18. Februar 1997; Datum des Antrags auf Überführung aus der ursprünglichen
Hinterlegung in eine internationale Hinterlegung nach dem Budapester
Vertrag: 26. Januar 1998.
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Zu
den Beispielen für
plsX-Mutanten zählen plsX-Mutanten
mit einer Insertionsmutantion des Tetracyclin-Resistenzgens in eine
Position, die der N-terminalen Region eines von plsX codierten Polypeptids
entspricht (japanisches offengelegtes Patent Nr. Hei 8-140671).
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Zu
den Beispielen für
rpoH-Deletionsmutanten zählen
E. coli MC4100 ΔrpoH
[Zhou, Y. N. et al., J. Bacteriol. 170, 3640–3649 (1988)], E. coli MG1655 ΔrpoH und
dergleichen. In den rpoH-Deletionsmutanten werden die Expressionsspiegel
aller durch σ32 gesteuerten Hitzeschockproteine einschließlich Chaperone
und Proteasen abgesenkt. Durch ausreichendes Zusetzen solcher Chaperone,
deren Expression durch die Transformation der rpoH-Deletionsmutanten
beispielsweise mit pG-KJE6 unterdrückt wird, steht zu erwarten,
dass ein System von niedrigem Protease- und hohem Chaperongehalt
mit vorteilhaften Auswirkungen auf die stabile Expression instabiler
fremder Proteine geschaffen werden kann. Auch sind die rpoH-Deletionsmutanten
temperatursensitiv, und sie können
für gewöhnlich nicht
bei Temperaturen wachsen, die über
20°C hinausgehen.
Durch Zusetzen von GroEL und GroES, wie vorstehend beschrieben,
können
die rpoH-Deletionsmutanten bei Temperaturen über 20°C wachsen, was ihre Handhabung
vereinfacht. Es ist daher besonders vorzuziehen, die rpoH-Deletionsmutante
zu verwenden.
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In
der vorliegenden Erfindung kann das zu exprimierende fremde Protein
jedes beliebige Protein sein, solange es ein fremdes Protein ist,
dass in nicht stabilisierter Form und/oder unlöslicher Form in E. coli exprimiert
wird. Zu solchen fremden Proteinen zählen Interferone, Interleukine,
Interleukinrezeptoren, Interleukinrezeptor-Antagonisten, Granulocytenkoloniestimulierende
Faktoren, Granulocyten-Makrophagenkoloniestimulierende Faktoren,
Makrophagenkoloniestimulierende Faktoren, Erythropoietin, Thrombopoietin,
Leukämieinhibitoren,
Stammzellwachstumsfaktoren, Tumor-Nekrosefaktoren, Wachstumshormone,
Proinsulin, insulinähnliche Wachtsumsfaktoren,
Fibroblasten-Wachstumsfaktoren, Thrombocyten-Wachstumsfaktoren, transformierende
Wachstumsfaktoren, Hepatocyten-Wachstumsfaktoren, knochenmorphogenetische
Faktoren, Nervenwachstumsfaktoren, ciliäre neurotrophe Faktoren, hirnabstammende
neurotrophe Faktoren, von Gliazellinien abstammende neurotrophe
Faktoren, Neurotrophine, Prourokinase, Gewebeplasminogen-Aktivatoren,
Blutgerinnungsfaktoren, Protein C, Glucocerebrosidase, Superoxiddismutase,
Renin, Lysozym, P450, Prochymosin, Trypsininhibitoren, Elastaseinhibitoren,
Lipocortin, Reptin, Immunglobuline, einzelkettige Antikörper, Komplementkomponenten,
Serumalbumin, Zederblütenstaub-Allergene, hypoxieinduzierte
Stressproteine, Proteinkinasen, Produkte der Proto-Oncogene, Transkriptionsfaktoren
und proteinhaltige Virusbestandteile.
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Zum
Einschleusen des Plasmids der vorliegenden Erfindung gemeinsam mit
einem Expressionsvektor für
ein fremdes Protein in E. coli kann ein Calciumchloridverfahren,
ein Rubidiumchloridverfahren ein Elektroporationsverfahren oder
andere herkömmliche
Verfahren angewandt werden. Das Absuchen nach Kotransformanten kann
durch Verwendung von Chemikalien ausgeführt werden, die für Selektionsmarkergene
geeignet sind. Die Expression des fremden Proteins kann beispielsweise
mit solchen Mitteln wie dem Western-Blot-Test bestätigt werden.
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Die
vorliegende Erfindung liefert weiter ein Verfahren zur Herstellung
eines fremden Proteins, das die vorstehend beschriebene Kotransformante verwendet.
