JPH05507193A - タンパク質パートナースクリーニング検定法およびその使用 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 タンパク質パートナースクリーニング検定法およびその使用発明の分野 本発明は分子生物学の分野に属し、他のペプチドと結合してヘテロニ量複合体を 形成し得るペプチドを同定する方法に関する。また本発明は、このようなヘテロ ニ量複合体形成の阻害剤を同定する方法に関する。

多くの型の癌の誘発は、究極的には細胞性腫瘍遺伝子の活性化によって起こると 考えられている（Ｂｉｓｈｏｐ、　Ｊ、　ｉｆ、　、　５ｃｆｅｎｃｅ　２３５ ：３０５−３１０（１９８７）　；　Ｂａｒｂａｃｉｄ、@Ｍ、　、Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、　Ｂｆｏｃｈｅｔ　５６　：　７７９−８２７（１９８７）　：　Ｃｏ １ｅ、　Ｍ、　Ｄ、　、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　ＧｅｎｅｔA　２０：　３６１ −３８４（１９８６）　；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、　Ｒ，Ａ、　、　５ｃｉｅｎｃｅ 　２３０　ニア７Ｏ−７７６（１９８５））。このような腫瘍遺伝子は、その細 胞内にあって、しばしば核、細胞質または細胞膜など特定の部位に局在化してい る腫瘍タンパク質を発現する。

例えば、細胞性ｃ−ｍｙｃ腫瘍遺伝子はｃ−ｍｙｃタンパク質をコード化してい る。種々の細胞型におけるｃ−ｍｙｃｑ）大量発現は、細胞を培養中で無限に成 長させる（Ｂｉｓｈｏｐ。

Ｊ、　Ｍ、　、Ｃｅ１１４２：２３−３８（１９８５）　；　Ｗｅｉｎｂｅｒｇ 、　Ｒ，＾、　、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３０　ニア７Ｏ−７V６（１９８５）の 総説 がある）。ｃ−ｍｙｃ発現はヒトの癌全体の少なくとも１０％に要因として関連 づけられている。

さらに、正常なラット線維芽細胞におけるｃ−ｍｙｃの過剰発現は、活性化され たｒａｓ腫瘍遺伝子産物の発現と共に、その線維芽細胞の形質を転換し、それら に生存動物中で腫瘍を形成する能力を与える（Ｌａｎｄ、　Ｈ，ら、　Ｎａｔｕ ｒｅ　３０４：５９６−６０１（１９８３）　：　Ｒｕ１ｅｙ、　Ｈ，Ｅ、　、 　Ｎａｔｕｒｅ　３０４　：６０２−６０６（１９８３））。

ｍｙｃタンパク質の機能は、転写調節、ＲＮＡプロセシング、および複製におけ る考え得る役割を示唆する証拠にもかかられず、未知のままである。ｍｙｃは、 実際にはＮ−ｍｙｃ（ＤｅＰｉｎｈｏ、　Ｒ，Ａ、ら、　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、 　１　：１３１１−１３２６（１９８７））、１．−ｏ＋ｙｃiＤｅＰｉｎｈｏ 、　Ｒ。

＾、ら、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、　１：１３１１−１３２６（１９８７））および ｃｌｙｅ（Ｂａｔｔｅｔら、Ｃｅ１１３４ニア７９−７８７i１９ ８３））と呼ばれる複数の型を包含するタンパク質ファミリーである。

Ｃ１ｙＣが成長制御および分化に関与することは明らかである（＾Ｉｔ、　Ｆ、 　Ｗ、ら、　ＣｏｌｄＳｐｒｆｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　５ｙｓｐ、　Ｑｕａｎｔ、 　Ｂｉｏｌ、　５１　：９３１−９４１（ｆ９８６）　；　Ｋｅｌｌｙ、　Ｌら 、@Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｌ關ｕ ｎｏ１．４：３２７−３２８（１９８６））。最近の研究により、ｃ−ｍｙｃな どの腫瘍タンパク質カ特定の標的遺伝子のプロモーター活性を調節し、したがっ てそれらの標的遺伝子の転写を活性化または抑制することによって、遺伝子発現 を変化させ、細胞を不死化すルコとが示唆されティる（例えば、Ｖａｒｇ＋ｕｓ 、　Ｈ，Ｅ、　、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３８　：　１３３７−１３３９（１９ｇ ？）；　Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、　Ｒ，Ｅ、ら、　Ｃｅ１ｌ　４１：３−５（１９８ ５）　；　Ｂ１５ｈｏｐ、　Ｊ、　Ｍ、　、　Ｃｅ１ｌ　４２：Q３−３８（１ ９８５）　；　Ｗｅ ｉｎｂｅｒｇ、　Ｒ，Ａ、　、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３０ニア７Ｏ−７７６（１ ９８５）を参照のこと）。

