RU1816797C - Рекомбинантна плазмидна ДНК рР1, определ юща синтез гибридного белка, обладающего антигенными свойствами вируса иммунодефицита человека 1, способ ее конструировани и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент гибридного белка, обладающего антигенными свойствами вируса иммунодефицита человека 1 - Google Patents

Abstract

Использование: генетическа  инженери  и биотехнологи . Сущность изобретени : в вектор pVR290 встраивают Hincll-EcoRI фрагмент области pol генома ВИЧ1, кодирующего обратную транскрип- тазу и часть эндонуклеазы-интегразы, выделенного из плазмиды рВНЮ, содержащей ДНК-копию вирусного генома. Плазмида определ ет устойчивость к ампициллину, неконьюгативна. Использование данного изобретени  позвол ет получать с 1 л клеточной суспензии 45-65 мг гибридного белка , содержащего специфическую последовательность полипептида, кодируемого pol областью генома ВИЧ1.

Description

ел

с

Изобретение относитс  к биотехнологии и представл ет собой штамм Е.coll, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК с фрагментами области pol генома ВИЧ1, определ ющую синтез гибридного белка, обладающего антигенными свойствами ВИЧ1.

Целью изобретени   вл етс  получение рекомбинатной плазмидной ДНК, обеспечивающей высокий уровень продукции гибридного белка, обладающего антигенными свойствами ВИЧ1, способной наследоватьс  в штаммах бактерий Е.coll и создание таким образом штамма-продуцента этого белка.

Описание плазмиды.

- название - рР1

- размер - 7,3 т.п.н.

- состоит из Hindll - E.coR 1-фрагмента плазмиды рВН 10 размером 2,1 т.п.н., содержащего последовательность области ВИЧ1; Hindlll фрагмента плазмиды puR 290 размером 5,2 т.п.н. с геном бета-гелактозидаза, областью ori и геном устойчивости к ампициллину: и E.coRl-Hindlll III олигонуклеоти- даадаптора размером 12 нуклеотидов.

- уникальные сайты рестрикции BamHI, SalGl, Pstl

- плазмида определ ет устойчивость клеток E.coli HB101 к ампициллину и синтез

00

сь VI о

4

в них гибридного белка, содержащего антигенные детерминанты области pol ВИЧ1.

- плазмида неконьюгативна.

Описание штамма E.coli HB101/pP1

Морфологические признаки.

Клетки пр мые, палочковидной формы 1,2x1,6x2,0 мкт, подвижные с перитрихи- альными жгутиками, грамотрицательныё, иеспорообразугощие.

Культуральные признаки.

Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на м со-пептон- ном агаре, L-arape-колонии гладкие, круглые, прижатые, блест щие, серые, край ровный, мутные. При росте на жидких сре- дах м со-пептонном бульоне, L-бульоне образуют ровную интенсивную муть.

Физико-биохимические признаки.

Клетки растут в пределах 4-45°С при оптимуме рН 6,8-7,5. В качестве источника углерода используют глюкозу, фруктозу. Не усваивают ацетат. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Индол не образуют. Уреазна  активность не обнаруживаетс . Устойчивость к антибиотикам.

Клетки устойчивы кампициллинузасчет наличи  плазмиды рР1,.

П р и м е р 1. Конструирование плазми ДырР1. ;

Hindll-E.coRI фрагмент области pol re- нома ВИЧ1, кодирующий обратную транс- криптазу и часть эндонуклеазы-интегрэзы, выдел ют из плазмиды рВНЮ, содержащий ДНК-копию вирусного генрма и встраивают в вектор рис 19 по сайтам дл  этих рестрик- таз. Дл  этого 10 мкг ДНК плазмиды рВНЮ инкубируют с 20д. Hindll и ЗОд.Е.соРИ в бу- фере, содержащем 100 мМ №CI, 10 mM MgCl2. Ю тМ трис-HCI рН7.5, 1 mM ДТТ в течение 2 ч при 37°С. Далее выдел ют нужный фрагмент ДНК методом электроэлюции из 1 % агарозного гел . 2 мкг вектора риС19 инкубируют с 5 ед. Hindll и 5 ед.. E.coRI в тех же услови х,

Соединение смеси фрагментов ДНК плазмиды риС19 (0,5 мкг) и Hindtl - E.coRI фрагмента ВИЧ1 из плазмиды рВНЮ провод т с помощью ДНК-дигазы фага Т4 (30000 единиц/мл) из расчета 1 мкл фермен- та на 5 мкг ДНК (инкубацию ведут в.течение 10 ч при 12°С).