Das Verfahren umfaßt
folgende Schritte:
- (1) Feststellen der Bedingungen
für die
Induktion von Chaperonen und/oder Solubilisierung eines in Expression
befindlichen fremden Proteins;
- (2) Züchtung
einer Kotransformante, um die Expression von Chaperonen und des
fremden Proteins unter den in Punkt (1) festgestellten Induktionsbedingungen
zu induzieren und Gewinnung der Zellen; und
- (3) Aufbrechen der gewonnenen Zellen und Isolieren und Reinigen
des fremden Proteins mittels eines Reinigungsverfahrens, das von
dem fremden Protein abhängt.
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Zuerst
kann durch beispielhafte Verwendung der Expression von Prourokinase
als fremdes Protein spezifisch überprüft werden,
ob die Chaperonfunktion durch Koexpression von zusammenwirkenden DnaK,
DnaJ und GrpE unter Verwendung des dnaK/dnaJ/grpE-Operons der vorliegenden
Erfindung wirksamer ausgeübt
werden kann, als dies der Fall ist, wenn nur DnaK und DnaJ mittels
eines bekannten dnaK/dnaJ-Operons exprimiert werden.
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Ein
aus dem Vektor pACYC abgeleitetes Plasmid pAR3 (ATCC87026), das
ein Cm-Resistenzgen
und araC- und araB-Promotor/Operatorgene trägt, wird mit einer Pst I-Restriktionsendonuclease an
einer Stelle stromabwärts
des araB-Promotors gespaltet, und die Enden des so erhaltenen Plasmids werden
in glatte Enden überführt. Danach
werden etwa 3 kb durch PCR hergestellte codierende Region des E.
coli-dnaK/dnaJ-Operons und etwa 0,6 kb codierende Region des grpE-Gens
in geeignete Stellen inseriert und so ein Plasmid pKJE7 zur Expression von
DnaK, DnaJ und GrpE aus einem einzelnen Operon unter der Kontrolle
des araB-Promotors hergestellt.
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Als
nächstes
wird das Plasmid pKJE7 mit den Restriktionsendonucleasen BspHI und
KpnI gespaltet und so fast die ganze codierende Region des grpE-Gens
entfernt, und die Enden des so erhaltenen Plasmids werden in glatte
Enden überführt. Danach wird
das so erhaltene Plasmid selbstligiert. Ein Plasmid zur Expression
von DnaK und DnaJ unter der Kontrolle des araB-Promotors wird isoliert
und pKJ1 benannt.
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Als
nächstes
wird E. coli MG1655 (CGSC 6300; E. coli Genetic Stock Center, Yale
University) mit dem Rubidiumchloridverfahren mit einem IPTG induzierbaren
Plasmid pUK-02pm0
[Kanemori, M. et al., J. Bacteriol. 176, 5648–5653 (1994)] und einem der
vorstehend hergestellten Plasmide pKJE7 und pKJ1 transformiert.
Die so erhaltene Kotransformante mit pUK-02pm0 und pKJE7 und die
so erhaltene Kotransformante mit pUK-02pm0 und pKJ1 werden isoliert
und als Kotransformanten NK284 bzw. NK287 bezeichnet.
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Beide
vorstehend hergestellten Kotransformanten NK284 und NK287 werden
jeweils bei 37°C in
L-Medium angereichert mit 1 mg/ml L-Arabinose gezüchtet. Wenn
die Klett-Einheit etwa 40 erreicht, wird 1 mM IPTG zur Kultur hinzugefügt. Nach
einstündiger
Aufzucht wird ein Teil der Kultur entnommen, und es wird Trichloressigsäure bis
zu einer Endkonzentration von 5% hinzugefügt, um die Zellen zu fällen. Alle
Präzipitate
werden durch Zentrifugierung gewonnen und mit Aceton gewaschen.
Danach werden die gewaschenen Zellen ein einem Probenpuffer fix
SDS-PAGE gelöst,
und die Proteine werden durch SDS-PAGE getrennt und anschließend die
induzierten Chaperone durch CBB-Färbung nachgewiesen (2,
linke Tafel).
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Die
durch Zentrifugierung des erwähnten, verbliebenen
Teils der Kultur gewonnenen Zellen sowohl von NK284 als auch von
NK287 werden durch Ultraschall zertrümmert. Anschließend werden
die zertrümmerten
Zellen durch Zentrifugierung in eine lösliche Fraktion und eine unlösliche Fraktion
fraktioniert, und die Prourokinase wird in jeder Fraktion durch
Western-Blot-Test mit einem Antikörper gegen Urokinase nachgewiesen
(2, rechte Tafel).
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Aus 2 geht
hervor, dass, wenn DnaK, DnaJ und GrpE koexprimiert werden, fast
die gesamte Prourokinase in löslicher
Form exprimiert wird, wenn hingegen nur DnaK und DnaJ koexprimiert werden,
die exprimierte Prourokinase nur teilweise solubilisierbar ist,
der Rest aber in einer unlöslichen Form
exprimiert wird.
