DE69121888T2 - Screening nach proteinpartnern und deren verwendung - Google Patents

Screening nach proteinpartnern und deren verwendung

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Description

    Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung gehört in das Gebiet der Molekularbiologie und bezieht sich auf eine Methode zur Identifizierung eines Peptids, das fähig ist mit einem weiteren Peptid zu einem heterodimeren Komplex zu assoziieren. Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Methode zur Identifizierung von Inhibitoren solcher heterodimeren Komplexbildungen.
    • HINTERGRUND DER ERFINDUNG I. Onkogene
  • Es wird vermutet, daß die Induktion vieler Typen von Krebs letztlich durch die Aktivierung zellulärer Onkogene hervorgerufen wird (Bishop, J.M., Science 235:305-310 (1987); Barbacid, M., Ann. Rev. Biochem. 56:779-827 (1987); Cole, M.D., Ann. Rev. Genet. 20:361-384 (1986); und Weinberg, R.A., Science 230:770-776 (1985)). Solche Onkogene verbleiben in der Zelle, oft lokalisiert an bestimmten Stellen wie Zellkern, Zytoplasma oder Zellmembran.
  • Zum Beispiel kodiert das zelluläre c-myc-Onkogen für das c-myc-Protein. Die Expression großer Mengen von c-myc in einer Vielzahl von Zelltypen erlaubt den Zellen in Zellkultur unendlich zu wachsen (reviewed in Bishop, J.M., Cell 42:23-38 (1985); und Weinberg, R.A., Science 230:770-776 (1985)). C-myc- Expression wurde als ein mitwirkender Umstand in mindestens 10% aller menschlichen Krebsarten in Zusammenhang gebracht.
  • Weiters transformiert eine Überexpression von c-myc in normalen Rattenfibroblasten zusammen mit der Expression eines aktivierten ras-Onkogenprodukts die Fibroblasten und stattet sie mit der Fähigkeit aus, Tumore in lebenden Tieren zu bilden (Land, H. et al., Nature 304:596-601 (1983); Ruley, H.E., Nature 304:602-606 (1983)).
  • Die Funktion des myc-Proteins bleibt unbekannt, trotz der Ergebnisse, die mögliche Rollen in transkriptioneller Regulation, RNA-Processing und Replikation vermuten lassen. Myc ist eigentlich eine Familie von Proteinen, die Formen beinhaltet, die N-myc (DePinho, R.A. et al., Genes Dev. 1:1311- 1326 (1987)), L-myc (DePinho, R.A. et al., Genes Dev. 1:1311- 1326 (1987)) und c-myc (Battet, et al., Cell 34:779-787 (1983)) genannt werden.
  • Es ist klar, daß c-myc in Wachstumskontrolle und Differenzierung involviert ist (Alt, F.W. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:931-941 (1986); Kelly, K. et al., Annu. Rev. Iminunol. 4:327-328 (1986)). Neuere Untersuchungen lassen vermuten, daß Onkoproteine wie c-myc die Genexpression verändern und Zellen unsterblich machen durch die Regulation der Promoteraktivität der spezifischen Zielgene und auf diese Weise die Transkription jener Zielgene aktivieren oder reprimieren (siehe zum Beispiel Varmus, H.E., Science 238:1337- 1339 (1987); Kingston, R.E. et al., Cell 41:3-5 (1985); Bishop, J.M., Cell 42:23-38 (1985); Weinberg, R.A., Science 230:770-776 (1985)).
    • II. Regulatorische Proteine
  • Viele regulatorische Proteine sind Heterodimere, das heißt, sie bestehen aus zwei verschiedenen Peptidketten, die miteinander in Wechselwirkung treten, um das native Protein zu bilden. Unter solchen regulatorischen Proteinen sind DNA- bindende Proteine, die fähig sind, an spezifische DNA-Sequenzen zu binden und dadurch die Transkription von DNA in RNA regulieren. Für solche Proteine ist die Dimerisierung notwendig um solche Bindungsspezifität aufzuweisen. Es wurde gezeigt, daß DNA-Bindungsstellen austauschbar sind und dabei zur Erkennung einer DNA-Region führen, die der neu eingeführten DNA- Bindungsstelle entspricht (Wharton et al., Nature 313:601-605 (1985); Elledge et al., PNAS USA 86:3689-3693 (1989)). Es wurde gezeigt, daß heterodimere DNA-Bindungsproteine einen nicht symmetrischen Hybrid-434/P22-Operator mit hoher Affinität erkennen (PNAS USA 85:5834-5839 (1988)). Eine große Zahl an transkriptionell regulatorischen Proteinen wurde identifiziert: Myc, Fos, Ebp, Fra-1, Jun-B, Sp1, H2TF-1/NF-KB-ähnliches Protein, PRDI, TDF, GLI, Evi-1, der Glukokortikoidrezeptor, der Östrogenrezeptor, der Progesteronrezeptor, der Thyroidhormonrezeptor (c-erbA) und ZIF/268, OTF-1(OCT1), OTF-2(OCT2) und PIT-1; die Hefeproteine GCN4, GAL4, HAP1, ADR1, SWI5, ARGRII und LAC9, Mating-Type Faktoren MATα1, MATα2 und MATα1; die Neurosporaproteine cys-3 und möglicherweise cpc-1; und das Drosophilaprotein bsg 25D, "Kruppel", "Snail", "Hunchback", "Serendipity" und der Suppressor von "Hairy Wing", "Antennapedia", "Ultrabithorax", "paired", "Fushi Tarazu", "Cut" und "Engrailed". Eukaryontische transkriptionell regulatorische Proteine und Methoden zur Charakterisierung solcher Proteine wurden kürzlich in einem Review beschrieben (Johnson, P.F. et al., Annu. Rev. Bloch. 58:799-839 (1989)).
  • Mitglieder der transkriptionell regulatorischen Proteinfamilien von Säugetieren Jun/Fos und ATF/CREB binden nur als Dimere an DNA. Die Proteine in diesen Familien sind "Leucin-Zipper"-Proteine, die eine Region enthalten, die reich an basischen Aminosäuren ist, gefolgt von einem Teilstück von etwa 35 Aminosäuren, die 4-5 Leucinreste enthalten, die durch 6 Aminosäuren voneinander getrennt sind (die "leucin-Zipper"- Region). Zusammen wird die Kombination einer basischen Region mit dem "Leucin-Zipper" bZIP-Domäne genannt.
  • Allgemein wurde gefunden, daß die basische Region hauptsächlich in die DNA-Kontaktierung involviert ist und die "Zipper"-Region die Dimerisierung bewirkt. Viele dimere Kombinationen sind möglich, jedoch bestimmt die besondere Art des "Zippers", welche Partnerschaften zulässig sind (Abel, T. et al., Nature 341:24-25 (1989)).
  • Eine weitere große Proteinfamihe enthält das DNA- bindende/Dimerisierungsmotiv bekannt als das basische "Helix- Loop-Helix"-Motiv (bHLH) (Jones, N., Cell 61:9-11 (1990)). Ein bHLH-Protein enthält im allgemeinen einen basischen N-Terminus gefolgt von einer Helix-Loop-Helix-Struktur, zwei kurzen amphipathischen Helices, die an jeder dritten oder vierten Position hydrophobe Reste enthalten. Die Sequenz der basischen Region zeigt charakteristischerweise keine Anzeichen einer amphipathischen Helix. Der dazwischen liegende Loop enthält normalerweise einen oder mehrere Helix-brechende Reste.
