RU1679798C - РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pUR 290 S ΔE, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД β -ГАЛАКТОЗИДАЗА-NS 1-БЕЛОК ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА, И СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может найти применение в медицине для разработки высокоэффективных диагностических и профилактических средств против клещевого энцефалита. Целью изобретения является создание рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей синтез гибридного полипептида b галактозидаза -NSI-белок вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). Сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pUR 290 SΔE, кодирующая в клетках E.coli синтез полноразмерного белка NSI ВКЭ в составе гибридного полипропилена β галактозидаза -NSI ВКЭ. Рекомбинантная ДНК pUR 290 SΔE сконструирована на основе большого SaL I Hind III-фрагмента векторной плазмиды pUR 290 размером 5200 п.н. Sal I hindIII фрагмента ДНК размером 1224 п. н. представляющего собой ALu I (2451) -Hind III(3672) фрагмент кДНК генома ВКЭ, Alu L, конец которого заменен на липкий Sal I конец в процессе конструирования целевой плазмиды, и Hind III EcoRI синтетического фрагмента ДНК размером 26 п.н. 2 с.п. ф-лы.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может найти применение в медицине для разработки высокоэффективных диагностических и профилактических средств против клещевого энцефалита.

Целью изобретения является создание рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей синтез гибридного полипептида β-галактозидаза-NS1 белок вируса клещевого энцефалита (ВКЭ).

Для этого сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pUR 290 S ΔE, которая кодирует в трансформированных ею клетках E.coli синтез гибридного белка β-галактозидаза-NS 1 ВКЭ, обладает размером 6440 п.н. и состоит из следующих элементов:
большого Sal I Hind III фрагмента векторной плазмиды pUR 290 размером 5200 п.н. Hind III конец которого достроен фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1 E.coli;
Sal I Hind III фрагмента ДНК размером 1224 п.н. содержащего неполную (недостает 19 п.н. на третьем конце) кодирующую последовательность гена NS 1 ВКЭ, состоящего из Alu I Msp I части выделенного из плазмиды pTBE 2 фрагмента 2 кДНК ВКЭ, которая обладает размером 109 п.н. и Alu I конец которой заменен на Sal I конец, Msp I Clr 101 части фрагмента 2 кДНК ВКЭ размером 572 п.н. и Cfr 10 I Hind III части (размером 540 п.н.), выделенного из плазмиды p621 II фрагмент II вирусной кДНК;
Hind III EcoRI синтетического фрагмента ДНК размером 26 п.н. который содержит недостающий 3-концевой участок кодирующей последовательности гена NS 1 белка ВКЭ длиной 19 п.н. и терминирующий кодон EcoRI, конец которого достроен фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1 E.coli;
один участок расщепления рестриктазы BamHI;
один участок расщепления рестриктазы Sal I, расположенный на расстоянии 6 п.н. по часовой стрелке от единственного BamHI сайта;
один участок расщепления рестриктазы Hind III, расположенный на расстоянии 1230 н.п. по часовой стрелке от BamHI-сайта;
два участка расщепления рестриктазы EcoRI, расположенных на расстоянии 0,21 т.п.н и 6,39 т.п.н по часовой стрелке от BamHI-сайта.

Фрагменты содержат следующие гены и регуляторные участки:
bla ген, обеспечивающий синтез β-лактамазы (устойчивость к ампициллину), расположенный на участке от 1,2 до 2,1 т.п.н. вправо от BamHI-сайта;
промотор plac и ген β-галактозидазы E.coli, расположенные на участке от 3382 до 6 п.н. по часовой стрелке от BamHI-сайта;
ген NS I-белка ВКЭ, расположенный на участке от 6 до 1256 п.н. по часовой стрелке от BamHI-сайта;
молекулярная масса рекомбинантной плазмидной ДНК равна 4,25 МД.