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Das
Verfahren zur Herstellung eines fremden Proteins durch Verwendung
einer NK241-Kotransformante
unter Verwendung des Plasmids pG-KJE6 und eines Expressionsvektors
für ein
Zederblütenstaub-Allergen
wie das Blütenstaub-Allergen
CryjII von Cryptomeria japonica wird im folgenden konkret erläutert. Wenn
es in E. coli exprimiert wird, ist das CryjII ein instabiles Protein;
seine Halbwertszeit beträgt
ungefähr
10 min, wie mit Western-Blot-Test der verbleibenden Menge von CryjII
in Zellen festgestellt wurde, in denen die Proteinsynthese durch
die Hinzufügung
von Spectinomycin blockiert wurde.
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(1) Untersuchungen zu
den Bedingungen für
die Chaperoninduktion, die zur Stabilisierung und/oder Solubilisierung
von CryjII geeignet sind
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Zuerst
wird E. coli JM109 nur mit pG-KJE6 transformiert und eine Transformante
mittels Chloramphenicolselektion gewonnen. Die so erhaltene Transformante
wird bei 30°C
in mit 0 bis 3 mg/ml L-Arabinose und 0 bis 150 ng/ml Tetracyclin
angereichertem L-Medium gezüchtet.
Wenn die Klett-Einheit etwa 40 erreicht, wird der Kultur Trichloressigsäure bis
zu einer Endkonzentration von 5% hinzugefügt, um die Zellen zu fällen. Anschließend werden
die Proteine durch SDS-PAGE getrennt und die induzierten Chaperone
durch Coomassie-Brilliantblau(CBB)-Färbung nachgewiesen
(3). Wie in 3 gezeigt,
werden beide Chaperone in Abhängigkeit
von der Konzentration der verwendeten Chemikalien induziert.
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Als
nächstes
werden NK241, eine Kotransformante von MG1655 mit pG-KJE6 und einem
IPTG induzierbaren Expressionsvektor für CryjII, in der gleichen Art
und Weise, wie vorstehend beschrieben, gezüchtet, außer dass 0 bis 8 mg/ml L-Arabinose
und 0 bis 10 ng/ml Tetracyclin hinzugefügt werden. Wenn die Klett-Einheit
ungefähr
40 erreicht, wird 1 mM IPTG zur Kultur hinzugefügt. Nach zweistündiger Aufzucht
wird ein Teil der Kultur entnommen, und es wird Trichloressigsäure bis
zu einer Endkonzentration von 5% hinzugefügt, um die Zellen zu fällen. Anschließend werden
die Proteine durch SDS-PAGE getrennt und die induzierten Chaperone
durch CBB-Färbung
oder Nachweis von CryjII durch Western Blot-Test nachgewiesen (4).
Wie in 4 gezeigt, wird CryjII auf hohem Niveau exprimiert, wenn
DnaK, DnaJ und GrpE koexprimiert werden oder wenn GroEL und GroES
koexprimiert werden oder wenn alle fünf Proteine koexprimiert werden.
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Auch
die durch Zentrifugieren gewonnene Kotransformante des verbliebenen
Kulturanteils wird durch Ultraschall zertrümmert. Anschließend werden die
zertrümmerten
Zellen durch Zentrifugierung in eine lösliche und eine unlösliche Fraktion
fraktioniert, und die Löslichkeit
von CryjII in jeder Fraktion durch Western-Blot-Test festgestellt
(5). Wie in 5 gezeigt,
wird CryjII in einer unlösliche
Form exprimiert, wenn nur DnaK, DnaJ und GrpE koexprimiert werden
(Bahnen 2 bis 5), während
es in einer löslichen
Form stabilisiert wird, wenn gleichzeitig die Expression von GroEL
und GroES in der Gegenwart von relativ niedrigen Mengen von exprimiertem DnaK,
DnaJ und GrpE induziert wird (Bahnen 6 bis 9). Wenn jedoch DnaK,
DnaJ und GrpE in großem Überschuß exprimiert
werden, wird CryjII n einer unlöslichen
Form exprimiert, selbst wenn die Expression von GroEL und GroES
gleichzeitig induziert wird (Bahn 10). Man sieht also, dass die
Insolubilisierung von CryjII aufgrund der Überexpression von DnaK, DnaJ
und GrpE bis zu einem gewissen Grad unterdrückt wird, wenn gleichzeitig
die Expression von GroEL und GroES induziert wird.
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Die
Stabilisierung von CryjII kann als Halbwertszeit dargestellt werden,
indem durch Western-Blot-Test die Menge des CryjII quantifiziert
wird, die in den Zellen verbleibt, in denen die Proteinsynthese
durch Hinzufügen
von Spectinomycin unterbrochen wird. Unter den vorstehend gezeigten
Bedingungen beträgt
die Halbwertszeit 40 min oder mehr (6).
