JP2008271967A - エルシニア・ペスティス及びシュードモナス・エルギノーサのｄｎａ複製をブロックする薬剤の開発のためのシステム - Google Patents

エルシニア・ペスティス及びシュードモナス・エルギノーサのｄｎａ複製をブロックする薬剤の開発のためのシステム Download PDF

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ブラード，ジェームス・エム
Nebojsa Janjic
ジャンジック，ナボイサ
Charles S Mchenry
マックヘンリー，チャールズ・エス
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Abstract

【課題】シュードモナス・エルギノーサとエルシニア・ペスティスの中心的なＤＮＡ複製装置を阻害する新規な治療剤の提供。
【解決手段】ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調させる化合物をスクリーニングする方法であって、ａ）レプリカーゼ活性に関して許容する条件下で少なくとも一つの試験化合物に単離されたレプリカーゼを接触させ；ｂ）試験化合物の存在下でレプリカーゼの活性を評価し；そしてｃ）試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性を試験化合物の不在下でのレプリカーゼの活性と比較するが、その際、試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性における変化が、レプリカーゼの活性を変調させる化合物の指標である。レプリカーゼは単離されたシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質である。
【選択図】図１

Description

発明の詳細な説明
連邦が後援する研究及び開発に関する陳述
ＭＰＥＰ ３１０の基での陳述。米国政府は、この発明における支払済のライセンスを有し、そして妥当な期間、他者に対して特許所有者がライセンスすることを必要とする限定された環境における権利を有し、ナショナルインスティチュートオブヘルス（ＮＩＨ）により授与されたＳＢＩＲ助成金１Ｒ４３ ＧＭ６４８５４−０１、並びにディフェンスアドバンスドリサーチプロジェクトエージェンシー（ＤＡＲＰＡ）助成金Ｎ６５２３６−０１−１−７４０２の合意により提供されるとおりである。
この発明の開発の間に実施された研究の一部は米国政府基金を利用した。米国政府はこの発明において一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、エルシニア・ペスティス（Yersinia pestis）及びシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）由来のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット及び構造遺伝子をコードする遺伝子及びアミノ酸配列、並びに各々の生物のための完全な染色体のＤＮＡ複製伸長システムの集合体に関する。本発明は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ分子を同定するのに有用な抗体及び他の試薬（reagents）も提供する。
発明の背景
ＤＮＡ複製。マクロ分子合成の他の多くの複雑な機構と同様に、ＤＮＡ複製の根本的な機構は生物を通じて保存されてきた。合成の化学及び方向、ＲＮＡプライマーの必要性、ラギング鎖上のオカザキフラグメントによる半保存的複製の機構及びよく規定された起点に関する要求が共通である（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．ａｎｄＢａｋｅｒ，Ｔ．Ａ．（１９９２）ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，２版、ＷＨＦｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。この文献、及び引用された他の文献は引用によりそれらの全体を編入する。複製装置の基本的な特徴も共通である。全ての複製システムは、主に、複製装置の残部との特異的蛋白質−蛋白質相互作用に関与することができるその能力により、その他とは識別される複製ポリメラーゼからなる。全ての細胞、原核生物及び真核生物の両者は、複数のＤＮＡポリメラーゼを含む。しかし、これらポリメラーゼの１セットのみで複製触媒サブユニットとして機能できる。真核生物においては、δポリメラーゼが主要なポリメラーゼである可能性が強い（Ｎｅｔｈａｎｅｌ，Ｔ．ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｇ．（１９９０）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６４，５９１２−５９１８）が、大腸菌においては、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのαサブユニットが重合ユニットとして働く。ポリメラーゼＩＩＩサブユニットは、遺伝子産物として及び個々のギリシャ文字により：α（ＤｎａＥ），ポリメラーゼ触媒ユニット；β（ＤｎａＮ），スライディングクランププロセッシビティー因子；ＤｎａＸ（τ（そして大腸菌及びサーマス・サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）においてはγ））；ＤｎａＸ複合体のＡＴＰａｓｅサブユニット；δ（ＨｏｌＡ）及びδ’（ＨｏｌＢ）、ＤｎａＸ複合体の必須の補助サブユニット。これら２つのポリメラーゼは、異なるクラスであり、そして蛋白質配列レベルでは検出可能な相同性を提供しない。別の鍵となる複製システム成分は、いわゆるスライディングクランプであり、複製システム上での高いプロセッシビティーを付与する（プロセッシビティーは鋳型解離−触媒−解離事象あたりに挿入されるヌクレオチドの数として定義される）。それは、ＤＮＡの回りを絞めるブレスレット形態の分子からなり、迅速にＤＮＡをスライドダウンすることを可能にさせるが、解離はしない。クランプは、蛋白質−蛋白質相互作用によりポリメラーゼに接近して、鋳型からそれが落ちるのを防ぐことにより、高いプロセッシビティーを保証する。原核生物及び真核生物のスライディングクランプは、それぞれ、βとＰＣＮＡである。酵母のＰＣＮＡと大腸菌のβの結晶構造はほとんど重ね合わせることができる（Ｋｏｎｇ，Ｘ．Ｐ．，Ｏｎｒｕｓｔ，Ｒ．，Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．，ａｎｄ Ｋｕｒｉｙａｎ，Ｊ．（１９９２）Ｃｅｌｌ ６９，４２５−４３７１７；Ｋｒｉｓｈｎａ，Ｔ．Ｓ．，Ｋｏｎｇ，Ｘ．Ｐ．，Ｇａｒｙ，Ｓ．，Ｂｕｒｇｅｒｓ，Ｐ．Ｍ．，ａｎｄ Ｋｕｒｉｙａｎ，Ｊ．（１９９４）Ｃｅｌｌ ７９，１２３３−１２４３１８）；しかし、上記２つの間の関係は構造レベル及び機能レベルにおいてのみである。蛋白質配列レベルにおいては、ＰＣＮＡとβの間に相同性はない。細菌及び真核生物の両方において、ＡＴＰ依存性反応にてプライマー末端上へスライディングクランプを移動させることに、５−蛋白質複合体が必須である（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｈ．，Ｋｗｏｎｇ，Ａ．Ｄ．，Ｐａｎ，Ｚ．Ｑ．，ａｎｄＨｕｒｗｉｔｚ，Ｊ．（１９９１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２６６，５９４−６０２；Ｂｕｎｚ，Ｆ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｒ．，ａｎｄ Ｓｔｉｌｌｍａｎ，Ｂ．（１９９３）ＰｒｏｃＮａｔｌ Ａｃａｄ ＳｃｉＵＳＡ ９０，１１０１４−１１０１８）。いくつかのサブユニットは真核生物と細菌の間で認識可能な配列相同性を呈するが、主に、保存されたＡＴＰ結合Ｎ−末端ドメインにおいてである。そこでさえ、リード化合物を細菌特性に最適化させることを可能にさせるべき、十分な相違が存在する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｆｒａｎｄｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．，ａｎｄＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．（１９９３）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７５，３８１２−３８２２；Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．，Ｏｎｒｕｓｔ，Ｒ．，Ｄｅａｎ，Ｆ．Ｂ．，Ｃｈｅｎ，Ｍ．，ａｎｄＨｕｒｗｉｚｔ，Ｊ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２１，１−３；Ｂｒｕｃｋ，Ｉ．ａｎｄ Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．（２９９９）ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５，２８９７１−２８９８３）。
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素は大腸菌の複製ポリメラーゼであり、染色体の大部分の合成に必須である（総説として、Ｋｅｌｍａｎ，Ｚ．ａｎｄＯ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．（１９９５）ＡｎｎｕＲｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６４，１７１−２００）。上記酵素の複製における役割は、生化学の基準及び遺伝学の基準の両方により確立されてきた。ホロ酵素は、天然染色体アッセイを使用して生化学上定義されて精製された。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのホロ酵素形態のみが他の公知の複製蛋白質の存在下でインビトロにおいて一本鎖バクテリオファージを効率よく複製する（Ｗｉｃｋｎｅｒ，Ｗ．ａｎｄＫｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．（１９７３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ７０，３６７−３６８３；Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｊ．ａｎｄ Ｗｉｃｋｎｅｒ，Ｓ．（１９７４）ＰｒｏｃＮａｔｌ Ａｃａｄ ＳｃｉＵＳＡ ７１，６−１０；ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．ａｎｄ Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．（１９７７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２５２，６４７８−６４８４）。バクテリオファージλプラスミド、バクテリオファージＭｕ及び大腸菌複製起点ｏｒｉＣを含む分子の複製において、上記ホロ酵素のみが機能する（Ｗｏｌｄ，Ｍ．Ｓ．，Ｍａｌｌｏｒｙ，Ｊ．Ｂ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｌｅｂｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｈ．，ａｎｄＭｃＭａｃｋｅｎ，Ｒ．（１９８２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ７９，６１７６−６１８０；Ｋａｇｕｎｉ，Ｊ．Ｍ．，Ｆｕｌｌｅｒ，Ｒ．Ｓ．，ａｎｄ Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９６，６２３−６２７；Ｋａｔａｙａｍａ，Ｔ．，Ｋｕｂｏｔａ，Ｔ．，Ｋｕｒｏｋａｗａ，Ｋ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｅ．，ａｎｄＳｅｋｉｍｉｚｕ，Ｋ．（１９９８）Ｃｅｌｌ ９４，６１−７１；Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｍ．ａｎＮａｋａｉ，Ｈ．（１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ １６，６８８６−６８９５）。ホロ酵素は１０のサブユニット：それぞれ１２９，９００、７１，０００、４７４，４００、４０６，００、３８７００、３６，９００、２６，９００、１６，６００、１５，０００及び８，８００ドルトンの、α、τ、γ、β、δ、δ’、ε、Ψ、χ及びθを含む。
遺伝学の研究も、ｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素に対する主要な複製の役割の割り当てを支持し、そしてさらに、抗細菌作用のための標的としてのそれを確認する。α触媒サブユニットの構造遺伝子であるｄｎａＥ内の温度感受性変異は条件致死性である（Ｇｅｆｔｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｈｉｒｏｔａ，Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ｔ．，Ｗｅｃｈｓｌｅｒ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄＢａｒｎｏｕｘ，Ｃ．（９７１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ６８，３１５０−３１５３）。同様に温度感受性の条件致死性変異が、それぞれ、βプロセッシビティー因子、ＤｎａＸ蛋白質及びεプルーフリーディングエキソヌクレアーゼをコードするｄｎａＮ，ｄｎａＸ及びｄｎａＱに関して単離された（Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，Ｙ．ａｎｄＭｉｚｕｋａｍｉ，Ｔ．（１９８０）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ １７８，５４１−５５３；Ｃｈｕ，Ｈ．，Ｍａｌｏｎｅ，Ｍ．Ｍ．，Ｈａｌｄｅｎｗａｎｇ，Ｗ．Ｇ．，ａｎｄＷａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｒ．（１９７７）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １３２，１５１−１５８；Ｈｅｎｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｃｈｕ，Ｈ．，Ｉｒｗｉｎ，Ｃ．Ａ．，ａｎｄＷａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｒ．（１９７９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９２，１０４１−１０５９；Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｔ．，Ｍａｋｉ，Ｈ．，Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．（１９７８）ＭｏｌＧｅｎ Ｇｅｎｅｔ １６３，２７７−２８３）。最後の５つのホロ酵素サブユニットの構造遺伝子は、リバースジェネティックスのアプローチにより同定された（Ｃａｒｔｅｒｅｔ ａｌ．，同じ箇所；Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｆｒａｎｄｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．，ａｎｄＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．（１９９２） Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７４，７０１３−７０２５；Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｆｒａｎｄｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．，Ｋｉｍ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２１，３２８１−３２８６；Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｆｒａｎｄｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．，ａｎｄＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．（１９９３）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７５，５６０４−５６１０；Ｄｏｎｇ，Ｚ．，Ｏｎｒｕｓｔ，Ｒ．，Ｓｋａｎｇａｌｉｓ，Ｍ．ａｎｄ Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．（１９９３）ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８，１１７７３−１１７７８）。これらは、それぞれ、δ、δ’、χ、Ψ及びθ遺伝子に関するこれらｈｏｌＡ−Ｅと命名された。最近、ｈｏｌＡ及びＢのノックアウト変異体は、δとδ’が細胞の生存に必須であることを示した（Ｓｏｎｇ，Ｍ．−Ｓ．，Ｐｈａｍ，Ｐ．Ｔ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｍ．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｆｒａｎｄｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ｓｃｈａａｐｅｒ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６，３５１６５−３５１７５）ことから、抗細菌剤の開発のための標的としてそれらと、ｄｎａＥ，ｄｎａＸ，ｄｎａＱ及びｄｎａＮを確認する。
大腸菌において同定された５つのＤＮＡポリメラーゼのうち、ｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素のみが主要な複製の役割を担うらしい。複製においてその唯一の役割を授与するｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素の特定の特徴とは何であろうか？これまでの研究は、迅速な伸長、高いプロセッシビティー、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質をコートされた長い一本鎖鋳型を利用する能力、生理学上のレベルの塩に対する耐性及び複製装置の他の蛋白質に相互作用する能力がその独特の機能に全て必須であることを示唆する。対照的に、他の非複製ポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼＩは、インビトロ又はインビボのどちらでも複製ポリメラーゼに有効に代ることができない（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ＆ Ｂａｋｅｒ，前と同じ箇所）。これは、それらの低いプロセッシビティー、それらの一致する遅い反応速度、及び複製フォークにおいて調整された反応の触媒を可能にさせるために他の複製蛋白質に相互作用することができないためである。
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素は、Ｍ１３Ｇｏｒｉ一本鎖ＤＮＡの二本鎖複製形態への変換により便利にアッセイされる（図１）。このアッセイは、細菌複製フォークにおける、ラギング鎖上のオカザキフラグメントの合成及びリーディング鎖上の伸長に必要な相互作用の全てを再現する。複製に先んじてＤＮＡの２つの鎖を離すのに必要なＤｎａＢヘリカーゼのみが無いのは、Ｇ４起点の機能のためにはそれが必要ないからである。このアッセイは、二重鎖ＤＮＡ産物へのインターカレート蛍光体の添加に際して生じる蛍光の増加を監視することにより、高処理量フォーマットに適合した（Ｓｅｖｉｌｌｅ，Ｍ．，Ｗｅｓｔ，Ａ．Ｂ．，Ｃｕｌｌ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２１，６６４−６７２）。
複数のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ形態。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素は一連の連続する単純な形態で生化学上溶解することができる。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩコアは、ε（３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性を有するプルーフリーディングサブユニット）とθに強固に複合したα触媒サブユニットを含む。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ’はコア＋τを含む。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩはｐｏｌＩＩＩ’＋ＤｎａＸγ複合体（γ，δδ’，χΨ）を含む。ホロ酵素はｐｏｌ ＩＩＩ＊＋βからなる。
プロセッシビティー。複数ポリメラーゼＩＩＩ形態のプロセッシビティーの研究はサブユニットの個々の寄与を明らかにした（Ｆａｙ，Ｐ．Ｊ．，Ｊｏｈａｎｓｏｎ，Ｋ．Ｏ．，ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．，ａｎｄＢａｍｂａｒａ，Ｒ．Ａ．（１９８１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５６，９７６−９８３；Ｆａｙ，Ｐ．Ｊ．，Ｊｏｈａｎｓｏｎ，Ｋ．Ｏ．，ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．，ａｎｄＢａｍｂａｒａ，Ｒ．Ａ．（１９８２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５７，５６９２−５６９９）。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの複数形態は、著しく異なるプロセッシビティーを呈する。コアのｐｏｌＩＩＩは、より生理学的な条件下で完全に別個になること（プロセッシビティー＝１）を減少させる低いイオン強度において低いプロセッシビティー（計算上１０塩基）を有する。上記ホロ酵素は、その半集合体の何れよりも桁違いに高いプロセッシビティーを呈する。一本鎖ファージによる注意深く制御された実験においては、全鋳型（約８０００ヌクレオチド）が３０℃において１５秒間で１回の進行事象にて合成される（Ｊｏｈａｎｓｏｎ，Ｋ．Ｏ．ａｎｄＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．（１９８２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５７，１２３１０−１２３１５）。ホロ酵素がプライモソームの成分と反応する共役された複製フォークシステムに関して、１５０−５５０ｋｂのプロセッシビティーが直接観察された（Ｗｕ，Ｃ．Ａ．，Ｚｅｃｈｎｅｒ，Ｅ．Ｌ．，ＨｕｇｈｅｓＪｒ，Ａ．Ｊ．，Ｆｒａｎｄｅｎ，Ｍ．Ａ．，ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．，ａｎｄ Ｍａｒｉａｎｓ，Ｋ．Ｊ．（１９９２）ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７，４０６４−４０７３）。これらの産物は、５００−７００ｎｔ／ｓの速度で合成される。即ち、相当する酵素形態の構造上の複雑性に匹敵するプロセッシビティーの進行が観察される。比較のため、細菌のＤＮＡポリメラーゼＩクラスの「修復種」のポリメラーゼのプロセッシビティーは典型的には１５−５０塩基である（Ｂａｍｂａｒａ，Ｒ．Ａ．，Ｕｙｅｍｕｒａ，Ｄ．，ａｎｄＣｈｏｉ，Ｔ．（１９７８）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２５３，４１３）。
βスライディングクランプの構造。Ｋｕｒｉｙａ，Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ及び共同研究者により解析されたβのＸ線結晶学構造（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，同じ箇所）は、その機能のための単純で上品な説明を提供する。βダイマーはブレスレット様構造を形成し、おそらくは中心の穴にＤＮＡを通し、ＤＮＡを素早くスライドダウンされることを可能にするが、容易に解離することを防ぐ。βと複製複合体の他の成分の間の蛋白質−蛋白質の接触は、ポリメラーゼをＤＮＡにつなぎ止め、そのプロセッシビティーを増加させる。強固に握られたブレスレットはＤＮＡを容易に解離しないと予測される。これは、エネルギー依存性クランプセッティング複合体、ＤｎａＸ複合体がプライマー末端を認識して、ＤＮＡの回りのβブレスレットを開いて閉じることの必要性を説明する。
開始複合体形成。高いプロセッシビティーを達成するため、ホロ酵素は、安定な開始複合体を形成するために、ＡＴＰ（又はｄＡＴＰ）及びプライムされたＤＮＡを要求する（Ｆａｙ，ｅｔａｌ．１９８１，同じ箇所）。開始複合体はゲル濾過により単離することができ、ｄＮＴＰｓの添加に際して、完全なＲＦＩＩ（複製形態ＩＩ、複製が完了した部位において１カ所のニックを含む二重鎖環状）を１０−１５秒間で解離することなしに形成する（Ｗｉｃｋｎｅｒ＆ Ｋｏｒｎｂｅｒ，同じ箇所；Ｈｕｒｗｉｔｚ ＆ Ｗｉｃｋｎｅｒ，同じ箇所；Ｊｏｈａｎｓｏｎ，Ｋ．Ｏ．ａｎｄ ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．（１９８０）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５５，１０９８４−１０９９０）。開始複合体の形成は、複製活性の抗β ＩｇＧ耐性への変換として実験上監視することができる（Ｃａｒｔｅｒ，ｅｔａｌ．，１９９２，同じ箇所；Ｊｏｈａｎｓｏｎ ＆ ＭｃＨｅｎｒｙ，同じ箇所、１９８０）。βは伸長に関与する；抗体は上記複合体中のβの侵入により抗体耐性が生じ、立体的に抗体の結合を排除する。
ＤｎａＸ複合体：プライムされたＤＮＡ上にβスライディングクランプをセットする装置。ＤｎａＸ蛋白質は、そのアミノ末端近傍においてコンセンサスＡＴＰ結合部位を含み（Ｙｉｎ，Ｋ．Ｃ．，Ｂｌｉｎｋｏｗａ，Ａ．，ａｎｄＷａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｒ．（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ）、δ−δ’−χ−Ψと共にＡＴＰに結合して加水分解するために使用され、プライマー末端上にβのプロセッシビティークランプを設置する。ＤｎａＸは、計算上２μＭの解離定数にてＡＴＰを結合し（Ｔｓｕｃｈｉｈａｓｈｉ，Ｚ．ａｎｄ Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．（１９８９）ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４，１７７９０−１７７）、そしてＤＮＡ−依存性ＡＴＰｓｅである（同じ箇所；Ｌｅｅ，Ｓ．Ｈ．ａｎｄＷａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｒ．（１９８７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ８４，２７１３−２７１７）。プライマーの末端は、ＡＴＰａｓｅのもっとも活性なエフェクターであるらしい（Ｏｎｒｕｓｔ，Ｒ．，Ｓｔｕｋｅｎｂｅｒｇ，Ｐ．Ｔ．，ａｎｄＯ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．（１９９１）ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６，２１６８１−２１６８６）。ｄｎａＸ遺伝子は、２つの関連する蛋白質、γとτを発現するが、γはτのアミノ末端の５／７を表す（Ｆｌｏｗｅｒ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ８７，３７１３−３７１７）。ＤｎａＸ（τ）は、αサブユニットＤＮＡポリメラーゼＩＩＩコアを結合して、二量体の足場を形成して、二量体化を引き起こし、他の補助蛋白質が集合して二量体複製複合体を形成する。インビトロにおいては、τ ＤｎａＸサブユニットが、プライムされたＤＮＡ上にβを負荷するように機能する「τ−複合体」（τ−Ψ−χ−δ−δ’）を容易に形成することができる（Ｄａｌｌｍａｎｎ，Ｈ．Ｇ．ａｎｄ ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．（１９９５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０，２９５６３−２９５６９；Ｏｎｒｕｓｔ，Ｒ．，Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，Ｊ．，Ｎａｋｔｉｎｉｓ，Ｖ．，Ｔｕｒｎｅｒ，Ｊ．，Ｆａｎｇ，Ｌ．，ａｎｄＯ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．（１９９５）ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０，１３３４８−１３３５７；Ｄａｌｌｍａｎｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｔｈｉｍｍｉｇ，Ｒ．Ｌ．，ａｎｄＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．（１９９５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０，２９５５５−２９５６２）。ＤｎａＸ複合体の化学量論を測定したところ、それがＤｎａＸ蛋白質３コピーと補助的なサブユニットの各１つを有することがわかった（ＤｎａＸ３δ１δ’１χ１Ψ１）（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ，Ａ．，Ｄａｌｌｍａｎｎ，Ｇ．，Ｇｌｏｖｅｒ，Ｂ．，ａｎｄＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．（２０００）ＥＭＢＯ Ｊ １９，６５３６−６５４５）。天然のホロ酵素中に含まれるＤｎａＸ複合体の形成は、τ２γδ１δ’１χ１Ψ１である。
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素の構造。図２は、ホロ酵素サブユニット−サブユニット相互作用の現在の認識を示す。αとεが混合に際して単離可能な複合体を形成する（Ｍａｋｉ，Ｈ．ａｎｄ Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．（１９８７）ＰｒｏｃＮａｔｌ Ａｃａｄ ＳｃｉＵＳＡ ８４，４３８９−４３９２）。εの構造遺伝子中の変異がｄｎａＥ（α）サブユニットを抑圧することもわかった（Ｍａｕｒｅｒ，Ｒ．，Ｏｓｍｏｎｄ，Ｂ．Ｃ．，ａｎｄ Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，Ｄ．（１９８４）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １０８，２５−３８）。抑圧変異は抑圧された変異遺伝子産物に直接相互作用するサブユニットの修飾を通してもっとも生じやすい。ｐｏｌＩＩＩコア（αεθ）は単離可能である（ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．ａｎｄＣｒｏｗ，Ｗ．（１９７９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２５４，１７４８−１７５３）。ＤｎａＸ（τ）はｐｏｌ ＩＩＩコアとの複合体中で単離することができる（ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．（１９８２）ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５７，２６５７−２６６３）。δとδ’の存在下で、ＤｎａＸはβをプライムされたＤＮＡに運ぶことにより、前開始（preinitiation）複合体を形成する（Ｂｒｙａｎ，Ｓ．，Ｈａｇｅｎｅｓｓｅｅ，Ｍ．，ａｎｄＭｏｓｅｓ，Ｒ．Ｅ．（１９９０）ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩＩ ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｉｎ Ｍｏｓｅｓ，Ｒ．ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｗ．，編纂．ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）。抑圧遺伝子のデータは、βとαの間の相互作用（Ｋｕｗａｂａｒａ，Ｎ．ａｎｄ Ｕｃｈｉｄａ，Ｈ．（１９８１）ＰｒｏｃＮａｔｌ Ａｃａｄ ＳｃｉＵＳＡ ７８，５７６４−５７６７）、コアのｐｏｌ ＩＩＩに相互作用してそのプロセッシビティーを増加させるβの能力により支持される概念（Ｌａｄｕｃａ，Ｒ．Ｊ．，Ｃｒｕｔｅ，Ｊ．Ｊ．，ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．，ａｎｄ Ｂａｍｂａｒａ，Ｒ．Ａ．（１９８６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６１，７５５０−７５５７）及びβとα触媒サブユニットのカルボキシル末端ドメインの間の相互作用の観察（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．（１９９６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１，２０６９９−２０７０４）を示唆する。α−αの相互作用及びｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素の二量体の性質に関する遺伝学上の証拠が、ｄｎａＥ１０２６とｄｎａＥ４８６又はｄｎａＥ５１１の間の対立遺伝子間の（interallelic）相補性を通して得られた（Ｂｙｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，同じ箇所）−もしもこの相互作用が起きたら、それは、弱くて、他のサブユニットの存在を必要とするに違いないが、それはα−α相互作用がインビトロにて観察されないからである。χとΨがＤｎａＸとの複合体中で単離された（Ｏｌｓｏｎ，Ｍ．Ｗ．，Ｄａｌｌｍａｎｎ，Ｈ．Ｇ．，ａｎｄＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．（１９９５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０，２９５７０−２９５７７；Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．ａｎｄ Ｓｔｕｄｗｅｌｌ，Ｐ．Ｓ．（１９９０）ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５，１１７９−１１８７）。δとδ’とはそれら自身で弱く溶液中で相互作用することができ、一緒になってＤｎａＸと相互作用することができる（Ｄａｌｌｍａｎｎ，＆ ＭｃＨｅｎｒｙ，同じ箇所；Ｏｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，同じ箇所；Ｏｎｒｕｓｔ，Ｒ．ａｎｄＯ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．（１９９３）ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８、１１７６６−１１７７２）。Ψとδ’は、見かけ上、ＤｎａＸに直接相互作用するサブユニットである（Ｏｎｒｕｓｔ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，同じ箇所）。直接のδ−βの相互作用が検出された（Ｎａｋｔｉｎｉｓ，Ｖ．，Ｏｎｒｕｓｔ，Ｒ．，Ｆａｎｇ，Ｌ．，ａｎｄ Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．（１９９５）ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０，１３３５８−１３３６５）。ホロ酵素中には３コピーのＤｎａＸ蛋白質が存在する（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ，ｅｔａｌ．，同じ箇所）。
種間のサブユニットの相同性。表１に示すとおり、細胞の複製システムの基本的な機構の特徴のいくつかは、原核生物でも真核生物でも用いられる。
にもかかわらず、顕著な配列上及び機能上の相違も存在する。一本鎖ＤＮＡ上の合成に必要なコア成分をコードする１１の遺伝子のうち、ｄｎａＸ（γとτをコードする）とｈｏｌＢ（δ’をコードする）のみが、真核生物の遺伝子と顕著な相同性を共有する（Ｃａｒｔｅｒ，ｅｔａｌ．，同じ箇所、（１９９３）；Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７５，３８１２−３８２２；Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，１９９３，同じ箇所）。それでさえ、相同性はコアのＡＴＰ結合部位に限られる。真核生物の制御装置に結合して制御する天然の阻害蛋白質（Ｗａｇａ，Ｓ．，Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．，Ｂｅａｃｈ，Ｄ．，ａｎｄＳｔｉｌｌｍａｎ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６９，５７４−５７８；Ｇｕｌｂｉｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｋｅｌｍａｎ，Ｚ．，Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｊ．，Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．，ａｎｄ Ｋｕｒｉｙａｎ，Ｊ．（１９９６）Ｃｅｌｌ８７，２９７−３０６）は、対応する原核生物の蛋白質に影響を及ぼさない。
即ち、それらのみで固有の活性を呈するそれらの少ししかない蛋白質に対して単純にスクリーニングすることにより可能であるはずのものよりも、新規な抗微生物剤の同定を可能にすることにおいては、より複雑な複数酵素システムのアプローチがより有効になると予測される。ホロ酵素−触媒性反応の間に蛋白質−蛋白質相互作用を変化させることを防いでそれらの検出を可能にさせる阻害剤を、単純な機能的リードアウトにより検出する複数酵素アッセイに関する要求がいまだ存在する。
細菌及び抗細菌薬剤。細菌の感染は主要な世界中の健康上の危険を代表し続けている（抗微生物剤の耐性を克服する（２０００）。世界保険機関、感染性疾患の報告（ＷＨＯ／ＣＤＳ／２０００．２））。感染は、相対的に無害な、例えば皮膚の発疹及び幼児に共通の耳の感染から、極めて重大且つ潜在的に致死性の、免疫上危険のある患者における感染までにわたる。我々は、薬剤耐性の院内で獲得された群集性の感染に直面することが増えた。スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、エンテロコッカス・エーカリス（Enterococcus aecalis）、ミコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）、及びシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）を含む、莫大で、臨床上重要な、薬剤耐性の細菌の最近の危険性により、緊急性が明白になりつつある。
抗微生物剤と耐性の機構。抗微生物剤は、生存に必須の細胞機能の主要なプロセスを干渉することにより細菌を殺す。β−ラクタム（ペニシリン及びセファロスポリン）及びグリコペプチド（バンコマイシン及びテイコプラニン）は、細胞壁の合成を阻害する。マクロライド類（エリスロマイシン、クラリスロマイシン、及びアジスロマイシン）、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、アミノグリコシド類（ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、及びアミカシン）及びテトラサイクリン類は蛋白質合成を阻害する。また、蛋白質合成を阻害するのは、合成アキサゾリジノン類であることが認められらた抗細菌剤の新規なクラス（ラインゾリド（linezolid））である。リファンピシンはＲＮＡ合成を阻害し、フルオロキノロン類（例えば、シプロフロキサシン）は、ＤＮＡのトポロジー状態を保持する酵素を阻害することにより間接にＤＮＡ合成を阻害する。トリメトプリンとスルフォナミド類は、必要とされるヌクレオチドの一つのプールを枯渇させることにより、葉酸生合成を直接、そしてＤＮＡ合成を間接に阻害する（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｈ．Ｆ．ａｎｄＳａｎｄｅ，Ｍ．Ａ．（１９９６）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ．Ｇｏｏｄｍａ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＢａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。
抗細菌剤耐性は薬剤の標的が変異した場合におこり得ることであり、機能はするが、薬剤によりもはやブロックされないか、又はそれらの特性を新規な薬剤に広げるような流出ポンプ（efflux pumps）の変異又は酵素の修飾によりもはやブロックされない。成長における利点のため、これは、抗細菌剤の存在下で耐性細胞及びその子孫を提供し、耐性生物は細菌集団を素早く支配する。一つの細胞において発生した耐性は集団中の他の細菌に伝達され得るが、それは、細菌が遺伝物質を直接交換する機構を有するからである。最近の議会の報告において、会計検査院（ＧＡＯ）は薬剤耐性細菌からもたらされる現在と未来の公共の健康上の負担を要約した（抗微生物耐性（１９９９）．会計検査院（ＧＡＯ／ＲＣＥＤ−９９−１３２））。この報告によれば、薬剤耐性細菌による感染のためにセッティングされた病院において治療された患者の数は、１９９４年から１９９６年に２倍になり、そして１９９６年から１９９７年に再び２倍になった。耐性株は、かなり多数の免疫上抑圧された患者を有する病院又は第三の介護施設のような環境において容易に広がり得る。同じＧＡＯ報告は、以前に影響されやすい細菌が、ますます耐性になって、全世界に広がるという明確な証拠も提供する。さらに、細菌集団内の耐性細菌の集団が増大する。特に驚くべき発生は、全て立証済みの抗細菌剤に耐性の細菌株の出現である。薬剤耐性細菌の劇的な増加を認識すると、食品医薬品局は最近、外科医に対して、より思慮分別をもって臨床上必要なときのみ抗細菌剤を使用することを促す勧告を発した（ＦＤＡアドバイザリー（２０００）。ＦｅｄｅｒａｌＲｅｇｉｓｔｅｒ ６５（１８２），５６５１１−５６５１８）。
最近まで、薬剤の開発者は、単純に存在する抗細菌剤を修飾することにより、新生の薬剤耐性細菌株に応答する傾向にあった。事実、後期に開発されたほとんどの抗細菌剤は臨床で既に使用された薬剤のアナログである。この戦略は有効性が低くなっており、それは、抗細菌剤クラスに対する耐性の基本的な機構が既に自然界に広がっているからである。同じクラスの新規な抗細菌剤に耐性を付与するための耐性標的のさらなる変異が、標的の遺伝子内での１塩基違いによりしばしばおこり得る。即ち、開発パイプライン中にある抗細菌剤の利用性は限られており、ヘルスケアの工業は、存在する薬剤とは機構上異なる新規な抗細菌剤の重要な要求を現在有する。
シュードモナス・エルギノーサ。シュードモナス・エルギノーサ感染を治療するためのより有効な薬剤に関する要求は緊急を要する。このグラム陰性細菌は、主に、植物及び動物からの組織、岩、土並びに合成物質、例えばコンタクトレンズ、外科手術用装置及びカテーテルを含む多くの異なる表面上で生育するその傾向のために、環境下に偏在する（Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｗ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｐ．Ｓ．，ａｎｄＧｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｅ．Ｐ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４，１３１８−１３２２）。シュードモナス・エルギノーサは、尿管の感染、火傷の犠牲及び呼吸器の患者における菌血症を含む様々な感染を引き起こす。病院において、シュードモナス・エルギノーサは全ての感染の約１／７の原因であり、複数薬剤耐性株が増加するのが普通である（Ｍａｓｃｈｍｅｙｅｒ，Ｇ．ａｎｄＢｒａｖｅｎｃｙ，Ｉ．（２０００）Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ＩｎｆｅｃｔＤｉｓ １９，９１５−９２５；Ｇｉａｍａｒｅｌｌｏｕ，Ｈ．ａｎｄ Ａｎｔｏｎｉａｄｏｕ，Ａ．（２００１）Ｍｅｄ Ｃｌｉｎ Ｍｏｒｔｈ Ａｍ ８５，１９−４２）。しかしながら、シュードモナス・エルギノーサにより引き起こされるほとんどの重大な医学上の問題は、嚢胞性繊維症（ＣＦ）に付随した肺感染である。ＣＦにおいては、膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）塩素チャネルをコードする遺伝子が変異して、肺の上皮細胞の先端の膜からの不十分な塩の除去を導く。気管の表面の塩の蓄積は、内在性の抗細菌ペプチド及び蛋白質の塩−媒介性阻害を含む、肺の様々な機能不全を導く。即ち、今度は、持続性のシュードモナス・エルギノーサ感染を導き、細菌の薄膜により引き起こされる肺の感染の物理的な障害並びに細菌により生産される抗原決定基により誘発される、免疫−媒介性の炎症性の肺組織への損傷をもたらす。ＣＦ患者の中間的な寿命の予測は約３０歳である。若いＣＦ患者の抗生物質による予防的な処置による初期の肺感染コロニー化は、肺の損傷を制御する実行可能な臨床上の戦略として現在試験されつつある（Ｊｏｈａｎｓｅ，Ｈ．Ｋ．，Ｋｏｖｅｓｉ，Ｔ．Ａ．，Ｋｏｃｈ，Ｃ．，Ｃｏｒｅｙ，Ｍ．，Ｈｏｉｂｙ，Ｎ．，ａｎｄＬｅｖｉｓｏｎ，Ｈ．（１９８０）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｐｕｌｍｏｎｏｌ ２６，８９−９６）。
