JPH07115993A - 肝細胞を用いたインビトロ染色体異常試験方法 - Google Patents
肝細胞を用いたインビトロ染色体異常試験方法Info
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- JPH07115993A JPH07115993A JP26897793A JP26897793A JPH07115993A JP H07115993 A JPH07115993 A JP H07115993A JP 26897793 A JP26897793 A JP 26897793A JP 26897793 A JP26897793 A JP 26897793A JP H07115993 A JPH07115993 A JP H07115993A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】（１）哺乳類の肝臓から肝細胞を分離する工
程、 （２）(a) 分離された肝細胞に増殖刺激物質を処理する
ことによって、肝細胞をインビトロで増殖させると同時
に、該肝細胞と検体である化合物とを接触させることに
よって、肝細胞中に存在する染色体に異常を誘発させる
工程、または(b)分離された肝細胞と検体である化合物
とを接触させることによって、肝細胞中に存在する染色
体に異常を誘発させた後、該肝細胞に増殖刺激物質を処
理することによって、肝細胞をインビトロで増殖させる
工程、 （３）得られた肝細胞を固定、染色した後、肝細胞中に
存在する染色体の異常を観察することによって、検体で
ある化合物の肝細胞に対する染色体異常誘発性を検出す
る工程、からなることを特徴とする染色体異常試験方
法。 【効果】本発明方法により、少ない労力と時間で化合物
の肝細胞に対する染色体異常誘発性を検出することがで
きるようになった。また、高薬物代謝活性を維持してい
る増殖後の肝細胞を用いることにより、高感度での検出
を可能とした。
程、 （２）(a) 分離された肝細胞に増殖刺激物質を処理する
ことによって、肝細胞をインビトロで増殖させると同時
に、該肝細胞と検体である化合物とを接触させることに
よって、肝細胞中に存在する染色体に異常を誘発させる
工程、または(b)分離された肝細胞と検体である化合物
とを接触させることによって、肝細胞中に存在する染色
体に異常を誘発させた後、該肝細胞に増殖刺激物質を処
理することによって、肝細胞をインビトロで増殖させる
工程、 （３）得られた肝細胞を固定、染色した後、肝細胞中に
存在する染色体の異常を観察することによって、検体で
ある化合物の肝細胞に対する染色体異常誘発性を検出す
る工程、からなることを特徴とする染色体異常試験方
法。 【効果】本発明方法により、少ない労力と時間で化合物
の肝細胞に対する染色体異常誘発性を検出することがで
きるようになった。また、高薬物代謝活性を維持してい
る増殖後の肝細胞を用いることにより、高感度での検出
を可能とした。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、肝細胞を用いたインビ
トロ染色体異常試験方法に関するものである。
トロ染色体異常試験方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】肝臓は薬物代謝の主要な臓器であり、生
体に損傷を与える化合物の標的臓器となりやすい。変異
原性試験は化合物の発ガン性を評価するためのスクリー
ニング試験として広く用いられている試験であり、なか
でも染色体異常試験は染色体の構造変化というダイナミ
ックな変異を検出する重要な試験である。細胞のガン化
には染色体の変異を伴うことが知られており、肝細胞に
おける化合物の影響を評価する上で染色体異常誘発性を
調べることは重要な意味をもっている。一般に、化合物
が細胞の染色体に及ぼす影響を調べるためには、その細
胞が増殖している（細胞周期をまわっている）必要があ
る。肝細胞は通常の状態ではＧ 0 期にあり、増殖は行っ
ていない。したがって、肝細胞における化合物の染色体
異常誘発性を検出するには、肝細胞を増殖させることが
必要である。従来は、動物の肝臓の部分的切除手術の実
施や、肝細胞を増殖させる化合物、即ち、増殖刺激物質
を動物に投与するなどの方法で肝細胞を増殖させ、その
動物に検体である化合物を投与して、肝細胞の染色体異
常を生体内（インビボ）で検出する方法が一般的であっ
た。
体に損傷を与える化合物の標的臓器となりやすい。変異
原性試験は化合物の発ガン性を評価するためのスクリー
ニング試験として広く用いられている試験であり、なか
でも染色体異常試験は染色体の構造変化というダイナミ
ックな変異を検出する重要な試験である。細胞のガン化
には染色体の変異を伴うことが知られており、肝細胞に
おける化合物の影響を評価する上で染色体異常誘発性を
調べることは重要な意味をもっている。一般に、化合物
が細胞の染色体に及ぼす影響を調べるためには、その細
胞が増殖している（細胞周期をまわっている）必要があ
る。肝細胞は通常の状態ではＧ 0 期にあり、増殖は行っ
