EP2625520A1 - Geeignete hepatozyten für in-vitro genotoxizitätstests - Google Patents

Geeignete hepatozyten für in-vitro genotoxizitätstests

Info

Publication number
EP2625520A1
EP2625520A1 EP11779357.0A EP11779357A EP2625520A1 EP 2625520 A1 EP2625520 A1 EP 2625520A1 EP 11779357 A EP11779357 A EP 11779357A EP 2625520 A1 EP2625520 A1 EP 2625520A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cell
proliferating hepatocytes
cells
proliferating
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP11779357.0A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Adrianus J. C. M. Braspenning
Stefan Heinz
Astrid NÖRENBERG
Nicola Hewitt
Jan-Heiner KÜPPER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Medicyte GmbH
Original Assignee
Medicyte GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Medicyte GmbH filed Critical Medicyte GmbH
Publication of EP2625520A1 publication Critical patent/EP2625520A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5067—Liver cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity

Definitions

  • the invention relates to a method for carrying out genotoxic (zi) itstestests of chemical, biological and
  • the method is particularly suitable for genotoxic testing of already known and new drugs and active ingredients and combinations thereof in humans and animals.
  • it is suitable to use chemicals or biological agents in
  • Medicines, chemicals or biological agents for example, in addition to a desired effect in terms of a therapy, also undesirable side effects such as Liver damage, damage to the heart muscle, neurotoxicity or teratogenicity unfold. It can lead to the loss of many cells of an organ to a degenerative organ disease such as a heart failure or a
  • the cause of this toxicity may be in damage or influence in principle of all
  • Compartments and functions of a cell lie, so for example in a damage of the cell membranes, an influence of physiological processes like cell respiration, intracellular transport, signal transduction and gene expression, to name but a few examples.
  • the invention relates to the direct or indirect action of agents on the genetic material DNA in human or animal cells and their suitable
  • cell lines have been established, these are cells that are unlimited on appropriate nutrient medium can reproduce and are immortal.
  • tumor cells or tumor-like cells and HeLa cells - cervical carcinoma cell line, COS cells, HEK-293 cells - kidney, Chinese hamster ovary (CHO) cells, HEp-2 - human epithelial laryngeal carcinoma cell line and the like are known Cell lines is for example in EP833934
  • Cell Such cell lines are used, for example, for drug testing.
  • the disadvantage of such cell lines are the genetic changes (such as point mutations, exchanges of chromosomal pieces
  • Chromosome sets (aneuploidy) as well as the tumor properties due to lack of contact inhibition, which enables the cells to grow in vitro on soft agar documents.
  • tumor cells have an unlimited ability to divide due to immortalization. It is known that the cells of such cell lines in the course of
  • Mutations already after about 60 cell divisions in the culture may be mutations that lead to activation of oncogenes or inactivation of tumor suppressor genes. In a cell population, therefore, those cells can prevail which have an increased cell division activity due to the accumulated mutations. This selection process corresponds to precancerous lesions during tumorigenesis;
  • the commercially available cell lines usually have an unknown number of duplications already behind them, if they are not already from malignant tumor cells
  • Point mutation in a gene are no longer able to synthesize a particular amino acid (auxotrophic mutants) applied to a non-containing this amino acid medium (agar). Since these bacteria depend on the persistence of this amino acid, they would die or could not multiply on this deficiency medium. Now you expose the bacteria to the potential mutagen by
  • Bacteria have grown and have regained the ability to synthesize the corresponding amino acid. These are so-called revertants in which the Auxotrophy leading to point mutation in a gene was reversed.
  • aberrant chromosomal aberrations e.g. examined by karyotype analyzes.
  • This method allows a variety of chromosome aberrations to be visualized, e.g. the development of dicentric chromosomes, chromosomal breaks, and sister chromosome exchanges (Morita et al., 1989).
  • Genotoxicity testing of 776 chemical substances with a combination of bacterial mutation test (Arnes test) and chromosome aberration test having the best sensitivity for the detection of clastogenic agents (Broschinski et al., 1998).
  • hepatocytes such as those found in an intact liver, possess various functions in vivo that are important for this biotransformation of substances in the diet, but also of drugs or toxins (Elaut et al., 2006) Biotransformation important are the Phase I enzymes of the Cytochrome P 450 Systems.
  • Isoenyzme are z.T. Polymorphisms are known, which may be responsible for the individual variability in the hepatotoxic effect of drugs.
  • the CYP 450 enzymes are oxidoreductases that cause the oxidative degradation or metabolism of many substances such as u.a. also cause drugs.
  • Phase II enzymes e.g. the N-acetyltransferases [NATs], as well as UDP-glucuronyltransferases and sulfotransferases.
  • NATs N-acetyltransferases
  • the functionality of the CYP 450 systems, the phase II enzymes and other liver functions is of crucial importance.
  • the Arnes test is usually performed in combination with a biotransformation of the substance to be tested by liver enzymes.
  • S9 mix is used, which is a mixture of several liver enzymes to simulate a liver
  • comet assay also called single cell gel electrophoresis (Singh et al., 1988). The principle of the comet assay is based on the fact that cells embedded in agarose are lysed. The DNA of the cells is then exposed to an electric field. If the DNA has been damaged by a substance or physical action, it may leak out of the nucleus and migrate to the anode, while undamaged chromosomal DNA can not.
  • the damaged cells which were previously stained with fluorescent dyes such as ethidium bromide, now appear with a tail of DNA fragments, giving them the appearance of a comet.
  • the length of the comet's tail is a measure of DNA damage.
  • the comet assay measures the genesis of DNA strand breaks, but does not allow a direct statement about the underlying DNA damage.
  • Genotoxicity test is the so-called micronucleus test, with which cytogenetic changes much easier and capture faster than with the
  • Micronuclei contain components of the nucleus that are different because of their molecular structure
  • Actions are not distributed to the daughter cell nuclei but appear as chromatin particles in the cytoplasm.
  • the number or frequency of micronuclei is a measure of
  • Micronuclei are quantified in binuclear cells, while "old" micronuclei, which are the background of the measurement, are determined in mononuclear cells (Fenech and Morley, 1985).
  • micronucleus test is often used in in the Chinese hamster V79 lung fibroblast line or in peripheral blood human lymphocytes. In many studies, different tests are usually combined in order to obtain the most reliable information: Rossi and colleagues, for example, are investigating the possible genotoxicity of estrogens using both the Arnes test, the chromosomal aberration test and the
  • Genotoxicity assay based on a specific CHO cell line containing human chromosome 11. This hybrid cell line expresses the human CD59 protein presented on the cell surface. Mutations can lead to the loss of presentation on the surface, which can be detected by suitable immunological detection methods.
  • US patent application US2008 / 0138820 AI describes a multi-parameter genotoxicity assay based on Micronucleus tests.
  • a construct is introduced into a target cell line which constitutively expresses a fusion protein from a centromere protein with GFP.
  • fusion micronuclei are made detectable, which have arisen.
  • Expressionskonstrukt is the coding sequence of the nitroreductase, whose enzyme activity by a
  • Nitroreductase is operably linked to a promoter which is activated by DNA damage (e.g., the GADD45a promoter), then genotoxic effects can be detected which are clastogenic.
  • a promoter which is activated by DNA damage e.g., the GADD45a promoter
  • genotoxic effects can be detected which are clastogenic.
  • additional cellular parameters such as proliferation index and zyotoxicity, an algorithm suitable for the respective cell system for multi-parameter analysis can potentially become more genotoxic
  • the object of the present invention is to provide suitable hepatocytes for performing in vitro genotoxicity tests.
  • proliferating hepatocytes according to the invention are specified in that they have at least four of at least six different phase I enzyme functions during the
  • proliferative phase preferably selected from the group CYP -1A2, -2C9, -2C19, -2D6, -2E1 and 3A4, which account for approximately 90% of all oxidative metabolizations of
  • Phase I enzymes are included, in particular containing ten different Phase I enzymes, preferably CYP -1A1, -1A2, -2A6, -2B6, -2C8, -2C9, - 2C19, -2D6, -2E1, -3A4, especially thirteen
  • phase I enzymes in particular CYP -1A1, -1A2, -2A6, -2B6, -2C8, -2C9, -2C19, -2D6, -2E1, -3A4, -3A5, -3A7, -4A11. Furthermore, the problem of "false positive" and false results in the prior art is advantageously completely solved since these proliferating hepatocytes:
  • Phase I has activities that last for several days
  • d. has an enzyme activity which is inducible by reagents
  • hepatocytes The enrichment of such suitable hepatocytes is described, for example, in WO2009030217 of the Applicant, which can preferably be obtained from primary cells. Furthermore, proliferating hepatocytes may also be from others Progenitor cells are obtained, such as stem cells, adult cells and other differentiable cells.
  • Body tissues derived explants with normal, i. non-degenerate cells from multicellular organisms, e.g. humans, mammals or suitable donors.
  • Primary cell cultures are cultured primary cells until the first passage. Primary cells have natural differentiation properties and are mortal.
  • telomere shortening of chromosomal telomeres compensated.
  • telomerase a sequence of chromosomal telomeres compensated.
  • telomere loss through, for example, telomerase have an unlimited amount
  • b2. is inactivated with at least one cellular factor that induces cell division arrest, and / or
  • human primary liver cells are preferred.