  • Das bHLH-Motiv wurde zu allererst in zwei Proteinen entdeckt, E12 und E47, die an eine spezifische "E-Box"-DNA- Enhancersequenz binden, die man in Immunglobulinenhancern findet (Murre, C. et al., Cell 56:777-783 (1989)). E-Motive sind im allgemeinen doppelsträngige Varianten der 5'-CAGGTGGC- 3'Konsensussequenz. Zum Beispiel ist das µE1-Motiv GTCAAGATGGC, das µE2-Motiv ist AGCAGCTGGC, µE3 ist GTCATGTGGC, µE ist TGCAGGTGT (Murre, C. et al., Cell 56:777-783 (1989)). Wie viele transkriptionelle Faktoren dimerisieren Peptide, die das bHLH- Motiv enthalten, oft miteinander, entweder als Homodimer, welches zwei idente Peptide enthält, oder als Heterodimer, welches zwei verschiedene Peptide enthält. Beispiele von heterodimeren Komplexen von zwei bHLH-Proteinen, die DNA mit größerer Effizienz binden, als homodimere Komplexe der jeweiligen Peptide im Heterodimer, sind bekannt (Murre, C., et al., Cell 56:777-783 (1989); Murre, C. et al., Cell 58:537-544 (1989)).
  • Myc ist ein bHLH-Protein und die bHLH-Domäne von c-myc wird von den c-myc-Aminosäuren 255-410 kodiert. Die Sequenzhomologie zwischen den Proteinen, die von den drei myc- Genen (menschliches N-myc 393-437, menschliches c-myc 346-401 und menschliches L-myc 289-338) und anderen Genen, die bHLH- Domänen enthalten, exprimiert werden, wurden verglichen (Murre, C. et al., Cell 56:777-783 (1989)).
  • In der Abwesenheit eines Partnerproteins, mit dem es dimerisieren kann, bindet ein Homodimer aus zwei myc-Ketten nicht an die µE2-DNA. Daher ist es wünschenswert, Partner, die die myc-DNA-Bindung bewerkstelligen und Verbindungen, die die myc-Aktivität inhibieren, indem sie diese myc-Partner- Wechselwirkung inhibieren, zu identifizieren. Proteine wie myc, die das bHLH-Motiv enthalten, besitzen auch die Fähigkeit, mit anderen bHLH-Proteinen zu dimerisieren, daher ist es höchst wahrscheinlich, daß myc-Partner auch das bHLH-Motiv besitzen. Durch die Inhibierung solcher Wechselwirkungen kann Inhibierung und/oder Kontrolle von myc-induziertem Zellwachstum erreicht werden. Die Anwendung von Inhibitoren von myc-Partnerbildung würde einen therapeutischen Nutzen ergeben in der Behandlung von Krankheiten, bei denen die Expression und Aktivität von myc ein mitwirkender Umstand ist, der das Zellwachstum fördert oder die Zelle in einem transformierten Zustand erhält.
  • Jedoch wurden bis heute keine myc-Inhibitoren identifiziert. Die Identifizierung solcher Inhibitoren litt unter dem Mangel an einem einfachen, billigen und verläßlichen Testsystem, das schnell potentielle Inhibitoren und aktive Derivate davon identifiziert. Daher besteht noch immer ein Bedarf an schnellen, ökonomischen Testsystemen, die spezifische Inhibitoren von Onkogenaktivität identifizieren.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Da die potentielle Wichtigkeit von Inhibitoren von Onkoproteinen in der therapeutischen Behandlung vieler Formen von Krebs erkannt wurde, und eingedenk des Mangels eines einfachen Testsystems, mit dem solche Inhibitoren identifiziert werden können, untersuchten die Erfinder die Verwendung von chimären Onkogenkonstrukten in in vitro Untersuchungen in prokaryontischen Wirten als ein Modellsystem zur Identifizierung von Substanzen, die Onkogenexpression ändern.
  • Diese Bemühungen gipfelten in der Entwicklung eines einfachen, billigen Testsystems, welches zur Identifizierung von Proteinpartnern im allgemeinen und Partnern von transkriptionell regulatorischen Proteinen im speziellen verwendet werden kann.
  • Die Verfahren der Erfindung sind besonders nützlich zur Identifizierung von Partnern, die transkriptionell regulatorische Proteine beeinflussen, und besonders Onkoproteinaktivität.
  • Das Verfahren der Erfindung ergibt weiters eine Methode zur Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung von Inhibitoren solcher Partnerbildungen und im speziellen von Inhibitoren von Onkoproteinaktivität.
  • Die Erfindung liefert weiters eine schnelle, verläßliche und genaue Methode um Verbindungen, einschließlich Pharmazeutika für Menschen, objektiv als Inhibitoren von Onkogenaktivität zu klassifizieren.
  • Das Verfahren der Erfindung liefert weiters eine Methode zur Identifizierung von Proteinpartnern aufgrund ihrer Fähigkeit, λcI-induzierte Repression des lytischen Wachstums in bakteriellen Wirten, die Fusionsproteine exprimieren, die die cI-DNA-Bindungsdomäne und die Partner-B-Dimerisierungsdomäne enthalten, zu unterbrechen. Die Partner, die so identifiziert werden, liegen schon in klonierter Form vor und sind leicht zugänglich für weitere Charakterisierung.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Abbildung 1 zeigt die Sequenz des menschlichen c-myc-Exons 3 und die Stellen, die verwendet wurden, um die HLH/LZ und HLH- Fragmente von c-myc zu synthetisieren.
    • BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • In der folgenden Beschreibung werden häufig Ausdrücke aus der rekombinanten DNA-Technologie verwendet. Um ein klareres und übereinstimmenderes Verständnis der Beschreibung und Ansprüche zu ermöglichen, einschließlich des Umfanges, der diesen Ausdrücken gegeben wird, werden die folgenden Definitionen zur verfügung gestellt.
  • Operabel gebunden. Hier so verwendet, daß zwei Makromoleküle operabel gebunden sind, wenn die beiden makromolekularen Elemente physikalisch so angeordnet sind, daß Faktoren, die die Aktivität des ersten Elements beeinflussen, bewirken, daß das erste Element einen Effekt im zweiten Element induziert.
  • Fusionsorotein. Wie hier verwendet, ist ein "Fusionsprotein" ein Hybridprotein, das so konstruiert wurde, daß es Domänen von zwei verschiedenen Proteinen enthält.
  • Der Ausdruck "Fusionsproteingen" soll sich auf eine DNA- Sequenz beziehen, die für ein Fusionsprotein kodiert, und, wo es angemessen ist, inklusive der transkriptionell und translatorisch regulierenden Elementen davon.
  • Variante. Eine "Variante" eines Fusionsproteins ist ein Protein, das eine Aminosäuresequenz enthält, die im wesentlichen ähnlich aber nicht ident mit der Aminosäuresequenz eines Fusionsproteins ist, das aus natürlich vorkommenden Domänen, das heißt, die native Aminosäuresequenz enthaltenden Domänen, konstruiert wurde.