Ｉｌ、調節タンパク質 多（の調節タンパク質はへテロニ量体である。即ち、それらは相互作用して天然 型タンパク質を形成する２つの異なるペプチド鎖から構成されている。このよう な調節タンパク質の１種に、特定のＤＮＡ配列に結合し、その結果ＤＮＡのＲＮ Ａへの転写を調節し得るＤＮＡ結合タンパク質がある。これらのタンパク質がこ のような結合特異性を発揮するためには、このようなタンパク質の二量体が必要 である。数多くの転写調節タンパク質が同定されている：　１ｌｙｃＳＦｏｓ、 　ＪｕｎＳＥｂｐ。

Ｆｒａ−１、Ｊｕｎ−Ｂ、　Ｓｐｌ、■２ＴＦ−１／ＮＦ−ｐｃ　Ｂ一様タンパ ク質、ＰＲＤＩ、　ＴＤＦ、　ＧＬＩ、　Ｅｖｉ−１、糖質コルチコイド受容体 、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、甲状腺ホルモン受容体（ｃ−ｅ ｒｂＡ）およびＺＩＦ／２６ｇ、０↑Ｆ−１（ＯＣＴＩ）、０ＴＦ−２（ＯＣＴ ２）およびＰＩＴ−１；酵母タンパク質ＧＣＮ４、Ｇ’ＡＬ４、■ＡＰＩ、＾Ｄ Ｉ？１．５ｆＩ５、ＡＲＧＲＩＩおよびＬＡＣ９、交配型因子ＭＡＴα１、ＭＡ Ｔａ２およびＭＡＴａｌ　；ニューロスポラ属タンパク質ｃｙｓ−３およびおそ らくｃｐｃ−１：ならびにショウジヨウバエ属タンパク質ｂｓｇ　２５Ｄ、アン テナベディア（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）、ウルトラピッラックス（ｕｌｔｒ ａｂｆｔｈｏｒａｘ）、ベアード（ｐａｉｒｅｄ）、フシタラズ（ｆｕｓｈｉ　 ｔａｒａｚｕ）、カット（ｃｕｔ）、エングレイルド（ｅｎｇｒａｉｌｅｄ）、 および毛状翼の抑制遺伝子、クルッペル（ｋｒｕｐｐｅｌ）、スネイル（ｓｎａ ｉｌ）、バンクバック（ｈｕｎｃｈｂａｃｋ）、セレンジピティ（ｓｅｒｅｎｄ ｉｐｆｔｙ）。真核生物の転写調節タンパク質ならびにそのようなタンパク質を 特徴づけるために用いられる方法に関する総説が最近刊行されている（Ｊｏｈｎ ｓｏｎ、　Ｐ、　Ｆ、ら、Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈ、　５８ニア９９ −８３９（１９８９））。

哺乳動物の転写制御タンパク質ファミリーＪｕｎ／Ｆｏｓおよび＾ＴＦ／ＣＲＥ Ｂの構成要素は二量体としてＤＮＡに結合するだけである。これらのファミリー に属するタンパク質は、塩基性アミノ酸が豊富な領域と、それに続く、互いに６ アミノ酸で隔てられた４〜５個のロイシン残基を含有する約３５アミノ酸（“ロ イシンジッパ−“領域）とを含有する“ロイシンジッパ−”タンパク質である。

塩基性領域とロイシンジッパ−領域の組み合わせは集合的にｂＺＩＰドメインと 呼ばれている。

一般に、主としてＤＮＡとの接触に関与することがわかっているのが塩基性領域 であるのに対し、ジッパ−領域は二量体を媒介する。二量体としての組み合わせ は数多く考えられるが、ジッパ−の特定の性質がどの相手が許容されるかを指定 する（Ａｂｅｌ、　Ｔ、ら、　Ｎａｔｕｒｅ　３４１：２４−２５（１９８９） ）。

タンパク質のもう１つの大きいファミリーは、塩基性ヘリックス−ループーへリ ックス・モチーフ（ｂＨＬＨ）として知られているＤＮＡ結合／二量体モチーフ を含有する（Ｊｏｎｅｓ、Ｎ、、Ｃｅ１１６１：９−１１（１９９０））、　ｂ ＨＬＨタンパク質は一般に塩基性のＮ末端と、それに続く、３残基または４残基 ごとに疎水性残基を含有する２つの短い両親媒性ヘリックスであるヘリックス− ループ−へリックス構造を含有する。