シュードモナス・エルギノーサは、広い範囲の抗生物質に対して本来耐性であるが、それは一部には、その外膜が小分子（いくつかの抗生物質を含む）をペリプラズム空間へ移動させるのに作用する高透過性のポリン蛋白質を欠くためである（Ｎｉｋａｉｄｏ，Ｈ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６４，３８２−３８８）。さらに、シュードモナス・エルギノーサは、細胞内部での抗生物質の濃度を制限するのに共同で作用するいくつかの複数薬剤流出システムを有する（Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｒ．Ｅ．（１９９８）ＣｌｉｎＩｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２７ 補遺１，Ｓ９３−Ｓ９９；Ｗｅｓｔｂｒｏｃｋ−Ｗａｄｍａｎ，Ｓ．，Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｒ．，Ｈｉｃｋｅｙ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｏｕｌｔｒ，Ｓ．Ｎ．，Ｚｈｕ，Ｙ．Ｑ．，Ｗａｒｒｅｎｅｒ，Ｐ．，Ｋｇｕｙｅｎ，Ｌ．Ｙ．，Ｓｈａｗａｒ，Ｒ．Ｍ．，Ｆｏｌｇｅｒ，Ｋ．Ｒ．，ａｎｄＳｔｏｖｅｒ，Ｃ．Ｋ．（１９９９）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４３，２９７５−２９８３）。別の流出システムは、最近完了したシュードモナス・エルギノーサのゲノムのＢＬＡＳＴ分析において明らかである（Ｓｔｏｖｅｒ，Ｃ．Ｋ．，Ｐｈａｍ，Ｘ．Ｑ．，Ｅｒｗｉｎ，Ａ．Ｌ．，Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ，Ｓ．Ｄ．，Ｗａｒｒｅｎｅｒ，Ｐ．，Ｈｉｃｋｅｙ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｒｉｎｋｍａｎ，Ｆ．Ｓ．Ｌ．，Ｈｕｆｎａｇｌｅ，Ｗ．Ｏ．，Ｋｏｗａｌｉｋ，Ｄ．Ｊ．，Ｌａｇｒｏｕ，Ｍ．，Ｇａｒｂｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｇｏｌｔｒｙ，Ｌ．，Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ，Ｅ．，Ｗｅｓｔｂｒｏｃｋ−Ｗａｄｍａｎ，Ｓ．，Ｙｕａｎ，Ｙ．，Ｂｒｏｄｙ，Ｌ．Ｌ．，Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｓ．Ｎ．，Ｆｏｌｇｅｒ，Ｋ．Ｒ．，Ｋａｓ，Ａ．，Ｌａｒｂｉｇ，Ｋ．，Ｌｉｍ，Ｒ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．，Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．，Ｗｏｎｇ，Ｋ．−Ｓ．，Ｗｕ，Ｚ．，Ｐａｕｌｓｅｎ，Ｉ．Ｔ．，Ｒｅｉｚｅｒ，Ｊ．，Ｓａｉｅｒ，Ｍ．Ｈ．，Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｒ．Ｅ．，Ｗ．，Ｌｏｒｙ，Ｓ．，ａｎｄＯｌｓｏｎ，Ｍ．Ｖ．（２０００）Ｎａｔｕｒ ４０６，９５９−９６４）。抗生物質の不十分な取り込みと十分な流出の問題と戦う一つの方法は、希薄なために有効な阻害のために相対的にほとんど薬剤を必要としない標的を選択することである。細菌細胞中には５−１０未満のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素分子しか存在しない（Ｗｕ，Ｙ．Ｈ．，Ｆｒａｎｄｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ｈａｗｋｅｒ，Ｊｒ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．（１９８４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５９，１２１１７−１２１２２）。さらに、ホロ酵素の基質であるゲノミックＤＮＡも希薄である。複製フォークの過剰か又は延期された失速（stalling）はヌクレアーゼ及び細胞死による鋳型の破壊を導く（Ｎａｋａｙａｍａ，Ｋ．，Ｋｕｓａｎｏ，Ｋ．，Ｉｒｉｎｏ，Ｎ．，ａｎｄＮａｋａｙａｍａ，Ｈ．（１９９４）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２４３，６１１−６２０）。即ち、極めてわずかな分子のみが細菌細胞のＤＮＡ複製能力を破壊するために不活性化される必要があり、そして複製システムを標的とする抗細菌細胞がシュードモナス・エルギノーサの感染の治療のために特別うまく適合させられるかもしれない。
エルシニア・ペスティス。エルシニア・ペスティスは、１４世紀に約１７００から２８００万のヨーロッパ人（計算上、全人口の３分の１）を殺した歴史に残る「ペスト」の病原菌である（Ｔｕｃｈｍａｎ，Ｂ．Ｗ．（１９７８）ＡＤｉｓｔａｎｔ Ｍｉｒｒｏｒ：Ｔｈｅ Ｃａｌａｍｉｔｏｕｓ １４ｔｈ Ｃｅｎｔｕｒｙ，ＲａｎｄｏｍＨｏｕｓｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，５章；Ｒａｏｕｌｔ，Ｄ．，Ａｂｏｕｄｈａｒａｍ，Ｇ．，Ｃｒｕｂｅｚｙ，Ｅ．，Ｌａｒｒｏｕｙ，Ｇ．，Ｌｕｄｅｓ，Ｂ．，ａｎｄＤｒａｎｃｏｕｒｔ，Ｍ，（２０００）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９７，１２８００−１２８０３）。ペストは動物源性感染である；当該疾患は齧歯類集団の主なひとつであり、保有宿主を保持するためにヒトに依存しない（Ｋｅｅｌｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄＧｉｌｌｉｇａｎ，Ｃ．Ａ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０７，９０３−９０６；ＭｃＧｏｖｅｒｎ，Ｔ．ａｎｄＦｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ，Ａ．（１９９７）Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｗａｒｅｆａｒｅ．Ｂｏｒｄｅｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｗａｌｔｅｒ Ｒｅｅｄ Ａｒｍｙ ＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，２３章）。感染した動物からのブラッドミールを摂取する際に、ノミがエルシニア・ペスティスの成長をサポートし、繊維性の塊によりノミの前腸を結果的にブロックする。感染したノミが再び給餌しようとすると、凝固した血液と細菌を罹病者の血流に吐き出して、感染症を次の動物に移す。
ヒトはエルシニア・ペスティス感染の非本質的な（accidental）宿主である。エルシニア・ペスティスの特定の病原性の株が動物間で流行するようになると、問題は悪化して、天然の齧歯類集団を殺して、ノミにあまり好ましくない宿主をつきまとわさせる。ヒトの感染に際し、インキュベーション相の間に、エルシニア・ペスティスの桿菌（bacilli）がリンパ節に広がり、リンパ節炎と腺ペスト（bubonic plaque）の特徴的な膨張したリンパ節を生じさせる。未治療の感染物は敗血症に進行して、膵臓、肝臓、肺、皮膚及び粘膜を含む、他の器官に広がる。主な肺ペストは噴霧器の直接の吸入によりもたらされ得る。これは、当該疾患のもっとも重度の形態をもたらしてもっとも早く致命的になるが、それは、吸入した飛沫が、哺乳類宿主において３７℃にて生育する間に発生する桿菌の病原菌耐性形態を含むからである。主な敗血性ペストは桿菌の血流への直接の接種からおこり得て、リンパ節における初期増殖を迂回する。
エルシニア・ペスティスは、桿菌形態の、非運動性の、非胞子形成性の、グラム陰性の、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）のガンマ門のオプションの嫌気菌である。それは、必須の病原性遺伝子をコードするために、染色体外プラスミドに依存する。当該細菌は、ほぼ凍結する温度において数カ月から数年生存したままであり得る。それは、乾燥した唾液、ノミの糞及び埋葬された体の中でも生存可能であるが、太陽光に数時間暴露されると死滅する。野生型の細菌は標準的な抗微生物剤、特にストレプトマイシン及びテトラサイクリン誘導体に感受性である（ＭｃＧｏｖｅｒｎ＆ Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ，同じ箇所）。オフロキサシンとセフトリアゾンは動物モデルにおいて有効であることが示された（同じ箇所）。エルシニア・ペスティスの天然に生じる株が単離され、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン及びスルフォナミド類に耐性である。移動可能なプラスミドにマップされた耐性要素（Ｇａｌｉｍａｎｄ，Ｍ．，Ｇｕｉｙｏｕｌｅ，Ａ．，Ｇｅｒｂａｕｄ，Ｇ．，Ｒａｓｏａｍａｎａｎａ，Ｂ．，Ｃｈａｎｔｅａｕ，Ｓ．，Ｃａｒｎｉｅｌ，Ｅ．，ａｎｄＣｏｕｒｖａｌｉｎ，Ｐ．（１９９７）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３３７，６７７−６８０）。有毒な桿菌の死滅懸濁液から製剤されたワクチンは利用可能である（ＭｃＧｏｖｅｒｎ＆ Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ，同じ箇所）。通常のワクチンの用量のスケジュールは６カ月の免疫コースに従う。１４日間を要する加速されたプロトコルが開発されたが、有効性に関する重要なサポートデータは利用可能でない（同じ箇所）。
エルシニア・ペスティスは顕著な脅威を示す。天然の固有の脅威として、世界保健機関はそれを再出現した感染性疾患として分類した。毎年の世界における薬剤耐性株の検出及び突然の出現によれば、重大な自然の脅威を象徴する（Ｂｏｉｓｉｅｒ，Ｐ．，Ｒａｓｏｌｏｍａｈａｒｏ，Ｍ．，Ｒａｎａｉｖｏｓｏｎ，Ｇ．，Ｒａｓｏａｍａｎａｎａ，Ｂ．，Ｒａｋｏｔｏ，Ｌ．，Ａｎｄｒｉａｎｉｒｉｎａ，Ｚ．，Ａｎｄｒｉａｍａｈｅｆａｚａｆｙ，Ｂ．，ａｎｄＣｈａｎｔｅａｕ，Ｓ．（１９９７）Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｉｎｔ Ｈｅａｌｔｈ ２，４２２−４２７；Ｂａｒｒｅｔｏ，Ａ．，Ａｒａｇｏｎ，Ｍ．，ａｎｄＥｐｓｔｅｎ，Ｐ．Ｒ．（１９９５）Ｌａｎｃｅｔ ３４５，９８３−９８４）。生物兵器として使用されて配達されて噴霧器として吸引されるため、エルシニア・ペスティスは、当該細菌が自然界で生じる風土病の肺の症候群の特徴を生じる。１４世紀の悪名高いペストの突然の出現は、生物兵器としてのエルシニア・ペスティスの使用の結果として始まった。１３４６年に、カッファのジェノバの北部黒海の港の攻城期間の間、その市の壁を越えて致死性の疾患に圧倒されていた死んだ兵士をモンゴル人が捕らえることにより、その耐性を遮断した。当該疾患が市の内部に素早く拡散するにつれて、居住者は商船によりヨーロッパへ逃れた（Ｔｕｃｈｍａｎ，同じ箇所）。食作用に耐性の形態にて構成的に操作されたエルシニア・ペスティスの薬剤耐性形態は、免疫の監視に一部打ち勝つために修飾されたカプセルと共に、驚くべき可能性を表す。薬剤耐性の機構は全ての臨床上利用可能な抗細菌剤に関して今判明して（以下のセクションを参照）、細菌を操作することも可能であり、それによりそれらがこれらの薬剤に耐性になる。報告が大衆的な出版物に現れ、以前のソビエト連邦の亡命者を起源として、ソビエト連邦が生物戦争の目的でエルシニア・ペスティスの薬剤耐性株を開発するための５年間のプログラムを有した（ＭｃＧｏｖｒｎ＆ Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ，同じ箇所；Ｂａｒｒｙ，Ｊ．（１９９３）Ｎｅｗｓｗｅｅｋ（２月１日），４０−４１）。この脅威を避けるための一つの可能な方法は、耐性機構がまだ判明していない新規な標的機能する抗細菌剤の新規なクラスを開発することである。
したがって、シュードモナス・エルギノーサとエルシニア・ペスティスの中心的なＤＮＡ複製装置を阻害する新規な治療剤を発見するための染色体複製システムに関する要求が残されている。
発明の概要
本発明は、細菌のＤＮＡレプリカーゼの活性を変調させる化合物をスクリーニングするための方法を提供する。一つの態様において、上記の方法は、レプリカーゼ活性に関して許容する条件下で少なくとも一つの試験化合物を単離されたレプリカーゼと接触させ；当該試験化合物の存在下で上記レプリカーゼの活性を評価し；そして、試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性を試験化合物の不在下でのレプリカーゼの活性と比較することを含み、その際の試験化合物存在下でのレプリカーゼの活性の変化がレプリカーゼの活性を変調する化合物の指標であり、但し、上記レプリカーゼは単離されたエルシニア・ペスティス又はシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質を含む。
別の態様において、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調する化合物を同定する方法を提供し、上記方法は、ＤＮＡ鋳型分子、ＤｎａＧプライマーゼ、ＤＮＡポリメラーゼαサブユニット、候補化合物、ＮＴＰｓ及びｄＮＴＰｓの混合物、及び任意に、βサブユニット、τ複合体、及びβサブユニットとτサブユニットの両方の複合体からなる群から選択されるメンバーを含む反応混合物を形成することによりレプリカーゼを形成させ、候補化合物の不在下で核酸の重合を達成するのに有効な条件に上記反応混合物を供し、試験化合物存在下でのレプリカーゼの活性を試験化合物不在下でのレプリカーゼの活性を比較するが、その際、試験化合物存在下でのレプリカーゼの活性の変化がレプリカーゼの活性を変調する化合物の指標であり、但し、上記レプリカーゼは単離されたエルシニア・ペスティス又はシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質を含む。
本発明は、これらの方法により同定された細菌のＤＮＡレプリカーゼの活性を変調する化合物も含む。
本発明の別の態様は、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ蛋白質サブユニットの機能活性を検出するための方法である。好ましい方法は、ａ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット蛋白質を含む疑いのある試験サンプルを用意し；そして、ｂ）サンプル中の試験ホロ酵素サブユニットの活性を、対照の中の定量されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のサブユニットと比較することにより、サンプル中の試験ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットの相対活性を測定することを含む、活性の検出である。一つの態様において、上記の活性は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩαサブユニットの検出のためのポリメラーゼギャップフィリング活性である。別の態様において、上記の活性は、βサブユニットの検出のためのＤＮＡポリメラーゼのプロセッシビティーの刺激である。別の態様において、上記の活性は、ＤｎａＡの検出のためのｄｎａＡボックスへの結合である。他の態様において、ＤｎａＸサブユニットは、再構成アッセイにおいてＤＮＡポリメラーゼのプロセッシビティーを刺激することができる。別の態様において、δ’サブユニットは、再構成アッセイにおいてＤＮＡポリメラーゼのプロセッシビティーを刺激することができる。別の態様において、δサブユニットは、再構成アッセイにおいてＤＮＡポリメラーゼのプロセッシビティーを刺激することができる。そのような方法の例は実施例のセクションに見いだされる。
本発明は、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼホロ酵素のレプリカーゼ活性を阻害する抗細菌性薬剤の候補をスクリーニングする方法も提供する。この方法は、ａ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素複製を阻害すると予測される試験阻害剤を用意し、ｂ）試験するＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ複製反応と対照の反応を検出し、そしてｃ）試験と対照を比較することを含むが、その際、複製の量が試験阻害剤の阻害効果と相関する。
本発明は、シュードモナス・エルギノーサ、シュードモナス・エルギノーサ遺伝子及び核酸分子由来のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットをコードする遺伝子及びアミノ酸の配列に関し、そのような蛋白質をコードするものを含み、そしてそのような蛋白質に対して生じさせた抗体にも関する。本発明は、エルシニア・ペスティス、エルシニア・ペスティス遺伝子及び核酸分子由来のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットをコードする遺伝子及びアミノ酸の配列に関し、そのような蛋白質をコードするものを含み、そしてそのような蛋白質に対して生じさせた抗体にも関する。本発明は、そのような蛋白質、核酸分子及び抗体を得るための方法も含む。
本発明の一つの態様は、ＤｎａＥ，ＤｎａＮ，ＤｎａＸ，ＨｏｌＡ，及びＨｏｌＢを含む、単離されたシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ蛋白質を含む。好ましいシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ蛋白質は、機能アッセイにおいてそのサブユニットの機能を実行可能である。一つの態様において、ＤｎａＥは、プライムされたＤＮＡをギャップフィリングポリメラーゼアッセイにおいて伸長できる。別の態様において、ＤｎａＮは、プロセッシビティー刺激アッセイにおいてＤＮＡポリメラーゼのプロセッシビティーを刺激することができる。別の態様において、ＤｎａＸは、ＤＮＡ依存様式においてＡＴＰを加水分解できる。別の態様において、ＨｏｌＡとＨｏｌＢはＤｎａＸ存在下で、プライムされたＤＮＡ鋳型上にＤｎａＮを負荷する（load）ことができる。別の態様において、ＤｎａＥ，ＤｎａＮ，ＤｎａＸ，ＨｏｌＡ及びＨｏｌＢは、ＲＮＡ−又はＤＮＡ−プライムされた長い一本鎖ＤＮＡ鋳型上で迅速かつプロセッシブなＤＮＡ合成を実施することができる機能性ＤＮＡレプリカーゼを集合させることができる。本発明は、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ蛋白質の融合蛋白質及びその類似体（mimetopes）並びにシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ蛋白質又はその類似体（mimetopes）に選択的に結合する単離された抗体にも関する。また、組換え方法を含む、本発明の蛋白質、類似体及び抗体を生産するための方法も含まれる。
本発明の別の態様は、ストリンジェントな条件下で、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤｎａＥ遺伝子、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤｎａＮ遺伝子、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤｎａＱ遺伝子、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＨｏｌＥ遺伝子、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤｎａＸ遺伝子、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのｈｏｌＡ遺伝子、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのｈｏｌＢ遺伝子、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのｈｏｌＣ遺伝子、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのｈｏｌＤ遺伝子、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのｓｓｂ遺伝子、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤｎａＧ遺伝子とハイブリダイズする単離されたシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスの核酸分子である。
エルシニア・ペスティスのｄｎａＥ遺伝子は、核酸配列、配列番号：１を含むことが好ましい；エルシニア・ペスティスのｄｎａＮ遺伝子は、核酸配列、配列番号：１８を含むことが好ましい；エルシニア・ペスティスのｄｎａＱ遺伝子は、核酸配列、配列番号：８を含むことが好ましい；エルシニア・ペスティスのｈｏｌＥ遺伝子は、核酸配列、配列番号：１３を含むことが好ましい；エルシニア・ペスティスのｄｎａＸ遺伝子は、核酸配列、配列番号：２３を含むことが好ましい；エルシニア・ペスティスのｈｏｌＡ遺伝子は、核酸配列、配列番号：３３を含むことが好ましい；エルシニア・ペスティスのｈｏｌＢ遺伝子は、核酸配列、配列番号：３８を含むことが好ましい；エルシニア・ペスティスのｈｏｌＣ遺伝子は、核酸配列、配列番号：４３を含むことが好ましい；エルシニア・ペスティスのｈｏｌＤ遺伝子は、核酸配列、配列番号：４８を含むことが好ましい；エルシニア・ペスティスのｓｓｂ遺伝子は、核酸配列、配列番号：５３を含むことが好ましい；エルシニア・ペスティスのｄｎａＧ遺伝子は、核酸配列、配列番号：５８を含むことが好ましい。
シュードモナス・エルギノーサのｄｎａＥ遺伝子は、核酸配列、配列番号：６５を含むことが好ましい；シュードモナス・エルギノーサのｄｎａＮ遺伝子は、核酸配列、配列番号：１１２を含むことが好ましい；シュードモナス・エルギノーサのｄｎａＱ遺伝子は、核酸配列、配列番号：７５を含むことが好ましい；シュードモナス・エルギノーサのｄｎａＸ遺伝子は、核酸配列、配列番号：８０を含むことが好ましい；シュードモナス・エルギノーサのｈｏｌＡ遺伝子は、核酸配列、配列番号：８５を含むことが好ましい；シュードモナス・エルギノーサのｈｏｌＢ遺伝子は、核酸配列、配列番号：９０を含むことが好ましい；シュードモナス・エルギノーサのｈｏｌＣ遺伝子は、核酸配列、配列番号：９５を含むことが好ましい；シュードモナス・エルギノーサのｓｓｂ遺伝子は、核酸配列、配列番号：１０７を含むことが好ましい；シュードモナス・エルギノーサのｄｎａＧ遺伝子は、核酸配列、配列番号：１０２を含むことが好ましい。
本発明のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ核酸分子は、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ遺伝子の制御領域を含むことができ、及び／又はシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ蛋白質をコードすることができる。
本発明は、本発明のシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ核酸分子の少なくとも一部を含む組換え分子及び組換え細胞にも関する。また、そのような核酸分子、組換え分子及び組換え細胞を生産するための方法も含まれる。
本発明は、本発明のアミノ酸配列によりコードされる蛋白質上の少なくとも一つの抗原決定基に特異的に結合することができる抗体も提供する。本発明の抗体は、様々な免疫源を用いて製造してよい。一つの態様において、免疫源がＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニットペプチドであることにより、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニットを認識する抗体が生成される。そのような抗体は、限定ではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ断片及びＦａｂ発現ライブラリーを含む。当業界で知られている様々な手法を、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニットに対するポリクローナル又はモノクローナル抗体の生産に使用してよい。
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩを含むと推測されるサンプル及びＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの少なくとも一部に対して特異的に結合することができる抗体を何れかの順序で用意し；抗体がＤＮＡポリメラーゼＩＩＩに結合できる条件下でサンプルと抗体を混合し；そして結合を検出することを含む。上記方法の好ましい態様において、サンプルは、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスである。
本発明は、抗−ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素及び抗−ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット抗体を生産する方法も提供し、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットの少なくとも一つの抗原性部分を含む免疫源に、免疫コンピテント細胞を有する動物を暴露する。一つの態様において、上記方法は、抗体を回収する工程をさらに含む。別の態様において、上記方法は、ハイブリドーマが生産される条件下で免疫コンピテント細胞を不死の細胞系と融合させる工程を含む。
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素、又はＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットの少なくとも一部をコードする核酸分子を生物学上のサンプル中で検出する方法も提供し、ａ）本発明の核酸分子の少なくとも一部を生物学上のサンプルの核酸物質にハイブリダイズさせ、それにより、ハイブリダイゼーション複合体を形成させ、そして、ｂ）ハイブリダイゼーション複合体を検出するが、その際、複合体の存在が生物学上のサンプルの中のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットの少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドの存在と相関する、工程を含む。上記方法の別の好ましい態様において、生物学上のサンプルの核酸物質は、ポリメラーゼ鎖反応により増幅される。
本発明は、異常か又は変異したＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット又は遺伝子配列を含む、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットを検出する方法も提供し、ａ）適宜、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットを含むと推測される試験サンプルを用意し；そして、ｂ）試験ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットを、対照中の定量されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットと比較することにより、サンプル中の試験ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットの相対濃度を測定する工程を含む。さらに、上記方法は、試験サンプル又は対照サンプル中のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットの相対濃度を測定するためのあらゆる適切な手段を用いて実施してよい。
この発明は、全シュードモナス・エルギノーサ染色体のＤＮＡ複製伸長システムの集合のための方法を提供する。この発明は、シュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素の予測される５つの中心的に重要な成分の発現と精製のための方法も提供する。この発明は、シュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素の９つの成分の発現と精製のための方法も提供する。この発明は、さらに、シュードモナス・エルギノーサの最小のプロセッシブなレプリカーゼを提供する。この発明は、シュードモナスのＤＮＡ複製の阻害剤として活性な化合物を同定するための高処理量のスクリーニングフォーマット内の完全に再構成されたシュードモナス・エルギノーサの複製システムの使用のための方法も提供する。
この発明は、全エルシニア・ペスティス染色体のＤＮＡ複製伸長システムの集合のための方法を提供する。この発明は、エルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素の予測される５つの中心的に重要な成分の発現と精製のための方法も提供する。この発明は、エルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素の９つの成分の発現と精製のための方法も提供する。この発明は、さらに、エルシニア・ペスティスの最小のプロセッシブなレプリカーゼを提供する。この発明は、ＹｅｒｓｉｎｉａのＤＮＡ複製の変調剤として活性な化合物を同定するための高処理量のスクリーニングフォーマット内の完全に再構成されたエルシニア・ペスティスの複製システムの使用のための方法も提供する。
発明は、複製ポリメラーゼをコードする遺伝子であるシュードモナス・エルギノーサ及びエルシニア・ペスティスのｄｎａＥの分子クローニング、大腸菌内でのＤｎａＥの発現、その精製、及びその内在のギャップフィリング活性の特性決定のための方法も提供する。
発明は、細菌レプリカーゼのスライディングクランププロセッシビティー因子をコードする遺伝子であるシュードモナス・エルギノーサ及びエルシニア・ペスティスのｄｎａＮの分子クローニング、大腸菌内でのＤｎａＮの発現、その精製、及びＤｎａＥに相当するプロセッシビティーへの貢献のその特性決定のための方法も提供する。
発明は、ＤＮＡ−依存性ＡＴＰａｓｅクランプローダーをコードする遺伝子であるシュードモナス・エルギノーサ及びエルシニア・ペスティスのｄｎａＸ，ＤｎａＸ複合体の必須アクセサリーサブユニットをコードする遺伝子であるシュードモナス・エルギノーサ及びエルシニア・ペスティスのｈｏｌＡ及びｈｏｌＢの分子クローニング、大腸菌内でのｈｏｌＡ及びｈｏｌＢの発現及びそれらの精製のための方法も提供する。
発明は、エルシニア・ペスティスのｈｏｌＣ及びｈｏｌＤ，ｓｓｂ，及びｄｎａＧ遺伝子の分子クローニング及び大腸菌内でのＨｏｌＣ，ＨｏｌＤ，ＳＳＢ，及びＤｎａＧ蛋白質の発現及びそれらの精製のための方法も提供する。
発明は、プライムされた一本鎖鋳型上で迅速かつプロセッシブなＤＮＡ合成が可能なシュードモナス・エルギノーサ及びエルシニア・ペスティス由来の最小ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素を再構成するため、及び複製乗法標的スクリーニング（Multiplicative Target Screening（商標））アッセイに対して再構成された酵素を適合させるための上記蛋白質の使用方法も提供する。
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、シュードモナス・エルギノーサとエルシニア・ペスティス由良のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットをコードする遺伝子及びアミノ酸の配列及び構造遺伝子に関する。本明細書において使用される用語「遺伝子」は、核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を意味し、ポリペプチド又は前駆体の生産に必要なコーディング配列を含む（例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット）。上記ポリペプチドは、完全長又は断片の所望の活性又は機能特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達等）が残っている限り、完全長のコーディング配列又はコーディング配列の如何なる部分によってもコードされ得る。上記用語は、構造遺伝子のコーディング領域と、遺伝子が完全長のｍＲＮＡの長さに相当するように何れかの末端上で約１ｋｂの距離で５’及び３’の両末端上でコーディング領域に隣接するように位置する配列も含む。用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡ形態及びゲノミック形態の両方を包含する。遺伝子のゲノミック形態は、「介在（intervening）領域」又は「介在配列」と呼ばれる非コーディング配列により遮断されたコーディング領域を含む。ｍＲＮＡは、翻訳の間、発生するポリペプチドの配列又は順番を特定するために機能する。本明細書にて、用語「ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素」は、完全なＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの実在物（即ち、ポリメラーゼサブユニット、並びにプロセッシブな染色体又はゲノムの複製に必要な他の付随するアクセサリー蛋白質の全て）を意味するが、「ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ」はポリメラーゼのコアのみである大腸菌においてはα、ε、θサブユニット］。本明細書にて使用される「ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット」は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素を含むサブユニット実在物の何れかに関して使用される。即ち、用語「ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素」は、「ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ」及び「ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット」を包含する。サブユニットは、限定ではないが、ＤｎａＥ，ＤｎａＮ（ベータ（β）プロセッシビティー因子），ＤｎａＸ，ＨｏｌＡ，ＨｏｌＢ，ＳＳＢ，ＤｎａＧ及びＤｎａＢ蛋白質を含む。本明細書にて使用される「アミノ酸配列」が天然に生じる蛋白質分子のアミノ酸配列を意味する場合、「アミノ酸配列」及び類似の用語、例えば「ポリペプチド」又は「蛋白質」は、アミノ酸配列を、記載された蛋白質に関連する完全な天然のアミノ酸配列に限定することを意味しない。
アミノ酸配列及び蛋白質
本発明の一つの態様は、単離されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット蛋白質である。本発明によれば、単離されたか、又は生物学上純粋な蛋白質は、その天然の環境から取り出された蛋白質である。そうゆうものとして、「単離された」と「生物学上純粋な」は、蛋白質が精製された程度を必ずしも反映しない。本発明の単離されたシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットは、天然源から得ることができるか、組換えＤＮＡ技術を用いて生産することができるか、又は化学合成により生産することができる。本明細書にて使用される単離されたシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット蛋白質は、そのような蛋白質の完全長蛋白質又はあらゆる相同物であり得る。本発明の好ましいＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット蛋白質は、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットであり、ＤＮＡポリメラーゼサブユニットＤｎａＥ蛋白質、ＤｎａＱ蛋白質、ＤｎａＮ蛋白質、ＤｎａＸ蛋白質、ＨｏｌＡ蛋白質、ＨｏｌＢ蛋白質、ＨｏｌＣ蛋白質、ＨｏｌＤ蛋白質、ＳＳＢ蛋白質、ＤｎａＧ蛋白質、又はこれらのサブユニットの何れかの相同物（限定ではないが、コードされた蛋白質、完全長の蛋白質、加工された蛋白質、融合蛋白質及びそれらの多価の蛋白質）並びに上記蛋白質の少なくとも一部を含む、蛋白質の末端削除された蛋白質を含む。本発明の別の態様は、単離されたシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質を含み、ＤＮＡポリメラーゼＤｎａＥ蛋白質、ＤｎａＮ蛋白質、ＤｎａＸ蛋白質、ＨｏｌＡ蛋白質、及びＨｏｌＢ蛋白質を含む。一つの態様において、好ましいＤＮＡポリメラーゼＩＩＩＤｎａＥサブユニット蛋白質は、Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ ＰＡＧＥによる測定で約１１０−１３５ｋＤａの分子量を有する。別の態様において、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩＤｎａＮサブユニット蛋白質は、Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ ＰＡＧＥによる測定で約４０−４１ｋＤａの分子量を有する。別の態様において、ＤｎａＸサブユニット蛋白質は、Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳＰＡＧＥによる測定で約７１−７３ｋＤａ（完全長の遺伝子産物に関して）の分子量を有する。別の態様において、ＨｏｌＡサブユニット蛋白質は、Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳＰＡＧＥによる測定で約３７−４０ｋＤａの分子量を有する。別の態様において、ＨｏｌＢサブユニット蛋白質は、Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳＰＡＧＥによる測定で約３５−３８ｋＤａの分子量を有する。別の態様において、ＨｏｌＣサブユニット蛋白質は、Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳＰＡＧＥによる測定で約１５−１７ｋＤａの分子量を有する。特に好ましいエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ蛋白質は、配列番号：３により表されるＤｎａＥ（τ）、配列番号：１０により表されるＤｎａＱ（ε）、配列番号：１５により表されるＨｏｌＥ（θ）、配列番号：２０により表されるＤｎａＮ（β）、配列番号：２５により表されるＤｎａＥ（γ／τ）、配列番号：３５により表されるＨｏｌＡ（δ）、配列番号：４０により表されるＨｏｌＢ（δ’）、配列番号：４５により表されるＨｏｌＣ（χ）、配列番号：５０により表されるＨｏｌＤ（Ψ）、配列番号：５５により表されるｓｓｂ、及び／又は配列番号：６０により表されるＤｎａＧ（プライマーゼ）を含む。特に好ましいシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ蛋白質は、配列番号：６７により表されるＤｎａＥ（α）、配列番号：７２により表されるＤｎａＥ（α）、配列番号：７７により表されるＤｎａＱ（ε）、配列番号：８２により表されるＤｎａＥ（γ／τ）、配列番号：８７により表されるＨｏｌＡ（δ）、配列番号：９２により表されるＨｏｌＢ（δ’）、配列番号：９７により表されるＨｏｌＣ（χ）、配列番号：１０４により表されるＳＳＢ、配列番号：１０９により表されるＤｎａＧ（プライマーゼ）、及び／又は配列番号：１１４により表されるＤｎａＮ（β）並びにそれらの配列番号の何れかを有する蛋白質をコードする核酸分子の対立遺伝子バリアントである核酸分子によりコードされた蛋白質を含む。そのような蛋白質を生産する方法の実施例は、本明細書に開示される。
好ましいシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ蛋白質サブユニットは、機能アッセイにおいてそのサブユニットの機能を果たすことができる。一つの態様において、ＤｎａＥは、ギャップフィリングポリメラーゼアッセイにおいて、プライムされたＤＮＡを伸長することができる。別の態様において、ＤｎａＮは、プロセッシビティー刺激アッセイにおいて、ＤｎａＮの存在下でＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロセッシビティーの刺激が可能である。別の態様において、ＤｎａＸは、ＤＮＡ−依存様式にてＡＴＰを加水分解することができる。別の態様において、ＤｎａＸ存在下でのＨｏｌＡ及びＨｏｌＢは、プライムされたＤＮＡ鋳型上にＤｎａＮを負荷することができる。別の態様において、ＤｎａＥ，ＤｎａＮ，ＤｎａＸ，ＨｏｌＡ及びＨｏｌＢは、ＲＮＡ−又はＤＮＡ−プライムされた長い一本鎖ＤＮＡ鋳型上で迅速且つプロセッシブなＤＮＡ合成を実行することができる機能性ＤＮＡレプリカーゼに集合することができる。そのようなアッセイの例は、実施例のセクションにおいて詳細に記載される。そのような蛋白質サブユニットが活性検出アッセイにおいて機能する能力は、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのレプリカーゼを阻害する抗細菌薬剤候補に関してスクリーニングすることにおける、アッセイにおいてのそのような蛋白質及び模倣体（mimetopes）の利用性を示唆する。本明細書にて使用される「レプリカーゼ」は、ＤＮＡポリヌクレオチド配列を複製する酵素を意味する。
「機能アッセイにおいてそのサブユニットの機能を果たすことができる」なる句は、機能アッセイにおいて天然蛋白質サブユニットの活性の少なくとも約１０％を蛋白質が有することを意味する。別の好ましい態様においては、機能アッセイにおいて天然蛋白質サブユニットの活性の少なくとも約２０％を有する。別の好ましい態様においては、機能アッセイにおいて天然蛋白質サブユニットの活性の少なくとも約３０％を有する。別の好ましい態様においては、機能アッセイにおいて天然蛋白質サブユニットの活性の少なくとも約４０％を有する。別の好ましい態様においては、機能アッセイにおいて天然蛋白質サブユニットの活性の少なくとも約５０％を有する。別の好ましい態様においては、機能アッセイにおいて天然蛋白質サブユニットの活性の少なくとも約６０％を有する。別の好ましい態様においては、機能アッセイにおいて天然蛋白質サブユニットの活性の少なくとも約７０％を有する。別の好ましい態様においては、機能アッセイにおいて天然蛋白質サブユニットの活性の少なくとも約８０％を有する。別の好ましい態様においては、機能アッセイにおいて天然蛋白質サブユニットの活性の少なくとも約９０％を有する。
本明細書にて使用される本発明の単離された蛋白質は、完全長の蛋白質又はそのような蛋白質のあらゆる相同物、例えば、アミノ酸配列が欠失されたか、挿入されたか、倒置されたか、置換されたか、及び／又は誘導された（例えば、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、イリストイル化、プレニル化、パルミトイル化、アミド化及び／又はグリセロホスファチジルイノシトールの添加による）蛋白質であり得て、上記相同物は、相同物をコードする核酸配列が、対応する天然のシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列をコードする核酸配列の相補体に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズできるように、天然のシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼ蛋白質に十分類似しているアミノ酸配列を有する蛋白質を含むようなものである。本明細書にて使用されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、オリゴヌクレオチドを含む核酸分子を使用して類似の核酸分子を同定する標準ハイブリダイゼーション条件を意味する。そのような標準条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｓＰｒｅｓｓ，１９８９に開示されている；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，同じ箇所、は、その全体を引用により本明細書に編入する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、ハイブリダイゼーション反応において釣り上げるために使用される核酸分子と少なくとも約７０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にさせる。ヌクレオチドの３０％又はそれ未満のミスマッチを許容するハイブリダイゼーションを達成するための適切なハイブリダイゼーション及び洗浄条件を計算する式は、例えば、Ｍｅｉｎｋｏｔｈｅｔ ａｌ．，１９８４，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８，２６７−２８４に開示される；Ｍｅｉｎｋｏｔｈｅｔ ａｌ，同じ箇所、は、その全体を引用により本明細書に編入する。好ましい態様において、ハイブリダイゼーション条件は、釣り上げるために使用される核酸分子と少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にさせる。より好ましい態様において、ハイブリダイゼーション条件は、釣り上げるために使用される核酸分子と少なくとも約９０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にさせる。より好ましい態様において、ハイブリダイゼーション条件は、釣り上げるために使用される核酸分子と少なくとも約９５％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にさせる。
本発明の蛋白質相同物の最小サイズは、対応する天然蛋白質をコードする核酸分子の相補配列と安定なハイブリッドを形成することができる核酸分子によりコードされるのに十分なサイズである。そういうものとして、そのような蛋白質相同物をコードする核酸分子のサイズは、核酸分子と相補配列の間の核酸組成及びパーセント相同性並びにハイブリダイゼーション条件それ自体（例えば、温度、塩濃度、及びホルムアルデヒド濃度）に依存する。そのような核酸分子の最小サイズは、もしも核酸分子がＧＣ−リッチならば少なくとも約１２から約１５ヌクレオチドの長さであり、そして核酸分子がＡＴ−リッチならば少なくとも約１５から約１７塩基の長さである。そういうものとして、本発明のプロテアーゼ蛋白質相同物をコードするように使用される核酸分子の最小サイズは、約１２から約１８ヌクレオチドの長さである。核酸分子が遺伝子の一部、遺伝子全体、又は複数の遺伝子またはそれらの一部を含み得ることにおいて、そのような核酸分子の最大サイズに制限はない。同様に、本発明のポリメラーゼ蛋白質相同物の最小サイズは約４から約６アミノ酸の長さであり、好ましいサイズはそのような蛋白質の完全長、多価性（即ち、機能を有する各一つのドメインより多くを有する融合多機能）又は機能部分が望まれるか否かに依存する。本発明のポリメラーゼ蛋白質相同物は天然サブユニットに相当する活性を有することが好ましい。
本発明の蛋白質相同物は、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットをコードする天然遺伝子の対立遺伝子バリアントの結果であり得る。天然遺伝子とは、天然にもっとも多い頻度で見いだされる遺伝子の形態を意味する。ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素ＩＩＩサブユニット相同物は、限定ではないが、例えばランダムか又は標的化された変異導入を起こすための古典的技術か又はＤＮＡ組換え技術を用いて蛋白質をコードする遺伝子を直接修飾することを含む、当業界公知の技術を用いて生産することができる。相同物を含む、本発明の単離されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質は、サブユニットの特定の機能を果たす蛋白質の能力により直接の様式にて同定することができる。そのような技術の例は実施例のセクションにおいて詳細に説明される。
本発明は、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼホロ酵素ＩＩＩのサブユニット蛋白質の模倣物も含む。本発明によれば、模倣物は、本発明の単離されたシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼホロ酵素ＩＩＩのサブユニット蛋白質を模倣することにより機能アッセイにおいてサブユニットの機能を果たすことができるあらゆる化合物を意味する。模倣物は、分解に対するその感受性を低下させるが機能上の能力は保持するように修飾されたペプチドであり得る。模倣物の他の例は、限定ではないが、本発明の単離された蛋白質の一つ又は複数のエピトープを模倣する少なくとも一つの結合部位；単離された蛋白質の非蛋白質性免疫原部分（例えば糖質構造）；及び本発明の単離された蛋白質の少なくとも一つのエピトープに類似な構造を有する、核酸を含む合成又は天然有機分子を含む、抗イディオタイプ抗体又はそれらの断片を含む。そのような模倣物は、本発明の蛋白質のコンピューターにより生じさせた構造を用いてデザインすることができる。模倣物は、分子のランダムサンプル、例えばオリゴヌクレオチド、ペプチド又は他の有機分子を生じさせ、そして相当する結合パートナーを用いて親和性クロマトグラフィー技術によりそのようなサンプルをスクリーニングすることにより、得ることもできる。