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Um
die Auswirkungen der Chaperone auf die Expression von CryjII weiter
zu klären,
wird der vorstehend beschriebene CryjII-Expressionsvektor in jede
aus dem Stamm MC1400 abgeleitete DnaK-, DnaJ-, GrpE-, GroEL und
GroES-Mutante inseriert, und die Expression und Löslichkeit
von CryjII werden in gleicher Weise, wie vorstehend beschrieben,
geprüft
(7). Wie in 7 gezeigt,
wird CryjII in der DnaK- und in der DnaJ-Mutante in einer unlöslichen Form
exprimiert, wogegen es in der GrpE-Mutante kaum beeinflußt wird.
Daraus kann gefolgert werden, dass CryjII bei niedrigeren Expressionsspiegeln
in der GroEL- und GroES-Mutante
löslich,
aber instabiler ist.
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In
Anbetracht dieser Ergebnisse wird vorgeschlagen, dass DnaK, DnaJ
und GrpE bedeutende Auswirkungen auf die Faltung von CryjII haben,
da CryjII in einer unlöslichen
Form exprimiert wird, wenn DnaK, DnaJ und GrpE im Überschuß oder in
Knappheit eprimiert werden.
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Als
nächstes
werden die an der Faltung von CryjII beteiligten Chaperone in der
gleichen Art und Weise, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung
einer rpoH-Deletionsmutanten-Kotransformante,
NK196, detaillierter untersucht (8 und 9). Wie
in den 8 und 9 gezeigt, ist das in der rpoH-Mutante
exprimierte CryjII sehr stabil, wird aber wegen der verringerten
Mengen eines Satzes von Chaperonen und Proteasen in einer ziemlich
unlöslichen
Form exprimiert (8 und 9, Bahn „a"). Auch wird, was
die CryjII-Solubilisierung betrifft, CryjII nicht solubilisiert,
wenn nur die drei Proteine DnaK, DnaJ und GrpE oder nur die zwei
Proteine GroEL und GroES koexprimiert werden (9,
Bahnen „b" und „c"). CryjII wird erstmals
solubilisiert, wenn alle fünf
Proteine DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL und GroES koexprimiert werden (9,
Bahn „d"). Darüberhinaus
findet, wenn die Expressionsspiegel von DnaK, DnaJ und GrpE unter
den Bedingungen für
die Koexpression der vorstehend genannten fünf Proteine weiter gesteigert
werden, eine Resolubilisierung von CryjII statt (9,
Bahn „e"), was Versuchsergebnisse
erbringt, die mit jenen übereinstimmen, die
mit NK241 erhalten wurden.
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Wenn
miteinander kombiniert, führen
die vorstehend beschriebenen Ergebnisse zur folgenden Hypothese:
GroEL und GroES binden an CryjII und inhibieren so die vorstehende
CryjII-Degradation durch Proteasen, ohne dass sie an der Faltung
von CryjII besonders beteiligt sind. Andererseits sind DnaK, DnaJ
und GrpE mit der Faltung von CryjII eng verbunden, wobei wahrscheinlich
DnaJ eine besonders wichtige Rolle spielt. Jedoch würde eine
Expression von DnaK, DnaJ und GrpE im Überschuß CryjII in einer unlöslichen
Form erscheinen lassen. Somit ist es, um die Faltung von CryjII
wirkungsvoll ablaufen zu lassen, wünschenswert, dass zwei Chaperongruppen,
d. h. die Gruppe DnaK, DnaJ und GrpE und die Gruppe GroEL und GroES
in angemessenen Mengen vorhanden sind. Diese Hypothese stimmt auch
gut mit der existierenden Hypothese eines gegenseitigen Zusammenwirkens
der Chaperone überein.
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Die
Untersuchung der Wirkungen der fünf Chaperone
DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL und GroES auf die Expression eines fremden
Proteins, indem sie gleichzeitig oder in Gruppen koexprimiert werden, und
die Untersuchung ihrer wirksamen Expression sind ein neuer Ansatz.
Die Untersuchung von Proteinen wie CryjII, deren Verhalten sich
in Abhängigkeit von
der Art und der Menge der koexprimierten Chaperone ändert, ist
unter dem Gesichtspunkt des Verstehens der Chaperonwirkung hochinteressant.
Auch scheinen die Systeme, in denen nur Chaperone in den rpoH-Deletionsmutanten überexprimiert
werden, auch auf die wirkungsvollere Expression anderer fremder
Proteine anwendbar zu sein.
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(2) Züchtung von NK241, induktive
Expression von Chaperonen und fremden Proteinen und Gewinnung von
Zellen
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NK241
wird in der gleichen Art und Weise, wie vorstehend in (1) beschrieben,
unter für
die Chaperoninduktion geeigneten Bedingungen gezüchtet und dadurch die Expression
von CryjII in stabiler und löslicher
Form (10 ng/ml Tetracyclin und 1 mg/ml L-Arabinose) erreicht. Wenn
die Klett-Einheit etwa 40 erreicht, wird 1 mM IPTG zur Kultur hinzugefügt, und die
Zellen werden nach zweistündigem
Züchten
geerntet.