  • Eine "im wesentlichen ähnliche" Aminosäuresequenz bedeutet eine Aminosäuresequenz, die in hohem Maße homolog zu aber nicht identisch mit der Aminosäuresequenz ist, die man in einem Fusionsprotein findet. In hohem Maße homologe Aminosäuresequenzen beinhalten Sequenzen von 80% oder mehr Homologie und möglicherweise auch von niedrigerer Homologie, vor allem, wenn die Homologie in Domänen von Interesse konzentriert ist.
  • Funktionelles Derivat. Ein "funktionelles Derivat" eines Fusionsproteins ist ein Protein, das die Fähigkeit besitzt, mit einem Partnerprotein zu dimerisieren oder die Fähigkeit, an eine gewünschte Ziel-DNA zu binden, in wesentlichen ähnlich der Fähigkeit des Fusionsproteinkonstrukts der Erfindung zu dimerisieren. "Im wesentlichen ähnlich" bedeutet, daß die oben beschriebenen biologischen Aktivitäten ähnlich der des Fusionsproteins der Erfindung sind, aber quantitativ anders. Zum Beispiel kann ein funktionelles Derivat eines Fusionsproteins das selbe Ziel wie das Fusionsprotein erkennen, oder Heterodimere mit dem selben Partnerprotein bilden, aber nicht mit der selben Affinität.
  • Wie hier verwendet, zum Beispiel, wird ein Peptid ein "funktionelles Derivat" genannt, wenn es das Aminosäuregerüst des Fusionsproteins enthält und zusätzlich chemische Gruppen, die üblicherweise kein Bestandteil von Fusionsproteinen sind. Solche Gruppen können die Löslichkeit des Derivates, dessen Absorption, seine biologische Halbwertszeit, etc. erhöhen. Im anderen Fall können die Gruppen die Giftigkeit des Derivats herabsetzen oder unerwünschte Nebenwirkungen des Derivats beseitigen oder abschwächen etc. Gruppen, die solche Effekte vermitteln, werden in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) bekanntgegeben. Verfahren zur Kopplung solcher Gruppen an ein Molekül sind gut bekannt.
  • Ein funktionelles Derivat eines Fusionsproteins kann post translationale Modifikationen, wie kovalent gebundene Kohlenhydrate, enthalten oder nicht, abhängig von der Notwendigkeit solcher Modifikationen für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung.
  • Der Ausdruck "funktionelles Derivat" soll funktionelle "Fragmente", "Varianten", "Analoge" oder "chemische Derivate" eines Moleküls miteinschließen.
  • Promoter. Ein "Promoter" ist eine DNA-Sequenz, die proximal zum Transkriptionsbeginn am 5' Ende der transkribierten Sequenz liegt, wo die DNA-Polymerase bindet oder die Transkription einleitet. Der Promoter kann vielfache regulatorische Elemente enthalten, die durch ihr Zusammenwirken die Transkription des operabel-gebundenen Gens regulieren.
  • Expression. Expression ist der Prozeß, bei dem die in einem Gen kodierte Information transkribiert und in ein Protein translatiert wird.
  • Ein Nukleinsäuremolekül, wie DNA oder ein Gen, wird "fähig zur Expression" eines Polypeptids genannt, wenn das Molekül die Sequenz enthält, die für das Polypeptid kodiert und die Expressions-Kontroll-Sequenz, die in der passenden Wirtsumgebung die Fähigkeit zur Transkription, zum Processing und zur Translation der genetischen Information, welche in der DNA enthalten ist, in ein Proteinprodukt, besitzt, und wenn solche Expressions-Kontroll-Sequenzen operabel gebunden an die Nukleotidsequenz sind, die für das Polypeptid kodiert.
  • Klonierungsvehikel. Ein "Klonierungsvehikel" ist jede molekulare Einheit, die fähig ist, eine Nukleinsäuresequenz einer Wirtszelle zu Klonierungszwecken zu vermitteln. Beispiele von Klonierungsvehikeln beinhalten Plasmide oder Phagengenome. Ein Plasmid, das sich in der Wirtszelle autonom replizieren kann, ist besonders wünschenswert. Alternativ dazu ist ein Nukleinsäuremolekül, das in die chromosomale DNA der Wirtszelle insertiert werden kann, besonders nützlich.
  • Klonierungsvehikel werden oft charakterisiert durch eine oder eine kleine Zahl von Endonukleaseerkennungsstellen, an denen solche DNA-Sequenzen in einer bestimmten Art gespalten werden können, ohne Verlust einer biologisch essentiellen Funktion des Vehikels, und in welche die DNA gespleißt werden kann um Replikation und Klonierung in Gang zu bringen.
  • Das Klonierungvehikel kann weiters Marker enthalten zur Identifizierung von Zellen, die mit dem Klonierungsvehikel transformiert wurden. Beispiele für Marker sind Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz. Das Wort "Vektor" wird manchmal für "Klonierungsvehikel" verwendet.
  • Expressionsvehikel. Ein "Expressionsvehikel" ist ein Vehikel oder Vektor ähnlich einem Klonierungsvehikel, aber es ist besonders konstruiert um Sequenzen zu enthalten, die fähig sind, das klonierte Gen nach der Transformation in einen Wirt zu exprimieren.
  • In einem Expressionsvehikel ist das Gen, das kloniert werden soll, an bestimmte Kontrollsequenzen, wie Promotersequenzen operabel gebunden. Expressionskontrollsequenzen können variieren, abhängig davon, ob der Vektor konstruiert wurde um das operabel gebundene Gen in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt zu exprimieren und sie können zusätzlich transkriptionelle Elemente, wirtsspezifische Elemente wie Operatorelemente, Upstream- Aktivatorregionen, Enhancerelemente, Terminationssequenzen, Gewebsspezifitätselemente und/oder Translationsinitiationsstellen und Translationsterminationsstellen enthalten.
  • Wirt. Ein "Wirt" ist ein Organismus, der der Empfänger eines Klonierungs- oder Expressionsvehikels ist.
  • Antwort. Der Ausdruck "Antwort" soll sich auf die Änderung irgendeines Parameters beziehen, der zur Messung und Beschreibung des Effekts einer Verbindung auf die Aktivität eines Proteins verwendet werden kann. Die Antwort kann sich als physische Änderung (wie Änderung im phänotyp) oder als molekulare Änderung (wie Änderung in der Reaktionsgeschwindigkeit oder Affinitätskonstanten) zeigen. Die Detektion der Antwort kann durch alle geeigneten Mittel erfolgen.
  • Verbindung. Der Begriff "Verbindung" soll sich auf eine chemische Einheit beziehen, die in fester, flüssiger oder gasförmiger Phase vorliegt. Der Begriff sollte so aufgefaßt werden, daß er synthetische Verbindungen, natürliche Produkte und makromolekulare Einheiten wie Polypeptide, Polynukleotide oder Lipide und auch kleine Einheiten wie Neurotransmitter, Liganden, Hormone oder elementare Verbindungen umfaßt.
  • Bioaktive Verbindung. Der Ausdruck "bioaktive Verbindung" bezieht sich auf jede Verbindung, die eine meßbare Antwort in den Testsystemen der Erfindung hervorruft.
