CN110982778B - 一种大鼠肝s9的诱导方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种大鼠肝S9的诱导方法，包括如下步骤：(a)选择6‑7周雄性大鼠，采用经口灌和腹腔注射方式联合给予1‑苄基咪唑和环己醇两种诱导剂诱导；(b)处死大鼠，无菌条件下应用预冷缓冲液灌洗肝脏，取出肝脏称重；(c)剪碎肝脏，加入预冷缓冲液混匀在冰浴中用匀浆器制成肝匀浆；(d)将肝匀浆置低温高速离心机中，离心后取其上清液即得到大鼠肝S9；(e)检测大鼠肝S9的蛋白浓度和典型肝代谢酶基因表达相对倍数。本发明所述的诱导剂方法经济、易得，对活化化学物质的典型代谢酶均有较强的诱导作用，适用于工业化学品、药物和环境化学物安全性评价。

Description

一种大鼠肝S9的诱导方法
技术领域
本发明属于蛋白酶学领域，尤其是涉及一种大鼠肝S9的诱导方法。
背景技术
在化学物质致突变、致癌等安全性评价试验中，相当部分化学物质需经代谢活化才能引起致突变、致癌作用，因此在新药或新化学物质的非临床安全性评价中，体外短期试验应采用适当的活化系统。大鼠肝S9是大鼠肝实质细胞匀浆液的去线粒体上清液，包含了大量化学物质代谢酶，常作为体外试验的生物转化活化系统。传统的大鼠肝S9诱导剂有两种：一是多氯联苯混合物，因其致癌性强，严重污染环境，许多国家已禁止生产，作为科研试剂价格昂贵；另一种是苯巴比妥和β-萘黄酮联用，苯巴比妥作为麻醉剂购买受到严格管控。另外，经典诱导剂还存在一个主要问题，对化学物质代谢活化起主要作用的细胞色素P450(cytochrome P450，CYP)亚型2E1、2C11无诱导作用。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种大鼠肝S9的诱导方法，本发明通过建立一种新的诱导方法，使用的诱导剂经济、易得，对活化化学物质的典型代谢酶均有较强的诱导作用，适用于工业化学品、药物和环境化学物安全性评价。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种大鼠肝S9的诱导方法，包括如下步骤：
(a)选择6-7周雄性大鼠，采用经口灌和腹腔注射方式联合给予1-苄基咪唑和环己醇两种诱导剂诱导；
(b)处死大鼠，无菌条件下应用预冷缓冲液灌洗肝脏，取出肝脏称重；
(c)剪碎肝脏，加入预冷缓冲液混匀在冰浴中用匀浆器制成肝匀浆；
(d)将肝匀浆置低温高速离心机中，离心后取其上清液即得到大鼠肝S9；
(e)检测大鼠肝S9的蛋白浓度和典型肝代谢酶基因表达相对倍数。
进一步的，所述步骤(a)的诱导方法为经口灌胃1-苄基咪唑50-75mg/kg连续3-5天，腹腔注射环己醇0.3-0.5mL/kg连续2天，末次给药后24h处死大鼠取肝。
进一步的，所述雄性大鼠为雄性SD大鼠。
进一步的，所述步骤(b)和步骤(c)中使用的预冷缓冲液为pH为7.4，浓度为0.15mol/L的KCl缓冲液。
进一步的，所述诱导方法还包括在步骤(b)后去除肝中残血的步骤，具体操作如下：使用预冷缓冲液经门静脉灌洗肝脏。
进一步的，所述步骤(c)中预冷缓冲液的加入量为肝湿重的3倍。
进一步的，所述步骤(e)中速度为9000g，时间20min，温度控制2-6℃。
相对于现有技术，本发明所述的大鼠肝S9的诱导方法具有以下优势：
本发明的诱导剂方法经济、易得，对活化化学物质的典型代谢酶均有较强的诱导作用，适用于工业化学品、药物和环境化学物安全性评价。
附图说明
图1为应用本发明诱导方法和传统诱导方法获得鼠肝S9在细菌回复突变试验中的应用结果。
图2为应用本发明诱导方法和传统诱导方法的获得鼠肝S9代谢酶CYP1A1、CYP2B1、CYP2C6基因表达诱导倍数。
图3为应用本发明诱导方法和传统诱导方法的获得鼠肝S9代谢酶CYP1A2、CYP2B2、CYP2C11、CYP2E1、CYP3A2、CYP3A23基因表达诱导倍数。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