本発明の一つの態様は、融合セグメントに結合させた、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼホロ酵素ＩＩＩサブユニット蛋白質含有ドメインを含む融合蛋白質である。本明細書にて使用される用語「融合蛋白質」は、興味のある蛋白質（即ち、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット及びそれらの断片）を外来蛋白質断片（非ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット蛋白質からなる融合パートナー）に連結させて含むキメラ蛋白質を意味する。融合パートナーは、宿主細胞中で発現されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット蛋白質の可溶性を増強してよく、宿主細胞又は培養上清又はその両方からの組換え融合蛋白質の精製を可能にさせる親和性タグを提供してよい。所望ならば、当業界公知の様々な酵素手段又は化学手段により、興味のある蛋白質（即ち、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素、ホロ酵素サブユニット蛋白質又はそれらの断片）から融合蛋白質を取り出してよい。本発明のシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼホロ酵素ＩＩＩサブユニットの一部としての融合セグメントの包含は、生産、保存及び／又は使用の間の蛋白質の安定性を増強することができる。セグメントの特性に依存して、融合セグメントは、そのような融合セグメントを含むシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼホロ酵素ＩＩＩサブユニット蛋白質により免疫された動物により上昇した免疫応答を増強するための免疫強化剤（immunopotentiator）としても作用し得る。さらに、融合セグメントは、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼホロ酵素ＩＩＩサブユニット蛋白質の精製を単純化させるための道具として、例えば親和性クロマトグラフィーを用いて結果生じる融合蛋白質の精製を可能にさせる道具として機能することができる。適切な融合セグメントは、所望の機能を有するあらゆるサイズのドメインであり得る（例えば、蛋白質に増加した安定性を授与するか、増加した免疫原性を授与するか、及び／又は蛋白質の精製を単純化する）。一つ又は複数の融合セグメントを使用することは本発明の範囲内である。融合セグメントは、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼホロ酵素ＩＩＩサブユニットを含む蛋白質のドメインのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端に連結することができる。融合セグメントと融合蛋白質のシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼホロ酵素ＩＩＩサブユニットを含むドメインの間の連結は、そのような蛋白質のシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼホロ酵素ＩＩＩサブユニット含有ドメインの直接の回収を可能にさせるため、分割に対して感受性であることができる。融合蛋白質は、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼホロ酵素ＩＩＩサブユニット含有ドメインのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端の何れかに連結した融合セグメントを含む蛋白質をコードする融合核酸分子により形質転換された組換え細胞を培養することにより生産されるのが好ましい。
本発明の使用のための好ましい融合セグメントは、グルタチオン結合ドメイン、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はグルタチオンに結合できるその一部；金属結合ドメイン、例えば二価金属イオンに結合できるポリ−ヒスチジンセグメント；イムノグロブリン結合ドメイン、例えば、プロテインＡ，プロテインＧ，Ｔ細胞、Ｂ細胞、Ｆｃ受容体又は相補蛋白質抗体−結合ドメイン；糖結合ドメイン、例えばマルトース結合蛋白質由来のマルトース結合ドメイン；及び／又は「タグ」ドメイン（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ｓｔｒｅｐタグペプチド、モノクローナル抗体のようなドメインに結合する化合物を用いて精製され得る他のドメインの少なくとも一部）を含む。より好ましい融合セグメントは、金属結合ドメイン、例えば、ヒスチジンセグメント；マルトース結合ドメイン；及びヘキサヒスチジン／ビオチン結合ドメインを含む。
核酸分子
本発明の別の態様は、本発明のシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼホロ酵素ＩＩＩサブユニットの少なくとも一方にストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、単離された核酸分子である。好ましいシュードモナス・エルギノーサの遺伝子はｄｎａＥであり、そして核酸配列の配列番号：６５及び配列番号：７０を含み、配列番号：６７及び配列番号：７２を含むｄｎａＥサブユニット蛋白質をコードする。別の好ましいシュードモナス・エルギノーサ遺伝子はｄｎａＱであり、そして核酸配列の配列番号：７５を含み、配列番号：７７を含むｄｎａＱサブユニット蛋白質をコードする。別の好ましいシュードモナス・エルギノーサ遺伝子はｄｎａＮであり、そして核酸配列の配列番号：１１２を含み、配列番号：１１４を含むＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ βサブユニット蛋白質をコードする。別の好ましいシュードモナス・エルギノーサ遺伝子はｄｎａＸであり、そして核酸配列の配列番号：８０を含み、配列番号：８２を含むｄｎａＸサブユニット蛋白質をコードする。別の好ましいシュードモナス・エルギノーサ遺伝子はｈｏｌＡであり、そして核酸配列の配列番号：８５を含み、配列番号：８７を含むδサブユニット蛋白質をコードする。別の好ましいシュードモナス・エルギノーサ遺伝子はｈｏｌＢであり、そして核酸配列の配列番号：９０を含み、配列番号：９２を含むδ’サブユニット蛋白質をコードする。別の好ましいシュードモナス・エルギノーサ遺伝子はｈｏｌＣであり、そして核酸配列の配列番号：９５を含み、配列番号：９７を含むχサブユニット蛋白質をコードする。別の好ましいシュードモナス・エルギノーサ遺伝子はｄｎａＧであり、そして核酸配列の配列番号：１０２を含み、配列番号：１０４を含むｄｎａＧサブユニット蛋白質をコードする。別の好ましいシュードモナス・エルギノーサ遺伝子はｓｓｂであり、そして核酸配列の配列番号：１０７を含み、配列番号：１０９を含むｓｓｂサブユニット蛋白質をコードする。
好ましいエルシニア・ペスティスの遺伝子はｄｎａＥであり、そして核酸配列の配列番号：１を含み、配列番号：３を含むｄｎａＥサブユニット蛋白質をコードする。別の好ましいエルシニア・ペスティス遺伝子はｄｎａＱであり、そして核酸配列の配列番号：８を含み、配列番号：１０を含むＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ ε−サブユニット蛋白質をコードする。別の好ましいエルシニア・ペスティス遺伝子はｈｏｌＥであり、そして核酸配列の配列番号：１３を含み、配列番号：１５を含むＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ θ−サブユニット蛋白質をコードする。別の好ましいエルシニア・ペスティス遺伝子はｄｎａＮであり、そして核酸配列の配列番号：１８を含み、配列番号：２０を含むＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ β−サブユニット蛋白質をコードする。別の好ましいエルシニア・ペスティス遺伝子はｄｎａＸであり、そして核酸配列の配列番号：２３を含み、配列番号：２５を含むｄｎａＸサブユニット蛋白質をコードする。別の好ましいエルシニア・ペスティス遺伝子はｈｏｌＡであり、そして核酸配列の配列番号：３３を含み、配列番号：３５を含むδサブユニット蛋白質をコードする。別の好ましいエルシニア・ペスティス遺伝子はｈｏｌＢであり、そして核酸配列の配列番号：３８を含み、配列番号：４０を含むδ’サブユニット蛋白質をコードする。別の好ましいエルシニア・ペスティス遺伝子はｈｏｌＣであり、そして核酸配列の配列番号：４３を含み、配列番号：４５を含むχサブユニット蛋白質をコードする。別の好ましいエルシニア・ペスティス遺伝子はｈｏｌＤであり、そして核酸配列の配列番号：４８を含み、配列番号：５０を含むΨサブユニット蛋白質をコードする。別の好ましいエルシニア・ペスティス遺伝子はｓｓｂであり、そして核酸配列の配列番号：５３を含み、配列番号：５５を含むｓｓｂサブユニット蛋白質をコードする。別の好ましいエルシニア・ペスティス遺伝子はｄｎａＧであり、そして核酸配列の配列番号：５８を含み、配列番号：６０を含むｄｎａＧサブユニット蛋白質をコードする。
核酸配列決定技術は完全に間違いを除き切れないから、本明細書に提示された配列は最高でも本発明のシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼホロ酵素サブユニット蛋白質をコードする核酸分子の真実らしい（apparent）核酸配列を表す。本発明の核酸分子は、単離された天然遺伝子又はその相同物を含むことができ、そのうちの後者は以下においてより詳細に説明される。本発明の核酸分子は、一つ又は複数の制御領域、完全長又は部分的なコーディング領域、又はそれの混合物を含み得る。本発明の核酸分子の最小サイズは、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で前記の遺伝子の一つと安定にハイブリッドを形成できる最小サイズである。
一つの態様において、ハイブリダイゼーション条件は、釣り上げるために使用される核酸分子と少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にさせる。より好ましい態様において、ハイブリダイゼーション条件は、釣り上げるために使用される核酸分子と少なくとも約９０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にさせる。より好ましい態様において、ハイブリダイゼーション条件は、釣り上げるために使用される核酸分子と少なくとも約９５％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にさせる。
本発明によれば、単離された核酸分子は、その天然源において普通は結合している少なくとも一つの混在する核酸から同定されて分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、即ち、自然界で見いだされるのとは異なった形態又は環境（setting）で存在する。対照的に、核酸、例えばＤＮＡ及びＲＮＡとしての非単離核酸はそれらが自然界で存在する状態で見いだされる。単離された核酸分子は、一本鎖又は二本鎖の形態で存在してよい。単離された核酸分子を蛋白質を発現させるために使用する場合、核酸分子はセンス又はコーディング鎖（即ち、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは一本鎖であってよい）を最小限含むことになるが、センス鎖とアンチセンス鎖の両方を含んでよい（即ち、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは二本鎖であってよい）。「単離された」は、核酸分子が精製される程度を反映しない。単離された核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ又はＲＮＡの何れかの誘導体を含み得る。
本発明の単離されたシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット核酸分子は、遺伝子全体（即ち、完全遺伝子）又はその遺伝子と安定にハイブリダイズを形成することができるその一部の何れかとしてその天然源から得ることができる。単離されたシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット核酸分子は、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）又は化学合成を用いて生産することができる。単離されたシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット核酸分子は、天然核酸分子及びその相同物を含み、限定ではないが、ヌクレオチドが挿入されるか、欠失されるか、置換されるか、及び／又は倒置された天然対立遺伝子バリアント及び修飾された核酸分子を含み、本発明の蛋白質をコードするか又は天然遺伝子単離物とストリンジェント条件下で安定なハイブリッドを形成する上記核酸分子の能力をそのような修飾が実質上干渉しない様式における。
シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット核酸分子相同物は、当業者に知られている多数の方法を用いて生産することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．，同じ箇所、を参照）。例えば、核酸分子は、様々な技術を用いて修飾することができ、限定ではないが、古典的な変異導入技術及び組換えＤＮＡ技術、例えば、部位特異的変異導入、核酸分子の化学処理による変異誘発、核酸断片の制限酵素分割、核酸断片の連結、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅及び／又は核酸配列の選択された領域の変異導入、オリゴヌクレオチド混合物の合成及び混合物グループの連結による核酸分子の混合物及びそれらの組み合わせの「構築（build）」を含む。核酸分子相同物は、核酸によりコードされる蛋白質の機能に関してスクリーニングすること（例えば、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット蛋白質の少なくとも一つのエピトープに対する免疫応答性を導き出す能力、免疫血清に結合する能力）及び／又はシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット遺伝子とのハイブリダイゼーションにより、修飾された核酸の混合物から選択することができる。
本発明は、生物学上のサンプル中のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素、又はＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットの少なくとも一部をコードする核酸分子の検出のための方法も提供し、ａ）本発明の核酸分子の少なくとも一部を、生物学上のサンプルの核酸物質にハイブリダイズさせることにより、ハイブリダイゼーション複合体を形成させ、そしてｂ）ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程を含み、その際、複合体の存在が生物学上のサンプル中のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットの少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドの存在に相関する。好ましい態様において、ハイブリダイゼーションの条件は、釣り上げるために使用される核酸分子と少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にさせる。より好ましい態様において、ハイブリダイゼーション条件は、釣り上げるために使用される核酸分子と少なくとも約９０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にさせる。より好ましい態様において、ハイブリダイゼーション条件は、釣り上げるために使用される核酸分子と少なくとも約９５％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にさせる。上記方法の別の好ましい態様において、生物学上のサンプルは、ポリメラーゼ鎖反応により増幅される。
組換え分子、組換え細胞、及び組換え分子と組換え分子の用途
本発明は組換えベクターも含み、宿主細胞中に核酸分子を送達することができるあらゆるベクターに挿入された、少なくとも一つの、本発明のシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ核酸分子を含む。そのようなベクターは、異種核酸配列を含み、それは、本発明の核酸分子に近接して天然では見いだされない核酸配列及び核酸分子が由来する種以外の種に好ましくは由来する核酸配列である。上記ベクターは、ＲＮＡ又はＤＮＡの何れか、原核生物又は真核生物の何れか、そして典型的にはウイルス又はプラスミドである。組換えベクターは、本発明のシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ核酸分子のクローン化、配列決定及び／又は他の操作において使用することができる。他の種類の組換えベクターは、本明細書では組換え分子と呼ばれて以下において詳細に説明されるが、本発明の核酸分子の発現においいて使用することができる。好ましい組換えベクターは、形質転換細胞において複製できる。
単離された本発明のシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼ蛋白質は、様々な方法により生産することができ、天然蛋白質の生産と回収、組換え蛋白質の生産と回収、及び当該蛋白質の化学合成を含む。一つの態様において、本発明の単離された蛋白質は、当該蛋白質を生産するのに十分な条件下で蛋白質を発現させることができる細胞を培養し、そして蛋白質を回収することにより生産する。培養される好ましい細胞は、蛋白質を発現することができる組換え細胞であり、当該組換え細胞は、本発明の一つ又は複数の核酸分子により宿主細胞を形質転換することにより製造される。核酸分子による細胞の形質転換は、核酸が細胞中に挿入され得るあらゆる方法により達成することができる。形質転換技術は、限定ではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクチン、吸着、及びプロトプラスト融合を含む。組換え細胞は単細胞のままでよく、あるいは、組織、器官、又は多細胞生物に成長させてよい。本発明の形質転換された核酸分子は、染色体外のままであることができ、あるいは、それらが発現される能力を保持する様式にて、形質転換された（即ち、組換え）細胞の染色体内の一つ又は複数の部位に組込まれる得る。細胞を形質転換するための適切で且つ好ましい核酸分子は、適切で且つ好ましいシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ核酸分子それ自体に関して本明細書において開示されたとおりである。本発明の組換え細胞中に含まれる特に好ましい核酸分子は、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのｄｎａＮ，ｄｎａＥ，ｄｎａＸ，ｄｎａＸ，ｄｎａＱ，ｈｏｌＡ，ｈｏｌＢ，ｈｏｌＣ，ｈｏｌＤ，ｈｏｌＥ，ｓｓｂ，及びｄｎａＧを含む。
形質転換する適切な宿主細胞は、本発明の核酸分子で形質転換され得るあらゆる細胞を含む。宿主細胞は、形質転換されていない細胞か又は少なくとも一つの核酸分子により既に形質転換された細胞の何れかであり得る。本発明の宿主細胞は、本発明のシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ蛋白質を内生的に（即ち、天然で）生産することができる細胞、又は本発明の少なくとも一つの核酸分子で形質転換された後にそのような蛋白質を生産することができる細胞の何れかであり得る。本発明の宿主細胞は、本発明の少なくとも一つの蛋白質を生産することができるあらゆる細胞であり得て、細菌、真菌（酵母を含む）、昆虫、他の動物及び植物細胞を含む。好ましい宿主細胞は、細菌、ミコバクテリウム、酵母、昆虫及び哺乳類細胞を含む。もっとも好ましい宿主細胞は、エシェリヒア（Escherichia）を含む。特に好ましい宿主細胞は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）（大腸菌）であり、ＤＨ５α、ＭＧＣ１０３０及びＡＰ１．Ｌ１株を含む。別の好ましい宿主細胞は、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスであり、病原性を低下させた弱毒化株を含む。
組換え細胞は、宿主細胞を、一つ又は複数の組換え分子で形質転換することにより生産することが好ましく、各々が一つ又は複数の転写調節配列を含む発現ベクターに作動可能なように連結された本発明の核酸分子を一つ又は複数含む。作動可能なように連結されたなる句は、宿主細胞を形質転換する際に分子が発現され得る様式での発現ベクターへの核酸分子の挿入を意味する。本明細書にて使用される、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換することができて且つ特定された核酸分子の発現を作用させ得る、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターである。用語「媒体（vehicle）」が、時々、「ベクター」と交換可能に使用される。好ましくは、発現ベクターは、宿主細胞内で複製もできる。本発明の発現ベクターは、本発明の組換え細胞内で機能する（即ち、遺伝子発現を指示する）あらゆるベクターを含み、細菌中、真菌中、寄生虫中、昆虫中、他の動物中、及び植物細胞中を含む。本発明の好ましい発現ベクターは、細菌、酵母、昆虫及び哺乳類細胞の中、そしてより好ましくは今まで開示された細胞種の中で遺伝子発現を指示することができる。
本発明の組換え分子は、（ａ）分泌シグナル（即ち、シグナルセグメント核酸配列）を含むことにより、発現された本発明のシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスの蛋白質を、当該蛋白質を発現した細胞の外に分泌し，及び／又は、（ｂ）本発明の核酸分子の発現を導く融合配列を融合蛋白質として含んでもよい。真核組換え分子は、介在配列及び／又は非翻訳配列を、本発明の核酸分子の核酸配列の周囲又は中に含んでよい。
適切なシグナルセグメントは、本発明の蛋白質の分泌を指示することが可能な、天然シグナルセグメント又はあらゆる異種シグナルセグメントを含む。好ましいシグナルセグメントは、限定ではないが、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、組織適合性及びウイルスエンベロープ糖蛋白質シグナルセグメントを含む。
本発明の核酸分子は、制御配列、例えば、転写調節配列、翻訳調節配列、複製の起点、及び組換え細胞と共存可能であって且つ本発明の核酸分子の発現を調節する他の制御配列を含む発現ベクターに作動可能なように連結され得る。特に、本発明の組換え分子は、転写調節配列を含む。転写調節配列は、転写の開始、伸長、及び停止を調節する配列である。特に重要な転写調節配列は、転写開始を調節するもの、例えばプロモーター、エンハンサー、オペレーター及びリプレッサー配列である。適切な転写調節配列は、本発明の組換え細胞少なくとも一つの中で機能し得るあらゆる転写調節配列を含む。様々なそのような転写調節配列が当業者には知られている。好ましい転写調節配列は、細菌、酵母、昆虫及び哺乳類細胞の中で機能し得るものを含み、限定ではないが、例えば、ｐＡ１，ｔａｃ，ｌａｃ，ｔｒｐ，ｔｒｃ，ｏｘｙ−ｐｒｏ，ｏｍｐ／ｌｐｐ，ｒｒｎＢ，バクテリオファージラムダ（λ）、バクテリオファージＴ７、Ｔ７ｌａｃ，バクテリオファージＴ３、バクテリオファージＳＰ６、バクテリオファージＳＰ０１、メタロチオネイン、α−メーティング因子、ピキアアルコールオキシダーゼ、アルファウイルスサブゲノミックプロモーター（例えば、シンドビス（Sindbis）ウイルスサブゲノミックプロモーター）、抗生物質耐性遺伝子、バキュロウイルス、ヘリオディス・ゼア（Heliothis zea）昆虫ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス（例えば、中間（intermediate）初期プロモーター）、シミアンウイルス４０、レトロウイルス、レトロウイルスロングターミナルリピート、ラウス肉腫ウイルス、ヒートショック、リン酸及び硝酸転写制御配列並びに原核生物又は真核生物において遺伝子発現を調節することができる他の配列である。追加の適切な転写調節配列は、組織特異的プロモーター並びにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロン又はインターロイキンにより誘導可能なプロモーター）を含む。本発明の転写調節配列は、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスに自然界で関係のある天然に生じる転写調節配列も含み得る。
本発明の組換え分子は、形質転換される細胞内で核酸分子の発現を有効に制御できるあらゆる転写調節配列の少なくとも一つに作動可能なように連結された、前記のあらゆる核酸分子の少なくとも一つを含み得る。本発明の組換え細胞は、本発明のあらゆる核酸分子少なくとも一つで形質転換されたあらゆる細胞を含む。本発明の組換え細胞は、本発明の一つまたは複数の蛋白質をコードするシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ核酸分子を含む一つ又は複数の組換え分子により同時形質転換することもでき、その例を本明細書に開示する。特に好ましい組換え分子は、ｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＥ５’，ｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＥ，ｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＱ，ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＥ，ｐＡ１−ＹＰ−ＱＥ，ｐＡ１−ＹＰ−コア、ｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＮ，ｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＸ，ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＡ，ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＢ，ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＣ，ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＤ，ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＣＤ，ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＢＡ，ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＢＡＸ，ｐＡ１−ＹＰ−ＣＬ複合体（complex）、ｐＡ１−ＹＰ−ｓｓｂ，ｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＧ，ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＥ＃１５’，ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＥ＃１，ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＥ＃２−５’，ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＥ＃２，ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＱ，ｐＡ１−ＰＡ−コア＃１，ｐＡ１−ＰＡ−コア＃２，ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＸ，ｐＡ１−ＰＡ−ｈｏｌＡ，ｐＡ１−ＡＰ−ｈｏｌＢ，ｐＡ１−ＮＢ−ＰＡｈｏｌＣ，ｐＵＣＰ１９−ＮＢ−ＰＡｈｏｌＣ，ｐＡ１−ＣＢ−ＰＡｈｏｌＣ，ｐＵＣＰ１９−ＣＢ−ＰＡｈｏｌＣ，ｐＡ１−ＰＡ−ｈｏｌＢＡ，ｐＡ１−ＰＡ−ＢＡＸ，ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＧ，及びｐＡ１−ＰＡ−ｓｓｂを含む。そのような組換え分子の生産に関する詳細は、本明細書に記載される。
本発明の組換え細胞は、本発明のあらゆる核酸分子の少なくとも一つにより形質転換されたあらゆる細胞を含む。細胞に運ばれる、適切で好ましい核酸分子並びに適切で好ましい組換え分子は、本明細書に開示される。好ましい組換え細胞は、上で列挙された好ましい組換え分子により形質転換された、ＤＨ５α、ＭＧＣ１０３０及びＡＰ１．Ｌ１株を含むエシェリヒア／コリ、シュードモナス・エルギノーサ株及びエルシニア・ペスティス株を含む。特に好ましい組換え細胞は、以下のセクションの実施例において記載される形質転換された細胞を含む。これらの組換え細胞の生産に関する詳細は、本明細書に開示される。
本発明の組換え細胞は、本発明の一つ又は複数の蛋白質をコードするＰｓｕＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ核酸分子を含む一つ又は複数の組換え分子により同時形質転換されることもできる。
組換えＤＮＡ技術の使用は、例えば、宿主細胞内で核酸分子のコピー数、それらの核酸分子が転写される効率、結果の転写物が翻訳される効率、及び翻訳後修飾の効率を操作することにより、形質転換された核酸分子の発現を改善することができる。本発明の核酸分子の発現を増加させるために有用な組換え技術は、限定ではないが、核酸分子の高コピー数プラスミドへの作動可能な連結、核酸分子の一つ又は複数の宿主染色体への組込み、ベクター安定性配列のプラスミドへの付加、転写調節シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換又は修飾、転写置換配列（例えば、リボソーム結合部位、シャイン−ダルガノ配列）の置換又は修飾、宿主細胞のコドン使用度に対応させるための本発明の核酸分子の修飾、転写物を脱安定化させる配列の削除、及び培養の間に組換え酵素生成物から組換え細胞の生育を特定の時期に分離させる調節シグナルの使用を含む。本発明の発現された組換え蛋白質の活性は、そのような蛋白質をコードする核酸分子を断片化、修飾又は誘導することにより、改善してよい。
本発明の組換え細胞は、本発明の一つ又は複数の蛋白質を生産するために使用することができ、そのような蛋白質を生産するのに有効な条件下でそのような細胞を培養し、そして蛋白質を回収することによる。蛋白質を生産する有効な条件は、限定ではないが、蛋白質の生産を許容する、適切な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨ及び酸素条件を含む。適切又は有効な培地は、培養した場合に、本発明の細胞が本発明のシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ蛋白質を生産できるあらゆる培地を意味する。そのような培地は、典型的には、同化できる炭素、窒素及びリン酸源、並びに適切な塩、ミネラル、金属及び他の栄養、例えばビタミンを含む水性培地である。当該培地は、複合栄養物を含んでよいか又は規定された最小培地であってよい。本発明の細胞は、限定ではないが、バッチ、給餌バッチ（fed-batch）、細胞リサイクル及び連続発酵機を含む慣用の発酵バイオリアクター中で培養することができる。培養は、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ、又はペトリ皿中で実施することもできる。培養は、組換え細胞に適した、温度、ｐＨ及び酸素含有量にて実施することができる。そのような培養条件は、当業者の専門技術の範囲内である。
生産のために使用されるベクター及び宿主に依存して、本発明の結果として生じる蛋白質は、組換え細胞内に残ったままであるか；培養培地中に分泌されるか；２つの細胞膜の間の空間、例えば大腸菌のペリプラズム空間の間に分泌されるか；又は細胞の膜又はウイルスの膜の外部表面上に残される。
「蛋白質を回収する」なる句は、蛋白質を含む全培養培地を回収することを単に意味し、分離又は精製の追加工程を意味しない。本発明の蛋白質は、限定ではないが、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング及び差動性（differential）可溶化のような様々な標準蛋白質精製技術を用いて精製することができる。本発明の蛋白質は、「実質上純粋な」形態にて回収するのが好ましい。本明細書にて使用される「実質上純粋な」は、上記蛋白質の治療組成物又は診断としての有効な使用を可能にさせる精製度を意味する。
抗体
本発明は、本発明のシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット蛋白質又はその模倣物に選択的に結合できる単離された抗体も含む。そのような抗体は、本明細書において、抗シュードモナス・エルギノーサ又は抗エルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット抗体とも呼ばれる。この態様の特に好ましい態様は、抗−ＤｎａＥ抗体、抗−ＤｎａＮ抗体、抗−ＤｎａＸ抗体、抗−ＨｏｌＡ抗体及び抗−ＨｏｌＢ抗体を含む。
単離された抗体は、それらの天然環境から取り出された抗体である。用語「単離された」は、そのような抗体の精製の度合いを意味しない。そういうものとして、単離された抗体は、そのような抗体を含む抗血清、又は程度を変えて精製された抗体を含み得る。
本明細書において使用される用語「選択的に結合する」は、本発明の抗体が本発明の特定された蛋白質及びそれらの模倣物に優先的に結合する能力を意味する。結合は、免疫ブロットアッセイ、免疫沈殿アッセイ、放射免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光抗体アッセイ及び免疫電子顕微鏡を含む当業者には公知の様々な方法を用いて測定できる；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ，同じ箇所を参照。
本発明の抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体の何れかであり得る。本発明の抗体は、機能性均等物、例えば抗体断片及び遺伝子操作された抗体を含み、抗体を得るために使用された蛋白質又は模倣物のエピトープの少なくとも一つに選択的に結合することができる単鎖抗体を含む。本発明の抗体は、一つより多くのエピトープに結合できる核酸分子により、少なくとも一部、コードされた蛋白質又はその模倣物に応答して生じる。抗体を生成及び検出する方法は当業界公知である。例えば、Ｈａｒｌｏｗａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，その全体を引用により本明細書に取り込む。
本発明の抗体を生産するための好ましい方法は、（ａ）本発明の蛋白質又はその模倣物を有効量、動物に投与することにより抗体を産生させ、そして（ｂ）抗体を回収することを含む。別の方法において、本発明の抗体は、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット蛋白質を生産するために本明細書にてこれまで開示された技術を用いて組換えにより生産される。規定された蛋白質又は模倣物に対する抗体は有利であり得るが、そのような抗体が、治療組成物中で使用されたならば診断アッセイにおける干渉又は副作用を別に引き起こすかもしれない他の物質に対する抗体で実質上汚染されていないからである。
本発明の抗体は、本発明の範囲内での様々な可能性の用途を有する。例えば、そのような抗体は、そのような抗体による治療に感受性の細菌、例えば（ａ）シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスから動物を防御するために動物を受動的に免疫するための治療用化合物として、（ｂ）そのような細菌による感染を検出するためのアッセイにおける試薬として、及び／又は（ｃ）発現ライブラリーをスクリーンするか、及び／又は蛋白質と他の汚染物との混合物から本発明の所望の蛋白質を回収するための道具として、使用することができる。さらに、本発明の抗体は、直接そのような細菌を殺傷するために本発明の細菌に対して毒性薬剤を標的化するために使用することができる。標的化は、当業者に知られている技術を用いて毒性薬剤にそのような抗体をコンジュゲートする（即ち、安定に連結する）ことにより、達成することができる。適切な毒性薬剤は、当業者に知られている。適切な毒性薬剤は、限定ではないが、抗細菌薬剤の全てのクラスを含む。
本発明のアミノ酸分子及び核酸分子の検出
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩを検出するための方法も提供し、何れかの順番で、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩを含むと推測されるサンプル、及びＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの少なくとも一部に特異的に結合することができる抗体を用意し；サンプルと抗体を、抗体がＤＮＡポリメラーゼＩＩＩに結合できる条件下で混合し；そして、結合を検出することを含む。別の好ましい態様において、生物はシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスである。抗体を用いて蛋白質を検出する方法は、当業者に知られており、例えば、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ，同じ箇所を参照されたく、そして免疫ブロットアッセイ、免疫沈殿アッセイ、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫アッセイ、免疫蛍光抗体アッセイ及び免疫電子顕微鏡を含む。
本発明は、生物学上のサンプル中のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素、又はＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットの少なくとも一部をコードする核酸分子を検出するための方法も提供し、ａ）本発明の核酸分子の少なくとも一部を生物学上のサンプルの核酸物質にハイブリダイズさせ、それにより、ハイブリダイゼーション複合体を形成させ、そして、ｂ）ハイブリダイゼーション複合体を検出するが、その際、複合体の存在が生物学上のサンプルの中のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットの少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドの存在と相関する、工程を含む。別の好ましい態様において、生物学上のサンプルの核酸物質は、ポリメラーゼ鎖反応により増幅される。
本発明は、異常か又は変異したＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット蛋白質又は遺伝子配列を含む、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット発現を検出する方法も提供し、ａ）適宜、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット蛋白質を含むと推測される試験サンプルを用意し；そして、ｂ）試験ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニットを、対照中の定量されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニットと比較することにより、サンプル中の試験ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニットの相対濃度を測定する工程を含む。さらに、上記方法は、試験サンプル及び対照サンプル中のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニットの相対濃度を測定するためのあらゆる適切な手段を用いて実施してよい。そのような方法の例は実施例のセクションにおいて見い出される。
本発明の別の態様は、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット蛋白質サブユニットの機能活性を検出する方法である。好ましい方法は、ａ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット蛋白質を含むと推測される試験サンプルを用意し；そしてｂ）サンプル中の試験ホロ酵素サブユニットの活性を、対照中の定量されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットと比較することにより、サンプル中の試験ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットの相対活性を測定することを含む。一つの態様において、上記活性は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩタイプＤｎａＥサブユニットの検出に関するポリメラーゼギャップフィリング活性である。別の態様において、上記活性は、ＤｎａＮサブユニットの検出に関するＤＮＡポリメラーゼのプロセッシビティーの刺激である。別の態様において、上記活性は、ＤｎａＸサブユニットのＤＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅ活性である。別の態様において、上記活性は、ＤｎａＥ，ＤｎａＮ，ＤｎａＸ，ＨｏｌＡ及びＨｏｌＢの存在下におけるＲＮＡ−又はＤＮＡ−プライムされた長い一本鎖ＤＮＡ鋳型上の迅速且つプロセッシブなＤＮＡ合成である。
レプリカーゼの機能の修飾
細菌のレプリカーゼの必須サブユニットの最小の集合体は、長いストレッチのＤＮＡの迅速且つプロセッシブな合成を許容するべきである。これまでに研究された全ての細菌のレプリカーゼにおいて、最小の機能性ホロ酵素は３つの成分からなる：１）ポリメラーゼコア、２）β−プロセッシビティー因子−負荷（又はクランプ−ローディング）複合体、及び３）スライディングクランププロセッシビティー因子、β。大腸菌においては、最小ホロ酵素は、αサブユニット、ＤｎａＸ−δδ’クランプローディング複合体及びβサブユニットからなる。同じ成分がグラム陽性のストレプトコッカス・ピオゲネス及びサーマス・サーモフィルス由来の機能性ＤＮＡｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素に最小限必要である。類縁上近い関係の生物間にこの要求の一般性を仮定すれば、α、β、ＤｎａＸ，δ、及びδ’が、エルシニア・ペスティス及びシュードモナス・エルギノーサを含むほとんどの生物のためのレプリカーゼの集合体に十分となる。本明細書にて使用されるＤｎａＸ複合体は、ＤｎａＸ，デルタ及びデルタ’の集合体を記載するのに使用される用語である。
本発明は、動物、植物、ヒト及び周囲の環境の細菌感染を減じるための、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの複製活性を変調する細菌ＤＮＡ複製の変調剤又は推測された変調剤の使用を含む。本明細書にて使用される細菌ＤＮＡ複製の変調剤は、レプリカーゼと相互作用することにより、ＤＮＡを複製するレプリカーゼの能力を変更させる化合物である。好ましい変調剤は、複製を阻害する。
標的の指示（target indications）は、動物研究において細菌感染からの回収をもたらす細胞成長を阻止するか又は細胞死を引き起こすことを含んでよい。活性に関する様々な範囲のアッセイ及び結合剤が提供されており、ＤＮＡ、蛋白質−蛋白質結合アッセイ、免疫アッセイ、細胞に基づくアッセイ等を含む。薬剤を同定するために使用される複製蛋白質組成物は、単離されて、部分精製されたか又は純粋な形態であり必然ではないが典型的には組換え生産される。複製蛋白質は、別のペプチド又はポリペプチド（例えば、アッセイ条件下で蛋白質−蛋白質結合、安定性を提供又は増強できるポリペプチド（例えば、検出又はアンカーリングのためのタグ）、等）との融合生成物の一部であってよい。アッセイ混合物は、天然の細胞内複製蛋白質−結合標的、例えば、ＤＮＡ、別の例えば、ＮＴＰ，又はｄＮＴＰを含む。結合アッセイに関しては、天然の結合標的を使用してよいが、アッセイにおいて便利に測定可能な主題の複製蛋白質に対して結合親和性及び親和力を提供するかぎり、その一部（例えば、ペプチド、核酸断片）を使用することがしばしば好まれる。上記アッセイ混合物は候補の薬剤も含む。一般に、多数のアッセイ混合物を平行に異なる試薬濃度にて流す（run）ことにより、様々な濃度に対して異なる応答を得る。典型的には、これらの濃度のうちの一つが陰性対照として機能する（即ち、ゼロ濃度又はアッセイ検出限界より下）。陽性対照、用量応答曲線、公知阻害剤の使用、対照の異種蛋白質の使用等のような追加の対照がしばしば存在する。候補の薬剤は多数の化学物質のクラスを包含するが、典型的にはそれらは有機化合物である；好ましくは、それらは小さな有機化合物であり、合成又は天然の化合物のライブラリーを含む様々な源から得られる。様々な他の試薬も混合物に含んでよい。これらは、塩、バッファー、中性蛋白質（例えば、アルブミン、界面活性剤、等）のような試薬を含み、最適な結合を促進させるため及び／又は非特異的相互作用又はバックグラウンドの相互作用等を減じるために使用してよい。また、他にアッセイの効率を改善する試薬（例えば、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤、等）を使用してよい。
発明は、複製蛋白質特異的アッセイ及び他の複製蛋白質等のような細胞内結合標的を含む結合試薬及びそのような試薬を同定及び作成する方法、及び様々な診断上の応用及び治療上の応用、特に疾患が過剰な細胞の成長に関連する場合におけるそれらの使用を提供する。新規な複製蛋白質−特異的な蛋白質及び１ハイブリッドスクリーン及び２ハイブリッドスクリーンのようなアッセイにより同定された他の天然細胞内結合試薬、化学物質ライブラリーによるスクリーニングにより同定された非天然細胞内結合試薬等である。
一般に、上記結合試薬の複製蛋白質−特異性は、平衡定数又は平衡定数に近似させた値、例えば反応を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）により示される。そのような試薬は、複製蛋白質を特異的に結合することができる（即ち、少なくとも約１０７Ｍ−１，好ましくは少なくとも約１０８Ｍ−１，より好ましくは少なくとも約１０９Ｍ−１の平衡結合定数を伴う）。様々な細胞に基づくアッセイ及び細胞を含まないアッセイを使用することにより、複製蛋白質−特異活性、結合、ゲルシフトアッセイ、免疫アッセイ等を示してよい。
結果の混合物は、候補の薬剤の存在を別にすれば、複製蛋白質が細胞結合標的、一部又は類似体に結合する条件下でインキュベートする。成分の混合物は、必要な結合を提供するあらゆる順序で添加することができる。
インキュベーションは、最適な結合を促進させるあらゆる温度、典型的には、４℃と４０℃の間、より一般的には１５℃と３７℃の間にて実施してよい。インキュベーション時間は、同様に最適な結合のために選択されるが、迅速且つ高処理量のスクリーニングを促進させるのに最小化もされて、典型的には０．０１時間から１０時間の間、好ましくは５時間未満、より好ましくは１時間未満である。
インキュベーションの後に、活性又は複製蛋白質と一つ又は複数の結合標的の間の特異的結合の存在又は不在をあらゆる便利な方法により検出する。細胞を含まないアッセイ及び結合種アッセイに関しては、分離工程を使用することにより、未結合の成分から活性産物又は結合成分を分離してよい。
分離は、沈殿（例えば、免疫沈殿又は核酸生成物の酸沈殿）、固定化（例えば、固相基材、例えばマイクロタイタープレート）等、続く洗浄により行ってよい。分離を必要としない多くの分離アッセイも可能であり、例えば、近接アッセイにおけるユーロピウムのコンジュゲートの使用、二本鎖ＤＮＡ内へのインターカレートに際して蛍光を増加させる染料の存在下での二本鎖ＤＮＡ合成に際しての蛍光増加、シンチレーション近接アッセイ、又は反応産物又は基質の損失に依存する検出系である。
検出は、あらゆる便利な方法により行ってよい。細胞を含まない活性及び結合アッセイに関しては、成分の一つが、通常は、標識を含むか又は標識にカップリングされる。
様々な標識を用いてよく−本質的には、ＤＮＡ生成物の検出、ＤＮＡ基質の損失、ヌクレオチド基質の変換又は結合蛋白質に備えるあらゆる標識が有用である。標識は、直接検出、例えば放射活性、蛍光、発光、目視（optical）、又は電子密度等、又は間接検出、例えばエピトープタグ、酵素等に備えてよい。標識は、蛋白質に付加するか（例えば、リンの放射性同位体を含むリン酸基）、ＤＮＡ基質又は蛋白質構造中に取り込んでよい（例えば、イオウの放射性同位体を含むメチオニン残基）。様々な方法を用いることにより、標識及び他のアッセイ成分の性質に依存して標識を検出してよい。例えば、標識は固相基材から分離して良く、あるいは、標識を含む結合複合体の一部を固相基材から分離してよく、その後、標識を検出する。標識は、目視の密度又は電子密度、放射性の放射、非放射性エネルギーの移動、蛍光放射等により直接検出して良く、あるいは抗体コンジュゲート等により間接に検出してよい。例えば、放射性標識の場合、放射は直接（例えば、素粒子カウンターを用いて）又は間接（例えば、シンチレーションカクテル及びカウンターを用いて）に検出してよい。
本発明は、細菌、好ましくは、エルシニア・ペスティス及びシュードモナス・エルギノーサからの複製蛋白質を用いて新規な薬剤を発見する方法を提供する。複製蛋白質の機能を別の化学試験化合物の存在下で定量する。当該機能を阻害する化学化合物が候補抗生物質である。