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(3) Isolierung und Reinigung
von CryjII
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Nachdem
die geernteten Zellen zertrümmert wurden,
wird der Überstand
etwa durch Zentrifugieren gewonnen. Der so erhaltene Überstand
wird konventionellen Reinigungsmethoden für Proteine unterworfen, wie
der Gelfiltration und verschiedenen Säulenchromatographien, um CryjII
zu reinigen.
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In
einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird unter Verwendung einer NK269-Kotransformante
menschliches ORP150 erzeugt, indem pORP4, ein (mit IPTG induzierter)
Expressionsvektor für
menschliches Hypoxie induziertes Streßprotein ORP150 und pG-KJE6
in E. coli JM109 eingeschleust werden. Wenn menschliches ORP150
in E. coli nur durch pORP4 exprimiert wird, ist das exprimierte
ORP150 meist unlöslich.
Da NK269 aus unbekannten Gründen
nicht wachsen kann, wenn zum Beginn der Aufzuchtphase L-Arabinose
zur Kultur hinzugefügt
wird, wird NK269 zur Induktion der Expression von menschlichem ORP150 in
der gleichen Art und Weise, wie vorstehend beschrieben, gezüchtet, außer dass
L-Arabinose und Tetracyclin hinzugefügt werden, wenn die Klett-Einheit
etwa 40 erreicht (10). Wie in 10 gezeigt, erscheint
nicht weniger als die Hälfte
des produzierten menschlichen ORP150 in der löslichen Fraktion, wenn nur
GroEL und GroES koexprimiert werden (rechte Tafel, Bahn „b"), und es ist am
besten löslich, wenn
nur drei von DnaK, DnaJ und GrpE oder alle vorstehend beschriebenen
fünf Proteine
gleichzeitig exprimiert werden (rechte Tafel, Bahnen „c", „d" und „e").
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Menschliches
ORP150 wird daher zum Beispiel folgendermaßen hergestellt: NK269 wird
in L-Medium gezüchtet.
Wenn die Klett-Einheit etwa 40 erreicht, werden 10 ng/ml Tetracyclin,
10 mg/ml L-Arabinose und 1 mM IPTG zur Kultur hinzugefügt, um die
Expression zu induzieren. Nach zweistündiger Kultur werden die Zellen
in der gleichen Art und Weise, wie vorstehend beschrieben, geerntet,
und anschließend
wird das ORP150 isoliert und gereinigt.
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Die
Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
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Wenn
nicht anders angegeben, wurden die folgenden Beispiele nach den
Verfahren ausgeführt, die
in Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, veröffentlicht
1989, und in Current Protocols in Protein Science (Hrsg. Coligan, J.
E. et al.), John Wiley and Sons, Inc., beschrieben sind.
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Beispiel 1
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Herstellung von pKJE7
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Ein
aus einem pACYC-Vektor abgeleitetes Plasmid pAR3 (ATCC87026), das
ein Cm-Resistenzgen
und araC- und ara-B-Promotor/Operatorgene enthält, wurde mit einer PstI-Restriktionsendonuclease
an einer Stelle stromabwärts
des araB-Promotors gespaltet, und die Enden des so erhaltenen gespalteten
Plasmids wurden in glatte Enden überführt. Danach
wurden ungefähr
3 kb codierende Region des dnaK/dnaJ-Operons von E. coli durch PCR
präpariert und
etwa 0,6 kb codierende Region des grpE-Gens in geeignete Stellen
inseriert und so ein Plasmid pKJE7 zur Expression von DnaK, DnaJ
und GrpE von einem einzelnen Operon unter der Kontrolle des araB-Promotors
hergestellt.
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Vergleichsbeispiel 1
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Herstellung von pKJ1
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Das
in Beispiel 1 hergestellte Plasmid pKJE7 wurde mit den Restriktionsendonucleasen
BspHI und KpnI gespaltet und so fast die ganze codierende Region
des grpE-Gens entfernt, und die Enden des so erhaltenen gespalteten
Plasmids wurden in glatte Enden überführt. Danach
wurde das erhaltene Plasmid selbstligiert. Ein Plasmid zur Expression
von nur DnaK und DnaJ unter der Kontrolle des araB-Promotors wurde
isoliert und pKJ1 benannt.
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Beispiel 2
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Herstellung der Kotransformante
NK284
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E.
coli MC1655 (CGSC6300); E. coli Genetic Stock Center, Yale University)
wurde mit dem Rubidiumchloridverfahren mit 10 ng eines Plasmids pUK-02pm0
[Kanemori, M. et al., J. Bacteriol. 176, 5648–5653 (1994)] transformiert,
und 10 ng des Plasmids pKJE7 wurden wie in Beispiel 1 präpariert,
wobei das Plasmid pUK-02pm0 dazu in der Lage ist, die Expression
menschlicher Prourokinase mit IPTG zu induzieren. Die erhaltene
Kotransformante mit pUK-02pm0
und pKJE7 wurde durch Selektion mit Chloramphenicol und Ampicillin
isoliert und als Kotransformante NK284 bezeichnet.