Разработан способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pUR 290 SΔ E, который заключается в том, что кДНК-фрагмент II генома ВКЭ размером 830 п.н. содержащий пятую концевую часть гена NSI-белка ВКЭ и выделенный из плазмиды pTBE 2 гидролизом рестриктазой Pst I, расщепляют последовательно рестриктазами Cfr 10I и Msp I и выделяют Pst I Msp I (2560), Cfr 10 I (3132) фрагменты геномной кДНК ВКЭ. Затем Pst I MspP I (2560) фрагмент подвергают неполному гидролизу рестриктазой Alu I таким образом, что сайт Alu I (2489) остается нерасщепленным, и выделяют Alu I (2451) Msp 1 (2560) фрагмент. кДНК фрагмент II генома ВКЭ размером 910 п.н. содержащий неполную 3-концевую часть гена NS I белка ВКЭ и выделенный из плазмиды p621 II гидролизом рестриктазой Hind III, расщепляют рестриктазой Cfr 10 I и выделяют Cfr 10 I (3132) Hind III (3672) фрагмент ДНК-плазмиды puC 18 расщепляют рестриктазой Sal I, достраивают образовавшиеся липкие концы фрагментов Кленова ДНК-полимеразы 1 E. coli и гидролизуют рестриктазой E.coRI, полученную векторную часть плазмиды сшивают ДНК-лигазой фага Т4 с Alu I (2451) Msp I (2560)-, Msp I (2560) Cfr 10 I (3132), Cfr 10 I (3132) Hind III и с синтетическим Hind III EcoRI фрагментом ДНК, имеющим структуру: AGC TTA GTG CGT TAT GTC GCA TG
AT CAC GCA ATA CAG CAC CGT ACT
TAA,
затем лигазной смесью трансформируют клетки E.coli. Среди трансформантов, устойчивых к ампициллину, с помощью ДНК-ДНК-гибридизации и рестриктного анализа отбирают клоны, несущие плазмидную ДНК pUC 18 SE, которую выделяют из бактериальных клеток. Полученную ДНК гидролизуют рестриктазой EcoRI, достраивают липкие концы фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1 E.coli, расщепляют рестриктазой Sal I и выделяют Sal I-EcoRI полусинтетический фрагмент с затупленным EcoRI-концом длиной 1250 п.н. Плазмидную ДНК pUR 290 гидролизуют рестриктазой Hind III, достраивают липкие концы фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1 E.coli и гидролизуют рестриктазой Sal I. Выделенную векторную часть плазмиды сшивают с полученным полусинтетическим фрагментом при помощи ДНК-лигазы фага Т4. Лигазной смесью трансформируют клетки E. coli. Среди трансформантов при помощи рекстриктного анализа отбирают клоны, содержащие целевую плазмидную ДНК pUR 290 S ΔE, которая обеспечивает синтез полипептида β-галактозидаза-NSI-белок ВКЭ в трансформированных ею клетках E.coli Δ М 15 с уровнем синтеза 80-100 мг/л культуры.

П р и м е р 1. Способ конструирования плазменной ДНК pUR 290 SΔ E.

10 мкг фрагмента 2 размером 830 п.н. содержащего 5-концевую часть гена NS I белка ВКЭ и выделенного из плазмиды pTBE 2 гидролизом рестриктазой Pst I, расщепляют последовательно сначала рестриктазой Cfr 10 I, а затем рестриктазой Msp I в реакционной смеси, содержащей 20 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ MgCl₂ 50 мМ NaCl, 20 ед соответствующего фермента в объеме 200 мкл при 37^оС в течение 1 ч. Фрагменты Pst I Msp I (2560) длиной 209 п.н. Msp I (2560) Cfr 10 I (3132) длиной 572 п.н. выделяют после электрофореза в ПААГ методом электроэлюции (здесь и в дальнейшем цифры в круглых скобках означают позиции соответствующих сайтов рестрикции на карте геномной кДНК ВКЭ штамм Софьин). Полученное количество (2 мкг) фрагмента Pst I-Msp I (2560) подвергают неполному гидролизу рестриктазой Alu I в реакционной смеси, содержащий 20 мМ трис-HCl (pH 8,0), 10 мМ MgCl₂, 50 мМ NaCl, 6 мМ -меркаптоэтанол, 5 ед рестриктазы Alu I в объеме 40 мкл при 37^оС в течение 20 мин. Фрагменты Alu (2451) Msp I (2560) длиной 109 п.н. выделяют после электрофореза в ПААГ также методом электроэлюции.