ていない。したがって、肝細胞における化合物の染色体
異常誘発性を検出するには、肝細胞を増殖させることが
必要である。従来は、動物の肝臓の部分的切除手術の実
施や、肝細胞を増殖させる化合物、即ち、増殖刺激物質
を動物に投与するなどの方法で肝細胞を増殖させ、その
動物に検体である化合物を投与して、肝細胞の染色体異
常を生体内（インビボ）で検出する方法が一般的であっ
た。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の方法では労力と時間がかかり、多くの化合物のスクリ
ーニングには不向きである。このため、少ない労力と時
間で化合物の肝細胞に対する染色体異常誘発性を検出す
る系の開発が望まれていた。
の方法では労力と時間がかかり、多くの化合物のスクリ
ーニングには不向きである。このため、少ない労力と時
間で化合物の肝細胞に対する染色体異常誘発性を検出す
る系の開発が望まれていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】このような状況下で、本
発明者らは、鋭意検討を行った結果、肝細胞を生体外
（インビトロ）で増殖させる技術を用いることにより、
肝細胞における化合物の染色体異常誘発性をインビトロ
で検出するための毒性試験を確立することに成功し、本
発明を完成した。すなわち、本発明は、 （１）哺乳類の肝臓から肝細胞を分離する工程、 （２）(a) 分離された肝細胞に増殖刺激物質を処理する
ことによって、肝細胞をインビトロで増殖させると同時
に、該肝細胞と検体である化合物とを接触させることに
よって、肝細胞中に存在する染色体に異常を誘発させる
工程、または(b)分離された肝細胞と検体である化合物
とを接触させることによって、肝細胞中に存在する染色
体に異常を誘発させた後、該肝細胞に増殖刺激物質を処
理することによって、肝細胞をインビトロで増殖させる
工程、 （３）得られた肝細胞を固定、染色した後、肝細胞中に
存在する染色体の異常を観察することによって、検体で
ある化合物の肝細胞に対する染色体異常誘発性を検出す
る工程、からなることを特徴とする染色体異常試験方法
（以下、本発明方法と記す。）を提供するものである。
発明者らは、鋭意検討を行った結果、肝細胞を生体外
（インビトロ）で増殖させる技術を用いることにより、
肝細胞における化合物の染色体異常誘発性をインビトロ
で検出するための毒性試験を確立することに成功し、本
発明を完成した。すなわち、本発明は、 （１）哺乳類の肝臓から肝細胞を分離する工程、 （２）(a) 分離された肝細胞に増殖刺激物質を処理する
ことによって、肝細胞をインビトロで増殖させると同時
に、該肝細胞と検体である化合物とを接触させることに
よって、肝細胞中に存在する染色体に異常を誘発させる
工程、または(b)分離された肝細胞と検体である化合物
とを接触させることによって、肝細胞中に存在する染色
体に異常を誘発させた後、該肝細胞に増殖刺激物質を処
理することによって、肝細胞をインビトロで増殖させる
工程、 （３）得られた肝細胞を固定、染色した後、肝細胞中に
存在する染色体の異常を観察することによって、検体で
ある化合物の肝細胞に対する染色体異常誘発性を検出す
る工程、からなることを特徴とする染色体異常試験方法
（以下、本発明方法と記す。）を提供するものである。
【０００５】以下、さらに詳細に本発明を説明する。 （１）哺乳類の肝臓から肝細胞を分離する工程に関し
て。本発明方法で用いられる哺乳類の肝臓は、たとえば
ラット、マウス等由来のものがあげられ、適するものと
して、ＳＤ系ラット、F344系ラット、ＩＣＲ系マウス、
B6C3F1系マウス等をあげることができる。好ましくは、
ＳＤ系雄性ラット等があげられる。肝臓から肝細胞を分
離するには、たとえば「初代培養肝細胞実験法」、中村
敏一著、学会出版センター、1987等に記載される通常の
方法を用いることができる。具体的には、コラゲナーゼ
二段階灌流法、すなわち、麻酔されたラットを開腹し、
肝門脈を充分に露出させる後、該肝門脈にカニューレを
固定する。固定後直ちに、肝臓下の下大静脈を切断し、
前灌流用緩衝液を灌流する。この間に、胸郭部を開き、
右心房に入る横隔膜下の下大静脈に別のカニューレを固
定する。そして鉗子で切断した肝臓下の下大静脈を止め
る。この状態で、灌流液は肝門脈から肝臓を流れ、横隔
膜下の下大静脈を通って右心房より出てくる。前灌流用
緩衝液の灌流後、該灌流液を37℃に保温したコラゲナー
ゼ溶液に交換し、灌流を続ける。肝臓表面に酵素液がし
みだし、きめが荒くなってきたら灌流を中止し、肝臓を
摘出する。摘出された肝臓を動物細胞用培養液中で細切
することによって、肝細胞を分離させる方法等がある。
て。本発明方法で用いられる哺乳類の肝臓は、たとえば
ラット、マウス等由来のものがあげられ、適するものと
して、ＳＤ系ラット、F344系ラット、ＩＣＲ系マウス、
B6C3F1系マウス等をあげることができる。好ましくは、
ＳＤ系雄性ラット等があげられる。肝臓から肝細胞を分
離するには、たとえば「初代培養肝細胞実験法」、中村
敏一著、学会出版センター、1987等に記載される通常の
