JP2024501818A - 微生物の複合群集を増殖させる方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、微生物の複合群集を増殖させる方法、該方法によって得られた増殖させた微生物の複合群集、該増殖させた微生物の複合群集を含む医薬製剤、並びに該増殖させた微生物の複合群集及び該医薬製剤の使用に関する。

Description

本発明は、微生物の複合群集を増殖させる方法、該方法によって得られた増殖させた微生物の複合群集、該増殖させた微生物の複合群集を含む医薬製剤、並びに該増殖させた微生物の複合群集及び該医薬製剤の使用に関する。

微生物の複合群集は、健康及び疾患において重要な役割を果たす。特に、微生物の複合群集の投与又は移植のような使用が感染及び疾患を処置し得ることが発見されている。

微生物の複合群集を使用する場合、使用される試料が、細菌の生存率及び多様性に関して適切なプロファイルを有することが重要である。

現在適用されている方法は、多くの場合、経験的であり、使用される試料中に存在する細菌の多様性を確保するために、又は細菌の生存率を最良に保つために、特定の予防措置を採ることはない。

さらに、用途に応じて、微生物の複合群集の複数回の使用が必要である。しかしながら、最初の試料収集では、経時的に再現可能な用量での治療の全過程に十分な材料が提供されない。

所望の量の微生物の複合群集を得るために複数のドナーに協力を要請しても、それ自体では先行技術の欠点を十分に改善するものではない。第１に、ドナーはいくつかの周知の病原性微生物種を有していてはならないため、ドナー選択は注意を払うものかつ困難なものであり得る。ドナー選択は高度な管理下におかれるため、ドナー候補の９０％超がスクリーニング評価に合格しない。第２に、均質でない異なるドナーに由来する異なる用量を投与することは、治療効力に有害であり得る。例えば、治療の場合、対象が、受けた微生物の複合群集の各用量（又は試料）に対して同様に応答することを確保するため、用量が可能な限り均一であることが必要となり得る。

したがって、既存の方法では、使用される試料間にかなりの不均一性が存在し、これは非常に望ましくない。

したがって、安全であり（多くのドナーを試験する必要がなく）、再現可能であり（同じプロトコルに従うことによって得られる異なる用量／試料間に均質性があり）、有効であり、特に工業規模で実施するのが容易である一方で、細菌の多様性が、意図される目的に応じて保存又は最適化され、方法全体及び貯蔵中の細菌の生存率が保存される、微生物の初期複合群集を大量に提供する方法を提供することが必要とされている。

本発明は、上記の必要性に応えるものである。

したがって、本発明の目的は、例えば投与法又は移植法において使用するための最適な多様性及び十分な細菌生存率を有し、工業規模であっても安全に、容易に、確実に、かつ再現可能に製造することができる、増殖させた微生物の複合群集を提供することである。

本発明は、微生物の複合群集を増殖させる方法であって、以下のステップを含む方法に関する：
（ａ）少なくとも２つのバイオリアクター、好ましくは少なくとも３つのバイオリアクターで、該微生物の複合群集を培養することであって、該バイオリアクターが、少なくとも１つの異なるパラメータを有し、該パラメータが、ｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせから選択されて、少なくとも２つの採取された接種材料を得る、培養することと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた少なくとも２つの採取された接種材料を混合して、増殖させた微生物の複合群集を得ること。

本発明はまた、本発明の方法によって得られる増殖させた微生物の複合群集であって、以下から選択される少なくとも３つの細菌門を含むことを特徴とする増殖した微生物の複合群集に関する：バクテロイデーテス（Bacteroidetes）、シネルギステテス（Synergistetes）、ファーミキューテス（Firmicutes）、プロテオバクテリア（Proteobacteria）、アクチノバクテリア（Actinobacteria）、ベルコミクロビア（Verrucomicrobia）、テネリクテス（Tenericutes）、フソバクテリア（Fusobacteria）及びそれらの混合物。

本発明はまた、クロストリジウム（Clostridium）、ユーバクテリウム（Eubacterium）、アネロスティペス（Anaerostipes）、バクテロイデス（Bacteroides）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、ブラウティア（Blautia）、ブチリコッカス（Butyricicoccus）、コリンセラ（Collinsella）、ダイアリスター（Dialister）、ドレア（Dorea）、アイゼンベルギエラ（Eisenbergiella）、エシェリキア・シゲラ（Escherichia-Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、フィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）、フシカテニバクター（Fusicatenibacter）、フンガテラ（Hungatella）、ラクノクロストリジウム（Lachnoclostridium）、パラステラ（Parasutterella）、ローズブリア（Roseburia）、ユーバクテリウム（Eubacterium）、［ユーバクテリウム］コプロスタノリゲネス（[Eubacterium]coprostanoligenes）群、［ユーバクテリウム］フィシカテナ（[Eubacterium]fissicatena）群、［ルミノコッカス］トルクス（[Ruminococcus]torque）群、アリゾネラ（Allisonella）、ビロフィラ（Bilophila）、クリステンセネラ（Christensenella）、クリステンセンネラ（Christensenellaceae）Ｒ－７群、クロストリジウム（Clostridium）、クロストリジウム・センス・ストリクト１（Clostridium sensu stricto 1）、コポロコッカス（Coporococcus）、デスルフォビブリオ（Desulfovibrio）、エンテロコッカス（Enterococcus）、フラボニフラクター（Flavonifractor）、ラクノスピラＮＫ４Ａ１３６（Lachnospiraceae NK4A136）群、ラクノスピラＵＣＧ－００１（Lachnospiraceae UCG-001）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、パラバクテロイデス（Parabacteroides）、ペプトストレプトコッカス（Peptostreptococcus）、ロンブツシア（Romboutsia）、ルミノクロストリジウム（Ruminoclostridium）、ルミノコッカスＵＣＧ－００３（Ruminococcaceae UCG-003）、ルミノコッカスＵＣＧ－０１３（Ruminococcaceae UCG-013）、ルミノコッカスＵＣＧ－０１４（Ruminococcaceae UCG-014）、ルミノコッカス（Ruminococcus）、サブドリグラヌラム（Subdoligranulum）及びステレラ（Sutterella）、及びそれらの混合物、を含む群から選択される少なくとも１５の属を含むことを特徴とする、本発明の方法によって得られる増殖させた微生物の複合群集に関する。

本発明はまた、本発明の方法によって得られる増殖させた微生物の複合群集を含む医薬製剤に関する。

本発明はまた、本発明の方法によって得られる増殖させた微生物の複合群集、先に定義された増殖させた微生物の複合群集、又は先に定義された医薬製剤であって、任意選択で、薬物ベースの療法、免疫療法、免疫チェックポイント阻害剤、腫瘍ネオ抗原を標的とする療法、化学療法及び／又は放射線療法と組み合わせた医薬としてのその使用のためのものに関する。

本発明はまた、本発明の方法によって得られる増殖させた微生物の複合群集、上記の増殖させた微生物の複合群集、又は上記の医薬製剤であって、敗血症、敗血性ショック、感染、例えばクロストリジウム・ディフィシル（Clostridioides difficile）感染及び関連する下痢（ＣＤＩ）、潰瘍性結腸炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性大腸症候群（ＩＢＳ）、特発性便秘、セリアック病、クローン病、１型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、食物アレルギー、固形がん及び液性がん、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、例えば胃腸急性ＧｖＨＤ、ステロイド抵抗性ＧｖＨＤ又はステロイド依存性ＧｖＨＤ、肥満及び病的肥満、自閉、硬化症、慢性膣感染、例えば膀胱炎及び真菌症、骨・関節感染症、パーキンソン病、アルツハイマー病、統合失調症及び双極性障害、消化管障害、例えば腸炎、下痢、旅行者下痢、粘膜炎、腹痛及び胃腸出血、腸内毒素症、例えばがん化学療法又は免疫療法に関連付けられる腸内毒素症、集中治療室（ＩＣＵ）関連腸内毒素症、アルコール性及び非アルコール性肝臓疾患、治療誘発性炎症、例えば治療誘発性腸炎、抗がん療法誘発性炎症、血液疾患、コロナウイルス感染症、同種造血幹細胞移植（ａｌｌｏ－ＨＳＣＴ）から生じる感染性又は非感染性合併症、例えば同種造血幹細胞移植（ａｌｌｏ－ＨＳＣＴ）後ステロイド抵抗性移植片対宿主病（ＳＲ－ａＧｖＨＤ）、クロストリジウム（Clostridium）、エンテロコッキ（Enterococci）などの、例えばバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）及びグリコペプチド耐性腸球菌（ＧＲＥ）、広域スペクトルβ－ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）産生細菌、カルバペネマーゼ産生腸内細菌（ＣＰＥ）、高抗生物質耐性細菌（Emerging Bacteria Highly Resistant to Antibiotics、ＢＨＲｅ）を含む多剤耐性細菌による保菌又は感染、及び／又は悪性血液疾患、及びこれらの組み合わせの予防及び／又は治療における使用のための、該増殖させた複合群集又は医薬製剤と、任意選択で、薬物ベースの療法、免疫療法、免疫チェックポイント阻害剤、腫瘍ネオ抗原を標的とする療法、化学治療及び／又は放射線治療との組み合わせにも関する。

本発明はまた、本発明の方法によって得られる増殖させた微生物の複合群集、先に定義された増殖させた微生物の複合群集、又は先に定義された医薬製剤であって、任意選択で、薬物ベースの療法、免疫療法、免疫チェックポイント阻害剤、腫瘍ネオ抗原を標的とする療法、化学療法及び／又は放射線療法と組み合わせた、マイクロバイオーム生態系療法におけるその使用のためのものに関する。

本発明の第１の目的は、微生物の複合群集を増殖させる方法であって、以下のステップを含む方法に関する：
（ａ）少なくとも２つのバイオリアクター、好ましくは少なくとも３つのバイオリアクターで微生物の該複合群集を培養することであって、該バイオリアクターが少なくとも１つの異なるパラメータを有し、少なくとも２つの採取された接種材料を得る、培養することと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた少なくとも２つの採取された接種材料を混合して、増殖させた微生物の複合群集を得ること。

「パラメータ」とは、培養ステップに影響を及ぼす任意のパラメータと理解することができる。好ましくは、該パラメータは、ｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせから選択される。より好ましくは、該パラメータは、ｐＨ、温度、培養時間、滞留時間及びそれらの組み合わせから選択される。

「ｐＨ」とは、本明細書において、バイオリアクターのｐＨ設定点と理解される。各バイオリアクターは、異なるｐＨ設定値を有し得る。

「温度」とは、本明細書では、バイオリアクターの温度設定点と理解される。各バイオリアクターは、異なる温度設定点を有し得る。

「圧力」とは、本明細書では、バイオリアクターの圧力設定点と理解される。各バイオリアクターは、異なる圧力設定点を有し得る。

「パラメータＸ設定点」とは、好ましくは、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、より好ましくは０．１％以下、さらにより好ましくは０．０１％以下の許容誤差で、バイオリアクターにおいて測定されるパラメータＸの値であると理解される。
「培養時間」とは、本明細書において、微生物の該複合群集を培養するための時間と理解される。微生物の複合群集は、少なくとも２つのバイオリアクターで培養される。微生物の該複合群集を培養するための時間は、各バイオリアクターごとに異なり得る。

「滞留時間」とは、本明細書において、バイオリアクター内の微生物の複合群集の滞留時間と理解される。それは、バッチ培養が実現される場合の培養時間、及び連続プロセスにおける培養の全体積の更新時間に対応する。滞留時間は、各バイオリアクターについて異なり得る。

「ガス処理条件」とは、本明細書では、バイオリアクター内のガス条件と理解される。各バイオリアクターは、異なるガス処理条件を有し得る。

「酸化還元電位」とは、本明細書では、バイオリアクター内の培養培地の酸化還元電位と理解される。培養培地の酸化還元電位は、バイオリアクターごとに異なり得る。

本発明はまた、微生物の複合群集を増殖させる方法であって、以下のステップを含む方法に関する：
（ａ）少なくとも２つのバイオリアクター、好ましくは少なくとも３つのバイオリアクターで微生物の該複合群集を培養することであって、該バイオリアクターが異なるｐＨ設定点を有し、少なくとも２つの採取された接種材料を得る、培養することと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた少なくとも２つの採取された接種材料を混合して、増殖させた微生物の複合群集を得ること。

本発明者らは、驚くべきことに、本発明の方法が、以下のいずれかの目的のプロファイルを有する増殖させた微生物の複合群集を得ることを可能にすることを見出した：
－細菌多様性が保存されている、すなわち、ベースラインプロファイル（任意の培養ステップ前のプロファイル）と同様の培養後プロファイルを有するか、又は
－意図される目的に依存して、該ベースラインプロファイルと比較して多様性が最適化される。

「細菌多様性」とは、属又は種又はＯＴＵのレベルで測定される、微生物の複合群集の多様性又は変動性と理解される。細菌多様性は、富化度（試料中に観察される分類群の数）、シャノン指数、シンプソン指数、及び逆シンプソン指数などの微生物の複合群集を説明するためのアルファ多様性パラメータを用いて、また、ブレイ－カーティス指数及びジャッカード指数などの微生物の複合群集の試料を比較するためのベータ多様性パラメータを用いて、表すことができる。

本発明者らは、培養ステップ中にｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせなどのパラメータを変化させることによって、並びに少なくとも２つの培養物の生成物を特定の割合で混合することによって、初期複合体の培養後プロファイル（本明細書では「ベースラインプロファイル」と呼ぶ）に近い、所望のプロファイルに近い、又は初期複合体と比較して存在する特定の種、属、若しくはＯＴＵ（操作分類単位）に関して富化された培養後プロファイルを有する増殖させた微生物の複合群集を得ることが可能であることを予想外に見出し、実証した。

「種、属又はＯＴＵに関して富化された」とは、本明細書において、微生物の初期の複合群集において非常に低い存在度で存在し、検出可能ではなかった種、属又はＯＴＵの量に関して増加することと理解される。この富化は、非常に低い存在度で存在し、微生物の最初の複合群集において検出できなかった種、属又はＯＴＵのより大きな割合に由来し、したがって、その後検出可能になる。

特に、本発明の方法のおかげで、少なくとも２つのバイオリアクターのｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせなどのパラメータ、並びに増殖させた微生物の複合群集を構成する少なくとも２つのバイオリアクターに由来する試料の量を選択することによって、目的のプロファイルを再構築することが可能である。

得られた増殖させた微生物の複合群集は、最初の試料と比較して少なくとも類似した、さらには改善された細菌生存率を有する。

実施例のセクションで実証されるように、本発明の方法は、該方法によって得られる増殖させた微生物の複合群集の多様性の予想外の増加をもたらし得る。本発明の方法はまた、ベースラインに近い、又は分類プロファイルに関して所望のプロファイルに近い微生物の均質な増殖させた複合群集に対して行うことができる。この均質性は、医薬品又は食品などの工業製品としての最終製品の特徴付けにとって基本的に重要である。