Полученный препарат используют дл  трансформации клеток E.coli HB101. Трансформацию провод т следующим обрэзом: 0,1 мл суспензии клеток E.coii HB101-внос т в 20 мл питательного L-бульона и выращивают до титра 3x108 клеток/мл. Клеткисоби- рают центрифугированием (5000 д, 10 мин, 0°С), ресуспендируют в 10 мл 75 mM раствора CaCl2 и выдерживают 30 мин при 0°С. Клетки повторно центрифугируют (5000, 10 мин, 4°С), затем ресуспендируют в 1 мл 75 mM CaCla (0°C) и 100 мкл такой суспензии используют дл  трансформации, Смесь соединенных фрагментов ДНК инкубируют с компонентными клетками (обработанными CaCI) в течение 1 ч при 0°С и 3 минуты при 42°С. После двенадцатикратного разбавлени  L-бульоном трансформированные клетки подращивают 1,5 ч и высевают на агаризованную среду L-бульона с ампицил- лином (30 мкг/мл). Плазмидную ДНК, выделенную из ампициллин-устойчивых колоний, выросших через 36 ч при 37°С, анализируют с помощью электрофореза. Отбирают клоны, молекул рный вес которых больше чем у исходного вектора риС19. Полученную плазмиду обозначают pRT3.

Клетки бактерий E.coli HB101, содержащие плазмидную ДНК pRT3, выращивают в 200 мл бульона до титра 1x109 клеток/мл. Клетки осаждают центрифугированием (5000 д, 5 мин, 4°С) и ресуспендируют в 35 мл раствора, содержащего 8% сахарозы, 0,5% тритона Х100, 50 mM ЭДТА рН 8,0 и 10 mM трис-НCI рН 8,0. Далее добавл ют 2,5 мл свежеприготовленного раствора лизоцима с концентрацией 10 мг/мл, быстро перемешивают и нагревают на кип щей вод ной бане в течение 3 мин. Полученный лизат центрифугируют (20000 д, 30 мин, 4°С) и ДНК из супернатанта осаждают равным объемом изопропанола. Образовавшийс  осадок собирают центрифугированием (12000 д, 20 мин, 2°С) и ресуспендируют в 5 мл 10 mM трис-HCI, рН 8,0 буфера. Окончательную очистку плазмидной ДНК провод т методом равновесного центрифугировани  в градиенте плотности CsCI с бромистым этидием (1 мкг/мл).

Дл  получени  плазмиды рР1 фрагмент Hindlll-E.coRI плазмиды pRT3 переклонируют в вектор puR.290 по сайту Hindlll. С этой целью 10 мкг ДНК плазмиды инкубируют с 30 ед. эндонуклеазы E.coRI в буфере, содержащем 100 мМ NaCI, 10 mM MgMl2, 10 mM трис-HCI рН 7.5, 1 mM ДТТ, в течение 1 ч при 37°С. Затем добавл ют 1/10 объема ЗМ ацетата Na и осаждают ДНК 2,5 объемами этилового спирта на ценрифуге (10000 д, 10 мин, 4°С). Осадок высушивают и раствор ют в буфере 10 мМ трис-НCI рН 8,0 и 5мМ ЭДТА. Полученный препарат лигируют с 50 мМ адаптера E.coRI-Hindlll с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (30000 единиц/мл), из расчета 1 мкл фермента на 5 мкг ДНК (инкубацию вели в течение 10 ч при 12°С). Затем добавл ют 40 ед. рестриктазы Hindlll и инкубируют в буфере, содержащем 50 mM

трис-HCI, рН 8,0, 50 mM CaCI, 10 тМ MgCl2, 1 тМ ДТТ. Реакцию провод т 1 ч при 37°С. Далее выдел ют нужный фрагмент ДНК методом электроэлюции из 1% агарозного гел . 5 мкг ДНК вектора puR290 инкубируют с 10 ед. рестриктазы Hindlll в буфере, содержащем 50 тМ трис-HCI, рН 8,0,50 mM NaCl, 10 тМ MgCla, 1 тМ ДТТ. Реакцию провод т 1 ч при 37 град.С.

Соединение смеси фрагментов ДНК плазмиды puR290 (0,5 мкг) и Hindlll фрагмента из плазмиды рРТЗ провод т с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (30000 ед./мл) из расчета 1 мкл фермента на 5 мкг ДНК (инкубацию провод т в течение 10 ч при 12°С).

Полученную смесь используют дл  трансформации как описано ранее. Плаз- мидную ДНК, выделенную из ампициллин- устойчивых колоний, выросших через 36 ч при 37°С, анализируют с помощью электрофореза . Отбирают клоны, молекул рный вес которых был больше, чему исходного вектора puR290.

Дл  окончательного выбора нужной плазмиды провод т анализ способности выбранных плазмид синтезировать гибридные белки молекул рной массы 160 кД, содержащие вирусспецифические последовательности области pol.

Приме р 2. Анализ уровн  синтеза гибридного белка, обладающего антигенными свойствами E.coli НВ101/рР1.

Анализ белков в лизатах клеток E.coli НВ101, содержащих гибридную плазмиду рР1 провод т следующим образом.