方法を用いることができる。具体的には、コラゲナーゼ
二段階灌流法、すなわち、麻酔されたラットを開腹し、
肝門脈を充分に露出させる後、該肝門脈にカニューレを
固定する。固定後直ちに、肝臓下の下大静脈を切断し、
前灌流用緩衝液を灌流する。この間に、胸郭部を開き、
右心房に入る横隔膜下の下大静脈に別のカニューレを固
定する。そして鉗子で切断した肝臓下の下大静脈を止め
る。この状態で、灌流液は肝門脈から肝臓を流れ、横隔
膜下の下大静脈を通って右心房より出てくる。前灌流用
緩衝液の灌流後、該灌流液を37℃に保温したコラゲナー
ゼ溶液に交換し、灌流を続ける。肝臓表面に酵素液がし
みだし、きめが荒くなってきたら灌流を中止し、肝臓を
摘出する。摘出された肝臓を動物細胞用培養液中で細切
することによって、肝細胞を分離させる方法等がある。
【０００６】（２）(a) 分離された肝細胞に増殖刺激物
質を処理することによって、肝細胞をインビトロで増殖
させると同時に、該肝細胞と検体である化合物とを接触
させることによって、肝細胞中に存在する染色体に異常
を誘発させる工程、または(b)分離された肝細胞と検体
である化合物とを接触させることによって、肝細胞中に
存在する染色体に異常を誘発させた後、該肝細胞に増殖
刺激物質を処理することによって、肝細胞をインビトロ
で増殖させる工程に関して。上記工程は、（ｉ）肝細胞
に増殖刺激物質を処理することによって、肝細胞をイン
ビトロで増殖させる工程と（ii）肝細胞と検体である化
合物とを接触させることによって、肝細胞中に存在する
染色体に異常を誘発させる工程の２つの工程からなるも
のである。なお、工程の操作順序は、（ｉ）と同時に
（ii)(以下、（２)(a)と記す。）または（ii）から
（ｉ)(以下、（２)(b)と記す。）のどちらでもよい。
（ｉ）の工程において用いられる増殖刺激物質として
は、たとえば、表皮増殖因子（以下、ＥＧＦと記
す。）、肝細胞増殖因子（以下、ＨＧＦと記す。）等を
あげることができる。これら増殖刺激物質の処理方法と
しては、あらかじめ、たとえば、約５％〜約１０％牛胎
児血清を添加したウィリアムスＥ培地（Exp.Cell.Res.,
69:106〜112(1971) 等に記載）、約５％〜約１０％牛胎
児血清を添加したダルベッコＭＥＭ培地(Virology,8:39
6(1959) 、Virology,12:185(1960))等の通常の動物細胞
培養培地に存在する、分離された肝細胞に対してインス
リン約10- 7 Ｍ程度と共に増殖刺激物質を約１０ｎg/ml
〜約２０ｎg/mlの割合の処理量で、かつ約２４時間から
から約４８時間程度の処理時間をあげることができる。
好ましくは、分裂指数が最大となるような時間、すなわ
ち約４０時間から約４５時間程度である。このようにし
て、分離された肝細胞をインビトロで増殖させることが
できる。なお、インスリンは肝細胞を安定な状態に保つ
ために添加したほうが望ましいが、必ずしも必要という
わけではない。（ii）の工程において、肝細胞と検体で
ある化合物とを接触させる方法としては、肝細胞（5x10
5 cells ／10ml／シャーレ) に対して、検体である化合物を
約１０-6mg/ml 〜約１０mg/ml の割合の接種量で、かつ
約３時間から約４８時間程度の接触時間をあげることが
できる。具体的には、たとえば、（２)(a)として、分離
された肝細胞に増殖刺激物質を処理することによって、
肝細胞をインビトロで増殖させると同時に、該肝細胞と
検体である化合物とを約３時間から約４８時間程度接触
させる。なお、検体化合物との接触処理時間が増殖処理
時間より短い場合は、検体化合物との接触処理後、培地
交換を行なうことにより検体化合物を除去し、新たに増
殖刺激物質を添加する。そして検体化合物との接触処理
時間も含めた増殖処理時間が約２４時間から約４８時間
となるように培養する、２)(b)として、分離された肝細
胞と検体である化合物とを約３時間から約４８時間程度
接触させた後、培地交換を行なうことにより検体化合物
を除去し、新たに増殖刺激物質を添加する。そして増殖
処理時間が約２４時間から約４８時間となるように培養
する、方法等があげられる。このようにして、肝細胞中
に存在する染色体に異常を誘発させることができる。
質を処理することによって、肝細胞をインビトロで増殖
させると同時に、該肝細胞と検体である化合物とを接触
させることによって、肝細胞中に存在する染色体に異常
を誘発させる工程、または(b)分離された肝細胞と検体
である化合物とを接触させることによって、肝細胞中に
存在する染色体に異常を誘発させた後、該肝細胞に増殖
刺激物質を処理することによって、肝細胞をインビトロ
で増殖させる工程に関して。上記工程は、（ｉ）肝細胞
に増殖刺激物質を処理することによって、肝細胞をイン
ビトロで増殖させる工程と（ii）肝細胞と検体である化
合物とを接触させることによって、肝細胞中に存在する
染色体に異常を誘発させる工程の２つの工程からなるも
のである。なお、工程の操作順序は、（ｉ）と同時に
（ii)(以下、（２)(a)と記す。）または（ii）から