本発明の実施例の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列決定は、本発明に従って得られた増殖させた微生物の複合群集が以下を有することを実証する：
－微生物の初期の複合群集と比較して改善された又は保存された多様性、
－コア微生物叢を構成する分類群（ルミノコッカス属、フィーカリバクテリウム属、ドレア属、コルプロコッカス属、ブラウティア属、アリスチペス属、バクテロイデス属、サブドリグラヌルム属、ロゼブリア属、パラバクテロイデス属及びラクノスピラ属）、周知の属ビフィドバクテリウム属を含むアクチノバクテリア属、及び抗炎症属フィーカリバクテリウム属を含むファーミキューテス属などの目的の特定の分類群の有意に良好な保存、
－増殖させた微生物の複合群集の得られた試料間の良好なレベルの均質性。

「均質な」又は「均質性」とは、好ましくは、１０％以上、好ましくは２０％以上、好ましくは３０％以上、好ましくは４０％以上、好ましくは５０％以上、好ましくは５０％～１００％、好ましくは７５％～９５％、さらにより好ましくは８０％～９０％に含まれる類似性のパーセンテージを有すると理解される。

一般に、本発明による方法は、先行技術の再現性に対して改善された再現性を有し、このことは、薬剤の製造を意図した方法にとって非常に重要である。したがって、患者は、２回以上の治療が必要な場合、同じ製品を数回の治療で受けることができる。

本明細書で使用される場合、用語「少なくとも１つ」は、１つ以上、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０、より好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０、より好ましくは１、２、３、４又は５、さらにより好ましくは１、２、３又は４を指す。

本明細書で使用される場合、「少なくとも２つ」という用語は、２つ以上、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０、より好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９又は１０、より好ましくは２、３、４又は５、さらにより好ましくは２、３又は４を指す。

本明細書で使用される場合、「少なくとも３つ」という用語は、３つ以上、好ましくは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０、より好ましくは３、４、５、６、７、８、９又は１０、より好ましくは３、４又は５、さらにより好ましくは３又は４を指す。

本明細書で使用される場合、「少なくとも１回」という用語は、１回以上、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０回、より好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０回、より好ましくは１、２、３、４又は５回、より好ましくは１、２、３又は４回、さらにより好ましくは１、２又は３回を指す。

本明細書で使用される場合、用語「接種材料（複数の接種材料）」とは、バイオリアクターに接種される微生物の複合群集をいう。

本明細書で使用される場合、「回収された接種材料（複数の回収された接種材料）」という用語は、バイオリアクター内で少なくとも１回培養された微生物の複合群集を指す。

本明細書で使用される場合、「懸濁液」という用語は、微生物の複合群集を含有する溶液を指す。
本明細書で使用される場合、「培養（culture/cultivation）」という用語は、発酵プロセスを指し得る。

本明細書で使用される場合、「微生物の複合群集」という表現は、一緒に生存し、潜在的に相互作用している多数の異なる種の微生物を含む微生物の任意の集団を指す。このような複合群集に存在する可能性のある微生物としては、酵母、細菌、バクテリオファージ、古細菌、ウイルス、真菌、藻類、又は土壌、植物、動物、細菌、ウイルス、真菌若しくはヒト起源などの異なる起源の任意の原生動物が挙げられる。本発明の微生物の複合群集は、１つ以上の給源及び／又は１つ以上のドナーに由来する微生物を含み得るか、又はそれらからなり得る。

本発明の微生物の複合群集は、以下に由来し得る：
－単一の給源、
－少なくとも２つの給源、
－１人のドナー、
－少なくとも２人のドナー、
－単一の給源及び１人のドナー、
－単一の給源及び少なくとも２人のドナー、
－少なくとも２つの給源及び１人のドナー、又は
－少なくとも２つの給源及び少なくとも２人のドナー。
本明細書中で使用される場合、用語「給源」は、微生物の最初の複合群集が由来する任意の環境（例えば、土壌、植物の一部、動物体の一部又は人体の一部、動物の体液又はヒトの体液）をいう。ヒト又は動物の場合、給源は、腸などの身体の任意の部分を指し得る。

本明細書で使用される場合、「ドナー」という用語は、植物、動物又はヒト、好ましくはヒトを指す。

微生物の複合群集は、ヒト又は動物の微生物叢であり得る。微生物の複合群集がヒト又は動物の微生物叢である場合、微生物の最初の複合群集は、それぞれヒト又は動物ドナーの１つ以上の給源に由来し得る。
好ましくは、微生物の複合群集は、１人以上のドナーに由来する微生物叢、より好ましくは１人以上のドナーに由来する腸内微生物叢、さらにより好ましくは少なくとも１人のドナーに由来する、好ましくは少なくとも２人のドナーに由来する、糞便中微生物叢である。

本明細書で使用される場合、「微生物の複合群集を増殖させる」という表現は、培養によって微生物を増殖させ、それによって微生物の最初の複合群集をより大量に提供することを指す。所望の結果に応じて、本発明の方法によって得られる増殖させた微生物の複合群集は、微生物の最初の複合群集（「ベースライン」と呼ばれる）のものに近い、所望のプロファイルに近い、又は最初の複合体と比較して存在する種、属若しくはＯＴＵに関して富化された培養後プロファイルを有し得る。

本明細書で使用される場合、「ベースライン」という用語は、任意の培養ステップ前のプロファイルを指す。

ドナーは、例えば国際公開第２０１９／１７１０１２ Ａ１号パンフレットなどの先行技術に記載されている方法及び基準に従って予め選択されてもよい。例えば、ドナーがヒト微生物叢ドナーである場合、ドナーは、以下のスクリーニング基準に従って予め選択され得る：
－１８～６０歳、１８～３０のボディマスインデックス（ＢＭＩ）を有する、
－重篤な感染症、代謝及び神経障害、又は抑鬱の個人歴を有さない、
－腸内微生物叢の組成を悪化させ得る投薬の最近の履歴がない、
－発熱、下痢、悪心、嘔吐、腹痛、黄疸などの胃腸疾患に関連する症状の最近の発症がない、
－ＡＩＤＳ、肝炎等を含む重篤な感染症の病歴がない、
－熱帯国への最近の旅行がない、
－危険な性行動がない、
－最近の損傷、穿孔及び／又は入れ墨（複数可）がない、
－最近の慢性疲労がない、
－最近のアレルギー反応がない、
－及び／又は任意選択で多様な食餌を有する、
（国際公開第２０１９／１７１０１２ Ａ１パンフレットに記載）。

ステップ（ａ）で培養される微生物の複合群集は、微生物の複合群集を含むか又はそれからなる糞便などの試料であってもよい。

ドナーから収集された微生物の複合群集を含むか又はそれからなる試料は、先行技術、例えば国際公開第２０１９／１７１０１２ Ａ１号パンフレットに記載されている方法及び定性的基準に従って管理され得る。例えば、試料がヒト微生物叢を含む場合、試料の定性的基準は、国際公開第２０１９／１７１０１２ Ａ１パンフレットに記載されているように、ブリストルスケールで１～６の試料一貫性を含むこと、試料中に血液及び尿が存在しないこと、及び／又は特定の細菌、寄生虫及び／又はウイルスが存在しないこと、を含み得る。

微生物の複合群集を含むか又はそれからなる試料は、例えば国際公開第２０１６／１７０２８５ Ａ１号パンフレット、国際公開第２０１７／１０３５５０ Ａ１号パンフレット及び／又は国際公開第２０１９／１７１０１２ Ａ１号パンフレットなどの先行技術に記載されている任意の方法に従って収集することができる。好ましくは、微生物の複合群集を含むか又はそれからなる試料を収集し、次いで嫌気性条件下に置くことができる。例えば、国際公開第２０１６／１７０２８５ Ａ１号、国際公開第２０１７／１０３５５０ Ａ１号及び／又は国際公開第２０１９／１７１０１２ Ａ１号パンフレットに記載されているように、試料の採取後５分以内に、試料を酸素気密収集装置に入れてもよい。

微生物の複合群集を含むか又はそれからなる試料は、先行技術、例えば国際公開第２０１６／１７０２８５ Ａ１号、国際公開第２０１７／１０３５５０ Ａ１号及び／又は国際公開第２０１９／１７１０１２ Ａ１号パンフレットに記載されている方法に従って調製することができる。

例えば、試料は、国際公開第２０１６／１７０２８５ Ａ１号パンフレットに記載されている方法に従って調製することができ、この方法は、
－該ドナー対象から少なくとも１つの試料を採取することと、
－試料を採取してから５分以内に、該試料を酸素気密収集装置に入れることと、
－得られた試料を、少なくとも１つの凍結保護剤及び／又は少なくとも１つの増量剤を含む少なくとも１つの塩水溶液と混合して、混合物を得ることと、
－任意選択で、特に０．７ｍｍ以下、好ましくは０．５ｍｍ以下の直径の細孔を含むフィルターを使用して、該混合物を濾過することと、
－－１５℃～－１００℃、好ましくは－６０℃～－９０℃の温度で凍結することによって予め得られた該混合物を貯蔵することと、を含み、
全てのこれらのステップは、嫌気生活下で実施され得る。

例えば、微生物の複合群集を含むか又はそれからなる収集された試料は、国際公開第２０１７／１０３５５０ Ａ１号パンフレットに記載されている方法に従って凍結乾燥され得、以下のステップを含む：
－ドナー対象由来の該試料を、ポリオール、二糖から五糖、マルトデキストリン及びそれらの混合物から選択される希釈剤と混合すること、及び
－－５０℃未満、好ましくは－７０℃～－１００℃に含まれる温度で得られた混合物を凍結し、次いでそれを凍結乾燥すること。

例えば、少なくとも２人の予め選択されたドナーに由来する微生物の複合群集の均質な混合物は、国際公開第２０１９／１７１０１２ Ａ１号パンフレットに記載されている方法に従って調製され得、以下のステップを含む：
－該予め選択されたドナーから便微生物叢の少なくとも１つの試料を採取すること、
－採取から５分未満以内に、得られた試料を酸素気密採取装置に入れること、
－採取された試料の品質管理を行い、品質基準を満たさない試料を除外すること、－該対照ステップ後に保持された該試料のそれぞれに、少なくとも１つの抗凍結剤及び／又は増量剤を含む生理食塩水溶液を添加すること、
－得られた試料を濾過して、一連の接種材料を形成すること、
－該接種材料をグループ分けして接種材料混合物を形成すること、及び
－該得られた混合物を、特に手動撹拌によって、又は撹拌装置を使用して均質化すること（該ステップは嫌気的に行い得る）。

本明細書で使用される場合、「バイオリアクター」という用語は、培養パラメータ（温度、ｐＨ、滞留時間、通気、供給など）を制御することができる、微生物を培養するのに有用な容器を含む任意の装置を指す。本発明において、「発酵槽」及び「バイオリアクター」という用語は、同じ意味を有する。したがって、培養（cultivating）ステップは、発酵（fermentation）ステップとみなすことができる。バイオリアクターは、異なる環境の主要パラメータを統合し、したがって、微生物の複合群集が収集された環境を再構築し得る。例えば、微生物の複合群集がインビボのヒト結腸環境に由来するとき、バイオリアクターは、Ｃｏｒｄｏｎｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｔｒａｃｔ ａｓ Ｒｅｌｅｖａｎｔ Ｔｏｏｌｓ ｔｏ Ａｓｓｅｓｓ ｔｈｅ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ Ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ，Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．２０１５ Ｄｅｃ；３（４）：７２５－７４５などの先行技術にて説明されるように、例えばｐＨ、温度、回腸廃液の供給、滞留時間及び嫌気的条件など、インビボのヒト結腸環境パラメータを統合し得る。

培養ステップは、例えば、Ｗｉｅｓｅ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＰｅｅｒＪ．，２０１８．Ｊａｎ １９；６：ｐ．ｅ４２６８；又はＴａｋａｇｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．；３５ ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，２０１６．１１（８）：ｐ．ｅ０１６０５３３などの先行技術に記載されているように、バッチ、フェドバッチで、又は連続培養技術を使用して行うことができる。

バイオリアクターで使用される培養培地は、例えばＣｏｒｄｏｎｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５．（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｔｒａｃｔ ａｓ Ｒｅｌｅｖａｎｔ Ｔｏｏｌｓ ｔｏ Ａｓｓｅｓｓ ｔｈｅ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ Ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ，Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．２０１５ Ｄｅｃ；３（４）：７２５－７４５）などの先行技術に記載されている任意の培養培地であってもよい。好ましくは、増殖させた群集がヒトによる消費のためのものである場合、培養培地の各成分は食品規制基準及び／又は医薬品規制基準を満たす。好ましくは、培養培地は、微生物の複合群集が収集された環境の培地に可能な限り近い。

微生物の複合群集は、微生物に応じてバイオリアクター内で好気的条件又は嫌気的条件で培養することができる。腸内微生物叢の場合、微生物の複合群集は、好ましくは嫌気性条件で培養される。

消泡剤を培地に添加してもよい。消泡剤の例としては、シリコンポリマー、シリコンエマルジョン、ポリエーテル分散液、及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明による微生物の複合群集は、微生物の複合群集が収集された環境の１つに応じて、１５℃～５０℃、好ましくは３３℃～４０℃、より好ましくは３６℃～３８℃を含む温度で培養され得る。

本発明では、少なくとも１つの異なるパラメータを有する少なくとも２つのバイオリアクター、好ましくは少なくとも３つのバイオリアクターが使用されるという条件で、パラメータの任意の組み合わせが使用され得る。

本発明において、少なくとも１つの異なるパラメータが滞留時間である場合、異なる滞留時間を有する少なくとも２つのバイオリアクター、好ましくは少なくとも３つのバイオリアクターが使用されるという条件で、滞留時間の任意の組み合わせを使用することができる。

好ましくは、本発明の方法において、該バイオリアクターは、６時間～１０２時間、好ましくは１２時間～９６時間、好ましくは２４時間～７２時間に含まれる異なる滞留時間を有する。滞留時間は、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間及びこれらの組み合わせから選択されてもよく、好ましくは２４時間、４８時間、７２時間及びこれらの組み合わせから選択されてもよい。

好ましくは、本発明の方法において、少なくとも１つのバイオリアクターは、６時間～１８時間、好ましくは９時間～１５時間、より好ましくは１１時間～１３時間に含まれる滞留時間を有する。

好ましくは、本発明の方法において、少なくとも１つのバイオリアクターは、１８時間～３０時間、好ましくは２１時間～２７時間、より好ましくは２３時間～２５時間に含まれる滞留時間を有する。