  • Used starting material e.g. can be obtained by biopsy.
  • more than ten additional passages can be performed compared to primary cells, more than 20-60 additional passages.
  • Obtained hepatocytes that are highly suitable for performing genotoxicity tests.
  • cells can be obtained which do not adopt properties of tumor cells, in particular of malignant tumor cells, such as growth in soft agar or tumor growth in vivo (the growth of tumors in xenograft animal models).
  • the cultivation of such cells is carried out on culture media known to those skilled in the art.
  • a proliferation gene is one that enhances cell division and a limited extended cell division capacity in the primary cell
  • the proliferation gene is preferred
  • E6 and E7 of papillomaviruses e.g. HPV (human papilloma virus) and BPV (bovine papilloma virus); the large and small TAg of polyomaviruses, e.g. SV40, JK virus and BC virus; the
  • Proteins E1A and E1B of adenoviruses Proteins E1A and E1B of adenoviruses, EBNA proteins of
  • Epstein Barr virus (EBV); and the proliferation gene of HTLV and herpesvirus Saimiri and in each case their coding proteins or their chimeras or selected from the group of
  • cellular proliferation genes in particular the following classes of genes: myc, jun, ras, src, fyg, myb, E2F and Mdm2 and TERT (telomerase catalytic subunit), preferably the human telomerase hTERT).
  • viral are preferred
  • Proliferation genes particularly preferred are E6 and E7 of HPV or BPV.
  • proliferation genes of HPV types can be used, which are associated with malignant
  • HPV16 and HPV18 HPV16 and HPV18
  • HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, and 82 HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, and 82 but also the
  • Proliferation genes E6 and E7 are used by so-called "low-risk" HPVs, and well-known examples are HPV types 6 and 11, other HPV types of the low-risk group are HPV 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, and 81. Furthermore, the
  • Proliferation increase can be seen above all in the inactivation of the pRB pathway.
  • proliferation genes of different serotypes of a virus species or different virus species are combined or even chimeric proliferation genes of different
  • Serotypes of a virus species or different virus species are produced and used.
  • an E6 domain in a chimeric gene may be e.g.
  • the proliferation genes may also be truncated or have one or more base exchanges, without departing from the scope of the invention.
  • the proliferation genes mentioned above are preferred
  • the proliferation gene may also be the subject of a synthetic or engineered gene sequence.
  • Receptors are included or receptor-independent.
  • the aforementioned gene functions can also be transmitted via viral vectors in target cells. Examples are retroviral vectors, AAV vectors, adenovirus vectors and HSV vectors, to name but a few examples of vectors (review of viral vectors in: Lundstrom, K. 2004.
  • cellular proliferation genes can be controlled by strong or weak constitutive promoters of
  • Tissue-specific promoters, inducible promoters (Meyer-Ficca, ML et al., 2004. Anal. Biochem. 334: 9-19) or the expression cassettes may be flanked by specific sequences for molecular excision systems. Examples are the Cre / Lox system (US Patent 4,959,317), the application of which results in the molecular removal of the expression constructs from the genome of the target cells.
  • the gene products of the Proliferation genes also directly into the target cell as such or functionally by means of a fusion protein
  • messenger proteins such as VP22, HIV TAT (Suzuki et al., 277 J. Biol. Chem. 2437-2443 2002 and Futaki 245 Int. J. Pharmaceut 1-7 (2002 ), (HIV) REV, antennapedia polypeptide (W097 / 12912 and WO99 / 11809) or penetratin (Derossi et al., 8 Trends Cell Biol., 84-87 (1998), Engrailed (Gherbassi, D. & Simon, HHJ Neural Transm. Suppl 47-55 (2006), Morgan, R. 580 FEBS Lett., 2531-2533 (2006), Han, K. et al., 10 mol.
  • transport proteins such as VP22, HIV TAT (Suzuki et al., 277 J. Biol. Chem. 2437-2443 2002 and Futaki 245 Int. J. Pharmaceut 1-7 (2002 ), (HIV) REV, antennapedia polypeptid
  • the invention also relates to such proliferating heptocets which are transiently immortalized, preferably by means of i.) A polypeptide having a cell immortalization activity,
  • Such a polypeptide having cell immortalization activity may be e.g. from the above
  • Such a polypeptide that synthesizes telomeric DNA at chromosomal terminals is preferably selected from the
  • telomerase telomerase reverse transcriptase
  • pI40 telomerase reverse transcriptase
  • pI05 telomerase pI05
  • p 48 telomerase reverse transcriptase
  • EP 1175436 Bl for the preparation of such polypeptides.
  • cell division arrest is activated in the course of the senescence program (overview in: Ben Porath, I. and RA Vineyard. 2005. Int. J. Biochem. Cell Biol. 37: 961-976.) Or the cell division arrest activated in cells as part of the differentiation program.
  • cardiomyocytes are known to share their ability to divide shortly after birth
  • p53 protein p53, which is important for the control of the cell cycle, as well as all proteins which bind directly to p53, upstream (hereinafter referred to as "p53")
  • the protein pl6 / INK4a which is important for the control of the cell cycle, as well as all proteins directly binding to pl6 / INK4a, can be used
  • upstream and / or downstream (downstream) downstream factors of this pl6 pathway are turned off to achieve the goal of extended cell division capacity
  • the protein pRb which is important for the control of the cell cycle, or the others
  • upstream members of the pRb family (e.g., pl07, pl30), as well as all proteins directly attached to members of the pRb family, upstream (hereinafter upstream) and / or
  • Downstream (downstream) downstream factors of this pRb pathway are switched off to achieve the goal of extended cell division capacity (review of the pRb pathway in: Godefroy, N. et al., 2006 Apoptosis 11: 659-661, Seville, LL et al 2005. Curr. Cancer Drug Targets, 5: 159-170).
  • cellular factors e.g. p53, pRB, pI6, etc.
  • p53, pRB, pI6, etc. may e.g. by expression of dominant negative mutants of the respective factors (Herskowitz, I. 1987. Nature 329: 219-222; Küpper, J.H., et al., 1995. Biochimie 77: 450-455), by inhibiting gene expression thereof
  • the inactivation can also be effected by the action of specific antibodies (eg single-chain antibodies, intra-bodies etc., overview in: Leath, CA, III, et al., 2004. Int.J.Oncol., 24: 765-771; Stocks, MR 2004. Drug Discov., Today 9: 960-966).
  • the inactivation may also be due to the use of chemical inhibitors of cellular
  • Factors occur, for example, by using kinase inhibitors.
  • kinase inhibitor is the substance
  • Imatinib is a specific inhibitor that inhibits the activity of tyrosine kinase ABL in
  • the invention therefore relates in a preferred Embodiment also a method of making an assay, comprising the following steps:
  • agent means any one of
  • DNA damage such as nucleotide oxidation, deamination, base loss, strand breaks, adducts, DNA-DNA crosslinks.
  • Agents that break DNA such as nucleotide oxidation, deamination, base loss, strand breaks, adducts, DNA-DNA crosslinks.
  • An indirect genotoxic effect of an agent is, for example, the damage to the spindle fiber apparatus, which is necessary for the separation of chromosomes or sister chromatids and where it due to the damage, for example, to chromosome breaks or irregular Chromosome distributions on the daughter cells at the
  • Influencing chromosomal distribution is said to be an aneugenic
  • the detection of a positive genotoxicity event can be done with a detection reagent in the broadest sense, e.g. by means of a fluorescently labeled antibody or the like.
  • a detection reagent in the broadest sense, e.g. by means of a fluorescently labeled antibody or the like.
  • suitable bioanalytical methods such as
  • solid support includes embodiments such as a filter, a membrane, a magnetic bead, a
  • Silicon wafers glass, plastic, metal, a chip, a mass spectrometric target, or a matrix of e.g.
  • Proteins or other matrices such as PEG etc.
  • array corresponds to a grid that has the size of a microtiter plate (96 wells, 384 wells or more), a silicon wafer, a chip, a mass spectrometric target or a matrix.
  • the carrier material may be in the form of spherical, unaggregated particles, so-called beads, fibers or a
  • Membrane are present, with a porosity of the matrix the
  • the porosity for example, in the usual manner by adding pore formers, such as
  • Cyclohexanol or 1-dodecanol can be achieved to the reaction mixture of the suspension.
  • proliferatable hepatocytes are prepared by treating primary human hepatocytes with the method described in WO 2009030217A2.
  • the induction of CYP3A4 activity at various Doubling numbers (PD 23, 32 and 36) measured.
  • the cells were seeded at a density of 2.3 ⁇ 10 4 cells / cm on collagen-coated cell culture vessels and cultured for 4 days. Subsequently, the cells were treated with rifampicin (20 ⁇ ) daily for three days before the CYP3A4
  • Genotoxicity was quantified by the fraction of induced micronuclei versus control by a FACS assay. Specifically, the positive substances mitomycin C (MMC) and cyclophosphamide (CPA) and the negative substance curcurmin were tested. CPA must first be metabolized around MMC and cyclophosphamide
  • Micronucleus test with V79 cells detected exclusively if the substance was previously reacted with a CYP enzyme extract (S9 mix). Curcurmin is classified as false positive in the standard genotoxicity tests based on rodent cell lines.
  • Hepatocytes were plated at a density of 3000 cells / cm 2 on collagen-coated cell culture vessels and with the above-mentioned substances in various concentrations
  • OECD a cytotoxicity of 50% was tested, which was previously determined for each substance via an MTT viability determination. Since the rate of division of hepatocytes is 48h lower than for cell line V79, longer incubation and recovery periods have become available for the treatments
  • Curcurmin did not induce increased microkernel formation and was therefore correctly classified as a negative substance (FIG. 4).
  • Carcinogens are mutagens: a simple test system combining liver homogenates for activation and bacteria for detection. Proc. Natl. Acad. Be. U.S.A. 70, 2281-2285.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung von Genotoxi (zi) tätstests von chemischen, biologischen und physikalischen Wirkstoffen bzw. Agenzien mit Hilfe von Zellkultursystemen proliferierender physiologisch aktiver Leberzellen.