10 мкг ДНК фрагмента II размером 910 п.н. содержащего неполную 3-концевую часть гена NSI белка ВКЭ и выделенного из плазмиды p621-II гидролизом рестриктазной Hind III, расщепляют рестриктазой Cfr 10 I в реакционной смеси, содержащей 20 мМ трис-HCl (рН 8,0), 10 мМ MgCl₂, 50 мМ NaCl, 20 ед рестриктазы Cfr 10 I в объеме 200 мкл при 37^оС в течение 1 ч. Фрагмент Cfr 10 I (3132) Hind III (3672) длиной 540 п.н. выделяют после электрофореза в ПААГ при помощи электроэлюции.

Для формирования недостающего 3-концевого участка кодирующей последовательности длиной 19 п.н. и введения в конец этой последовательности терминирующего кодона используют Hind III E. coRI-синтетический фрагмент ДНК, имеющий следующую структуру: AGC TTA GTG CGT TAT GTC GTG GCA TG
AT CAC GCA ATA CAG CAC CGT ACT TAA
Sal I EcoRI векторную часть плазмиды pUC 18 с затупленным Sal I концом готовят следующим образом. 5 мкг плазмидной ДНК pUC 18 расщепляют рестриктазой Sal I в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl (рН 8,0), 10 мМ MgCl₂, 150 мМ NaCl, 6 мМ β-меркаптоэтанол, 10 ед рестриктазы Sal I, в объеме 100 мкл при 37^оС в течение 1 ч. Липкие Sal I концы гидролизованной ДНК достраивают фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1 E.coli в реакционной смеси, содержащей 20 мМ трис-HCl (рН 8,0), 10 мМ MGCl₂, 0,05 мМ dNTP, 20 ед. фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 E.coli, в объеме 100 мкл при комнатной температуре в течение 5 мин. Обработанную таким образом ДНК гидролизуют рестриктазой EcoRI в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl (рН 8,0,), 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl, 10 ед рестриктазы EcoRI, в объеме 100 мкл при 37^оС в течение 1 ч и очищают в ПААГ.

1 мкг суммарной ДНК, состоящей из эквимолярного количества фрагментов Alu I (2451) Msp I (2560)- Msp I (2560) Cfr 10 I (3132), Cfr 10 I (3132) Hind III (3672), синтетического Hind III EcoRI-фрагмента и полученной векторной части плазмиды pUC 18, обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 в реакционной смеси, содержащей 20 мМ трис-HCl (рН 8,0), 10 мМ MgCl₂, 10 мМ β-меркаптоэтанол, 0,5 мМ АТР, 10 ед ДНК-лигазы фага Т4, в объеме 20 мкл при 5^оС в течение 5 ч. Лигазной смесью трансформируют компонентные клетки штамма E.coli М 15, полученные методом обработки CaCl₂.

Клетки реципиентного штамма E.coli ΔM 15 растят ночь на качалке в 5 мл LB-среды (10 г бакто-триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl на 1 л Н₂О) при 37^оС. Ночной культурой заражают 100 мл LB-среды. Инокулят подращивают до плотности клеток в среде 0,6 о.е. при 550 нм и центрифугируют при 7000 об/мин, 0^оС, 10 мин. Осадок переносят в ледяную баню (все последующие операции проводят при 0^оС) и суспендируют в 50 мл стерильного холодного раствора: 0,01 М трис-HCl (рН 8,0), 0,05 М CaCl₂. Через 20 мин клетки осаждают и суспендируют в 5 мл приведенного раствора. Через 30 мин инкубации реципиентные клетки считаются подготовленными к трансформации их плазмидной ДНК.