好ましくは、本発明の方法において、少なくとも１つのバイオリアクターは、４２時間～５４時間、好ましくは４５時間～５１時間、より好ましくは４７時間～４９時間に含まれる滞留時間を有する。
好ましくは、本発明の方法において、少なくとも１つのバイオリアクターは、６６時間～７８時間、好ましくは６９時間～７５時間、より好ましくは７１時間～７３時間に含まれる滞留時間を有する。

好ましくは、本発明の方法において、少なくとも１つのバイオリアクターは、９０時間～１０２時間、好ましくは９３時間～９９時間、より好ましくは９５時間～９７時間に含まれる滞留時間を有する。

好ましくは、本発明の方法において、
－第１のバイオリアクターが、１８時間～３０時間、好ましくは２１時間～２７時間、より好ましくは２３時間～２５時間に含まれる滞留時間を有し、
－第２のバイオリアクターが、６時間～１８時間、好ましくは９時間～１５時間、より好ましくは１１時間～１３時間に含まれる滞留時間、又は４２時間～５４時間、好ましくは４５時間～５１時間、より好ましくは４７時間～４９時間に含まれる滞留時間を有する。

好ましくは、本発明の方法において、
－第１のバイオリアクターが、６時間～１８時間、好ましくは９時間～１５時間、より好ましくは１１時間～１３時間に含まれる滞留時間を有し、
－第２のバイオリアクターが、１８時間～３０時間、好ましくは２１時間～２７時間、より好ましくは２３時間～２５時間に含まれる滞留時間を有し、
－第３のバイオリアクターが、４２時間～５４時間、好ましくは４５時間～５１時間、より好ましくは４７時間～４９時間に含まれる滞留時間を有する。

好ましくは、本発明の方法において、
－第１のバイオリアクターが、１８時間～３０時間、好ましくは２１時間～２７時間、より好ましくは２３時間～２５時間に含まれる滞留時間を有し、
－第２のバイオリアクターが、６時間～１８時間、好ましくは９時間～１５時間、より好ましくは１１時間～１３時間に含まれる滞留時間、又は４２時間～５４時間、好ましくは４５時間～５１時間、より好ましくは４７時間～４９時間に含まれる滞留時間、又は６６時間～７８時間、好ましくは６９時間～７５時間、より好ましくは７１時間～７３時間に含まれる滞留時間、又は９０時間～１０２時間、好ましくは９３時間～９９時間、より好ましくは９５時間～９７時間に含まれる滞留時間を有する。

好ましくは、本発明の方法において、
－第１のバイオリアクターが、６時間～１８時間、好ましくは９時間～１５時間、より好ましくは１１時間～１３時間に含まれる滞留時間を有し、
－第２のバイオリアクターが、１８時間～３０時間、好ましくは２１時間～２７時間、より好ましくは２３時間～２５時間に含まれる滞留時間を有し、
－第３のバイオリアクターが、４２時間～５４時間、好ましくは４５時間～５１時間、より好ましくは４７時間～４９時間に含まれる滞留時間を有し、
－第４のバイオリアクターが、６６時間～７８時間、好ましくは６９時間～７５時間、より好ましくは７１時間～７３時間に含まれる滞留時間、又は９０時間～１０２時間、好ましくは９３時間～９９時間、より好ましくは９５時間～９７時間に含まれる滞留時間を有する。

本発明において、少なくとも１つの異なるパラメータが培養時間である場合、異なる培養時間を有する少なくとも２つのバイオリアクター、好ましくは少なくとも３つのバイオリアクターが使用されるという条件で、培養時間の任意の組み合わせを使用することができる。

好ましくは、本発明の方法において、該バイオリアクターは、１２時間～９０日間、好ましくは２４時間～６０日間、より好ましくは４８時間～３０日間、より好ましくは７２時間～１５日間、さらにより好ましくは９６時間～７日間に含まれる異なる培養時間を有する。培養時間は、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、７日、１５日、３０日、６０日及び９０日から選択することができる。

本発明において、少なくとも１つの異なるパラメータが温度である場合、異なる温度設定点を有する少なくとも２つのバイオリアクター、好ましくは少なくとも３つのバイオリアクターが使用されるという条件で、温度の任意の組み合わせを使用することができる。

好ましくは、本発明の方法において、該バイオリアクターは、１５℃～５０℃、好ましくは３３℃～４０℃、より好ましくは３６℃～３８℃に含まれる異なる温度設定点を有する。

本発明において、少なくとも１つの異なるパラメータがｐＨである場合、異なるｐＨ設定点を有する少なくとも２つのバイオリアクター、好ましくは少なくとも３つのバイオリアクターが使用されるという条件で、ｐＨ設定点の任意の組み合わせが使用され得る。

好ましくは、本発明の方法において、該バイオリアクターは、４．５～８．０、好ましくは５～７．６、より好ましくは５．２～７．４に含まれる異なるｐＨ設定値を有する。

好ましくは、本発明の方法において、少なくとも１つのバイオリアクターは、４．５～５．８、好ましくは５～５．６、より好ましくは５．２～５．４に含まれるｐＨ設定点を有する。

好ましくは、本発明の方法において、少なくとも１つのバイオリアクターは、５．９～６．８、好ましくは６～６．６、より好ましくは６．２～６．４に含まれるｐＨ設定点を有する。

好ましくは、本発明の方法において、少なくとも１つのバイオリアクターは、６．９～８、好ましくは７～７．６、より好ましくは７．２～７．４に含まれるｐＨ設定点を有する。

好ましくは、本発明の方法において、
－第１のバイオリアクターが、４．５～５．８、好ましくは５～５．６、より好ましくは５．２～５．４に含まれるｐＨ設定点を有し、
－第２のバイオリアクターが、５．９～６．８、好ましくは６～６．６、より好ましくは６．２～６．４に含まれるｐＨ設定点、又は６．９～８、好ましくは７～７．６、より好ましくは７．２～７．４に含まれるｐＨ設定点を有する。

好ましくは、本発明の方法において、
－第１のバイオリアクターが、５．９～６．８、好ましくは６～６．６、より好ましくは６．２～６．４に含まれるｐＨ設定点を有し、
－第２のバイオリアクターが、４．５～５．８、好ましくは５～５．６、より好ましくは５．２～５．４に含まれるｐＨ設定点、又は６．９～８、好ましくは７～７．６、より好ましくは７．２～７．４に含まれるｐＨ設定点を有する。

好ましくは、本発明の方法において、
－第１のバイオリアクターが、６．９～８、好ましくは７～７．６、より好ましくは７．２～７．４に含まれるｐＨ設定点を有し、
－第２のバイオリアクターは、４．５～５．８、好ましくは５～５．６、より好ましくは５．２～５．４に含まれるｐＨ設定点、又は５．９～６．８、好ましくは６～６．６、より好ましくは６．２～６．４に含まれるｐＨ設定点を有する。

好ましくは、本発明の方法において、
－第１のバイオリアクターが、４．５～５．８、好ましくは５～５．６、より好ましくは５．２～５．４に含まれるｐＨ設定点を有し、
－第２のバイオリアクターが、５．９～６．８、好ましくは６～６．６、より好ましくは６．２～６．４に含まれるｐＨ設定点を有し、
－第３のバイオリアクターが、６．９～８、好ましくは７～７．６、より好ましくは７．２～７．４に含まれるｐＨ設定点を有する。

好ましくは、該バイオリアクターは、先に定義したｐＨ及び／又は滞留時間から選択される１つのみ又は２つのみの異なるパラメータを有し、他のパラメータはバイオリアクター間で同一である。

意図される結果に応じて、当業者は、各バイオリアクターについて先に定義されたようなパラメータの特定の組み合わせを選択することができる。

さらに、繊維及びプレバイオティクスなどの追加の化合物を、ステップ（ａ）において少なくとも２つのバイオリアクターに添加することができる。それらの濃度及び性質は、意図される結果に依存して反応器ごとに様々であり得る。

各バイオリアクターに、微生物の複合群集を含むか又はそれからなる糞便などの試料を、バイオリアクター中に０．０１～１００ｇ試料／Ｌの範囲の濃度、好ましくは０．０５～１５ｇ試料／Ｌの範囲の濃度、好ましくは０．１～１０ｇ試料／Ｌの範囲の濃度、好ましくは０．１～５ｇ試料／Ｌの範囲の濃度、より好ましくは０．１～１ｇ試料／Ｌの範囲の濃度で接種することができる。

各バイオリアクターには、バイオリアクター内で１０^３～１０^１３細菌／Ｌ、好ましくは１０^６～１０^１２細菌／Ｌ、より好ましくは１０^９～１０^１１細菌／Ｌの範囲の濃度の微生物の複合群集を含む又はそれからなる糞便などの試料を接種することができる。

本発明の方法は、例えば国際公開第２０１６／１７０２８５ Ａ１号、第２０１７／１０３５５０ Ａ１号又は第２０１９／１７１０１２ Ａ１号パンフレットに記載されているような先行技術に記載されている任意の方法に従って、例えば濾過ステップ、均質化ステップ、凍結ステップ、解凍ステップ及び／又は凍結乾燥ステップなどの追加のステップを含んでもよい。

これらのステップは、ステップａ）の前、ステップａ）の後及びステップｂ）の前、ステップｂ）の後、並びに／又はこれらのステップの任意の繰り返しの前及び／若しくは後に行われてもよい。

ステップ（ａ）で使用される微生物の複合群集が２つ以上の給源及び／又は２つ以上のドナーに由来する場合、本発明の方法は、プールするステップをさらに含んでもよい。

したがって、ステップ（ａ）で使用される微生物の複合群集の少なくとも一部又は全部は、新たに収集されてもよく、又はステップ（ａ）の前に凍結、解凍及び／又は凍結乾燥されていてもよい。同様に、ステップ（ａ）で得られた少なくとも１つ又は全ての採取された接種材料、及びステップ（ｂ）で得られた増殖させた微生物の複合群集の少なくとも１つの部分又は全ては、凍結、解凍及び／又は凍結乾燥されていてもよい。

「新たに収集された」とは、本明細書では、凍結、解凍及び／又は凍結乾燥されていない試料と理解される。

ステップ（ａ）で使用される微生物の複合群集の少なくとも一部又は全部は、当業者に周知の技術によって、その最初のマトリックスから抽出されていても、部分的に抽出されていても、部分的に単離されていても、単離されていても、部分的に分離されていても、分離されていても、又はそれらの処理がなされていなくてもよい。

ステップ（ａ）で使用される微生物の複合群集の少なくとも一部又は全部は、人工的に合成されたものであっても、遺伝的に改変されたものであってもよい。

微生物の単離された複合群集の画分は、芽胞形成細菌を含み得る。微生物の単離された複合群集の画分は、胞子の形態であり得る。

「単離された」という用語は、（１）最初に産生されたとき（天然であっても実験環境であっても）関連していた成分の少なくとも一部から分離されている、並びに／又は（２）産生、調製、精製、及び／若しくは製造されている、微生物の複合群集を包含する。

微生物の単離された複合群集は、それが最初に会合していた他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又はそれ以上から分離され得る。

いくつかの実施形態では、微生物の単離された複合群集は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９％超純粋である。

「純粋」という用語は、微生物の複合群集が他の成分を実質的に含まないことを意味する。

「精製する」、「精製している」及び「精製された」という用語は、微生物の複合群集が、最初に産生若しくは生成されたとき（例えば、天然であるか又は実験的設定であるかにかかわらず）、又はその最初の産生後の任意の時間の間のいずれかに、それが関連していた成分の少なくともいくつかから分離されていることを指す。微生物の複合群集は、微生物の複合群集を含有する材料又は環境からなど、生産時又は生産後に単離される場合、精製されているとみなすことができ、微生物の精製された複合群集は、最大約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約９０％超の他の材料を含有してもよく、それでも「単離されている」とみなすことができる。
いくつかの実施形態では、微生物の複合群集は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９％超純粋である。微生物の複合群集は、微生物の複合群集を含有する材料又は環境中に産生及び／又は存在する微生物の１つ以上の他の複合群集から独立して精製することができる。微生物の複合群集は、残留生息環境生成物から精製され得る。

例えば、凍結は、先行技術及び例えば国際公開第２０１６／１７０２８５ Ａ１号又は第２０１７／１０３５５０ Ａ１号パンフレットに記載されているように実施することができる。特に、凍結は、国際公開第２０１６／１７０２８５ Ａ１号パンフレット又は国際公開第２０１７／１０３５５０ Ａ１号パンフレットに記載されているように、試料を－１５℃～－１００℃、好ましくは－３５℃～－９５℃、より好ましくは－６０℃～－９０℃の温度で、任意選択で少なくとも１つの抗凍結剤及び／又は増量剤を含む少なくとも１つの生理食塩水溶液と共に凍結させることによって実施することができる。
例えば、解凍は、従来技術及び例えば国際公開第２０１６／１７０２８５ Ａ１号パンフレットの１１頁に記載されている方法に従って、周囲温度まで行うことができる。特に、解凍は以下のように行うことができる：
－凍結試料を３５℃～４０℃の温度の水浴中に、数分～数時間、好ましくは１～２０分、より好ましくは２～１０分の期間にわたって入れること、
－該凍結試料を、２℃～１０℃、例えば４℃～８℃の温度で、１～３０時間、好ましくは１０～２０時間の期間にわたって配置すること、又は
－試料を周囲温度に１～１０時間、好ましくは２～４時間置くこと。
その他のステップについては、嫌気条件下で解凍を行ってもよい。

凍結保護剤は、凍結によって引き起こされる損傷、特に氷晶の形成に起因する損傷から試料を保護するために使用される物質である。抗凍結剤は、先行技術、例えば国際公開第２０１６１７０２８５ Ａ１号パンフレットの８～９頁又は国際公開第２０１７／１０３５５０ Ａ１号パンフレットの８～１０頁に記載されている任意の抗凍結剤であってよい。好ましくは、抗凍結剤は、ポリオール、二糖から五糖、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及びそれらの混合物から選択される。より好ましくは、凍結保護剤は、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、ＤＭＳＯ、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのエチレングリコール、トレハロース及びその類似体、サッカロース、ガラクトース－ラクトース、並びにそれらの混合物から選択され得る。

充填剤は、先行技術、例えば国際公開第２０１６１７０２８５ Ａ１号パンフレットの９頁又は国際公開第２０１７／１０３５５０ Ａ１号パンフレットの８～１０頁に記載されている任意の充填剤であってもよい。好ましくは、増量剤はマルトデキストリンの混合物である。