Description

Titel: Geeignete Hepatozyten für in-vitro Genotoxitätstests
Beschreibung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung von Genotoxi ( zi ) tätstests von chemischen, biologischen und
physikalischen Wirkstoffen bzw. Agenzien mit Hilfe von
Zellkultursystemen proliferierender physiologisch aktiver Leberzellen .
Das Verfahren ist besonders geeignet für genotoxische Testung bereits bekannter sowie neuer Medikamente und Wirkstoffe sowie Kombinationen davon bei Mensch und Tier. Darüber hinaus eignet es sich, Chemikalien oder biologische Wirkstoffe in
Lebensmitteln, Kosmetika, Textilien, Werkstoffen und sonstigen Materialien auf ihre genotoxische Wirkung bei Mensch und Tier zu testen.
In vielen Industriebranchen wie bspw. der Pharma-, Kosmetik- Lebensmittel- und Chemischen Industrie werden ständig neue Chemikalien und/oder biologische Wirkstoffe und Kombinationen davon entwickelt, deren mögliche gesundheitsgefährdende
Effekte zumeist unbekannt sind. Dabei können sich völlig unterschiedliche Wirkungen bei Mensch oder Tier ergeben.
Medikamente, Chemikalien oder biologische Wirkstoffe können beispielsweise, neben einer erwünschten Wirkung im Sinne einer Therapie, auch unerwünschte Nebenwirkungen wie LeberSchädigung, Schädigung des Herzmuskels, Neurotoxizität oder Teratogenität entfalten. Dabei kann es zum Verlust von vielen Zellen eines Organs bis hin zu einer degenerativen Organerkrankung wie z.B. einem Herzversagen oder einer
LeberSchädigung kommen. Die Ursache dieser Toxizität kann in einer Schädigung oder Beeinflussung prinzipiell aller
Kompartimente und Funktionen einer Zelle liegen, also bspw. in einer Schädigung der Zellmembranen, einer Beeinflussung von physiologischen Prozessen wie Zellatmung, intrazellulärer Transport, Signaltransduktion und Genexpression, um nur einige Beispiele zu nennen. Die Erfindung betrifft die direkte oder indirekte Wirkung von Agenzien auf die Erbsubstanz DNA in menschlichen oder tierischen Zellen und deren geeignete
Testung, mittels so genannter Genotoxitätstests .
Die Bereitstellung von geeigneten Zellen zur Testung ist eine medizinische und diagnostische Herausforderung, insbesondere in der Entwicklung von in-vitro Zellsystemen einschließlich zugehöriger Zellkulturen.
Daher besteht ein großes Bedürfnis Zellkulturen/Zellsysteme zu etablieren, die möglichst ähnlich zu humanen Zellen sind, so dass eine valide in-vitro Genotoxität-Testung erfolgen kann.
Im Stand der Technik haben sich Zelllinien etabliert, dies sind Zellen, die sich auf entsprechendem Nährboden unbegrenzt fortpflanzen können und immortal sind. Bekannt sind insbesondere Tumorzellen oder tumorähnliche Zellen sowie HeLa- Zellen - Cervix-Karzinom Zelllinie, COS-Zellen, HEK-293 Zellen - Niere, Chinese Hamster Ovary (CHO) Zellen, HEp-2 - humane epitheliale Larynxkarzinom-Zelllinie u.v.a. Die Herstellung von solchen Zelllinien ist beispielsweise in EP833934
(Crucell) beschrieben. Solche Zelllinien werden beispielsweise zur Medikamententestung eingesetzt. Nachteilig an solchen Zelllinien sind jedoch die genetischen Veränderungen (solche wie Punktmutationen, Austausche von Chromosomenstücken
(Rearrangements ) , Erhöhung der Kopienzahl von Genen
(Genamplifikation) und sogar Veränderungen der
Chromosomensätze (Aneuploidie ) ) sowie die Tumor-Eigenschaften infolge fehlender KontaktInhibition, wodurch die Zellen zu In- vitro Wachstum auf Soft Agar Unterlagen befähigt sind.
Tumorzellen haben zusätzlich eine durch Immortalsierung entstehende unbegrenzter Teilungsfähigkeit. Es ist bekannt, dass sich die Zellen solcher Zelllinien im Lauf der
Kultivierung durch spontane Mutationen allmählich verändern und sich zu einer malignen Zellpopulation entwickeln können und genetisch instabil sind. Nach Erkenntnis der Erfinder tritt hierbei eine kritische Schwelle von angesammelten
Mutationen schon nach etwa 60 Zellteilungen in der Kultur ein. Dies können Mutationen sein, die zur Aktivierung von Onkogenen oder Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen führen. In einer Zellpopulation können sich daher solche Zellen durchsetzen, die aufgrund der angesammelten Mutationen eine erhöhte Zellteilungsaktivität haben. Dieser Selekt ionsprozess entspricht der Präkanzerose bei der Tumorentstehung;
zusätzlich haben die im Handel erhältlichen Zelllinien zumeist eine nicht bekannte Anzahl von Verdopplungen bereits hinter sich, falls sie nicht ohnehin von malignen Tumorzellen
abstammen .
Ferner sind im Stand der Technik folgende Genotoxität stest s beschrieben:
Beim sogenannten Arnes-Test (Arnes et al . , 1973a; Arnes et al . , 1973b) werden Bakterien, die durch Mutation z. B.
Punktmutation in einem Gen nicht mehr in der Lage sind, eine bestimmte Aminosäure zu synthetisieren (auxotrophe Mutanten) auf einen diese Aminosäure nicht enthaltenden Nährboden (Agar) aufgebracht. Da diese Bakterien zur Fortexistenz auf diese Aminosäure angewiesen sind, würden sie absterben bzw. könnten sich nicht auf diesem Mangelmedium vermehren. Nun setzt man die Bakterien dem potentiellen Mutagen aus, indem man
beispielsweise ein damit getränktes Filterpapier auf den
Nährboden auflegt. Bilden sich nach dem anschließenden
Bebrüten sogenannte Bakterien-Kolonien, so sind einzelne
Bakterien gewachsen und haben die Fähigkeit zur Synthese der entsprechenden Aminosäure zurückerlangt. Es handelt sich hierbei um sogenannte Revertanten, bei denen die zur Auxotrophie führende Punktmutation in einem Gen rückgängig gemacht wurde .
Beim Chromosomen Aberrationstest werden die zu testenden
Substanzen mit Zellen inkubiert. Nach einer definierten
Inkubationszeit werden auftretende chromosomale Aberrationen z.B. durch Karyotypanalysen untersucht. Dieses Verfahren erlaubt, eine Vielzahl von Chromosomenaberrationen sichtbar zu machen wie z.B. die Entstehung dizentrischer Chromosomen, Chromsomenbrüche und Schwesterchromosomenaustausche (Morita et al . , 1989) .
Broschinski und Kollegen berichten die Routine
Genotoxizitätstestung von 776 chemischen Substanzen, wobei eine Kombination aus Bakteriellem Mutationstest (Arnes Test) und Chromosomen Aberrationstest die beste Sensitivität zur Detektion klastogener Agenzien hatte (Broschinski et al . , 1998) .
Viele Agenzien entfalten erst eine genotoxische Wirkung in einem Tier oder beim Menschen, wenn diese durch Leberenzyme chemisch modifiziert werden. Differenzierte Hepatozyten, wie sie in einer intakten Leber vorliegen, verfügen in vivo über verschiedene Funktionen, welche für diese Biotransformation von Stoffen in der Nahrung, aber auch von Medikamenten oder Toxinen wichtig sind (Übersicht in (Elaut et al . , 2006) . Für die Biotransformation wichtig sind die Phase I Enzyme des Cytochrom P 450 Systems. Es gibt beim Menschen zahlreiche Isoenzyme wie CYP 1A1, CYP 1A2, CYP 2A6, CYP 2B6, CYP 2C8, CYP 2C9, CYP 2C19, CYP 2D6, CYP 2E1, CYP 3A4, CYP 3A5, CYP 3A7, CYP 4A11, die unterschiedliche Funktionen haben. Bei den
Isoenyzme sind z.T. Polymorphismen bekannt, welche für die individuelle Variabilität in der lebertoxischen Wirkung von Medikamenten verantwortlich sein können. Es handelt sich bei den CYP 450 Enyzmen um Oxidoreduktasen, die einen oxidativen Abbau bzw. Metabolisierung zahlreicher Substanzen wie u.a. auch Arzneistoffe bewirken.
Neben den Phase I Enzymen existieren die Phase II Enzyme, z.B. die N-Acetyltransfereasen [NATs], sowie UDP- Glucoronyltransferasen und Sulfotransferasen .
Für die Beurteilung der möglichen Lebertoxi z ität von
Wirkstoffkandidaten aber auch allgemein von Chemikalien ist die Funktionalität der CYP 450 Systeme, der Phase II Enzyme sowie weiterer Leberfunktionen von entscheidender Bedeutung. Um diesem Umstand Rechnung zu tragen, wird der Arnes Test meistens in Kombination mit einer Biotransformation der zu testenden Substanz durch Leberenzyme durchgeführt. Dabei wird meist der sogenannte S9-Mix eingesetzt, welcher eine Mischung aus mehreren Leberenzymen zur Simulation einer Leber
darstellt. Die Abkürzung "S9" kommt von Supernatant