  • Heterodimere Proteine sind Proteine, die zwei verschiedene Polypeptidketten enthalten, die miteinander assozueren, zum Beispiel aufgrund von Wasserstoffbrückenbindung, ionischen Wechselwirkungen, hydrophoben Wechselwirkungen, Disulfidbrücken und ähnliches, aber die nicht durch Aminosäurebindung aneinander gebunden sind. Die beiden Polypeptidketten des heterodimeren Proteins werden dabei als "Partner" von einander bezeichnet. Man fand, daß heterodimere, transkriptionsregulatorische Proteine eine einzelne Domäne besitzen, die notwendig ist, damit Dimerisierung auftreten kann. Eine zweite einzelne Domäne ist notwendig, damit DNA-Bindung auftreten kann.
  • Diese Beobachtungen wurden durch die Erfinder so erklärt, daß sie die Erkennung eines Partners eines heterodimeren Proteins erlauben. Solche Proteinpartner können identifiziert werden durch die Herstellung eines chimären Peptids, das seine eigene Dimerisierungsdomäne beibehält, aber eine DNA- Bindungsdomäne enthält, die fähig ist, eine phänotypische Expression auf eine Wirtszelle zu übertragen (vorzugsweise eine bakterielle Wirtszelle wie E. coli). Durch die Beobachtung eines solchen Phänotyps kann die Bildung und Aktivität eines Heterodimers überwacht werden. Die bevorzugtesten chimären Peptide enthalten eine Dimerisierungsdomäne eines mutmaßlichen heterodimeren Proteinpartners und die DNA-Bindungsdomäne eines Bakteriophagenrepressors, wie den Repressor von Bakteriophage Lambda (λ).
  • Bakteriophage λ besitzt die Fähigkeit, einen bakteriellen Wirt zu infizieren und entweder (a) in einer infektiösen, lytischen Art und Weise (lytischer Zyklus) zu replizieren und zu wachsen oder (b) in das Wirtschromosom zu integrieren auf nicht infektiöse, lysogene Art (lysogener Zyklus). Wenn er als Teil des bakteriellen Chromosoms integriert ist, bezeichnet man den inerten Phagen als Prophagen. Aufgrund des Besitzes eines Prophagen sind lysogene Bakterien immun gegen weitere Infektion durch Phagenpartikel der selben Art. Bakteriophage Lambda ist ein Mitglied der Familie von lambdoiden Bakteriophagen (wie 434, 21 und φ80). Diese alle sind gleichwertig mit λ für die Zwecke der Erfindung.
  • Wenn λ auflytische Art in infizierten Bakterien gezüchtet wird, werden die Bakterien schließlich lysiert. Diese Lyse macht sich bemerkbar durch das Klarwerden der Trübung oder des opaken Aussehens, das die Anwesenheit einer Bakterienkultur anzeigt. Die Wachstums- und Replikationsaktivität eines Phagen, der in seinem lytischen Zyklus Bakterienzellen lysiert, kann getestet werden durch Untersuchung seiner Fähigkeit, Bakterien zu lysieren, indem Plaques (klare Stellen, in denen die Bakterien lysiert wurden) in einer Bakterienkultur auf Agar gebildet werden (The Bacteriophage Lambda, Hershy, A.D., ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1971); Lambd II, Hendrix, R.W. et al., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1983); Maniatis, T. et al., Molecular doning (A Laboratory Manual), 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)).
  • Das λcI Gen kodiert für ein Repressorprotein, cI, das notwendig ist, um Lysogenität zu erhalten. In seinem nativen Zustand ist cI ein Homodimer (ein Dimer mit zwei identen Ketten) und eine enge Bindung des Repressors an die λ-DNA verlangt den dimeren Zustand. cI bindet an zwei Operatoren, die die Transkription von anschließenden Genen kontrollieren, deren Produkte für die Expression von Genen notwendig sind, die für die lytische Entwicklung verantwortlich sind. Durch die Bindung an diese Operatoren verhindert der cI-Repressor die Transkription aller λ-Gene außer seinem eigenen. Die vollständige Aminosäure- und Nukleotidsequenz des cI-Gens ist bekannt (Lambda II, Hendrix, R.W. et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1983)).
  • In den Konstrukten der Erfindung wird ein Fusionsprotein geschaffen, das die DNA-Bindungsdomäne von cI (die 112 N- terminalen Aminosäuren von λcI) enthält und die Dimerisierungsdomäne eines mutmaßlichen heterodimeren Proteinpartners. In einer sehr bevorzugten Ausführungsform wird die Dimerisierungsdomäne, die bHLH-Region, von c-myc verwendet (Aminosäuren 255-410 von c-myc). Wenn gewünscht, können andere Dimerisierungsdomänen verwendet werden.
  • Dimerisierungsdomänen können durch Analyse der dreidimensionalen Struktur eines Proteins vorhergesagt werden, mittels der Verwendung der Aminosäuresequenz und bekannten Computeranalysetechniken, wie zum Beispiel des Chou-Fasman- Algorithmus. Solche Techniken gestatten die Identifizierung von helikalen Domänen und anderen Gebieten von Interesse, zum Beispiel hydrophobe oder hydrophile Domänen in der Peptidstruktur.
  • Die HLH-Dimerisierungsdomäne kann bestimmt werden durch den Vergleich der Aminosäuresequenz mit jenen von zehn bekannten Dimerisierungsdomänen (Aminosäuren 336-393 in E12, 336-393 in E47, 554-613 in "Daughterless", 357-407 in "Twist", 393-437 in menschlichem N-myc, 289-338 in menschlichem L-myc, 346-401 in menschlichem c-myc, 108-164 in Myod und Gene des "Achaete-scute"-Lokus: 101-167 von T4, 26-95 von T5 (Murre, C. et al., Cell 56:777-783 (1989)). Die HLH-Dimerisierungsdomäne enthält zwei amphipathische Helices, die durch einen dazwischenliegenden Loop getrennt sind. Die erste Helix enthält 12 Aminosäuren und die zweite Helix enthält 13 Aminosäuren. Bestimmte Aminosäuren scheinen im HLH-Format konserviert zu sein, besonders die hydrophoben Reste in den Helices. Der Vergleich der beiden oben genannten Sequenzen zeigt, daß es fünf praktisch idente hydrophile Reste im 5' Ende der homologen Region gibt und einen Satz von hauptsächlich hydrophoben Resten, der sich in zwei kurzen Segmenten befindet, die durch eine Sequenz voneinander getrennt sind, die im allgemeinen Proline oder Cluster von Glycinen enthält.
  • Eine Leucin-Zipper-Domäne ist üblicherweise ungefähr 35 Aminosäuren lang und enthält eine siebenzählige Wiederholungseinheit von Leucinresten und eine überaus große Dichte an entgegengesetzt geladenen Aminosäuren (Säuren und Basen), die in passender Weise für intrahelikale Ionenpaarung angeordnet sind. Man vermutet, daß die Leucine, die aus der Helix des einen Polypeptids herausragen, verflochten sind mit jenen der analogen Helix des zweiten Polypeptids (des Partners) und so die Verzahnung bilden, die Leucin-Zipper genannt wird.
  • Das Fusionsprotein der Erfindung ist konstruiert als ein rekombinantes DNA-Molekül, das fähig ist, das Fusionsprotein in einem bakteriellen Wirt zu exprimieren. Transformation von E. coli-Wirten mit einem rekombinanten λ-Konstrukt, das fähig ist, solch ein Fusionsprotein zu exprimieren, resultiert in der Immunität des bakteriellen Wirtes aufgrund der Dimerisierung des Fusionsproteins und vor allem der cI-Domäne in eine homodimere Form, die an die geeigneten λ-DNA-Operatoren binden kann. Daher wird nach der Transformation und Expression des Fusionsproteins lytisches Wachstum von Lambda oder nachfolgende Infektion mit λ verhindert.