本发明用到化学试剂有：1-苄基咪唑、环己醇、β-萘黄酮、2-氨基芴、N-亚硝基二甲胺。以上化学物均购自SIGMA公司，分析纯试剂，为中检科健(天津)检验检测有限责任公司保存。
本发明建立一种大鼠肝S9的诱导方法，对表达化学物质典型代谢酶均有较强的诱导作用。
实施例1：诱导剂剂量的选择
(a)选择6-7雄性大鼠21只，使用时已在动物室适应并检疫观察1周；将21只大鼠按体重分层随机分配到7组中，每组3只；
(b)组1：经口灌胃1-苄基咪唑25mg/kg连续3天；组2：经口灌胃1-苄基咪唑50mg/kg连续3天；组3：经口灌胃1-苄基咪唑75mg/kg连续3天；组4：腹腔注射环己醇0.1mL/kg连续2天；组5：腹腔注射环己醇0.3mL/kg连续2天；组6：腹腔注射环己醇0.5mL/kg连续2天；组1至6均于末次给药后24h处死大鼠取肝；阴性对照组：大鼠经口灌胃0.5mL含0.5％Tween20的溶液连续3天，末次给药后24h处死大鼠取肝；
(c)用手术剪剪取约0.5g肝脏用于基因表达检测；
(d)分别提取肝组织中总RNA，反转录获得cDNA；使用下述引物进行定量PCR检测：
CYP2B1上游引物：GGGAAAGAGGAGTGTGGAAGAA
CYP2B1下游引物：GAGCAGATGATGTTGGCTGTG
CYP2E1上游引物：GGAAGGATGTGCGGAGGTT
CYP2E1下游引物：CAGAAATGTGGGGTCAAAAGG
根据基因表达结果，1-苄基咪唑引起的CYP2B1表达水平在25mg/kg剂量下显著低于50-75mg/kg，环己醇引起的CYP2E1表达水平在0.1mL/kg剂量下显著低于0.3-0.5mL/kg。因此诱导剂浓度的选择：1-苄基咪唑50-75mg/kg，环己醇0.3-0.5mL/kg。
实施例2：诱导时间的选择
(a)选择6-7雄性大鼠12只，使用时已在动物室适应并检疫观察1周；将12只大鼠按体重分层随机分配到4组中，每组3只；
(b)组1：经口灌胃1-苄基咪唑75mg/kg 1天；组2：经口灌胃1-苄基咪唑75mg/kg连续3天；组3：经口灌胃1-苄基咪唑75mg/kg连续5天；阴性对照组：大鼠经口灌胃0.5mL含0.5％Tween 20的溶液连续3天，末次给药后24h处死大鼠取肝。
(c)用手术剪剪取约0.5g肝脏用于基因表达检测；
(d)分别提取肝组织中总RNA，反转录获得cDNA；使用下述引物进行定量PCR检测：
CYP2B1上游引物：GGGAAAGAGGAGTGTGGAAGAA
CYP2B1下游引物：GAGCAGATGATGTTGGCTGTG
根据基因表达结果，1-苄基咪唑引起的CYP2B1表达水平在给药1天时显著低于3-5天，诱导时间的选择：1-苄基咪唑连续3-5天。
实施例3：大鼠肝S9制备
(a)选择6-7雄性大鼠9只，使用时已在动物室适应并检疫观察1周；将9只大鼠按体重分层随机分配到3组中，每组3只；
(b)经口灌胃1-苄基咪唑75mg/kg连续3天，腹腔注射环己醇0.5mL/kg连续2天，末次给药后24h处死大鼠取肝；
(c)处死大鼠，无菌条件下应用预冷0.15mol/L KCl缓冲液(pH 7.4)灌洗肝脏，取出肝脏称重；
(d)用手术剪剪取约0.5g肝脏用于基因表达检测，用手术剪将其余肝脏剪碎，按肝湿重比3倍加预冷缓冲液混匀，在冰浴中用匀浆器制成肝匀浆；
(e)将匀浆液置低温高速离心机中，温度控制2-6℃，离心速度为9000g，时间20min，离心后取其上清液即得到肝S9。
另外设置阴性对照组和传统诱导对照组，具体地步骤如下：
阴性对照组：大鼠经口灌胃0.5mL含0.5％Tween 20的溶液连续3天，末次给药后24h处死大鼠取肝，其他步骤与本发明相同。
传统诱导对照组：将苯巴比妥片用0.9％氯化钠注射液制成所需浓度，β-萘黄酮用玉米油配制成32mg/mL浓度，于第1天每只大鼠按2.5mL/kg腹腔注射浓度为12mg/mL苯巴比妥，第2-4天腹腔注射浓度为32mg/mL苯巴比妥和β-萘黄酮，末次给药后24h处死大鼠取肝，其他步骤与本发明相同。
实施例4：细菌回复突变试验