凍結防止剤の総量は、微生物の複合群集を含むか又は微生物の複合群集からなる試料（懸濁液であってもよい）の総体積に対して３～３０重量／体積％、好ましくは４～２０重量／体積％、より好ましくは５～１５重量／体積％であってもよい；及び／又は増量剤の量は、微生物の複合群集を含むか又は微生物の複合群集からなる試料（懸濁液であってもよい）の総体積に対して３～３０重量％、好ましくは４～２０重量％、より好ましくは５～１５重量％であってもよい。

本発明の生理食塩水溶液は、先行技術及び例えば国際公開第２０１６１７０２８５ Ａ１号パンフレットの７～８頁又は国際公開第２０１７／１０３５５０ Ａ１号パンフレットの８頁に記載されているように、水及び生理学的に許容される塩を含み得る。例えば、塩は、カルシウム、ナトリウム、カリウム又はマグネシウムと、塩化物イオン、グルコン酸イオン、酢酸イオン又は炭酸水素イオンとの塩及びそれらの混合物であってよく、好ましくは塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、グルコン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム及びそれらの混合物である。

塩は、生理食塩水溶液中に、２～２０ｇ／Ｌ、好ましくは５～１５ｇ／Ｌ、より好ましくは７～１０ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは９ｇ／Ｌの濃度で存在してもよい。

生理食塩水溶液はまた、任意選択で、少なくとも１つの抗酸化剤を含んでもよい。抗酸化剤の例は、国際公開第２０１６１７０２８５ Ａ１号の７～８頁又は第２０１７／１０３５５０ Ａ号の８～９頁に記載されている抗酸化剤を含むが、これらに限定されない。例えば、抗酸化剤は、アスコルビン酸及びその塩（アスコルベート）、トコフェロール（酸α－トコフェロール）、システイン及びその塩形態（塩酸塩など）並びにそれらの混合物から選択されてもよく、好ましくはアスコルビン酸ナトリウム、トコフェロール、システイン塩酸塩一水和物、及びそれらの混合物から選択されてもよい。

抗酸化剤は、微生物の複合群集を含むか又はそれからなる試料の総体積に対して、０．１～１重量／体積％、好ましくは０．３～０．８重量／体積％、好ましくは０．４～０．６重量／体積％の量で存在し得る。

好ましくは、生理食塩水溶液は、以下を含む：
－塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、グルコン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、及びこれらの混合物から選択される少なくとも１つの塩、及び
－任意選択的に、好ましくはアスコルビン酸ナトリウム、トコフェロール、システイン塩酸塩一水和物、及びこれらの混合物から選択される少なくとも１つの抗酸化剤。

典型的には、生理食塩水溶液は、１：０．５～１：１０、好ましくは１：２～１：８、より好ましくは１：４に含まれる重量（ｇ）／体積（ｍＬ）比で、微生物の複合群集を含むか又はそれからなる試料に添加される。０．５重量：１０体積に等しい試料：溶液の重量／体積比は、試料が１０体積の溶液（例えば１０ｍＬ）に対して０．５重量（例えば０．５ｇ）まで混合されることを意味する。

ステップ（ａ）で使用される微生物の複合群集を含むか又はそれからなる試料は、先に定義したような生理食塩水溶液を含む懸濁液の形態であってもよい。

好ましくは、ステップ（ａ）で使用される微生物の複合群集を含むか又はそれからなる試料は、先に定義したように、生理食塩水溶液、少なくとも１つの凍結保護剤及び／又は少なくとも１つの増量剤を含む懸濁液の形態下にある。

ステップ（ａ）は、少なくとも１回繰り返されもよい。この場合、連続的な培養ステップは、連続的な培養ステップの間に採取された接種材料を混合することなく行われ得る。すなわち、ステップ（ａ）で得られた各バイオリアクターの採取された接種材料は、意図された結果に応じて、ｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせ、好ましくは先に定義されたｐＨ及び／又は滞留時間などの同じパラメータで、又はｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせ、好ましくは先に定義されたｐＨ及び／又は滞留時間などの異なるパラメータで、先に使用されたものと同様に再培養され得る。バイオリアクターは、以前に使用されたバイオリアクターと同じであっても異なっていてもよい。

好ましくは、ステップ（ａ）は少なくとも１回繰り返され、各採取された接種材料は、意図される結果に応じて、ステップ（ａ）で以前に使用されたものと同じパラメータ、例えばｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせ、好ましくは先に定義されたｐＨ及び／又は滞留時間で、又は異なるパラメータ、例えばｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせ、好ましくは先に定義されたｐＨ及び／又は滞留時間で、バイオリアクター中で再培養される。

前述したように、ステップ（ａ）で得られた少なくとも１つ又は全ての採取された接種材料は、ステップ（ａ）が繰り返されるか否かにかかわらず、各後続ステップの間に凍結され、任意選択で解凍及び／又は凍結乾燥されてもよい。すなわち、ステップ（ａ）で得られた各収集された接種材料は、ステップ（ａ）のいくつか又は全ての繰り返しの前及び／又はステップ（ｂ）の前に、凍結され得、必要に応じて解凍及び／又は凍結乾燥され得る。

好ましくは、ステップ（ａ）で使用される微生物の複合群集の少なくとも一部又は全部は、－１５℃～－１００℃、好ましくは－３５℃～－９５℃、より好ましくは－６０℃～－９０℃の温度で、任意選択で少なくとも１つの抗凍結剤及び／又は増量剤を含む少なくとも１つの生理食塩水溶液と共に凍結され、任意選択でステップ（ａ）で接種される前に解凍されている。

好ましくは、ステップ（ａ）で得られた少なくとも１つ又は全ての採取された接種材料は、－１５℃～－１００℃、好ましくは－３５℃～－９５℃、より好ましくは－６０℃～－９０℃の温度で、任意選択で少なくとも１つの凍結保護剤及び／又は増量剤を含む少なくとも１つの生理食塩水溶液と共に凍結されて、少なくとも１つの凍結採取接種材料を得る。

好ましくは、本発明の方法は、ステップ（ｂ）の前に、少なくとも１つの凍結された採取された接種材料を解凍するステップをさらに含む。該解凍ステップの後に、意図される結果に応じて、ステップ（ａ）で以前に使用されたものと同じパラメータ、例えばｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせ、好ましくは以前に定義されたｐＨ及び／又は滞留時間で、又は異なるパラメータ、例えばｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせ、好ましくは以前に定義されたｐＨ及び／又は滞留時間で、採取された接種材料を再培養する少なくとも１つのステップが続いてもよい。

好ましくは、本発明の方法は、凍結接種材料混合物を得るために、－１５℃～－１００℃、好ましくは－３５℃～－９５℃、より好ましくは－６０℃～－９０℃の温度で、任意選択で少なくとも１つの抗凍結剤及び／又は増量剤を含む少なくとも１つの生理食塩水溶液を用いて、ステップ（ｂ）で得られた増殖させた微生物の複合群集の少なくとも一部又は全部を凍結するステップをさらに含む。

本発明のステップ（ａ）又はステップ（ａ）及び（ｂ）は、意図する結果に応じて、ステップ（ａ）で先に使用したものと同じパラメータ、例えばｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせ、好ましくは先に定義したｐＨ及び／又は滞留時間で、又は異なるパラメータ、例えばｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせ、好ましくは先に定義したｐＨ及び／又は滞留時間で、少なくとも１回繰り返すことができる。

好ましくは、凍結接種材料混合物を解凍した後、ステップ（ａ）による混合物を、意図する結果に応じて、ステップ（ａ）で先に使用したものと同じパラメータ、例えばｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせ、好ましくは先に定義したｐＨ及び／又は滞留時間で、又は異なるパラメータ、例えばｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせ、好ましくは先に定義したｐＨ及び／又は滞留時間で再培養する少なくとも１つのステップ、並びに任意選択でステップ（ｂ）による少なくとも１つの混合ステップが続く。すなわち、凍結接種材料混合物は、少なくとも２つのバイオリアクター、好ましくは少なくとも３つのバイオリアクターにおいて、意図する結果に応じて、ステップ（ａ）で先に使用したものと同じパラメータ、例えばｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせ、好ましくは先に定義したｐＨ及び／又は滞留時間で、又は異なるパラメータ、例えばｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせ、好ましくは先に定義したｐＨ及び／又は滞留時間で、再培養することができ、得られた採取接種材料は任意に混合することができる。

解凍は、前述の方法に従って実施することができる。

したがって、本発明による方法では、
－ステップ（ａ）及び（ｂ）は繰り返されなくてもよく、
－ステップ（ａ）は、意図する結果に応じて、ステップ（ａ）で先に使用されたものと同じパラメータ、例えばｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、これらの組み合わせ、好ましくは先に定義されたｐＨ及び／又は滞留時間で、又は異なるパラメータ、例えばｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びこれらの組み合わせ、好ましくは先に定義されたｐＨ及び／又は滞留時間で、少なくとも１回繰り返してもよく、その後、混合ステップ（ｂ）が続き、
ステップ（ａ）及び（ｂ）は、意図する結果に応じて、ステップ（ａ）で先に使用したものと同じパラメータ、例えばｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせ、好ましくは先に定義したｐＨ及び／又は滞留時間で、又は異なるパラメータ、例えばｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせ、好ましくは先に定義したｐＨ及び／又は滞留時間で、少なくとも１回繰り返すことができ、
ステップ（ａ）は、少なくとも１回繰り返されてもよく、ステップ（ｂ）の後、ステップ（ａ）及び（ｂ）は、意図された結果に応じて、ステップ（ａ）で先に使用されたものと同じパラメータ、例えばｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせ、好ましくは先に定義されたｐＨ及び／又は滞留時間で、又は異なるパラメータ、例えばｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせ、好ましくは先に定義されたｐＨ及び／又は滞留時間で、少なくとも１回繰り返されてもよい。

本発明において、ステップ（ａ）を繰り返すことによって、本方法は、ステップ（ａ）の後に少なくとも１つの後続のステップ（ａ）を含み、ステップ（ａ）で得られた採取された接種材料が、意図される結果に応じて、ステップ（ａ）で先に使用されたものと同じパラメータ、例えばｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせ、好ましくは先に定義されたｐＨ及び／又は滞留時間で、又は異なるパラメータ、例えばｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせ、好ましくは先に定義されたｐＨ及び／又は滞留時間で、再培養されることが理解されるべきである。

本発明では、ステップ（ａ）及び（ｂ）を繰り返すことによって、本方法は、少なくとも１つの後続のステップ（ａ）と、それに続くステップ（ｂ）の後の後続のステップ（ｂ）とを含み、ステップ（ｂ）で得られた増殖させた微生物の複合群集が、少なくとも２つのバイオリアクターにおいて、意図する結果に応じて、ステップ（ａ）で先に使用したものと同じパラメータ、例えばｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせ、好ましくは先に定義したｐＨ及び／又は滞留時間で、又は異なるパラメータ、例えばｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせ、好ましくは先に定義したｐＨ及び／又は滞留時間で、再培養され、その後ステップ（ｂ）が続くことが理解されるべきである。

本発明の方法は、ステップ（ａ）と（ｂ）との間、ステップ（ａ）の各繰り返し若しくはいくつかの繰り返しの間、及び／又はステップ（ａ）と（ｂ）の各繰り返し若しくはいくつかの繰り返しの間に、先に記載したような凍結ステップ、解凍ステップ及び／又は凍結乾燥ステップを含み得る。

少なくとも２つの給源及び／又はドナーに由来する微生物の複合群集の場合、異なる給源及び／又はドナーの微生物の複合群集の試料は、ステップ（ａ）の前、ステップ（ａ）の後、ステップ（ａ）のいくつか若しくは全ての繰り返しの前、又はステップ（ａ）のいくつか若しくは全ての繰り返しの後に混合され得る。すなわち、少なくとも２つの給源及び／又はドナーに由来する微生物の複合群集を、以下のように混合することができる：
－ステップ（ａ）の前、又はステップ（ａ）のいくつか若しくはすべての繰り返しの前：この場合、ステップ（ａ）の間、少なくとも１つのバイオリアクターが、少なくとも２つの給源及び／若しくはドナーに由来する微生物の複合群集の混合物を含む、又は、
－ステップ（ａ）が繰り返されていないステップ（ａ）の後：この場合、各バイオリアクターは、単一の給源及び／又はドナーに由来する微生物の複雑な群集を含む。

したがって、本発明の方法において、複合群集が少なくとも２つの給源及び／又はドナーに由来する場合、異なる給源及び／又はドナーの微生物の複合群集の試料は、ステップ（ａ）において使用される各バイオリアクターが少なくとも１つの又は異なる給源及び／又はドナーの微生物の複合群集の異なる割合を含むように、ステップ（ａ）の前及び／又はステップ（ａ）の反復の前に混合されてもよいが、ただし、少なくとも１つのバイオリアクターは、少なくとも２つの給源及び／又はドナーに由来する微生物の複合群集の混合物を含む。

本発明の全てのステップ又はいくつかのステップは、嫌気的に行われ得る。

本発明の別の目的は、本発明の方法によって得られる増殖させた微生物の複合群集に関する。

増殖させた微生物の複合群集は、バクテロイデーテス、シネルギステテス、ファーミキューテス、プロテオバクテリア、アクチノバクテリア、ベルコミクロビア、テネリクテス及びそれらの混合物から選択される少なくとも３つの細菌門を含み得る。

増殖させた微生物の複合群集は、バクテロイデーテス、シネルギステテス、ファーミキューテス、プロテオバクテリア、アクチノバクテリア、ベルコミクロビア、テネリクテス、フソバクテリア及びそれらの混合物から選択される少なくとも３つの細菌門を含み得る。

好ましくは、ファーミキューテス、バクテロイデーテス、アクチノバクテリア及びプロテオバクテリアを含む増殖させた微生物の複合群集は、好ましくは８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相対存在度の合計を有する。

好ましくは、増殖させた微生物の複合群集は、以下を含む：
－３０％以上、好ましくは４０％以上、さらにより好ましくは５０％以上の相対存在度のファーミキューテス、
－５０％以下、好ましくは４０％以下、さらにより好ましくは３０％以下の相対存在度のバクテロイデーテス、
－１％～２０％、好ましくは２％～１５％、さらにより好ましくは５％～１０％の相対存在度のアクチノバクテリア、
－１０％以下、好ましくは５％以下、さらにより好ましくは３％以下の相対存在度のプロテオバクテリア。
好ましくは、該門は、ステップａ）で使用される微生物の複合群集に由来する。

