CZ308223B6 - Způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy - Google Patents

Způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy Download PDF

Info

Publication number
CZ308223B6
CZ308223B6 CZ2016-43A CZ201643A CZ308223B6 CZ 308223 B6 CZ308223 B6 CZ 308223B6 CZ 201643 A CZ201643 A CZ 201643A CZ 308223 B6 CZ308223 B6 CZ 308223B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
tyrosinase
plasmid
protyrosinase
gene encoding
carried out
Prior art date
Application number
CZ2016-43A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ201643A3 (cs
Inventor
Eva Marková
Michael KotĂ­k
Ludmila Martínková
Original Assignee
Mikrobiologický Ústav Av Čr V.V.I.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mikrobiologický Ústav Av Čr V.V.I. filed Critical Mikrobiologický Ústav Av Čr V.V.I.
Priority to CZ2016-43A priority Critical patent/CZ308223B6/cs
Publication of CZ201643A3 publication Critical patent/CZ201643A3/cs
Publication of CZ308223B6 publication Critical patent/CZ308223B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/375—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Basidiomycetes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/18—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with another compound as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.18)
    • C12Y114/18001—Tyrosinase (1.14.18.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy, při kterém se transformují kompetentní buňky expresního kmene bakterieBL21 (DE3). Star, se provádí kotransformací plasmidem pET28ParcP a zároveň plasmidem pGro7. Plasmid pET28ParcP se připraví ligací genu kódujícího protein dbj|BAD51402| pro latentní formu tyrosinasy izolovaného z bazidiomycety Polyporus arcularius do plasmidy pET 28a (+), a plasmid pGro7 obsahuje gen kódující chaperon groES-groEL. Kontransformace se po kultivaci bakterie projeví expresí genu kódujícího fúzní protein protyrosinasu s N-terminální His-tag sekvencí v heterologním systému a protyrosinasa se následně izoluje, purifikuje a aktivuje v tyrosinasu