К 0,2 мл суспензии клеток добавляют 10 мкл лигазной смеси, инкубируют 25 мин в ледной бане, 2 мин при 42^оС и 10 мин при комнатной температуре, добавляют 1 мл LB-среды и подращивают культуру при 37^оС в течение 1 ч.

Трансформанты выращивают на чашках Петри, содержащих 50 мгл ампициллина, в течение ночи при 37^оС.

Клоны, содержащие искомый фрагмент, отыскивают при помощи ДНК-ДНК-гибридизации с использование меченных ³²Р радиоактивных зондов, полученных методом ник-трансляции исходных кДНК-фрагментов 2 и 11 генома ВКЭ. Положительные по гибридизации клоны анализируют при помощи рестриктивного анализа. Для этого выделенные плазмиды гидролизуют рестриктазамин Sal I, Hind III, EcoRI, Msp I, Cfr 10 I. Продукты гидролиза анализируют электрофорезом в 1%-ном агарозном геле и 5%-ном ПААГ. В результате отбирают плазмиду pUC 18 SE, которая при гидролизе рестриктазами EcoRI и Sal I дает полусинтетический Sal I-EcoRI-фрагмент ДНК длиной 1250 п.н. который состоит из Sal I-Hind III-кДНК фрагмента вирусного генома длиной 1224 п.е. и синтетического Hind III EcoRI фрагмента размером 26 п.н. и содержит кодирующую последовательность генa NSI белка ВКЭ, которая оканчивается терминирующим кодоном.

Первичную структуру полученной плазмидной ДНК в областях, прилегающих к сайтам Sal I и EcoRI, проверяют при помощи метода Максама-Гилберта. В результате обнаруживают единственную замену

в позиции 3682 в 3-концевом участке встроенного Sal I EcoRI-фрагмента, введенном при помощи синтетических олигонуклеотидов. Эта замена ведет к точковой мутации: Arg-кодон заменяется на Gly-кодон на расстоянии четырех триплетов от терминирующего кодона.

10 мкг плазмидной ДНК pUC18 SE расщепляют рестриктазой E.coli I в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl (рН 8,0), 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl, 20 ед рестриктазы EcoRI, в объеме 200 мкл при 37^оС в течение 1 ч. Достраивают образовавшиеся при гидролизе липкие EcoRI-концы фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1 E.coli в присутствии 0,05 мМ dATP, 0,05 мМ dTTP. Затем ДНК гидролизуют рестриктазой Sal I и полусинтетический Sal I-EcoRI-фрагмент с затупленным EcoRI-концом очищают в ПААГ.

5 мкг плазмидной ДНК pUR 290 расщепляют рестриктазой Hind III в смеси, содержащей 20 мМ трис-HCl (pH 8,0), рестриктазы Hind III, в объеме 100 мкл при 37^оС в течение 1 ч, обрабатывают фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1 E. coli в присутствии 0,05 мМ dNTP, гидролизуют рестриктазой Sal I и очищают в ПААГ.

1 мкг ДНК, состоящей из эквимолярного количества Sal I-EcoRI-фрагмента с достроенным EcoRI-концом и Sal I-Hind III векторной части плазмиды pUR 290 с затупленным Hind III концом, обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 в условиях, описанных выше. Лигазной смесью трансформируют компонентные клетки штамма E. coli Δ М 15, полученные методом обработки CACl₂. Трансформанты выращивают на чашках Петри, содержащих 50 мг/л ампициллина, в течение ночи при 37^оС. Клоны идентифицируют методом ДНК-ДНК-гибридизации и анализируют при помощи рестриктного анализа. В результате отбирают целевую плазмиду pUR 290 SΔ E, содержащую ген гибридного полипептида β-галактозидаза-NSI-белок ВКЭ, экспрессия которого контролируется сильным бактериальным промотором plac.