好ましくは、増殖させた微生物の複合群集は、クロストリジウム（Clostridium）、ユーバクテリウム（Eubacterium）、アネロスティペス（Anaerostipes）、バクテロイデス（Bacteroides）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、ブラウティア（Blautia）、ブチリコッカス（Butyricicoccus）、コリンセラ（Collinsella）、ダイアリスター（Dialister）、ドレア（Dorea）、アイゼンベルギエラ（Eisenbergiella）、エシェリキア・シゲラ（Escherichia-Shigella）、フィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）、フシカテニバクター（Fusicatenibacter）、フンガテラ（Hungatella）、ラクノクロストリジウム（Lachnoclostridium）、パラステラ（Parasutterella）、ローズブリア（Roseburia）、ユーバクテリウム（Eubacterium）、［ユーバクテリウム］コプロスタノリゲネス（[Eubacterium]coprostanoligenes）群、［ユーバクテリウム］フィシカテナ（［Eubacterium]fissicatena）群、［ルミノコッカス］トルクス（[Ruminococcus]torque）群、アリゾネラ（Allisonella）、ビロフィラ（Bilophila）、クリステンセネラ（Christensenella）、クリステンセンネラ（Christensenellaceae）Ｒ－７群、クロストリジウム（Clostridium）、クロストリジウム・センス・ストリクト１（Clostridium sensu stricto 1）、コポロコッカス（Coporococcus）、デスルフォビブリオ（Desulfovibrio）、エンテロコッカス（Enterococcus）、フラボニフラクター（Flavonifractor）、ラクノスピラＮＫ４Ａ１３６（Lachnospiraceae NK4A136）群、ラクノスピラＵＣＧ－００１（Lachnospiraceae UCG-001）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、パラバクテロイデス（Parabacteroides）、ペプトストレプトコッカス（Peptostreptococcus）、ロンブツシア（Romboutsia）、ルミノクロストリジウム（Ruminoclostridium）、ルミノコッカスＵＣＧ－００３（Ruminococcaceae UCG-003）、ルミノコッカスＵＣＧ－０１３（Ruminococcaceae UCG-013）、ルミノコッカスＵＣＧ－０１４（Ruminococcaceae UCG-014）、ルミノコッカス（Ruminococcus）、サブドリグラヌラム（Subdoligranulum）及びステレラ（Sutterella）及びそれらの混合物を含む群から選択される少なくとも１５の属を含む。

好ましくは、該属は、ステップａ）で使用される微生物の複合群集に由来する。

増殖させた微生物の複合群集は、１５０以上、好ましくは２００以上、より好ましくは２７５以上の操作分類単位（ＯＴＵ）に基づく富化度を有し得る。ＯＴＵは、１６Ｓ ｒＤＮＡマーカー遺伝子配列の類似配列変異体のクラスターである。ＯＴＵベースの富化度指数は、分析された増殖させた微生物の複合群集において見出される異なるＯＴＵ数を表す。ＯＴＵベースの富化度指数は、実施例部分で説明される方法に従って計算され得る。特に、ゲノムＤＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｓｏｉｌキット（Ｍａｃｈｅｒｙ Ｎａｇｅｌ）を使用して抽出され得る。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３－Ｖ４領域を標的とする配列決定ライブラリーは、ＭｙＴａｑ ＨＳ－Ｍｉｘ ２Ｘ、Ｂｉｏｌｉｎｅを製造者の指示に従って使用して構築することができる。次いで、ライブラリーを等モル混合物中にプールし、ペアエンド（２×３００ｂｐ）ＭｉＳｅｑ Ｖ３ラン（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）において配列決定することができる。ＦＬＡＳＨ（ＦＬＡＳＨ：ｆａｓｔ ｌｅｎｇｔｈ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ，Ｍａｇｏｃ ａｎｄ Ｓａｌｚｂｅｒｇ，２０１１，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１１ Ｎｏｖ １；２７（２１）：２９５７－６３．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｒ５０７．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｓｅｐ ７．）を用いたアンプリコン結合、及びＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ：ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｔｒｉｍｍｅｒ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ，Ｂｏｌｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１４ Ａｕｇ １；３０（１５）：２１１４－２０．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｕ１７０．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ａｐｒ １．）を用いた品質フィルタリングの後、宿主配列汚染除去を、Ｂｏｗｔｉｅ２（Ｆａｓｔ ｇａｐｐｅｄ－ｒｅａｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｂｏｗｔｉｅ ２，Ｌａｎｇｍｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１２，９：３５７－３５９．）によって実行し得る。操作的分類単位（ＯＴＵ）配列クラスタリングを、９７％の同一性閾値によりＶＳＥＡＲＣＨ（ＶＳＥＡＲＣＨ：ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｏｐｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｒｏｇｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６，ＰｅｅｒＪ．２０１６ Ｏｃｔ １８；４：ｅ２５８４．ｄｏｉ：１０．７７１７／ｐｅｅｒｊ．２５８４．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１６．）を使用して実施し、次いで、Ｓｉｌｖａ ＳＳＵデータベースリリース１２８を用いて分類プロファイリングを実施し得る。

ｖｅｇａｎ及びｐｈｙｌｏｓｅｑパッケージを使用して、Ｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ ２０１５、バージョン３．４．４）により、分類分析及び多様性分析を行うことができる。公平な比較のために、各試料の配列番号を、同じ配列決定深度すなわち、試料当たり５００００アンプリコンにランダムに正規化し、ｑＰＣＲ結果に基づいて総細菌数によって正規化し得る。多様性尺度は、試料当たり２０個のサブサンプリングの中央値に対応し得る。

増殖させた微生物の複合群集は、６０以上、好ましくは７０以上、さらにより好ましくは７５以上の属レベルの富化度を有し得る。属レベルでの富化度は、分析された微生物の複合群集において見出される異なる属数を表す。

増殖させた微生物の複合群集は、２０％以上、好ましくは３０％以上、さらにより好ましくは４０％以上のＢｕｔｙｃｏｒｅを有し得る。ｂｕｔｙｃｏｒｅは、酪酸を産生することが知られている細菌の存在度を表す。酪酸を産生することが知られている細菌は、ブラウティア、フィーカリバクテリウム、アイスティペス、ユーバクテリウム、ビフィドバクテリウム、ルミノコッカス、クロストリジウム、コプロコッカス、オドリバクター、ローズブリア、ホルデマネラ、アナエロスティペス、オシリバクター、サブドリグラヌルム、ブチリビブリオを含む群から選択される。

増殖させた微生物の複合群集は、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上のコアを有し得る。コア微生物叢は、以下の属：ルミノコッカス属、フィーカリバクテリウム属、ドレア属、コルプロコッカス属、ブラウティア属、アリスチペス属、バクテロイデス属、サブドリグラヌルム属、ロゼブリア属、パラバクテロイデス属及びラクノスピラ属の総存在度を表す。

増殖させた微生物の複合群集は、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上の「健康指数」を有し得る。健康指数はラクノスピラ、ルミノコッカス、クロストリジウム、プレボテラ、及びエリシペロトリカデアエの存在度の合計を表す。

増殖させた微生物の複合群集は、ジャッカード指数によって測定される場合、その増殖の前後の微生物の複合群集の間で３０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上の類似性を有し得る。ジャッカード指数は、試料セットの類似性及び多様性を測定するために使用される統計ツールである。ジャッカード係数は、２つの試料間の類似性を測定する。ジャッカード指数は、属又はファミリーのレベルで計算することができる。ジャッカード指数は、当業者に周知のツールであり、例えば、Ｔｈｅ ｌｏｎｇｔｅｒｍ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ，Ｆａｉｔｈ，Ｊ．Ｊ．，Ｇｕｒｕｇｅ，Ｊ．Ｌ．，Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕ，Ｍ．，Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｓ．，Ｓｅｅｄｏｒｆ，Ｈ．，Ｇｏｏｄｍａｎ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１（６１４１），１２３７４３９．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３７４３９に記載されている。

次の段落において、「本発明の増殖させた微生物の複合群集」とは、本発明の方法によって得られた増殖させた微生物の複合群集であって、任意選択的に上述の技術的特徴を有するものと理解される。

本発明の別の目的は、本発明の増殖させた微生物の複合群集を含む医薬製剤に関する。

本明細書中で使用される場合、用語「医薬組成物」は、本発明の増殖させた微生物の複合群集及び少なくとも１つの薬学的に受容可能な賦形剤を含む任意の組成物をいう。

本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能な賦形剤」は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、そしてそれが投与される濃度で宿主に対して過度に毒性でない担体媒体をいう。該賦形剤は、剤形及び所望の投与方法に応じて、当業者に公知の通常の賦形剤から選択することができる。

本発明の増殖させた微生物の複合群集又は本発明の該複合体を含む医薬組成物は、許容される投与様式のいずれかによって、好ましくは経口経路、直腸経路、胃十二指腸及び皮膚（軟膏）によって投与することができる。

経口製剤の例は、国際公開第２０１９／０９７０３０ Ａ１号パンフレットに記載されている製剤を含むが、これらに限定されない。

本発明の増殖させた微生物の複合群集又は本発明の該複合群集を含む医薬組成物は、液体、懸濁液、ゲル、ゲルタブ、半固体、錠剤、サシェ、ロゼンジ、カプセル、浣腸としての経腸製剤、又は軟膏としての皮膚製剤として製剤化された、例えば、錠剤、カプセル、浣腸及び坐剤などの投与に適した任意の形態で存在し得る。

本発明の別の目的は、医薬として使用するための、本発明の増殖させた微生物の複合群集又は本発明の該複合群集を含む医薬組成物に関する。

治療される対象は、ヒト及び／又は動物であり得る。

本発明の別の目的は、自己又は同種異系マイクロバイオーム生態系療法などのマイクロバイオーム生態系療法におけるその使用のための、本発明の増殖させた微生物の複合群集又は本発明の医薬組成物に関する。

本発明で使用される場合、「マイクロバイオーム生態系療法」という用語は、本発明の方法に従って得られる増殖させた微生物の複合群集の投与を指し、ステップ（ａ）で培養される微生物の複合群集の少なくとも一部又は全部は、その最初のマトリックスから抽出されていても、部分的に抽出されていても、部分的に単離されていても、単離されていても、部分的に分離されていても、分離されていても、又はそれらの処理がなされていなくても、人工的に合成されていても、又は遺伝子改変されていてもよい。マイクロバイオーム生態系療法は、それを必要とする対象において、機能不全の損傷した生態系の少なくとも一部又は全部を、完全に機能的で健康な生態系で置き換えることを指し得る。

本発明の別の目的は、自己又は同種異系マイクロバイオーム生態系療法等のマイクロバイオーム生態系療法に好適な形態下にある、本発明の微生物の増殖させた複合群集又は本発明の医薬組成物に関する。

本発明の別の目的は、敗血症、敗血性ショック、感染、例えばクロストリジウム・ディフィシル（Clostridioides difficile）感染及び関連する下痢（ＣＤＩ）、潰瘍性結腸炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性大腸症候群（ＩＢＳ）、特発性便秘、セリアック病、クローン病、１型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、食物アレルギー、固形がん、例えば腎細胞がん、黒色腫、結腸直腸又は非小細胞肺がん、液性がん、例えば白血病又は骨髄異形成症候群、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、例えば胃腸急性ＧｖＨＤ、ステロイド抵抗性ＧｖＨＤ又はステロイド依存性ＧｖＨＤ、肥満及び病的肥満、自閉、硬化症、慢性膣感染、例えば膀胱炎及び真菌症、骨・関節感染症、パーキンソン病、アルツハイマー病、統合失調症及び双極性障害、消化管障害、例えば腸炎、下痢、旅行者下痢、粘膜炎、腹痛及び胃腸出血、腸内毒素症、例えばがん化学療法又は免疫療法に関連付けられる腸内毒素症、集中治療室（ＩＣＵ）関連腸内毒素症、アルコール性及び非アルコール性肝臓疾患、治療誘発性炎症、例えば治療誘発性腸炎、抗がん療法誘発性炎症、血液疾患、コロナウイルス感染症、同種造血幹細胞移植（ａｌｌｏ－ＨＳＣＴ）から生じる感染性又は非感染性合併症、例えば同種造血幹細胞移植（ａｌｌｏ－ＨＳＣＴ）後ステロイド抵抗性移植片対宿主病（ＳＲ－ａＧｖＨＤ）、クロストリジウム（Clostridium）、エンテロコッキ（Enterococci）などの、例えばバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）及びグリコペプチド耐性腸球菌（ＧＲＥ）、広域スペクトルβ－ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）産生細菌、カルバペネマーゼ産生腸内細菌（ＣＰＥ）、高抗生物質耐性細菌（Emerging Bacteria Highly Resistant to Antibiotics、ＢＨＲｅ）を含む多剤耐性細菌による保菌又は感染、及び／又は悪性血液疾患、及びこれらの組み合わせの予防及び／又は治療における使用のための本発明の増殖させた微生物の複合群集、又は本発明の該複合群集を含む医薬組成物に関する。

上述の疾患のいくつかにおいて、本発明の増殖させた微生物の複合群集は、直接的効果を有する。他の疾患において、本発明の増殖させた微生物の複合体群集は、薬物ベースの療法、免疫療法、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７を標的とするもの、腫瘍ネオ抗原を標的とする療法、化学療法、放射線療法及びそれらの組み合わせと組み合わせて、例えば、該療法の効果を増加させるアジュバントとして、及び／又は該療法によって誘導される副作用を減少させるために使用される。

本発明はまた、上述の疾患の予防及び／又は治療のための医薬の製造のための、本発明の増殖させた微生物の複合群集又は本発明の該増殖させた微生物の複合群集を含む医薬組成物の使用に関する。

本発明はまた、本発明の増殖させた微生物の複合群集又は本発明の該増殖させた微生物の複合群集を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む、上記疾患の予防及び／又は治療のための方法に関する。

本発明の別の目的は、自己又は同種異系マイクロバイオーム生態系療法などのマイクロバイオーム生態系療法における上述の疾患の予防及び／又は治療におけるその使用のための、本発明の増殖させた微生物の複合群集又は本発明の該増殖させた微生物の複合群集を含む医薬組成物に関する。

本発明はまた、自己又は同種異系マイクロバイオーム生態系療法などのマイクロバイオーム生態系療法における、本発明の増殖させた微生物の複合群集又は本発明の該増殖させた微生物の複合群集を含む医薬組成物の使用に関する。