Description

Způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy
Oblast techniky
Vynález se týká oblasti genového inženýrství, konkrétně způsobu přípravy rekombinantní tyrosinasy využitelné v různých oblastech biotechnologií.
Dosavadní stav techniky
Tyrosinasy, enzymy patřící do klasifikační skupiny EC 1.14.18.1, jsou nehemové oxidasy přítomné v širokém spektru různých organismů. V aktivním centru obsahují dva atomy mědi a katalyzují monooxygenaci fenolů a oxidaci katecholů. Meziprodukty těchto reakcí jsou intermediáty syntézy melaninu a podobných pigmentů důležitých pro obranu a rezistenci buněk. Možná biotechnologická využití tyrosinas zahrnují např. přípravu L-3,4-dihydroxy-Lfenylalaninu (L-DOPA) z tyrosinu, zlepšování konzistence potravin, imobilizaci enzymů, bioremediaci neboli degradaci fenolických polutantů a použití tyrosinas jako eukaryotních modelů pro studium jejich inhibice.
Nejběžnějším zdrojem tyrosinasy pro potenciální biotechnologická využití je v současné době izolace enzymu z žampionu dvouvýtrusého (Agaricus bisporus). Tato tyrosinasa se připravuje extrakcí z plodnic této houby, jak popisují ve své práci např. Zynek a sp. (J. Mol. Catal. B Enzym 2010, 66, 172). Nevýhodou je proměnlivé složení takto připraveného preparátu, který může obsahovat několik izoenzymů i další enzymové aktivity a kontaminující nízkomolekulámí látky. Jiné houby jsou k izolaci tyrosinas použity zřídka, a to zejména plodnice houby Pholiota microspora a mycelia hub Neurospora crassa a Pycnoporus sanguineus (pro přehled viz: Martínková a sp., Chemosphere 2016, http://dx.doi.Org/10.1016/j.chemosphere.2016.01.022).
Geny kódující tyrosinasy se vyskytují také u mnoha dalších vláknitých hub, jak lze soudit z analýzy sekvencí uložených v databázích genů, avšak jen málo z příslušných proteinů bylo připraveno expresí genů v rekombinantních organismech a následně charakterizováno. Jedná se o tři enzymy z bazidiomycet: A. bisporus, P. microspora a P. sanguineus - a dva enzymy z askomycet: Aspergillus oryzae a Trichoderma reesei. Některé z těchto enzymů byly exprimovány v eukaryotních hostitelích (Aspergillus niger, Pichiapastoris, T. reesei). Tyrosinasa se tvoří v těchto hostitelích v aktivované formě, tedy ve formě, kdy je C-terminální doména proteolyticky odštěpena, což může být nevýhodou, protože aktivovaná tyrosinasa může působit v buňce hostitele toxicky v důsledku modifikace tyrosinových zbytků proteinů hostitele. Alternativním způsobem přípravy tyrosinasy je její produkce v neaktivní formě jako protyrosinasa obsahující C-terminální doménu, která zřejmě chrání aktivní centrum, a následná aktivace protyrosinasy na tyrosinasu in vitro. Tento způsob byl použit pro přípravu dvou tyrosinas (z P. microspora a A. oryzae), které byly získány expresí příslušných genů v Escherichia coli a poté aktivovány in vitro částečným proteolytickým štěpením. Ani v jednom případě nebyl nicméně stanoven výtěžek enzymu (pro přehled: Martínková a sp., viz výše). Gen kódující protein dbj|BAD51402| byl sekvenován a následně byla studována jeho transkripce v nativním organismu - Polyporus arcularius (Kanda a sp., 2007), ale proteinový produkt transkripce genu nebyl zatím připraven v heterologním hostiteli a následně charakterizován (Kanda a sp., J Appl Microbiol 2007, 98, 332).
Množství sledovaného enzymu v roztoku lze určit kvantitativně prostřednictvím jeho katalytické aktivity. Aktivita enzymu se měří při jeho optimální hodnotě pH a při saturační koncentraci substrátu. Standardní jednotka enzymové aktivity je takové množství enzymu, které katalyzuje přeměnu 1 pmol substrátu za minutu při 25 °C a pH optimu. Označuje se U (z anglického unit). Koncentrace enzymu se pak vyjadřuje v jednotkách vztažených na jednotku objemu - UmL1.
- 1 CZ 308223 B6
Mírou čistoty enzymového preparátu je tzv. specifická aktivita enzymu vyjádřená v jednotkách aktivity vztažených na množství bílkovin v roztoku - Umg1.
Úkolem vynálezu je vytvoření způsobu přípravy rekombinantní tyrosinasy, který by odstraňoval výše uvedené nedostatky a který by poskytoval velké množství rekombinantní tyrosinasy transformované v heterologním hostiteli o velké enzymové specifické aktivitě.
Podstata vynálezu
Výše uvedené nedostatky odstraňuje způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy podle tohoto vynálezu. Při způsobu přípravy rekombinantní tyrosinasy se transformují kompetentní buňky expresního kmene bakterie Escherichia coli BL21 (DE3) Star.
Podstata vynálezu spočívá vtom, že se způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy provádí kotransformací plasmidem pET28ParcP a zároveň plasmidem pGro7. Plasmid pET28ParcP se připraví ligací genu kódujícího protein dbj|BAD51402| pro latentní formu tyrosinasy izolovaného z bazidiomycety Polyporus arcularius do plasmidu pET 28a (+) a plasmid pGro7 obsahuje gen kódující chaperon groES-groEL. Chaperon groES-groEL má vliv na skládání proteinů do správného prostorového uspořádání. Kotransformace se po kultivaci bakterie projeví vysokou hladinou exprese genu kódujícího fúzní protein protyrosinasu s N-terminální Hise-tag sekvencí v heterologním systému. Protyrosinasa se následně izoluje, purifikuje a aktivuje v tyrosinasu in vitro.
Ve výhodném provedení se kultivace transformovaných buněk provádí při 37 °C, po přidání induktoru se provádí při 20 °C. Jako induktor se s výhodou využívá isopropyl-P-D-l thiogalaktopyranosid (IPTG) a L-arabinosa.