2 мл суспензии клеток E.coli HB101, содержащих плазмиду рР1, выросших в течение ночи из отдельной колонии до концентрации 2x109 клеток/мл в L-бульоне, содержащем 30 мкг/мл ампициллина, осаждают центрифугированием (12000 д, 1 мин) и ресуспендируют в 200 мкл буфера, содержащего 50 тМ трис-PCI рН 7,8, 2,5% доде- цилсульфата натри , 10% глицерина, 0,7% меркаптоэтанола и 0,1% бромфенолового синего. Полученные препараты кип т т 5 минут на вод ной бане и 20 мкл анализируют методом электрофореза. В лизатах бактерий , содержащих плазмиду рР1, обнаружен дополнительный белок с молекул рной массой 160 кД. Антигенную активность белка молекул рной массой 160 кД демонстрируют с помощью метода имму- ноблотинга. Полученный гибридный белок обладает антигенной активностью ВИЧ1, . Уровень синтеза гибридного белка составл ет не менее 5% от тотального клеточного белка.

Изобретение позвол ет получать с 1 л

клеточной суспензии 45-65 мг белка, обла . дающего антигенными свойствами ВИЧ1.

При этом 1726 аминокислотных остатков (ак)

5 гибридного белка представлены: 1021 ак - бета-галактозидаза, 8 ак, кодируемых пол- илинкерной последовательностью векторной плазмиды puR290, 7 ак, кодируемых полилинкерной последовательностью век0 тора риС19, 687 ак, кодируемых фрагментом гена pol ВИЧ1, 3 ак олигонуклеотида-адап- тора и 2 ак, кодируемых полилинкером puR290.

П р и м е р 3. Демонстраци  возможно5 сти использовани  целевого продукта дл  создани  диагностикума на ВИЧ1.

Препараты белков, приготовленные по методике, изложенной в примере 2, раздел ют методом электрофореза в ПААГ и ана0 лизируют методом иммуноблотинга с помощью сыворотки пациента, инфицированного ВИЧ1. В препарате белков, полученных из клеток, содержащих гибридную плазмиду рР-1, вы вл ют дополнительные

5 полосы белков, специфически реагирующие с антителами к ВИЧ1. В препарате, использовавшемс  в качестве контрол , приготовленном из клеток, содержащих исходный вектор puR290,. также полосы не идентифи0 цируют.

Таким образом, плазмида рР1 детерминирует в клетках E.coli синтез белков, обладающих антигенными свойствами белков В1/1Ч1, поэтому данную плазмиду и штамм5 продуцент можно использовать дл  создани  диагностикумов на вы вление антител к ВИЧ1.

Claims (3)

1. Формула изобретени  1. Рекомбинантна  плазмидна  ДНК

   0 рР 1, определ юща  синтез гибридного белка , обладающего антигенными свойствами иммунодефицита человека Т размером 7,3 т.п.н. и содержаща :

   - Hindll - E.coRI - фрагмент плазмиды 5 рВНЮ размером 2,1 т.п.н.;

   - Hindi - Hindlll - фрагмент плазмиды puR290 размером 5,2 т.п.н.;

   -уникальные сайты рестрикции BamHI, SalGI, Pstl;

   0 - генетические маркеры - Ыа-ген устойчивости к а.мпициллину;

   -гены;

   - lac Z-pol-ген, обеспечивающий синтез гибридного белка, размером 1726 ак со сле- 5 дующей нуклеотидной и аминокислотной последовательностью

   бета-галактозидаза I полилинкерна  область puR290 ( полилинкер Мет...Трп Цис Apr Гли Сер Вал, Асп Лей Глн Про Сер Лей Гис Ала %

   I/

   АТГ...ТГГ ТГТ ЦГГ ГГА ТЦЦ ГТЦ ГАЦ ЦТГ

   1 1020 ЦАГ ЦЦА АЈЦ ТТГ ЦАТ ГЦЦ

   1030

   риС19 -последовательность pol -линкер последовательность puR290.

   Цис Apr Сер Тре Глу Иле Глу Фен Гли Иле Глн Ала Тир Apr

   ТГЦ АГГ ТЦГ АЦТ ЦАГ АТТ...ГАА ТП ГГА

   1039 1726 АТТ ЦАА ГЦТ ТАТ ЦГА ТГА

   1730
2. 2. Способ конструировани  рекомби- нантной плазмидной ДНК рР1, определ ющей синтез гибридного белка, обладающего антигенными свойствами вируса иммунодефицита человека I, заключающийс  в том, что Hlndll-E.coRI фрагмент плазмиды

   рВНЮ размером 2,1 т.п.н, клонируют в вектор риС19, гидролизованный рестриктаза- ми Hindll и E.coRI, полученную гибридную плазмиду после обработки ферментом

   E.coRI лигируют с синтетическим адаптером E.coRI-Hindlll, далее обрабатывают ре- стриктазойН1пйИГи Hindi II фрагмент клонируют в вектор puR290, обработанный рестриктазой Hlndlll штамм бактерий

   Escherlchia coll трансформируют полученными рекомбинантными ДНК с последующим отбором клонов, содержащих целевую плазмиду.
3. 3. Штамм бактерий Escherichla coll ГКВЫ рР1 - продуцент гибридного белка, обладающего антигенными свойствами вируса иммунодефицита человека 1,