実施例１の結果：
単一発酵槽に由来する試料と比較した、ラン１、２及び３についての発酵槽の混合物試料の門レベルでの分類を示す。

単一発酵槽に由来する試料と比較した、ラン１、２及び３についての発酵槽混合物試料のＯＴＵレベルでの富化度を示す。

ラン１、２及び３についての発酵槽混合物試料のベースラインからのＯＴＵ及び属の維持を示す。

単一発酵槽に由来する試料と比較した、ラン１、２及び３についての発酵槽混合物試料のｂｕｔｙｃｏｒｅ存在度を示す。

単一発酵槽に由来する試料と比較した、ラン１、２及び３についての発酵槽混合物試料のコア微生物叢存在度を示す。

単一発酵槽に由来する試料と比較した、ラン１、２及び３についての発酵槽混合物試料の健康指数存在度を示す。

ラン１、２及び３についての発酵槽混合物試料のベースラインと比較したジャッカード指数類似性によって表されるβ多様性を示す。

実施例２の結果：
図８Ａは、混合物の門レベルでの分類を示す。 図８Ｂは、混合物の門レベルでの分類を示す。

図９Ａは、混合物の属レベルでの富化度を示す。 図９Ｂは、混合物の属レベルでの富化度を示す。

図１０Ａは、混合物のベースラインからの属の維持を示す。 図１０Ｂは、混合物のベースラインからの属の維持を示す。

図１１Ａは、混合物のコア微生物叢存在度を示す。 図１１Ｂは、混合物のコア微生物叢存在度を示す。

図１２Ａは、混合物のｂｕｔｙｃｏｒｅ存在度を示す。 図１２Ｂは、混合物のｂｕｔｙｃｏｒｅ存在度を示す。

図１３Ａは、混合物の健康指数存在度を示す。 図１３Ｂは、混合物の健康指数存在度を示す。

図１４Ａは、混合物のベースラインと比較したジャッカード指数類似性によって表されるβ多様性を示す。 図１４Ｂは、混合物のベースラインと比較したジャッカード指数類似性によって表されるβ多様性を示す。

混合物２８～３１を調製するためのプロトコル。 実施例３の結果： 異なる滞留時間条件に由来する発酵槽混合物の門レベルでの分類を、単一発酵槽に由来する試料と比較して示す。

単一の発酵槽に由来する試料と比較した、異なる滞留時間条件に由来する発酵槽混合物の属レベルでの富化度を示す。

単一の発酵槽に由来する試料と比較した、異なる滞留時間条件に由来する発酵槽混合物のｂｕｔｙｃｏｒｅ量を示す。

単一発酵槽に由来する試料と比較した、異なる滞留時間条件に由来する発酵槽混合物のコア微生物叢存在度を示す。

単一発酵槽に由来する試料と比較した、異なる滞留時間条件に由来する発酵槽混合物の健康指数存在度を示す。

単一発酵槽に由来する試料と比較した、異なる滞留時間条件に由来する属レベルでの発酵槽混合物のジャッカード指数類似性によって表されるβ多様性を示す。

実施例４の結果：
ラン１、２、３及び４についての混合物の門レベルでの分類を示す。

ラン１、２、３及び４についての混合物のｂｕｔｙｃｏｒｅ存在度を示す。

ラン１、２、３及び４についての混合物のコア微生物叢存在度を示す。

実施例１：微生物叢発酵に対するｐＨの影響
実験の範囲
実験の目的は、微生物叢発酵に対する３つの異なるｐＨの効果を調査すること、及び異なるｐＨで安定化された微生物叢を混合することが初期微生物叢分類プロファイルにより良好に対応することを可能にするかどうかを確立すること、とした。

プロトコル
－発酵システム
Ｍｏｂｉｕｓ ＣｅｌｌＲｅａｄｙ ３Ｌ使い捨てバイオリアクターを使用した。Ｍｏｂｉｕｓバイオリアクターは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製である。

バイオリアクターをＭｙ－Ｃｏｎｔｒｏｌコントローラによってモニターする。コントローラは、Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（オランダ）製である。これらのシステムは、ｐＨ、体温、回腸流出物の供給、滞留時間、常在性微生物叢の活性によって維持される嫌気生活などのインビボヒト結腸環境の主要パラメータを統合する（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｔｒａｃｔ ａｓ Ｒｅｌｅｖａｎｔ Ｔｏｏｌｓ ｔｏ Ａｓｓｅｓｓ ｔｈｅ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ Ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ，Ｃｏｒｄｏｎｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．２０１５ Ｄｅｃ；３（４）：７２５－７４５）。

発酵パラメータは以下の通りとした：
－反応体積：１Ｌ
－設定温度：３７℃
－ｐＨ調整：５．３、６．３又は７．３（各バイオリアクター／発酵槽は異なるｐＨ設定点を有する）
－滞留時間：２４時間
培地の組成は、回腸流出物の１つに可能な限り近づけ（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｔｒａｃｔ ａｓ Ｒｅｌｅｖａｎｔ Ｔｏｏｌｓ ｔｏ Ａｓｓｅｓｓ ｔｈｅ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ Ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ，Ｃｏｒｄｏｎｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．２０１５ Ｄｅｃ；３（４）：７２５－７４５）、各成分は食品又は医薬品グレードとする。

１００μＬの消泡剤（Ａ５７５８と呼ばれるＳｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈからのＹ－３０エマルション）を微生物叢培養の開始時に添加し、培地のｐＨを、発酵槽の設定点に従い、それぞれ５．３、６．３及び７．３に調整した。

－ヒト糞便微生物叢の調達及び調製
・各実験について、各バイオリアクターに、同じドナー由来の凍結糞便試料を１ ｇ／Ｌの濃度で接種した。３人の異なるドナーを、３つの発酵槽の３回のランを通して試験した。

・糞便は、国際公開第２０１６／１７０２８５ Ａ１号、第２０１７／１０３５５０ Ａ１号又は第２０１９／１７１０１２ Ａ１号パンフレットに記載されている方法に従って調製した。特に、試料を収集し、国際公開第２０１６／１７０２８５ Ａ１号及び第２０１７／１０３５５０ Ａ１号パンフレットに記載の希釈剤（すなわち、５％トレハロース及び１５％マルトデキストリン）で希釈し、使用するまで－８０℃で保存した。
－実施したラン
３つの発酵槽で３回のランを行った。
・ラン１：ドナー１
・ラン２：ドナー２
・ラン３：ドナー３
各ランについて、３つの発酵を３つの異なる発酵槽で並行して行った。これら３つの発酵槽間の差は、発酵槽に応じて、それぞれ５．３、６．３及び７．３に設定されたｐＨ設定点であった。

－実施した分析
・１６Ｓ ｒＤＮＡ配列決定：
表１に従う異なる割合での３つのｐＨ条件の混合物を、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列決定に供した。

配列決定は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって実施した。ゲノムＤＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｓｏｉｌキット（Ｍａｃｈｅｒｙ Ｎａｇｅｌ）を用いて抽出した。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３－Ｖ４領域を標的とする配列決定ライブラリーを、製造業者の指示に従ってＭｙＴａｑ ＨＳ－Ｍｉｘ ２Ｘ、Ｂｉｏｌｉｎｅを使用して各試料について構築した。次いで、ライブラリーを等モル混合物中にプールし、ペアエンド（２×３００ｂｐ）ＭｉＳｅｑ Ｖ３ラン（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）において配列決定した。

ＦＬＡＳＨ（ＦＬＡＳＨ：ｆａｓｔ ｌｅｎｇｔｈ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ，Ｍａｇｏｃ ａｎｄ Ｓａｌｚｂｅｒｇ，２０１１，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１１ Ｎｏｖ １；２７（２１）：２９５７－６３．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｒ５０７．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｓｅｐ ７．）を用いたアンプリコン結合、及びＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ：ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｔｒｉｍｍｅｒ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ，Ｂｏｌｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１４ Ａｕｇ １；３０（１５）：２１１４－２０．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｕ１７０．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ａｐｒ １．．）を用いた品質フィルタリングの後、宿主配列汚染除去を、Ｂｏｗｔｉｅ２（Ｆａｓｔ ｇａｐｐｅｄ－ｒｅａｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｂｏｗｔｉｅ ２，Ｌａｎｇｍｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１２，９：３５７－３５９．）によって実施した。操作的分類単位（ＯＴＵ）配列クラスタリングを、９７％の同一性閾値で、ＶＳＥＡＲＣＨ（ＶＳＥＡＲＣＨ：ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｏｐｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｒｏｇｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６，ＰｅｅｒＪ．２０１６ Ｏｃｔ １８；４：ｅ２５８４．ｄｏｉ：１０．７７１７／ｐｅｅｒｊ．２５８４．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１６．）により、次いで、Ｓｉｌｖａ ＳＳＵデータベースリリース１２８を用いて分類プロファイリングを実施した。ｖｅｇａｎ及びｐｈｙｌｏｓｅｑパッケージを使用して、Ｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ ２０１５、バージョン３．４．４）により、分類分析及び多様性分析を実施した。

公平な比較のために、各試料の配列番号を、同じ配列決定深度すなわち、試料当たり５００００アンプリコンにランダムに正規化し、ｑＰＣＲ結果に基づいて総細菌数によって正規化した。多様性尺度は、試料当たり２０個のサブサンプリングの中央値に対応し得る。

・フローサイトメトリー分析：
フローサイトメトリー分析のために、試料を生／死キットで標識し、ＢＤ（商標）ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーターで分析した。

結果
異なる割合での、３つのｐＨ条件の混合物
本パートは、異なる発酵日（２日目、４日目、８日目及び１４日目）に、上記の表１に従って異なる割合で混合された発酵槽試料についての１６Ｓ結果に関する。

－混合物についての１６Ｓ：
－門レベルでの分類学的組成：
結果を図１に示す。

図１に示されるように、割合にかかわらず、最終組成に差はない。それにもかかわらず、組成は正規化され、ベースライン組成に近い。

－ＯＴＵレベルでの富化度：
結果を図２に示す。

ここで再び、図２に示されるように、少なくとも２つの発酵槽試料が混合されるとき、富化度は増加し、正規化される。これは、少なくとも２つのｐＨ条件が微生物の異なる群集をもたらし、富化度を増加させるという事実によって説明することができる。

－ＯＴＵの起源：
結果を図３に示す。

図３は、全ての混合物において、同定されたＯＴＵの大部分が少なくとも２つの発酵槽中にも存在したことを示す。それはまた、各発酵槽が混合物中にそれ自体のＯＴＵをもたらすことを示し、少なくとも２つのｐＨ条件が有用であることを意味する。また、より高い量で存在する発酵槽に属するＯＴＵの数は、一般に、他の２つのＯＴＵよりも高いパーセンテージのＯＴＵをもたらすため、比率による効果はこの図で見ることができる。３３－３３－３３（より具体的には３３．３４－３３．３３－３３．３３）の割合では、各発酵槽はほぼ同量のＯＴＵをもたらす。

驚くべきことに、おそらく非常に低い存在度で存在し、発酵の開始時に検出できないＯＴＵに起因して、発酵槽のいずれにも由来しない少量のＯＴＵも存在する。これらのＯＴＵは、培養条件において増加し、その後検出可能であった。

－Ｂｕｔｙｃｏｒｅ：
Ｂｕｔｙｃｏｒｅは、酪酸を産生することが知られている細菌の富化度を表す。

結果を図４に示す。

図４に示すように、発酵槽の試料が混合される場合、ｂｕｔｙｃｏｒｅは正規化される。ラン２の混合物６０－３０－１０及びラン２の混合物３０－１０－６０の場合、比率による若干の影響が観察される。第１の場合において、ｐＨ ５．３発酵槽（Ｆ１）は、最も高い細菌割合を示し、他の混合物と比較してｂｕｔｙｃｏｒｅが高く、その単一値が高い（４日後に約７０％）ため、ベースラインよりも高い。第２の場合において、ｐＨ ８．３発酵槽（Ｆ３）は、より高い割合を示し、その単一値が低い（２日後に１０％未満）ため、他の混合物と比較してｂｕｔｙｃｏｒｅが低い。

－コア微生物叢：
コア微生物叢は、以下の属：ルミノコッカス、フィーカリバクテリウム、ドレア、コルプロコッカス、ブラウティア、アリスチペス、バクテロイデス、サブドリグラヌルム、ロゼブリア、パラバクテロイデス及びラクノスピラの総存在度を表す。

結果を図５に示す。

図５に示すように、コア微生物叢はまた、ベースラインと比較してより高い又は同様の値に正規化される。比率間に差異は観察されない。それは、全ての発酵槽間のバランスであると考えられる。

－健康指数：
健康指数は、ラクノスピラ、ルミノコッカス、クロストリジウム、プレボテラ、及びエリシペロトリカデアエの存在度の合計を表す。

結果を図６に示す。

図６に示されるように、他の変数として、健康指数は、発酵槽が混合されるときに正規化される。値はベースライン値と同様である。割合間に有意差は観察されない（全ての実験について混合物１０－６０－３０を混合物６０－３０－１０と比較した場合のｐＨ ５．３（Ｆ１）のわずかな影響を除く）。

－β－多様性、ベースラインとのジャッカード類似性：
ジャッカード指数は、試料セットの類似性及び多様性を測定するために使用される統計ツールである。

結果を図７に示す。

図７に示すように、ジャッカード指数は、発酵槽を混合した場合に正規化される。２日目（Ｄ０２）及び４日目（Ｄ０４）において、混合物のジャッカード指数は、４時間の発酵後の単一発酵槽のジャッカード指数に近く（図示せず）、したがってベースラインに近い。４時間のジャッカード指数は約７０％であったからである。８日目（Ｄ０８）及び１４日目（Ｄ１４）に、指数はわずかに減少するが、ほとんど常に単一発酵槽の値より高い（図示せず）。

考察及び結論
異なる割合での、３つのｐＨ条件の混合物
混合物についての結果は、主に、ＯＴＵレベルで、発酵槽の割合とサンプリング日との間に差異が観察されなかったことを示す。例えば、発酵槽を混合することにより、結果の正規化が可能となり、発酵槽が混合されると、各指標はベースライン値に近づく。これは、ＯＴＵでの分類、ｂｕｔｙｃｏｒｅ、コア微生物叢、健康指数、富化度、及びβ多様性についての場合であった。

特に、同定されたＯＴＵの大部分は、少なくとも２つの発酵槽中に存在し、少なくとも２つの発酵槽のそれぞれは、混合物中にそれ自体のＯＴＵをもたらし、これは、少なくとも２つのｐＨ条件が有用であることを意味する。

結論として、本発明者らは、少なくとも２つの異なるｐＨで作用させることにより、目的のＯＴＵがもたらされることを見出した。また、少なくとも２つのｐＨが組み合わされると、各変数はベースライン値に近づく。すなわち、少なくとも２つのｐＨ条件が重要であり、さらなる実験のために維持することとする。

実施例２：インビトロ発酵に由来するいくつかの微生物叢を混合するための予測ツールの使用
実験の範囲
この実施例で使用されるツールは、いくつかの微生物叢試料の混合を模倣することによってインシリコで得られるプロファイルの予測を可能にする。この実験では、ツールを使用して、インビトロ発酵からの２つ、３つ又は４つの試料プロファイルを混合する。これらの試料は、同じ若しくは異なるドナーを用いて、及び／又は同じ若しくは異なるｐＨ設定点（複数可）を用いて行われた発酵から生じさせる。試料はまた、異なる割合で混合する。