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Vergleichsbeispiel 2
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Herstellung der Kotransformante
NK287
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Es
wurden die gleichen Schritte wie in Beispiel 2 ausgeführt, außer dass
das in Vergleichsbeispiel 1 hergestellte Plasmid pKJ1 an Stelle
des Plasmids pKEJ7 aus Beispiel 2 verwendet wurde. Es wurde eine
Kotransformante mit pUK-02pm0 und pKJ1 isoliert und als Kotransformante
NK287 bezeichnet.
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Testbeispiel 1
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Expression von Prourokinase
mit NK284 und NK287
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Die
in Beispiel 2 hergestellte Kotransformante NK284 und die in Vergleichsbeispiel
2 hergestellte Kotransformante NK287 wurden jeweils bei 37°C in mit
1 mg/ml L-Arabinose (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries)
angereichertem L-Medium gezüchtet.
Wenn die Klett-Einheit ungefähr
40 erreichte, wurde 1 mM IPTG (hergestellt von Wako Pure Chemical
Industries) zu der Kultur hinzugefügt. Nach einstündiger Kultur
wurde ein Teil der Kultur entnommen und Trichloressigsäure bis
zu einer Endkonzentration von 5% hinzugefügt, um die Zellen zu fällen. Die
Präzipitate
wurden durch Zentrifugieren gesammelt und mit Aceton gewaschen.
Danach wurden die gewaschenen Zellen in einem Probenpuffer für SDS-PAGE
gelöst,
und die Proteine wurden durch SDS-PAGE getrennt; anschließend wurden
die induzierten Chaperone durch CBB-Färbung nachgewiesen (2,
linke Tafel).
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Die
Zellen von NK284 und NK287, die durch Zentrifugieren des verbliebenen
Teils der vorstehend erwähnten
Kultur gewonnen worden waren, wurden durch Ultraschall zertrümmert. Danach
wurden die zertrümmerten
Zellen durch Zentrifugieren in eine lösliche Fraktion und eine unlösliche Fraktion
fraktioniert, und die Prourokinase wurde in beiden Fraktionen durch
Western-Blot-Test unter Verwendung eines Antikörpers gegen Urokinase (hergestellt
von SANBIO BV) nachgewiesen (2, rechte
Tafel).
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Beispiel 3
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Herstellung von pG-KJE6
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Das
in einem Plasmid pUHE2Pzt-1 (zur Verfügung gestellt von Dr. H. Bujard
von der Universität Heidelberg,
Deutschland) stromabwärts
des Pzt-1-Promotors gelegene Luciferasegen, das Plasmid pUHE2Pzt-1
mit dem Pzt-1-Promotor wurde mit den Restriktionsendonucleasen KpnI
und XbaI herausgeschnitten und an das groE-Operon von E. coli ligiert,
dem seine eigene Promotorregion fehlte, wobei das groE-Operon von
E. coli durch Verdauen von pKV1561 [Kanemori, M. et al., J. Bacteriol.
176, 4235–4242
(1994)] mit einer XhoI-Restriktionsendonuclease
hergestellt wurde; so wurde ein Plasmid pGro8 für die Expression von GroEL
und GroES unter der Kontrolle des Pzt-1-Promotors hergestellt. Anschließend wurde
das Tetracyclin-Repressorgen (tetR) von etwa 800 bp aus einem E.
coli-Stamm mit einem Transposon Tn10 durch PCR hergestellt, und das
so erhaltene Gen wurde in die AatI-Stelle stromaufwärts des Pzt-1-Promotors von
pGro8 inseriert und ergab so pGro10R.
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Danach
wurde das so erhaltene pGro10R mit den Restriktionendonucleasen
SacI und AvrII gespaltet und so ein Fragment hergestellt, das tetR-Pzt-1-groESgroEL
enthielt. Das erhaltene Fragment wurde mit glatten Enden versehen
und in die XmnI-Stelle des in Beispiel 1 hergestellten pKJE7 inseriert
und so ein Plasmid pG-KJE6 für
die Expression von DnaK, DnaJ und GrpE unter der Kontrolle des araB-Promotors
und für
die Expression von GroEL und Gro ES unter der Kontrolle von Pzt-1
hergestellt.
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Beispiel 4
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Induktionsexpression von
Chaperon von pG-KJE6 in E. coli JM109
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E.
coli JM109 (TaKaRa Competent Cell, hergestellt von Takara Shuzo
Co., Ltd.) wurde mit dem Rubidiumchloridverfahren mit 10 ng des
in Beispiel 3 hergestellten pG-KJE6 transformiert. Die aus der Selektion
mit Chloramphenicol erhaltenen Transformanten wurden bei 30°C in mit
0 bis 3 mg/ml L-Arabinose (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries)
und 0 bis 150 ng/ml Tetracyclin (hergestellt von Nacalai Tesque)
angereichertem L-Medium gezüchtet.