いくつかの態様においては、単一の生物に由来する複製蛋白質を使用することが好ましい。別の態様においては、様々なサブユニットを一つ又は複数の生物に由来してよい。グラム陽性細菌由来の複製蛋白質とグラム陰性細菌由来の複製蛋白質は、特定の態様において互いに交換可能であり得る。したがって、それらは、混合物として機能し得る。適切な大腸菌の複製蛋白質はそのＰｏｌＩＩＩホロ酵素のサブユニットであり、Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌに対する米国特許第５，５８３，０２６号及び第５，６６８，００４号であり、その全体を引用により本明細書に編入する。
本発明において有用ないくつかの他の複製サブユニットは、共に係属中の米国特許出願連続番号０９／９０６，１７６、特に表３−１８及び２１、２００１年７月１６日出願、発明の名称「ＮｏｖｅｌＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩＩ Ｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅ Ｄｅｌｔａ Ｓｕｂｕｎｉｔ ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ＡｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓ」、引用により本明細書に編入する、に詳細に説明されている。
本発明は、一つの態様において、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調させる化合物又は化学物質をスクリーニングする方法を提供し、ａ）レプリカーゼ活性に関して許容する条件下で少なくとも一つの試験化合物に単離されたレプリカーゼを接触させ、ｂ）試験化合物の存在下でレプリカーゼの活性を評価し、そしてｃ）試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性を試験化合物の不在下でのレプリカーゼの活性と比較するが、その際、試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性における変化が、レプリカーゼの活性を変調させる化合物の指標である。好ましい態様において、レプリカーゼは、エルシニア・ペスティス又はシュードモナス・エルギノーサのレプリカーゼサブユニット蛋白質を含む。
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調させる化合物を同定する方法を記載する。この方法は、鋳型ＤＮＡ分子、ＤｎａＧプライマーゼ、ＳＳＢ，ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼ、候補化合物、４つのＮＴＰｓ及びｄＮＴＰｓの混合物、及び任意に、βサブユニット、ＤｎａＸ複合体の何れか、又はβサブユニット及びＤｎａＸ複合体の両方を含む反応混合物を形成させ；候補化合物の不在下で核酸重合を達成させるために有効な条件に反応混合物を供し；核酸重合伸長産物の存在又は不在に関して反応混合物を分析し、そして試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性を試験化合物の不在下でのレプリカーゼの活性と比較する。別の態様においては、ＤｎａＧとＳＳＢを除外して、鋳型ＤｎａＧ分子をオキシダーゼヌクレオチドプライマーによりプライムさせることができる。試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性における変化が、レプリカーゼの活性を変調させる化合物の指標である。好ましい態様において、ＤｎａＸ複合体は、エルシニア・ペスティス又はシュードモナス・エルギノーサのＤｎａＸサブユニット蛋白質を含む。
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼを刺激することにおいてＤｎａＸ複合体とβサブユニットの活性を変調させる候補薬剤を同定する方法を記載する。上記方法は、プライムされたＤＮＡ（ＳＳＢでコートされていてよい）を、ＤＮＡポリメラーゼ、βサブユニット、及びＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）と、候補薬剤、及びｄＮＴＰｓ（又は修飾されたｄＮＴＰｓ）の存在下で接触させることにより、反応混合物を形成させる。上記反応混合物は、候補薬剤の不在下で、核酸重合を行わせるはずの条件に供され、そして反応混合物中の伸長産物の存在又は不在を分析する。試験化合物存在下での核酸の重合を、試験化合物不在下での核酸の重合と比較する。試験化合物の存在下での核酸の重合における変化が、ＤｎａＸ複合体とβサブユニットの活性を変調させる化合物の指標である。好ましい態様において、ＤｎａＸ複合体は、エルシニア・ペスティス又はシュードモナス・エルギノーサのＤｎａＸサブユニット蛋白質を含み、及び／又はβサブユニットはエルシニア・ペスティス又はシュードモナス・エルギノーサのβサブユニットである。
本発明は、βサブユニットとＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）が相互作用する能力を変調させる化学物質を同定する方法を記載する。この方法は、βサブユニットをＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）とＡＴＰ（又は適当なＡＴＰ類似体、例えばＡＴＰγＳ、加水分解不可能なＡＴＰの類似体）の存在下で接触させることを含み、βとＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）の相互作用を可能にさせて、候補薬剤と反応混合物を形成させる。反応混合物を、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）とβが候補薬剤不在下で相互作用するはずの条件に供する。次に、反応混合物をβサブユニットとＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）の間の相互作用に関して分析する。試験化合物存在下での相互作用の程度を、試験化合物不在下での相互作用の程度と比較する。βサブユニットとＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）の間の相互作用の変化が、相互作用を変調させる化合物の指標である。好ましい態様においては、ＤｎａＸ複合体は、エルシニア・ペスティス又はシュードモナス・エルギノーサのＤｎａＸ複合体サブユニット蛋白質を含み、そしてβサブユニットがエルシニア・ペスティス又はシュードモナス・エルギノーサのβサブユニットである。
本発明は、δサブユニットとδ’及び／又はＤｎａＸサブユニットが相互作用する能力を変調させる化学物質を同定する方法を記載する。この方法は、δサブユニットをδ’及び／又はδ’プラスＤｎａＸサブユニットと候補薬剤の存在下で接触させることにより反応混合物を形成させることを含む。反応混合物を、δサブユニットとδ’及び／又はδ’プラスＤｎａＸサブユニットが候補薬剤不在下で相互作用するはずの条件に供する。次に、反応混合物をδサブユニットとδ’及び／又はδ’プラスＤｎａＸサブユニットの間の相互作用に関して分析する。試験化合物存在下での相互作用の程度を、試験化合物不在下での相互作用の程度と比較する。δサブユニットとδ’及び／又はδ’プラスＤｎａＸサブユニットの間の相互作用の変化が、相互作用を変調させる化合物の指標である。好ましい態様においては、δ、δ’及びＤｎａＸサブユニットが、エルシニア・ペスティス及び／又はシュードモナス・エルギノーサのサブユニット蛋白質である。
本発明は、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）がＤＮＡ分子上でβサブユニットと集合する能力を変調させる化学物質を同定する方法を記載する。この方法は、環状のプライムされたＤＮＡ分子（ＳＳＢでコートされていてよい）を、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）とβサブユニットと、候補薬剤、ＡＴＰ又はｄＡＴＰの存在下で接触させることにより反応混合物を形成させることを含む。反応混合物を、ＤｎａＸ複合体（又は亜集合体）がβとＤＮＡ分子上で候補薬剤の不在下で集合する条件に供する。反応混合物中のＤＮＡ分子上のβサブユニットの存在又は不在を分析する。試験化合物存在下での集合の程度を、試験化合物不在下での集合の程度と比較する。ＤＮＡ分子上のβサブユニットの量の変化が、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体の亜集合体）がＤＮＡ分子上でβサブユニットと集合する能力を変調させる化合物の指標である。好ましい態様においては、ＤｎａＸ複合体又はその亜集合体は、エルシニア・ペスティス又はシュードモナス・エルギノーサのＤｎａＸ複合体サブユニット蛋白質を含み、そしてβサブユニットがエルシニア・ペスティス又はシュードモナス・エルギノーサのβサブユニットである。
本発明は、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット）がＤＮＡ分子上でβサブユニットを解離させる（disassemble）能力を変調させる化学物質を同定する方法を記載する。この方法は、ＤＮＡ分子を、βサブユニットが集合体形成していたところに候補薬剤の存在下で接触させることにより、反応混合物を形成させることを含む。反応混合物を、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）がβサブユニットを候補薬剤の不在下でＤＮＡ分子から解離させる条件に供する。反応混合物中のＤＮＡ分子上のβサブユニットの存在又は不在を分析する。試験化合物存在下での集合の程度を、試験化合物不在下での集合の程度と比較する。ＤＮＡ分子上のβサブユニットの量の変化が、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体の亜集合体）がＤＮＡ分子上でβサブユニットと集合する能力を変調させる化合物の指標である。好ましい態様においては、ＤｎａＸ複合体又はその亜集合体は、エルシニア・ペスティス又はシュードモナス・エルギノーサのＤｎａＸ複合体サブユニット蛋白質を含み、そしてβサブユニットがエルシニア・ペスティス又はシュードモナス・エルギノーサのβサブユニットである。
本発明は、ＤｎａＸ複合体又はＤｎａＸ複合体サブユニット（例えば、ＤＮＡサブユニット）のｄＡＴＰ／ＡＴＰ結合活性を変調させる化学物質を同定する方法を記載する。この方法は、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体サブユニット）を、ｄＡＴＰ／ＡＴＰとＤＮＡ分子の存在又は不在下で及び／又はβサブユニットと候補薬剤の存在下で接触させることにより、反応混合物を形成させることを含む。反応混合物を、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット）がｄＡＴＰ／ＡＴＰと、候補薬剤の存在下で相互作用する条件に供する。ｄＡＴＰ／ＡＴＰがＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット）と候補薬剤の存在下で結合するか否かを決定するために上記反応混合物を分析する。試験化合物存在下での結合の程度を、試験化合物不在下での結合の程度と比較する。ｄＡＴＰ／ＡＴＰ結合の変化が、ＤｎａＸ複合体又はＤｎａＸ複合体サブユニット（例えば、ＤｎａＸサブユニット）のｄＡＴＰ／ＡＴＰ結合活性を変調させる化合物の指標である。好ましい態様においては、ＤｎａＸ複合体又は亜集合体は、エルシニア・ペスティス又はシュードモナス・エルギノーサのＤｎａＸ複合体サブユニット蛋白質を含む。
本発明は、ＤｎａＸ複合体又はＤｎａＸ複合体サブユニット（例えば、ＤＮＡサブユニット）のｄＡＴＰ／ＡＴＰａｓｅ活性を変調させる化学物質を同定する方法を記載する。この方法は、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体サブユニット）を、ｄＡＴＰ／ＡＴＰと、ＤＮＡ分子の存在又は不在下で及び／又はβサブユニットと、候補薬剤の存在下で接触させることにより、反応混合物を形成させることを含む。反応混合物を、ＤｎａＸサブユニット（又は複合体）がｄＡＴＰ／ＡＴＰと、候補薬剤の存在下で相互作用する条件に供する。ｄＡＴＰ／ＡＴＰが加水分解されるか否かを決定するために上記反応混合物を分析する。試験化合物存在下での加水分解の程度を、試験化合物不在下での加水分解の程度と比較する。加水分解されたｄＡＴＰ／ＡＴＰの量の変化が、ＤｎａＸ複合体又はＤｎａＸ複合体サブユニット（例えば、ＤｎａＸサブユニット）のｄＡＴＰ／ＡＴＰａｓｅ活性を変調させる化合物の指標である。ＤｎａＸ複合体は、ＤｎａＸ複合体サブユニット（例えば、ＤｎａＸサブユニット）を含み、ＤｎａＸ複合体又は亜集合体は、エルシニア・ペスティス又はシュードモナス・エルギノーサのＤｎａＸ複合体サブユニット蛋白質を含む。
発明は、ＤＮＡポリメラーゼの活性を変調させる化学物質を同定する方法を記載し、環状のプライムされたＤＮＡ分子（ＳＳＢでコートされていてよい）を、ＤｎａＸ複合体、βサブユニット及びαサブユニット及びｄＮＴＰｓ（又は修飾されたｄＮＴＰｓ）と、候補薬剤存在下で接触させることにより反応混合物を形成させることを含む。反応混合物は、候補薬剤の不在下で、核酸重合に影響する条件に供し、そして反応混合物中の伸長産物の存在又は不在を分析する。試験化合物存在下でのレプリカーゼの活性を、試験化合物不在下でのレプリカーゼの活性と比較する。試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性の変化が、レプリカーゼの活性を変調させる化合物の指標である。好ましい態様において、レプリカーゼは、エルシニア・ペスティス又はシュードモナス・エルギノーサのレプリカーゼサブユニット蛋白質を含む。
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼ活性を変調させることができる化合物を同定するための試験キットも含む。そのようなキットは、エルシニア・ペスティス又はシュードモナス・エルギノーサ由来の単離されたレプリカーゼサブユニット蛋白質及び仮想阻害化合物の存在下で（即ち、に影響される）ＤＮＡ複製活性の変調の程度を測定する手段を含む。
本発明は、そのような方法、及び／又はキットにより単離された変調剤及び阻害剤、及びそのような阻害剤に感受性の本発明のあらゆるレプリカーゼを阻害するためのそれらの使用も含む。細菌のＤＮＡ複製の変調剤は、そのような化合物が処理される種にとって有害でない限り、細菌感染を有する疑いの有る動物、植物、及びヒトに対して直接使用することもできる。同様に、限定ではないが抗体及び小分子を含む、本発明のあらゆるレプリカーゼに結合する分子を、感染部位に対する細胞障害性、治療性又はイメージングの実在物を標的化するのに使用することもできる。
再構成のアプローチにより精製された必須ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットの利用可能性により、発明の複製方法は、提供された新規な標的に対して高処理量スクリーンに敏感である。これは、小分子ライブラリーの中で活性化合物との相互作用に際して変調が観察されるように、ほとんど限界でなくなるまで、各化合物を滴定することにより達成され得る。バッファーの条件を酵素混合物の安定性を保証するように最適化し、そして複数プレートスクリーニングプロセスの間に別の冷蔵されたコンテナー内で保存される。アッセイの時間と温度も、安定な直線応答を保証するように最適化される。同様に、アッセイの全ての関連する化合物の全てを、最良の化合物による心配に対してアッセイの高感度を保証するように最適化される。
本発明は、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼホロ酵素をスクリーニングする方法も提供する。この方法は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素複製を変調すると推測される試験阻害剤を用意し、ｂ）試験反応及び対照反応においてＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ複製反応を検出し、そしてｃ）試験を対照と比較するが、その際、複製の量が試験阻害剤の変調の影響と相関する、工程を含む。本発明は、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのプライモソームの活性を変調又は阻害する抗細菌性薬剤候補をスクリーニングする対応の方法も提供する。そのような方法の例は実施例のセクションに見いだされる。
この発明は、完全なシュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスの染色体のＤＮＡ複製伸長システムの集合体に関する方法を提供する。この発明は、シュードモナス・エルギノーサ又はエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素の予測される５つの中心的に重要な成分の発現及び精製のための方法も提供する。この発明は、さらに、シュードモナス・エルギノーサ及びエルシニア・ペスティスの最小のプロセッシブなレプリカーゼを提供する。この発明は、シュードモナス及びエルシニアのＤＮＡ複製の阻害剤として活性な化合物を同定するための高処理量スクリーニングフォーマット内での完全に再構成されたシュードモナス・エルギノーサ及びエルシニア・ペスティスの複製システムの使用のための方法も提供する。そのような方法の例は、実施例のセクションにおいて見いだされる。
実施例
以下の実施例は、当業者に知られている多数の組換えＤＮＡ技術及び蛋白質化学の技術を含む；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．同じ箇所を参照されたい。
一般的手法（開始のクローニングベクターを含む）
実施例１．ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩベクターの構築
プラスミドｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩを構築するため、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩをＮｄｅＩで消化した。突出末端をクレノウ断片で平滑化することにより、ポリリンカー領域の外側のＮｄｅＩ部位を破壊した。直鎖状プラスミドを再び閉じて、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩ（ＮｄｅＩ−）を作成した。このプラスミドによりＤＨ５αを形質転換して、プラスミドを一つの結果として生じたアンピシリン耐性コロニーから単離した。プラスミドをＮｄｅＩ部位の損失に関してスクリーニングした。クレノウ断片によりフィルインされた領域を配列決定することにより、ＮｄｅＩ部位の損失を確認した（ＡＴＧＳＥＱ ６６１，プライマーＰ６５−Ｓ２５２９）。ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩ（ＮｄｅＩ−）をＰａｃＩとＳｐｅＩ制限酵素により消化した。これは、ＰａｃＩＮｃｏＩ−スペーサー−ＫｐｎＩ−スペーサー−ＦｓｅＩ−ＳｐｅＩ制限部位を含むポリリンカーを除去した。ＰａｃＩ及びＳｐｅＩの粘着末端を含む、アニールさせたＤＮＡ二重鎖又はアダプター／リンカー（下に示す）（ＡＴＧリンカー／アダプターＰ６５−Ｓ１及びＰ６５−Ａ１）を、消化したｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩ（ＮｄｅＩ−）プラスミドに挿入した。
このアダプター／リンカーのｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩ（ＮｄｅＩ−）内への導入は、制限部位ＰａｃＩ−ＮｄｅＩ−スペーサー−ＮｈｅＩ−ＫｐｎＩ−ＦｓｅＩ−ＳｐｅＩを含むポリリンカーを新たに形成させた。このプラスミドによりＤＨ５αを形質転換して、プラスミドを一つの結果として生じたアンピシリン耐性コロニーから単離した。これらのプラスミドをＮｄｅＩ部位の導入に関してスクリーニングした。挿入された配列を含む領域をＤＮＡ配列決定に供することにより、正確な配列の挿入を確認した（ＡＴＧＳＥＱ＃７１８，プライマーＰ３８−Ｓ５５７６）。このプラスミドをｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩと命名し、陽性単離物を生育させて、グリセロールストック培養物として保存した。
実施例２．ｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩの構築
ｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩを構築するため、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩをＮｄｅＩで消化した。突出末端をクレノウ断片で平滑化することにより、ポリリンカー領域の外側のＮｄｅＩ部位を破壊した。直鎖状プラスミドを再び閉じて、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩ（ＮｄｅＩ−）を作成した。このプラスミドによりＤＨ５αを形質転換して、プラスミドを一つの結果として生じたアンピシリン耐性コロニーから単離した。プラスミドをＮｄｅＩ部位の損失に関してスクリーニングした。クレノウ断片によりフィルインされた領域を配列決定することにより、ＮｄｅＩ部位の損失を確認した（ＡＴＧＳＥＱ ６６１，プライマーＰ６５−Ｓ２５２９）。ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩ（ＮｄｅＩ−）をＰａｃＩとＳｐｅＩ制限酵素により消化した。これは、ＰａｃＩＮｃｏＩ−スペーサー−ＫｐｎＩ−スペーサー−ＦｓｅＩ−ＳｐｅＩ制限部位を含むポリリンカーを除去した。ＰａｃＩ及びＳｐｅＩの粘着末端を含む、アニールさせたＤＮＡ二重鎖又はアダプター／リンカー（配列番号：１３４及び配列番号：１３５に示す）（ＡＴＧリンカー／アダプターＰ６５−Ｓ１及びＰ６５−Ａ１）を、消化したｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩ（ＮｄｅＩ−）プラスミドに挿入した。
このアダプター／リンカーのｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩ（ＮｄｅＩ−）内への導入は、制限部位ＰａｃＩ−ＮｄｅＩ−スペーサー−ＮｈｅＩ−ＫｐｎＩ−ＦｓｅＩ−ＳｐｅＩを含むポリリンカーを新たに形成させた。このプラスミドによりＤＨ５αを形質転換して、プラスミドを一つの結果として生じたアンピシリン耐性コロニーから単離した。これらのプラスミドをＮｄｅＩ部位の導入に関してスクリーニングした。挿入された配列を含む領域をＤＮＡ配列決定に供することにより、正確な配列の挿入を確認した（ＡＴＧＳＥＱ＃７１８，プライマーＰ３８−Ｓ５５７６）。このプラスミドをｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩと命名し、陽性単離物を生育させて、グリセロールストック培養物として保存した。
実施例３．サブユニットの同定
シュードモナス・エルギノーサのサブユニットα＃１、β、δ、δ’、及びＤｎａＸを、共に係属中の２００１年７月１６日出願の米国特許出願連続番号０９／９０６，１７９に記載されたとおりに、Ψ−ＢＬＡＳＴ又はｔｂｌａｓｔｎ ＢＬＡＳＴサーチを用いて同定した。
シュードモナス・エルギノーサ由来のα＃２、ε、χ、ＤｎａＧ及びＳＳＢサブユニットをコードする遺伝子を同定するため、ゲノミックリサーチ研究所のＴＩＧＲにて進行中の配列決定計画からデータベースを検索した。当該検索は、それぞれ、大腸菌由来のα、ε、χ、ＤｎａＧ及びＳＳＢにより開始した。当該検索は、ｔｂｌａｓｔｎＢＬＡＳＴサーチを用いて実行した。これらのｔｂｌａｓｔｎ ＢＬＡＳＴを用いた設定（Ｇｉｓｈ，Ｗ．ａｎｄＳｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２（１９９３））。このプログラムは、６つの全リーディングフレーム内で翻訳されたヌクレオチドデータベースに対する蛋白質クエリー配列を比較する。
エルシニア・ペスティスのサブユニット、α、β、δ、δ’、及びＤｎａＸを、その全体を引用により本明細書に編入する、共に係属中の２００１年７月１６日出願の米国特許出願連続番号０９／９０６，１７９に記載されたとおりに、Ψ−ＢＬＡＳＴ又はｔｂｌａｓｔｎ ＢＬＡＳＴサーチを用いて同定した。エルシニア・ペスティス由来のε、θ、χ、Ψ、ＤｎａＧ及びＳＳＢサブユニットは、サンガーセンターにおいて進行中のｔｂｌａｓｔｎＢＬＡＳＴを用いて実行した。当該検索は、ｔｂｌａｓｔｎ ＢＬＡＳＴサーチを用いて実行した。当該検索は、大腸菌由来のε、θ、χ、Ψ、ＤｎａＧ及びＳＳＢにより開始した。上記サブユニットをコードする遺伝子が同定されれば、遺伝子配列は蛋白質配列に翻訳された。
実施例４．蛋白質を発現及び分析するための一般的手法
４．１．細胞の形質転換及び蛋白質の発現
全ての中間プラスミドによりＤＨ５α細菌を形質転換する。ａｍｐＲコロニーを選択して、プラスミドを適当な制限酵素部位の獲得又は損失に関してスクリーニングする。挿入されたＤＮＡの配列は、ＤＮＡ配列決定により確認する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及びＡＴＰの存在下で実施する。突出末端は、Ｍｇ＋＋及びｄＮＴＰｓの存在下でＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片による処理により平滑化する。
プラスミドによりＭＧＣ１０３０大腸菌細菌（ｍｃｒＡ，ｍｃｒＢ，ｌａｍＢＤＡ（−），ＲＲＮＤ−ＲＲＮＥ１，ｌｅｘＡ３）及びＡＰ１．Ｌ１大腸菌を形質転換する。ＡＰ１．Ｌ１細菌株に対する親株はＮｏｖａｇｅｎＢＬＲ細菌株［Ｆ−，ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ ｄｃｍ（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）３０６：：Ｔｎ１０］である。このＢＬＲ株のＴ１ファージ−耐性バージョンをＡＰ１．Ｌ１と命名した。アンピシリン耐性に関して選択された形質転換細胞の単一コロニー（各形質転換から少なくとも３コロニー）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｍｌの２ｘＹＴ培養培地へ接種して、振盪インキュベーター中で３７℃において一晩生育させる。朝に、一晩生育からの濁った培養物０．５ｍｌを１．５ｍｌの新鮮な２ｘＹＴ培養培地に接種する。培養物を１時間３７℃において振盪しながら生育させて、発現を最終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導する。細胞を誘導３時間後の遠心分離により回収する。細胞沈殿物をすぐに１／１０培養容量の２ｘレムリサンプルバッファー（２ｘ溶液：１２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），２０％グリセロール、４％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ），５％β−メルカプトエタノール、及び０．００５％ブロムフェノールブルーｗ／ｖ）に懸濁して、細胞が完全に溶解するまで音波処理して、ＤＮＡを専断する。サンプルを１０分間９０−１００℃にて加熱し、そして遠心分離することにより、不溶性の残渣を除去する。全細胞蛋白質を含む各上清の小アリコート（３μｌ）を４−２０％の勾配ＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル（Ｎｏｖｅｘ，ＥＣ６０２５５；１ｍｍ厚、１５ウエル／ゲル）上で、２５ｍＭのＴｒｉｓ塩基、１９２ｍＭグリシン、及び０．１％ＳＤＳ中で電気泳動する。ミニゲルはクマジーブルーで染色する。誘導された培養物からの蛋白質を、非誘導培養物からのサンプルと比較することにより、誘導培養物のみに観察される標的蛋白質の存在を確認する。
４．２．タグを付加した蛋白質の発現
蛋白質をタグを付加した蛋白質として発現するなら、ｄ−ビオチン（１０μＭ）を生育培地に含ませる。各溶解物中の全蛋白質を上記のとおりにポリアクリルアミドゲル上で電気泳動する。各溶解物中の全蛋白質を次にポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース膜へＮｏｖｅｘ転写装置を用いて３０Ｖ低圧にて１２ｍＭＴｒｉｓ塩基、９６ｍＭグリシン、０．０１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、及び２０％メタノール（ｖ／ｖ）中で６０分間室温にて移動させる。膜を、５％の非脂肪ドライミルク（ｗ／ｖ）を含む０．２％ツイーン２０（ｖ／ｖ）−ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）（ｔｒｉｓ−緩衝塩溶液；８ｇ／ＬＮａＣｌ，０．２ｇ／Ｌ ＫＣｌ，３ｇ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））中で１時間室温にてブロックする。ブロットされたニトロセルロースを次にＴＢＳＴにより洗浄して、次に、ＴＢＳＴ中の２μｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼコンジュゲートストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．＃２１３２４）中で１時間室温にてインキュベートする。ＴＢＳＴによる大規模な洗浄に続いて、ブロットをＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＫＰＬ＃５０−８１−０７；１成分系）により発色させる。内因性大腸菌ビオチン−カルボキシルキャリアー蛋白質（ビオチン−ＣＣＰ）約２０ｋＤａは、誘導サンプル及び非誘導サンプルの両方において検出可能である。標的蛋白質は誘導培養物中では明確なバンドとして観察されるが、非誘導培養物中では観察されない。
４．３．蛋白質発現の確認
プラスミドにより大腸菌ＡＰ１．Ｌ１を形質転換する。ＡＰ１．Ｌ１細菌株に対する親株はＮｏｖａｇｅｎＢＬＲ細菌株［Ｆ−，ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ ｄｃｍ（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）３０６：：Ｔｎ１０］である。このＢＬＲ株のＴ１ファージ−耐性バージョンをＡＰ１．Ｌ１と命名した。アンピシリン耐性に関して選択された形質転換細胞の単一コロニー（各形質転換から少なくとも３コロニー）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｍｌの２ｘＹＴ培養培地へ接種して、振盪インキュベーター中で３７℃において一晩生育させる。朝に、一晩生育からの濁った培養物０．５ｍｌを１．５ｍｌの新鮮な２ｘＹＴ培養培地に接種する。培養物を１時間３７℃において振盪しながら生育させて、発現を最終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導する。細胞を誘導３時間後の遠心分離により回収する。細胞沈殿物をすぐに１／１０培養容量の２ｘレムリサンプルバッファー（２ｘ溶液：１２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），２０％グリセロール、４％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ），５％β−メルカプトエタノール、及び０．００５％ブロムフェノールブルーｗ／ｖ）に懸濁して、細胞が完全に溶解するまで音波処理して、ＤＮＡを専断する。サンプルを１０分間９０−１００℃にて加熱し、そして遠心分離することにより、不溶性の残渣を除去する。全細胞蛋白質を含む各上清の小アリコート（３μｌ）を４−２０％の勾配ＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル（Ｎｏｖｅｘ，ＥＣ６０２５５；１ｍｍ厚、１５ウエル／ゲル）上で、２５ｍＭのＴｒｉｓ塩基、１９２ｍＭグリシン、及び０．１％ＳＤＳ中で電気泳動する。ミニゲルはクマジーブルーで染色する。標的サブユニットに相当する分子量により蛋白質に関して予測された部位に移動する蛋白質のバンドが明確なバンドとして検出されるべきであるが、非誘導対照中では観察されないべきである。
４．４．細菌の大規模な生育
細菌を２５０リットルの発酵機中で生育させることにより、エルシニア・ペスティスの蛋白質の精製のために細胞を製造した。Ｆ−培地を滅菌して、グルコースを１％から４０％滅菌溶液に加え、そしてアンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）を加えた。大規模な接種物（２８ｌ）を１ｍｌグリセロールストック培養物から開始して（即ち、１５％グリセロール中で−８０℃にてストックした培養物）、４０ｌ／分の通気にて３７℃にて一晩生育させた。接種物（約４．２ｌ）を、１％グルコース、及び１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１８０ｌのＦ−培地を含む２５０リットルの発酵機に移した（０．０６のＯＤ６００から開始）。発酵機に加えるための一晩培養物の量を計算するため、この発酵においては、発酵機に存在する培地をＯＤ６００＝０．０６にするのに加えられるべき十分な１８０ｌのＦ−初期培地が存在した。これは、細胞密度を誘導前に３−４倍に倍加させるのに十分な時間を与える。培養物を３７℃にて、４０ｌ／分の通気にてインキュベートして、２０ｒｐｍにて撹拌した。エルシニア・ペスティスの蛋白質の発現は、培養物が０．７９のＯＤ６００に到達したときに、ＩＰＴＧを１ｍＭまで添加することにより誘導した。追加のアンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）を誘導と同時に加えた。温度は生育を通して約３７℃に維持した。ｐＨは、ＮＨ４ＯＨの添加により生育を通して７．２に維持した。細胞の回収は、ＯＤ６００＝約６にて誘導後に様々な時間（通常は３−４時間後）開始し、そして細胞は回収の間１０℃に冷却した。回収容量は通常１５０から２００Ｌの間であり、そして最終回収重量は通常１．５から２．０ｋｇの細胞ペーストであった。等量（ｗ／ｗ）の５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）及び１０％蔗糖溶液を細胞ペーストに加えた。細胞懸濁液を液体窒素に注ぐことにより細胞を凍結させ、そして加工まで−２０℃に保存した。陽性コロニーはコロニーを選択性抗生物質を含むＬＢプレートに移したときにも生育するＬＢプレート上でストリークされたサンプルから生育させたコロニーである。
４．５．ＦｒＩ（細胞溶解）の調製
細胞の溶解は、発現されたエルシニア・ペスティスの蛋白質を有する細胞のスフェロプラストの創製により達成する。−２０℃において保存されていた、様々な量のＴｒｉｓ−蔗糖中の凍結細胞の１：１懸濁液を、予め５５℃に温めてあったＴｒｉｓ−蔗糖バッファーに加える（２．７５ｍｌ／細胞のｇ）。撹拌された混合物に、０．５Ｍの１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（０．０５ｍｇ／細胞のｇ）及び溶解バッファー（ｐＨ７．５に調節されたＴｒｉｓ−蔗糖中の２ＭＮａＣｌ，０．３Ｍスペルミジン）（０．２５ｍｌ／細胞のｇ）を加える。溶解バッファー中のスペルミジン（１８ｍＭ）を加えることにより、部分的に破壊された細胞中の濃縮された核様体を保持して、ＤＮＡ結合蛋白質をはずす。スラリーのｐＨは２ＭのＴｒｉｓ塩基の添加によりｐＨ７．５に維持し、そしてリゾチーム（ワシントンバイオケミカルコーポレーション、カタログ番号３８Ｈ２０８８）を５ｍｌのＴｒｉｓ−蔗糖バッファーに懸濁して加える（４ｍｇリゾチーム／細胞のｇ）。スラリーを撹拌後に２５０ｍｌの遠心分離ボトルに入れて、４℃において1時間インキュベートする。２５０ｍｌの遠心分離ボトルを次に３７℃の渦巻き水浴の中に入れて、４分間に３０秒ずつゆっくりと倒置する。不溶性の細胞成分を遠心分離により取り除く（２３，０００ｘｇ，６０分間、４℃）。回収された上清（典型的には１００ｍｌ）をフラクションＩ（Ｆｒ Ｉ）とする。
４．６．再構成アッセイ
再構成アッセイ中の鋳型は、ＲＮＡプライムされたＭ１３Ｇｏｒｉ一本鎖環状ＤＮＡである。ＲＮＡプライムされたＭ１３Ｇｏｒｉ一本鎖環状ＤＮＡは、０．５ｍｌのＭｇＯＡｃ（２５０ｍＭ），１．１２５ｍｌのＭ１３Ｇｏｒｉ（２４０μＭ，ｎｔ），０．２ｍｌの精製された大腸菌ＳＳＢ蛋白質（４．３ｍｇ／ｍｌ），１．５ｍｌのｄＮＴＰミックス（４００μＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及び１５０μＭの［３Ｈ］−ｄＴＴＰ；計算上は１００ｃｐｍ／ポリメラーゼにより取り込まれる全ヌクレオチドのｐｍｏｌ（比活性ｄＴＴＰ／４）），０．５ｍｌのｒＮＴＰミックス（５ｍＭの各ＡＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ及びＵＴＰ），０．０２５ｍｌの精製された大腸菌プライマーゼ（０．６６５ｍｇ／ｍｌ）及び５．６５ｍｌのＥＤＢ（５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５），２０％グリセロール、０．０２％のＮＰ４０，０．２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）を加えることにより調製した。放射活性ｄＮＴＰミックスは、プライミング反応において使用しなかったが、実際の再構成反応において使用するときは複製ポリメラーゼにより使用された。プライミングミックスは、３０℃において５分間インキュベートして、次に氷の上に置いた。混合物を４００μｌのアリコートに分割して、使用するまで−８０℃に保存した。この混合物を全ての再構成アッセイにおいて使用して、プライムされた鋳型ミックスと命名する。ＲＮＡプライムされた鋳型混合物を全てのＭ１３Ｇｏｒｉアッセイにおいて使用して、プライムされた鋳型ミックスと命名する。エルシニア・ペスティス（又は大腸菌）の成分（コア、クランプ−負荷複合体、及びβ）を６０μｌの全容量にてＥＤＢバッファー中で所望の濃度に希釈し、そして１９μｌのプライムされた鋳型ミックスと混合して２５μｌの反応物を生じさせる。混合後に、反応物の含有物を５分間３０℃においてインキュベートした。反応は、反応チューブを氷の上に置いて、２滴の０．２Ｍピロリン酸ナトリウム及び０．５ｍｌの１０％のＴＣＡを添加することにより停止させる。当該溶液を真空下でワットマンＧＦ／Ｃガラスマイクロファイバーフィルターを通して濾過する。フィルターは次に３アッセイチューブ容量（３ｘ５ｍｌ）の１ＭＨＣｌ／０．２Ｍピロリン酸ナトリウム及び１アッセイチューブ容量（５ｍｌ）の９５％エタノールで洗浄して、加熱ランプを用いて乾燥させる。取り込まれた放射活性ヌクレオチドの量はシンチレーション計数により定量する。１ユニットの活性は６０℃において１分あたりに取り込まれる１ｐｍｏｌの全デオキシリボヌクレオチドである。
エルシニア・ペスティスの核酸及び蛋白質に関する実施例
Ｐｏｌ ＩＩＩコア
到達点は、ｐｏｌ ＩＩＩサブユニットを含む３遺伝子（ε、θ及びα）のオペロンを作成することであった。段階的な手法を利用し、ベクター中に個別にクローン化された各遺伝子を用いて開始することにより、単独で発現させることができ、遺伝子の３遺伝子オペロンへの段階的組み合わせへと続く。
実施例５．複製ポリメラーゼｄｎａＥ（アルファ）をコードする遺伝子、エルシニア・ペスティスのｄｎａＥの分子クローニング
最近完了したエルシニア・ペスティスのゲノミックデータベース（サンガーデータベース（２００１））を、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットをコードする遺伝子に関して検索した。ｄｎａＥ（α）サブユニットに関する遺伝子が、他の公知のＤｎａＥ（α）サブユニットに対するその相同性から同定された。エルシニア・ペスティスからのＤｎａＥ蛋白質に関するアミノ酸配列とこの出願を通して比較のために一律に使用された細菌の選択されたサブセットの比較は、蛋白質配列の全部の長さにわたりそれらが相同であって整列化（align）されることを示す。
この実施例においては、ゲノミックＤＮＡからのｄｎａＥ遺伝子（αサブユニット）のＰＣＲ増幅を実施する。ＰＣＲ産物をベクターｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩに挿入した。このベクターのポリクローナル領域を図１０に示す。αサブユニットは、ｄｎａＥ遺伝子の３４８３ヌクレオチドによりコードされる１１６１アミノ酸からなる。ｄｎａＥのヌクレオチド配列は、配列番号：１により表される。コドン２と４（下線を付された文字の中のヌクレオチド配列中に示される）Ａｌａ及びＰｒｏをコードするが大腸菌において低使用頻度であり、ＰＣＲ反応において高使用頻度コドンに変更した。変更は、ＡＴＧＧＣＣＧＡＡＣＣＴ（配列番号：４）からＡＴＧＧＣＴＧＡＡＣＣＧ（配列番号：５）である。アルファのアミノ酸配列は、配列番号：３により表される。
これは大きな遺伝子であるから、２つの別の反応においてＰＣＲにより増幅した。第１のＰＣＲ反応においては、５’の１４４５ヌクレオチドを増幅する。唯一のＮｈｅＩ制限部位がｄｎａＥ遺伝子のヌクレオチド位置１４４０−１４４５に位置して存在する。ｄｎａＥ遺伝子のこの領域を図９に示す。第１ＰＣＲ反応のためのフォワード／センスプライマーは：
である。５’クランプ領域（ＧＡＴＣ）はｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩへの挿入のためのＰａｃＩ制限部位へと続き（下線イタリック文字）、コアオペロンの続く構築において使用されるＡｖｒＩＩ制限部位（イタリック文字）へと続く。次に、１２ｎｔｓ（最初の４コドン、コドン２と４に変異を有する）が存在し、大文字のイタリックにより示す。最後に、コドン５から始まるｄｎａＥの５’末端に相補な１８ヌクレオチドが存在する（下線大文字）。
リバース／アンチセンスプライマーゼは、唯一のＮｈｅＩ制限部位の下流の領域に相補である。このプライマーは：
である。使用可能な唯一のＮｈｅＩのちょうど下流に唯一のＫｐｎＩ部位も存在し、約８００塩基下流にＰｓｔＩ部位も存在する。ＮｈｅＩ制限部位は太字で示し、唯一のＮｈｅＩの上流（フォワード第２ＰＣＲ反応）及び下流（リバース第１ＰＣＲ反応）を太字の下線文字で示す。
ＰＣＲ産物とプラスミドｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩの両方をＰａｃＩ／ＮｈｅＩ制限酵素で消化した。ｄｎａＥ遺伝子の５’部分を含むＰＣＲ断片をＰａｃＩ／ＮｈｅＩ消化したｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩに挿入した。これはプラスミドｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＥ５’をもたらし、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩ内のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）のスペースを入れた１４ヌクレオチド下流のｄｎａＥ遺伝子の５’部分を含み、最適なスペース距離より少し上回る。しかしながら、コアオペロン内に配置する場合、上記の距離は最適である。ｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＥ５’の模式的な描写を図１１に示す。第２ＰＣＲ反応においては、ｄｎａＥ遺伝子の３’の２０３８ヌクレオチドを増幅した。唯一のＮｈｅＩ制限部位の上流に位置するフォワード／センスプライマーは：
である。両方／センスプライマーは、
である。５’クランプ領域（ＧＡＴＣ）に、ｐＡ１−ＹＰ−５’への挿入のためのＳｐｅＩ制限部位（イタリック文字）（この部位はコアオペロンの構築にも使用される）及び追加の停止コドン（二重下線文字）が続く。最後に、ｄｎａＥ遺伝子の３’末端に相補な１９ヌクレオチドが存在する（天然の停止コドンを含む）。
ＰＣＲ産物とプラスミドｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＥ５’の両方をＮｈｅＩ／ＳｐｅＩ制限酵素で消化した。ｄｎａＥ遺伝子の５’部分を含むＰＣＲ断片をＮｈｅＩ／ＳｐｅＩ消化したｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＥ５’に挿入した。これはプラスミドｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＥ５’をもたらし、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩ内のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）のスペースを入れた１４ヌクレオチド下流のｄｎａＥ遺伝子の５’部分を含み、最適なスペース距離よりいくらか長い。しかしながら、コアオペロン内に配置する場合、上記の距離は最適である。ｄｎａＥ挿入物の配列決定により概説された上記ベクター内の天然（未変異）ｄｎａＥ遺伝子の存在を確認した。ｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＥベクターの模式的な描写を図１２に示す。
実施例６．大腸菌内でのアルファの発現
自身により発現されるエルシニア・ペスティスのＤｎａＥの精製を以前の仕事に関して達成する。酵素の回収及び位置は付属因子を必要としない当業界公知の単純なアッセイを用いて監視することができる−ヌクレアーゼ活性化ＤＮＡにおける非プロセッシブなギャップフィリング（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｒ．ａｎｄＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．（１９９６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１，２０６８１−２０６８９７９）。一般に、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩアルファサブユニットは硫酸アンモニウムに相対的に不溶性である。エルシニア・ペスティスのＤｎａＥを少なくとも９０％を沈殿させる最も低い濃度の硫酸アンモニウムを用いた。大腸菌蛋白質の大部分は上清中に残る。カチオン交換クロマトグラフィーはポリメラーゼの良好な精製をもたらす。それらは、ほとんどの大腸菌蛋白質がフロースルーする条件下で樹脂を結合し、ポリメラーゼは塩勾配において高い精製度で溶出される。この段階において純粋な蛋白質を得ることは期待されるが、もしも達成されないならば、活性の保存を伴って最大の精製度を達成する追加の当業界公知のクロマトグラフィー工程が開発される。全蛋白質レベルはこの出願に記載されるこの精製及び他の精製においてブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，同じ箇所）により測定される。
実施例７．イプシロンサブユニットをコードする遺伝子であるエルシニア・ペスティスのｄｎａＱの分子クローニング
ｄｎａＱ遺伝子（εサブユニット）をゲノミックＤＮＡからＰＣＲにより増幅して、ベクターｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩに挿入した（このベクターのポリクローナル領域を図１０に示す）。εサブユニットはｄｎａＱ遺伝子の７６５ヌクレオチドによりコードされた２５５アミノ酸からなる。ｄｎａＱのヌクレオチド配列は、配列番号：８により表される。εサブユニットのアミノ酸配列は、配列番号：１０により表される。
フォワード／センスプライマーは：
である。５’クランプ領域（ＧＡＴＣ）に、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩへの挿入のためのＮｄｅＩ部位（イタリック文字）が続く。ＮｄｅＩ制限部位はｄｎａＱ上ではＡＴＧ開始コドンとオーバーラップする。ｄｎａＱの５’末端に対応する１７のヌクレオチドを下線の大文字で示す。
リバース／アンチセンスプライマーは：
である。
５’クランプ領域（ＧＡＴＣ）に、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩへの挿入のためのＫｐｎＩ制限部位（イタリック文字）が続き、そしてＰｓｔＩ部位（イタリック文字）とは分離され、３塩基のスペーサー（太字、ｔｇｔ）によりコアオペロンの構築に使用される。この３塩基のスペーサーはコアオペロンの構築のためののちの工程においてＫｐｎＩ及びＰｓｔＩの両方による有効な制限消化を可能にするのに必要である。制限部位に続き、別の３塩基スペーサー（太字下線文字）があることにより、下に記載のコアオペロンの構築においてＲＢＳと下流の遺伝子の間に距離設定を最適化する。このスペーサーに続き、下流の遺伝子のためのＲＢＳ（太文字）が存在し、コアオペロンと追加の停止コドンの構築においてのちに加えられる（二重下線文字）。最後に、ｄｎａＱ遺伝子の３’末端に相補な１８ヌクレオチドが存在し、天然停止コドンを含む（下線大文字）。