プロトコル
混合物
異なる混合物について試験した割合を以下に示す。

－ＭＩＸ １～７は、同じドナーに由来する微生物叢を接種された３つの発酵槽に由来するが、３つの異なるｐＨ設定点（５．３、６．３及び７．３）を有し、ＭＩＸ ８～１０は、比較目的として、同じドナーに由来する微生物叢及び単一のｐＨ設定点により接種された１つの発酵槽に由来するプロファイルを用いて構築する。
－ＭＩＸ１１～２７は、同じドナーに由来する微生物叢が、２つの異なるｐＨ設定点（５．３、６．３又は７．３）で接種された、２つの発酵槽に由来する２つの微生物叢プロファイルを用いて構築する。
－ＭＩＸ２８～３１は、図１５に従い、異なるドナーに由来する微生物叢が、異なるｐＨ設定点（５．３、６．３及び／又は７．３）で接種された、発酵槽に由来する４つの微生物叢プロファイルを用いて構築する。

混合物は、先の表に見られるように同定した：ＭＩＸ １～３１。

実施した分析
混合物は、予測ツールプラットフォーム上で予測する。予測されたプールの分類学的構成を要約する得られた．ｃｓｖファイルをエクスポートし、以下の測定基準を計算するためにバイオインフォマティクスツールを使用して分析する。
・門レベルでの分類学的組成（バクテロイデーテス、ファーミキューテス、プロテオバクテリア、・・・）
・富化度（属レベル）
・ベースラインに見出される属の保存
・コア微生物叢
・Ｂｕｔｙｃｏｒｅ
・健康指数Ｉ２
・β－多様性、ベースラインとのジャッカード類似性
結果
－門レベルでの分類学的組成
結果を図８に示す。

ＭＩＸ８、ＭＩＸ９及びＭＩＸ１０は、第１、第２及び第３の発酵槽に由来する試料に対応する。実施例１に見られるように、ｐＨ ５．３発酵槽に由来する試料（ＭＩＸ８）は、ｐＨ ６．３及び７．３の発酵槽に由来する試料（それぞれＭＩＸ９及びＭＩＸ１０）と比較して、より高い量のアクチノバクテリア（Actinobacteria）及びより低い量のバクテロイデーテス（Bacteroidetes）を有する組成を有する。ｐＨ ６．３及びｐＨ ７．３発酵槽（それぞれＭＩＸ９及びＭＩＸ １０）に由来する試料は、ｐＨ ６．３発酵槽（ＭＩＸ９）に由来する試料中により高い量のプロテオバクテリアが存在することを除いて、同様である。

次に、ｐＨ ５．３の発酵槽に由来する試料が高い割合で存在する混合物（ＭＩＸ２、ＭＩＸ５、ＭＩＸ８、ＭＩＸ１１、ＭＩＸ１３、ＭＩＸ１４、ＭＩＸ１８、ＭＩＸ２２及びＭＩＸ２６）を除いて、微生物叢の数にかかわらず、またｐＨが異なっていても、門レベルでのプロファイルはすべての混合物で類似していることが分かる。

－富化度（属レベル）
結果を図９に示す。

微生物叢が単独で考慮される場合（ＭＩＸ８、ＭＩＸ９及びＭＩＸ１０）、対応する富化度は、他の混合物の富化度よりも低い。全ての混合物は、ＭＩＸ１～ＭＩＸ７については初期試料（ベースライン－図示せず）に、ＭＩＸ１１～ＭＩＸ３１についてはＭＩＸ１に類似し、近い富化度を示す。

ベースラインに見出される属の保存
結果を図１０に示す。

ここで、ＭＩＸ１～ＭＩＸ１０における属の数を、最初の試料（ベースラインは示さず）と比較した。ＭＩＸ１１～ＭＩＸ３１の属の数をＭＩＸ１と比較した。

すなわち、最初の試料は、ＭＩＸ１～ＭＩＸ１０のベースラインであり、ＭＩＸ１は、ＭＩＸ１１～ＭＩＸ３１のベースラインである。

３つの異なるｐＨ設定点を有する３つの発酵槽に由来する試料の混合物に対応するＭＩＸ １～７を、単一発酵槽に由来する試料（ＭＩＸ８～ＭＩＸ１０）と比較すると、実施例１に見られるように少なくとも２つの微生物叢を混合することにより、単一発酵槽（ＭＩＸ８～ＭＩＸ１０）の使用よりも多くの属を維持することが可能になることが分かる。ＭＩＸ １及びＭＩＸ４は、より高い属の数を示し、それらは、それぞれ３３／３３／３３（より具体的には３３，３４／３３，３３／３３，３３）、６０／３０／１０、１０／６０／３０及び３０／１０／６０の割合に対応する。コア微生物叢に属する属を見ると、混合時に属が完全に失われないことが分かる。ブラウティア又はロセブリアのようないくつかの属は、混合物中に維持することが困難であるが、それらの存在は、割合のみに依存する。第１のものについては、ｐＨ ５．３の発酵槽に由来する試料中にのみ見出されるので、この発酵槽に由来する試料を高い割合で含有する混合物中にのみ見出される。第２のものについては、同様に、ｐＨ ５．３発酵槽に由来する試料中にのみ見出され、したがって、混合物がｐＨ ５．３発酵槽に由来する試料を低い割合で含有する場合、属は混合物中で失われる。

ＭＩＸ１１～３１に関して、２つの微生物叢（ＭＩＸ１１～ＭＩＸ２７）のみを混合することもまた、多数の属を維持することを可能にし、コア微生物叢属の大部分が全ての混合物において維持されることが分かる。ＭＩＸ１のドナーとは異なるドナーに由来する微生物叢を含有する混合物と比較することができるＭＩＸ ２８～３１では、失われた属の数は、予想通り、他の混合物よりも多い。それにもかかわらず、ＭＩＸ ２８～３１における失われた属の数は、３つの異なるｐＨ設定点（ＭＩＸ１～７）を有する発酵槽に由来する３つの微生物叢を有する試料混合物の１つと同様である。

－コア微生物叢：
結果を図１１に示す。

コア微生物叢は、以下の属の総存在度を表す：ルミノコッカス、フィーカリバクテリウム、ドレア、コルプロコッカス、ブラウティア、アリスチペス、バクテロイデス、サブドリグラヌルム、ロゼブリア、パラバクテロイデス及びラクノスピラ。

図１１に見られるように、コア微生物叢は、全ての混合物について類似しており、ｐＨ ５．３発酵槽に由来する試料の割合が高い混合物についてはわずかに低い（コア微生物叢値は、ｐＨ ５．３発酵槽のみに由来する試料において低いため）。３種、２種及び４種の微生物叢の混合物の間に実際の差は観察されず、値は常に６０％に近い。

－Ｂｕｔｙｃｏｒｅ
結果を図１２に示す。

Ｂｕｔｙｃｏｒｅは、酪酸を産生することが知られている細菌の富化度を表す。実施例１に見られるように、ｂｕｔｙｃｏｒｅ指数はｐＨ ５．３発酵槽で高い。これはまた、ｐＨ ５．３発酵槽のみに由来する試料に対応するＭＩＸ８の場合である。したがって、混合物がｐＨ ５．３発酵槽由来の試料を含む場合、ｂｕｔｙｃｏｒｅ指数は、ｐＨ ５．３発酵槽由来の試料を含まない混合物と比較して高い。興味深いことに、混合物がｐＨ改変を伴わない３人の異なるドナーに由来する試料を含む場合、ｂｕｔｙｃｏｒｅは高い（ＭＩＸ２８）。次いで、Ｂｕｔｙｃｏｒｅは、ｐＨ ５．３発酵槽に由来する試料及び／又は数人のドナーに由来する試料を含む混合物についてより高い。

健康指数Ｉ２
結果を図１３に示す。

健康指数は、ラクノスピラ、ルミノコッカス、クロストリジウム、プレボテラ、及びエリシペロトリカデアエの存在度の合計を表す。

図１３は、ドナーの数にかかわらず、またｐＨ条件の数にかかわらず、健康指数が常に３０～４５％であることを示す。この割合は、ｐＨ ６．３の発酵槽に由来する試料を高い割合で含む混合物についてはさらに高い。ｐＨ ６．３の発酵槽のみに由来する試料が高い健康指数値を示すことから、予想されるところであった。

－β－多様性、ベースラインとのジャッカード類似性：
結果を図１４に示す。

単一の発酵槽に由来する試料を含む混合物（ＭＩＸ ８～１０）と最初の試料（ベースライン－図示せず）との類似性は、異なる発酵槽に由来する試料を含む混合物（ＭＩＸ１～７及び１１～２７）よりも低く、２つの発酵槽のみに由来する試料を含む混合物（ＭＩＸ１１～２７）よりもさらに高い。

予想されるように、ＭＩＸ１とＭＩＸ２８～３１との間の類似性は、最初のドナーが同じでないため、より低い。それにもかかわらず、値は依然として４０％に近い。

考察及び結論
この実験では、実施例１に見られるように、単一のドナーに由来する微生物叢及び少なくとも２つの異なるｐＨ設定点で接種された混合発酵槽が、単一の発酵槽条件と比較して指数を改善することによって、いくつかの指数に影響を及ぼしたことが実証された。さらに、ｐＨ ５．３の条件は、値を増加又は減少させることによってこれらの指数に影響を及ぼすことが分かった。したがって、この条件は混合物において重要であり、最終的な微生物叢組成に影響を与えるために維持されるべきである。

ツールの結果はまた、２つのみのｐＨ条件では、指数が単一発酵槽（１つのｐＨ条件）で得られたものと比較して良好であることを示した。そしてより興味深いことに、いくつかのドナーに由来する４つの微生物叢を、及び／又はいくつかのｐＨ設定点で混合することにより、単一の発酵槽（１つのｐＨ条件）よりもベースライン値に近づけることが可能になる。

結論として、この実施例は、２、３及び４つの微生物叢の培養及び混合が可能であり、単一発酵槽（１つのｐＨ条件）の使用と比較して、初期プロファイルに近づけるために必要であり、異なる割合で混合することにより、微生物叢の最終組成に影響を与えることができることを示した。培養は、少なくとも２つの微生物叢（少なくとも２つのｐＨ条件）で機能することができるが、より多くのｐＨ条件及び／又はより多くの初期ドナーを加えることによって、また各微生物叢の割合を変化させることによって、この混合微生物叢を富化することは容易に想像することができる。なぜならそれは、可能な限り多くの属を維持し、発酵前の初期微生物叢にさらに近づけることを可能にするからである。

実施例３：微生物叢発酵に対する滞留時間の影響
実験の範囲
実験の目的を、微生物叢発酵に対する４つの滞留時間条件の効果を試験することとした。

プロトコル
プロトコルは、発酵パラメータ及びフローサイトメトリー分析が異なることを除いて、実施例１と同一とした。

－発酵パラメータ
発酵パラメータは以下の通りとした：
－反応体積：１Ｌ
－設定温度：３７℃
－ｐＨ調整：６．３
－滞留時間：１２時間、２４時間、４８時間、９６時間（各バイオリアクター／発酵槽は異なる滞留時間を有する）。
実施例１に記載されるように供給された１つのヒト糞便微生物叢のみを使用した。

－フローサイトメトリー分析：
フローサイトメトリー分析のために、試料を生／死キットで標識し、Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）５ ＨＴフローサイトメーターで分析した。

－実施したラン
４つの発酵を実施した：
ＲＴ１：滞留時間１２時間
ＲＴ２：滞留時間２４時間
ＲＴ３：滞留時間４８時間
ＲＴ４：滞留時間９６時間
４つの発酵を、４つの異なる発酵槽において並行して行った。これら４つの発酵槽間の差は、それぞれ１２時間、２４時間、４８時間及び９６時間に設定された滞留時間設定点であった。

－実施した混合
インシリコ予測ツールを用いて混合を行った。Ｅｒｒｅｕｒ！Ｓｏｕｒｃｅ ｄｕ ｒｅｎｖｏｉ ｉｎｔｒｏｕｖａｂｌｅ．は、予測ツールで使用される割合を示す。

結果
－門レベルでの分類学的組成
結果を図１６に示す。図１６に示すように、使用した滞留時間に依存して、Ｄ０３での組成に差異が観察される。より多くのファーミキューテスがＲＴ１条件で得られ、より多くのプロテオバクテリアがＲＴ４条件で得られる。割合に関係なく、最終組成に差はない。それにもかかわらず、組成は正規化され、ベースライン組成に近い。

－属レベルでの富化度
結果を図１７に示す。図１７に示すように、発酵時間にわたっていくつかの差が観察される。Ｄ０３では、滞留時間条件にかかわらず、富化度指数は類似していた。発酵槽の試料が混合される場合、割合にかかわらず、富化度が正規化される。

－Ｂｕｔｙｃｏｒｅ
Ｂｕｔｙｃｏｒｅは、酪酸を産生することが知られている細菌の富化度を表す。結果を図１８に示す。

図１８に示すように、Ｄ０１で既に、ｂｕｔｙｃｏｒｅ指数は、ＲＴ１条件でより高い。ＲＴ４条件は、発酵時間にかかわらず、ｂｕｔｙｃｏｒｅにとって最も好ましくない。ＲＴ１条件は、ベースラインと比較してさらに高い最も高いｂｕｔｙｃｏｒｅスコアを得ることを可能にした。発酵槽の試料が混合される場合、ＲＴ１がより高い割合で添加される混合物を除いて、割合にかかわらず、ｂｕｔｙｃｏｒｅは正規化される。

－コア微生物叢：
コア微生物叢は、以下の属：ルミノコッカス、フィーカリバクテリウム、ドレア、コルプロコッカス、ブラウティア、アリスチペス、バクテロイデス、サブドリグラヌルム、ロゼブリア、パラバクテロイデス及びラクノスピラの総存在度を表す。結果を図１９に示す。

図１９に示すように、使用した滞留時間にかかわらず、コア微生物叢指数は経時的に増加して、Ｄ０３で同様の存在度に達した。値はベースライン値と同様である。比率間に差異は観察されない。

－健康指数：
健康指数は、ラクノスピラ、ルミノコッカス、クロストリジウム、プレボテラ、及びエリシペロトリカデアエの存在度の合計を表す。結果を図２０に示す。

図２０に示されるように、滞留時間にかかわらず、健康指数はＤ０１からＤ０２で増加した。ＲＴ１は、他の滞留時間条件と比較して、Ｄ０３でより高い健康指数に達した。健康指数は、滞留時間が長くなるにつれて減少する傾向があった。他の変数として、健康指数は、発酵槽が混合される場合に正規化される。ＲＴ１がより高い割合で添加される混合物を除いて、大きな差異は観察されない。