Wenn die Klett-Einheit etwa 40 erreichte, wurde Trichloressigsäure bis
zu einer Endkonzentration von 5% zu der Kultur hinzugefügt, um die
Zellen zu fällen.
Die Präzipitate
wurden durch Zentrifugieren gesammelt und mit Aceton gewaschen.
Danach wurden die gewaschenen Zellen in einem Probenpuffer für SDS-PAGE
gelöst,
und die Proteine wurden durch SDS-PAGE getrennt; anschließend wurden
die induzierten Chaperone durch CBB-Färbung
nachgewiesen (3).
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Beispiel 5
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Herstellung der Kotransformante
NK241
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Eine
reifes CryjII-Protein (Arg45-Ser433) codierende Region einer CryjII-cDNA
eines Cryptomeria japonica-Blütenstauballergens
[Namba et al., FEBS Lett. 353, 124–128 (1994)] wurde in die EcoRI-PstI-Stelle
des durch IPTG induzierbaren Expressionsplasmids pKK223-3 für E. coli
(hergestellt von Pharmacia Biotech) inseriert und so pKCJ2 hergestellt. Anschließend wurde
das aus pMJR1560 (hergestellt von Amersham) hergestellte lacIg-Gen in die BamHI-Stelle von pKCJ2 inseriert
und ergab so pKCJ2I.
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E.
coli MG1655 (CGSC6300; E. coli Genetic Stock Center, Yale University)
wurde nach dem Rubidiumchloridverfahren mit 10 ng des in Beispiel
3 hergestellten pG-KJE6 und 10 ng CryjII-Expressionsvektor pKCJ2I,
vorstehend beschrieben, transformiert. Die erhaltenen Kotransformanten
wurden durch Selektion mit Chloramphenicol und Ampicillin isoliert
und als Kotransformante NK241 bezeichnet.
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Beispiel 6
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Expression von CryjII
mittels NK241
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Die
in Beispiel 5 hergestellte NK241 wurde in der gleichen Art und Weise
gezüchtet
wie in Beispiel 4, außer
dass 0 bis 8 mg/ml L-Arabinose und 0 bis 10 ng/ml Tetracyclin hinzugefügt wurden.
Wenn die Klett-Einheit ungefähr
40 erreichte, wurde 1 mM IPTG zur Kultur hin zugefügt. Nach
zweistündiger Kultur
wurde ein Teil der Kultur entnommen, und es wurde Trichloressigsäure bis
zu einer Endkonzentration von 5% hinzugefügt, um die Zellen zu fällen. Die Präzipitate
wurden durch Zentrifugieren gesammelt und mit Aceton gewaschen.
Anschließend
wurden die gewaschenen Zellen in Probenpuffer für SDS-PAGE gelöst, die
Proteine wurden durch SDS-PAGE getrennt, und es erfolgte der Nachweis
der induzierten Chaperone durch CBB-Färbung. Weiterhin wurde CryjII
durch Western-Blot-Test unter Verwendung eines gegen CryjII hervorgerufenen
monoclonalen Antikörpers
N-26 nachgewiesen [Sawatani et al., Allergy, 43, 467–473 (1984)]
(4).
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Auch
wurden die durch Zentrifugieren des verbleibenden Teils der Kultur
gewonnenen NK241-Zellen durch Ultraschall zertrümmert. Danach wurden die zertrümmerten
Zellen durch Zentrifugieren in eine lösliche Fraktion und eine unlösliche Fraktion
fraktioniert, und CryjII wurde in beiden Fraktionen durch Western-Blot-Test
in der gleichen Art und Weise, wie vorstehend beschrieben, nachgewiesen (5).
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Beispiel 7
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Stabilität von CryjII
in NK241
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Das
in Beispiel 5 hergestellte NK241 wurde in der gleichen Art und Weise
gezüchtet
wie in Beispiel 4, außer
dass 20 ng/ml Tetracyclin oder 8 mg/ml L-Arabinose oder sowohl 20
ng/ml Tetracyclin als auch 8 mg/ml L-Arabinose hinzugefügt wurden. Wenn
die Klett-Einheit
ungefähr
40 erreichte, wurde 1 mM IPTG zur Kultur hinzugefügt. Nach
zweistündiger
Kultur wurde die Expression von CryjII inuziert. Dann wurde Spectinomycin
(hergestellt von Sigma) bis zu einer Endkonzentration von 500 μg/ml hinzugefügt, um die
Proteinsynthese zu stoppen. Danach wurden in gegebenen Intervallen
Proben genommen und Zellen gesammelt. Jeweils das Gesamtprotein der
Zellen wurde durch SDS-PAGE getrennt, und es wurde ein Western-Blot-Test
unter Verwendung eines gegen CryjII hervorgerufenen monoclonalen
Antikörpers
N-26 ausgeführt.