ｄｎａＱのＰＣＲ産物とｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩの両方をＮｄｅＩ／ＫｐｎＩ制限酵素で消化した。ｄｎａＱ遺伝子を含むＰＣＲ産物の断片を、ＮｄｅＩ／ＫｐｎＩ消化したｐＡ１−ＣＢ−ＭｄｅＩに挿入した。これは、上流のＲＢＳから最適にｄｎａＱ遺伝子を離し、そしてプラスミドｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＱをもたらし、図１３に模式的に示される。
実施例８．シータサブユニットをコードする遺伝子であるエルシニア・ペスティスのｈｏｌＥの分子クローニング
この実施例は、ゲノミックＤＮＡからのｈｏｌＥ遺伝子（θ）のＰＣＲ増幅及びｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩへのその挿入を記載する。θサブユニットはｈｏｌＥ遺伝子の２３１ヌクレオチドによりコードされる７７アミノ酸からなる。ｈｏｌＥのヌクレオチド配列は、配列番号：１３により表される。Ｇｌｙ，Ｔｙｒ，及びＡｓｎをコードするコドン２、３、及び４は、大腸菌において低い使用頻度で有り、ＰＣＲ反応において高い使用頻度のコドンに変更した。当該変更は、ＧＧＡＴＡＴＡＡＴからＧＧＣＴＡＣＡＡＣである。θのアミノ酸配列は配列番号：１５により表される。
フォワード／センスプラスミドは：
である。５’クランプ領域に、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩへの挿入のためのＰａｃＩ制限部位（下線イタリック文字）が続き、コアオペロン構築のためののちの使用のためのＰｓｔＩ制限部位（イタリック文字）が続く。これは、開始ＡＴＧ及び変異したコドン２、３、及び４（大文字イタリック文字）を含む１２ヌクレオチド（４つのコドン）に続く。最後に、ｈｏｌＥのコドン５から始まる５’ヌクレオチドに相当する１９ヌクレオチドである（大文字及び下線）。
リバース／アンチセンスプライマーは：
である。
５’クランプ領域（ＧＡＴＣ）に、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩへの挿入のためのＫｐｎＩ部位（イタリック文字）に続き、コアオペロンののちの構築のためのＡｖｒＩＩ制限部位（下線イタリック文字）に続く。下流の遺伝子の最適な距離設定のための３塩基スペーサー（太字ａｔｔ）（コアオペロンののちの構築における）が上記制限部位に続く。これは、ＲＢＳ（太字下線文字）及び追加の停止コドン（二重下線文字）へと続く。最後に、ｈｏｌＥ遺伝子の３’末端に相補な１８ヌクレオチドを下線の大文字で示す。ＰＣＲ産物とプラスミドｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩの両方をＰａｃＩ／ＫｐｎＩ制限酵素で消化した。ｈｏｌＥ遺伝子を含むＰＣＲ断片をＰａｃＩ／ＫｐｎＩで消化したｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩに挿入した。これはプラスミドｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＥをもたらし、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩの間隔を空けた１４ヌクレオチド下流のｈｏｌＥ遺伝子を含み、スペースをとる距離を最適化するにはいくらか短い。しかしながら、コアオペロンに置かれる場合には、上記の距離設定が最適である。ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＥの模式的描写を図１４に示す。
実施例９．オペロン構築
９．１．ＨｏｌＱＥオペロンの構築
この実施例においては、ｄｎａＱ遺伝子とｈｏｌＥ遺伝子を含む２遺伝子オペロンを構築した。これは、ｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＱ及びｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＥの両方のＰｓｔＩ／ＫｐｎＩによる消化により達成された。ＰｓｔＩ／ＫｐｎＩ部位の間にｈｏｌＥ遺伝子を含むｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＥからの小断片を消化されたｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＱプラスミドに挿入した。これは、ｄｎａＱの下流にｈｏｌＥを配置して、ｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＱ内で創製されたＲＢＳから最適に離れた下流でもある。このプラスミドはｐＡ１−ＹＰ−ＱＥと命名されて、図１５において模式的に示す。
９．２．コアオペロンの構築
この実施例は、ｄｎａＱ、ｈｏｌＥ及びｄｎａＥを含む３遺伝子（コア）を記載する。これは、ｐＡ１−ＹＰ−ＱＥ及びｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＱの両方のＡｖｒＩＩ／ＳｐｅＩによる消化により達成した。ｄｎａＥ遺伝子（αサブユニット）をＡｖｒＩＩ／ＳｐｅＩ部位の間に含むｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＥからの小断片を、消化したｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＱプラスミドに挿入した。これは、ｄｎａＱ−ｈｏｌＥの下流にｄｎａＥを配置したが、ｐＡ１−ＹＰ−コア内で創製されたＲＢＳから最適に離れた下流でもあった。このプラスミドはｐＡ１−ＹＰ−コアと命名されて、図１６において模式的に示す。
９．３．コアオペロンの発現
ｐＡ１−ＹＰ−コアにより大腸菌のＡＰ１．Ｌ１株を形質転換して、実施例４．１に記載されるとおりに発現させた。発現された蛋白質を実施例４．１に記載されたとおりにしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ミニゲルをクマジーブルーで染色した。α（１３０ｋＤａ），ε（２８．９ｋＤａ）及びθ（９ｋＤａ）に対応する分子量の蛋白質に関して予測された部位に移動する蛋白質バンドが別々の蛋白質バンドとして検出できたが、非誘導対照においては観察されなかった。
実施例１０．大腸菌内でのＹ．ｐＡのコア蛋白質の発現の最適化
発現された組換えエルシニア・ペスティスのコア蛋白質の収量を最適化するための試みにおいて、誘導時間をｐＡ１−ＹＰ−コアに関して分析した。Ｆ−培地（バクトイーストエキストラクト、１４ｇ／ｌ；バクトトリプトン、８ｇ／ｌ；リン酸水素二カリウム、１２ｇ／ｌ；リン酸二水素カリウム，１．２ｇ／ｌ；ｐＨ７．２，１％グルコース）を生育培地として用いた。アンピシリンを含む少量のＦ−培地（１０−２０ｍｌ）に標的細菌を接種して３７℃において撹拌しながら生育させた。この一晩培養物を用いて、予め３７℃に温められたアンピシリンを含む新鮮なＦ−培地を接種した。新鮮な培地を２０：１の比にて培養生育を用いて一晩接種した。これは、誘導前に３−４倍に細胞密度を倍加させるために十分な時間を与えた。新鮮に接種された培養物をＯＤ６００＝０．６−０．８の間で生育させて、ＩＰＴＧの１ｍＭの添加により誘導した。
培養物の等サンプル容量（５ｍｌ）を誘導の時及び１時間ごとに５時間まで分析のために回収することにより、最適生育時間を決定した。各サンプルのＯＤ６００を測定した。回収されたサンプルをフィッシャーセントリフィックモデル２２８（１３８０ｘｇ）内で１０分間遠心分離した。上清を捨てて、細胞沈殿物を分析の為に残した。各サンプル中の全蛋白質の等濃度を保持するため、５０μｌのレムリ溶解バッファー（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ６．８），２０％グリセロール、５％ＳＤＳ）を、サンプル容量（５ｍｌ）を掛けた各サンプルのＯＤ６００ユニットあたり加えた。細胞沈殿物を懸濁して９０−１００℃において１０分間加熱した。サンプルを最大ｒｐｍ（１６，０００ｘｇ）にて１０分間テーブルトップマイクロ遠心分離機上で遠心分離して、上清を残した。各上清の全細胞蛋白質を含む小アリコート（５μｌ）を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基中、１９２ｍＭグリシン、及び０．１％ＳＤＳ中の１０％又は５−２０％の勾配ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１６ｘ１８ｘ０．７５ｃｍ）上に負荷した。ゲルは、２時間２５０ボルトにて泳動して、蛋白質をクマジーブルー染色で可視化した。
ｐＡ１−ＹＰ−コアに関してＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析された生育最適化の結果を図１７に示す。このゲルにおいて、エルシニア・ペスティスのαは高いレベルに発現され、全細胞蛋白質の約１０％に達した。分子質量マーカーはゲルの右側に示す。
実施例１１．コアオペロンの大規模な生育
ｐＡ１−ＹＰ−コアプラスミドを含む大腸菌の大規模な生育は実施例４．４に記載されたとおりであったが、しかしながら、当該細菌は、１．４４ｋｇの回収重量を与える誘導の後３．５時間生育を続けることを可能にされた。量的な対照の結果は、接種物中アンピシリン含有培地上で１０の陽性コロニーのうち１０を示し、そして回収時にアンピシリンを含む培地上で１０の陽性コロニーのうち１０を示した。
実施例１２．エルシニア・ペスティスのコアの精製
最初の精製工程として、多くの内因性大腸菌蛋白質を、硫酸アンモニウム（ＡＳ）を興味のある蛋白質（及びいくつかの内因性蛋白質）が溶液から析出するが他の蛋白質が溶液中に残ることを引き起こす濃度まで添加することにより除去することができる。沈殿した蛋白質は、次に、遠心分離により溶液中にまだ残る蛋白質が蛋白質から分離することができる。各蛋白質は、異なる濃度の硫酸アンモニウムにて溶液から析出する（アミノ酸組成、極性／非極性表面の露出したアミノ酸の分散、分子形態及び水和のレベルに依存して）。よって、各標的蛋白質が溶液から沈殿する硫酸アンモニウムの濃度を測定しなければならない（パーセント飽和として表現する）。
−２０℃に保存されていたＴｒｉｓ−蔗糖中の凍結した細胞（３５ｇ細胞）の１：１懸濁液７０ｇを溶解することにより、最大活性を含むが混在する蛋白質を最少量しかもたない大量のコア複合体を沈殿させる硫酸アンモニウムの最適濃度を決定した。
Ｆｒ Ｉを各１５ｍｌの７サンプルに分割して、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％及び６０％と標記した。各サンプル中の蛋白質を、量を変えた硫酸アンモニウムを添加することにより沈殿させたところ、硫酸アンモニウムの濃度はそれぞれ４℃において２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％及び６０％飽和であった。混合物をさらに３０分間４℃において撹拌して、沈殿物を遠心分離により回収した（２３，０００ｘｇ，４５分、０℃）。上清を各サンプルから除去して、結果生じる沈殿物をバッファー（２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５），５ｍＭ ＥＤＴＡ，１０％グリセロール、５ｍＭ ＤＴＴ，１００ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁し、各（７）硫酸アンモニウム沈殿させたサンプルに関してＦｒＩＩを生じた。上清及びＦｒ ＩＩの両方からのサンプルの濃度を図１８に示す。これは、懸濁した蛋白質沈殿物のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析により確認した（データは示さず）。
エルシニア・ペスティスのコアを精製するために、エルシニア・ペスティスのコアを含む細胞４００ｇを溶解して、ＦｒＩを上記のとおりに形成させ、そして１２７０ｍｌのＦｒ Ｉ溶解物をもたらした。サンプル中の蛋白質を勾配硫酸アンモニウムにより沈殿させたところ、硫酸アンモニウムの最終濃度は４℃において４５％であった。混合物をさらに３０分間４℃において撹拌して、沈殿物を遠心分離により回収した（２３，０００ｘｇ，４５分、０℃）。蛋白質沈殿物をＴＧ．５１バッファー中に懸濁して、ＴＧ．５１／２５ｍＭ ＮａＣｌバッファー中で平衡化されたＤＥＡＥクロマトグラフィーカラム（３００ｍｌ，５ｃｍ ｘ １５ｃｍ）の伝導性まで希釈した（２１００ｍｌ，Ｆｒ ＩＩ）。サンプルをＤＥＡＥカラム上に負荷し、３カラム容量のＴＧ．５１／２５ｍＭ ＮａＣｌバッファーで洗浄して、２５−４００ｍＭのＮａＣｌ勾配を含む１０カラム容量のＴＧ．５１バッファーにより溶出した。フラクション（５０）が回収され、各２５ｍｌを含んだ。蛋白質はフラクション４０−１４０の間の一つの広いピークに溶出した。活性はフラクション９６−１１１の広いピーク内に包含される単一ピークに含まれた（４００ｍｌ）。活性の１００％がこのピーク内に回収された。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析は、上記活性ピークがエルシニア・ペスティスのコアを含むが、コア複合体のみで全蛋白質の約２０％しか構成しなかったことを示した。サンプル中の蛋白質を硫酸アンモニウムにより沈殿させたところ、４℃において７０％飽和であった。混合物をさらに３０分間４℃において撹拌して、沈殿物を遠心分離により回収し（２３，０００ｘｇ，４５分、０℃）、液体窒素中で凍結させ、そして−８０℃に保存した。
エルシニア・ペスティスのコアを含む蛋白質沈殿物を２００ｍｌのイミダゾールバッファー（５０ｍＭイミダゾール、（ｐＨ６．８），１０％グリセロール、５０ｍＭＮａＣｌ，５．０ｍＭ ＤＴＴ）中に溶解して、ダウンスホモジェナイザーを用いてホモジェナイズした。サンプルを遠心分離（１６，０００ｘｇ）により透明にして、結果のサンプルをＦｒＩＩとした。サンプルを、ＮａＣｌを含まないイミダゾールバッファーを用いて、イミダゾールバッファー内で平衡化したヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー（２００ｍｌ，５ｃｍｘ １０ｃｍ）の伝導性まで希釈した（４３０ｍｌ）。サンプルをヒドロキシルアパタイトカラムに負荷して、３カラム容量のイミダゾールバッファー／プラス１０ｍＭＫＰＯ４で洗浄して、１０カラム容量の１０−１５０のＫＰＯ４勾配を含むイミダゾールバッファーで溶出した。フラクション（８０）を各々２５ｍｌを含むように回収した。蛋白質はフラクション１５−５０の間の一つのピークに溶出した。活性は広いピーク内に包含される単一ピークに含まれた。フラクション２５−３７をプールして（３２５ｍｌ）、カラムに負荷された全活性の１００％を含んだ。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析は、エルシニア・ペスティスのコア複合体の蛋白質が全蛋白質の約５０％しか構成しなかったことを示した。サンプル中の蛋白質を硫酸アンモニウムにより沈殿させたところ、４℃において５０％飽和であった。混合物をさらに３０分間４℃において撹拌して、沈殿物を遠心分離により回収し（２３，０００ｘｇ，４５分、０℃）、液体窒素中で凍結させ、そして−８０℃に保存した。
ヒドロキシルアパタイトカラムからのエルシニア・ペスティスのコアを含む蛋白質沈殿物を１００ｍｌのイミダゾールバッファープラスＥＤＴＡ中に懸濁して、ダウンスホモジェナイザーを用いてホモジェナイズした。サンプルを遠心分離（１６，０００ｘｇ）により透明にして、結果のサンプルをＦｒＩＶとした。サンプルを、ＮａＣｌを含まないイミダゾールバッファーを用いて、イミダゾールバッファープラス１ｍＭ ＥＤＴＡ内で平衡化したＰ−１１ホスホセルロース（ワットマン）クロマトグラフィー（２００ｍｌ，５ｃｍ ｘ １０ｃｍ）の伝導性まで希釈した（２８００ｍｌ）。サンプルをＰ−１１ホスホセルロースカラムに負荷して、４カラム容量のイミダゾールバッファープラス１ｍＭＥＤＴＡで洗浄して、１０カラム容量の２５−３００のＮａＣｌ勾配を含むイミダゾールバッファーで溶出した。フラクション（８０）を各々２５ｍｌを含むように回収した。蛋白質はフラクション１０−３０の間の一つのピークに溶出した。活性は広いピーク内に包含される単一ピークに含まれた。フラクション１１−２２をプールしたところ（３００ｍｌ）、カラムに負荷された全活性の７５％を含んだ。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析は、エルシニア・ペスティスのコアが９０％を越る均質性であったことを示した。サンプル中の蛋白質を硫酸アンモニウムにより沈殿させたところ、４℃において５０％飽和であった。混合物をさらに３０分間４℃において撹拌して、沈殿物を遠心分離により回収し（２３，０００ｘｇ，４５分、０℃）、液体窒素中で素早く凍結させ、そして−８０℃に保存した。
エルシニア・ペスティスのコアを含む蛋白質沈殿物を６ｍｌのＨＧ．０５バッファー（２５ｍＭＨＥＰＥＳ，（ｐＨ７．５），５０ｍＭ ＫＣｌ，１０％グリセロール、５ｍＭ ＤＴＴ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に懸濁して、ダウンスホモジェナイザーを用いてホモジェナイズした。サンプルを遠心分離（１６，０００ｘｇ）により透明にして、結果のサンプルをＦｒＶとした。サンプルを、ＨＧ．０５バッファー平衡化したセファクリル（登録商標）Ｓ−２００（アマシャムファルマシアバイオテック）クロマトグラフィーカラム（２００ｍｌ，１：２０直径：高さ比）に負荷した。上記手法は、樹脂の上から樹脂ベッドの下までバッファーを走らせることを含み、サンプルを樹脂ベッド上までゆっくりとピペッティングし、サンプルを樹脂の上に吸い上げ、２ｍｌのバッファーをゆっくりと樹脂の上部に加え、樹脂の中に吸い上げた。ランニングバッファーを次に樹脂の上部に加え、そして溶出を続けた。蛋白質は０．２２ｍｌ／分の流速にて溶出し、３ｍｌフラクションを回収した。フラクション３５−５８（１２ｍｌ）が負荷した活性の全てを含んだので、プールした（ＦｒＶＩ）。Ｆｒ ＶＩを等分にして、−８０℃に保存し、そしてエルシニア・ペスティスのコアのストックサプライを表す。精製プロセスの各工程において、エルシニア・ペスティスコアの精製度をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。各精製工程に関してのプールされた蛋白質のサマリーゲルを図２１に示す。ＦｒＶＩ中の蛋白質バンドの濃度計スキャンは、α、ε及びθの比がそれぞれ１：１：１であることを示す。蛋白質の濃度及び活性も各精製工程に関して特性決定した（表ＩＩ）。
実施例１３．エルシニア・ペスティスコアのギャップフィリング活性の特性決定及びエルシニア・ペスティスコアの精製のための最適な硫酸アンモニウム濃度の決定
エルシニア・ペスティスのコアの活性を、最初に、ギャップフィリングアッセイを用いてアッセイした。各ＦｒＩＩの滴定を含む一連の反応を実施した（図１９）。反応（２５μｌ）は、様々な希釈のＦｒ ＩＩの、ｄＮＴＰｓ（１００ｃｐｍ［３Ｈ］／ｐｍｏｌｄＮＴＰｓ），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び５μｇの活性化子ウシ胸腺ＤＮＡを含む溶液への添加により開始した。当該ＤＮＡは前記のとおりに調製した（ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．ａｎｄＣｒｏｗ，Ｗ．（１９７９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２５４，１７４８−１７５３）。反応物は５分間３０℃においてインキュベートした。１ユニットは、３０℃において１分あたり１ｐｍｏｌのｄＮＴＰｓを取り込むのに必要な酵素の量として定義される。
実施例１４．大腸菌ベータ及びタウ複合体とのコアの再構成
実施例４．６において前に記載されたエルシニア・ペスティスコアが再構成アッセイにおいて機能できるか否かを測定するため、４５％硫酸アンモニウム沈殿させたサンプルからのＦｒＩＩの１：８希釈を１μｌか又は大腸菌コア１μｌ（３ｘ１０６ユニット／ｍｇ，４ｍｇ／ｍｌ）を、１μｌの大腸菌（１．７ｘ１０６ユニット／ｍｇ，１ｍｇ／ｍｌ）４μｌのτ複合体（２．８ｘ１０６ユニット／ｍｇ，２ｍｇ／ｍｌ）及び１９μｌのＲＮＡプライムされたＭ１３Ｇｏｒｉ鋳型を含む再構成アッセイにおいてアッセイした。図２０に示す結果は、エルシニア・ペスティスのコアが大腸菌のβ及び大腸菌のτの複合体と共に機能することを示す。
ベータクランプ
実施例１５．エルシニア・ペスティスのＤｎａＮ（βサブユニット）のプロセッシビティー因子の分子クローニング
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のβサブユニットをコードするエルシニア・ペスティスのｄｎａＮ遺伝子の遺伝子を、他の公知のＤｎａＮ（β）サブユニットに対するその相同性によりエルシニア・ペスティスデータベース（サンガーデータベース（２００１））から同定した。エルシニア・ペスティス由来のＤｎａＮ蛋白質のアミノ酸配列と選択されたサブセットの細菌の比較は、それらが高度に相同性であり蛋白質配列の全長にわたり整列化されることを示す（図４）。
この実施例は、ゲノミックＤＮＡからのｄｎａＮ（βサブユニット）のＰＣＲ増幅及びそのベクターｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩへの挿入を記載する。ポリクローナル領域を包含するｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩの領域を図１０に示す。ベータサブユニットはｄｎａＮ遺伝子の１１０１ヌクレオチドによりコードされる３６７アミノ酸からなる。ｄｎａＮのヌクレオチド配列は、配列番号：１８により表される。βサブユニットのアミノ酸配列は、配列番号：２０により表される。フォワード／センスプライマーは：
である。５’クランプ（ＧＡＴＣ）に、イタリック文字で示されるＮｄｅＩ制限部位が続く。ＮｄｅＩはＡＴＧ開始コドンとオーバーラップし、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩへの挿入のために使用される。ｄｎａＮの５’末端に相当する２１ヌクレオチドは下線の大文字で示す。
リバース／アンチセンスプライマーは：
である。５’クランプ領域に、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩへの挿入のためのＳｐｅＩ制限部位（イタリック文字）及び追加の停止コドン（二重下線文字）が続き、天然の停止コドンが直列に続く。最後に、ｄｎａＮ遺伝子の３’末端に相補な１９ヌクレオチドを下線の大文字にて示す。
ｄｎａＮのＰＣＲ産物及びプラスミドｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩの両方をＮｄｅＩ／ＳｐｅＩ制限酵素により消化した。ｄｎａＮ遺伝子を含むＰＣＲ産物の断片をＮｄｅＩ−ＳｐｅＩｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩに挿入した。これは、上流のＲＢＳから最適に距離を離してｄｎａＮ遺伝子を配置して、プラスミドｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＮをもたらし、図２２に模式的に描写する。ｄｎａＮ挿入物の配列決定は上記ベクター中の天然（非変異）ｄｎａＮの存在を証明した。
実施例１６．大腸菌内でのｄｎａＮの発現
ｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＮ内のｄｎａＮ遺伝子の正確な配列をＤＮＡ配列決定により確認した。実施例４．１．に記載されたのと同じ様式により、ｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＮプラスミドにより大腸菌のＡＰ１．Ｌ１株を形質転換した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動は、図２３においてβに関して予測された部位に移動する蛋白質のバンドを示す（４０．９ｋＤａ）。
実施例１７．大腸菌内でのエルシニア・ペスティスの発現の最適化
発現された組換えエルシニア・ペスティスのβの収量を最適化するための試みにおいて、誘導時間を実施例１０に記載したとおりにｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＮに関して分析した。ｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＮに関してＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析された生育の最適化の結果を図２３に示す。このゲルにおいて、大腸菌のβは分子質量がエルシニア・ペスティスのβとほとんど同じであるため対照として使用した。ゲル中に見いだされ得るように、βは極めて高いレベルまで発現され、全細胞蛋白質の５０％にも達する！分子質量マーカーを上記ゲルの右側に示す。
実施例１８．βの大規模生育
大規模生育の条件は実施例４．４においてコアオペロンに関して記載されたとおりであって、βを発現する細菌の誘導後の生育時間の長さは３時間であった。
実施例１９．βの精製
Ｔｒｉｓ−蔗糖中の凍結細胞（３５ｇ細胞の）１：１懸濁液７０ｇからのＦｒ Ｉの精製は実施例４．５に記載されたとおりであった。回収された上清（１１０ｍｌ）をフラクションＩ（Ｆｒ Ｉ）とした（３０ｍｇ／ｍｌ）。
Ｆｒ Ｉを各１５ｍｌの７サンプルに分割して、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％及び６０％と標記した。各サンプル中の蛋白質を、量を変えた硫酸アンモニウムを添加することにより沈殿させたところ、硫酸アンモニウムの濃度はそれぞれ４℃において２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％及び６０％飽和であった。混合物をさらに３０分間４℃において撹拌して、沈殿物を遠心分離により回収した（２３，０００ｘｇ，４５分、０℃）。上清を各サンプルから除去して、結果生じる沈殿物をバッファー（２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５），５ｍＭ ＥＤＴＡ，１０％グリセロール、５ｍＭ ＤＴＴ，１００ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁した。結果の混合物をＦｒ ＩＩとした。懸濁させた沈殿物及び上清からの各サンプルの蛋白質濃度をクマジープロテインアッセイ試薬（ピアス）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として用いて図２４に示すとおりに測定した。懸濁した沈殿物の蛋白質もＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析及び蛋白質アッセイと共に分析したところ（データは示さず）、エルシニア・ペスティスのβは高い濃度の硫酸アンモニウム（７０％）中でのみ沈殿したことを示した。
硫酸アンモニウムの沈殿条件を最適化した後、フラクションＩ（Ｆｒ Ｉ）（７５ｍｌ）を形成させるためのエルシニア・ペスティスのβを含む細胞３５ｇの溶解を上記のとおりに実施した。サンプル中の蛋白質を硫酸アンモニウム沈殿させたところ、４℃において硫酸アンモニウムの最終濃度は７０％であった。混合物をさらに３０分間４℃において撹拌して、沈殿物を遠心分離により回収した（２３，０００ｘｇ，４５分、０℃）。上清を各サンプルから除去し、そして結果の沈殿物を２００ｍｌのＴＧ．５１／５０ｍｍ ＮａＣｌ バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０），０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，１０％グリシン、５ｍＭＤＴＴプラス５０ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁して、ダウンスホモジェナイザーを用いてホモジェナイズした。サンプルを遠心分離（１６，０００ｘｇ）により透明にして、結果のサンプルをＦｒＩＩとした（１０．８ｍｇ／ｍｌ）。懸濁した沈殿物からの各サンプルの蛋白質の濃度をクマジープロテインアッセイ試薬（ピアス）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として用いて測定した。サンプルを、ＮａＣｌを含まないＴＧ．５１バッファーにより１０００ｍｌまで希釈して、ＴＧ．５１／５０ｍＭＮａＣｌバッファー中で平衡化されたＤＥＡＥクロマトグラフィーカラム（２００ｍｌ，５ｃｍ ｘ １０ｃｍ）の伝導性に調節した。サンプルをＤＥＡＥカラム上に負荷し、２．５カラム容量のＴＧ．５１／５０ｍＭＮａＣｌバッファーで洗浄して、５０−６００ｍＭのＮａＣｌ勾配を含む１０カラム容量のＴＧ．５１バッファーにより溶出した。フラクション（４０）が回収され、各２５ｍｌを含んだ。蛋白質はフラクション１５−３０の間の一つの広いピークに溶出し、１００％の活性が，９０％を超える均質性のエルシニア・ペスティスのβを含むフラクション２０−２６に回収された（１７５ｍｌ）。サンプル中の蛋白質を硫酸アンモニウムにより沈殿させたところ、４℃において７０％飽和であった。混合物をさらに３０分間４℃において撹拌して、沈殿物を遠心分離により回収し（２３，０００ｘｇ，４５分、０℃）、液体窒素中で凍結させ、そして−８０℃に保存した。
エルシニア・ペスティスのβを含む蛋白質沈殿物をイミダゾールバッファー（５０ｍＭイミダゾール、（ｐＨ６．８），１０％グリセロール、５０ｍＭ ＮａＣｌ，５．０ｍＭ ＤＴＴ）中に懸濁して、ダウンスホモジェナイザーを用いてホモジェナイズした。サンプルを遠心分離（１６，０００ｘｇ）により透明にして、結果のサンプルをＦｒＩＩＩとした。サンプルを、ＮａＣｌを含まないイミダゾールバッファーを用いて、イミダゾールバッファー内で平衡化したヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー（２００ｍｌ，５ｃｍｘ １０ｃｍ）の伝導性まで希釈した（４６０ｍｌ）。サンプルをヒドロキシルアパタイトカラムに負荷して、３カラム容量のイミダゾールバッファー／プラス１０ｍＭＫＰＯ４で洗浄して、１０カラム容量の２０−１３０ＫＰＯ４勾配を含むイミダゾールバッファーで溶出した。フラクション（８０）を各々２５ｍｌを含むように回収した。蛋白質と活性が一つのピークに溶出した。フラクション２５−３５をプールして（２７５ｍｌ）、カラムに負荷された全活性の９５％を含んだ。サンプル中の蛋白質を硫酸アンモニウムにより沈殿させたところ、４℃において７０％飽和であった。混合物をさらに３０分間４℃において撹拌して、沈殿物を遠心分離により回収し（２３，０００ｘｇ，４５分、０℃）、液体窒素中で凍結させ、そして−８０℃に保存した。
エルシニア・ペスティスのβを含む蛋白質沈殿物をＨＧ．０５バッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，（ｐＨ７．５），５０ｍＭＫＣｌ，１０％グリセロール、５ｍＭ ＤＴＴ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に懸濁して、ダウンスホモジェナイザーを用いてホモジェナイズした。サンプルを遠心分離（１６，０００ｘｇ）により透明にして、結果のサンプルをＦｒＩＶとした。サンプルを、ＨＧ．０５バッファー平衡化したセファクリル（登録商標）Ｓ−２００（アマシャムファルマシアバイオテック）クロマトグラフィーカラム（２００ｍｌ，１：２０直径：高さ比）に負荷した。上記手法は、樹脂の上から樹脂ベッドの下までバッファーを走らせることを含み、サンプルを樹脂ベッド上までゆっくりとピペッティングし、サンプルを樹脂の上に吸い上げ、２ｍｌのバッファーをゆっくりと樹脂の上部に加え、樹脂の中に吸い上げた。ランニングバッファーを次に樹脂の上部に加え、そして溶出を続けた。蛋白質は０．２２ｍｌ／分の流速にて溶出し、２ｍｌフラクションを回収した。フラクション４５−５５（２２ｍｌ）が負荷した活性の全てを含んだので、プールした（ＦｒＶ）。Ｆｒ Ｖを等分にして、−８０℃に保存し、そしてエルシニア・ペスティスのβのストックサプライを表す。精製プロセスの各工程において、エルシニア・ペスティス βの精製度をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。各精製工程に関してのプールされた蛋白質のサマリーゲルを図２５に示す。
蛋白質の濃度及び活性も各精製工程に関して特性決定した（表ＩＩＩ）。
実施例２０．大腸菌のコア及びタウの複合体による再構成を通したプロセッシビティー活性の特性決定
エルシニア・ペスティスのβが大腸菌のコアとτの複合体を刺激できるか否かを決定するため、３５％ＡＳ沈殿させた蛋白質からのエルシニア・ペスティスのβが大腸菌再構成アッセイに滴定されたアッセイを、実施例４．６に記載されたとおりに実施した。再構成アッセイ（２６μｌ）は、大腸菌コア１μｌ（３ｘ１０６ユニット／ｍｇ，４ｍｇ／ｍｌ）、４μｌのτ複合体（２．８ｘ１０６ユニット／ｍｇ，２ｍｇ／ｍｌ）及び１９μｌのＲＮＡプライムされたＭ１３Ｇｏｒｉ鋳型を含んだ。これに対してエルシニア・ペスティスのβを含む様々な希釈のＦｒ ＩＩ（３５％ＡＳ沈殿）２μｌを加えた。これらのアッセイの結果を図２６に示す。
これらの結果は、ＦｒＩＩ中のエルシニア・ペスティスのβが、大腸菌のｐｏｌ ＩＩＩ及びτの複合体の存在下で迅速かつプロセッシブなＤＮＡ合成を完全に刺激できるため、活性であることを示す。これらと同じ希釈のＦｒＩＩ（３５％ＡＳ沈殿）を大腸菌のｐｏｌ ＩＩＩ不在下でアッセイしたところ、きわけて低いレベルのバックグラウンド活性しか含まないことがわかった。
これらの同じアッセイを最初に使用することにより、実施例１９に記載された硫酸アンモニウム沈殿最適化を確認した。これらのアッセイを実施例１９に記載された蛋白質の硫酸アンモニウムの異なる濃度の沈殿によりもたらされた全７つのＦｒＩＩサンプルに関して実施した。結果は、多くの内因性混在蛋白質も沈殿していたとしても、エルシニア・ペスティスのβが高い濃度の硫酸アンモニウム濃度にて溶液からもっとも効率よく沈殿したことを示す（図２７）。
クランプ負荷複合体
実施例２１．ガンマ及びタウ複合体をコードする遺伝子であるエルシニア・ペスティスのｄｎａＸの分子クローニング
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のエルシニア・ペスティスのｄｎａＸ遺伝子の遺伝子を、エルシニア・ペスティスのデータベース（サンガーデータベース（２００１））からの他の公知のＤｎａＸサブユニットに対するその相同性により同定した。エルシニア・ペスティス由来のＤｎａＸ蛋白質のアミノ酸配列と選択されたサブセットの細菌の比較は、それらが高度に相同性であり蛋白質配列の全長にわたり整列化されることを示す（図５）。
この実施例は、ゲノミックＤＮＡからのｄｎａＸ遺伝子（τ）のＰＣＲ増幅及びそのベクターｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩへの挿入を記載する。τサブユニットは１９７７ヌクレオチドによりコードされる６５９アミノ酸の配列番号：２５からなる。ｄｎａＸの大腸菌内での発現は２つの天然産物をもたらす：τ、完全長の産物及びγ、末端削除された産物。γは、−１翻訳のフレームシフトの結果として形成されたτの様々なＣ末端欠損バリアントである。−１フレームシフトは６つのＡの配列において生じる。同じフレームシフト配列がエルシニア・ペスティスのｄｎａＸ遺伝子のヌクレオチド配列中に存在する。完全長の蛋白質産物（τ）のみの発現を強いるために、ｄｎａＸ遺伝子中の３つのヌクレオチドを変異させた。変異は１３２９Ａ＞Ｇ，１３３２Ｇ＞Ａ及び１３３５Ｔ＞Ｃである。１３２９Ａ＞Ｇは−１のフレームシフトを排除して、１３３２Ｇ＞Ａは低い使用頻度のコドンを高い使用頻度のコドンに置き換え、そして１３３５Ｔ＞Ｃ変異は−１フレームシフトの場合の停止コドンを除去する。これらの変異は、フレームシフトを排除しながら蛋白質の正確な配列を保持し、以下に示すとおりである。
τのアミノ酸配列は配列番号：２５により表される。ｄｎａＸのクローニングは２つの別々の工程によりもたらされ、その間に上記の変異が導入される。
第１の工程において、２つのＰＣＲ、ＰＣＲ＃１とＰＣＲ＃２がある。ＰＣＲ＃１において、ｄｎａＸ遺伝子の５’末端のフォワード／センスプライマーは：
であった。ＧＡＴＣクランプに、ＰａｃＩ制限部位（イタリック文字）及びＳａｃＩ制限部位（下線イタリック文字）が続く。ＰａｃＩ部位はｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩへの挿入に必要であり、そしてＳａｃＩ部位は５つの遺伝子のオペロンを構築するのに後で使用される（以下参照）。３塩基のスペーサー（太字ｃｃｃ）は、５遺伝子オペロン中の上流のＲＢＳとｄｎａＸ開始コドンの間の最適な距離をおくために必要である。３’の１９ヌクレオチドはｄｎａＸ遺伝子の５’末端に相補である。変異を含むリバース／アンチセンスプライマーは：
であった。このＰＣＲ断片はｄｎａＸからの５’１３５９ヌクレオチドを含んだ。
ＰＣＲ＃２においては、フォワード／センスプライマーは変異を含んだ。フォワード／センスプライマーは、
であった。リバース／アンチセンスプライマーは、
である。リバース／アンチセンスプライマーはＧＡＴＣクランプを含み、ＳｐｅＩ制限部位及び追加の停止コドン（二重下線文字）へと続く。これに、ｄｎａＸ遺伝子の３’末端に相補な１７ヌクレオチドが続く。
工程２において、工程１からの２つのＰＣＲ断片を混合して、鋳型として作用させて、ＰＣＲ＃１反応からのフォワード／センスプライマー及びＰＣＲ＃２反応からのリバース／アンチセンスプライマーをＰＣＲ＃２反応において用いた。この反応は、適切な部位において変異した完全長のｄｎａＸ遺伝子を含むＰＣＲ産物をもたらした。
ＰＣＲ＃３産物及びプラスミドｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩの両方をＰａｃＩ／ＳｐｅＩ制限酵素で消化した。ｄｎａＸ遺伝子を含む消化されたＰＣＲ産物の断片を、消化されたｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩに挿入することにより（ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩのクローニング領域を図３１に示す）、プラスミドｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＸを生成したが（図２８）、３つの変異ヌクレオチドを含むｄｎａＸ遺伝子を含む。ｄｎａＸ挿入物の配列決定により、上記ベクター中の正確に変異されたｄｎａＸ遺伝子の存在を確認することを完了した。
実施例２２．タウ（ｔａｕ）サブユニットの精製と特性決定
エルシニア・ペスティスのＤｎａＸ蛋白質を、精製を監視するために再構成アッセイを用いて精製した。複雑であるが、これらの手法は、より日常的になってきており、大腸菌、サーマス・サーモフィルス（共に係属中の米国特許出願連続番号０９／８１８，７８０、２００１年３月２８日出願に記載されるとおり）及びストレプトコッカス・ピオゲネス（共に係属中の国際出願連続番号ＰＣＴ／ＵＳ０１／４８３９６、２００１年１０月２９日出願に記載されるとおり）のＤＮＡ複製の研究において使用されている。日常的には、蛋白質がＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて観察できるように、等しいレベルの発現を得ることができる。この研究において実現されないならば、大腸菌のサブユニットに対するモノクローナル抗体により発現を確認してよい。顕著な交差反応性が、より進化上離れた生物のホロ酵素サブユニットに対する選択された抗体により（ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．Ｓｅｒｖｉｌｌｅ，Ｍ．，ａｎｄＣｕｌｌ，Ｍ．Ｇ．（１９９７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ２７２，１７８−１８９）過去に観察された。ＤｎａＸの過剰生産物を所有したなら、細胞を溶解し、そして硫酸アンモニウム沈殿物を最適濃度の飽和硫酸アンモニウムを用いて生じさせることにより、最初に求めるサブユニットの沈殿を保証することになる。繰り返し溶解し、透析した沈殿をエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素を再構成させるために使用して、ここのサブユニットの精製を指示するための定量機能アッセイの基礎を提供する。
実施例２３．デルタサブユニット蛋白質をコードする遺伝子であるエルシニア・ペスティスのｈｏｌＡの分子クローニング
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のエルシニア・ペスティスのｈｏｌＡ遺伝子は、他の公知のＨｏｌＡ（δ）サブユニットに対するその相同性によりエルシニア・ペスティスのデータベース（１００）から同定した。エルシニア・ペスティス由来のδサブユニットのアミノ酸配列と選択されたサブセットの細菌の比較は、それらが蛋白質配列の全長にわたり低い相同性を有することを示す（図６）。
この実施例は、ゲノミックＤＮＡからのｈｏｌＡ遺伝子（δサブユニット）のＰＣＲ増幅及びそのｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩへの挿入を記載する。δサブユニットは１０３５ヌクレオチドによりコードされる３４５アミノ酸からなる。ｈｏｌＡのヌクレオチド配列は、配列番号：３３により表される。コドン３は大腸菌において低使用頻度コドン（ＣＧＧ）であり、高い使用頻度のコドン（ＣＧＴ）に変更される。デルタのアミノ酸配列は、配列番号：３５により表される。フォワード／センスプライマーは：
である。
ＧＡＴＣクランプに、ＰａｃＩ制限部位（イタリック文字）が続き、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（下線イタリック文字）とオーバーラップする。次に、オペロン形成の間のＲＢＳとｈｏｌＡ開始コドンの間の距離設定の最適化のための３塩基のスペーサー（ｃｃｃ，太字）がある。ＲＢＳとｈｏｌＡ開始コドンの間のこの構築物中の距離設定は、１５ヌクレオチドになる。３塩基スペーサーに続いて、上記のようにコドン３の高い使用頻度のコドンへの修飾のために相補にならないｈｏｌＡの最初の３つのコドンがある（大文字イタリック文字）。最後の１９ヌクレオチド（下線大文字）は、コドン４から始まるｈｏｌＡ遺伝子の５’末端に相当する。リバース／アンチセンスプライマーは、
である。ＧＡＴＣクランプに、ＳｐｅＩ制限部位（イタリック文字）が続き、ＳｐｅＩとＳａｃＩの両者の有効な消化のための３塩基スペーサー（太字、ｃｃｃ）によりＳａｃＩ制限部位（下線イタリック文字）が離れて続く。ＲＢＳ配列が続く。ＳａｃＩとＳｐｅＩ部位及びＲＢＳは５遺伝子オペロンの構築に必要である。次に、第２停止コドン（二重下線文字）が天然停止コドンと直列にある。最後に、最後の２２ヌクレオチド（下線大文字）は、天然停止コドンを含むｈｏｌＡの３’末端に相補である。
ＰＣＲ産物及びプラスミドｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩの両方をＰａｃＩ／ＳｐｅＩ制限酵素で消化した。ｈｏｌＡ遺伝子を含む消化されたＰＣＲ産物の断片を、消化されたｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩに挿入した（ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩのクローニング領域を図３１に示す）。これはプラスミドｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＡの形成をもたらし、５遺伝子オペロンの形成において下流に位置する遺伝子のためのＲＢＳへと続くｈｏｌＡ遺伝子を含む。ｈｏｌＡ挿入物の配列決定により、上記ベクター中の正確に天然の（非変異）ｈｏｌＡ遺伝子の存在を確認することを完了した。ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩ／ＳｐｅＩを５遺伝子オペロンの形成において使用する。このプラスミドを、ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＡと命名して、図２９に模式的に描写する。
実施例２４．ＨｏｌＡ（デルタ）サブユニットの精製と特性決定
精製されたＤｎａＥ，ＤｎａＮ，ＤｎａＸ及びＨｏｌＢを用いて、ＨｏｌＡに関するアッセイを提供する。ＨｏｌＡは、高度に精製されるまで、他の蛋白質に関して記載された論理を用いて精製される。
実施例２５．ＨｏｌＢ（デルタプライム）サブユニットをコードする遺伝子であるエルシニア・ペスティスのｈｏｌＢの分子クローニング
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のエルシニア・ペスティスのｈｏｌＢの遺伝子は、他の公知のＨｏｌＢ（δ’）サブユニットに対するその相同性によりエルシニア・ペスティスのデータベース（１００）から同定した。エルシニア・ペスティス由来のδ’サブユニットのアミノ酸配列と選択されたサブセットの細菌の比較は、それらが蛋白質配列の全長にわたり相同性であり整列化されることを示す（図６）。
この実施例は、ゲノミックＤＮＡからのｈｏｌＢ遺伝子（δ’サブユニット）のＰＣＲ増幅及びそのｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩへの挿入を記載する。δ’サブユニットは１０２３ヌクレオチドによりコードされる３４１アミノ酸からなる。ｈｏｌＢのヌクレオチド配列は、配列番号：３８により表される。コドン２はＡｓｎをコードする。これは、大腸菌において低使用頻度コドンであり、よって、高い使用頻度のコドンに修飾される。当該コドンはＡＡＴであり、ＰＣＲ反応においてＡＡＣに変更される。δ’のアミノ酸配列は、配列番号：４０により表される。ＰＣＲ反応を実施するための、フォワード／センスプライマーは：
である。ＧＡＴＣクランプに、ＰａｃＩ制限部位（イタリック文字）及びＡｖｒＩＩ制限部位（下線イタリック文字）が続く。続く３塩基のスペーサー（ｃｃｃ，太字）は、５遺伝子オペロンにおいて上流のＲＢＳとｈｏｌＢ開始コドンの間の最適な距離設定を可能にする本明細書における個々の発現のためのＲＢＳとｈｏｌＢ開始コドンの間の距離設定は、１７ヌクレオチドになり、最適な物よりはいくらか長いが、機能することが予測される。最初の２つのコドンは相補でなく、上記の修飾されたコドン２を含み、大文字のイタリック文字により示される。残りの２０ヌクレオチドはコドン３から始まるｈｏｌＢの５’末端に相補であり、下線の大文字で示される。リバース／アンチセンスプライマーは、
である。ＧＡＴＣクランプに、ＫｐｎＩ制限部位（イタリック）及びＨｉｎｄＩＩＩ（下線イタリック文字）が続く。ＲＢＳ配列（大文字）及び第２停止コドン（二重下線文字）が続く。追加の停止コドンに、ｈｏｌＢ遺伝子の３’末端に相補な天然停止コドンを含む２０ヌクレオチドが続く。ＫｐｎＩ部位はｈｏｌＤをｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩに挿入するために使用され、そしてＨｉｎｄＩＩＩ部位は、５遺伝子オペロンの形成に使用される。
ＰＣＲ産物及びプラスミドｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩの両方をＰａｃＩ／ＫｐｎＩ制限酵素で消化した。ｈｏｌＢ遺伝子を含む消化されたＰＣＲ産物の断片を、消化されたｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩプラスミドに挿入した。これはプラスミドｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＢの形成をもたらし（図３０）、５遺伝子オペロンの形成において下流に位置する遺伝子のためのＲＢＳへと続くｈｏｌＢ遺伝子を含む（下に示す）。ｈｏｌＢ入物の配列決定により、上記ベクター中の正確に天然の（非変異）ｈｏｌＢ遺伝子の存在を確認することを完了した。ＡｖｒＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを５遺伝子オペロンの形成において使用する。このプラスミドを、ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＢと命名して、図３０に模式的に描写する。
実施例２６．ＨｏｌＢ（デルタプライム）サブユニットの精製と特性決定
大腸菌のＨｏｌＢ（δ’）及びサーマス・サーモフィルスのＨｏｌＢに関しての精製をモデルとして使用することにより、ＨｏｌＢを精製する。
実施例２７．ＨｏｌＣ（カイ）サブユニット蛋白質をコードする遺伝子であるエルシニア・ペスティスのｈｏｌＣの分子クローニング
この実施例は、ゲノミックＤＮＡからのｈｏｌＣ遺伝子（χサブユニット）のＰＣＲ増幅及びそのｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩベクターへの挿入を記載する。χサブユニットは相対的に小さい（停止コドンを含んで４５０ヌクレオチドによりコードされる１４９アミノ酸）。ＰＣＲ増幅において使用された全てのプライマーは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びＨＰＬＣのいずれかにより精製された。ｈｏｌＣのヌクレオチド配列は、配列番号：４３により表される。開始コドンと停止コドンを、ここ並びに本明細書を通して太字で示す。χサブユニットのアミノ酸配列は、配列番号：４５により表される。ｈｏｌＣ遺伝子をＰＣＲするための、フォワード／センスプライマーは：