Ve výhodném provedení se kultivace při 37 °C provádí po dobu 3 hodin v tekutém živném LB médiu, které se připraví z 1 % hmota, peptonu, z 0,5 % hmota, kvasničného extraktu a z 0,5 % hmota. NaCl, s přidaným 1 % hmota, glukózy a 0,2mM C11SO4 a kultivace při 20 °C se s výhodou provádí podobu 24 hodin s přidaným 0,02mM IPTG a ll,3mM arabinosy. Tyto speciální kultivační podmínky vedou k vysoké hladině exprese fúzního proteinu, a to protyrosinasy s N-terminální Hise-tag sekvencí.
Izolace a purifíkace protyrosinasy se s výhodou provádí lyží buněk působením enzymu lysozymu v kombinaci se sonikací za vzniku extraktu, a následnou afinitní chromatografri na koloně s náplní Ni Sepharose.
Ve výhodném provedení se aktivace tyrosinasy provádí inkubací s trypsinem nebo hovězím pankreatickým a-chymotrypsinem. Trypsin nebo hovězí pankreatický a-chymotrypsin se s výhodou používá v lOOmM Tris/HCl pufru s upraveným pH na 7,5 a lOmM CaCE při 30 °C. Aplikace těchto látek způsobuje štěpení C-koncové domény a sekvence Hise-tag z protyrosinasy a vzniku tyrosinasy.
Purifíkace tyrosinasy se s výhodou provádí gelovou filtrací na koloně Superdex 200.
Předmětem vynálezu je i rekombinantní tyrosinasa, která vykazuje specifickou aktivitu vztaženou na objem kultury o minimální hodnotě 3 000 UL1 pro substrát L-DOPA, s molekulovou hmotností 43 kDa a se specifickou aktivitou vztaženou na hmotnost proteinu o minimální hodnotě 100 Umg1 pro substrát L-DOPA.
Výhody způsobu přípravy rekombinantní tyrosinasy podle tohoto vynálezu spočívají zejména ve vysokém výtěžku rekombinantní tyrosinasy transformované v heterologním hostiteli o velké enzymové specifické aktivitě.
-2 CZ 308223 B6
Příklady uskutečnění vynálezu
Rozumí se, že dále popsané a zobrazené konkrétní případy uskutečnění vynálezu jsou představovány pro ilustraci, nikoliv jako omezení vynálezu na uvedené příklady. Odborníci znalí stavu techniky najdou nebo budou schopni zajistit za použití rutinního experimentování větší či menší počet ekvivalentů ke specifickým uskutečněním vynálezu, která jsou zde popsána. I tyto ekvivalenty budou zahrnuty v rozsahu následujících patentových nároků.
Příprava protyrosinasy
Synteticky připravený gen pro tyrosinasu izolovaný z bazidiomycety Polyporus arcularius kódující protein dbj|BAD51402| je ligován do plasmidu pET 28a (+), čímž se připraví plasmid pET28ParcP, kterým jsou transformovány kompetentní buňky expresního kmene E. coli BL21 (DE3) Star. Kmen E. coli BL21 (DE3) Star je zároveň transformován plasmidem pGro7 obsahujícím gen pro chaperon groES-groEL.
Ke kultivaci buněk je použito 100 ml media LB s 0,2 mM CuSCfi, 50 pg kanamycinu ml1 a 20 pg chloramfenikolu ml1. Inkubace probíhá v 500-mL Erlenmeyerových baňkách po dobu 3 hodin při 37 °C a třepání 220 ot./min. Indukce je provedena přidáním ll,3mM arabinosy a 0,02mM IPTG a teplota je poté snížena na 20 °C. Inkubace pokračuje dalších 24 hodin při 20 °C a třepání 220 ot./min. Buňky jsou poté odděleny centrifugací po dobu 30 min, při 4 °C a skladovány při -80 °C.
Purifikace protyrosinasy
Biomasa získaná výše popsaným postupem z 800 ml media je resuspendována ve 17,5 ml 20 mM fosfátového pufiru s upraveným pH 7,4 pomocí 500 mM NaCl a 20mM imidazolu, následně enzymaticky lyžována pomocí 0,2 mg lysozymuml1, 20 pg DNAsyml1, 1 mM MgCh a 1 mM fenylmethansulfonylfluoridu (PMSF) při 4 °C a poté mechanicky sonikací 15 x 1 min purifikována. Zbytky buněk jsou odstraněny centrifugací při 4 °C po dobu 30 min. Po lyži a centrifugací je supernatant nanesen na Ni Sepharose™ 6 Fast Flow kolonu (HisTrap FF crude, GE Healthcare Life Sciences) ekvilibrovanou 20 mM fosfátovým pufrem s upraveným pH 7,4 pomocí 500 mM NaCl a 20 mM imidazolu. Kolona je poté promyta tímto pufrem a navázaný protein je eluován 500mM imidazolem ve 20mM fosfátovém pufiru s upraveným pH 7,4 pomocí 500 mM NaCl s gradientem po dobu 30 min s průtokem 4 ml/min, kde jsou frakce eluátu odebírány po cca 15 ml. Aktivní frakce jsou následně spojeny a zakoncentrovány.
Aktivace tyrosinasy
Aktivace tyrosinasy je provedena v elučním pufiru s upraveným pH 7,4 pomocí 500 mM NaCl a 500 mM imidazolu obsahujícím 1 mg protyrosinasy mL1 a 0,1 mg trypsinu (Sigma) mL _1. Reakce probíhá při 25 °C a třepání 800 ot./min a následně je ukončena po 15 min přidáním 2mM PMSF. Vzorek je přečištěn gelovou filtrací na koloně Superdex 200 10/300 GL, kde eluce probíhá pomocí 50mM Tris/HCl pufiru s upraveným pH 7,2, pomocí 150 mM NaCl s průtokem 0,4 ml/min, kde jsou frakce eluátu odebírány po 2 ml. Aktivní frakce jsou následně spojeny a zakoncentrovány.
Aktivita takto získané tyrosinasy je stanovena spektrofotometricky pro substráty L-tyrosin, LDOPA, tert-butylcatechol (TBC) a p-kresol a pomocí HPLC-kolona Chromolith Speedrod RP18 (Merck) s mobilní fází 20% acetonitril s 0,1 % H3PO4 o průtoku 2 mLmin1 pro substráty fenol a p-kresol. Získaný enzym vykazuje tyto relativní aktivity: TBC 100 % (303 U mg1 proteinu), LDOPA 42 %, /2-krcso'l 37 %, fenol 4 %, L-tyrosin 1 %. Hodnoty Km and Cat pro L-DOPA byly cca 1,0 mM a 237 s1. Enzym je aktivní mezi pH 4 a 9 a vykazuje maximum aktivity při pH 5,5.
-3 CZ 308223 B6
Teplotní optimum enzymu je 50 °C a 65 % aktivity je zachováno při 70 °C. Enzym vykazuje molekulovou hmotnost podjednotky 43 kDa podle SDS-PAGE a nativní molekulovou hmotnost 79 kDa podle gelové filtrace.
Průmyslová využitelnost
Způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy podle tohoto vynálezu lze využít jako biokatalyzátor pro různé oblasti biotechnologických aplikací, jako je biokatalýza, enzymové modifikace proteinů s potravinářským a medicínským využitím či jako model pro studium látek pro léčení poruch pigmentace.