  • Vorzugsweise wird ein Plasmid mit niedriger Kopienzahl zusammen mit einem schwachen Promoter verwendet (zum Beispiel dem β-Laktamase-Promoter und dem Laktoseoperator) für die Transkription des Fusionsgens, um den bakteriellen Wirt nicht mit einem riesigen Überschuß an Fusionsprotein zu überlasten. Wenn ein riesiger Überschuß an Fusionsprotein erzeugt wird, kann das molare Verhältnis von Fusionsproteinhomodimer zu Fusionsproteinheterodimer (wie unten beschrieben) so hoch sein, daß das Homodimer erfolgreich die Repression des Phagenwachstums aufrecht erhält und die Detektion des Heterodimers verhindert.
  • Jedes Protein, das eine Bindungsdomäne besitzt, die ein Heterodimer mit dem Fusionsprotein bilden kann, wird die Bildung eines Fusionsproteinhomodimers beeinträchtigen oder verhindern. Solche Proteine können auf diese Weise durch ihre Fähigkeit, bei der Repression des Phagenwachstums, die durch das Fusionsprotein vermittelt wird, einzugreifen, identifiziert werden.
  • In einer Ausführungsform wird der bakterielle Wirt, der das oben beschriebene Fusionsprotein exprimiert, transformiert mit einer λ-Expressionsbibliothek, die klonierte eukaryontische Gene exprimiert. Zum Beispiel sind λgtII-Verpackungssysteme für die Herstellung von Expressionsbibliotheken aus mRNA, die nützlich sind für die Methoden der Erfindung, bekannt und sind kommerziell erhältlich (zum Beispiel durch Promega Corporation, Madison, Wisconsin). Weiters können nach Maß gemachte genomische Expressionsbibliotheken auch kommerziell erhalten werden.
  • Wenn kommerzielle Kits verwendet werden, kann eine cDNA- Bibliothek mit oligo(dT)-Primer in λgtII hergestellt werden unter Verwendung von poly(A) enthaltender mRNA aus jeder gewünschten Säugetierquelle. Um die Expression der klonierten, darin enthaltenen Proteine zu induzieren, kann 10 mM IPTG (Isopropylthiogalaktosid) zugegeben werden.
  • Es ist wichtig, daß, da alle Wirtszellen den Fusionsprotein-λ-Repressor produzieren, die lytische Vermehrung der infizierenden λ-Expressionsbibliothek unterdrückt wird. Jedes infizierende Mitglied der λ-Expressionsbibliothek, das kein Protein exprimiert, das eine Dimerisierungsdomäne besitzt, die fähig ist die Dimerisierungsdomäne des Fusionsproteins zu binden, wird die Phagenrepression nicht beeinträchtigen, die durch das Fusionsproteinhomodimer vermittelt wird. Daher wird kein lytisches Wachstum des λ-Phagen gefunden werden. Wenn irgendein Mitglied der λ-Expressionsbibliothek ein Protein exprimiert, das fähig ist, die Homodimerisierung des Fusionsproteins zu stören (zum Beispiel durch die Bildung eines Heterodimers mit der bHLH-Domäne des Fusionsproteins, etc.), wird die Repressorfunktion verlorengehen und lytisches Wachstum von λ wird auftreten. Auf diese Weise kann die Identifizierung von Partnern, die Heterodimere bilden, leicht durchgeführt werden mittels Untersuchung auf Plaque-bildende Phagen.
  • Das Verfahren der Erfindung ist allgemein anwendbar zur Identifizierung von Partnern für jedes Protein, das Partner mit anderen Proteinen bildet, und besonders Heterodimere. Ein Vorteil des Verfahrens der Erfindung zur Identifizierung von Proteinpartnern ist, daß der Partner, der identifiziert wird, einer ist mit höherer Affinität für das Fusionsprotein als die homodimere Affinität und daher ein Protein ist, das höchst wahrscheinlich ein wichtiger Regulator der biologischen Aktivität des Proteins ist. Weiters ist der Partner, der identifiziert wird in einer klonierten, exprimierenden Form, die verwendet werden kann um größere Mengen des Proteins für dessen Isolierung und weitere Charakterisierung durch bekannte Protein- und Molekularbiologische Techniken zu erhalten.
  • Die Identifizierung von Proteinpartnern in der Expressionsbiblothek erlaubt die Identifizierung von Verbindungen, die die Fähigkeit solcher Partner Heterodimere zu bilden inhibiert, durch Untersuchung der Fähigkeit der Verbindung Plaquebildung zu inhibieren.
  • Zum Beispiel kann, sobald ein Partner durch das Erscheinen von klaren oder trüben Plaques, wie oben beschrieben, identifiziert wurde, die Identifizierung von Verbindungen, die Heterodimerbildung der Proteinpartner behindert oder sonstwie stört, identifiziert werden, durch Untersuchung solcher Verbindungen auf ihre Fähigkeit, Plaquebildung zu inhibieren. Eine Verbindung, bei welcher in diesem Beispiel Inhibierung von Plaquebildung gefunden wurde, würde eine Verbindung sein, die (a) das Fusionsprotein daran hindert, mit dem Partnerpeptid,das ebenfalls im Wirt exprimiert wird, zu assozueren und (b) nicht die Bildung des Homodimers verhindert, das bedeutet, die Dimerisierungs der cI-Domäne des Fusionsproteins. Solch eine Verbindung kann die Dimerisierungsdomänen daran hindern, im Homodimer aufeinander zu wirken, sie muß es aber nicht. (c) Sie verhindert nicht das Zellwachstum unter den Bedingungen des Plaque-Tests.
  • Um sicher zu gehen, daß der mittels des oben beschriebenen Prozesses ausgewählte Partner für die Regulation der Dimerisierung des Fusionsproteins spezifisch ist und nicht die Transkription im allgemeinen verhindert, kann der λ-Phage, der solch einen Partner exprimiert, verwendet werden, um einen bakteriellen Wirtsstamm zu infizieren, der Fusionsproteine exprimiert, die mit der Dimerisierungsdomäne von anderen Proteinen hergestellt wurden, und dann wird die Fähigkeit des Partners untersucht, in solchen Wirten lytisches Wachstum zu induzieren. Wenn es zum Beispiel von Interesse ist, eine Verbindung zu identifizieren, die die bHLH-Dimerisierung aber nicht die bZIP-Dimerisierung inhibiert, wird ein Fusionsprotein hergestellt, das cI enthält, wie oben beschrieben, und die passende Dimer-bildende Domäne eines bZIP-Proteins.
  • Partner jeder Art von transkriptionellen Regulationsproteinen, die sich zu Dimeren zusammenschließen und Verbindungen, die den Zusammenschluß solcher Partner inhibieren, können durch das bakterielle Verfahren der Erfindung identifiziert werden.
  • Bei der Anwendung der oben beschriebenen Techniken haben die Erfinder auch spezifische Partnerproteine entdeckt, die in vivo mit c-myc assoziieren und die bei der Bindung von c-myc an DNA mithelfen. Diese Partner festigen das Ausmaß und die Dauer der c-myc-Bindung an ihr bindendes Element, die µE2-Sequenz der DNA. Eines dieser Partnerproteine hat ein Molekulargewicht von 46,000 Dalton und bindet an die mE2-Sequenz in der Abwesenheit von c-myc.