П р и м е р 2. Экспрессия гибридного полипептида β-галактозидаза NSI белок ВКЭ в клетках E.coli.

Клетки E. coli Δ М 15, трансформированные плазмидной ДЕК pUR 290 SΔ E, выращивают при 37^оС в LB-среде в присутствии ампициллина (50 мг/л) до оптической плотности 0,6 о.е. при 550 нм, а затем индуцируют plac-промотор добавлением в среду изопропил-β- тиогалактопиранозида (ИПТГ) до 1 мМ и продолжают инкубацию, отбирая аликвоты клеточной суспензии для анализа. Лизаты отобранных проб исследуют на появление в клетках белкового продукта с мол.м. 160 кД при помощи диск-электрофореза в 7,5% ПААГ с последующим окрашиванием геля Кумасси R-250. Для контроля на гель наносят лизаты клеток E. coli I ΔM 15, несущих плазмиду pUR 290 и отобранных до и после индукции plac-промотора. Подвижность белков в геле контролируют положением маркеров. В результате в клетках E.coli ΔМ 15 (pUR 290 ΔЕ) фиксируют эффективный синтез белкового продукта с ожидаемой мол.м. (160 кД) в условиях индукции промотора plac.

Наличие характерной для белка NSI ВКЭ полипептидной последовательности в полученном гибридном продукте доказывают при помощи иммуноферментного анализа с использованием в качестве NSI специфических антител поликлональной асцитной жидкости мышей, иммунизированных суммарным антигеном ВКЭ. В качестве ферментной метки, связывающейся с комплексом АГ-АТ, используют конъюгат белок А-пероксидаза хрена. В результате регистрируют эффективное связывание антител только с полученным гибридным полипептидом β-галактозидаза NSI-белок ВКЭ и минорными продуктами его частичного протеолиза в клетках E.coli.

Для доказательства сохранности ферментативной активности β-галактозидазы у полученного гибридного полипротеина клетки выращивают на чашке Петри в присутствии 0,2 мМ ИПТГ, 40 мкг/мл 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактозида (X-gal), 50 мкг/мл ампициллина. Выросшие колонии приобретают интенсивно-синюю окраску. Следовательно, β-галактозидазная активность сохранена и может быть использована для тестирования продукта при оптимизации условий культивирования бактериальных клеток-продуцентов.

Уровень синтеза полипептида β-галактозидаза-NSI-белок ВКЭ определяют следующим образом. 1 л культуры клеток выращивают до D₅₅₀=0,6, а затем индуцируют plac-промотор в условиях, описанных выше. Осаждают клетки центрифугированием при 8000 об/ми, 15 мин, 4^оС. Осадок суспендируют в 25 мл буфера PBS (50 мМ трис-НCl, рН 7,5, 0,1 М NaCl, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ β-меркаптоэтанол). Клетки разрушают ультразвуком (22 кГц, 20 импульсов по 10 с). Полученную суспензию центрифугируют при 15000 об/мин, 15 мин, 4^оС. Осадок ресуспендируют в 20 мл раствора 2М мочевины в буфере PBS. Смесь центрифугируют. Осадок суспендируют в 20 мл раствора 4М мочевины в PBS. Повторяют центрифугирование. Осадок ресуспендируют в 10 мл 4М мочевины, 0,5% додецилсульфата натрия в PBS-буфере. Повторяют центрифугирование. Супернатант отбирают и диализуют против раствора, содержащего 50 мМ трис-HCl (рН 7,5), 0,1 М NaCl. В результате получают 10 мл раствора полипептида -галактозидаза-NSI-белок ВКЭ. Степень очистки при таком способе выделения составляет не менее 95% что подтверждают при помощи диск-электрофореза в ПААГ. Концентрацию белка в полученном растворе определяют с помощью биуретового метода. Она составляет 8 мг/мл, т.е. из 1 л культуры получают 80 мг продукта.