（ｉ)(以下、（２)(b)と記す。）のどちらでもよい。
（ｉ）の工程において用いられる増殖刺激物質として
は、たとえば、表皮増殖因子（以下、ＥＧＦと記
す。）、肝細胞増殖因子（以下、ＨＧＦと記す。）等を
あげることができる。これら増殖刺激物質の処理方法と
しては、あらかじめ、たとえば、約５％〜約１０％牛胎
児血清を添加したウィリアムスＥ培地（Exp.Cell.Res.,
69:106〜112(1971) 等に記載）、約５％〜約１０％牛胎
児血清を添加したダルベッコＭＥＭ培地(Virology,8:39
6(1959) 、Virology,12:185(1960))等の通常の動物細胞
培養培地に存在する、分離された肝細胞に対してインス
リン約10- 7 Ｍ程度と共に増殖刺激物質を約１０ｎg/ml
〜約２０ｎg/mlの割合の処理量で、かつ約２４時間から
から約４８時間程度の処理時間をあげることができる。
好ましくは、分裂指数が最大となるような時間、すなわ
ち約４０時間から約４５時間程度である。このようにし
て、分離された肝細胞をインビトロで増殖させることが
できる。なお、インスリンは肝細胞を安定な状態に保つ
ために添加したほうが望ましいが、必ずしも必要という
わけではない。（ii）の工程において、肝細胞と検体で
ある化合物とを接触させる方法としては、肝細胞（5x10
5 cells ／10ml／シャーレ) に対して、検体である化合物を
約１０-6mg/ml 〜約１０mg/ml の割合の接種量で、かつ
約３時間から約４８時間程度の接触時間をあげることが
できる。具体的には、たとえば、（２)(a)として、分離
された肝細胞に増殖刺激物質を処理することによって、
肝細胞をインビトロで増殖させると同時に、該肝細胞と
検体である化合物とを約３時間から約４８時間程度接触
させる。なお、検体化合物との接触処理時間が増殖処理
時間より短い場合は、検体化合物との接触処理後、培地
交換を行なうことにより検体化合物を除去し、新たに増
殖刺激物質を添加する。そして検体化合物との接触処理
時間も含めた増殖処理時間が約２４時間から約４８時間
となるように培養する、２)(b)として、分離された肝細
胞と検体である化合物とを約３時間から約４８時間程度
接触させた後、培地交換を行なうことにより検体化合物
を除去し、新たに増殖刺激物質を添加する。そして増殖
処理時間が約２４時間から約４８時間となるように培養
する、方法等があげられる。このようにして、肝細胞中
に存在する染色体に異常を誘発させることができる。
【０００７】（３）得られた肝細胞を固定、染色した
後、肝細胞中に存在する染色体の異常を観察することに
よって、検体である化合物の肝細胞に対する染色体異常
誘発性を検出する工程に関して。得られた肝細胞は、た
とえば、「化学物質による染色体異常アトラス」、JEMS
・MMS 分科会編、朝倉書店(1988)等に記載される通常の
方法を用いて固定することができ、また「染色のすべ
て」、月刊Medical Technology別冊、医歯薬出版（株）
(1988)等に記載される通常の方法を用いて染色すること
ができる。好ましくは、ギムザ染色液を用いる方法がよ
い。そして、肝細胞中に存在する染色体の異常を観察す
るには、通常顕微鏡を用いて行う。なお、分裂指数は、
対物レンズ約１０倍から約２０倍程度で、１標本当たり
約1000個程度の肝細胞の分裂指数を計数するとよい。ま
た、染色体の異常は、対物レンズ約１００倍から約２０
０倍程度で、１標本当たり約100 個程度の分裂中期像を
観察するとよい。染色体の異常の典型的例としては、染
色分体ギャップ、染色分体切断、染色分体交換、染色体
ギャップ、染色体切断、染色体交換等の形態的な変化を
あげることができ、このような染色体の異常が存在する
か否によって、検体である化合物の肝細胞に対する染色
体異常誘発性を検出することができる。
後、肝細胞中に存在する染色体の異常を観察することに
よって、検体である化合物の肝細胞に対する染色体異常
誘発性を検出する工程に関して。得られた肝細胞は、た
とえば、「化学物質による染色体異常アトラス」、JEMS
・MMS 分科会編、朝倉書店(1988)等に記載される通常の
方法を用いて固定することができ、また「染色のすべ
て」、月刊Medical Technology別冊、医歯薬出版（株）
(1988)等に記載される通常の方法を用いて染色すること
ができる。好ましくは、ギムザ染色液を用いる方法がよ
い。そして、肝細胞中に存在する染色体の異常を観察す
るには、通常顕微鏡を用いて行う。なお、分裂指数は、
対物レンズ約１０倍から約２０倍程度で、１標本当たり
約1000個程度の肝細胞の分裂指数を計数するとよい。ま
た、染色体の異常は、対物レンズ約１００倍から約２０
０倍程度で、１標本当たり約100 個程度の分裂中期像を
観察するとよい。染色体の異常の典型的例としては、染
色分体ギャップ、染色分体切断、染色分体交換、染色体
ギャップ、染色体切断、染色体交換等の形態的な変化を
あげることができ、このような染色体の異常が存在する
か否によって、検体である化合物の肝細胞に対する染色
体異常誘発性を検出することができる。