(Überstand) und der Zentrifugation des Leberzellextraktes bei 9000g. So berichten De Flora et al . , dass die Substanz Phenacetin nur dann im Arnes Test positiv getestet wird, wenn eine Inkubation von Phenacetin mit der S9 Fraktion von Hamster Leber
durchgeführt wird (De Flora S. et al . , 1985) . Ausschließlich durch die in Leberzellen aktiven Enzyme wurde diese Substanz in eine im Arnes Test detektierbare mutagene Form überführt. Eine weitere Möglichkeit zur Detektion von DNA-schädigenden Wirkungen von Agenzien ist der sogenannte Comet Assay, auch Einzelzellgelelektrophorese genannt (Singh et al . , 1988) . Das Prinzip des Comet Assays beruht darauf, dass in Agarose eingebettete Zellen lysiert werden. Die DNA der Zellen wird dann einem elektrischen Feld ausgesetzt. Wurde die DNA durch eine Substanz oder physikalische Einwirkung geschädigt, kann sie aus dem Zellkern austreten und zur Anode wandern, während ungeschädigte chromosomale DNA dies nicht kann. Unter dem UV- Mikroskop erscheinen die beschädigten Zellen, welche vorher mit Fluoreszenzfarbstoffen wie Ethidiumbromid angefärbt wurden, nun mit einem Schweif aus DNA Bruchstücken, der ihnen das Aussehen eines Kometen gibt. Die Länge des Kometenschweifs ist ein Maß für die DNA Schädigung. Der Comet Assay misst die Entstehung von DNA Strangbrüchen, erlaubt aber keine direkte Aussage über die zugrunde liegenden DNA Schäden.
Ein in den letzten Jahren zunehmend genutzter
Genotoxizitätstest ist der sogenannte Mikronukleustest , mit dem sich zytogenetische Veränderungen wesentlich einfacher und schneller erfassen lassen als mit dem
Chromosomenaberrationstest. Mikronuklei enthalten Bestandteile des Zellkernes, die wegen unterschiedlicher molekularer
Ursachen (Chromsomenschädigung durch klastogene Einwirkungen, Schädigung der Chromosomensegregation durch aneugene
Einwirkungen) nicht auf die Tochterzeilkerne verteilt werden sondern als Chromatinpartikel im Zytoplasma erscheinen. Die Anzahl bzw. Häufigkeit von Mikronuklei ist ein Maß für
genetische Instabilität von Zellen. Zur Neuentstehung von Mikronuklei ist im Allgemeinen eine Zellteilung notwendig. In Zellen, die durch Cytochalasin B eine Hemmung der Mitose haben, können neu durch Testbehandlungen entstandene
Mikronuklei in binukleären Zellen quantifziert werden, während „alte" Mikronuklei, die den Background der Messung darstellen, in mononukleären Zellen bestimmt werden (Fenech and Morley, 1985) .
Seit der Einführung dieser Technik werden Mikronuklei als biologische Indikatoren für Genotoxizität zunehmend
untersucht. Dies liegt vor allem daran, dass die
Mikronukleusauswertung im Gegensatz zur Auswertung der
dizentrischen oder sonst wie aberranten Chromosomen relativ einfach und schnell ist. Darüber hinaus ist die
Automatisierung der Zählung von Mikronuklei leichter
durchführbar, als dies bei Chromosomenaberrationen oder beim Kometassay der Fall ist. Der Mikronukleustest wird häufig in in der Lungenfibroblastenlinie V79 des Chinesischen Hamsters oder in humanen Lymphozyten aus peripherem Blut durchgeführt. Bei vielen Untersuchungen werden üblicherweise verschiedene Tests kombiniert, um eine möglichst zuverlässige Aussage zu erhalten: so führen z.B. Rossi und Kollegen die Untersuchung einer möglichen Genotoxizität von Estrogenen sowohl mit dem Arnes Test, dem Chromosomenaberrationstest als auch dem
Mikronukleustest durch (Rossi et al . , 2007) .
Die WO2004/034013 beschreibt einen alternativen In-vitro
Genotoxizitätsassay auf der Basis einer speziellen CHO- Zelllinie, welche das humane Chromosom 11 enthält. Diese hybride Zelllinie exprimiert das humane CD59 Protein, welches auf der Zelloberfläche präsentiert wird. Durch Mutationen kann es zum Verlust der Präsentation auf der Oberfläche kommen, was über geeignete immunologische Nachweisverfahren detektiert werden kann.
Das Problem dieser Tests ist, dass sie bis heute nicht
zuverlässig genug sind; darüber hinaus sind sie zeitaufwändig und teuer. In der Pharmaindustrie entstehen hohe Kosten für Genotoxizitätsassays . Nicht präzise vorhergesagte
Genotoxizität machen nach Schätzungen des Cambridge Healthtech Advances Life Sciences Bericht vom Dezember 2004 ca. 30 % der sogenannten Drug Failure Kosten aus.
Die US Patentanmeldung US2008/0138820 AI beschreibt einen Multiparameter Genotoxizitätsassay auf der Basis des Mikronukleustests . Dabei wird ein Konstrukt in eine Target zelllinie eingebracht, welches ein Fusionsprotein aus einem Centromerprotein mit GFP konstitutiv exprimiert. Durch diese Fusion werden Mikronuklei detektierbar gemacht, welche aneugen entstanden sind. Auf einem zweiten
Expressionskonstrukt befindet sich die kodierende Sequenz der Nitroreduktase , deren Enzymaktivität durch eine
Fluoreszenzumwandlung des synthetischen Substrats CytoCy5S (GE Healthcare) detektierbar gemacht werden kann. Wenn die
Nitroreduktase operativ mit einem Promotor verknüpft ist, welcher durch DNA Schädigung aktiviert wird (z.B. der GADD45a Promotor), dann können genotoxische Wirkungen detektierbar gemacht werden, die klastogen sind. Durch Hinzuziehen weiterer zelluläre Parameter wie Proliferationsindex und Zyotoxizität kann ein für das jeweilige Zellsystem geeigneter Algorithmus für eine Mulitparameteranalyse potentiell genotoxischer
Substanzen angewendet werden.
Es besteht jedoch ein großer Bedarf, geeignete Zellen für in- vitro Genotoxitätstests zu verwenden, die humanen Zellen sehr nahe kommen und eine vorteilhafte in-vitro Stabilität und metabolische Funktionalität aufweisen.
Insbesondere bei Genotoxitätstests besteht im Stand der
Technik das Problem, dass bei Zelllinien der Metabolismus von humanen Hepatozyten nicht hinreichend berücksichtigt wird und daher die getesteten Agenzien „false-positive" oder gar falsche Ergebnisse in einer in-vitro Testung liefern.
Daher besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung geeigneter Hepatozyten zur Durchführung von in- vitro Genotoxitätstests .
Die Aufgabe wird durch den Anspruch 1 vollständig gelöst.
Proliferierende Hepatozyten weisen überraschender Weise folgende Vorteile auf:
Die physiologisch relevanten Eigenschaften der
erfindungsgemäßen proliferierenden Hepatozyten sind dadurch spezifiziert, dass sie mindestens vier von mindestens sechs verschiedenen Phase I Enzymfunktionen auch während der
proliferativen Phase verfügen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe CYP -1A2, -2C9, -2C19, -2D6, -2E1 und - 3A4, die für ca. 90 % sämtlicher oxidativen Metabolisierungen von
Medikamenten verantwortlich sind (Arimoto, 2006), daher insbesondere auch mehr als 6 verschiedene Phase I Enzyme enthalten, insbesondere zehn verschiedene Phase I Enzyme enthalten, vorzugsweise CYP -1A1, -1A2, -2A6, -2B6, -2C8, - 2C9, -2C19, -2D6, -2E1, -3A4, insbesondere dreizehn
verschiedene Phase I Enzyme enthalten, insbesondere CYP -1A1, -1A2, -2A6, -2B6, -2C8, -2C9, -2C19, -2D6, -2E1, -3A4, -3A5, -3A7, -4A11. Weiterhin wird vorteilhaft das Problem der „false positive" und falschen Ergebnisse im Stand der Technik vollständig gelöst, da diese proliferierende Hepatozyten:
a. während der Proliferation aktive Phase I und II
Aktivitäten aufweisen,
b. in der Enzymausstattung signifikante Aktivitäten
aufweisen, die in vivo Bedingungen entsprechen,
c. Phase I Aktivitäten aufweist, die über mehrere Tage
aufrecht erhalten bleibt,
d. eine Enzymaktivität besitzt, welche mittels Reagenzien induzierbar ist,
e. eine externe Metabolisierung mittels Mikrosomen folglich entfällt ,
f. „false positive" Ergebnisse durch reaktive Agenzien, die nicht zellgängig sind, erheblich reduziert sind,
g. nach Aufnahme des Agens in die Zelle das Agens selbst als auch der entstehenden Metaboliten auf die DNA wirken können, und daher falsch negative Ergebnisse durch nicht adäquate Metabolisierung der Testsubstanz entfallen oder deutlich reduziert sind.