Claims (11)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy, při kterém se transformují kompetentní buňky expresního kmene bakterie Escherichia coli BL21 (DE3) Star, vyznačující se tím, že se provádí kotransformací plasmidem pET28ParcP a zároveň plasmidem pGro7, kde plasmid pET28ParcP se připraví ligací genu kódujícího protein dbj|BAD51402| pro latentní formu tyrosinasy izolovaného z bazidiomycety Polyporus arcularius do plasmidu pET 28a (+), a plasmid pGro7 obsahuje gen kódující chaperon groES-groEL, přičemž kotransformace se po kultivaci bakterie projeví expresí genu kódujícího fúzní protein protyrosinasu s N-terminální Hise-tag sekvencí v heterologním systému a protyrosinasa se následně izoluje, purifikuje a aktivuje v tyrosinasu in vitro.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že kultivace transformovaných buněk se provádí při 37 °C, po přidání induktoru se provádí při 20 °C.
  3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že jako induktor se využívá isopropyl-β- D-l thiogalaktopyranosid (IPTG) a L-arabinosa.
  4. 4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že kultivace při 37 °C se provádí po dobu 3 hodin v LB médiu, které se připraví z 1 % hmota, peptonu, 0,5 % hmota, kvasničného extraktu a 0,5 % hmota. NaCl, s přidaným 1 % hmota, glukózy a 0,2mM CuSCfi.
  5. 5. Způsob podle některého z nároků 2 až 4, vyznačující se tím, že kultivace při 20 °C se provádí po dobu 24 hodin s přidaným 0,02mM IPTG a 1 l,3mM arabinosy.
  6. 6. Způsob podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že izolace a purifikace protyrosinasy se provádí lyží buněk působením enzymu lysozymu v kombinaci se sonikací za vzniku extraktu, a afinita! chromatografií.
  7. 7. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že aktivace tyrosinasy se provádí inkubací s trypsinem nebo hovězím pankreatickým a-chymotrypsinem.
  8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že trypsin nebo hovězí pankreatický achymotrypsin se používá v lOOmM Tris/HCl pufiru s upraveným pH na 7,5 a lOmM CaCf při 30 °C.
    -4 CZ 308223 B6
  9. 9. Způsob podle některého z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že purifikace tyrosinasy se provádí gelovou filtrací.
  10. 10. Rekombinantní tyrosinasa připravená způsobem podle některého z nároků 1 až 9,
    5 vyznačující se tím, že vykazuje specifickou aktivitu vztaženou na objem kultury o minimální hodnotě 3000 UL1 pro substrát L-DOPA.
  11. 11. Rekombinantní tyrosinasa připravená způsobem podle některého z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že má molekulovou hmotnost 43 kDa a vykazuje specifickou aktivitu ίο vztaženou na hmotnost proteinu o minimální hodnotě 100 Umg1 pro substrát L-DOPA.
CZ2016-43A 2016-01-28 2016-01-28 Způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy CZ308223B6 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2016-43A CZ308223B6 (cs) 2016-01-28 2016-01-28 Způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2016-43A CZ308223B6 (cs) 2016-01-28 2016-01-28 Způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ201643A3 CZ201643A3 (cs) 2017-08-09
CZ308223B6 true CZ308223B6 (cs) 2020-03-11