【０００８】以上、実施例により詳細に説明するが、本
発明はこれに限定されるものではない。
発明はこれに限定されるものではない。
【０００９】実施例１ （２−アセチルアミノフルオレ
ンの染色体異常試験） ＳＤ系雄性ラットをネンブタール（Abbott Lab.,III,US
A ）で麻酔(0.3〜0.5ml ／匹）し、開腹し、腸管を向か
って右に寄せて肝門脈を充分に露出させた。結紮糸を肝
門脈にかけて輪をつくり、その後肝門脈へカニューレを
挿入した。この際カニューレの針先から下記の組成の前
灌流用緩衝液がわずかに流れ出るようにした。 前灌流用緩衝液（ｐＨ７．２） NaCl ８（ｇ／１０００ｍｌ
dist. water ） KCl ０．４ NaH 2 PO4 ・2H2 O ０．０７８ Na2 HPO 4 ・12H 2 O ０．１５１ HEPES ２．３８ NaHCO 3 ０．３５ フェノールレッドNa ０．００６ EGTA ０．１９ グルコース ０．９ HEPES ：N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N'-2-ethanesu
lfonic acid EGTA ：Ethyleneglycol bis( β-aminoethylether)-N,
N,N',N'-tetraaceticacid 針先が血管内に挿入されたことを確認した後、糸を結紮
し、カニューレを固定した。カニューレ固定後直ちに、
肝臓下の下大静脈を切断し、流速約30ml/ 分で37℃に保
温した前灌流用緩衝液を５分間灌流した。この間に、胸
郭部を開き、右心房に入る横隔膜下の下大静脈に結紮糸
の輪をかけた。右心房を切開し、右心房から下大静脈に
別のカニューレを挿入した。挿入後、糸を結紮してカニ
ューレを固定した。そして鉗子で切断した肝臓下の下大
静脈を止めた。この状態で、前灌流用緩衝液は肝門脈か
ら肝臓を流れ、横隔膜下の下大静脈を通って右心房より
出てくるようにした。前灌流用緩衝液の灌流後、該灌流
液を37℃に保温した下記の組成のコラゲナーゼ溶液に交
換し、同じ流速で約１０分間灌流を続けた。肝臓表面に
酵素液がしみだし、きめが荒くなってきたら灌流を中止
し、肝臓を摘出した。 コラゲナーゼ溶液（ｐＨ７．５） NaCl ８（ｇ／１０００ｍｌ
dist. water ） KCl ０．４ NaH 2 PO4 ・2H2 O ０．０７８ Na2 HPO 4 ・12H 2 O ０．１５１ HEPES ２．３８ NaHCO 3 ０．３５ フェノールレッドNa ０．００６ CaCl2 ０．５６ コラゲナーゼ １０００００ Units トリプシンインヒビター ０．０５ ペニシリン ５００００ IU ストレプトマイシン ０．０５ HEPES ：N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N'-2-ethanesu
lfonic acid 摘出された肝臓は氷冷した10％牛胎児血清（ＭＢＬ社
製）を添加したウィリアムスＥ培地中で保持した。肝細
胞を同培地中ではさみで細切した。得られた細胞浮遊液
をガーゼ４枚を重ねたもので濾過し、濾液を４℃、５０
×ｇ、１分間の低速遠心を行い、肝細胞を沈澱させた。
上清を除去した後、肝細胞を再び１０％牛胎児血清を添
加したウィリアムスＥ培地中に浮遊させた。沈澱、再浮
遊の洗浄操作を３回繰り返して、肝細胞を分離した。そ
して分離された肝細胞は、約５ｘ１０4 個／ｍｌの細胞
濃度で同培地に浮遊させた。この細胞浮遊液１０ｍｌ
を、あらかじめコラーゲンコートしたシャーレ（直径１
０ｃｍ）に分注した後、５％ＣＯ2 大気下、３７℃で、
２時間前培養することによりシャーレに付着させた。つ
ぎに、 （Ａ）肝細胞への増殖刺激開始と同時に検体である２−
アセチルアミノフルオレン（この化合物が染色体異常誘
発性を示すためには、代謝活性化が必要である。以下、
２−ＡＡＦと記す。）を処理する系（以下、Ａ群と記
す。）においては、培地に対して、０（無添加）、0.05
および 0.1μｇ／mlの濃度になるように２−ＡＡＦ、１
０μｇ／mlの濃度になるようにＥＧＦおよび１０-7Ｍの
濃度になるようにインスリンを同時に添加することによ
り、薬剤処理と同時に肝細胞を増殖させた。該増殖は５
％ＣＯ2 大気下、３７℃、２４時間行われた。２４時間
処理後、培地交換を実施して２−ＡＡＦを除き、さらに
１８時間、１０μｇ／mlのEGF と１０-7Ｍのインスリン
を加えた培地で肝細胞を増殖させた。 （Ｂ）肝細胞への増殖刺激開始前に検体である２−ＡＡ
Ｆを処理する系（以下、Ｂ群と記す。）においては、培
地に対して、０（無添加）、0.05および 0.1μｇ／mlの
濃度になるように２−ＡＡＦをシャーレ内に添加し、５
％ＣＯ2 大気下、３７℃で、２４時間処理した。処理
後、培地を交換し、化合物を除いた培地に対して１０μ
ｇ／mlの濃度になるようにＥＧＦおよび１０-7Ｍの濃度
になるようにインスリンを添加することにより、肝細胞
を増殖させた。該増殖は５％ＣＯ2大気下、３７℃、４
２時間行われた。 そしてＡ群およびＢ群の系とも増殖後の肝細胞をハンク