  • Die Identifizierung einer DNA-bindenden Domäne in einem Protein kann mittels einer Vielzahl von bekannten und kürzlich zur Identifizierung solcher Domänen verwendeten Techniken durchgeführt werden (siehe Johnson, P.E. et al., Annu. Rev. Biochem. 58:799-839 (1989) für einen Review solcher Domänen) DNA-bindende Proteine und DNA-bindende Domänen in solchen Proteinen werden identifiziert und gereinigt aufgrund ihrer Affinität zu DNA. Zum Beispiel kann die DNA-Bindung entdeckt werden in Filterhybridisierungsexperimenten, wobei das Protein (meistens zur leichteren Detektion markiert) an eine am Filter immobilisierte DNA binden soll, oder umgekehrt, wobei die DNA- Bindungsstelle (meistens markiert) an ein Filter bindet, an dem das Protein immobilisiert wurde. Die Sequenzspezifität und die Affinität einer solchen Bindung wird mittels "DNA-Protection- Assays" und "Gel-Retardation-Assays" festgestellt. Die Reinigung solcher Proteine kann unter Verwendung von sequenzspezifischer DNA-Affinitätschromatographietechniken, das bedeutet Säulenchromatographie mit einem Harz, das mit der DNA, an die die Domäne bindet, derivatisiert wurde, durchgeführt werden. Proteolytischer Abbau von DNA-bindenden Proteinen kann zur Identifizierung der Domäne mit DNA-Bindungsfähigkeit verwendet werden.
  • Die Dimerisierungsdomäne in einem Protein wird durch ihre Homologie zu bekannten Dimerisierungsdomänen erkannt und kann durch die Aminosäuresequenz des Proteins unter Verwendung von Computer-unterstützten Strukturanalysen, wie oben beschrieben, vorhergesagt werden.
  • Die Bindungsdomäne und die Dimerisierungsdomäne sind so in das Fusionsprotein eingebaut, daß die Funktion keiner der beiden Domänen zerstört wird; das bedeutet, die DNA- Bindungsdomäne, wenn sie richtig dimerisiert ist, kann das DNA- Element erkennen, an das sie natürlicherweise bindet und die Dimerisierungsdomäne behält ihre Fähigkeit, mit ihren Partnern zu dimerisieren. Jemand, der in dieser Kunst geschult ist, wird es zustande bringen, unter Durchführung von Kontrolltests, es einzurichten, daß das Fusionsprotein ordnungsgemäß funktioniert.
  • Das Fusionsproteinkonstrukt der Erfindung kann extrachromosomal erhalten bleiben als Plasmid oder in das Genom der Wirtszelle inseriert werden.
  • Die Methoden der Erfindung können verwendet werden um Verbindungen in ihrer Reinform zu untersuchen, in verschiedenen Konzentrationen oder auch in unreiner Form. Die Methoden der Erfindung können auch verwendet werden um die Anwesenheit solcher Inhibitoren in Rohextrakten zu identifizieren und die Reinigung der Inhibitoren von dort weg zu verfolgen. Die Methoden der Erfindung sind auch nützlich bei der Bewertung der Stabilität der wie oben beschrieben identifizierten Inhibitoren, um die Wirksamkeit verschiedener Aufbereitungen zu bewerten.
  • Es können auch Analoge zu solchen Verbindungen verwendet werden, die eine höhere Permeabilität durch die bakterielle Wirtszellwand besitzen. Zum Beispiel zeigen Dibutyrylderivate oft eine erhöhte Permeabilität.
  • Die Methoden können auch verwendet werden um Partner und Verbindungen zu identifizieren, die mit dem Partner von Membran-lokalisierten und/oder im Zytoplasma lokalisierten Proteinen in Wechselwirkung treten, wenn solche Proteine fähig sind mit der Dimerisierungsdomäne des Fusionsproteins zu assozueren.
  • Die DNA-Sequenz des Fusionsproteins und/oder des Zielgens kann chemisch hergestellt werden oder auf bekannte rekombinante Art. Methoden zur chemischen Synthese von DNA sind gut bekannt (Oligonukleotide Synthesis, A Practical Approach, M.J.Gail, ed., IRL Press, Washington, D.C., 1094; Synthesis and Applications of DNA and RNA, S.A. Narang; ed., Academic Press, San Diego, CA, 1987). Da der genetische Code degeneriert ist, kann mehr als ein Codon verwendet werden, um die DNA-Sequenz herzustellen, die für eine bestimmte Aminosäure kodiert (Watson, J.D., In: Molecular Biology of the Gene, 3rd edition, W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA, 1977, pp. 356-357).
  • Um die rekombinanten Fusionskonstrukte der Erfindung zu exprimieren, sind transkriptionelle und translationelle Signale, die vom Wirt erkannt werden, notwendig. Ein kloniertes Fusionsprotein, das durch die oben beschriebenen Methoden erhalten wurde, vorzugsweise in doppelsträngiger Form, kann operabel gebunden werden an Sequenzen, die transkriptionelle Expression in einem Expressionsvektor kontrollieren, und in eine Wirtszelle, zum Beispiel mittels Transformation, eingebracht werden, um das rekombinante Fusionsprotein oder ein funktionelles Derivat davon zur Verwendung in den Verfahren der Erfindung herzustellen.
  • Transkriptionelle, die Initiation regulierende Signale können gewählt werden, was eine Repression oder eine Aktivierung der Expression des Gens, das für das Fusionsprotein kodiert, ermöglicht, sodaß die Expression des Fusionskonstrukts reguliert werden kann, wenn es erwünscht ist. Von Interesse sind regulatorische Signale, die temperatursensitiv sind, sodaß durch Veränderung der Temperatur die Expression reprimiert oder initiiert werden kann, oder welche, die chemischer Regulation unterworfen sind, zum Beispiel durch einen Metaboliten oder ein Substrat, das dem Nährmedium zugegeben wird. Alternativ dazu kann das Fusionskonstrukt in der Wirtszelle konstitutiv exprimiert werden.
  • Es ist wichtig, das Protein in einem Wirt zu exprimieren, in dem die Fähigkeit des Proteins seine biologische Funktion zu erhalten, nicht behindert wird. Die Expression von Proteinen in bakteriellen Wirten wird vorzugsweise durch die Verwendung von prokaryontischen regulatorischen Signalen erreicht.
  • Expressionsvektoren enthalten typischerweise einzelne DNA- Elemente wie zum Beispiel (a) einen Replikationsursprung, der die selbständige Replikation des Vektors erlaubt, oder Elemente, die eine stabile Insertion des Vektors in das Wirtsgenom fördern und (b) spezifische Gene, die fähig sind, phänotypische Selektion in transformierten Zellen zu vermitteln. Viele geeignete Expressionsvektorsysteme, die nützlich sind für die Methoden der Erfindung, sind kommerziell erhältlich.