Family

ID=59519989

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2016-43A CZ308223B6 (cs) 2016-01-28 2016-01-28 Způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ308223B6 (cs)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6159708A (en) * 1997-06-20 2000-12-12 Hsp Research Institute, Inc. Chaperone expression plasmids
JP2004016147A (ja) * 2002-06-18 2004-01-22 Rengo Co Ltd 有機溶媒耐性チロシナーゼ、その遺伝子およびその製造方法
CN102505023A (zh) * 2011-11-18 2012-06-20 华东理工大学 一种dahp合酶的异源可溶性表达方法及其重组载体和基因工程菌
WO2015179621A2 (en) * 2014-05-22 2015-11-26 Dow Agrosciences Llc Cytokinin synthase enzymes, constructs, and related methods

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6159708A (en) * 1997-06-20 2000-12-12 Hsp Research Institute, Inc. Chaperone expression plasmids
JP2004016147A (ja) * 2002-06-18 2004-01-22 Rengo Co Ltd 有機溶媒耐性チロシナーゼ、その遺伝子およびその製造方法
CN102505023A (zh) * 2011-11-18 2012-06-20 华东理工大学 一种dahp合酶的异源可溶性表达方法及其重组载体和基因工程菌
WO2015179621A2 (en) * 2014-05-22 2015-11-26 Dow Agrosciences Llc Cytokinin synthase enzymes, constructs, and related methods