Das so erhaltene Western-Blot-Bild wurde mit einem Scanner eingelesen und
die Intensität
der Banden wurde mit der Analysesoftware Intelligent Quantifier
(hergestellt von Nihon Bioimage) gemessen (6).
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Beispiel 8
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Expression von CryjII
in verschiedenen Chaperonmutanten
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E.
coli MC4100 ΔdnaK52
[Nagai, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10280–10284 (1994)] wurde
als DnaK-Mutante verwendet, E. coli MC4100 ΔdnaJ259 [Ishiai, M. et al., J.
Bacteriol. 174, 5597–5603
(1992)] als DnaJ-Mutante, E. coli MC4100 grpE280 [Ishiai, M. et
al., J. Bacteriol. 174, 5597–5603
(1992)] als GrpE-Mutante, E. coli MC4100 groEL44 [Tilly, K. und
Georgopoulos, C., J. Bacteriol. 149, 1082–1088 (1982)] als GroEL-Mutante
und E. coli MC4100 groES72 [Tilly, K. und Georgopoulos, C., J. Bacteriol.
149, 1082–1088
(1982)] als GroES-Mutante. Nach dem in Beispiel 5 beschriebenen
Verfahren wurden 10 ng des CryjII-Expressionsvektors in jede dieser
Mutanten eingeschleust, und die Expression und Löslichkeit von CryjII in jeder
Mutante in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 6 untersucht
(7).
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Beispiel 9
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Expression
von CryjII in einer rpoH-Deletionsmutante
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Das ΔrpoH::kan-Gen
von E. coli MC4100 ΔrpoH
[Zhou, Y. N. et al., J. Bacteriol. 170, 3640–3649 (1988)] wurde durch Transduktion
mit einem T4-Phagen in E. coli MG1655 transferiert. Ein Stamm, in
den ΔrpoH::kan
transferiert worden war, wurde über
Kanamycinresistenz als Index selektiert. Durch die Bestätigung,
dass der Stamm bei 20°C wachsen
konnte, während
er bei 30°C,
37°C oder 42°C nicht wachsen
konnte, erhielt man den Stamm E. coli MG1655 ΔrpoH, NK161.
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Es
wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 5 ausgeführt, außer dass
der vorstehend beschriebene Stamm E. coli MG1655 ΔrpoH, NK161
an Stelle von E. coli MG1655 in Beispiel 5 verwendet wurde, so dass
sich eine rpoH-Deletionsmutanten-Kotransformante NK196 ergab. Die
Expression und Löslichkeit
von CryjII wurden für
die erhaltene Deletionsmutanten-Kotransformante in der gleichen Art
und Weise untersucht wie in Beispiel 6 (8 und 9)
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Beispiel 10
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Herstellung der Kotransformante
NK269
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Eine
reifes ORP150-Protein (Leu33-Leu999) codierende Region einer menschlichen
ORP150-cDNA [Ikeda, J. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 230,
94–99
(1997)] wurde in die NcoI Stelle des IPTG induzierbaren Expressionsplasmids
pTrc99A für
E. coli (hergestellt von Pharmacia Biotech) inseriert und so pORP4
hergestellt. E. coli JM109 wurde mit 10 ng des so erhaltenen pORP4
und 10 ng des in Beispiel 3 hergestellten pG-KJE6 nach dem in Beispiel
4 beschriebenen Verfahren transformiert, wodurch man eine Kotransformante
NK269 erhielt.
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Beispiel 11
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Expression von menschlichem
ORP150 mittels NK269
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Da
die in Beispiel 10 hergestellte NK269 nicht wachsen konnte, wenn
der Kultur zum Zeitpunkt des Beginns der Kultivierung L-Arabinose
hinzugefügt
wurde, wurde NK269 gezüchtet,
um die Expression von menschlichem ORP150 in der gleichen Art und
Weise wie in Beispiel 6 zu induzieren, außer dass L-Arabinose und Tetracyclin
hinzugefügt
wurden, wenn die Klett-Einheit ungefähr 40 erreichte (10).
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Nach
der vorliegenden Erfindung kann ein Operon, das Polynucleotide umfaßt, die
Chaperone codieren, die für
die Expression eines fremden Proteins in E. coli-Zellen in stabilisierter
und solubilisierter Form verwendet werden können, ein Expressionsplasmid,
das das Operon aufweist, eine Kotransformante, die durch Einschleusen
des Plasmids in E. coli zusammen mit dem Expressionsvektor für ein fremdes
Protein hergestellt wird, und ein Verfahren zur Herstellung eines
fremden Proteins, das die Kotransformante verwendet, bereitgestellt
werden. Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine wirksame Produktion eines fremden Proteins in
E. coli gentechnisch ermöglicht.