－β－多様性、ベースラインとのジャッカード類似性：
ジャッカード指数は、試料セットの類似性及び多様性を測定するために使用される統計ツールである。結果を図２１に示す。

図２１に示すように、各滞留時間条件のジャッカード指数は類似している。混合物のジャッカード指数は、７２時間の発酵後の単一発酵槽のジャッカード指数に近い。混合物の割合にかかわらず、大きな差異は観察されない。

考察及び結論
結果は、滞留時間が異なる門、したがって異なる属の発生に影響を及ぼし得ることを示す。最も短い滞留時間は、コア微生物叢及びｂｕｔｙｃｏｒｅを構成する目的の属に有利であった。さらに、滞留時間がどのようなものであっても、富化度指数は類似している。
結論として、本発明者らは、滞留時間の変化が培養された生態系の組成に影響を及ぼすこと、及び特定の微生物叢プロファイルを選択するためにいくつかの滞留時間が有利であり得ることを見出した。混合物についての結果は、発酵槽の割合の間で差異がほとんど観察されないことを示している。例えば、発酵槽を混合することにより、結果の正規化が可能となり、発酵槽が混合されると、各指標はベースライン値に近づく。

実施例４：微生物叢発酵に対する再培養の影響の試験
実験の範囲
実験の目的を、微生物叢培発酵に対するいくつかの連続した再培養の効果を試験することとした。

プロトコル
プロトコルは、フローサイトメトリー分析が異なることを除いて、実施例１と同一とした。

－フローサイトメトリー分析：
フローサイトメトリー分析のために、試料を生／死キットで標識し、Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）５ ＨＴフローサイトメーターで分析した。

－実施したラン
４回のランを連続して行った：
ラン１：１回目の培養
ラン２：１回目の再培養
ラン３：２回目の再培養
ラン４：３回目の再培養
この実施例では、各ランについて、３つの発酵を３つの異なる発酵槽で並行して行った。これらの３つの発酵槽間の差はｐＨ設定値であり、それぞれ５．３、６．３及び７．３に設定した。各ランは連続して行った。ラン１の接種材料は、ヒト糞便微生物叢（実施例１に記載の通り）であり、次のランの接種材料は、前のランの３つの発酵槽から得られた混合物（３４％／３３％／３３％の割合の混合物）であった。このようにして、合計４回の培養を行った。

結果
各ランの最後に得られた混合物（３４％／３３％／３３％）のみを示す。
－門レベルでの分類学的組成
結果を図２２に示す。
図２２に示すように、培養物の数にかかわらず、得られた混合物は、主にファーミキューテス及びバクテロイデーテス門からなり、３％未満のプロテオバクテリア及びフソバクテリア門を含む。

－Ｂｕｔｙｃｏｒｅ
Ｂｕｔｙｃｏｒｅは、酪酸を産生することが知られている細菌の富化度を表す。結果を図２３に示す。

図２３に示されるように、ｂｕｔｙｃｏｒｅ指数は、培養物の数にかかわらず、類似しており、値は、ベースライン値と同様であるか、又はそれよりも高い。

－コア微生物叢：
コア微生物叢は、以下の属：ルミノコッカス、フィーカリバクテリウム、ドレア、コルプロコッカス、ブラウティア、アリスチペス、バクテロイデス、サブドリグラヌルム、ロゼブリア、パラバクテロイデス及びラクノスピラの総存在度を表す。結果を図２４に示す。

図２４に示されるように、いくつかのわずかな変動が、再培養数に応じてコア微生物叢存在度において観察される。得られた値は、培養物の数にかかわらず、ベースライン値よりも高い。

考察及び結論
結果は、連続的な再培養が、得られたメタゲノムプロファイルに影響を及ぼさなかったことを示す。

結論として、本発明者らは、再培養が、培養された生態系の組成に劇的な影響を及ぼさなかったことを見出した。

Claims (20)

1. 微生物の複合群集を増殖させる方法であって、以下のステップ：
   （ａ）少なくとも２つのバイオリアクター、好ましくは少なくとも３つのバイオリアクターで、前記微生物の複合群集を培養するステップであって、前記バイオリアクターが、少なくとも１つの異なるパラメータを有し、前記パラメータが、ｐＨ、温度、圧力、培養時間、滞留時間、ガス処理条件、酸化還元電位、及びそれらの組み合わせから選択されて、少なくとも２つの採取された接種材料を得る、培養するステップと、
   （ｂ）ステップ（ａ）で得られた少なくとも２つの採取された接種材料を混合して、増殖させた微生物の複合群集を得るステップと、を含む方法。
2. 前記バイオリアクターが、６時間～１０２時間、好ましくは１２時間～９６時間、好ましくは２４時間～７２時間に含まれる異なる滞留時間を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 少なくとも１つのバイオリアクターが、６時間～１８時間、好ましくは９時間～１５時間、より好ましくは１１時間～１３時間に含まれる滞留時間を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
4. 少なくとも１つのバイオリアクターが、１８時間～３０時間、好ましくは２１時間～２７時間、より好ましくは２３時間～２５時間に含まれる滞留時間を有することを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 請求項１～４のいずれか一項に記載の方法であって、
   －第１のバイオリアクターが、１８時間～３０時間、好ましくは２１時間～２７時間、より好ましくは２３時間～２５時間に含まれる滞留時間を有し、
   －第２のバイオリアクターが、６時間～１８時間、好ましくは９時間～１５時間、より好ましくは１１時間～１３時間に含まれる滞留時間、又は４２時間～５４時間、好ましくは４５時間～５１時間、より好ましくは４７時間～４９時間に含まれる滞留時間を有することを特徴とする、方法。
6. 請求項１～５のいずれか一項に記載の方法であって、
   －第１のバイオリアクターが、６時間～１８時間、好ましくは９時間～１５時間、より好ましくは１１時間～１３時間に含まれる滞留時間を有し、
   －第２のバイオリアクターが、１８時間～３０時間、好ましくは２１時間～２７時間、より好ましくは２３時間～２５時間に含まれる滞留時間を有し、
   －第３のバイオリアクターが、４２時間～５４時間、好ましくは４５時間～５１時間、より好ましくは４７時間～４９時間に含まれる滞留時間を有する、方法。
7. 前記バイオリアクターが、４．５～８．０、好ましくは５～７．６、より好ましくは５．２～７．４に含まれる異なるｐＨ設定値を有することを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 少なくとも１つのバイオリアクターが、４．５～５．８、好ましくは５～５．６、より好ましくは５．２～５．４に含まれるｐＨ設定値を有することを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 請求項１～８のいずれか一項に記載の方法であって、
   －第１のバイオリアクターが、４．５～５．８、好ましくは５～５．６、より好ましくは５．２～５．４に含まれるｐＨ設定点を有し、
   －第２のバイオリアクターが、５．９～６．８、好ましくは６～６．６、より好ましくは６．２～６．４に含まれるｐＨ設定点、又は６．９～８、好ましくは７～７．６、より好ましくは７．２～７．４に含まれるｐＨ設定点を有することを特徴とする、方法。
10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の方法であって、
    －第１のバイオリアクターが、４．５～５．８、好ましくは５～５．６、より好ましくは５．２～５．４に含まれるｐＨ設定点を有し、
    －第２のバイオリアクターが、５．９～６．８、好ましくは６～６．６、より好ましくは６．２～６．４に含まれるｐＨ設定点を有し、
    －第３のバイオリアクターが、６．９～８、好ましくは７～７．６、より好ましくは７．２～７．４に含まれるｐＨ設定点を有することを特徴とする、方法。
11. ステップ（ａ）で使用される微生物の複合群集が、生理食塩水溶液、少なくとも１つの抗凍結剤及び／又は少なくとも１つの増量剤を含む懸濁液の形態であることを特徴とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. ステップ（ａ）又はステップ（ａ）及び（ｂ）が、ステップ（ａ）で以前に使用されたものと同じｐＨ又は異なるｐＨで少なくとも１回繰り返されることを特徴とする、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. ステップ（ａ）で使用される微生物の複合群集の少なくとも一部若しくは全部、ステップ（ａ）で得られる採取された接種材料の少なくとも一部若しくは全部、及び／又はステップ（ｂ）で得られる増殖させた微生物の複合群集の少なくとも一部若しくは全部が、凍結、解凍及び／又は凍結乾燥されていることを特徴とする、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記微生物の複合群集が、少なくとも１人のドナーに由来する、好ましくは少なくとも２人のドナーに由来する、便微生物叢であることを特徴とする、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. バクテロイデーテス（Bacteroidetes）、シネルギステテス（Synergistetes）、ファーミキューテス（Firmicutes）、プロテオバクテリア（Proteobacteria）、アクチノバクテリア（Actinobacteria）、ベルコミクロビア（Verrucomicrobia）、テンエリクテス（Tenericutes）、フソバクテリア（Fusobacteria）及びそれらの混合物から選択される少なくとも３つの細菌門を含むことを特徴とする、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法によって得られる微生物を増殖させた複合群集。
16. クロストリジウム（Clostridium）、ユーバクテリウム（Eubacterium）、アネロスティペス（Anaerostipes）、バクテロイデス（Bacteroides）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、ブラウティア（Blautia）、ブチリコッカス（Butyricicoccus）、コリンセラ（Collinsella）、ダイアリスター（Dialister）、ドレア（Dorea）、アイゼンベルギエラ（Eisenbergiella）、エシェリキア・シゲラ（Escherichia-Shigella）、フィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）、フシカテニバクター（Fusicatenibacter）、フンガテラ（Hungatella）、ラクノクロストリジウム（Lachnoclostridium）、パラステラ（Parasutterella）、ローズブリア（Roseburia）、ユーバクテリウム（Eubacterium）、［ユーバクテリウム］コプロスタノリゲネス（[Eubacterium]coprostanoligenes）群、［ユーバクテリウム］フィシカテナ（[Eubacterium]fissicatena）群、［ルミノコッカス］トルクス（[Ruminococcus]torque）群、アリゾネラ（Allisonella）、ビロフィラ（Bilophila）、クリステンセネラ（Christensenella）、クリステンセンネラ（Christensenellaceae）Ｒ－７群、クロストリジウム（Clostridium）、クロストリジウム・センス・ストリクト１（Clostridium sensu stricto 1）、コポロコッカス（Coporococcus）、デスルフォビブリオ（Desulfovibrio）、エンテロコッカス（Enterococcus）、フラボニフラクター（Flavonifractor）、ラクノスピラＮＫ４Ａ１３６（Lachnospiraceae NK4A136）群、ラクノスピラＵＣＧ－００１（Lachnospiraceae UCG-001）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、パラバクテロイデス（Parabacteroides）、ペプトストレプトコッカス（Peptostreptococcus）、ロンブツシア（Romboutsia）、ルミノクロストリジウム（Ruminoclostridium）、ルミノコッカスＵＣＧ－００３（Ruminococcaceae UCG-003）、ルミノコッカスＵＣＧ－０１３（Ruminococcaceae UCG-013）、ルミノコッカスＵＣＧ－０１４（Ruminococcaceae UCG-014）、ルミノコッカス（Ruminococcus）、サブドリグラヌルム（Subdoligranulum）及びステレラ（Sutterella）、及びそれらの混合物、を含む群から選択される少なくとも１５の属を含むことを特徴とする、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法によって得られる増殖させた微生物の複合群集。
17. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法によって得られる増殖させた微生物の複合群集を含む医薬製剤。
18. 任意選択で、薬物ベースの療法、免疫療法、免疫チェックポイント阻害剤、腫瘍ネオ抗原を標的とする療法、化学療法及び／又は放射線療法と組み合わせて医薬として使用するための、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法によって得られる増殖させた微生物の複合群集、請求項１５若しくは１６に記載の増殖させた微生物の複合群集、又は請求項１７に記載の医薬製剤。
19. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法によって得られる増殖させた微生物の複合群集、請求項１５又は１６に記載の増殖させた微生物の複合群集、又は請求項１７に記載の医薬製剤であって、敗血症、敗血性ショック、感染、例えばクロストリジウム・ディフィシル（Clostridioides difficile）感染及び関連する下痢(ＣＤＩ)、潰瘍性結腸炎、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)、過敏性大腸症候群(ＩＢＳ)、特発性便秘、セリアック病、クローン病、1型糖尿病、II型糖尿病、食物アレルギー、固形がん及び液性がん、移植片対宿主病(ＧｖＨＤ)、例えば胃腸急性ＧｖＨＤ、ステロイド抵抗性ＧｖＨＤ又はステロイド依存性ＧｖＨＤ、肥満及び病的肥満、自閉、硬化症、慢性膣感染、例えば膀胱炎及び真菌症、骨・関節感染症、パーキンソン病、アルツハイマー病、統合失調症及び双極性障害、消化管障害、例えば、腸炎、下痢、旅行者下痢、粘膜炎、腹痛及び胃腸出血、腸内毒素症、例えばがん化学療法又は免疫療法に関連付けられる腸内毒素症、集中治療室（ＩＣＵ）関連腸内毒素症、アルコール性及び非アルコール性肝臓疾患、治療誘発性炎症、例えば治療誘発性腸炎、抗がん療法誘発性炎症、血液疾患、コロナウイルス感染症、同種造血幹細胞移植(allo-ＨＳＣＴ)から生じる感染性又は非感染性合併症例えば同種造血幹細胞移植（allo-ＨＳＣＴ）後ステロイド抵抗性移植片対宿主病（ＳＲ－ａＧｖＨＤ）、クロストリジウム（Clostridium）、エンテロコッキ（Enterococci）などの、例えばバンコマイシン耐性腸球菌(ＶＲＥ)及びグリコペプチド耐性腸球菌(ＧＲＥ)、広域スペクトルβ-ラクタマーゼ(ＥＳＢＬ)産生細菌、カルバペネマーゼ産生腸内細菌(ＣＰＥ)、高抗生物質耐性細菌（Emerging Bacteria Highly Resistant to Antibiotics、BHRe)を含む多剤耐性細菌による保菌又は感染、及び/又は悪性血液疾患、及びこれらの組み合わせの予防及び/又は治療における使用のための、該増殖させた複合群集又は医薬製剤と、任意選択で、薬物ベースの療法、免疫療法、免疫チェックポイント阻害剤、腫瘍ネオ抗原を標的とする療法、化学治療及び／又は放射線治療との組み合わせ。
20. 任意選択で、薬物ベースの療法、免疫療法、免疫チェックポイント阻害剤、腫瘍ネオ抗原を標的とする療法、化学療法及び／又は放射線療法と組み合わせてマイクロバイオーム生態系療法において使用するための、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法によって得られる増殖させた微生物の複合群集、請求項１５若しくは１６に記載の増殖させた微生物の複合群集、又は請求項１７に記載の医薬製剤。