  • Sobald der Vektor oder die DNA-Sequenz, die das Konstrukt (die Konstrukte) enthält, für die Expression vorbereitet wurden, wird das DNA-Konstrukt (die Konstrukte) in eine geeignete Wirtszelle mittels einer Vielzahl geeigneter Methoden, zum Beispiel durch Transformation, eingebracht. Nach dem Einbringen des Vektors werden die Empfängerzellen in einem selektiven Medium gezüchtet, das auf das Wachstum von Vektorenthaltenden Zellen selektiert. Die Expression der klonierten Gensequenz(en) resultiert in der Erzeugung des Fusionsproteins.
  • Wenn die DNA-kodierende Sequenz des Fusionsproteins und ein operabel gebundener Promoter in eine Empfängerwirtszelle als ein nicht-replizierendes DNA-(oder RNA) Molekül eingebracht wird, das entweder als lineares Molekül, oder bevorzugterweise als geschlossenes kovalent zirkuläres Molekül ohne Fähigkeit zur autonomen Replikation vorliegt, kann die Expression des Fusionsproteins durch die vorübergehende Expression der eingebrachten Sequenz auftreten.
  • Es können genetisch stabile Transformanten hergestellt werden mittels Vektorsystemen oder Transformationssystemen, wobei die DNA des Fusionsproteins in das Wirtschromosom integriert wird. Solch eine Integration kann in der Zelle de novo auftreten oder kann unterstützt werden durch Transformation mit einem Vektor, der sich selbst funktionell in das Wirtschromosom integriert, zum Beispiel mit Bakteriophagen, Transposons oder anderen DNA-Elementen, die die Integration von DNA-Sequenzen in Chromosomen fördern.
  • Zellen, die mit dem Vektor der Fusionsprotein-DNA der Erfindung transformiert wurden, werden selektiert durch die weitere Zugabe eines oder mehrerer Marker, die Selektion von Wirtszellen, die den Vektor enthalten, ermöglichen, zum Beispiel kann der Marker Biozidresistenz vermitteln, zum Beispiel Resistenz gegen Antibiotika oder ähnliches.
  • Die transformierte Wirtszelle kann auf bekannte Weise fermentiert werden um optimales Zellwachstum und auch optimale Expression des klonierten Fragments der Fusionsproteinsequenz zu erreichen. Eine optimale Expression des Fusionsproteins ist eine Expression, die nicht mehr als gleich viel Mole an Fusionsproteinuntereinheiten hervorbringt, wie Mole des Partnerproteins, die exprimiert werden. Dennoch sind Abweichungen dieser Menge annehmbar, wenn sie die Fähigkeit des Partners, wenn er in dimerer Form vorliegt, die cI- Repressoraktivität aufzuheben, nicht stört.
  • Es mag wünschenswert sein, die Partnerproteine von c-myc, die durch die Verfahren der Erfindung identifiziert werden, in einem eukaryontischen Expressionsssystem weiter zu charakterisieren. Solch eine Charakterisierung kann mittels der Verfahren durchgeführt werden, die von den Erfindern beschrieben werden im gleichzeitig angemeldeten Patentantrag mit dem Titel "C-MYC SCREENING ASSAYS," mit der Seriennr. 07/210,253, eingereicht am selben Tag wie dieser Antrag, am 19. April 1990, und hier als Referenz enthalten.
  • Die folgenden Beispiele beschreiben weiter das Material und die Methoden, die verwendet wurden um diese Erfindung auszuführen. Die Beispiele sollen die Erfindung in keiner Weise limitieren.
    • BEISPIELE Beispiel 1 Herstellung des c-myc-Fusionsproteins
  • Die Promoter/Operator-Regionen sind in all diesen Konstrukten die gleichen und bestehen aus dem β-Laktamasepromoter und dem lac-Operator und der Shine-Delgarno-(S.D.)- Sequenz. Die Sequenz ist wie folgt:
  • cI in jedem dieser Konstrukte besteht aus den ersten 330 bp (1121 Aminosäuren), die dem N-terminalen Polypeptid, das man durch recA-Spaltung erhält, entsprechen. Es wurde synthetisiert mit Polymerasekettenreaktion-(PCR)-Primern mit XhoI- und XbaI- Stellen am 5'-Ende beziehungsweise am 3'-Ende. Die Promoter/Operator- und cI-DNAs wurden in pUC18 kloniert, das mit BamHI und XbaI verdaut wurde.
  • Die Sequenz um die XbaI-Stelle lautet:
  • 5' CAG GCA GGG TCT AGA....
  • Gln Ala Gly XbaI
  • cI kod. Seq.
  • Die HLH/LZ- (Helix-Loop-Helix/Leucin Zipper) und HLH- Fragmente von c-myc wurden mittels PCR hergestellt unter Verwendung von menschlicher c-myc-DNA als Template. HLH/LZ ist ein 257 bp Fragment, das mit Primern synthetisiert wurde, die an den Stellen #2 und #9 (Abbildung 1) beginnen, mit XbaI- und SalI-Stellen am 5'-Ende beziehungsweise am 3'-Ende. HLH ist ein 178 bp Fragment mit XbaI- und PstI-Stellen am 5'-Ende beziehungsweise am 3'-Ende; die Grenzen von HLH sind die mit #2 und #10 bezeichneten Stellen. Der Primer, der an Stelle #10 verwendet wurde, enthält ein Terminationscodon, ebenso wie jener an Stelle #9. Die Insertion der c-myc-Sequenz in pU33cI erfolgte an den Stellen, die jenen in den indizierten PCR- Primern entsprechen.
  • Jedes dieser Konstrukte in pUC18 wurde in pYC177 wie folgt subkloniert. pYC177 wurde mit Bgl1 (mit Klenow aufgefüllt) und BamH1 verdaut und jedes der auf pUC18 basierenden Konstrukte wurde mit HindIII (mit Klenow aufgefüllt) und BamHI verdaut. Die entstehenden pYC-Konstrukte vermittelten Kanamycinresistenz.
    • Beispiel 2 Screening der cDNA-Expressionsbibliothek auf Proteinpartner, die fähig sind, mit der Helix-Loop-Helix-Domäne von c-Myc in Wechselwirkung zu treten
  • Um auf Proteine zu testen, die fähig sind, mit der Helix- Loop-Helix-(HLH)-Domäne von menschlichem c-Myc in Wechselwirkung zu treten, wurde DNA, die für die Aminosäuren 255-410 kodiert, welche die basische Region enthält und HLH des c-myc- Peptids, wie oben beschrieben "in frame" an ein DNA-Fragment ligiert, das für die 112 N-terminalen Aminosäuren des Lambdarepressor (cI) Proteins kodiert. Die Expression dieses chimären Proteins wurde unter die Kontrolle des sehr schwachen &beta;-Laktamasepromoters und des Laktoseoperators gestellt. Diese Expressionseinheit wurde in pACYC177, ein Plasmid in niedriger Kopienzahl (10-15 Kopien/Zelle) mit einem Kanamycin -Gen, subkloniert. Zellen, die mit diesem Konstrukt transformiert wurden, erwiesen sich im "Dot Plaque Assay" als resistent gegen Lambdaphageninfektion. Das oben beschriebene Konstrukt, pYC192cIHLH, machte die Zellen resistent gegen Phageninfektion bei > 10&sup8; pfu, wohingegen Zellen, die nur die N-terminale Region von cI exprimierten, infiziert wurden bei < 10² pfu.