Die Anreicherung solcher geeigneter Hepatozyten wird z.B. in der WO2009030217 der Anmelderin beschrieben, die vorzugsweise aus primären Zellen erhalten werden können. Weiterhin können proliferierende Hepatozyten ebenfalls aus anderen Vorläuferzellen erhalten werden, wie Stammzellen, adulten Zellen und anderen differenzierbaren Zellen.
Unter dem Begriff „primäre Zellen" werden im Rahmen der
Erfindung direkt aus Körperflüssigkeiten oder aus
Körpergeweben gewonnene Explantate mit normalen, d.h. nicht entarteten Zellen, von vielzelligen Organismen, wie z.B. dem Menschen, Säugetieren bzw. geeigneten Donoren verstanden.
Primäre Zellkulturen sind in Kultur genommene primäre Zellen bis zur ersten Passage. Primäre Zellen haben die natürlichen Differenzierungseigenschaften und sind mortal.
Um Zellen in-vitro aufrecht zu erhalten, muss ein Verfahren verwendet werden, welches die bei jeder Zellteilung
auftretende Verkürzung der chromosomalen Telomere kompensiert. Eine Möglichkeit dazu ist die Verwendung der Telomerase
(Harley, C. B. and B. Villeponteau . 1995. Telomeres and telomerase in aging and Cancer. Curr . Opin . Genet . Dev . 5:249- 255.) . Zellen, welche den Telomerverlust beispielsweise durch Telomerase kompensieren können, haben eine unbegrenzte
Teilungsfähigkeit bzw. Immortalität . Dabei treten jedoch im Lauf der Zellteilungen nachteilig unvermeidlicherweise
Mutationen auf, die früher oder später zur Krebsentstehung führen müssen. Zur in-vitro Aufrechterhaltung von humanen primären oder differenzierbaren Zellen können folgende Schritte durchgeführt werden :
Primäre oder differenzierbare Zellen werden
a . ) isoliert ,
bl . ) mit mindestens einem Proliferationsgen oder dessen
Genprodukt in die Zelle funktionell eingebracht wird
und / oder
b2. ) mit mindestens einem zellulären Faktor inaktiviert, der einen Zellteilungsarrest induziert, und / oder
b3. ) transient immortalisiert
c.) kultiviert und / oder passagiert.
Bevorzugt werden jedoch humane primäre Leberzellen als
Ausgangsmaterial verwendet, die z.B. mittels Biopsie erhalten werden können.
Vorzugsweise können mehr als zehn zusätzliche Passagen im Vergleich zu primären Zellen, mehr als 20 - 60 zusätzliche Passagen, durchgeführt werden.
Erfindungsgemäß werden wie vorstehend proliferierende
Hepatozyten erhalten, die hochgradig für die Durchführung von Genotoxitätstests geeignet sind. Besonders vorteilhaft können Zellen erhalten werden, die keine Eigenschaften von Tumorzellen annehmen, insbesondere von malignen Tumorzellen, wie z.B. Wachstum in Soft Agar oder Tumorwachstum in vivo (das Anwachsen von Tumoren in Xenograft- Tiermodellen) .
Die Kultivierung solcher Zellen erfolgt auf für den Fachmann bekannten Kulturmedien.
Im Rahmen dieser Erfindung ist ein Proliferationsgen ein solches, dass die Zellteilung verbessert und eine begrenzt erweiterte Zellteilungskapazität in der primären Zelle
ermöglicht, wobei die Wahrscheinlichkeit von
Zelltransformation oder Veränderungen der
Differenzierungseigenschaften sehr stark reduziert wird im Vergleich zu den Zelllinien, die Stand der Technik sind.
Erfindungsgemäß ist das Proliferationsgen vorzugsweise
ausgewählt aus der Gruppe der viralen Proliferationsgene : E6 und E7 von Papillomviren wie z.B. HPV (humanes Papillomvirus) und BPV (bovines Papillomvirus); das große und kleine TAg von Polyomaviren wie z.B. SV40, JK-Virus und BC-Virus; die
Proteine E1A und E1B von Adenoviren, EBNA- Proteine von
Epstein Barr Virus (EBV) ; sowie das Proliferationsgen von HTLV und Herpesvirus Saimiri und jeweils deren kodierenden Proteine bzw. deren Chimären oder ausgewählt aus der Gruppe der
zellulären Proliferationsgene, insbesondere folgenden Klassen von Genen: myc, jun, ras, src, fyg, myb, E2F und Mdm2 und TERT ( katalytische Untereinheit der Telomerase), vorzugsweise der humanen Telomerase hTERT) . Erfindungsgemäß bevorzugt sind jedoch virale
Proliferationsgene, besonders bevorzugt sind E6 und E7 von HPV oder BPV. Dabei können Proliferationsgene von HPV-Typen verwendet werden, die in Zusammenhang mit malignen
Erkrankungen stehen. Die bekanntesten Beispiele für „High Risk" Papillomviren sind HPV16 und HPV18. Weitere Beispiele der High Risk Gruppe sind HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 und 82. Es können aber auch die
Proliferationsgene E6 und E7 von so genannten „low risk" HPVs verwendet werden. Bekannte Beispiele sind die HPV-Typen 6 und 11, weitere HPV Typen der Low-Risk Gruppe sind HPV 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, und 81. Weiterhin können die
entsprechenden Chimären oder chimäre Genprodukte beliebig kombiniert und eingesetzt werden. Die Bedeutung der E6 Proteine im Zusammenhang mit
Proliferationssteigerung sind vor allem in der Inaktivierung des p53 Weges sowie der Induktion der Telomerase zu sehen. Die Bedeutung der E7 Proteine im Zusammenhang mit
Proliferationssteigerung sind vor allem in der Inaktivierung des pRB-Weges zu sehen. Im Zusammenhang der Erfindung können auch die Proliferationsgene verschiedener Serotypen einer Virusspezies oder verschiedener Virusspezies kombiniert werden oder sogar chimäre Proliferationsgene von verschiedenen
Serotypen einer Virusspezies oder verschiedener Virusspezies hergestellt und eingesetzt werden. Z.B. kann eine E6 Domäne in einem Chimären Gen z.B. von HPV 16 abstammen und eine andere von HPV 6. Selbstverständlich können die Proliferationsgene auch trunktiert sein oder einen oder mehrere Basenaustausche haben, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen. Die oben erwähnten Proliferationsgene stellen bevorzugte
Ausführungsformen dar und sollen die Erfindung nicht
einschränken. Das Proliferationsgen kann ebenfalls Gegenstand einer synthetischen oder künstlich hergestellten Gensequenz sein .
Diese Faktoren werden in die Zielzellen, deren
Zellteilungskapazität erweitert werden soll, „funktionell eingebracht" und hierbei können nicht abschließend folgende GentransferSysteme verwendet werden: Transfer von
Expressionskonstrukte der vorstehend genannten Genfunktionen in Zellen mit der klassischen Calzium-Phosphatmethode (Wigler, M. et al., 1977. Cell 11:223-232), mit Lipofektion (Felgner, P. L. et al, 1987. Proc . Nat1. Acad . Sei . U . S . A 84:7413-7417), mit Elektroporation (Wolf, H. et al . , 1994. Biophys.J. 66:524- 531), mit Mikroinjektion (Diacumakos, E. G. 1973. Methods Cell Biol. 7:287-311), über Konjugate, welche über zelluläre
Rezeptoren aufgenommen werden oder Rezeptor-unabhängig. Die vorstehend genannten Genfunktionen können auch über virale Vektoren in Zielzellen übertragen werden. Beispiele sind retrovirale Vektoren, AAV-Vektoren, Adenovirus-Vektoren und HSV-Vektoren, um nur einige Beispiele von Vektoren zu nennen (Übersicht über virale Vektoren in: Lundstrom, K. 2004.
Technol . Cancer Res.Treat. 3:467-477; Robbins, P. D. and S. C. Ghivizzani. 1998. Pharmacol . Ther . 80:35-47). Der Begriff „funktionell eingebracht" umfasst insbesondere die
Transfektion der Zielzellen mittels mindestens einem
Proliferationsgen .
Die Expression der vorstehend genannten viralen oder
zellulären Proliferationsgene kann durch starke oder schwache konstitutive Promotoren kontrolliert werden, von
Gewebespezifischen Promotoren, von induzierbaren Promotoren (Meyer-Ficca, M. L. et al . 2004. Anal . Biochem . 334:9-19) oder die Expressionskassetten können von spezifischen Sequenzen für molekulare Exzisionssysteme flankiert sein. Beispiele sind das Cre/Lox System (US Patent 4,959,317), dessen Anwendung zur molekularen Entfernung der Expressionskonstrukte aus dem Genom der Zielzellen führt. In einer weiteren Ausführungsform können die Genprodukte der Proliferationsgene ebenfalls direkt in die Zielzelle als solches oder mittels eines Fusionsproteins funktionell
eingebracht werden. Vorzugsweise handelt es sich um Messenger- Proteine (Transport-Proteine), wie VP22, HIV TAT (Suzuki et al., 277 J. Biol. Chem. 2437-2443 2002 and Futaki 245 Int. J. Pharmaceut . 1-7 (2002), (HIV) REV, Antennapedia Polypeptid (W097/12912 and WO99/11809) oder Penetratin (Derossi et al . , 8 Trends Cell Biol., 84-87 (1998), Engrailed (Gherbassi, D. & Simon, H. H. J. Neural Transm. Suppl 47-55 (2006), Morgan, R. 580 FEBS Lett . , 2531-2533 (2006), Han, K. et al . 10 Mol.