ス液（組成：塩化ナトリウム8000mg、塩化カリウム400m
g 、リン酸一水素ナトリウム( 無水)47.9mg 、リン酸二
水素ナトリウム( 無水)60mg 、硫酸マグネシウム( 無
水)46.8mg 、塩化カルシウム( 無水)140mg、ブドウ糖10
00mg、フェノールレッド6mg 、炭酸水素ナトリウム250m
g ／１Ｌ）10mlで２回洗浄し、さらにトリプシン・ＥＤ
ＴＡ溶液（組成：塩化ナトリウム8000mg、塩化カリウム
200mg 、リン酸一水素ナトリウム(無水)1150mg 、リン
酸二水素ナトリウム( 無水)200mg、EDTA・2Na 500mg 、
トリプシン500mg ／１Ｌ）10mlで１回洗浄した後、再び
5 ml/10cm シャーレの該トリプシン・ＥＤＴＡ溶液をシ
ャーレに添加し、37℃で、5 分間程放置することにより
付着した肝細胞を遊離させた。このようにして得られた
肝細胞浮遊液を1ml の牛胎児血清（ＭＢＬ社製）を入れ
た遠沈管に回収し、遠心分離（1000rpm 、５min 、室
温）により肝細胞を沈澱させた。沈澱した肝細胞は７５
mMの塩化カリウム水溶液６ｍｌ中に再懸濁され、そのま
ま室温(20 〜25℃) で、２０分間放置された。放置後、
1ml の氷冷した固定液（メタノール：酢酸＝３：１）を
上から加え、遠沈管を転倒混和した。混和後、遠心分離
（1000rpm 、５min 、４℃）により肝細胞を沈澱させ
た。上清を捨て、沈澱した肝細胞を４ｍｌの同固定液に
再懸濁後、再び遠心分離（1000rpm 、５min 、４℃）に
より肝細胞を沈澱させた。さらに再懸濁後、4 ℃で、１
０分間放置すること以外は同じ操作を２回繰り返した。
このようにして得られた肝細胞に少量の固定液（４℃）
を添加し、肝細胞を浮遊させた。つぎに該肝細胞浮遊液
をスライドグラス上に滴下し、室温(20 〜25℃)で、一
晩風乾させた。風乾後、３％ギムザ染色液〔組成：ギム
ザ液( メルク社製)30ml 、1/15M リン酸緩衝液 970ml
（リン酸一水素ナトリウム−リン酸二水素カリウム、 p
H6.8) 〕で室温(20 〜25℃) で、１５分間染色した。蒸
留水で３回洗浄した後、ドライヤーにて乾燥させた。こ
のようにして得られた標本はカバーグラスをかけ、顕微
鏡下で観察された。結果を表１に示す。
ンの染色体異常試験） ＳＤ系雄性ラットをネンブタール（Abbott Lab.,III,US
A ）で麻酔(0.3〜0.5ml ／匹）し、開腹し、腸管を向か
って右に寄せて肝門脈を充分に露出させた。結紮糸を肝
門脈にかけて輪をつくり、その後肝門脈へカニューレを
挿入した。この際カニューレの針先から下記の組成の前
灌流用緩衝液がわずかに流れ出るようにした。 前灌流用緩衝液（ｐＨ７．２） NaCl ８（ｇ／１０００ｍｌ
dist. water ） KCl ０．４ NaH 2 PO4 ・2H2 O ０．０７８ Na2 HPO 4 ・12H 2 O ０．１５１ HEPES ２．３８ NaHCO 3 ０．３５ フェノールレッドNa ０．００６ EGTA ０．１９ グルコース ０．９ HEPES ：N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N'-2-ethanesu
lfonic acid EGTA ：Ethyleneglycol bis( β-aminoethylether)-N,
N,N',N'-tetraaceticacid 針先が血管内に挿入されたことを確認した後、糸を結紮
し、カニューレを固定した。カニューレ固定後直ちに、
肝臓下の下大静脈を切断し、流速約30ml/ 分で37℃に保
温した前灌流用緩衝液を５分間灌流した。この間に、胸
郭部を開き、右心房に入る横隔膜下の下大静脈に結紮糸
の輪をかけた。右心房を切開し、右心房から下大静脈に
別のカニューレを挿入した。挿入後、糸を結紮してカニ
ューレを固定した。そして鉗子で切断した肝臓下の下大
静脈を止めた。この状態で、前灌流用緩衝液は肝門脈か
ら肝臓を流れ、横隔膜下の下大静脈を通って右心房より
出てくるようにした。前灌流用緩衝液の灌流後、該灌流
液を37℃に保温した下記の組成のコラゲナーゼ溶液に交
換し、同じ流速で約１０分間灌流を続けた。肝臓表面に
酵素液がしみだし、きめが荒くなってきたら灌流を中止
し、肝臓を摘出した。 コラゲナーゼ溶液（ｐＨ７．５） NaCl ８（ｇ／１０００ｍｌ
dist. water ） KCl ０．４ NaH 2 PO4 ・2H2 O ０．０７８ Na2 HPO 4 ・12H 2 O ０．１５１ HEPES ２．３８ NaHCO 3 ０．３５ フェノールレッドNa ０．００６ CaCl2 ０．５６ コラゲナーゼ １０００００ Units トリプシンインヒビター ０．０５ ペニシリン ５００００ IU ストレプトマイシン ０．０５ HEPES ：N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N'-2-ethanesu
lfonic acid 摘出された肝臓は氷冷した10％牛胎児血清（ＭＢＬ社
製）を添加したウィリアムスＥ培地中で保持した。肝細