である。プライマーの５’末端上にＧＡＴＣクランプが存在することにより、制限酵素による有効な消化を可能にさせる。次に、ＰａｃＩ制限部位があり、イタリック文字で示される。「ｃ」（太字及び二重下線）が、ＰａｃＩと開始コドンの上流に位置するリボソーム結合部位（ＲＢＳ）、ＡＧＧＡＧＧの間の正確な距離設定のためのＰａｃＩ部位とＡＴＧ開始コドンの間に存在する。ｈｏｌＣ遺伝子の５’末端に相補な領域は２１ヌクレオチドからなり、太字で示されて、下線を引かれる。リバース／アンチセンスプライマーは、
である。制限酵素による有効な消化のために５’末端上にＧＡＴＣクランプがある。次に、ＫｐｎＩ制限部位があり、イタリックで示される。次に、下流の遺伝子のオペロンに使用されるＲＢＳが作られる。第２の非相補停止コドンが次にあり、二重下線で示される。当該プライマーの相補領域は天然開始コドンから始まり、そしてゲノミックＤＮＡ上の１７ヌクレオチドに相補である。これが大文字で下線を引かれた文字にて示される。ポリクローナル部位を含むｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩベクターの領域を図３１に示す。
ＰＣＲ産物及びプラスミドｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩの両方をＰａｃＩ／ＫｐｎＩ制限酵素で消化した。ｈｏｌＣ遺伝子を含む消化されたＰＣＲ産物の断片を、消化されたｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩプラスミドに挿入した。これはプラスミドｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＣを創製し、ｈｏｌＣ遺伝子のすぐ下流にＲＢＳ配列を含み、オペロンが構築されるように次の下流の遺伝子により利用され得る。ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＣベクターの模式的描写を図３２に示す。
実施例２８．ＨｏｌＤ（プサイ）サブユニット蛋白質をコードする遺伝子であるエルシニア・ペスティスのｈｏｌＤの分子クローニング
この実施例は、ゲノミックＤＮＡからのｈｏｌＤ遺伝子（Ψサブユニット）のＰＣＲ増幅及びそのｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩベクターへの挿入を記載する。Ψサブユニットは相対的に小さい（４３８ヌクレオチドによりコードされる１４６アミノ酸）。ｈｏｌＤ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号：４８により表される。コドン３、４及び５（下線文字中のヌクレオチド配列に示される）はＳｅｒＡｒｇ Ａｒｇをコードするが、大腸菌において低い使用頻度であり、ＰＣＲ反応において高い使用頻度のコドンに変更される。変更は、ＴＣＡＡＧＡＣＧＡからＴＣＣＣＧＣＣＧＴである。Ψのアミノ酸配列は、配列番号：５０により表される。ｈｏｌＤ遺伝子をＰＣＲするための、フォワード／センスプライマーは：
であった。ＧＡＴＣクランプに、イタリック文字で示したＰａｃＩ部位が続く。ＰａｃＩ部位に隣接するのはＫｐｎＩ部位であり、下線イタリック文字で示されて、太字で示された「ｔｃｃ」に続く。このスペーサーは、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩ中のＲＢＳとｈｏｌＤの開始コドンの間の領域を１７ヌクレオチドに長くし、最低な距離設定よりはかなり長いが、Ψサブユニットは大腸菌の先例に基づくと、χサブユニット不在下で可溶性になるとは予測されず、単独では発現されない。上記スペーサーは、しかしながら、ｈｏｌＣＤオペロンが作られるときに、ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＣの下流のＲＢＳからのｈｏｌＤの開始を最適に配置する。続く１５ヌクレオチドはコドン１−５を包含し、上記の変更のためにｈｏｌＤ遺伝子の５’末端には正確に対応せず、大文字イタリックにより示される。最後に、コドン６−１２に相当する１８ヌクレオチドを下線大文字で示す。リバース／アンチセンスプライマーは、
である。当該プライマーの５’末端における有効な制限消化のためにＧＡＴＣクランプがある。次に、ＳｐｅＩ及びＡｖｒＩＩ制限部位があり（下線のイタリックで示される）、３塩基スペーサーにより離される（太字、「ｃｃｃ」）。この３塩基スペーサーは、のちのオペロンの構築の間にＳｐｅＩとＡｖｒＩＩの両方により消化を可能にさせる。上記制限部位に、太字のＲＢＳ及び追加の（第２の）停止コドン（二重下線文字）が続き、天然停止コドンに隣接する。最後に、天然停止コドンを含むｈｏｌＤ遺伝子の３’末端に相補な１８ヌクレオチドを下線大文字により示す。ＳｐｅＩ部位はｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩにｈｏｌＤを挿入するために使用され、そしてＡｖｒＩＩ部位はのちの５遺伝子オペロンの形成において使用される。
ＰＣＲ産物及びプラスミドｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩの両方をＰａｃＩ／ＳｐｅＩ制限酵素で消化した。ｈｏｌＤ遺伝子を含む消化されたＰＣＲ産物の断片を、消化されたｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩプラスミドに挿入し、プラスミドｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＤの形成をもたらすが、ｈｏｌＤ遺伝子を含み、次に５遺伝子オペロンの形成において下流に配置された遺伝子のためのＲＢＳが続く。ｈｏｌＤ挿入物の配列決定により、上記ベクター中の天然（非変異）ｈｏｌＤ遺伝子の存在の確認を完了した。ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＤベクターの模式的描写を図３３に示す。
オペロンクローニング
実施例２９．ｈｏｌＣ及びｈｏｌＤの両方を含む２遺伝子オペロンの構築
この実施例は、同じ発現ベクター中にｈｏｌＣ及びｈｏｌＤの両方を含む２遺伝子オペロンの形成を記載する。これは、ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＣとｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＤの両方をＫｐｎＩとＳｐｅＩにより消化することにより達成される。ＫｐｎＩとＳｐｅＩ部位の間にｈｏｌＤ遺伝子を含むｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＤからの小断片を、消化したｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＣプラスミドに挿入した。これは、ｈｏｌＣ構築物中に創製されたＲＢＳからの最適な距離設定を伴い、ｈｏｌＣの下流にｈｏｌＤを配置した。このプラスミドをｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＣＤと命名し、図３４に示す。
実施例３０．ｈｏｌＢとｈｏｌＡの両方を含む２遺伝子オペロンの構築
この実施例は、ｈｏｌＢとｈｏｌＡの両方を含む２遺伝子オペロンの形成を記載する。これは、ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＢとｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＡの両方をＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｅＩにより消化することにより達成される。ＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｅＩ部位の間にｈｏｌＡ遺伝子を含むｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＡからの小断片を、消化したｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＢプラスミドに挿入した。これは、ｈｏｌＢの下流にｈｏｌＡを含み、そしてｈｏｌＡベクター構築物中に創製されたＲＢＳからの最適な距離設定を伴う下流も含む。このプラスミドをｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＢＡと命名し、図３５に示す。
実施例３１．ｈｏｌＢ、ｈｏｌＡ及びｄｎａＸの両方を含む３遺伝子オペロンの構築
この実施例は、ｈｏｌＢ、ｈｏｌＡ及びｄｎａＸを含む３遺伝子オペロンの形成を記載する。これは、ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＢＡとｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＸの両方をＳａｃＩとＳｐｅＩにより消化することにより達成される。ＳａｃＩとＳｐｅＩ部位の間にｄｎａＸ遺伝子を含むｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＸの小断片を、消化したｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＢＡプラスミドに挿入した。これは、ｈｏｌＡ遺伝子の下流にｄｎａＸ遺伝子を含み、そしてｈｏｌＡベクター構築物中に創製されたＲＢＳからの最適な距離設定を伴う下流も含む。このプラスミドをｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＢＡＸと命名し、図３６に示す。
実施例３２．ｈｏｌＣ，ｈｏｌＤ，ｈｏｌＢ，ｈｏｌＡ，及びｄｎａＸの５遺伝子オペロンの構築
この実施例は、ｈｏｌＣとｈｏｌＤ遺伝子（χとΨ、ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＣＤベクター）を含む２遺伝子オペロンと、ｈｏｌＢ，ｈｏｌＡ及びｄｎａＸ遺伝子（δ’、δ及びτ、ｐＡ１−ＣＢ−ｈｏｌＢＡＸベクター）を含む３遺伝子オペロンの組み合わせによりクランプ負荷複合体を形成するのに必要な全てのサブユニットからなる５遺伝子オペロンの生成を記載する。このプラスミドをｐＡ１−ＹＰ−ＣＬ複合体と命名する。ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＣＤとｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＢＡＸの両方をＡｖｒＩＩ／ＳｐｅＩで消化した。３遺伝子オペロンを含む消化されたｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＢＡＸからのＡｖｒＩＩ／ＳｐｅＩ断片を、ＡｖｒＩＩ／ＳｐｅＩ消化したｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＣＤに挿入した。これは、２遺伝子オペロンの下流に３遺伝子オペロンを配置させた。ｈｏｌＤ遺伝子の下流に配置したＲＢＳは、ｈｏｌＢ遺伝子の上流ＲＢＳとして機能する。これは５遺伝子オペロンを生じさせるが、各遺伝子がそれ自身の唯一のＲＢＳからの最適な距離設定である（ｐＡ１−ＹＰ−ＣＬ複合体）。これを模式的に図３７に描写する。
実施例３３．エルシニア・ペスティスのクランプ負荷複合体の発現
ｐＡ１−ＹＰ−ＣＬ複合体の構築の完了と共に、全ての遺伝子の正確な配列をＤＮＡ配列決定により確認した（示さず）。
上記プラスミドにより、大腸菌のＡＰ１．Ｌ１株を形質転換して、実施例９．３においてコアオペロンに関して記載されたとおりに発現させた。図３８においてクマジーブルーにより染色された蛋白質ゲルは、δ（３９．６ｋＤａ）、δ’（３８．２ｋＤａ）、χ（１７ｋＤａ）、Ψ（１６．２ｋＤａ）及びτ（７２．３ｋＤａ）サブユニットに相当する分子量の蛋白質に関して予測された部位に移動する蛋白質バンドを示し、別々の蛋白質バンドとして検出できたが、未誘導の対照においては観察されなかった。δ及びδ’サブユニットχ及びΨサブユニットは互いに分離できなかったが、これらのサブユニットの間の分子量の類似性のためである。
実施例３４．クランプ負荷複合体の大規模生育
ｐＡ１−ＹＰ−ＣＬプラスミドを含む大腸菌の大規模な生育を実施例４．４に記載された通りに実施したが、エルシニア・ペスティスのτ複合体を生成するこの大規模生育においては、細菌を誘導後３．５時間生育させ続けることが例外であり、１．６ｋｇの回収重量を与えた。質の制御の結果は、接種時にアンピシリン含有培地上の１０の陽性コロニーのうち１０を示し、回収時にアンピシリン含有培地上の１０の陽性コロニーのうち０を示した。−２０℃において保存されていたＴｒｉｓ−蔗糖中の凍結した細胞（３５ｇ）の１：１懸濁液７０ｇを、溶解することにより、最大活性を含むが最少量の混在蛋白質を残すコア複合体の最大量を沈殿させるのに最適な硫酸アンモニウムの最大量を決定した。この溶解は実施例４．５に記載されたとおりであった。ＦｒＩを各１５ｍｌの７サンプルに分割して、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％及び７０％と標記した。各サンプル中の蛋白質を、量を変えた硫酸アンモニウムを添加することにより沈殿させたところ、硫酸アンモニウムの濃度はそれぞれ４℃において２０％、３０％、４０％、５０％、６０％及び７０％飽和であった。混合物をさらに３０分間４℃において撹拌して、沈殿物を遠心分離により回収した（２３，０００ｘｇ，４５分、０℃）。上清を各サンプルから除去して、結果生じる沈殿物をバッファー（２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５），５ｍＭ ＥＤＴＡ，１０％グリセロール、５ｍＭ ＤＴＴ，１００ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁し、各（６）硫酸アンモニウム沈殿させたサンプルに関してＦｒＩＩを生じた。上清及び別々のＦｒ ＩＩの両方からのサンプルの濃度を図３９に示す。
実施例３５．クランプ負荷複合体の精製
エルシニア・ペスティスのτ複合体が大腸菌のコア及びβを刺激することができるか否かを決定するため、実施例４．６に記載されたとおりに、硫酸アンモニウム沈殿させた蛋白質ＦｒＩＩの各々からのエルシニア・ペスティスのτ複合体を大腸菌再構成アッセイにて滴定するアッセイを実施した。再構成アッセイ（２５μｌ）は、１μｌの大腸菌コア（３ｘ１０６ユニット／ｍｇ，４ｍｇ／ｍｌ）、１μｌの大腸菌β（１．７ｘ１０６ユニット／ｍｇ，１ｍｇ／ｍｌ）及び１９μｌのＲＮＡプライムされたＭ１３Ｇｏｒｉ鋳型を含んだ。これに対してエルシニア・ペスティスのτ複合体を含む様々な希釈のＦｒ ＩＩ（ＡＳ沈殿蛋白質）２μｌを加えた。硫酸アンモニウムカットの各々に関する活性の全量を図４０に示す。３０％硫酸アンモニウム沈殿からのＦｒ ＩＩが混在蛋白質を最も低い濃度で含みながら最大の活性量を与えたので、τ複合体の精製に使用した。
エルシニア・ペスティスのτ複合体を精製するため、４００ｇの細胞を溶解してＦｒ Ｉを実施例４．５の通りに形成させ、そして１６５０ｍｌのＦｒＩ溶解物をもたらした。サンプル中の蛋白質を勾配硫酸アンモニウムにより沈殿させたところ、硫酸アンモニウムの最終濃度は４℃において３０％であった。混合物をさらに３０分間４℃において撹拌して、沈殿物を遠心分離により回収した（２３，０００ｘｇ，４５分、０℃）。蛋白質沈殿物をＴＧ．５１バッファー中に懸濁して、ＴＧ．５１／５０ｍＭ ＮａＣｌバッファー中で平衡化されたＤＥＡＥクロマトグラフィーカラム（３００ｍｌ，５ｃｍ ｘ １５ｃｍ）の伝導性まで希釈した（４８００ｍｌ，Ｆｒ ＩＩ）。サンプルをＤＥＡＥカラム上に負荷し（４．０ｍｌ／分）、５カラム容量のＴＧ．５１／５０ｍＭ ＮａＣｌバッファーで洗浄して、５０−４００ｍＭのＮａＣｌ勾配を含む１０カラム容量のＴＧ．５１バッファーにより溶出した。フラクション（１２０）が回収され、各２５ｍｌを含んだ。蛋白質はフラクション６−２０と３０−５０の間の二つの主要なピークに溶出した。活性はフラクション１２−１７の第１ピーク内に包含される単一ピークに含まれた（１４０ｍｌ）。これらのフラクションをプールして、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析したところ、上記活性ピークはエルシニア・ペスティスのτ複合体を含み、全蛋白質の約７０％をなしたことが示された。サンプル中の蛋白質を硫酸アンモニウムにより沈殿させたところ、４℃において６０％飽和であった。混合物をさらに３０分間４℃において撹拌して、沈殿物を遠心分離により回収し（２３，０００ｘｇ，４５分、０℃）、液体窒素中で凍結させ、そして−８０℃に保存した。
エルシニア・ペスティスのτを含む蛋白質沈殿物をイミダゾールバッファー中に溶解して、ダウンスホモジェナイザーを用いてホモジェナイズした。サンプルを遠心分離（１６，０００ｘｇ）により透明にして、ＮａＣｌを含まないイミダゾールバッファーを用いて、イミダゾールバッファープラス５０ｍＭＮａＣｌ内で平衡化したヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー（１５０ｍｌ，５ｃｍ ｘ ９ｃｍ）の伝導性まで希釈した（３６５ｍｌ）。このサンプルをＦｒ ＩＩとした。サンプルをヒドロキシルアパタイトカラムに負荷して（２．５ｍｌ／分）、２．５カラム容量のイミダゾールバッファー／プラス１０ｍＭＫＰＯ４で洗浄して、１０カラム容量の１０−１５０のＫＰＯ４勾配を含むイミダゾールバッファーで溶出した。フラクション（６０）を各々２５ｍｌを含むように回収した。蛋白質はフラクション１５と５０の間の一つのピークに溶出した。活性は広いピーク内に包含される単一ピークに含まれた。フラクション３６−４５をプールして（１９０ｍｌ）、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、エルシニア・ペスティスのτ複合体の蛋白質がプール中の全蛋白質の約９０％を構成したことを示した。サンプル中の蛋白質を硫酸アンモニウムにより沈殿させたところ、４℃において５０％飽和であった。混合物をさらに３０分間４℃において撹拌して、沈殿物を遠心分離により回収し（２３，０００ｘｇ，４５分、０℃）、液体窒素中で凍結させ、そして−８０℃に保存した。
エルシニア・ペスティスのτ複合体を含む蛋白質沈殿物を６ｍｌのＨＧ．０５バッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，（ｐＨ７．５），５０ｍＭＫＣｌ，１０％グリセロール、５ｍＭ ＤＴＴ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に懸濁して、ダウンスホモジェナイザーを用いてホモジェナイズした。サンプルを遠心分離（１６，０００ｘｇ）により透明にして、結果のサンプルをＦｒＩＶとした（７．０ｍｌ）。サンプルを、ＨＧ．０５バッファー平衡化したセファクリル（登録商標）Ｓ−２００（アマシャムファルマシアバイオテック）クロマトグラフィーカラム（２５０ｍｌ，１：２０比）に負荷した。上記手法は、樹脂の上から樹脂ベッドの下までバッファーを走らせることを含み、サンプルを樹脂ベッド上までゆっくりとピペッティングし、サンプルを樹脂の上に吸い上げ、２ｍｌのバッファーをゆっくりと樹脂の上部に加え、樹脂の中に吸い上げた。ランニングバッファーを次に樹脂の上部に加え、そして溶出を続けた。蛋白質は０．２４ｍｌ／分の流速にて溶出し、２．５ｍｌフラクションを回収した。フラクション２２−３４（３２ｍｌ）が負荷した活性の全てを含んだので、プールした（ＦｒＶ）。Ｆｒ Ｖを等分にして、−８０℃に保存し、そしてエルシニア・ペスティスのτ複合体のストックサプライを表す。精製プロセスの各工程において、エルシニア・ペスティスのτ複合体の精製度をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。各精製工程に関してのプールされた蛋白質のサマリーゲルを図４１に示す。
Ｆｒ Ｖ中の蛋白質バンドの濃度計スキャンは、コア中のτ，δ／δ’及びχ／Ψの比がそれぞれ３：１：１であることを示す。これは、３つのτサブユニットと一つの各δ、δ’、χ及びΨのサブユニットを示す。蛋白質の濃度及び活性も各精製工程に関して特性決定した（表ＩＶ）。
実施例３６．再構成アッセイにおけるエルシニア・ペスティスのホロ酵素成分の最適化
化学化合物のライブラリーをスクリーニングするための再構成アッセイにおいて使用されるエルシニア・ペスティスのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素の３つの成分の最適濃度を決定するために、各成分を、他の２つの成分を一定濃度に保ちながらアッセイにおいて個別に滴定した。再構成アッセイの一般手法は実施例４．５に記載されている。第１セットの実験において、一定濃度に保たれた成分は、個々の成分の精製の間に実施されたアッセイから測定された飽和濃度に近似した濃度であった。飽和量のβ２、コア（α、ε及びθ）及びτ複合体（τ３，δ，δ’，χ及びΨ）は、反応あたり２．５，０．５及び０．７ｐｍｏｌであると予測した。最初の反応は、β２、コア及びτ複合体がそれぞれ０．０３，０．１及び０．０７ｐｍｏｌにおいて最適活性に達した。
第２セットの実験においては、一定濃度にした２つの成分を第１セットの実験において最大活性を有すると決定された濃度にして、第３成分の濃度を変えた。このセットの実験においては、β２、コア及びτ複合体に関して最大活性を与える最少濃度が、それぞれ０．０３，０．１及び０．１２ｐｍｏｌであった。再構成アッセイにおける上記３つの成分のこれらの濃度は、直線応答範囲のちょうど上である（図４２Ａ−Ｃ）。よって、スクリーンされた化学化合物の影響のために３つのエルシニア・ペスティスのｐｏｌＩＩＩホロ酵素成分の活性の如何なる阻害も即座に検出することができる。
アクセサリー蛋白質
実施例３７．ＳＳＢサブユニット蛋白質をコードする遺伝子であるエルシニア・ペスティスの分子クローニング
最初の計画は、エルシニア・ペスティスのゲノミックＤＮＡからのｓｓｂ遺伝子（ＳＳＢ）にＰＣＲを行って、それをｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩに挿入することを内含した。ＳＳＢサブユニットは、１８３アミノ酸からなる。ＳＳＢをコードする遺伝子はｓｓｂであり、５４９ｎｔからなる。ｓｓｂのヌクレオチド配列は配列番号：５３により表される。Ａｒｇをコードするコドン＃４は大腸菌において使用頻度が低いコドンである。これはＰＣＲ反応において高い使用頻度のコドンに変更した。最初の４つのコドンの配列は、ＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＧＡ（配列番号：１１９）からＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＧＣ（配列番号：１２０）に変更した。ＳＳＢのアミノ酸配列は、配列番号：５５により表される。エルシニア・ペスティスのゲノミックＤＮＡからｓｓｂ遺伝子をＰＣＲするため、フォワード／センスプライマーは：
であった。５’末端は制限酵素による有効な消化を可能にするためのクランプ領域である（大文字）。次に、小文字のイタリック文字により示されるＮｃｏＩ制限部位である。ＮｃｏＩ制限部位はｓｓｂ遺伝子の５’末端の最初の４ｎｔとオーバーラップする（太字）。コドン＃４には、極めて使用頻度の低いコドンがあり、ここでは変更した。最初の４つのコドン（１２ｎｔｓ）を太字で示すが、コドン＃４の修飾がｓｓｂ遺伝子に対応しないからである。次に２２ｎｔｓはコドン＃５から開始するｓｓｂ遺伝子の５’末端の（に対応する）センス鎖をなし、下線大文字で示される。コドン＃４の変更は１４位から始まる配列を創製し、即ちＧＣＣＧＣＧＧＣであり、二次構造を形成することができるが、プライマーの基質に対するアニーリングには影響しなかった。リバース／アンチセンスプライマーは：
であった。プライマーの５’末端には、制限酵素により有効な消化を可能にさせるクランプ領域（ＧＡＴＣ）がある。次に、小文字のイタリック文字により示されるＳｐｅＩ制限部位である。これに、追加の（第２の）非相補性停止コドン（小文字太字）が続く。第２の停止コドンは、天然の停止コドンに隣接する。ｓｓｂ遺伝子の３’末端と相補な１８ｎｔｓ（停止コドンを含む）を大文字の下線文字で示す。ｓｓｂ遺伝子をｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩに挿入した。ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩのポリクローナル領域を図３１に示す。
ＰＣＲ産物とプラスミドｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩの両方をＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ制限酵素により消化した。ｓｓｂ遺伝子を含むＰＣＲ産物の断片を、消化したｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩプラスミドに挿入した。これは、ＲＢＳの下流に最適に距離設定してｓｓｂ遺伝子を配置した。このプラスミドをｐＡ１−ＹＰ−ｓｓｂと命名して、図４３において描写により示す。
３７．１．ｓｓｂの発現
図４３に示したプラスミド、ｐＡ１−ＹＰ−ｓｓｂの構築を完了した。全ての遺伝子の完全な配列は、ＤＮＡ配列決定により確認した。当該プラスミドにより大腸菌のＡＰ１．Ｌ１株を形質転換して、実施例４．１に記載されるとおりに発現させた。ミニゲルを、実施例４．１に記載されたとおりに、発現された蛋白質を分析して、クマジーブルーで染色した。ＳＳＢ（１９．３ｋＤａ）に対応する分子量の蛋白質に関して予測された部位に移動する蛋白質バンドが別々の蛋白質バンドとして検出できたが、非誘導対照においては観察されなかった。
３７．２．エルシニア・ペスティスのＳＳＢの大規模な生育と精製
実施例１０に記載されたとおりに、エルシニア・ペスティスのＳＳＢの最適化発現のための時間生育の分析を実施した。ｐＡ１−ＹＰ−ｓｓｂを含む大腸菌に関してのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析された生育最適化の結果を図４４に示す。これら３つの時間生育実験において、エルシニア・ペスティスのＳＳＢは低レベルで発現された。
ｐＡ１−ＹＰ−ｓｓｂを含む大腸菌の大規模な生育は、実施例４．４に記載されたとおりであった。例外は、エルシニア・ペスティスのτ複合体を生成するためのこの大規模な生育においては、細菌を誘導後３時間生育させ続けて２．０ｋｇの回収重量を得たことである。質の制御の結果は、接種時にアンピシリン含有培地上の１０の陽性コロニーのうち１０を示し、誘導時にアンピシリン含有培地上の１０の陽性コロニーのうち１０を示し、そして回収時にアンピシリン含有培地上の１０の陽性コロニーのうち１０を示した。−２０℃において保存されていたＴｒｉｓ−蔗糖中の凍結した細胞（３５ｇ）の１：１懸濁液７０ｇを、溶解することにより、最大活性を含むが最少量の混在蛋白質を残すコア複合体の最大量を沈殿させるのに最適な硫酸アンモニウムの最大量を決定した。この溶解は実施例４．５に記載されたとおりであった。ＦｒＩを各１５ｍｌの７サンプルに分割して、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％及び５５％と標記した。各サンプル中の蛋白質を、量を変えた硫酸アンモニウムを添加することにより沈殿させたところ、硫酸アンモニウムの濃度はそれぞれ４℃において３０％、３５％、４０％、４５％、５０％及び５５％飽和であった。混合物をさらに３０分間４℃において撹拌して、沈殿物を遠心分離により回収した（２３，０００ｘｇ，４５分、０℃）。上清を各サンプルから除去して、結果生じる沈殿物をバッファー（２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５），５ｍＭ ＥＤＴＡ，１０％グリセロール、５ｍＭ ＤＴＴ，１００ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁し、各（６）硫酸アンモニウム沈殿させたサンプルに関してＦｒＩＩを生じた。上清及び別々のＦｒ ＩＩの両方からのサンプルの濃度を図４５に示す。
懸濁した蛋白質沈殿物を含むサンプル（Ｆｒ ＩＩ）をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によっても分析して、結果を図４５に示す。
エルシニア・ペスティスのＳＳＢを精製するため、エルシニア・ペスティスのＳＳＢを含む６００ｇの細胞を溶解してＦｒＩを実施例４．５の通りに形成させ、そして２３８０ｍｌのＦｒ Ｉ溶解物をもたらした。サンプル中の蛋白質を勾配硫酸アンモニウムにより沈殿させたところ、硫酸アンモニウムの最終濃度は４℃において３０％であった。混合物をさらに３０分間４℃において撹拌して、沈殿物を遠心分離により回収した（２３，０００ｘｇ，４５分、０℃）。蛋白質沈殿物をＴＧ．５２バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ７．５），２０％グリセロール、１ｍＭＥＤＴＡ，５ｍＭ ＤＴＴ）中に懸濁して、ＴＧ．５２／１００ｍＭ ＮａＣｌバッファー中で平衡化されたＤＥＡＥクロマトグラフィーカラム（８００ｍｌ，５ｃｍ ｘ ３８ｃｍ）の伝導性まで希釈した（１００ｍｌ，Ｆｒ ＩＩ）。サンプルをＤＥＡＥカラム上に負荷し（１ｍｌ／分）、濃度を増加させてＮａＣｌを含むＴＧ．５２バッファーで洗浄することにより、段階様式にて溶出した。カラムを、最初に１カラム容量のＴＧ．５２／０．１ＭＮａＣｌバッファーにより洗浄した（５ｍｌ／分）。２番目に、カラムを、３カラム容量のＴＧ．５２／０．５Ｍ ＮａＣｌバッファーにより洗浄した（５ｍｌ／分）。３番目に、カラムを、２カラム容量のＴＧ．５２／１Ｍ ＮａＣｌバッファーにより洗浄した（１．５ｍｌ／分）。この点において、２５ｍｌのフラクション（全部で１３０）を最終溶出工程を通して回収した。カラムを、１カラム容量のＴＧ．５２／２ＭＮａＣｌバッファーにより洗浄した（５ｍｌ／分）。最後に、カラムを、３カラム容量のＴＧ．５２／４Ｍ ＮａＣｌバッファーにより溶出した。蛋白質は、全ての全域において大きなピークにて溶出した。エルシニア・ペスティスのＳＳＢは、フラクション８５−１３０に包含される単一ピークに溶出した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析したところ、上記活性ピークはエルシニア・ペスティスのＳＳＢは９５％を超えて均質であったことが示された。
エルシニア・ペスティスのＳＳＢを、イミダゾールバッファー（５０ｍＭイミダゾール、（ｐＨ６．８），１０％グリセロール、５０ｍＭＮａＣｌ，５．０ｍＭ ＤＴＴ）により平衡化されたヒドロキシルアパタイトカラム（４０ｍｌ，２．５ｘ ８ｃｍ）上に直接負荷して（１．５ｍｌ／分）、２カラム容量のイミダゾールバッファーを用いて洗浄し、そして、５カラム容量の７０ｍＭのＫＰＯ４を含むイミダゾールバッファーで溶出した。蛋白質はフラクション１１−２２の間の単一ピークに溶出した（ＦｒＩＶ，３６ｍｌ）。サンプル中の蛋白質を硫酸アンモニウムにより沈殿させたところ、４℃において５０％飽和であった。混合物をさらに３０分間４℃において撹拌して、沈殿物を遠心分離により回収し（２３，０００ｘｇ，４５分、０℃）、液体窒素中で素早く凍結させ、そして−８０℃に保存した。
蛋白質沈殿物を、３ｍｌのＴＧ．５２バッファー中に懸濁して、ＨＧ．０５バッファー平衡化したセファクリル（登録商標）Ｓ−２００（アマシャムファルマシアバイオテック）クロマトグラフィーカラム（２５０ｍｌ，１：２５比）に負荷した。上記手法は、樹脂の上から樹脂ベッドの下までバッファーを走らせることを含み、サンプルを樹脂ベッド上までゆっくりとピペッティングし、サンプルを樹脂の上に吸い上げ、２ｍｌのバッファーをゆっくりと樹脂の上部に加え、樹脂の中に吸い上げた。ランニングバッファーを次に樹脂の上部に加え、そして溶出を続けた。蛋白質は０．２ｍｌ／分の流速にて溶出し、１ｍｌフラクションを回収した。フラクション４７−５７（１１ｍｌ）が負荷した活性の全てを含んだので、プールした（ＦｒＶ）。Ｆｒ Ｖを等分にして、−８０℃に保存し、そしてエルシニア・ペスティスのＳＳＢのストックサプライを表す。精製プロセスの各工程において、エルシニア・ペスティスのＳＳＢの精製度をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。各精製工程に関してのプールされた蛋白質のサマリーゲルを図４７に示す。
蛋白質の濃度も各精製工程において特性決定した（表Ｖ）。
実施例３８．ＤｎａＧをコードする遺伝子であるｄｎａＧの分子クローニング
第２の計画は、エルシニア・ペスティスのゲノミックＤＮＡからｄｎａＧ遺伝子（ＤｎａＧプライマーゼ）にＰＣＲを行って、それをｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩに挿入することを内含した。ＤｎａＧサブユニットは、５８３アミノ酸からなる。ｄｎａＧ遺伝子１７４９ｎｔからなる。ｄｎａＧのｎｔ配列は配列番号：５８により表される。コドン＃３と４は大腸菌において使用頻度が低いコドンであり、ＰＣＲ反応において高い使用頻度のコドンに変更した。最初の４つのコドンの天然の配列は、ＡＴＧＧＣＴＧＧＡＣＧＡ（配列番号：６１）であり、これを、ＰＣＲ反応においてＡＴＧＧＣＴＧＧＴＣＧＴ（配列番号：６２）に変更した。修飾されたコドンに下線を引く。ＤｎａＧのアミノ酸配列は、配列番号：６０により表される。フォワード／センスプライマーは：
であった。５’末端は制限酵素による有効な消化を可能にするためのクランプ領域である（大文字）。次に、小文字のイタリック文字により示されるＮｃｏＩ制限部位である。ＡＴＧ開始コドンから始まるｄｎａＧ遺伝子の５’末端の最初の４ｎｔｓは、ＮｃｏＩ制限部位とオーバーラップする。修飾されたコドン＃３と４を含むｄｎａＧ遺伝子の５’末端の最初の４つのコドン大文字のイタリック文字により示す。コドン＃５から開始するｄｎａＧ遺伝子の５’末端に対応する２２ｎｔｓを下線の大文字により示す。リバース／アンチセンスプライマーは：
であった。プライマーの５’末端には、制限酵素により有効な消化を可能にさせるクランプ領域（ＧＡＴＣ）がある。これに続くのはＳｐｅＩ制限部位であり、小文字のイタリック文字により示される。次に、追加の停止コドン（小文字、太字）があり、天然の停止コドンに隣接する。最後に、天然停止コドンを含むｄｎａＧの３’末端に相補であり、下線の大文字として示す。ＰＣＲ産物とプラスミドｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩの両方を、ＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ制限酵素により消化した。ｄｎａＧ遺伝子を含むＰＣＲ産物の断片を、消化したｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩプラスミドに挿入した。これは、ＲＢＳの下流に最適に距離を取ってｄｎａＧ遺伝子を配置した。このプラスミドをｐＡ１−ＹＰ−ｓｓｂと命名して、図５０において描写により示す。
３８．１．ＤｎａＧの発現
図５０に示すプラスミド、ｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＧの構築を全ての遺伝子の完全な配列は、ＤＮＡ配列決定により確認した。
当該プラスミドにより大腸菌のＡＰ１．Ｌ１株を形質転換して、実施例４．１に記載されるとおりに発現させた。細胞蛋白質を分析して、ＤｎａＧ（６５．６ｋＤａ）に対応する分子量の蛋白質に関して予測された部位に移動する蛋白質バンドが別々の蛋白質バンドとして検出できたが、非誘導対照においては観察されなかった。
３８．２．エルシニア・ペスティスのＤｎａＧの大規模な生育と精製
実施例１０に記載されたとおりに、エルシニア・ペスティスのＤｎａＧの最適化発現のための時間生育の分析を実施した。ｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＧを含む大腸菌に関してのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析された生育最適化の結果を図４８に示す。このゲル中で、エルシニア・ペスティスのＤｎａＧは全細胞蛋白質の約５％発現された。
ｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＧを含む大腸菌の大規模な生育は、実施例４．４に記載されたとおりであったが、エルシニア・ペスティスのＤｎａＧを生成するためのこの大規模な生育において細菌を誘導後３時間生育させ続けて２．０ｋｇの回収重量を得たことが例外である。質の制御の結果は、接種時にアンピシリン含有培地上の１０の陽性コロニーのうち１０を示し、誘導時にアンピシリン含有培地上の１０の陽性コロニーのうち１０を示し、そして回収時にアンピシリン含有培地上の１０の陽性コロニーのうち９を示した。−２０℃において保存されていたＴｒｉｓ−蔗糖中の凍結した細胞（３０ｇ細胞）の１：１懸濁液６０ｇを、溶解することにより、最大活性を含むが最少量の混在蛋白質を残すコア複合体の最大量を沈殿させるのに最適な硫酸アンモニウムの最大量を決定した。この溶解は実施例４．５に記載されたとおりであった。ＦｒＩを各２０ｍｌの６サンプルに分割して、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％及び６０％と標記した。各サンプル中の蛋白質を、量を変えた硫酸アンモニウムを添加することにより沈殿させたところ、硫酸アンモニウムの濃度はそれぞれ４℃において３０％、３５％、４０％、４５％、５０％及び６０％飽和であった。混合物をさらに３０分間４℃において撹拌して、沈殿物を遠心分離により回収した（２３，０００ｘｇ，４５分、０℃）。上清を各サンプルから除去して、結果生じる沈殿物をＴＧ．５２バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＥＤＴＡ，２０％グリセロール、５ｍＭＤＴＴ）に懸濁し、全部の（５）硫酸アンモニウム沈殿させたサンプルに関してＦｒ ＩＩを生じた。上清及び別々のＦｒＩＩの両方からのサンプルの濃度を図４９に示す。
（実施例４．６において記載された）エルシニア・ペスティスのＤｎａＧが大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素再構成アッセイからなる再構成アッセイにおいて機能できるか否かを測定するため、及びエルシニア・ペスティスのＤｎａＧの精製において使用するための最適な硫酸アンモニウムの濃度を決定するため、別々に硫酸アンモニウム沈殿させたサンプルからのＦｒＩＩの様々な希釈を２μｌ、再構成アッセイにおいて試験した。再構成アッセイ（２５μｌ）は、１：５０に希釈した１μｌの大腸菌コア（３ｘ１０６ユニット／ｍｇ，４ｍｇ／ｍｌ）、１：５０に希釈した１μｌの大腸菌β（１．７ｘ１０６ユニット／ｍｇ，１ｍｇ／ｍｌ）、１：１００に希釈した大腸菌τ複合体（２．８ｘ１０６ユニット／ｍｇ，２ｍｇ／ｍｌ）及び１９μｌのＲＮＡプライムされたＭ１３Ｇｏｒｉ鋳型を含んだ。図５１に示す結果は、エルシニア・ペスティスのＤｎａＧが事実大腸菌ホロ酵素からの他の成分と共に機能することが可能なことを示す。これらのアッセイは、最少量の混在蛋白質を含むエルシニア・ペスティスのＤｎａＧの最大量が、４５％硫酸アンモニウムにて沈殿することを示す。
４５％硫酸アンモニウム沈殿させたエルシニア・ペスティスのＤｎａＧからのサンプル及び４５％硫酸アンモニウム沈殿させたエルシニア・ペスティスのｓｓｂからのサンプルを再構成アッセイにおいて滴定する平行実験を我々は実施した。これらの実験は、内因性の大腸菌ＤｎａＧが図５２に示した４５％硫酸アンモニウム沈殿させたエルシニア・ペスティスのＤｎａＧの活性に寄与しないことを示す。
エルシニア・ペスティスのＤｎａＧを精製するため、エルシニア・ペスティスのＤｎａＧを含む４００ｇの細胞を溶解してＦｒＩを実施例４．５の通りに形成させ、そして１４００ｍｌのＦｒ Ｉ溶解物をもたらした。サンプル中の蛋白質を勾配硫酸アンモニウムにより沈殿させたところ、硫酸アンモニウムの最終濃度は４℃において４５％であった。混合物をさらに３０分間４℃において撹拌して、沈殿物を遠心分離により回収した（２３，０００ｘｇ，４５分、０℃）。蛋白質沈殿物をＴＧ．５１バッファー中に懸濁して、ＴＧ．５１／５０ｍＭ ＮａＣｌバッファー中で平衡化されたＰ−１１ホスホセルロース（ワットマン）クロマトグラフィーカラム（５００ｍｌ，６ｃｍ ｘ ２６ｃｍ）の伝導性まで希釈した。サンプルをＰ−１１ホスホセルロースＤＥＡＥカラム上に負荷し（４ｍｌ／分）、１カラム容量のＴＧ．５１／５０ｍＭＮａＣｌバッファーで洗浄して、５０−４５０ｍＭのＮａＣｌ勾配を含む１０カラム容量のＴＧ．５１バッファーにより溶出した。フラクション（１５０）が回収され、各２５ｍｌを含んだ。蛋白質は、勾配の第２の２／３全域で溶出した。活性はフラクション５０−８０のピーク内に溶出した。フラクション６０−７９をプールしたところ（５００ｍｌ）、カラム上に負荷された全活性の約２０％を含んだ。上記フラクションのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析は、エルシニア・ペスティスのＤｎａＧが全蛋白質の約９０％をなしたことを示す。サンプル中の蛋白質を硫酸アンモニウムにより沈殿させたところ、４℃において５０％飽和であった。混合物をさらに３０分間４℃において撹拌して、沈殿物を遠心分離により回収し（２３，０００ｘｇ，４５分、０℃）、液体窒素中で素早く凍結させ、そして−８０℃に保存した。この全プロセスは、次に、Ｆｒ Ｉから蛋白質を沈殿させる硫酸アンモニウムから第２の半分の蛋白質により繰り返した。
エルシニア・ペスティスのＤｎａＧを含む蛋白質沈殿物を、イミダゾールバッファー（５０ｍＭイミダゾール、（ｐＨ６．８），１０％グリセロール、５０ｍＭＮａＣｌ，５．０ｍＭ ＤＴＴ）に懸濁して、ダウンスホモジェナイザーを用いてホモジェナイズした。サンプルを遠心分離（１６，０００ｘｇ）により透明にして、ＮａＣｌを含まないイミダゾールバッファーを用いて、イミダゾールバッファー内で平衡化したヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー（５００ｍｌ，５ｃｍｘ ２５ｃｍ）の伝導性まで希釈した（ＦｒＩＩＩ，９２０ｍｌ）。サンプルをヒドロキシルアパタイトカラムに負荷して（２．５ｍｌ／分）、３カラム容量のイミダゾールバッファー／プラス１０ｍＭＫＰＯ４で洗浄して、１０カラム容量の１０−２２５のＫＰＯ４勾配を含むイミダゾールバッファーで溶出した。フラクション（２００）を各々２５ｍｌを含むように回収した。蛋白質と活性は、フラクション６０−１１０の間の一つのピークに溶出した。フラクション６８−８８をプールし（５４０ｍｌ）、カラム上に負荷された全活性の３０％を含んだ。サンプル中の蛋白質を硫酸アンモニウムにより沈殿させたところ、４℃において５５％飽和であった。混合物をさらに３０分間４℃において撹拌して、沈殿物を遠心分離により回収し（２３，０００ｘｇ，４５分、０℃）、液体窒素中で素早く凍結させ、そして−８０℃に保存した。
エルシニア・ペスティスのＤｎａＧを含む蛋白質沈殿物をＨＧ．０５バッファー（２５ｍＭＨＥＰＥＳ，（ｐＨ７．５），５０ｍＭ ＫＣｌ，１０％グリセロール、５ｍＭ ＤＴＴ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に懸濁して、ダウンスホモジェナイザーを用いてホモジェナイズした。サンプルを遠心分離（１６，０００ｘｇ）により透明にして、結果のサンプルをＦｒＩＶとした（７ｍｌ，３９ｍｇ／ｍｌ）。サンプルを、ＨＧ．０５バッファー平衡化したセファクリル（登録商標）Ｓ−２００（アマシャムファルマシアバイオテック）クロマトグラフィーカラム（２５０ｍｌ，１：２０比）に負荷した。上記手法は、樹脂の上から樹脂ベッドの下までバッファーを走らせることを含み、サンプルを樹脂ベッド上までゆっくりとピペッティングし、サンプルを樹脂の上に吸い上げ、２ｍｌのバッファーをゆっくりと樹脂の上部に加え、樹脂の中に吸い上げた。ランニングバッファーを次に樹脂の上部に加え、そして溶出を続けた。蛋白質は０．２ｍｌ／分の流速にて溶出し、２ｍｌフラクションを回収した。フラクション３８−４６（２０ｍｌ）が負荷した活性の全てを含んだので、プールした（ＦｒＶ，１４ｍｇ／ｍｌ）。Ｆｒ Ｖを等分にして、−８０℃に保存し、そしてエルシニア・ペスティスのＤｎａＧのストックサプライを表す。精製プロセスの各工程において、エルシニア・ペスティスのＤｎａＧの精製度をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。各精製工程に関してのプールされた蛋白質のサマリーゲルを図５３に示す。
蛋白質の濃度及び活性も各精製工程に関して特性決定した（表ＶＩ）。
再構成
実施例３９．ＳＳＢ及びＤｎａＧを含むエルシニア・ペスティスのホロ酵素の再構成
ＤｎａＧの活性を、修飾された再構成アッセイを用いて測定した。このアッセイにおいて、０．０６ｐｍｏｌのＭ１３ＧｏｒｉＤＮＡ（計算上、５００ｐｍｏｌ全ヌクレオチド）、１．６μｇのＳＳＢ、１０ｍＭの硫酸マグネシウム、２００μＭのＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ及びＵＴＰ、４８μＭのｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ及び１８μＭ［３Ｈ］ｄＴＴＰ（１００ｃｐｍ．ｐｍｏｌ）を含む１９μｌを、１０００ユニットのエルシニア・ペスティスのＤｎａＥ、１４０００ユニットのエルシニア・ペスティスのクランプ負荷複合体及び１２０００ユニットのβを含む４μｌと混合した。反応は、様々な希釈のエルシニア・ペスティスのＤｎａＧの２μｌの添加により開始した。この結果を図７８に示す。
実施例４０．エルシニア・ペスティスの完全な複製ポリメラーゼ
所有するエルシニア・ペスティスの機能複製ポリメラーゼを用いて、小分子のライブラリー（コンビナトリアルケミストリーライブラリーのいくつかの供給者から得た）を高処理量フォーマットにおいてスクリーニングすることにより、エルシニア・ペスティスの複製ポリメラーゼの阻害剤を同定した。薬剤スクリーニングの最初の標的は、上記のとおり集合した成分を最小限含むことになる（ｐｏｌＩＩＩコア、クランプ負荷複合体、ベータ、ＳＳＢ及びＤｎａＧ）。エルシニア・ペスティスの複製ポリメラーゼの追加の成分（例えば、ＤｎａＢヘリカーゼ）は、利用可能になれば、上記スクリーニングに添加されることになる。複数の病原体からの複製システムを所有するなら、狭い範囲及び広い範囲の抗細菌薬剤を同定する方法は、複数の生物から複数の複製システムに対する平行のスクリーニングを設定することを含むことになる。重要なことに、上記複製システムが抗細菌薬剤の新規な標的を表すため、耐性機構はまだ存在しないであろう。
実施例４１．新規抗細菌薬剤のスクリーニングにおける使用のためのＤＮＡ複製乗法標的スクリーニング（商標）
ＤＮＡ複製のプロセスは全ての細菌の増殖に対して中心である。これまで、市販の抗細菌剤のいずれもが、細菌中の中心的な複製を構成する酵素のいすれも標的としなかった。ＤＮＡ複製が細胞プロセスはの中で最も必須であることを考えると、これは驚くべきことである。感染性生物のＤＮＡ複製装置は、よって、薬剤開発の努力に関して未探索の標的として位置しており、重要な機会を表す。複製システムは大部分においてこれまでに標的とされてこなかったが、その複雑性が薬剤スクリーニングアッセイを設定する侮りがたい技術上のバリヤーを提示するためである。さらに、個々のサブユニットの多くの活性が複製装置の他の成分との正確な対合に依存するため、単一のサブユニットを用いる標的に基づくアッセイでは通常実行できない。
細菌のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素は、それらが触媒する複雑な反応の工程の各々の間に蛋白質−蛋白質の対合における顕著な変化を経る約１０のサブユニットを含む。これらの蛋白質の全ては一緒になって機能しなければならないから、多数の別々の相互作用及び触媒事象の全てが、抗細菌作用の標的を提供して、即ち、標的として存在する多数の蛋白質を供給することになる。高処理量のスクリーニングフォーマットの蛍光に基づくアッセイが、本明細書において複製乗法（multiplicative）標的スクリーニング（商標）（ＭＴＳＴＭ）と命名したものの基礎を提供する。この技術は、デコンボルーションのための有効な高処理量のアプローチ及び特定の標的の有効な同定も含んだ。ＭＴＳ技術を利用するアッセイは、単一の標的酵素を用いたいっそう伝統的なスクリーニングアッセイに比較して十分にいっそう有効であるが、ホロ酵素を含む蛋白質の各々の活性が同時に標的にされるからである。
平行標的スクリーニングは、広い範囲及び狭い範囲の特異性により、ヒットの同定のために使用することができる。大腸菌のＭＴＳＴＭが開発されて、他のグラム陰性及びグラム陽性のＭＴＳＴＭシステムを再構成するためのプロセスにおいて使用されることになる。これらのアッセイは、再構成されたヒトのレプリカーゼと共に、広い範囲及び狭い範囲の能力により「ヒット」を同定し、そしてヒト（ＤＮＡポリメラーゼδ、ＰＣＮＡ，ＲＦＣ，ＲＰＡ）複製システムを阻害する障害性能力により化合物を排除するために使用されることになる。例えば、ヒトのレプリカーゼを阻害することなくグラム陰性及びグラム陽性レプリカーゼを阻害する化合物は、広い範囲の抗細菌剤に開発され得る有力な候補を提供する。この戦略は、理想的な抗細菌薬剤が適切に特異的であって正常な非病原性の植物相（flora）の排除を導かない、特定の慢性の感染の治療に有用な抗細菌剤を得るために逆戻りされ得る（即ち、グラム陰性レプリカーゼを、別のグラム陰性レプリカーゼを阻害することなく阻害する化合物を同定する）。シュードモナス・エルギノーサの複製装置を特異的に阻害する化合物は、有益な嚢胞性繊維症及び免疫−障害性（compromised）患者に対して全身投与される薬剤として有用であるべきである。