Cells 728-732 (2000)) oder Hoxa-5 (Chatelin et al . 55 Mech. Dev. 111-117 (1996)), ein Polymer aus L-Arginin oder D-Arginin Aminosäureresten (Can. Patent No . 2,094,658; U.S. Pat . No . 4,701,521; W098/52614), ein Polymer aus L-Lysin or D- Lysin Aminosäureresten (Mai et al . , 277 J. Biol. Chem. 30208-30218 (2002), Park et al . 13 Mol. Cells 202-208 (2002), Mi et al . 2 Mol. Ther. 339-347 (2000)), Transkriptionsfaktoren wie
BETA2 /neuro D, PDX-1 (Noguchi and Matsumoto 60 Acta Med.
Okayama 1-11, (2006), Noguchi et al . 52 Diabetes 1732-1737 (2003), Noguchi et al . 332 Biochem. Biophys. Res. Commun. 68- 74 (2005)), Nuclear Localization Signal , (Yoneda et al . 201 Exp. Cell Res. 313-320 (1992), Histone derived peptides
(Lundberg and Johansson 291 Biochem. Biophys. Res. Comm. 367- 371 (2002)), ein Polymer aus kationischen Makromolekülen, FGF- 1 und FGF-2, Lactoferrin u.a., wie einschlägig in der Literatur beschrieben.
Daher betrifft die Erfindung ebenfalls solche proliferierende Heptozytzen, die transient immortalisiert werden, vorzugsweise mittels i.) einem Polypeptid aufweisend eine Zell- Immortalisationsaktivität ,
ii.) Polypeptid, dass telomerische DNA an chromosomalen Enden synthetisiert, oder jeweils ein Fusionspeptid davon, wobei das Fusionspeptid in einem ersten Teil aus einem Transport-Protein besteht, siehe oben.
Ein solches Polypeptid aufweisend eine Zell- Immortalisationsaktivität kann z.B. aus den vorstehend
genannten viralen oder zellulären Proliferationsgenen erhalten werden. Weiterhin wird zur Herstellung solcher Polypeptide auf EP 1175436 Bl verwiesen.
Ein solches Polypeptid, dass telomerische DNA an chromosomalen Enden synthetisiert, ist vorzugsweise ausgewählt aus der
Gruppe Telomerase, Telomerase reverse Transkriptase (hTERT) , pl40, pl05, p 48 und p 43. Weiterhin wird zur Herstellung solcher Polypeptide auf EP 1175436 Bl verwiesen.
Im Rahmen dieser Erfindung wird unter „mit mindestens einem zellulären Faktor, der einen Zellteilungsarrest induziert, inaktiviert wird", verstanden, dass z.B. Zellteilungsarrest im Zuge des Seneszenzprogramms aktiviert wird (Übersicht in: Ben Porath, I. and R. A. Weinberg. 2005. Int . J . Biochem . Cell Biol. 37:961-976.) oder um denjenigen Zellteilungsarrest, der im Rahmen des Differenzierungsprogramms bei Zellen aktiviert wird. Beispielsweise ist bei Herzmuskelzellen bekannt, dass sie schon kurz nach der Geburt ihre Teilungsfähigkeit
einstellen, was u.a. durch Expression von Zellzyklus- Inhibitoren wie pl6, p21, p27 reguliert wird (Brooks, G., et al. 1998. Cardiovasc. Res. 39, 301-311; Flink, I.L. et al . , 1998. J. Mol. Cell Cardiol. 30, 563-578; Walsh,K. and
Perlman,H. 1997. Curr . Opin. Genet . Dev. 7, 597-602). Ähnliche Vorgänge treffen sicherlich auf die Mehrzahl aller primären Zelltypen zu. Eine Ausschaltung von Zellzyklusinhibitoren in differenzierten Zellen könnte somit bewirken, dass die Zellen wieder in die Proliferation gehen. Das trifft im Kontext der Erfindung auch auf weitere hier nicht erwähnte Zellzyklusinhibitorische Proteine zu.
Im Rahmen der Erfindung kann allgemein das für die Kontrolle des Zellzyklus wichtige Protein p53 sowie sämtliche an p53 direkt bindende Proteine, vorgeschaltete (nachfolgend
upstream) und/ oder nachgeschaltete (nachfolgend) downstream
Faktoren dieses p53 Pathways ausgeschaltet werden, um das Ziel der erweiterten Zellteilungskapazität zu erreichen (Übersicht über den p53 Pathway in: Giono, L. E. and J. J. Manfredi.
2006. J.Cell Physiol 209:13-20; Farid, N. R. 2004. Cancer Treat.Res. 122:149-164). Im Rahmen der Erfindung kann allgemein das für die Kontrolle des Zellzyklus wichtige Protein pl6/INK4a sowie sämtliche an pl6/INK4a direkt bindende Proteine, vorgeschaltete
(nachfolgend upstream) und/ oder nachgeschaltete (nachfolgend) downstream Faktoren dieses pl6 Pathways ausgeschaltet werden, um das Ziel der erweiterten Zellteilungskapazität zu erreichen
(Übersicht über den pl6/INK4a Pathway in: Shapiro, G. I. et al., 2000. Cell Biochem . Biophys . 33:189-197)
Im Rahmen der Erfindung kann allgemein das für die Kontrolle des Zellzyklus wichtige Protein pRb bzw. die anderen
Mitglieder der pRb-Familie (z.B. pl07, pl30) sowie sämtliche an Mitglieder der pRb-Familie direkt bindende Proteine, vorgeschaltete (nachfolgend upstream) und/ oder
nachgeschaltete (nachfolgend) downstream Faktoren dieses pRb Pathways ausgeschaltet werden, um das Ziel der erweiterten Zellteilungskapazität zu erreichen (Übersicht über den pRb Pathway in: Godefroy, N. et al . 2006. Apoptosis. 11:659-661; Seville, L. L. et al . 2005. Curr. Cancer Drug Targets. 5:159- 170) .
Die Inaktivierung zellulärer Faktoren wie z.B. p53, pRB, pl6 etc. kann z.B. durch Expression dominant negativer Mutanten der entsprechenden Faktoren erfolgen (Herskowitz, I. 1987. Nature 329:219-222; Küpper, J. H., et al . 1995. Biochimie 77:450-455), durch Inhibition der Genexpression dieser
Faktoren mithilfe von antisense Olignukleotiden (Zon, G. 1990. Ann.N. Y.Acad. Sei . 616:161-172), RNAi Molekülen (Aagaard, L. and J. J. Rossi. 2007. Adv.Drug Deliv.Rev. 59:75-86;
Chakraborty, C. 2007. Curr.Drug Targets. 8:469-482),
Morpholinos (Angerer, L. M. and R. C. Angerer. 2004. Methods Cell Biol. 74:699-711) , Ribozymen (Sioud, M. and P. 0.
Iversen. 2005. Curr.Drug Targets. 6:647-653) oder durch Gen- Knockout (Le, Y. and B. Sauer. 2000. Methods Mol. Biol.
136:477-485; Yamamura, K. 1999. Prog . Exp . Tumor Res. 35:13-24). Diese Verfahren sind dem Fachmann bekannt und in der Literatur vielfach beschrieben. Die Inaktivierung kann auch durch die Wirkung spezifischer Antikörper erfolgen (z.B. Single chain Antikörper, intra bodies etc.; Übersicht in: Leath, C. A., III, et al. 2004. Int.J.Oncol. 24:765-771; Stocks, M. R. 2004. Drug Discov. Today 9:960-966) . Die Inaktivierung kann auch durch Verwendung von chemischen Inhibitoren der zellulären
Faktoren erfolgen, beispielsweise durch Verwendung von Kinase Inhibitoren .
Ein Beispiel für einen Kinase-Inhibitor ist die Substanz
Imatinib (Glivec®) . Dadurch wird eine Reduktion der
Zellproliferation erreicht. Imatinib ist ein spezifischer Hemmstoff, der die Aktivität der Tyrosinkinase ABL in
erkrankten Zellen blockiert und damit eine krankhaft
gesteigerte Vermehrung mutierten BlutStammzellen unterdrückt. Die Erfindung betrifft daher in einer bevorzugten Ausführungsform ebenfalls ein Verfahren zum Herstellen eines Assays, umfassend die folgenden Schritte:
a. ) Bereitstellen eines Trägermaterials,
b. ) Immobilisieren oder Fixieren von proliferierenden
Hepatozyten auf diesem Trägermaterial und
In Kontakt bringen dieser Zelle aus b.) mit einem Agens und Bestimmung des Genotoxität des Agens.
Im Rahmen dieser Erfindung bedeutet Agens ein beliebiger
Stoff, wie z.B. zugelassene oder in Entwicklung befindliche
Medikamente und Medikamentenkandidaten sowie deren Vorläufer; allgemein Chemikalien; biologische Wirkstoffe, d.h. von Zellen erzeugte Moleküle wie z.B. Proteine, die natürlicherweise genauso oder in Abwandlung in Organismen oder Viren vorkommen oder dort gebildet werden können; auch unter physikalischen Einwirkungen wie elektromagnetische Strahlung, Wärme, Kälte, Schall etc. Eine Wirkung eines solchen Agens ist nicht
abschließend die Erzeugung von DNA-Schäden wie Nukleotid- Oxidationen, Deaminierungen, Basenverluste, Strangbrüche, Addukte, DNA-DNA-Crosslinks . Agenzien, die DNA Brüche
bewirken, werden als klastogen bezeichnet. Eine indirekte genotoxische Wirkung eines Agens ist bspw. die Schädigung des Spindelfaserapparats, der für die Trennung von Chromosomen bzw. Schwesterchromatiden notwendig ist und wobei es infolge der Schädigung bspw. zu Chromosomenbrüchen oder unregelmäßige Chromosomenverteilungen auf die Tochterzellen bei der
Zellteilung kommen kann. Agenzien, welche die
Chromsomenverteilung beeinflussen, werden als aneugen