胞を同培地中ではさみで細切した。得られた細胞浮遊液
をガーゼ４枚を重ねたもので濾過し、濾液を４℃、５０
×ｇ、１分間の低速遠心を行い、肝細胞を沈澱させた。
上清を除去した後、肝細胞を再び１０％牛胎児血清を添
加したウィリアムスＥ培地中に浮遊させた。沈澱、再浮
遊の洗浄操作を３回繰り返して、肝細胞を分離した。そ
して分離された肝細胞は、約５ｘ１０4 個／ｍｌの細胞
濃度で同培地に浮遊させた。この細胞浮遊液１０ｍｌ
を、あらかじめコラーゲンコートしたシャーレ（直径１
０ｃｍ）に分注した後、５％ＣＯ2 大気下、３７℃で、
２時間前培養することによりシャーレに付着させた。つ
ぎに、 （Ａ）肝細胞への増殖刺激開始と同時に検体である２−
アセチルアミノフルオレン（この化合物が染色体異常誘
発性を示すためには、代謝活性化が必要である。以下、
２−ＡＡＦと記す。）を処理する系（以下、Ａ群と記
す。）においては、培地に対して、０（無添加）、0.05
および 0.1μｇ／mlの濃度になるように２−ＡＡＦ、１
０μｇ／mlの濃度になるようにＥＧＦおよび１０-7Ｍの
濃度になるようにインスリンを同時に添加することによ
り、薬剤処理と同時に肝細胞を増殖させた。該増殖は５
％ＣＯ2 大気下、３７℃、２４時間行われた。２４時間
処理後、培地交換を実施して２−ＡＡＦを除き、さらに
１８時間、１０μｇ／mlのEGF と１０-7Ｍのインスリン
を加えた培地で肝細胞を増殖させた。 （Ｂ）肝細胞への増殖刺激開始前に検体である２−ＡＡ
Ｆを処理する系（以下、Ｂ群と記す。）においては、培
地に対して、０（無添加）、0.05および 0.1μｇ／mlの
濃度になるように２−ＡＡＦをシャーレ内に添加し、５
％ＣＯ2 大気下、３７℃で、２４時間処理した。処理
後、培地を交換し、化合物を除いた培地に対して１０μ
ｇ／mlの濃度になるようにＥＧＦおよび１０-7Ｍの濃度
になるようにインスリンを添加することにより、肝細胞
を増殖させた。該増殖は５％ＣＯ2大気下、３７℃、４
２時間行われた。 そしてＡ群およびＢ群の系とも増殖後の肝細胞をハンク
ス液（組成：塩化ナトリウム8000mg、塩化カリウム400m
g 、リン酸一水素ナトリウム( 無水)47.9mg 、リン酸二
水素ナトリウム( 無水)60mg 、硫酸マグネシウム( 無
水)46.8mg 、塩化カルシウム( 無水)140mg、ブドウ糖10
00mg、フェノールレッド6mg 、炭酸水素ナトリウム250m
g ／１Ｌ）10mlで２回洗浄し、さらにトリプシン・ＥＤ
ＴＡ溶液（組成：塩化ナトリウム8000mg、塩化カリウム
200mg 、リン酸一水素ナトリウム(無水)1150mg 、リン
酸二水素ナトリウム( 無水)200mg、EDTA・2Na 500mg 、
トリプシン500mg ／１Ｌ）10mlで１回洗浄した後、再び
5 ml/10cm シャーレの該トリプシン・ＥＤＴＡ溶液をシ
ャーレに添加し、37℃で、5 分間程放置することにより
付着した肝細胞を遊離させた。このようにして得られた
肝細胞浮遊液を1ml の牛胎児血清（ＭＢＬ社製）を入れ
た遠沈管に回収し、遠心分離（1000rpm 、５min 、室
温）により肝細胞を沈澱させた。沈澱した肝細胞は７５
mMの塩化カリウム水溶液６ｍｌ中に再懸濁され、そのま
ま室温(20 〜25℃) で、２０分間放置された。放置後、
1ml の氷冷した固定液（メタノール：酢酸＝３：１）を
上から加え、遠沈管を転倒混和した。混和後、遠心分離
（1000rpm 、５min 、４℃）により肝細胞を沈澱させ
た。上清を捨て、沈澱した肝細胞を４ｍｌの同固定液に
再懸濁後、再び遠心分離（1000rpm 、５min 、４℃）に
より肝細胞を沈澱させた。さらに再懸濁後、4 ℃で、１
０分間放置すること以外は同じ操作を２回繰り返した。
このようにして得られた肝細胞に少量の固定液（４℃）
を添加し、肝細胞を浮遊させた。つぎに該肝細胞浮遊液
をスライドグラス上に滴下し、室温(20 〜25℃)で、一
晩風乾させた。風乾後、３％ギムザ染色液〔組成：ギム
ザ液( メルク社製)30ml 、1/15M リン酸緩衝液 970ml
（リン酸一水素ナトリウム−リン酸二水素カリウム、 p
H6.8) 〕で室温(20 〜25℃) で、１５分間染色した。蒸
留水で３回洗浄した後、ドライヤーにて乾燥させた。こ
のようにして得られた標本はカバーグラスをかけ、顕微
鏡下で観察された。結果を表１に示す。
【００１０】
【表１】
【００１１】いずれの処理群（Ａ，Ｂ）とも、２−ＡＡ
Ｆは濃度依存的に染色体異常を誘発した。
Ｆは濃度依存的に染色体異常を誘発した。
【００１２】実施例２ （シクロホスファミドの染色体
異常試験） 検体である２−ＡＡＦの代わりに、シクロホスファミド
（この化合物が染色体異常誘発性を示すためには、代謝
活性化が必要である。以下、ＣＰと記す。）を用いて、
かつその処理量を、０（無添加）、５および２０μｇ／
mlに代えた以外は実施例１と同様な試験を行った。結果
を表２に示す。
異常試験） 検体である２−ＡＡＦの代わりに、シクロホスファミド
（この化合物が染色体異常誘発性を示すためには、代謝
活性化が必要である。以下、ＣＰと記す。）を用いて、