将本发明的诱导方法得到的鼠肝S9以及传统诱导方法得到的鼠肝S9应用于经典体外细菌回复突变试验(TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535)，由图1可以看出，对典型间接致突变物2-氨基芴(2AF)具有与传统诱导方法获得鼠肝S9相当的活化作用，对传统诱导方法获得鼠肝S9应用TA100菌株不表现出活化作用的N-亚硝基二甲胺(NMDA)，应用本发明所述诱导方法获得鼠肝S9表现出活化作用。
实施例5：典型肝代谢酶基因表达相对倍数检测
将本发明的诱导方法得到的鼠肝S9以及传统诱导方法得到的鼠肝S9分别提取肝组织中总RNA，反转录获得cDNA；使用下述引物进行定量PCR检测：
GAPDH上游引物：CCCATCACCATCTTCCAGGAG
GAPDH下游引物：GTTGTCATGGATGACCTTGGC
CYP1A1上游引物：CATTGTGCCTGCCTCCTACTT
CYP1A1下游引物：GTTCCTGTGGGTCTCTGCTGT
CYP1A2上游引物：CACAGCACAACGAGGGACA
CYP1A2下游引物：TCTGGGCGGAACACAAAG
CYP2B1上游引物：GGGAAAGAGGAGTGTGGAAGAA
CYP2B1下游引物：GAGCAGATGATGTTGGCTGTG
CYP2B2上游引物：CGGCGATTCTCTCTGGCTAC
CYP2B2下游引物：GCAGTTCCTCCACCAAACATTG
CYP2C6上游引物：CTGTTGCTCCTGCTGAAGTGTCC
CYP2C6下游引物：CCGCATGTGGCAGGTTGGTAG
CYP2C11上游引物：AGCTTGGTGGCTACTGTAACTGAC
CYP2C11下游引物：CAGCAGCAGCAGGAGTCCATAC
CYP2E1上游引物：GGAAGGATGTGCGGAGGTT
CYP2E1下游引物：CAGAAATGTGGGGTCAAAAGG
CYP3A2上游引物：GATCCTTTTGTGGAGAAAACCAAG
CYP3A2下游引物：TTGGGGTGAGGAATGGAAAG
CYP3A23上游引物：ATGTTCCCTGTCATCGAACAGTATG
CYP3A23下游引物：TTCACAGGGACAGGTTTGCCT
常规方法计算相对表达诱导倍数，结果见图2和图3，结果表明本发明所述的大鼠肝S9的诱导方法，对表达化学物质典型代谢酶均有较强的诱导作用，尤其对传统诱导方法中无诱导作用的代谢酶2E1、2C11具有诱导作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种大鼠肝S9的诱导方法，其特征在于：包括如下步骤：
(a)选择6-7周雄性大鼠，采用经口灌和腹腔注射方式联合给予1-苄基咪唑和环己醇两种诱导剂诱导，诱导方法为经口灌胃1-苄基咪唑50-75mg/kg连续3-5天，腹腔注射环己醇0.3-0.5mL/kg连续2天；
(b) 末次给药后24h处死大鼠，无菌条件下应用预冷缓冲液灌洗肝脏，取出肝脏称重；
(c)剪碎肝脏，加入预冷缓冲液混匀在冰浴中用匀浆器制成肝匀浆；
(d)将肝匀浆置低温高速离心机中，离心后取其上清液即得到大鼠肝S9；
(e)检测大鼠肝S9的蛋白浓度和典型肝代谢酶基因表达相对倍数。
2.根据权利要求1所述的大鼠肝S9的诱导方法，其特征在于：所述雄性大鼠为雄性SD大鼠。
3.根据权利要求1所述的大鼠肝S9的诱导方法，其特征在于：所述步骤(b)和步骤(c)中使用的预冷缓冲液为pH为7.4，浓度为0.15mol/L的KCl缓冲液。
4.根据权利要求3所述的大鼠肝S9的诱导方法，其特征在于：所述诱导方法还包括在步骤(b)后去除肝中残血的步骤，具体操作如下：使用预冷缓冲液经门静脉灌洗肝脏。
5.根据权利要求1所述的大鼠肝S9的诱导方法，其特征在于：所述步骤(c)中预冷缓冲液的加入量为肝湿重的3倍。
6.根据权利要求1所述的大鼠肝S9的诱导方法，其特征在于：所述步骤(d)中离心速度为9000g，时间20min，温度控制2-6℃。
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