bezeichnet .
Durch diese genotoxischen Wirkungen von einem oder mehreren Agenzien kommt es zu einer Veränderung des Erbgutes einer Zelle, was verbunden sein kann, aber nicht muss, mit einer unmittelbaren Toxizität, die zum Absterben der Zelle führt. Andererseits kann sich eine Veränderung des Erbgutes in einer veränderten Genaktivität auswirken, die zu einem veränderten Metabolismus der Zelle führt.
Der Nachweis eines positiven Ereignisses zur Bestimmung der Genotoxität kann mit einem Nachweisreagenz im weitesten Sinne erfolgen, z.B. mittels einem fluoresenzmarkiertem Antikörper oder dergleichen. Zu nennen sind hier insbesondere dazu geeignete bioanalytische Verfahren, wie zum Beispiel
Immunhistochemie, Antikörperarrays , Luminex / Luminol, ELISA, Immunfluoreszenz , Radioimmunoassays .
Der Begriff "fester Träger" umfasst Ausführungen wie einen Filter, eine Membran, ein magnetisches Kügelchen, ein
Silizium-Wafer , Glas, Kunststoff, Metall, ein Chip, ein massenspektrometrisches Target oder eine Matrix aus z.B.
Proteinen oder anderweitige Matrices wie z.B. PEG etc. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der
erfindungsgemäßen Anordnung (synonym: Array) entspricht diese einem Gitter, dass die Größenordnung einer Mikrotiterplatte (96 Wells, 384 Wells oder mehr), eines Silizium-Wafers, eines Chips, eines massenspektrometrischen Targets oder einer Matrix besitzt .
Das Trägermaterial (Matrix) kann in der Form von sphärischen, unaggregierten Partikeln, sog. Beads, Fasern oder einer
Membran vorliegen, wobei eine Porosität der Matrix die
Oberfläche erhöht. Die Porosität kann beispielsweise in üblicher Weise durch Zugabe von Porenbildnern, wie
Cyclohexanol oder 1-Dodecanol zu der Reaktionsmischung der Suspensionspolymerisation erreicht werden.
Beispiele :
Beispiel 1: Induktion der CYP3A4-Aktivität von
proliferierenden Hepatozyten
Zunächst werden proliferierbare Hepatozyten hergestellt, indem primäre humane Hepatozyten mit dem in der WO 2009030217A2 beschriebenen Verfahren behandelt werden.
Um die metabolische Kapazität der in dieser Erfindung
beschriebenen proliferierenden Hepatozyten zu untersuchen, wurde die Induktion der CYP3A4 Aktivität bei verschiedenen Verdopplungszahlen (PD 23, 32 und 36) gemessen. Dazu wurden die Zellen in einer Dichte von 2,3 x 104 Zellen / cm auf Kollagen beschichteten Zellkulturgefäßen eingesät und 4 Tage kultiviert. Anschließend wurden die Zellen für drei Tage täglich mit Rifampicin (20μΜ) behandelt bevor die CYP3A4
Aktivität mittels Lumineszens-basierten P450-Glo Assay
(Promega) gemessen wurde. Die x-fache Induktion (Mittelwert ± Standardabweichung, n=3) wurde berechnet als CYP3A4-Aktivität (in RLU / s / well) der Rifampicin behandelten Zellen
dividiert durch CYP3A4-Aktivität der Kontrollzellen.
Die CYP3A4-Aktivität der proliferierenden Hepatozyten konnte bei allen drei getesteten Verdopplungszeiten induziert werden (Figur 1) . Die Induktion war für alle untersuchten
Verdopplungs Zeiten ähnlich und erfüllt die FDA-Kriterien für die CYP3A4 Induktion in humanen Hepatozyten (d.h. größer als 4-fach) .
Beispiel 2: Korrekte Identifikation von Positiv- und
Negativsubstanzen für Genotoxizitätstests .
Um die Eignung der in dem Patent beschriebenen vermehrbaren Hepatozyten in Bezug auf Genotoxizitätstests zu überprüfen, wurden die Zellen mit Substanzen behandelt, die als Positivbzw. Negativsubstanzen für Genotoxizität gelten. Die
Genotoxi z ität wurde über den Anteil an induzierten Mikrokernen gegenüber der Kontrolle durch einen FACS-Assay quantifiziert. Im Einzelnen wurden die Positivsubstanzen Mitomycin C (MMC) und Cyclophosphamid (CPA) und die Negativsubstanz Curcurmin getestet. CPA muss zunächst metabolisiert werden um
genotoxisch zu wirken und wird im bislang verwendeten
Mikronukleustest mit V79 Zellen ausschließlich erkannt wenn die Substanz zuvor mit einem CYP-Enzym-Extrakt (S9-Mix) umgesetzt wurde. Curcurmin wird in den Standard- Genotoxizitätstests, die auf Nagerzelllinien basieren, als falsch positiv klassifiziert.
Die in dieser Erfindung beschriebenen proliferierenden
Hepatozyten wurden in einer Dichte von 3000 Zellen / cm2 auf Kollagen beschichteten Zellkulturgefäßen ausplattiert und mit den o.g. Substanzen in verschiedenen Konzentrationen
behandelt. Im Rahmen der regulatorischen Testung nach OECD wurde bis zu einer Zytotoxizität von 50% geprüft, die für jede Substanz zuvor über eine MTT-Viabilitätsbestimmung ermittelt wurde. Da die Teilungsgeschwindigkeit der Leberzellen mit 48h niedriger als bei der Zelllinie V79 liegt, wurden längere Inkubations- und Erholungs Zeiträume für die Behandlungen
(jeweils angegeben) gewählt.
Für MMC und CPA ergab sich eine Dosis-Wirkungsbeziehung der Mikrokernbildung, so dass diese Substanzen als eindeutig positiv erkannt wurden (Figuren 2 und 3) . Die korrekt
identifizierte Genotoxizität von CPA bestätigt die
metabolische Kompetenz der Zellen. Curcurmin dagegen induzierte keine vermehrte Mikrokernbildung und wurde daher korrekt als Negativsubstanz eingeordnet (Figur 4) . Literaturliste
Agarwal, M. L . , Taylor, W.R., Chernov, M . V . , Chernova, 0. B . and Stark, G.R. (1998)
Arnes, B.N., Durston, W . E . , Yamasaki,E., and Lee, F.D. (1973a).
Carcinogens are mutagens: a simple test System combining liver homogenates for activation and bacteria for detection. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 70, 2281-2285.
Arnes, B.N., Lee, F.D., and Durston, W.E. (1973b) . An improved bacterial test System for the detection and Classification of mutagens and carcinogens. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 70, 782-786.
Arimoto,R. (2006) . Computational models for predicting
interactions with cytochrome p450 enzyme. Curr . Top. Med.
Chem. 6, 1609-1618.
Broschinski , L . , Madie, S., and Hensel,C. (1998). Genotoxicity tests for new chemicals in Germany: routine in vitro test Systems. Mutat. Res. 418, 121-129.
De Flora S., Russo,P., Pala,M., Fassina, G., Zunino, A. ,
Bennicelli , C . , Zanacchi,P., Camoirano , A . , and Parodi,S.
(1985) . Assay of phenacetin genotoxicity using in vitro and in vivo test Systems. J. Toxicol. Environ. Health 16, 355-377. Elaut,G., Henkens, T . , Papeleu, P., Snykers,S., Vinken,M., Vanhaecke, T. , and Rogiers,V. (2006) . Molecular mechanisms underlying the dedifferentiation process of isolated
hepatocytes and their cultures. Curr . Drug Metab 7, 629-660. Fenech,M. and Morley,A.A. (1985) . Measurement of micronuclei in lymphocytes. Mutat. Res. 147, 29-36.
Gomez-Lechon, M . J . , Donato,M.T., Castell , J . V . , and Jover,R.
(2004) . Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man. Curr. Drug Metab 5, 443- 462.
Hewitt et al (2007) . Primary hepatocytes: current
understanding of the regulation of metabolic enzymes and transporter proteins, and pharmaceutical practice for the use of hepatocytes in metabolism, enzyme induction, transporter, clearance, and hepatotoxicity studies.
Drug Metab., 39, 159-234
Kirkland D, Aardema M, Henderson L, Müller L.
Evaluation of the ability of a battery of three in vitro genotoxicity tests to discriminate rodent carcinogens and non- carcinogens I. Sensitivity, specificity and relative
predictivity . Mutat Res. 2005 Jul 4 ; 584 ( 1-2 ) : 1-256.
Mathijs,K., Brauers , K . J . , Jennen,D.G., Lizarraga, D . ,
Kleinj ans , J . C . , and van Delft,J.H. (2010) . Gene expression profiling in primary mouse hepatocytes discriminates true from false-positive genotoxic Compounds. Mutagenesis. Morita,T., Watanabe,Y., Takeda,K., and Okumura,K. (1989).
Effects of pH in the in vitro chromosomal aberration test. Mutat. Res. 225, 55-60.
Rossi,D., Aiello,V., Mazzoni, L . , Sensi,A., and Calzolari,E. (2007) . In vitro short-term test evaluation of
catecholestrogens genotoxicity. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 105, 98-105.
Singh,N.P., McCoy,M.T., Tice , R . R . , and Schneider , E . L . (1988).
A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell Res. 175, 184-191.