かつその処理量を、０（無添加）、５および２０μｇ／
mlに代えた以外は実施例１と同様な試験を行った。結果
を表２に示す。
【００１３】
【表２】
【００１４】いずれの処理群（Ａ，Ｂ）とも、ＣＰは濃
度依存的に染色体異常を誘発した。
度依存的に染色体異常を誘発した。
【００１５】実施例３ （マイトマイシンＣの染色体異
常試験） 検体である２−ＡＡＦの代わりに、マイトマイシンＣ
（この化合物は代謝活性化を受けずとも染色体異常誘発
性を示す。以下、ＭＭＣと記す。）を用いて、かつその
処理量を、０（無添加）、0.01および0.03μｇ／mlに代
えた以外は実施例１と同様な試験を行った。結果を表３
に示す。
常試験） 検体である２−ＡＡＦの代わりに、マイトマイシンＣ
（この化合物は代謝活性化を受けずとも染色体異常誘発
性を示す。以下、ＭＭＣと記す。）を用いて、かつその
処理量を、０（無添加）、0.01および0.03μｇ／mlに代
えた以外は実施例１と同様な試験を行った。結果を表３
に示す。
【００１６】
【表３】
【００１７】いずれの処理群（Ａ，Ｂ）とも、ＭＭＣは
濃度依存的に染色体異常を誘発した。
濃度依存的に染色体異常を誘発した。
【００１８】
【発明の効果】本発明方法により、少ない労力と時間で
化合物の肝細胞に対する染色体異常誘発性を検出するこ
とができるようになった。また、高薬物代謝活性を維持
している増殖後の肝細胞を用いることにより、高感度で
の検出を可能とした。
化合物の肝細胞に対する染色体異常誘発性を検出するこ
とができるようになった。また、高薬物代謝活性を維持
している増殖後の肝細胞を用いることにより、高感度で
の検出を可能とした。
Claims (2)
- 【請求項１】（１）哺乳類の肝臓から肝細胞を分離する
工程、 （２）(a) 分離された肝細胞に増殖刺激物質を処理する
ことによって、肝細胞をインビトロで増殖させると同時
に、該肝細胞と検体である化合物とを接触させることに
よって、肝細胞中に存在する染色体に異常を誘発させる
工程、または(b)分離された肝細胞と検体である化合物
とを接触させることによって、肝細胞中に存在する染色
体に異常を誘発させた後、該肝細胞に増殖刺激物質を処
理することによって、肝細胞をインビトロで増殖させる
工程、 （３）得られた肝細胞を固定、染色した後、肝細胞中に
存在する染色体の異常を観察することによって、検体で
ある化合物の肝細胞に対する染色体異常誘発性を検出す
る工程、からなることを特徴とする染色体異常試験方
法。 - 【請求項２】哺乳類がラットである請求項１記載の染色
体異常試験方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26897793A JPH07115993A (ja) | 1993-10-27 | 1993-10-27 | 肝細胞を用いたインビトロ染色体異常試験方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26897793A JPH07115993A (ja) | 1993-10-27 | 1993-10-27 | 肝細胞を用いたインビトロ染色体異常試験方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07115993A true JPH07115993A (ja) | 1995-05-09 |
Family
ID=17465941
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26897793A Pending JPH07115993A (ja) | 1993-10-27 | 1993-10-27 | 肝細胞を用いたインビトロ染色体異常試験方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07115993A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012045731A1 (de) * | 2010-10-04 | 2012-04-12 | Medicyte Gmbh | Geeignete hepatozyten für in-vitro genotoxizitätstests |
-
1993
- 1993-10-27 JP JP26897793A patent/JPH07115993A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012045731A1 (de) * | 2010-10-04 | 2012-04-12 | Medicyte Gmbh | Geeignete hepatozyten für in-vitro genotoxizitätstests |
| CN103221822A (zh) * | 2010-10-04 | 2013-07-24 | 米迪赛特有限公司 | 用于体外基因毒性试验的合适的肝细胞 |
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