  • Der mit pYC192cIHLH transformierte E. coli Stamm Y1090 wurde zum Screenen einer menschlichen Mandel/B-Zell- Expressionsbibliothek verwendet, hergestellt nach den Empfehlungen der Hersteller (Promega). 5 x 10&sup6; pfu wurden in doppelter Ausführung am oben genannten Stamm gescreent, ebenso am Y1090::&lambda; lysogenen Stamm. Auf jeder Testplatte bildeten sich 800 Plaques. Auf der Kontrollplatte waren keine Plaques. Die Plaques wurden einmal Plaque-gereinigt und ein einzelner Plaque wurde entnommen und in Suspensionsmedium (SM) suspendiert. Die 160 gereinigten Plaques wurden nach ihrer Größe in Gruppen eingeteilt: 20 kleine, 70 mittelere, 70 große. (Vier aus der "kleinen" Gruppe bildeten im Plaque-Reinigungsschritt keine Plaques.) Jeder von diesen wurde mit "Dot Plaque Assay" an einem E. coli Stamm, JM109, der mit dem Plasmid pJH370 transformiert war, das ein chimäres Protein exprimiert, das aus dem N-Terminus von cI fusioniert mit der Leucin-Zipper-Domäne von GCN4 besteht, getestet. Jeder Phage wurde noch einmal getestet an dem oben erwähnten Stamm, der im ersten Screening verwendet wurde, ebenso am &lambda; lysogene Stamm und am elterlichen Y1090 Stamm.
  • Phagen, die auf dem elterlichen Y1090 Stamm und am cI-Mycexprimierenden Stamm Plaques bildeten, aber weder auf dem lysogenen Stamm noch auf dem cI-GCN4-exprimierenden Stamm, wurden als "positiv" bezeichnet. Die vier Stämme wurden insgesammt zweimal auf "Positive" gescreent. Im "Dot Plaque Assay" ergaben 5-20µl typischerweise 50-100 Plaques. Wenn ein einziger, winziger Plaque auf cI-GCN4 zusehen war, wurde der Phage als "negativ" bezeichnet. In diesem Test wurden unter 156 getesteten Phagen 10 positive gefunden. Davon waren 3 aus der kleinen Gruppe und 7 aus der mittleren Gruppe. Diese "positiven" repräsentieren Proteinen, die mit c-myc in einer Art und Weise assozueren, die ausreicht, Homodimerbildung zu zerstören.
    • Beispiel 3 Identifizierung einer Verbindung, die c-Myc-Partner-Heterodimerisierung verhindert
  • E. coli-Wirtszellen, die ein Protein exprimieren, das als ein "mittlerer" c-myc-Partner identifiziert wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, werden weiters den Verbindungen W, X, Y und Z ausgesetzt, und der Effekt solcher Verbindungen auf die Fähigkeit von &lambda; in lytischer Art zu wachsen, wird bestimmt, indem man die Fähigkeit der Verbindung betrachtet, Plaquebildung auffesten Agarplatten zu verhindern.
  • Typische Ergebnisse aus solchen Experimenten werden in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1: Identifizierung von C-myc-Partnern
  • Die Ergebnisse der oben dargestellten Tabelle zeigen, daß in der Abwesenheit von Partnerprotein die Verbindung W keinen Einfluß auf die Fähigkeit des &lambda;cI-Proteins Dimere zu bilden und lytisches Wachstum zu unterdrücken, hat. Weiters hat die Verbindung W keinen Effekt auf die Fähigkeit des Partners Heterodimere mit dem myc-Fusionsprotein zu bilden. Daher wird die Verbindung W keine Verbindung von Interesse sein.
  • Verbindung X störte die Homodimerbildung und nicht die Heterodimerbildung. Daher ist die Verbindung X kein Inhibitor der c-myc-Funktion.
  • Verbindung Y ist ein Inhibitor der Heterodimerbildung. Verbindung Y störte die Homodimerbildung nicht, aber die Heterodimerbildung. Daher ist Verbindung Y eine Verbindung, die in vivo c-myc Wirkung zerstören könnte.
  • Alle hier zitierten Referenzen sind vollständig als Referenz eingeschlossen. Nachdem die Erfindung nun vollständig beschrieben wurde, werden jene mit Sachkenntnis verstehen, daß innerhalb eines großen Spielraums von Bedingungen, Parametern und ähnlichem gearbeitet werden kann, ohne den Geist und den Anwendungsbereich der Erfindung oder irgendeiner Ausführungsform davon zu beeinträchtigen.

Claims (11)

1. Verfahren zum Identifizieren und Klassifizieren eines Proteinpartners, welches Verfahren umfaßt:
(a) Transformation einer bakteriellen Wirtszelle mit einem Genkonstrukt, das zur Expression eines Fusionsproteins befähigt ist, worin das Fusionsprotein eine DNA-Bindungsdomäne und eine Dimerisationsdomäne enthält und worin das Fusionsprotein eine Homodimer ausbildet, das ein Wachstum eines lytischen Bakteriophagen unterdrückt;
(b) Transformation dieser Wirtszelle aus Teil (a) mit einem Genkonstrukt, das zur Expression des Proteinpartners befähigt ist;
(c) Vermehren dieser Wirtszelle aus (b) unter Bedingungen, welche das Fusionsprotein und den Proteinpartner exprimieren;
(d) Bestimmen des Vermögens des lytischen Bakteriophagen zum Induzieren einer Lysis der Wirtszelle; und
(e) Klassifizieren des Proteinpartners auf der Basis des Vorliegens oder Ausbleibens der Lysis.
2. Verfahren zum Identifizieren und Klassifizieren einer Verbindung als ein Inhibitor der Dimerisation eines Proteinpartners, welches Verfahren umfaßt:
(a) Transformation einer bakteriellen Wirtszelle mit einem Genkonstrukt, das zur Expression eines Fusionsproteins befähigt ist, worin das Fusionsprotein eine DNA-Bindungsdomäne und eine Dimerisationsdomäne enthält und worin das Fusionsprotein eine Homodimer ausbildet, das ein Wachstum eines lytischen Bakteriophagen unterdrückt;
(b) Transformation dieser Wirtszelle aus Teil (a) mit einem Genkonstrukt, das zur Expression des Proteinpartners befähigt ist;
(c) Vermehren dieser Wirtszelle aus (b) in Anwesenheit der genannten Verbindung und unter Bedingungen, welche das Fusionsprotein und den Proteinpartner exprimieren;
(d) Bestimmen des Vermögens der Verbindung zur Vermeidung eines durch den Proteinpartner induzierten Wachstums des lytischen Bakteriophagen und der Lysis der Wirtszelle; und
(e) Klassifizieren der Verbindung als ein Inhibitor der Proteinpartnerbildung auf der Basis des Vorliegens oder Ausbleibens der Lysis.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, worin die DNA-Bindungsdomäne die DNA-Bindungsdomäne des Bakteriophagen &lambda; cI -Repressorproteins ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die DNA-Bindungsdomäne des cI-Repressorproteins die N-terminalen 112 Aminosäuren des Repressorproteins sind
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, worin der Phage &lambda; ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, worin die Dimerisationsdomäne eine bHLH-Domäne ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die bHLH-Domäne von Myc stammt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das Myc c-Myc ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die bHLH-Domäne die Aminosäuren 255-410 von c-Myc sind.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, worin die Dimerisationsdomäne eine bZIP-Domäne.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, worin die Dimerisationsdomäne eine Zink-Fingerdomäne ist.
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