Claims

Patentansprüche
Verwendung von proliferierenden Hepatozyten zur
Durchführung von in-vitro Testverfahren zur Genotoxität.
Verwendung von proliferierenden Hepatozyten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Arnes-Test, Chromosomen Aberrationstest, Comet Assay, Mikronukleustest
durchgeführt werden.
Verwendung von proliferierenden Hepatozyten nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass diese
proliferierenden Hepatozyten mindestens vier Phase I Enzyme ausgewählt aus der Gruppe CYP -1A2, -2C9, -2C19, - 2D6, -2E1, - 3A4, - 1A2, -2A6, -2B6, -2C8, -1A1, -3A5, - 3A7 und -4A11 aufweisen.
Verwendung von proliferierenden Hepatozyten nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass diese proliferierenden Hepatozyten keine
Wachstumsfähigkeit in Soft Agar oder Tumorwachstum in vivo aufweisen.
Verwendung von proliferierenden Hepatozyten nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass diese proliferierenden Hepatozyten aus primären Zellen aus Mensch oder Säugetier a.) ein Proliferationsgen, insbesondere ein zelluläres und / oder virales
Proliferationsgen
und / oder b.) mindestens ein zellulärer Faktor
inaktiviert ist, der einen Zellteilungsarrest induziert, aufweisen,
und / oder
c.) transient immortalisiert sind.
Verwendung von proliferierenden Hepatozyten nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass diese zelluläre
Proliferationsgen aus der Gruppe myc, jun, ras, src, fyg, myb, E2F und Mdm2 und TERT ausgewählt ist oder das virale Proliferationsgen aus der Gruppe E6 und E7 von
Papillomviren wie z.B. HPV; das große und kleine TAg von Polyomaviren wie z.B. SV40, JK-Virus und BC-Virus; die Proteine E1A und E1B von Adenoviren, EBNA- Proteine von Epstein Barr Virus (EBV) ; sowie HTLV und Herpesvirus Saimiri ausgewählt ist.
Verwendung von proliferierenden Hepatozyten nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die virale
Proliferationsgene, E6 und E7 von HPV oder BPV sind, insbesondere HPV16 und HPV18 und HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 und 82 und / oder HPV6 und HPV11 sowie HPV 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, und 81. Verwendung von proliferierenden Hepatozyten nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der zelluläre Faktor aus der Gruppe p53, pl6, pRB, pl07, pl30 oder deren
jeweiligen upstream oder downstream Faktoren oder daran bindende Proteine im Pathway ausgewählt ist und die
Inaktivierung solcher zellulärer Faktoren mittels
Expression dominant negativer Mutanten erfolgt oder durch Inhibition der Genexpression dieser Faktoren mithilfe von antisense Olignukleotiden, RNAi Molekülen, Morpholinos, Ribozymen erfolgt oder durch Gen-Knockout, durch die Wirkung spezifischer Antikörpern, chemischen Inhibitoren erfolgt .
Verwendung von proliferierenden Hepatozyten nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die transiente
Immortalisierung mittels i.) einem Polypeptid aufweisend eine Zell-Immortalisationsaktivität , ii.) Polypeptid, dass telomerische DNA an chromosomalen Enden
synthetisiert, oder jeweils ein Fusionspeptid davon.
Verwendung von proliferierenden Hepatozyten nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die transiente
Immortalisierung mittels i.) einem Polypeptid aufweisend eine Zell-Immortalisationsaktivität ausgewählt ist aus der Gruppe eines Expressionsprodukts nach Anspruch 6 oder 7 erfolgt .
11. Verwendung von proliferierenden Hepatozyten nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die transiente
Immortalisierung mittels ii.) Polypeptid, dass
telomerische DNA an chromosomalen Enden synthetisiert ausgewählt ist aus der Gruppe Telomerase, Telomerase reverse Transkriptase (hTERT) , pl40, pl05, p 48 und p 43.
12. Verwendung von proliferierenden Hepatozyten nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die transiente
Immortalisierung mittels einem Fusionspeptid erfolgt, woebei der erste Teil ein Transport-Polypeptid ist, insbesondere VP22, HIV TAT, (HIV) REV, Antennapedia
Polypeptid, Penetratin, Engrailed, Hoxa-5, ein Polymer aus L-Arginin oder D-Arginin Aminosäureresten, ein
Polymer aus L-Lysin or D- Lysin Aminosäureresten,
Transkriptionsfaktoren wie BETA2/neuro D, PDX-1, Nuclear Localization Signal, Histone derived peptides, ein
Polymer aus kationischen Makromolekülen, FGF-1 und FGF-2, Lactoferrin und der zweite Teil ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 6 oder 7 ist.
13. Verfahren zum Herstellen eines Assays, umfassend die
folgenden Schritte:
a. ) Bereitstellen eines Trägermaterials,
b. ) Immobilisieren oder Fixieren von proliferierenden Hepatozyten auf diesem Trägermaterial und In Kontakt bringen dieser Zelle aus b.) mit einem Agens und Bestimmung des Genotoxität des Agens.
Verfahren zum Herstellen eines Assays nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Agens ausgewählt ist aus der Gruppe chemische und biologisch Wirkstoffe,
Medikamente, Kosmetika.
EP11779357.0A 2010-10-04 2011-10-04 Geeignete hepatozyten für in-vitro genotoxizitätstests Withdrawn EP2625520A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102010041958A DE102010041958A1 (de) 2010-10-04 2010-10-04 Geeignete Hepatozyten für in-vitro Genotoxitätstests
PCT/EP2011/067295 WO2012045731A1 (de) 2010-10-04 2011-10-04 Geeignete hepatozyten für in-vitro genotoxizitätstests

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP2625520A1 true EP2625520A1 (de) 2013-08-14

Family

ID=44910178

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP11779357.0A Withdrawn EP2625520A1 (de) 2010-10-04 2011-10-04 Geeignete hepatozyten für in-vitro genotoxizitätstests

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20130323721A1 (de)
EP (1) EP2625520A1 (de)
CN (1) CN103221822A (de)
CA (1) CA2813502A1 (de)
DE (1) DE102010041958A1 (de)
WO (1) WO2012045731A1 (de)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2871233A1 (de) 2013-11-12 2015-05-13 Brandenburgische Technische Universität Cottbus-Senftenberg Verfahren zur Herstellung von biogenen Stoffen
EP2927685A1 (de) * 2014-04-02 2015-10-07 Medicyte GmbH Geeignete Hepatozyten für In-vitro-Hepatitistests
EP3271451A4 (de) * 2015-03-20 2018-09-19 Hurel Corporation Verfahren zur charakterisierung von zeitbasierter hepatotoxizität
CN105624196A (zh) * 2015-12-24 2016-06-01 江苏大学 一种建立cyp2c11基因敲除大鼠模型的方法
CN105624191A (zh) * 2015-12-24 2016-06-01 江苏大学 一种建立cyp2d1基因敲除大鼠模型的方法
CN105969744A (zh) * 2016-07-26 2016-09-28 王红阳 Cyp3a5蛋白、编码基因、重组载体及其在制备抗肿瘤复发或转移药物中的应用
CN110982778B (zh) * 2019-12-24 2023-04-18 中检科健(天津)检验检测有限责任公司 一种大鼠肝s9的诱导方法
CN114674806B (zh) * 2022-05-26 2022-08-12 中国药科大学 一种基于表面增强拉曼散射的细胞传感器及其应用

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2094658A (en) 1935-06-04 1937-10-05 Irving L Keith Machine for applying liquid in the manufacture of shoes
US4701521A (en) 1978-07-17 1987-10-20 The Trustees Of Boston University Method of effecting cellular uptake of molecules
CA1293460C (en) 1985-10-07 1991-12-24 Brian Lee Sauer Site-specific recombination of dna in yeast
US5665589A (en) * 1988-12-14 1997-09-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Human liver epithelial cell lines
CA2094658A1 (en) 1992-04-23 1993-10-24 Martin Sumner-Smith Intracellular delivery of biochemical agents
JPH07115993A (ja) * 1993-10-27 1995-05-09 Sumitomo Chem Co Ltd 肝細胞を用いたインビトロ染色体異常試験方法
DE69633565T3 (de) 1995-06-15 2013-01-17 Crucell Holland B.V. Verpackungssysteme für humane, menschliche adenoviren, zur verwendung in die gentherapie
FR2739621B1 (fr) 1995-10-05 1997-12-05 Centre Nat Rech Scient Peptides utilisables comme vecteurs pour l'adressage intracellulaire de molecules actives
EP0975370B9 (de) 1997-05-21 2004-11-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Zusammensetzung und verfahren zur verzögerung des transports durch biologische membranen
GB9718609D0 (en) 1997-09-02 1997-11-05 Imp College Innovations Ltd Fusion protein
AU4342900A (en) * 1999-04-12 2000-11-14 Modex Therapeutiques, S.A. Transiently immortalized cells for use in gene therapy
US20050221324A1 (en) 2002-05-06 2005-10-06 Fox Michael H Genotoxicity analysis
GB0624462D0 (en) 2006-12-07 2007-01-17 Ge Healthcare Ltd Method for determining gentoxicity
DE102007041655A1 (de) * 2007-09-03 2009-03-05 Medicyte Gmbh Vermehrung von primären Zellen und deren Verwendung

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2012045731A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE102010041958A1 (de) 2012-04-05
CN103221822A (zh) 2013-07-24
US20130323721A1 (en) 2013-12-05
WO2012045731A1 (de) 2012-04-12
CA2813502A1 (en) 2012-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2625520A1 (de) Geeignete hepatozyten für in-vitro genotoxizitätstests
DE68926816T2 (de) SCREENING-VERFAHREN FüR PROTEIN-INHIBITOREN UND -AKTIVATOREN.
Pruszak et al. CD15, CD24, and CD29 define a surface biomarker code for neural lineage differentiation of stem cells
Barro et al. Myoblasts from affected and non‐affected FSHD muscles exhibit morphological differentiation defects
Barbosa et al. In vitro models for neurotoxicology research
AU650677B2 (en) Screening assays
Wang et al. Androgen receptor-mediated apoptosis in bovine testicular induced pluripotent stem cells in response to phthalate esters
Seaberg et al. Intrinsic differences distinguish transiently neurogenic progenitors from neural stem cells in the early postnatal brain
Kaku et al. PAX2 is dispensable for in vitro nephron formation from human induced pluripotent stem cells
Raghuram et al. Molecular mechanisms of isocyanate induced oncogenic transformation in ovarian epithelial cells
Nizzardo et al. iPSC-derived LewisX+ CXCR4+ β1-integrin+ neural stem cells improve the amyotrophic lateral sclerosis phenotype by preserving motor neurons and muscle innervation in human and rodent models
Rau et al. Cutaneous tissue damage induces long-lasting nociceptive sensitization and regulation of cellular stress-and nerve injury-associated genes in sensory neurons
DE102007041655A1 (de) Vermehrung von primären Zellen und deren Verwendung
DE69121888T2 (de) Screening nach proteinpartnern und deren verwendung
Yuan et al. Evidence of nuclear localization of neuronal nitric oxide synthase in cultured astrocytes of rats
WO2018124119A1 (ja) 染色体の異常の検出方法および誘発性を評価する方法
Maier The granuloma pouch assay
Kittipassorn et al. Characterization of the novel spontaneously immortalized rat Müller cell line SIRMu-1
Philips et al. Anchorage-dependent expression of cyclin A in primary cells requires a negative DNA regulatory element and a functional Rb
Cohen et al. Mitochondria serve as axonal shuttle for Cox7c mRNA through mechanism that involves its mitochondrial targeting signal
DE69231710T2 (de) Tyrosinkinase
EP1141716B1 (de) Methode zur zellulären high-throughput-detektion von rezeptor-liganden-interaktionen
Ariyoshi et al. Rapid isolation of murine primary hepatocytes for chromosomal analysis
Assad et al. Immunogold electron microscopy in situ end‐labeling (EM‐ISEL): Assay for biomaterial DNA damage detection
DE60304345T2 (de) Screening-verfahren

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20130506

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
19U Interruption of proceedings before grant

Effective date: 20150715

19W Proceedings resumed before grant after interruption of proceedings

Effective date: 20160401

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20161005