シュードモナス・エルギノーサの核酸及び蛋白質に関する実施例
ｐｏｌ ＩＩＩコア
実施例４２．ｄｎａＥ（アルファ）サブユニットをコードする遺伝子であるシュードモナス・エルギノーサのｄｎａＥの分子クローニング
最近完了したシュードモナス・エルギノーサのゲノミックデータベース（Ｓｔｏｖｅｒ，ｅｔａｌ．同じ箇所）を、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットをコードする遺伝子に関して検索した。ｄｎａＥ（α）サブユニットに関する遺伝子が同定されて注釈を付けられた。シュードモナス・エルギノーサと大腸菌からのＤｎａＥ蛋白質のアミノ酸配列の比較は、それらが５８％同一であって、蛋白質配列の全部の長さにわたりそれらが相同であって整列化（align）されることを示す（図３）。２つのｄｎａＥ候補が同定されて、両者がクローン化されてコア蛋白質に挿入される。最初のｄｎａＥ遺伝子（ｄｎａＥ＃１）を最初に記載する。
４２．１．候補＃１の分子クローニング
ｄｎａＥ＃１遺伝子は、α＃１サブユニットをコードし、シュードモナス・エルギノーサのゲノミックＤＮＡから増幅される。ｄｎａＥ＃１遺伝子は、次に、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩプラスミド（ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩのポリクローナル領域は図９に示す）に挿入する。ｄｎａＥ＃１遺伝子は、大腸菌において使用頻度の低いコドンを何も有さない。この手法は２段階プロセスである。ｄｎａＥ＃１の５’半分を最初にＰＣＲ増幅して、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩに挿入することにより、ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＥ＃１−５’を作成する。ｄｎａＥ＃１の３’半分をＰＣＲ増幅して、ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＥ１−５’に挿入して、ｐＡ１−ＰＡ−コア＃１を創製する。α＃１サブユニットは、１１７３アミノ酸からなる。α＃１をコードする遺伝子はｄｎａＥ＃１であり、そして停止コドンを含んで３５２２ヌクレオチドからなる。ｄｎａＥ＃１のヌクレオチド配列は、配列番号：６５により表される。α＃１のアミノ酸配列は、配列番号：６７により表される。ｄｎａＥ＃１の５’半分をＰＣＲ増幅するため、フォワード／センスプライマーは：
である。４ヌクレオチドの５’クランプ領域（小文字ｇａｃｔ）があり、制限酵素による有効な消化を可能にさせる。クランプ領域に、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩへの挿入のためのＰａｃＩ制限部位が続く（大文字、イタリック文字）。ＰａｃＩ部位は、オペロンの構築に使用されるＨｉｎｄＩＩＩ部位（続く大文字、イタリック文字）とオーバーラップする。これは、ＲＢＳから１２ヌクレオチドの距離で下流に開始コドンを置き、９−１１ヌクレオチドの最適化距離設定範囲をちょうど超える。ｄｎａＥ＃１遺伝子は、コアオペロンの一部になるようにデザインされるが、ちょうど上記のように最適にＲＢＳからの距離を取って上記プラスミド中で単独で発現され得る。最後に、ｄｎａＥ＃１遺伝子の５’末端の最初の２０ヌクレオチドに相当する２０ヌクレオチドを大文字の下線により示す。
ｄｎａＥ＃１開始コドンの約１５２７ヌクレオチド下流に位置する唯一のＫｐｎＩ制限部位が存在する。リバース／アンチセンスプライマーは、このＫｐｎＩ制限部位のちょうど下流に選択される。１．５ｋｂのＰＣＲ産物は、ｄｎａＥ＃１遺伝子の５’半分を含む。当該ＰＣＲ産物をＰａｃＩ／ＫｐｎＩ制限酵素により消化する。当該ＰＣＲ断片（約１．５ｋｂ）は、次に、同じ２つの制限酵素により消化されたｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩに挿入される。この前駆体プラスミドをｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＥ＃１−５’と命名して、図５４に模式的に示す。
ｄｎａＥ＃１遺伝子の３’の半分をＰＣＲ増幅するため、フォワード／センスプライマーを上記の唯一のＫｐｎＬ制限部位のちょうど上流の配列から選択する。これは、ＰＣＲ産物のＫｐｎＩによる消化及びｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＥ＃１−５’のＫｐｎＩ部位におけるその挿入を可能にさせ、それにより、完全なｄｎａＥ＃１遺伝子を再度作成する。リバース／センスプライマーは：
である。４ヌクレオチドの５’クランプ（小文字ａｇｃｔ）は制限酵素により有効な消化を可能にさせる。ＳｐｅＩ部位（大文字、イタリック文字）がクランプに続く。ＳｐｅＩ制限部位は、第２の非相補停止コドン（太字）の「ｔ」とオーバーラップする。第２の非相補停止コドンは、天然の停止に隣接しており、天然停止コドンと直列にある。ｄｎａＥ＃１遺伝子の３’の２０ヌクレオチドに相補な２０ヌクレオチドを大文字のイタリックとして示す。１．５ｋｂのＰＣＲ産物は、＃１遺伝子の３’半分を含む。
ＰＣＲ産物をＫｐｎＩ／ＳｐｅＩにより消化して、同じ２つの制限酵素により消化してあったｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＥ＃１−５’に挿入する。これは、完全なｄｎａＥ＃１遺伝子を上記プラスミド中で正確な読み枠にてあらゆるものを配置させる。このプラスミドをｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＥ＃１と命名して、図５５に模式的に示す。
４２．２．候補＃２の分子クローニング
ここでは、α＃２サブユニットをコードするｄｎａＥ＃２遺伝子を、シュードモナス・エルギノーサのゲノミックＤＮＡから増幅する。ｄｎａＥ＃２遺伝子は、次に、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩプラスミド（ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩのポリクローナル領域は上に示す）に挿入する。ｄｎａＥ＃２遺伝子は、大腸菌において使用頻度の低いコドン、第１コドン、をたった一つ有する。シュードモナス・エルギノーサのｄｎａＥ＃２における開始コドンはＧＴＧである。これをフォワード／センスプライマーによりＡＴＧに変更する。この手法は２段階プロセスである。ｄｎａＥ＃２の５’の１／３を最初にＰＣＲ増幅して、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩに挿入することにより、ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＥ＃２−５’を作成する。２番目に、ｄｎａＥ＃２の２／３を続いてＰＣＲ増幅して、ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＥ２−５’に挿入して、完全長のｄｎａＥ＃２遺伝子を含むプラスミドを創製する。α＃２サブユニットは、１０３１アミノ酸からなる。α＃２をコードする遺伝子はｄｎａＥ＃２であり、そして停止コドンを含んで３０９６ヌクレオチドからなる。ｄｎａＥ＃１のヌクレオチド配列は、配列番号：７０により表される。Ｍｅｔをコードする第１コドンはＧＴＧである。これは、フォワード／センスプライマーによりＡＴＧに変更される。α＃２のアミノ酸配列は、配列番号：７２により表される。ｄｎａＥ＃２の５’の１／３をＰＣＲ増幅するため、フォワード／センスプライマーは：
である。４ヌクレオチドの５’クランプ領域（小文字ｇｃｔａ）があり、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩへの挿入のためのＰａｃＩ制限部位が続く（大文字、イタリック文字）。ＰａｃＩ部位は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位（これも大文字、イタリック文字）の最初の２ヌクレオチドとオーバーラップする。ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位は、オペロンの構築に使用される。当該制限部位に、大文字の太字で示された修飾開始コドン（ＧＴＧからＡＴＧへ）が続く。ｄｎａＥ＃２遺伝子の５’末端の４−２３位に相当する２０ヌクレオチドを大文字の下線により示す。
ｄｎａＥ＃２開始コドンの約８００ヌクレオチド下流に位置する唯一のＫｐｎＩ部位が存在する。リバース／アンチセンスプライマーとして作用するように、このＫｐｎＩ制限部位のちょうど下流にプライマーを選択する。０．８ｋｂのＰＣＲ産物は、ｄｎａＥ＃２遺伝子の５’の１／３を含む。
このＰＣＲ産物を、ＰａｃＩ／ＫｐｎＩ制限酵素により消化する。当該ＰＣＲ断片（約０．８ｋｂ）は、次に、同じ２つの制限酵素により消化されたｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩに挿入される。この前駆体プラスミドをｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＥ＃２−５’と命名して、図５６に模式的に示す。ｄｎａＥ＃２遺伝子の３’の２／３をＰＣＲ増幅するため；フォワード／センスプライマーを上記の唯一のＫｐｎＬ制限部位のちょうど上流の配列から選択する。これは、ＰＣＲ産物のＫｐｎＩによる消化及びｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＥ＃２−５’のＫｐｎＩ部位におけるその挿入を可能にさせ、それにより、完全なｄｎａＥ＃２遺伝子を再度作成する。リバース／センスプライマーは：
である。４ヌクレオチドの５’クランプ（小文字ａｇｔｃ）は、制限酵素により有効な消化を可能にさせる。ＳｐｅＩ部位（大文字、イタリック文字）がクランプに続く。ＳｐｅＩ制限部位は、第２の非相補停止コドン（太字）の「ｔ」とオーバーラップする。第２の非相補停止コドンは、天然の停止に隣接しており、天然停止コドンと直列にある。ｄｎａＥ＃２遺伝子の３’の２３ヌクレオチドに相補な２０ヌクレオチドを大文字のイタリックとして示す。２．２ｋｂのＰＣＲ産物は、＃２遺伝子の３’の２／３を含む。
ＰＣＲ産物をＫｐｎＩ／ＳｐｅＩにより消化して、同じ２つの制限酵素により消化してあったｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＥ＃２−５’に挿入する。これは、完全なｄｎａＥ＃２遺伝子を上記プラスミド中で正確な読み枠にてあらゆるものを配置させる。このプラスミドをｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＥ＃２と命名して、図５７に模式的に示す。
４２．３．大腸菌内でのｄｎａＥの発現
シュードモナス・エルギノーサのＤｎａＥ蛋白質（αサブユニット）を、大腸菌のＤｎａＥ（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｒ．ａｎｄ ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．（１９９６）ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１，２０６８１−２０６８９）、ＴｔｈのＤｎａＥ（Ｂｕｌｌａｒｔ，ｅｔａｌ．，同じ箇所）及びストレプトコッカス・ピオゲネスのＤｎａＥを過剰発現させるために使用されたのと類似のベクターに挿入することにより大腸菌内で発現させる。全細胞蛋白質の１−１０％の過剰発現が、これら３つのαサブユニットに関して達成された。
発現ベクターは、Ｔ７のＲＮＡポリメラーゼにより転写されるｌａｃリプレッサー又はｐＥＴ−スタイルベクターにより高度に誘導可能及び抑制可能な合成プロモーターを含むことになる（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｒ．ａｎｄＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．（１９９６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１，２０６８１−２０６８９；Ｋｉｍ，Ｄ．Ｒ．ａｎｄ ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．（１９９６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１，２０６８１−２０６８９；Ｍａｒｉａｎｓ，Ｋ．Ｊ．（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２６２，５０７−５２１）。シュードモナス・エルギノーサのｄｎａＥ遺伝子の一部分は、開始ＡＴＧに関して適切な位置に制限部位を置くために、ＰＣＲにより得られる。ＰＣＲにより得られた全てのＤＮＡ断片はＤＮＡ配列決定により確認されることにより、増幅法により変異が創製されなかったことを確認する。誘導後の障害性は問題にならないであろう−１００ｍｇの量の過剰発現された蛋白質は、誘導前に高密度に生育させた死細胞から日常的に精製される。しかしながら、プラスミドの損失又は変異を伴う誘導前の障害性が問題であれば別のアプローチを使用してよく、例えば、Ｔ７リゾチーム同じ発現又は如何なるＴ７ＲＮＡポリメラーゼもなしに細胞を生育させて、誘導前にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えＭ１３ファージによる感染により上記酵素を誘導する。類似の手法が発酵機中で１８０ｌのスケールまで実施された。この蛋白質を発現させることにおいて特別な困難はないと予測されるが、高度に類似の大腸菌、サーマス・サーモフィルス及びストレプトコッカス・ピオゲネスの蛋白質が大腸菌内で発現されて精製されたからである（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｒ．ａｎｄＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．（１９９６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１，２０６８１−２０６８９）。実施例４にて論じられた標準プロトコルのとおりに、細胞を標準の発酵機中で生育させ、誘導し、溶解し、そしてシュードモナス・エルギノーサのＤｎａＥ蛋白質を精製する（同じ箇所）。ポリメラーゼは相同な大腸菌の蛋白質と類似の特性を呈すると予測される。結果の精製された酵素は、再構成されたシュードモナス・エルギノーサの複製システムに必須の第１に発現される伸長蛋白質として作用する。ＤＮＡ合成触媒活性を提供するサブユニットとして、ＤｎａＥは再構成アッセイにおいて必須の成分であるが、追加の付属蛋白質の活性を測定するために、その活性の変調が用いられるからである。
自身により発現されるシュードモナス・エルギノーサのＤｎａＥの精製を以前の仕事に関して達成する。酵素の回収及び位置は付属因子を必要としない当業界公知の単純なアッセイを用いて監視することができる−ヌクレアーゼ活性化ＤＮＡにおける非プロセッシブなギャップフィリング（同じ箇所）。一般に、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのαサブユニットは硫酸アンモニウムに相対的に不溶性である。シュードモナス・エルギノーサのＤｎａＥを少なくとも９０％を沈殿させる最も低い濃度の硫酸アンモニウムを用いる。大腸菌蛋白質の大部分は上清中に残る。カチオン交換クロマトグラフィーはポリメラーゼの良好な精製をもたらす。それらは、ほとんどの大腸菌蛋白質がフロースルーする条件下で樹脂を結合し、ポリメラーゼは塩勾配において高い精製度で溶出される。この段階において純粋な蛋白質を得ることは期待されるが、もしも達成されないならば、活性の保存を伴って最大の精製度を達成する特別の当業界公知の追加のクロマトグラフィー工程が開発される。全蛋白質レベルは、この出願に記載されるこの精製及び他の精製においてブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．（１９７６）ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ ７２，２４８−２５４）により測定される。
実施例４３．イプシロンサブユニットをコードする遺伝子であるシュードモナス・エルギノーサのｄｎａＱの分子クローニング
この実施例は、シュードモナス・エルギノーサのゲノミックＤＮＡからイプシロン（ε）サブユニットをコードするｄｎａＱ遺伝子のＰＣＲ増幅を記載する。ｄｎａＱ遺伝子は、次に、ベクターｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩに挿入される（このベクターのポリクローナル領域を図１０に示す）。ｄｎａＱ遺伝子は、大腸菌における発現のために５’の使用頻度の低いコドンを有さない。εサブユニットは２４６のアミノ酸からなる。εをコードする遺伝子はｄｎａＱであり、停止コドンを含んで７４１ヌクレオチドからなる。ｄｎａＱのヌクレオチド配列は、配列番号：７５により表される。シュードモナス・エルギノーサのεのアミノ酸配列は、配列番号：７７により表される。フォワード／センスプライマーは：
である。４ヌクレオチドの５’クランプ領域（小文字ａｇｔｃ）は制限酵素による有効な消化を可能にさせる。ＮｄｅＩ制限部位（大文字、イタリック文字、）がクランプ領域に続く。ＮｄｅＩ部位は、ｄｎａＱ遺伝子のＡＴＧ開始コドンとオーバーラップする。続く１９ヌクレオチドは、ｄｎａＱ遺伝子の５’末端の４−２２のヌクレオチドに相当し、大文字で示される。ｄｎａＱ遺伝子の５’末端に相当する全てのヌクレオチドに下線を引く。リバース／アンチセンスプライマーは：
である。４ヌクレオチドの５’クランプ領域（小文字ａｇｔｃ）は制限酵素により有効な消化を可能にさせる。クランプに、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩへの挿入を可能にさせるＮｈｅＩ制限部位（大文字、イタリック文字）が続く。ＮｈｅＩ制限部位に、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（これも大文字、イタリック文字）が続き、コアオペロンの構築に使用される。次に、３塩基のスペーサー（小文字、太字）は、オペロンの構築のためにｄｎａＱの下流に追加された遺伝子のための最適な距離を提供する。これは、ＲＢＳに続く（大文字、太字）。ＲＢＳに続き、天然の停止コドンに隣接して第２の非相補停止コドン（小文字、太字）が続き、２つの停止コドンを直列に提供する。最後の２３ヌクレオチド（大文字、下線）は、ｄｎａＱ遺伝子の３’末端に相補である。
シュードモナス・エルギノーサのｄｎａＱ遺伝子を、２つのプライマーを用いてＰＣＲ増幅して、ＮｄｅＩ／ＮｈｅＩ制限酵素により消化する。
消化されたＰＣＲ断片を、同じ２つの制限酵素で消化してあったｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩに挿入した。これはｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＱを形成する。開始コドンは、ＲＢＳの下流１１ヌクレオチドであり、最適な距離設定である。ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＱを図５８に模式的に示す。
実施例４４．オペロンクローニング
４４．１．ｄｎａＸ＃１及びｄｎａＱの両方を含む２遺伝子オペロンの構築
この実施例は、ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＥ＃１からのｄｎａＥ＃１遺伝子の抽出及びｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＱ内のｄｎａＱ遺伝子の下流へのその挿入を記載する。ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＱの構築において、ＲＢＳとＨｉｎｄＩＩＩ部位をｄｎａＱ遺伝子の下流に配置することにより、オペロンの構築を可能にした。これらの成分が、このオペロンの構築において利用される。
ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＥ＃１からｄｎａＥ＃１遺伝子を抽出するため、当該プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｅＩにより消化する。ｄｎａＥ＃１遺伝子を含む断片（約３．５ｋｂ）を、次に、同じ２つの制限酵素により消化されていたｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＱに挿入する。これは、ｄｎａＥ＃１遺伝子を、下流のＲＢＳからの最適な距離設定で配置する。このプラスミドをｐＡ１−ＰＡ−コア＃１と命名し、図５９に示す。
４４．２．ｄｎａＥ＃１とｄｎａＱの両方を含む２遺伝子オペロンの構築
この実施例は、ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＥ＃２からのｄｎａＥ＃２遺伝子の抽出及びｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＱ内のｄｎａＱ遺伝子の下流へのその挿入を記載する。ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＱの構築において、ＲＢＳとＨｉｎｄＩＩＩ部位をｄｎａＱ遺伝子の下流に配置することにより、オペロンの構築を可能にした。これらの成分をここで利用する。ここでの工程は、ｄｎａＱ＃２をｄｎａＱ＃１の代りに用いた以外は、ｐＡ１−ＰＡ−コア＃１の構築と全く同じである。
ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＥ＃２からｄｎａＥ＃２遺伝子を抽出するため、当該プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｅＩにより消化する。ｄｎａＥ＃１遺伝子を含む断片（約３ｋｂ）を、次に、同じ２つの制限酵素により消化されていたｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＱに挿入する。これは、ｄｎａＥ＃１遺伝子を、下流のＲＢＳからの最適な距離設定で配置する。このプラスミドをｐＡ１−ＰＡ−コア＃１と命名し、図６０に示す。
ベータクランプ
実施例４５．シュードモナス・エルギノーサのＤｎａＮ（ベータサブユニット）プロセッシビティー因子をコードする遺伝子であるシュードモナス・エルギノーサのｄｎａＮの分子クローニング、及びその大腸菌における発現、その精製、及びＤｎａＥのプロセッシビティーへのその寄与の特徴
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のβサブユニットをコードするシュードモナス・エルギノーサのｄｎａＮ遺伝子の遺伝子は同定されて、注釈が付された。シュードモナス・エルギノーサ及び大腸菌由来のＤｎａＮ蛋白質のアミノ酸配列の比較は、それらが５６％相同であり、蛋白質配列の全長にわたり整列化されることを示す（図４）。
この実施例は、シュードモナス・エルギノーサのゲノミックＤＮＡからのｄｎａＮ遺伝子（β）のＰＣＲを用いた増幅及びそのベクターｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩへの挿入を記載する。ポリクローナル領域を包含するｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩの領域を図１０に示す。βサブユニットは３６７アミノ酸からなる。ベータをコードする遺伝子はｄｎａＮであり、停止コドンを含めて１１０４ヌクレオチド（ｎｔｓ）からなる。全ての計画のためのプライマーの全部が全く長くて、６１ヌクレオチドまであり、ゲル精製又はＨＰＬＣ精製を必要とする。ｄｎａＮのヌクレオチド配列は、配列番号：１１２により表される。フォワード／センスプライマーは：
である。４ヌクレオチドの５’クランプ（小文字ａｇｃｔ）は制限酵素の有効な消化を可能にさせる、これに、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩへの挿入のためのＰａｃＩ制限部位（大文字、太字）及びリボソーム結合部位（ＲＢＳ）及び開始コドンの間の最適な距離のための、二重下線を付された一つのヌクレオチド「ｃ」が続く。次の６つのヌクレオチド（大文字イタリック）はＮｓｉＩ部位を形成し、使用されない。次に６つのヌクレオチドは、ｄｎａＮ遺伝子配列の最初の６ヌクレオチドでもあり、ｄｎａＮ遺伝子の５’末端のヌクレオチド７−２４に相当する１８のヌクレオチド（大文字）が続く。ｄｎａＮ遺伝子の５’末端に相当する全てのヌクレオチドに一本の下線を引く。ｄｎａＮ遺伝子には大腸菌で使用頻度の低いコドンは存在しない；よって、上記プライマーは当該遺伝子の末端の５’エンドに相補である。リバース／アンチセンスプライマーは：
である。４ヌクレオチドの５’クランプ領域（小文字ａｇｃｔ）は制限酵素の有効な消化を可能にさせる、これに、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩへの挿入のためのＳｐｅＩ制限部位（大文字、イタリック太字）が続く。次に、第２の非相補停止コドン（小文字、太字、二重下線文字）が天然停止コドンと直列にある。これに、ｄｎａＮ遺伝子の３’末端に相補な２３ヌクレオチドが続く。
シュードモナス・エルギノーサのｄｎａＮのＰＣＲ産物及びプラスミドｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩの両方をＰａｃＩ／ＳｐｅＩ制限酵素により消化する。ｄｎａＮ遺伝子を含むＰＣＲ産物の断片（１．１ｋｂ）を、ＮｄｅＩ−ＳｐｅＩ消化したｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩに挿入する。これは、上流のＲＢＳから最適に距離を離してｄｎａＮ遺伝子を配置して、図６１に模式的に描写する。
精製は、大腸菌（Ｊｏｈａｎｓｏｎ，Ｋ．Ｏ．，Ｈａｙｎｅｓ，Ｔ．Ｅ．，ａｎｄ ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．（１９８６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６１，１１４６０−１１４６５）、サーマス・サーモフィルスのベータ（Ｂｕｌｌａｒｄ，ｅｔａｌ．，同じ箇所）に関して開発された成功した手法の後に設計され（modeled）、そして必要に応じてシュードモナス・エルギノーサのベータの唯一の特性のために適合される。精製手法は、シュードモナス・エルギノーサのベータを配置した定量するために直鎖状の鋳型上で機能プロセッシビティーアッセイを用いて、経験的に開発されることになる。精製されたβは、αと共に、シュードモナス・エルギノーサのＤｎａＸ複合体の必須成分の精製のためのアッセイを開発するための基礎を提供する。
クランプ負荷複合体
実施例４６．シュードモナス・エルギノーサのＤｎａＸ複合体のシュードモナス・エルギノーサのＤｎａＸ，ＨｏｌＡ及びＨｏｌＢ成分の分子クローニング及びそれらの大腸菌における発現、及びそれらの精製
ＤＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素のシュードモナス・エルギノーサのｄｎａＸ遺伝子の遺伝子がデータベース中に同定されて注釈を付けられた（Ｓｔｏｖｅｒ，ｅｔａｌ．同じ箇所）。シュードモナス・エルギノーサ及び大腸菌からのＤｎａＸ蛋白質のアミノ酸配列の比較は、それらが４５％同一であって、蛋白質配列の全部の長さにわたりそれらが整列化（align）され、蛋白質のアミノ末端領域に高い配列同一性があることを示す（図５）。
この実施例は、シュードモナス・エルギノーサのゲノミックＤＮＡからの、τサブユニットをコードするｄｎａＸ遺伝のＰＣＲ増幅を記載する。ｄｎａＸ遺伝子は、次に、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩプラスミドに挿入される（ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩのポリクローナル領域は図３１に示される）。ｄｎａＸ遺伝子は、大腸菌及びエルシニア・ペスティスからのｄｎａＸのように、翻訳フレームシフト部位を有さず、よって、フレームシフト部位を含むかもしれない如何なるコーディング領域も変化させる内部変異は作動しなかった。τサブユニットは６８１アミノ酸からなる。ＤｎａＸ（τ）をコードする遺伝子はｄｎａＸであり、停止コドンを含めて２０４６ヌクレオチドからなる。ｄｎａＸのヌクレオチド配列は、配列番号：８０により表される。Ｓｅｒコードするｋｄｏｎ＃２は大腸菌において使用頻度の低いコドンであり、よって、フォワード／センスプライマーにより高い使用頻度のコドンに変更する。＃２コドンはＡＧＴ＞ＡＧＣに変化させる。ＤｎａＸ（τ）のアミノ酸配列は、配列番号：８２により表される。フォワード／センスプライマーは：
である。４ヌクレオチドのクランプ（小文字ａｇｔａ）は制限酵素による有効な消化を可能にさせる。クランプにＰａｃＩ制限部位（大文字、イタリック文字）が続き、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（これも大文字、イタリックにより示す）の最初の２ヌクレオチドとオーバーラップする。次に、開始コドン及び高い使用頻度のコドンに修飾されるコドン＃２であり（ＡＧＴ＞ＡＧＣ）、共に、大文字の太字の字体で示す。最後の２２ヌクレオチドは、ｄｎａＸ遺伝子の７−２８位に相当し、大文字で下線を引いて示される。リバース／アンチセンスプライマーは：
である。４ヌクレオチドのクランプ（小文字のａｇｔｃ）は制限酵素による有効な消化を可能にさせる。クランプにＳｐｅＩ制限部位（大文字、イタリック文字）が続く。次に、天然停止コドンに隣接して第２の非相補停止コドン（小文字、太字）があり、直列の停止コドンを創製する。次の１９ヌクレオチド（大文字、下線）は、ｄｎａＸ遺伝子の最後の１９ヌクレオチドに相当する。
シュードモナス・エルギノーサのｄｎａＸ遺伝子を、２つのプライマーを用いてＰＣＲ増幅して、ＰａｃＩ／ＳｐｅＩ制限酵素により消化する。消化されたＰＣＲ断片を、同じ２つの制限酵素で消化してあったｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩに挿入する。これはｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＸを形成する。開始コドンは、ＲＢＳの下流１２ヌクレオチドであり、最適な距離設定をたった１ヌクレオチドしか超えず、それ自身の右をうまく発現する。しかしながら、ｈｏｌＢ（δ）及びｈｏｌＡ（δ’）の下流にてオペロンに挿入されたなら、距離設定は最適になる。ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＸを図６２に模式的に示す。
実施例４７．ＨｏｌＡ（デルタ）サブユニットをコードする遺伝子であるシュードモナス・エルギノーサのｈｏｌＡの分子クローニング
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のシュードモナス・エルギノーサのｈｏｌＡ遺伝子は、データベースから同定されて注釈を付された（Ｓｔｏｖｅｒ，ｅｔａｌ．，同じ箇所）。シュードモナス・エルギノーサと大腸菌由来のδサブユニットのアミノ酸配列の細菌の比較は、それらが３４％同一であること及び蛋白質配列の全長にわたり整列化されることを示す（図６）。シュードモナス・エルギノーサのδを、ＤｎａＥに関して記載されたのと類似の方法を用いて、ＰＣＲによりクローン化して、発現させて、そして精製する。
この実施例は、シュードモナス・エルギノーサのゲノミックＤＮＡからのｈｏｌＡ遺伝子（δサブユニット）のＰＣＲを用いた増幅を記載する。ｈｏｌＡ遺伝子は、次にｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩプラスミドへ挿入される（ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩのポリクローナル領域は図Ｐ２に示す）。リバース／アンチセンスプライマーを用いたＰＣＲ増幅においては、ＲＢＳ部位に相当する停止コドンの下流に配列を挿入するが、オペロン形成においてｈｏｌＡ遺伝子の下流に他の遺伝子を添加するために使用することができる制限部位でもある。δサブユニットは３４５アミノ酸からなる。δをコードする遺伝子はｈｏｌＡであり、１０３８ヌクレオチドからなる。ｈｏｌＡのヌクレオチド配列は、配列番号：８５により表される。コドン＃２，４及び５（それぞれ、Ｌｙｓ，Ｔｈｒ及びＰｒｏをコードする）を二重下線により示し、それらは大腸菌において低使用頻度コドンであり、フォワード／センスプライマーにより高い使用頻度のコドンに変更される。当該変化は、コドン＃２ＡＡＡ＞ＡＡＡ，コドン＃４ＡＣＴ＞ＡＣＣ，そしてコドン＃５ＣＣＣ＞ＣＣＧである。δのアミノ酸配列は、配列番号：８７により表される。フォワード／センスプライマーは：
である。４塩基の５’クランプ（小文字ａｇｔａ）が存在することにより、制限酵素による有効な消化が可能になる。ＰａｃＩ制限部位（大文字のイタリック文字）がクランプに続き、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩへの挿入のために使用される。これに、ＮｈｅＩの制限部位（大文字、太字、イタリック文字）が続く。この制限部位は、オペロンの構築に使用される。コドン＃２、４及び５は、大腸菌において使用頻度の低いコドンであり、フォワード／センスプライマーにより高い使用頻度のコドンに変更される。これらのコドンは、ｈｏｌＡ遺伝子には全体として対応しておらず、それらは小文字の太字により示される。最後に、最後の２０ヌクレオチド（大文字、下線）は、ｈｏｌＡ遺伝子のヌクレオチド１６−３５に相当する。リバース／アンチセンスプライマーは、
である。４塩基の５’クランプ（小文字ａｇｔａ）が存在することにより、制限酵素による有効な消化が可能になる。ＳｐｅＩ制限部位（大文字のイタリック文字）がクランプに続き、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩへの挿入を可能にする。ＳｐｅＩ制限部位に３つのヌクレオチドのスペーサー（小文字、イタリック文字）が続き、オペロンの構築の間にＳｐｅＩとＨｉｎｄＩＩＩの両方の制限酵素消化のためのクランプ領域として機能する。ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（大文字、太字）が続く。ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に、３つのヌクレオチドスペーサーが続き（小文字、太字）、オペロン構築の間のＲＢＳ（大文字、太字）と下流の遺伝子の間の最適な距離設定を提供する。ＲＢＳに、第２の停止コドンが続き、天然の停止コドンに隣接して、直列に２つの停止コドンが並ぶ。最後の２０ヌクレオチドはｈｏｌＡ遺伝子の３’末端に相補であり、大文字で下線を引かれる。
シュードモナス・エルギノーサのｈｏｌＡ遺伝子は、上記２つのプライマーを用いて増幅されて、ＰａｃＩ／ＳｐｅＩ制限酵素により消化される。消化されたＰＣＲ断片は、同じ制限酵素により消化されていたｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩに挿入される。これは、ｐＡ１−ＰＡ−ｈｏｌＡを形成する。開始コドンはＲＢＳの１４ヌクレオチド下流であり、最適の距離設定を上回る。しかしながら、オペロンに挿入されたら、距離設定は最適になる。また、リバース／アンチセンスプライマーは、オペロン構築において使用される下流のＲＢＳ及び制限部位を加える。新たに構築されたｐＡ１−ＰＡ−ｈｏｌＡプラスミドを図６３に模式的に示す。
実施例４８．ＨｏｌＢ（デルタプライム）サブユニットをコードする遺伝子であるシュードモナス・エルギノーサのｈｏｌＢの分子クローニング
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のシュードモナス・エルギノーサのｈｏｌＢの遺伝子は、データベースから同定されて注釈を付けられた（Ｓｔｏｖｅｒ，同じ箇所）。シュードモナス・エルギノーサ及び大腸菌由来のδ’サブユニットのアミノ酸配列の比較は、それらが３１％同一であって、蛋白質配列の全長にわたり相同性であり整列化されることを示す（図６）。
シュードモナス・エルギノーサのδ’サブユニットを、ｄｎａＥに関して記載されたのと類似の方法を用いて、ＰＣＲにより増幅して、発現させ、そして精製する。
この計画において、δ’サブユニットをコードするｈｏｌＢ遺伝子を、シュードモナス・エルギノーサのゲノミックＤＮＡから増幅する。ｈｏｌＢ遺伝子をｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩへ挿入する。ＰＣＲ産物中には、ＲＢＳ部位に相当する停止コドンの下流へリバース／アンチセンスプラスミドにより配列が挿入されるが、オペロン形成においてｈｏｌＢ遺伝子の下流に他の遺伝子を添加するために使用することができる制限部位でもある。ポリクローナル領域を包含するｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩの領域を図２に示す。δ’サブユニットは３２８アミノ酸からなる。δ’をコードする遺伝子はｈｏｌＢであり、停止コドンを含めて９８７ヌクレオチドからなる。ｈｏｌＢのヌクレオチド配列は、配列番号：９０により表される。δ’のアミノ酸配列は、配列番号：９２により表される。フォワード／センスプライマーは：
である。４塩基の５’クランプ（小文字ａｇｔｃ）が存在することにより、制限酵素による有効な消化が可能になる。ＮｃｏＩの制限部位（大文字のイタリック文字）がクランプに続く。ＮｃｏＩ制限部位はｈｏｌＢ遺伝子の５’末端の最初の４（４）ヌクレオチドとオーバーラップする。これは、開始コドンのＲＢＳからの最適な距離設定を提供する。ｈｏｌＢ遺伝子の５’末端に相当するヌクレオチドに下線を引く。大腸菌において使用頻度の低いコドンはｈｏｌＢの５’末端には無い；よって、当該遺伝子の５’末端に相補なプライマーを使用した。リバース／アンチセンスプライマーは、
である。４塩基の５’クランプ（小文字ａｇｔｔ）が存在し、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩへの挿入のためのＳｐｅＩ制限部位（大文字のイタリック文字）が続く。次に、オペロン構築において制限酵素による有効な消化のための３つのヌクレオチドのスペーサー（二重下線文字）が続く。当該スペーサーの次に、オペロンの構築において次のＲＢＳ（大文字、太字）と下流遺伝子の開始コドンの間の最適な距離設定を提供するための別の３ヌクレオチドのスペーサー（小文字、二重下線文字）が続く。ＲＢＳに、非相補な第２の停止コドン（小文字）が続き、天然の停止コドンに直列になる。これに、ｈｏｌＢ遺伝子の３’末端に相補な２２ヌクレオチドが続くｈｏｌＢ遺伝子の３’末端に相補なプライマーの領域に一本の下線を引く。
シュードモナス・エルギノーサのｈｏｌＢ遺伝子産物とプライマーｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩの両方を、ＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ制限酵素により消化する。ｈｏｌＢ遺伝子を含むＰＣＲ産物の断片を、ＮｃｏＩ／ＳｐｅＩで消化したｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩに挿入する。これは、上流のＲＢＳから最適に距離をおいてｈｏｌＢ遺伝子を配置する。また、オペロン構築において遺伝子を挿入させることを可能にさせるＲＢＳと配列を、リバース／アンチセンスプライマーによりｈｏｌＢ遺伝子の下流に配置した。このプライマーをｐＡ１−ＰＡ−ｈｏＢと命名して、図６４に模式的に示す。
実施例４９．ＨｏｌＣ（カイ）サブユニットをコードするシュードモナス・エルギノーサのｈｏｌＣの分子クローニング
ｈｏｌＣ（χ）をタグを付加した蛋白質として発現させる。χはＮ末端及びＣ末端の両方のタグを伴って発現させる。また、χをコードする遺伝子ｈｏｌＣを２つの異なるベクターに挿入する。最初に、ｈｏｌＣを、Ｎ末端又はＣ末端タグを含む正常な発現ベクターに入れて操作することにより、これらのベクターから抽出されて広いホストレンジのベクター内に入れることができるようになる。
４９．１．Ｎ末端タグを含むベクターの構築
この最初の方法においては、χがＮ末端タグを付加した蛋白質として発現されるようにデザインした。ここでは、χサブユニットをコードするシュードモナス・エルギノーサのゲノミックＤＮＡ由来のｈｏｌＣ遺伝子を増幅するＰＣＲを記載する。ｈｏｌＣ遺伝子を、次に、ｐＡ１−ＮＢ−ＫｐｎＩプラスミドに挿入した（ｐＡ１−ＮＢ−ＫｐｎＩのポリクローナル領域は図６５に示す）。χサブユニットは１４２のアミノ酸からなる。χをコードする遺伝子はｈｏｌＣであり、そして停止コドンを含めて４２９ヌクレオチドからなる。ｈｏｌＣのヌクレオチド配列は配列番号：９５により表される。コドン＃１及び３（それぞれ、ＭｅｔとＡｒｇをコードする）を二重下線で示し、そしてそれらは大腸菌において使用頻度の低いコドンであり、フォワード／センスプライマーにより高い使用頻度のコドンに変更される。当該変異は、コドン＃１ＧＴＧ＞ＡＴＧ，コドン＃２ＣＧＧ＞ＣＧＣである。第１のベクターにおいては、ｈｏｌＣをコドン＃２から始まるＮ末端タグを付加した蛋白質としてクローン化して、開始コドンを削除する。会のアミノ酸配列は配列番号：９７である。フォワード／センスプライマーは：
である。４塩基の５’クランプ（小文字ｇａｔｃ）が存在し、制限酵素による有効な消化を可能にさせる。クランプにＮｓｉＩ制限部位が続く（大文字、イタリック文字）。このＮｓｉＩ制限部位は上記遺伝子をｐＡ１−ＮＢ−ＫｐｎＩへ挿入するために使用される。次に、コドン＃２及び＃３があるが、ｈｏｌＣのコドン＃２及び＃３には対応しておらず、コドン＃３がＣＧＧからＣＧＣに修飾されるからである。最後の２２ヌクレオチドはｈｏｌＣの１０−３１位に対応し、下線の大文字で示される。リバース／センスプライマーは：
である。４塩基の５’クランプ（小文字ｇｃａｔ）が存在し、制限酵素による有効な消化を可能にさせる。クランプに、ｐＡ１−ＮＢ−ＫｐｎＩへの挿入のためのＳｐｅＩ制限部位が続く（大文字、イタリック文字）。ＳｐｅＩ部位に隣接して、ＳａｃＩ制限部位（これも大文字のイタリック文字）があり、Ｎ−末端タグを付したｈｏｌＣを広いホストレンジのベクターに挿入するための切断及び糊付けの反応（消化及び連結）において使用される。次は、天然の停止コドンに隣接するように第２の非相補停止コドンである（小文字、太字）。最後の２０ヌクレオチド（大文字、下線文字）は、シュードモナス・エルギノーサのｈｏｌＣ遺伝子の３’末端に相補であり、上記２つのプライマーを用いてＰＣＲ増幅された。
ＰＣＲ産物はＮｓｉＩ／ＳｐｅＩにより消化して、ｈｏｌＣ遺伝子を含む断片（約０．５ｋｂ）をｐＡ１−ＮＢ−ＫｐｎＩに挿入した。ｐＡ１−ＮＢ−ＫｐｎＩのポリクローナル領域の中にはＮｓｉＩ部位が存在するが、この部位はｈｏｌＣの挿入のために使用された。代りに、ｐＡ１−ＮＢ−ＫｐｎＩをＰｓｔＩ／ＳｐｅＩで消化した。上記プラスミドの消化されたＰｓｔＩ制限部位及びＰＣＲ産物のＮｓｉＩ部位を共にアニールさせて、両部位が上記反応により破壊されたにも拘わらず連結した。これは、コドン＃２をＮ−末端タグと同じフレームに配置させ、そしてＮ−末端タグを付した蛋白質としてｈｏｌＣが発現されることを可能にした。ＰＣＲ反応においてＰｓｔＩ部位を使用しなかった理由は、ｈｏｌＣ遺伝子中に内部のＰｓｔＩが存在するからである。この連結した蛋白質を図６６に示す。
ＰｓｔＩとＮｓｉＩが共に絡み合う領域を太字の下線で示す。ＰｓｔＩＡ制限部位の配列のＣＴＧＣＡＴの最初の５ヌクレオチドとＮｓｉＩ制限部位のＡＴＧＣＡＴの最後の５ヌクレオチドが絡み合うことにより、ＣＴＧＣＡＴを形成する。これは、ＰｓｔＩとＮｓｉＩ制限部位の両方を破壊した。また、内部のＰｓｔＩ制限部位を配列の最後のラインに示す。このプラスミドをｐＡ１−ＮＢ−ＰＡｈｏｌＣと命名して、模式的な表示を図６７に示す。
上記プラスミドによりＤＨ５α細菌を形質転換して、アンピシリン耐性の陽性単離物からのプラスミドを、０．６及び５．４ｋｂの断片を生じるＮｄｅＩ及びＳａｃＩ制限酵素による消化によりスクリーニングした。挿入物の両鎖の配列をＤＮＡ配列決定により確認した。配列分析は、正確な配列が、挿入された領域中に含まれたことを確証した。
ＲＢＳ、Ｎ−末端タグ及びｈｏｌＣ遺伝子を含む全領域をｐＡ１−ＮＢ−ＰＡｈｏｌＣから抽出した。これは、ｐＡ１−ＮＢ−ＰＡｈｏｌＣをＢａｍＨＩ／ＳａｃＩにより消化することにより達成した。図６５に示した連結領域から、ＢａｍＨＩ部位がＮ−末端領域の上流に観察でき、そしてＰＣＲ反応において、ＳａｃＩがｈｏｌＣのちょうど下流に加えられた。ＲＢＳ、Ｎ−末端タグ及びｈｏｌＣ遺伝子を含む断片（約０．６ｋｂ）を、ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩにり消化した広いホストレンジのベクターｐＵＣＰ１９に挿入した。
ｐＵＣＰ１９に関するポリクローナル領域は、ｐＵＣ１９プラスミドからのポリクローナル領域と同じであり、ｐＵＣＰ１９において反応ＬａｃＺ遺伝子内にある。このプラスミドは、ｐＢＲ３２２の複製起点とシュードモナス・エルギノーサ由来の複製起点を両方含む；これは、大腸菌及びシュードモナス・エルギノーサの両方における複製を可能にさせる。最初のプラスミドはｐＵＣ１９であり、そしてシュードモナス・エルギノーサ由来の複製起点を囲む領域からの１．９ｋｂ断片（２つのシュードモナス・エルギノーサ遺伝子の一部を含んだ）をｐＵＣ１９に挿入することにより、ｐＵＣＰ１９を作成した（Ｗｅｓｔ，Ｓ．Ｅ．Ｈ．，ｅｔａｌ．，（１９９４），Ｇｅｎｅ，１２８，８１−８６）。ポリクローナル領域を図６９に示す。ｐＵＣＰ１９プラスミドを、ｐＡ１−ＮＢ−ＰＡｈｏｌＣを消化するために使用されたのと同じ制限酵素により消化した（ＢａｍＨＩとＳａｃＩ）。ｐＡ１−ＮＢ−ＰＡｈｏｌＣからのＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ断片（０．６ｋｂ）を、消化されたｐＵＣＰ１９に挿入した。これは、ＲＢＳ、Ｎ−末端タグ及びｈｏｌＣ遺伝子をＬａｃＺ遺伝子内にＬａｃＺプロモーター制御下で配置させた。このプラスミド中のｈｏｌＣ遺伝子は極めて低いレベルで発現される必要があるが、天然のｈｏｌＤ遺伝子（Ψ）がシュードモナス・エルギノーサ細胞中では極めて低いレベルで発現されるからである。発現があまりに大きいと、アミノ酸配列決定を行うために発現されたχから十分なΨを分離することが難しくなる。ｐＵＣＰ−ＮＢ−ＰＡｈｏｌＣと命名されたこの新規なプラスミドの模式的な表示を図７０に示す。
上記プラスミドによりＤＨ５α細菌を形質転換して、アンピシリン耐性の陽性単離物からのプラスミドを、０．６及び４．５ｋｂの断片を生じるＢａｍＨＩ及びＳａｃＩ制限酵素による消化によりスクリーニングした。挿入物の両鎖の配列をＤＮＡ配列決定により確認した。配列分析は、正確な配列が、挿入された領域中に含まれたことを確証した。
４９．２．Ｃ末端タグを含むベクターの構築
この実施例は、シュードモナス・エルギノーサのχがＣ−末端タグを付した蛋白質として発現できることを示すような、ベクターのデザインを記載する。χサブユニットをコードするｈｏｌＣ遺伝子を、シュードモナス・エルギノーサのゲノミックＤＮＡからＰＣＲ増幅する。次に、ｈｏｌＣ遺伝子をｐＡ１−ＣＢ−ＮｓｉＩプラスミドに挿入する（ｐＡ１−ＮＢ−ＮｓｉＩのポリクローナル領域を図７１に示す）。ｐＡ１−ＣＢ−ＮｓｉＩへの挿入のためにｈｏｌＣ遺伝子をＰＣＲ増幅するため、フォワード／アンチセンスプラスミドは：
である。４塩基の５’クランプ（小文字ｇｔｃａ）が存在し、制限酵素による有効な消化を可能にさせる。クランプにＸｂａＩ制限部位が続き（大文字、イタリック文字）、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｓｉＩへの挿入のために使用される。ＸｂａＩ制限部位に続くと共に最後のヌクレオチドとオーバーラップするのは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（これも大文字、イタリック文字）であって、Ｃ末端にタグを付したｈｏｌＣをコードする遺伝子をｐＵＣＰ１９プラスミドに挿入するために使用される。次に、ＲＢＳ（大文字、太字）があり、ｈｏｌＣのｐＡ１−ＣＢ−ＮｓｉＩへの挿入により除去されたものを置き換える。３つのヌクレオチドのスペーサー、次にＮｈｅＩ制限部位がＲＢＳに続く。当該スペーサーとＮｈｅＩ制限部位の両者は、ＲＢＳとｈｏｌＣの開始コドンの間に最適な距離を提供するスペーサーとして作用する。次に、ｈｏｌＣ遺伝子の５’末端の最初の３つのコドンがある（大文字、太字）。それらは下線を付されないが、コドン＃１と＃３が大腸菌における使用頻度のために修飾されたからである（コドン＃１はＧＴＧからＡＴＧに変更し、そしてコドン＃３はＣＧＧからＣＧＣに変更し、それぞれＭｅｔとＡｒｇをコードする）。最後の２２ヌクレオチドはｈｏｌＣの１０−３１位に対応し、下線の大文字で示される。リバース／センスプライマーは：