Таким образом, получена плазмидная ДНК pUV 290 S Δ E, обуславливающая уровень синтеза не менее 80 мг/л культуры полноразмерного NSI-белка ВКЭ в составе гибридного полипротеина в трансформированных ею клетках E.coli. Получающийся белковый продукт обладает β-галактозидазной активностью, что весьма удобно для оптимизации условий культивирования клеток-продуцентов, а также сохраняет антигенные детерминанты вирусного белка NSI.

Claims (2)

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pUR 290 SΔE, кодирующая гибридный полипептид β галактозидаза NSI-белок вируса клещевого энцефалита, размером 6447 п.о. и мол.м. 4,25 МД, содержащая: Hin d III Sal I-фрагмент ДНК плазмиды pUR 290 размером 5200 п.о. Hind III-конец которого достроен фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1 E.coli; Alu I Msp I-фрагмент ДНК-плазмиды pTBE 2 размером 109 п.о. Alu I-конец которого заменен на Sal I-конец; Msp I Cfr 10 I-фрагмент ДНК-вируса клещевого энцефалита размером 572 п.о. Cfr 10 I Hind III фрагмент ДНК-плазмиды p621-11 размером 540 п.о. Hind III EcoRI синтетический фрагмент ДНК, включающий 3-концевой участок последовательности гена NSI вируса клещевого энцефалита размером 26 п.о. один участок расщепления рестрикции BamHI; один участок расщепления рестриктазы Sal I, расположенный на расстоянии 6 п.н. по часовой стрелке от BamHI-сайта; один участок расщепления рестрикции Hind III, расположенный на расстоянии 1230 п.н. по часовой стрелке от BamHI-сайта; два участка расщепления рестриктазы EcoRI, расположенных на расстоянии 0,21 т.п.н. и 6,39 т.п.н. по часовой стрелке от Bam HI-сайта; промотор plac и ген b -галактозидазы E.coli, расположенные в участке от 3382 до 6 п.н. по часовой стрелке от BamHI-сайта; ген NSI ВКЭ, расположенный в участке от 6 до 1256 п.н. по часовой стрелке от BamHI-сайта; генетические маркеры; bla-ген, обеспечивающий устойчивость к ампициллину.

2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pUR 290 SΔE, заключющийся в том, что Pst I Pst I ДНК-фрагмент плазмиды pTBE 2 размером 830 н.п. расщепляют последовательно рестриктазами Cfr 10 I и Msp I, выделяют Pst I Msp I и Msp I Cfr 10 I-фрагменты размером 203 и 572 п.н. соответственно, Pst I Msp I-фрагмент подвергают неполному гидролизу рестриктазой Alu I, выделяют Alu I Msp I-фрагмент размером 109 п.н. кДНК-фрагмент генома ВКЭ II размером 910 п.н. выделенный из плазмиды p621-11 гидролизом рестриктазой Hind III, расщепляют рестриктазой Cfr 10 I, выделяют Cfr 10 I Hind III-фрагмент размером 540 п.н. ДНК-плазмиды pUC 18 расщепляют рестриктазой Sal I, достраивают образовавшиеся липкие концы фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1 E. Coli и гидролизуют рестриктазой EcoRI, сшивают ДНК-лигазой фага Т4 с полученными Alu I Msp I-, Msp I Cfr 10 I-, Cfr 10 I Hind III-фрагментами кДНК генома ВКЭ и с синтетическим фрагментом ДНК, имеющим структуру
АГЦ ТТА ГТГ ЦГТ ТАТ ГТЦ ГТГ ГЦА ТГ
АТ ЦАЦ ГЦА АТА ЦАГ ЦАЦ ЦГТ АЦТ ТАА
лигазной смесью трансформируют клетки E.coli, отбирают клоны, устойчивые к ампициллину, ДНК отобранных клонов гидролизуют рестриктазой EcoRI, обрабатывают фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1 E.coli, расщепляют рестриктазой Sal I, выделяют фрагмент размером 1250 п.о. и клонируют его в плазмиде pUR 290, с помощью рестриктного анализа отбирают целевую плазмиду.