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Du Guang-Yu et al.: Soluble expression and purification of recombinant human bone morphogenetic protein-2 gene in E. coli 2009 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research 13, 1267-1270 *
GenBank BAD51402 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/bad51402 photo-regulated tyrosinase [Polyporus arcularius], 18.9.2004 *
Kanda Satoshi et al.: Photoregulated tyrosinase gene in Polyporus arcularius 2007 Mycoscience 48, 34–41 *
Yanjun Tong et al.: Enhancement of soluble expression of codon-optimized Thermomicrobium roseum sarcosine oxidase in Escherichia coli via chaperone co-expression 2016, dostupné online 11/2015 Journal of Biotechnology 218, 75 – 84 *
Yasuko Kawamura-Konishi et al.: C-terminal processing of tyrosinase is responsible for activation of Pholiota microspora proenzyme 2011 Applied Microbiology and Biotechnology 90, 227–234 *

Also Published As

Publication number Publication date
CZ201643A3 (cs) 2017-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA3062645A1 (en) Recombinant production systems for prenylated polyketides of the cannabinoid family
Strillinger et al. Production of halophilic proteins using Haloferax volcanii H1895 in a stirred-tank bioreactor
Kremer et al. A tyrosine O-prenyltransferase catalyses the first pathway-specific step in the biosynthesis of sirodesmin PL
Marková et al. Recombinant tyrosinase from Polyporus arcularius: overproduction in Escherichia coli, characterization, and use in a study of aurones as tyrosinase effectors
US10100297B2 (en) Nitrilase from arabis alpina, its encoding gene, vector, recombinant bacterial strain and uses thereof
Ichinose et al. Heterologous expression and mechanistic investigation of a fungal cytochrome P450 (CYP5150A2): involvement of alternative redox partners
Mokoena et al. Functional characterisation of a metagenome derived family VIII esterase with a deacetylation activity on β-lactam antibiotics
CN112513263A (zh) 产生折叶苔醇化合物的方法
You et al. Characterization of a prodigiosin synthetase PigC from Serratia marcescens jx-1 and its application in prodigiosin analogue synthesis
Cabrera et al. Cloning, overexpression, and characterization of a thermostable nitrilase from an Antarctic Pyrococcus sp.
Wang et al. A novel nitrilase from Rhodobacter sphaeroides LHS-305: cloning, heterologous expression and biochemical characterization
Wang et al. Purification and characterization of a cis-epoxysuccinic acid hydrolase from Nocardia tartaricans CAS-52, and expression in Escherichia coli
Isobe et al. Characterization of a novel hydroxynitrile lyase from Nandina domestica Thunb
US20210102186A1 (en) 3-methylcrotonic acid decarboxylase (mdc) variants
Itoh et al. Construction and characterization of a functional chimeric laccase from metagenomes suitable as a biocatalyst
Dadashipour et al. Comparative expression of wild-type and highly soluble mutant His103Leu of hydroxynitrile lyase from Manihot esculenta in prokaryotic and eukaryotic expression systems
US11939583B2 (en) Method of producing autotrophic organisms with altered photorespiration and improved CO2 fixation
Guo et al. Soluble and functional expression of a recombinant enantioselective amidase from Klebsiella oxytoca KCTC 1686 in Escherichia coli and its biochemical characterization
US8304223B2 (en) Isoforms of pig liver esterase
Kusumoto et al. Efficient production and partial characterization of aspartyl aminopeptidase from Aspergillus oryzae
JP6724285B2 (ja) シス−５−ヒドロキシ−ｌ−ピペコリン酸の製造方法
Matsushima et al. An enone reductase from Nicotiana tabacum: cDNA cloning, expression in Escherichia coli, and reduction of enones with the recombinant proteins
CZ308223B6 (cs) Způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy
US10036047B2 (en) Methods for hydroxylating phenylpropanoids
Kumar et al. Bench scale synthesis of p-hydroxybenzoic acid using whole-cell nitrilase of Gordonia terrae mutant E9

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20210128