である。４塩基の５’クランプ（小文字ｇａｃｔ）が存在し、制限酵素による有効な消化を可能にさせる。停止コドンは除去されて、終わりから２番目のコドンがＳｐｅＩ制限部位に隣接するようになり、ｈｏｌＣ遺伝子からのオープンリーディングフレームをＣ末端タグ配列内に維持することになる。これは、χタンパク質がＣ末端にタグを付された蛋白質として発現されるのを可能にする。最後の２０ヌクレオチドは、ｈｏｌＣ遺伝子の３’末端に相補であるが、停止コドンまでであって停止コドンを含まない。ＰＣＲ産物はＸｂａＩ／ＳｐｅＩにより消化して（約０．５ｋｂ）、同じ制限酵素により消化されていたｐＡ１−ＣＢ−ＮｓｉＩに挿入した。ｐＡ１−ＣＢ−ＮｓｉＩをＸｂａＩ／ＳｐｅＩにより消化するときは、ＲＢＳとポリクローナル領域を含むＸｂａＩ制限部位とＳｐｅＩの制限部位の間の領域を除去する。フォワード／アンチセンスプライマーは、前で除去されたＲＢＳを、ｈｏｌＣ開始コドンから正確に距離をおいた新規なＲＢＳで置き換える。Ｃ−末端にタグを付した配列は、ＳｐｅＩとＳａｌＩ制限部位の間に位置する。ＳｐｅＩ制限部位と同じリーディングフレームに挿入された遺伝子はＣ末端タグと同じリーディングフレームになる。消化したＰＣＲ産物のｐＡ１−ＣＢ−ＮｓｉＩへの挿入はｐＡ１−ＣＢ−ＰＡｈｏｌＣの形成をもたらし、図７２に模式的に示される。記載されたとおりの正確な配列がＤＮＡ配列決定により確認された。
次の工程において、ＲＢＳ，ｈｏｌＣ遺伝子及びＣ−末端タグ配列を含む全領域をｐＡ１−ＣＢ−ＰＡｈｏｌＣから抽出する。これは、ｐＡ１−ＮＢ−ＰＡｈｏｌＣをＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩにより消化することにより達成した。図６９に示したｐＵＣＰ１９のポリクローナル領域から、ＨｉｎｄＩＩＩ部位がＳａｌＩ制限部位の上流に観察できる。ＲＢＳ，ｈｏｌＣ（約０．６ｋｂ）及びＣ−末端タグ配列を含む断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩにり消化した広いホストレンジのベクターｐＵＣＰ１９に挿入した。このプライマーにおいて、シュードモナス・エルギノーサのｈｏｌＣ遺伝子はＬａｃＺ遺伝子内にあるが、異なるリーディングフレーム中である。これはｐＵＣＰ−ＣＢ−ＰＡｈｏｌＣをもたらし、図７３において模式的に示される。ｈｏｌＣ遺伝子はそれ自身のＲＢＳを有することになるから、特定のパーセンテージのこの蛋白質が発現され、そしてＬａｃＺ遺伝子がｈｏｌＣ遺伝子の開始をリードスルーするなら、数コドン下流で停止することになる。これは、ｐＵＣＰ１９−ＣＢ−ＰＡｈｏｌＣとｐＵＣＰ１９−ＮＢ−ＰＡｈｏｌＣの両者に関して真実である。ｈｏｌＤ（Ψ）の同一性が知られたなら、ｈｏｌＣ／ｈｏｌＤオペロンが製造されて、次に、ｐＡ１−ＰＡ−ＢＡＸと連結されることにより、クランプ負荷オペロンが作成される。
オペロンクローニング
実施例５０．ｈｏｌＢとｈｏｌＡの両者を含む２遺伝子オペロンの構築
δ’（ｈｏｌＢ）とδ（ｈｏｌＡ）の両方を含む仮のオペロンを、ｐＡ１−ＰＡ−ｈｏｌＡ中のｈｏｌＡ遺伝子を、ｐＡ１−ＰＡ−ｈｏｌＢの中のｈｏｌＢ遺伝子の後ろに（下流に）挿入することにより、構築する。これは、ｐＡ１−ＰＡ−ｈｏｌＢとｐＡ１−ＰＡ−ｈｏｌＡの両方をＮｈｅＩ／ＳｐｅＩにより消化することにより達成される。ｈｏｌＡを含むｐＡ１−ＰＡ−ｈｏｌＡからの断片（約１ｋｂ）を、次に、消化されたｐＡ１−ＰＡ−ｈｏｌＢに挿入する。これは、ｈｏｌＢの下流にｈｏｌＡ遺伝子を配置し、そしてｈｏｌＢの下流に以前に置かれたＲＢＳの下流に最適に配置された。これは、リバース／アンチセンスプライマーにより創製されたＲＢＳを、ｈｏｌＡ遺伝子の下流のｐＡ１−ＰＡ−ｈｏｌＡの構築において、及びオペロン構築において別の下流の遺伝子の付加のための位置に配置させる。この２遺伝子オペロンをｐＡ１−ＰＡ−ｈｏｌＢＡと命名して、図７４に示す。
実施例５１．ｈｏｌＢ、ｈｏｌＡ及びｄｎａＸを含む３遺伝子オペロンの構築
δ’、δ及びＤｎａＸ（τ）をコードする遺伝子を含むオペロンを構築するため、ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＸ及びｐＡ１−ＰＡ−ｈｏｌＢＡの両方をＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｅＩ制限酵素により消化する。ｄｎａＸ遺伝子を含むｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＸの断片（約２ｋｂ）を、消化下ｐＡ１−ＰＡ−ｈｏｌＢＡプライマーに挿入することにより、図７７に示すｐＡ１−ＰＡ−ＢＡＸを生成する。これは、ｈｏｌＡ遺伝子の下流にシュードモナス・エルギノーサのｄｎａＸ遺伝子を配置し、そしてｐＡ１−ＰＡ−ｈｏｌＡの構築においてｈｏｌＡ遺伝子の下流に配置されたＲＢＳの下流に最適に距離をおく。これは、δ’、δ及びＤｎａＸ（τ）が全て３遺伝子オペロンとして発現されることを可能にさせる。この３遺伝子オペロンはｈｏｌＣ／ｈｏｌＤオペロンの下流に結果として位置する。しかしながら、このオペロン中の３つの遺伝子全てはそれら各々のＲＢＳから全てが最適に距離をおくように発現する。
実施例５２．シュードモナス・エルギノーサのＤｎａＸ（τ），ＨｏｌＡ（δ）及びＨｏｌＢ（δ’）蛋白質の精製
シュードモナス・エルギノーサのＤｎａＸ（τ），ＨｏｌＡ（δ）及びＨｏｌＢ（δ’）蛋白質を、それらの精製を監視するための再構成アッセイを用いて精製する。複雑であるが、これらの手法は平凡であり、大腸菌、サーマス・サーモフィルス及びストレプトコッカス・ピオゲネスのＤＮＡ複製の研究において使用される。日常的には、余分のクマジー染色バンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥに際して観察できるように、十分なレベルの発現を得ることができる。これがこれらの研究において実現されないなら、発現は、大腸菌サブユニットに対するモノクローナル抗体を用いて証明されるかもしれない。過去においては、より進化上離れた生物のホロ酵素に対する選択された抗体を用いて、顕著な交差反応性が観察されてきた。ＤｎａＸ、δ、δ’サブユニットの過剰生産者（overproducers）が手元にあるなら、細胞を溶解し、硫酸アンモニウム沈殿物を最適量の硫酸アンモニウムを用いて生成することにより、調べるサブユニットの沈殿を保証する。再溶解して、透析し、沈殿物を用いてシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素を再構成させることにより、個々のサブユニットの精製を指示する定量性の機能アッセイの基礎を提供する。
アッセイに関しては、短いＤＮＡプライマーを一本鎖Ｍ１３鋳型にアニールさせ、そしてｄＮＴＰｓ，ＡＴＰ，Ｍｇ＋＋，シュードモナス・エルギノーサのα（ＤｎａＥ）及びシュードモナス・エルギノーサのＤｎａＸ，ＨｏｌＡ及びＨｏｌＢを過剰生産する細胞由来のレベルを変更した硫酸アンモニウムカットを加える。このアッセイは本質的には図１に記載されたのと同じであるが、但し、ＤＮＡプライマーが提供され、最初のＤｎａＧプライマーゼ触媒プライミング工程に関する要求を回避する。再構成が達成されたなら、飽和レベルの各蛋白質又は抽出物が測定される。これが達成されたなら、シュードモナス・エルギノーサのＨｏｌＡ，ＨｏｌＢ及びＤｎａＸに関してアッセイを所有することになる。
各活性を沈殿させる最少の硫酸アンモニウム濃度を次に個別に測定する。上記アッセイにおいて粗精製ＨｏｌＡ及びＨｏｌＢを用いて、ＤｎａＸの精製を次に行う。これまで試験された全てのＤｎａＸ蛋白質によれば、カチオン交換クロマトグラフィーが高い精製度の蛋白質を生じさせる。高い精製度のＤｎａＸを生じさせる特定の条件を測定する。もし必要であれば、ほぼ均質な蛋白質を生じさせるために、追加のクロマトグラフィー工程が開発される。高い精製度のＤｎａＸが手元にあれば、それを、精製されたＤｎａＥ及びＤｎａＮ及び粗精製ＨｏｌＡと共に添加することにより、ＨｏｌＢの精製を指示するアッセイが提供される。
ＨｏｌＢは、大腸菌のＨｏｌＢ（δ’）及びサーマス・サーモフィルスのＨｏｌＢ（Ｂｕｌｌａｒｄ，ｅｔ ａｌ．同じ箇所）に関しての精製法をモデルにして精製される。このサイクルが完了したら、精製されたＤｎａＥ，ＤｎａＮ，ＤｎａＸ及びＨｏｌＢを用いて、ＨｏｌＡのためのアッセイが提供される。ＨｏｌＡは、高い精製度になるまで他の蛋白質に関して記載された論理を用いて精製される。
追加の因子が必要な場合のバックアップアプローチ。このアプローチは、多様な細菌（大腸菌、サーマス・サーモフィルス及びストレプトコッカス・ピオゲネス）並びにバクテリオファージＴ４及びヒト及び酵母に関して適用されて成功した。即ち、上記アプローチが成功する可能性は高い。しかしながら、３つの発現された蛋白質の結合（combination）が不成功ならば、抽出物をシュードモナス・エルギノーサ（好ましくは非病原性株）から調製することができ、変更された硫酸アンモニウムカットをアッセイに添加することにより、活性及びその結果の刺激された刺激活性を得ることができる。最初の細菌の複製システムが確立されなかった場合、このアプローチは、何れの蛋白質成分の過剰発現の前にも、細菌の複製因子の全てを分離して（resolving）、溶解及び再構成のアプローチによりそれら各々を精製することにおいて機能した（Ｓｃｈｅｋｍａｎ，Ｒ．，Ｗｅｉｎｅｒ，Ａ．ａｎｄＫｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．（１９７４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １８６，９８７−９９３）。それらの固有の活性を用いてそれらを監視するために開発されたそれらの精製法により何らかの新規な因子が得られたなら、質量分光測定法によるり容易に同定されるか又は配列決定されたシュードモナス・エルギノーサによりコードされた蛋白質との比較により容易に配列決定され得る。同定された遺伝子が発現されて、シュードモナス・エルギノーサの抽出物から開発されたアプローチを用いて対応する蛋白質が精製される。何らかの理由により、大腸菌において発現されたように最初は不活性であったなら、このアプローチは求める蛋白質の一つを生じさせることができた。他のアプローチ、例えば、安定化させる結合パートナーとも同時発現又はシュードモナス・エルギノーサ内での発現が有用かもしれない。
別のアプローチ：ＤｎａＸ、ＨｏｌＡ及びＨｏｌＢの同時発現。３つの蛋白質（ＤｎａＸ、ＨｏｌＡ及びＨｏｌＢ）全てを別々に発現することを含む初期のアプローチが存在したが、それがもっとも信頼できると考えられるからであるが、当該初期のアプローチと併行して「ショートカット」も意図される。大腸菌においては、ＤｎａＸ、ＨｏｌＡ及びＨｏｌＢは相乗的に相互作用して、単離可能な複合体を形成する。大腸菌のＤｎａＸの遺伝子複合体は同時発現することができ、そして全ての蛋白質の複合体を単一精製にて単離することができる。シュードモナス・エルギノーサのＤｎａＸ、ＨｏｌＡ及びＨｏｌＢは人工のオペロン中で結合されて、一つの完全なものとして精製できる単離可能な複合体が形成されるか否かが決定される。精製は、ちょうど大腸菌システムにおけるように、ＤｎａＥ及びＤｎａＮによる再構成アッセイにより監視される（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ，Ａ．，Ｄａｌｌｍａｎｎ，Ｇ．，Ｇｌｏｖｅｒ，Ｂ．，ａｎｄＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．（２０００）ＥＭＢＯ Ｊ １９，６５３６−６５４５；Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ，Ａ．Ｅ．，Ｄａｌｌｍａｎｎ，Ｈ．Ｇ．，ａｎｄ ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．（１９９６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈ１０２９１−１０２９８）。もし成功するなら、このアプローチは、精製されたシュードモナス・エルギノーサのレプリカーゼの再構成を、精製された蛋白質を用いて、進行及び促進させることを大きくはかどらせるはずである。
アクセサリー蛋白質
実施例５３．ＤｎａＧ（プライマーゼ）をコードするシュードモナス・エルギノーサのｄｎａＧの分子クローニング
この実施例は、ＤｎａＧプライマーゼをコードするｄｎａＧ遺伝子をシュードモナス・エルギノーサのゲノミックＤＮＡからＰＣＲ増幅することを記載する。ｄｎａＧ遺伝子は、次に、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩプラスミド（ｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩのポリクローナル領域を図３１に示す）に挿入される。ｄｎａＧ遺伝子は大腸菌における発現に関して低い使用頻度のコドンを５’に何も有さない。ＤｎａＧプライマーゼは６６４アミノ酸からなる。ＤｎａＧプライマーゼをコードする遺伝子はｄｎａＧであり、停止コドンを含めて１９９５ヌクレオチドからなる。ｄｎａＧのヌクレオチド配列は（配列番号：１０２）により表される。ＤｎａＧのアミノ酸配列は、配列番号：１０４により表される。ｄｎａＧ遺伝子を増幅するため、フォワード／センスプライマーは：
である。制限酵素による有効な消化を可能にさせる４ヌクレオチドの５’クランプ（小文字ｇａｃｔ）が存在する。クランプに、ＮｄｅＩ制限部位（大文字、イタリック文字）が続き、ＲＢＳからの最適な距離をおいてｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩへの挿入を可能にさせる。ＮｄｅＩ制限部位はｄｎａＧ遺伝子の「ａｔｇ」開始コドンとオーバーラップする。次の１９ヌクレオチドはｄｎａＧ遺伝子の５’末端の４−２２位に相当し、大文字に下線で示される。リバース／アンチセンスプライマーは：
である。制限酵素による有効な消化を可能にさせる４ヌクレオチドの５’クランプ（小文字ｇａｃｔ）が存在する。クランプに、ＳｐｅＩ制限部位（大文字、イタリック文字）が続き、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩへの挿入を可能にさせる。次に、第２の非相補の停止コドンがあり、天然の停止コドンに隣接する。最後の２２ヌクレオチドはｄｎａＧ遺伝子の３’末端に相補であり、大文字に下線で示される。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩ／ＳｐｅＩ制限酵素により消化する。ｄｎａＧ遺伝子（２．０ｋｂ）を含む断片を同じ２つの制限酵素により消化してあったｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩに挿入する。これはｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＧをもたらし、完全長のシュードモナス・エルギノーサのｄｎａＧを含み、そして天然蛋白質として発現される。ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＧを図７５において模式的に示す。
実施例５４．ＳＳＢをコードする遺伝子であるシュードモナス・エルギノーサのｓｓｂの分子クローニング
この実施例は、ＳＳＢプライマーゼをコードするｓｓｂ遺伝子をシュードモナス・エルギノーサのゲノミックＤＮＡからＰＣＲ増幅することを記載する。ｄｎａＧ遺伝子は、次に、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩプラスミド（ｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩのポリクローナル領域を図３１に示す）に挿入される。ｓｓｂ遺伝子は大腸菌における発現に関して低い使用頻度のコドンを５’に何も有さない。ＳＳＢ蛋白質は１６５アミノ酸からなる。ＳＳＢ蛋白質をコードする遺伝子はｓｓｂであり、停止コドンを含めて４９８ヌクレオチドからなる。ｓｓｂのヌクレオチド配列は配列番号：１０７により表される。ＳＳＢのアミノ酸配列は、配列番号：１０９により表される。ｓｓｂ遺伝子を増幅するため、フォワード／センスプライマーは：
である。制限酵素による有効な消化を可能にさせる４ヌクレオチドの５’クランプ（小文字ｇａｔｃ）が存在する。クランプに、ＮｃｏＩ制限部位（大文字、イタリック文字）が続き、ＲＢＳからの最適な距離をおいてｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩへの挿入を可能にさせる。ＮｃｏＩ制限部位はｓｓｂ遺伝子の５’末端の最初の４ヌクレオチドとオーバーラップする。次の１７ヌクレオチドはｓｓｂ遺伝子の５’末端の５−２１位に相当する。ｓｓｂ遺伝子の５’末端に相当する全ヌクレオチドを大文字の下線で示す。リバース／アンチセンスプライマーは：
である。制限酵素による有効な消化を可能にさせる４ヌクレオチドの５’クランプ（小文字ｇａｃｔ）が存在する。クランプに、ＳｐｅＩ制限部位（大文字、イタリック文字）が続き、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩへの挿入を可能にさせる。次に、第２の非相補の停止コドンがあり、天然の停止コドンに隣接する（小文字、太字）。最後の２４ヌクレオチドはｓｓｂ遺伝子の３’末端に相補である。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ制限酵素により消化する。ｓｓｂ遺伝子（０．５ｋｂ）を含む断片を同じ２つの制限酵素により消化してあったｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩに挿入する。これはｐＡ１−ＰＡ−ｓｓｂをもたらし、完全長のシュードモナス・エルギノーサのｓｓｂを含み、そして天然蛋白質として発現される。ｐＡ１−ＰＡ−ｓｓｂを図７６において模式的に示す。
再構成
実施例５５．α、β、ＤｎａＸ、δ及びδ’サブユニットからなるシュードモナス・エルギノーサ由来の最少ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素の再構成及びアッセイの複製乗法標的スクリーニング（商標）への適合
シュードモナス・エルギノーサのレプリカーゼの必須のサブユニットの最少集合体は、ＤＮＡの迅速かつプロセッシブな合成を許容する。これまで研究された全ての細菌のレプリカーゼにおいて、最少の機能性ホロ酵素は３つの成分：１）ポリメラーゼコア、２）クランプ付加集合体、及び３）スライディングクランププロセッシビティー因子からなる。大腸菌において、最少ホロ酵素は、αサブユニット、ＤｎａＸ−δδ’クランプ付加複合体及びβサブユニットからなる。同じ成分が、グラム陽性のストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｂｒｕｃｋ＆ Ｄｏｎｎｅｌｌ、同じ箇所）及びサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｂｕｌｌａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，同じ箇所）の機能性ＤｎａＸＰｏｌ ＩＩＩホロ酵素に最小限必要である。距離的に関連する生物間のこの要求の一般性を仮定すれば、シュードモナス・エルギノーサのα、β、ＤｎａＸ、δ及びδ’が最小限必要な蛋白質のみであろうことが予測される。ＤｎａＸ複合体に関して存在するバックアップアプローチは、それらが最小限必要とされるありそうもない事象において、追加の蛋白質を提供するのに利用され得る。
再構成アプローチにより精製された必須のシュードモナス・エルギノーサのＤｎａＸポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットの利用可能性により、蛍光に基づいた複製乗法標的スクリーニング（商標）アッセイが、提供された新規な標的に対する高処理量スクリーニングを可能にさせるように適合される。これは、標的による「ヒット」との相互作用に際して阻害が観察されるようにかろうじて制限するまで、各成分を滴定することにより行われる。バッファーの条件は、マルチプレートスクリーニングプロセスの間に、別の冷蔵コンテナーに保存された酵素混合物の安定性を保証するように最適化もされる。アッセイの時間と温度は安定な直線応答を保証するように再度最適化される。最初のアッセイに関しては、ＤＮＡプライマーをＭ１３サークルにアニールさせ、最初の酵素触媒によるプライミング工程に関する要求を回避する（図１）。この達成は、より完全なシュードモナス・エルギノーサ複製システムを集合させること可能性を確立し、そしてシュードモナス・エルギノーサの複製ポリメラーゼの阻害剤を同定するための高処理量のフォーマットにおいて小分子のライブラリー（コンビナトリアルケミストリーライブラリーのいくつかの供給者から得た）をスクリーニングする基礎を提供する。
実施例５６．シュードモナス・エルギノーサの完全複製システム
（ｉ）ＤｎａＱ（ＤｎａＥと結合していると予測される３’→５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ）、（ｉｉ）ＨｏｌＣ（Ψサブユニット）、ＨｏｌＤ（χサブユニット）及びＳＳＢ（ホロ酵素のＤＮＡに対する追加の物理的及び機能的リンクを提供し、複製を、特に生理学上のイオン強度において促進させ）（図７、８）、（ｉｉｉ）Ｍ１３ＧｏｒｉのＧ４起点を直接認識してプライマーを合成するかもしれないＤｎａＧプライマーゼ（図８）及び（ｉｖ）ＤｎａＢレプリカーゼ（大腸菌に対する類似性によれば、ＤｎａＧがＧ４起点を直接認識できないならば、ＤｎａＢが、一本鎖ＤＮＡを認識し、ＤｎａＧプライマーゼと相互作用し、そして「バックアップ」アプローチを提供するプライマー合成を可能にするべきである）（図８）をさらに発現させて精製することにより、シュードモナス・エルギノーサ由来の、より完全な複製システムを提供することが可能になる。
この点において、小分子のライブラリーコンビナトリアルケミストリーライブラリーのいくつかの供給者から得た）が、シュードモナス・エルギノーサの複製ポリメラーゼの阻害剤を同定するための高処理量フォーマットにおいてスクリーニングされる。手元にある複数の病原体由来の複製システムにより、狭い範囲及び広い範囲両方の抗細菌剤を同定する方法は、複数の生物からの複製システムに対して平行なスクリーニングを設定することを含むことになる。重要なのは、複製システムが抗細菌薬剤のための新規な標的を表すため、耐性の機構がまだ存在しない。
図１は、Ｍ１３Ｇｏｒｉ ＤＮＡの複製における段階を示す。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のために使用された標準アッセイは、一本鎖Ｍ１３ＧｏｒｉＤＮＡの二本鎖形態への変換である。日常的な実験室のアッセイにおいては、放射性標識ヌクレオチドの酸沈殿ＤＮＡへの取り込みを監視する。本明細書にて使用された高処理量のアッセイにおいては、上記アッセイをＥＤＴＡ−含有Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ（登録商標）により静まらせる。Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎの蛍光は、二本鎖ＤＮＡに結合した場合、合成されたＤＮＡの定量を許容する。プライミング工程：Ｍ１３のＤＮＡ中にクローン化されたＧ４起点はＳＳＢ存在下で大腸菌のＤｎａＧプライマーゼにより特異的に認識されて、短いＲＮＡプライマーの精製を許容する。開始複合体形成工程：ホロ酵素がプライマーを認識して、ＡＴＰ−依存性開始複合体を形成する。ＤｎａＸＡＴＰａｓｅは、反応のこの工程にてＤＮＡ上にβプロセッシビティー因子を移動させるために働く。伸長工程：４つ全てのｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）の開始複合体への添加と同時に、ホロ酵素レプリカーゼが解離なしに全サークルを複製する。 図２は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素の構造上の特徴を示す。 図３−１は、大腸菌（配列番号：１３９）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（配列番号：１４０）、シュードモナス・エルギノーサ（配列番号：７２）、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ（配列番号：１４１）及びエルシニア・ペスティス（配列番号：３）のＤｎａＥのアミノ酸配列のアラインメントを示す。同一の残基は黒で強調して、類似の残基はグレーで強調する。 図３−２は、図３−１の続きである。 図４は、大腸菌（配列番号：１４２）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（配列番号：１４３）、シュードモナス・エルギノーサ（配列番号：１１４）、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ（配列番号：１４４）及びエルシニア・ペスティス（配列番号：２０）のＤｎａＮのアミノ酸配列のアラインメントを示す。同一の残基は黒で強調して、類似の残基はグレーで強調する。 図５−１は、大腸菌（配列番号：１４５）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（配列番号：１４６）、シュードモナス・エルギノーサ（配列番号：８２）、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ（配列番号：１４７）及びエルシニア・ペスティス（配列番号：２５）のＤｎａＸのアミノ酸配列のアラインメントを示す。同一の残基は黒で強調して、類似の残基はグレーで強調する。 図５−２は、図５−１の続きである。 図６−１は、大腸菌（配列番号：１４８、配列番号：１５１）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（配列番号：１４９、配列番号：１５２）、シュードモナス・エルギノーサ（配列番号：８７、配列番号：９２）、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ（配列番号：１５０、配列番号：１５３）及びエルシニア・ペスティス（配列番号：３５、配列番号：４０）のＨｏｌＡ（上部パネル）及びＨｏｌＢ（下部パネル）のアミノ酸配列のアラインメントを示す。同一の残基は黒で強調して、類似の残基はグレーで強調する。 図６−２は、図６−１の続きである。 図７−１は、大腸菌（配列番号：１５４、配列番号：１５５、配列番号：１５６）及びエルシニア・ペスティス（配列番号：４５、配列番号：５０、配列番号：１０、配列番号：１５）のＨｏｌＣ（カイ），ＨｏｌＤ（プサイ），ＤｎａＱ（イプシロン）及びＨｏｌＥ（シータ）のアミノ酸配列のアラインメントを示す。同一の残基は黒で強調して、類似の残基はグレーで強調する。 図７−２は、図７−１の続きである。 図８Ａは、大腸菌（配列番号：１５７、配列番号：１５８、配列番号：１５９）及びエルシニア・ペスティス（配列番号：５５、配列番号：６０）のＳＳＢ，ＤｎａＢ及びＤｎａＧのアミノ酸配列のアラインメントを示す。同一の残基は黒で強調して、類似の残基はグレーで強調する。 図８Ｂは、大腸菌（配列番号：１５７、配列番号：１５８、配列番号：１５９）及びエルシニア・ペスティス（配列番号：５５、配列番号：６０）のＳＳＢ，ＤｎａＢ及びＤｎａＧのアミノ酸配列のアラインメントを示す。同一の残基は黒で強調して、類似の残基はグレーで強調する。 図８Ｃは、大腸菌（配列番号：１５７、配列番号：１５８、配列番号：１５９）及びエルシニア・ペスティス（配列番号：５５、配列番号：６０）のＳＳＢ，ＤｎａＢ及びＤｎａＧのアミノ酸配列のアラインメントを示す。同一の残基は黒で強調して、類似の残基はグレーで強調する。 図９は、ポリクローナル領域を包含するプラスミドｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩの領域を示す（配列番号：１２１及び配列番号：１２２）。 図１０は、ポリクローナル領域を包含するプラスミドｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩの領域を示す（配列番号：１２３及び配列番号：１２４）。 図１１は、ｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＥ５’の概要の描写を示す。 図１２は、ｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＥの概要の描写を示す。 図１３は、ｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＱの概要の描写を示す。 図１４は、ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＥの概要の描写を示す。 図１５は、ｐＡ１−ＹＰ−ＱＥの概要の描写を示す。 図１６は、ｐＡ１−ＹＰ−コアの概要の描写を示す。 図１７は、エルシニア・ペスティスのｐｏｌ ＩＩＩコアサブユニットの発現を、ＩＰＴＧ誘導後の生育時間の函数として示す。 図１８は、最大量のエルシニア・ペスティスコアを得るための任意の硫酸アンモニウム沈殿の条件の測定を示す。 図１９は、最大量の活性を得るための最適な硫酸アンモニウム沈殿の条件の測定に関する結果の概要を示す。 図２０は、大腸菌のτ及び大腸菌のβと組み合わせた場合にエルシニア・ペスティスが活性か否かを測定する再構成アッセイにおける活性対成分混合物を示す。 図２１は、エルシニア・ペスティスコアの精製における各工程のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析の概要を示す。 図２２は、ｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＮの概要の描写を示す。 図２３は、ＩＰＴＧ誘導後の生育時間の函数としてのエルシニア・ペスティスのβサブユニットの発現のゲルを示す。 図２４は、エルシニア・ペスティスのβサブユニットの最適な硫酸アンモニウム沈殿の条件の測定に関する、活性対硫酸アンモニウムのパーセントの結果を示す。 図２５は、エルシニア・ペスティスのβの精製の概要のゲルを示す。 図２６は、大腸菌のｐｏｌ ＩＩＩコアとτ複合体を含むアッセイ混合物中のエルシニア・ペスティスβサブユニットの滴定におけるＤＮＡ合成対エルシニア・ペスティス βを示す。 図２７は、大腸菌のｐｏｌ ＩＩＩコアとτ複合体を含むアッセイ混合物中の活性対硫酸アンモニウムパーセントを示し、そしてエルシニア・ペスティスのβが高濃度の硫酸アンモニウムにおいてもっとも有効に溶液から浸出することを示す。 図２８は、ｐＡ１−ＹＰ−ＤｎａＸの概要の描写を示す。 図２９は、ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＡの概要の描写を示す。 図３０は、ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＢの概要の描写を示す。 図３１は、ポリクローナル領域を包含するプラスミドｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩの領域を示す。 図３２は、ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＣの概要の描写を示す。 図３３は、ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＤの概要の描写を示す。 図３４は、ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＣＤの概要の描写を示す。 図３５は、ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＢＡの概要の描写を示す。 図３６は、ｐＡ１−ＹＰ−ｈｏｌＢＡＸの概要の描写を示す。 図３７は、ｐＡ１−ＹＰ−ＣＬ複合体の概要の描写を示す。 図３８は、エルシニア・ペスティスのτ複合体の発現を、ＩＰＴＧ誘導後の生育時間の函数として示す。 図３９は、エルシニア・ペスティスのτ複合体に関する蛋白質濃度対硫酸アンモニウム濃度を示す。 図４０は、エルシニア・ペスティスのτ複合体の各硫酸アンモニウムカットに関する再構成アッセイにおける活性の全量を示す。 図４１は、エルシニア・ペスティスのτ複合体の精製のＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析の結果を示す。 図４２Ａ−Ｃは、β２、コア及びτ複合体に関して最大の活性を有するように測定された濃度を測定するための実験の結果を示す。 図４３は、ｐＡ１−ＹＰ−ｓｓｂの概要の描写を示す。 図４４は、ｐＡ１−ＹＰ−ｓｓｂを含む大腸菌に関してＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析された生育最適化を示す。 図４５は、最大量のエルシニア・ペスティスのＳＳＢを得るための最適な硫酸アンモニウムの沈殿条件の結果を示す。 図４６は、エルシニア・ペスティスのＳＳＢの硫酸アンモニウム最適化実験からのＦｒＩＩｓのＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析の結果を示す。 図４７は、ｓｓｂに関する各精製工程のためのプールされた蛋白質のゲルの概要を示す。 図４８は、エルシニア・ペスティスのＤｎａＧの生育最適化を示す。 図４９は、異なる濃度の硫酸アンモニウムの中で沈殿させた蛋白質からもたらされたＦｒＩＩサンプルのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析を示す。 図５０は、ｐＡ１−ＹＰ−ｄｎａＧの概要の描写を示す。 図５１は、エルシニア・ペスティスのＤｎａＧの活性分析及び硫酸アンモニウム最適化を示す。 図５２は、再構成アッセイにおけるエルシニア・ペスティスのＤｎａＧのＦｒ ＩＩ調製物と、内在性大腸菌ＤｎａＧの寄与を測定するための大腸菌内在性蛋白質のみを含むＦｒ ＩＩ調製物の比較を示す。 図５３は、ＤｎａＧの各精製工程に関するプールされた蛋白質のゲルの概要を示す。 図５４は、ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＥ＃１−５’の概要の描写を示す。 図５５は、ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＥ＃１の概要の描写を示す。 図５６は、ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＥ＃２−５’の概要の描写を示す。 図５７は、ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＥ＃２の概要の描写を示す。 図５８は、ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＱの概要の描写を示す。 図５９は、ｐＡ１−ＰＡ−コア＃１の概要の描写を示す。 図６０は、ｐＡ１−ＰＡ−コア＃２の概要の描写を示す。 図６１は、ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＮの概要の描写を示す。 図６２は、ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＸの概要の描写を示す。 図６１は、ｐＡ１−ＰＡ−ｈｏｌＡの概要の描写を示す。 図６４は、ｐＡ１−ＰＡ−ｈｏｌＢの概要の描写を示す。 図６５は、ポリクローナル領域を包含するプラスミドｐＡ１−ＮＢ−ＫｐｎＩの領域を示す（配列番号：１３７及び配列番号：１３８）。 図６６は、ｈｏｌＣ ＰＣＲ産物が挿入された後のプラスミドｐＡ１−ＮＢ−ＫｐｎＩの領域を示す（配列番号：１３１、配列番号：１３２、配列番号：１３３）。 図６７は、ｐＡ１−ＮＢ−ＰＡｈｏｌＣの概要の描写を示す。 図６８は、ＰＵＣＰ１９−Ｒｅの概要の描写を示す。 図６９は、ポリクローナル領域を包含するプラスミドｐＵＣＰ１９の領域を示す（配列番号：１２５及び配列番号：１２６）。 図７０は、ｐＵＣＰ１９−ＮＢ−ＰＡｈｏｌＣの概要の描写を示す。 図７１は、ポリクローナル領域を包含するプラスミドｐＡ１−ＣＢ−ＮｓｉＩの領域を示す（配列番号：１２７及び配列番号：１２８）。 図７２は、ｐＡ１−ＣＢ−ＰＡｈｏｌＣの概要の描写を示す。 図７３は、ｐＵＣＰ１９−ＣＢ−ＰＡｈｏｌＣの概要の描写を示す。 図７４は、ｐＡ１−ＰＡ−ｈｏｌＢＡの概要の描写を示す。 図７５は、ｐＡ１−ＰＡ−ｄｎａＧの概要の描写を示す。 図７６は、ｐＡ１−ＰＡ−ｓｓｂの概要の描写を示す。 図７７は、ｐＡ１−ＰＡ−ＢＡＸの概要の描写を示す。 図７８は、修飾された再構成アッセイにおけるＤｎａＧの活性を示す。

Claims (12)

  1. ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調させる化合物をスクリーニングする方法であって、
    ａ）レプリカーゼ活性に関して許容する条件下で少なくとも一つの試験化合物に単離されたレプリカーゼを接触させ；
    ｂ）試験化合物の存在下でレプリカーゼの活性を評価し；そして
    ｃ）試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性を試験化合物の不在下でのレプリカーゼの活性と比較するが、その際、試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性における変化が、レプリカーゼの活性を変調させる化合物の指標であり、
    レプリカーゼが単離されたシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質である、方法。
  2. ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調する化合物を同定する方法であって、
    ａ）ＤＮＡ分子、ＤＮＡポリメラーゼαサブユニット、候補化合物、ｄＮＴＰｓの混合物、及び任意に、βサブユニット、τ複合体、及びβサブユニットとτサブユニットの両方の複合体からなる群から選択されるメンバーを含む反応混合物を形成することによりレプリカーゼを形成させ；
    ｂ）候補化合物の不在下で核酸の重合を達成するのに有効な条件に反応混合物を供し；
    ｃ）試験化合物存在下でのレプリカーゼの活性を試験化合物不在下でのレプリカーゼの活性を比較するが、その際、試験化合物存在下でのレプリカーゼの活性の変化がレプリカーゼの活性を変調する化合物の指標であり、
    但し、上記レプリカーゼは単離されたシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質を含む、方法。
  3. ＤＮＡポリメラーゼレプリカーゼを刺激することにおいてＤｎａＸ複合体とβサブユニットの活性を変調させる化合物を同定する方法であって、
    ａ）プライムされたＤＮＡ（ＳＳＢでコートされていてよい）を、ＤＮＡポリメラーゼレプリカーゼ、βサブユニット、及びＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）と、候補薬剤、及びｄＮＴＰｓ（又は修飾されたｄＮＴＰｓ）の存在下で接触させることにより、反応混合物を形成させ；
    ｂ）上記反応混合物を、候補薬剤の不在下で、核酸重合を達成するのに有効な条件に供し；そして
    ｃ）試験化合物の存在下での核酸の重合を試験化合物の不在下での核酸の重合と比較し、その際、試験化合物存在下での核酸重合の変化がＤｎａＸ複合体とβサブユニットの活性を変調する化合物の指標であり、但し、ＤｎａＸ複合体とβサブユニットはシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質を含む、方法。
  4. βサブユニットとＤｎａＸ複合体が相互作用能力を変調させる化合物を同定する方法であって、
    ａ）βサブユニットを、及びＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）と上記化合物の存在下で接触させることにより、反応混合物を形成させ；
    ｂ）ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）とβサブユニットがと上記化合物の不在下で相互作用する条件に、上記反応混合物を供し；そして
    ｃ）試験化合物の存在下での相互作用の程度と試験化合物の不在下での相互作用の程度を比較し、その際、βサブユニットとＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）の間の相互作用の変化が相互作用を変調する化合物の指標であり、
    但し、ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）はシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質を含む、方法。
  5. ＤＮＡ分子上でＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）がβサブユニットと集合する能力を変調させる化合物を同定する方法であって、
    ａ）環状のプライムされたＤＮＡ（ＳＳＢでコートされていてよい）を、ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）及びβサブユニットと、上記化合物、及びＡＴＰ及又はｄＡＴＰの存在下で接触させることにより、反応混合物を形成させ；
    ｂ）上記反応混合物を、ＤｎａＸ複合体（又は亜集合体）が上記化合物の不在下でＤｎａＸ分子上でべサブユニットと集合する条件に供し；そして
    ｃ）試験化合物の存在下での集合の程度を試験化合物の不在下での集合の程度と比較し、その際、ＤｎａＸ分子上のβサブユニットの量の変化が、ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）がβサブユニットとＤＮＡ分子上で集合する能力を変調する化合物の指標であり、
    但し、ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）はシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質を含む、方法。
  6. ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）がβサブユニットをＤＮＡ分子から解離する能力を変調させる化合物を同定する方法であって、
    ａ）βサブユニットが集合していたＤＮＡ分子を、上記化合物の存在下で接触させることにより、反応混合物を形成させ；
    ｂ）上記反応混合物を、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）が上記化合物の不在下でＤＮＡ分子からβサブユニットを解離する条件に供し；そして
    ｃ）試験化合物の存在下での集合の程度を試験化合物の不在下での集合の程度と比較し、その際、ＤｎａＸ分子上のβサブユニットの量の変化が、ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）がβサブユニットをＤＮＡ分子から解離する能力を変調する化合物の指標であり、
    但し、ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体の亜集合体）はシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質を含む、方法。
  7. ＤｎａＸ複合体又はＤｎａＸ複合体サブユニット（例えば、τサブユニット）のｄＡＴＰ／ＡＴＰ結合活性を変調させる化合物を同定する方法であって、
    ａ）ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット）を、ｄＡＴＰ／ＡＴＰと、ＤｎａＸ分子の存在又は不在下及び／又は上記化合物の存在下で接触させることにより、反応混合物を形成させ；
    ｂ）上記反応混合物を、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）がｄＡＴＰ／ＡＴＰと上記化合物の不在下で相互作用する条件に供し；そして
    ｃ）試験化合物の存在下での結合の程度を試験化合物の不在下での結合の程度と比較し、その際、ｄＡＴＰ／ＡＴＰ結合の変化が、ＤｎａＸ複合体又はＤｎａＸ複合体サブユニット（例えば、τサブユニット）のｄＡＴＰ／ＡＴＰ結合活性を変調する化合物の指標であり、
    但し、ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット）はシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質を含む、方法。
  8. ＤｎａＸ複合体又はＤｎａＸ複合体サブユニットのｄＡＴＰ／ＡＴＰａｓｅ活性を変調させる化合物を同定する方法であって、
    ａ）ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット）を、ｄＡＴＰ／ＡＴＰと、ＤｎａＸ分子の存在又は不在下及び／又は上記化合物の存在下で接触させることにより、反応混合物を形成させ；
    ｂ）上記反応混合物を、ＤｎａＸサブユニット（又は複合体）がｄＡＴＰ／ＡＴＰを上記化合物の不在下で加水分解する条件に供し；そして
    ｃ）試験化合物の存在下での加水分解の程度を試験化合物の不在下での加水分解の程度と比較し、その際、加水分解されたｄＡＴＰ／ＡＴＰ結合の量の変化が、ＤｎａＸ複合体又はＤｎａＸ複合体サブユニット（例えば、τサブユニット）のｄＡＴＰ／ＡＴＰａｓｅ活性を変調する化合物の指標であり、
    但し、ＤｎａＸ複合体（又はサブユニット）はシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質を含む、方法。
  9. ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調させる化合物を 同定する方法であって、
    ａ）任意にＳＳＢでコートされている環状のプライムされたＤＮＡ分子を、ＤｎａＸ複合体、βサブユニット及びαサブユニットと、上記化合物及びｄＮＴＰｓ（又は修飾されたｄＮＴＰｓ）の存在下で接触させることにより反応混合物を形成させ；
    ｂ）反応混合物を、上記化合物の不在下で、核酸重合に影響する条件に供し；そして ｃ）試験化合物存在下での核酸重合を、試験化合物不在下での核酸重合と比較するが、その際、試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性の変化が、レプリカーゼの活性を変調させる化合物の指標であり、
    ＤｎａＸ複合体がシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質である、方法。
  10. δサブユニットとδ’及び／又はＤｎａＸサブユニットが相互作用する能力を変調させる化合物を同定する方法であって、
    ａ）δサブユニットをδ’及び／又はδ’プラスＤｎａＸサブユニットと上記化合物の存在下で接触させることにより反応混合物を形成させ；
    ｂ）反応混合物を、δサブユニットとδ’及び／又はδ’プラスＤｎａＸサブユニットが上記化合物の不在下で相互作用するはずの条件に供し；そして
    ｃ）試験化合物存在下での相互作用の程度を、試験化合物不在下での相互作用の程度と比較し、その際、δサブユニットとδ’及び／又はδ’プラスＤｎａＸサブユニットの間の相互作用の変化が、相互作用を変調させる化合物の指標であり、
    但し、ＤｎａＸサブユニットがシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのサブユニット蛋白質である、方法。
  11. 単離されたシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質が、
    ａ）配列番号：６５、配列番号：７０、配列番号：７５、配列番号：８０、配列番号：８５、配列番号：９０、配列番号：９５、配列番号：１０２、配列番号：１０７、及び配列番号：１１２；及び
    ｂ）ａ）の蛋白質の相同体を含む蛋白質であって、但し、当該相同体は一つ又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は挿入を含む蛋白質をコードし、そして上記蛋白質は細菌複製アッセイにおいて天然サブユニット蛋白質の機能を果たす；及び
    ｃ）ａ）に記載された何れの核酸分子にも完全に相補な単離された細菌核酸分子からなる群から選択される核酸分子によりコードされる、請求項１、２、又は９記載の方法
  12. ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのδサブユニット蛋白質が、
    ａ）配列番号：８０、配列番号：８５、及び配列番号：９０；及び
    ｂ）ａ）の蛋白質の相同体を含む蛋白質であって、但し、当該相同体は一つ又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は挿入を含む蛋白質をコードし、そして上記蛋白質は細菌複製アッセイにおいて天然サブユニット蛋白質の機能を果たす；及び
    ｃ）ａ）に記載された何れの核酸分子にも完全に相補な単離された細菌核酸分子
    からなる群から選択される核酸分子によりコードされる、請求項３、４、５、６、７、８、又は１０記載の方法。
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