塩基性領域の配列がその特質として両親媒性ヘリックスの存在を示すことはない 。

介在ループ領域は通常１以上のへリックス破壊残基を含有している。

ｂＨＬＨモチーフは、免疫グロブリンエンハンサ−中に認められる特定の“Ｅボ ックス“ＤＮＡエンハンサ−配列に結合する２つのタンパク質Ｅ１２およびＢ４ ７で最初に検出された（Ｍｕｒｒｅ　Ｃ，ら、Ｃｅ１ｌ　５６＋７７７−７８３ （１９８９））。Ｅモチーフは一般に５−ＣＡＧＧＴＧＧＣ−３”共通配列の二 本鎖変種である。例えば、μＥ１モチーフはＧＴＣＡ、ＡＧＡＴＧＧＣであり、 μＥ２モチーフはＡＧＣＡＧＣＴＧＧＣであり、μＥ３はＧＴＣＡＴＧＴＧＧＣ であり、μＥはＴＧＣＡＧＧＴＧＴである（ｉｌｕｒｒｅ、　Ｃ，ら、Ｃｅ１ｌ 　５６：７７７−７８３（１９８９））。多くの転写因子と同様に、ｂ　ＨＬ　 Ｈモチーフを含有するペプチドは、２つの同一ペプチドを含有するホモニ量体と して、あるいは２つの異なるペプチドを含有するヘテロニ量体として、しばしば 互いに二量体する。２つのｂＨＬＨタンパク質からなるヘテロニ量複合体であっ て、そのヘテロニ量体中のそれぞれのペプチドからなるホモニ量複合体より高い 効率でＤＮＡを結合するヘテロニ量複合体の例が知られている（Ｍｕｒｒｅ、　 Ｃ，ら、Ｃｅ１ｌ　５６：７７７−７８３（１９８９）　；　Ｍｕｒｒｅ、　Ｃ ，ら、Ｃｅ１ｌ　５８：５３７−５４４（１９８９））。

ｌｙｃはｂＨＩ、Ｈタンパク質の一種であり、ｃ−ｌｙｃのｂＨＬＨドメインは ｃ−ｍｙｃアミノ酸２５５〜４１０にコード化されている。３つのｍｙｃ遺伝子 （ヒトＮ−ｍｙｃ３９３〜４３７、ヒトｃ−ｍｙｃ３４６〜４０１、およびヒト Ｌ−ｍｙｃ２８９〜３３８）およびｂＨＬＨドメインを含有する他の遺伝子によ りて発現されるタンパク質問の配列相同性が比較されティる（Ｍｕｒｒｅ、　Ｃ ，ら、Ｃｅ１ｌ　５６：７７７−７８３（１９８９））。

二量体し得るパートナ−タンパク質が存在しない場合、鳳ｙｃの２つの鎖からな るホモニ量体はμＥ２ＤＮＡに結合しない。したがって、■ｙｃＤＮＡ結合を指 示するパートナ−１およびそのようなｍｙｃパートナ−相互作用を阻害すること によって■ｙｃ活性を阻害する化合物を同定することが望まれる。ｂＨＬＨモチ ーフを含有するｍｙｃなどのタンパク質は他のｂＨＬＨモチーフタンパク質との 二量体能力をも有するので、ｍｙｃパートナ−もｂＨＬＨモチーフを含有する可 能性が極めて高い。このような相互作用を阻害することによって、ｓｙｃが誘発 する細胞成長の阻害および／または制御を達成し得る。■ｙｃパートナー形成の 阻害剤を投与することは、ｍｙｃの発現および活性が細胞の成長を促進する要因 もしくは細胞の形質転換状態を維持する要因である疾患の治嫌において、医療上 の利益を与えるであろう。

しかし現在までのところ、ｗｙｃ阻害剤は同定されていない。このような阻害剤 の同定は、潜在的阻害剤およびその活性誘導体を迅速に同定し得る簡単で安価で 信頼性の高いスクリーニング検定法が無いことから困難であった。したがって、 腫瘍遺伝子活性の特異的阻害剤を同定する迅速で経済的なスクリーニング検定法 が現在も必要とされている。

発明の要約 腫瘍タンパク質の阻害剤が多くの形態の癌の治療において潜在的に重要であるこ と、ならびにそのような阻害剤を同定し得る簡便な検定系が存在しないことを鑑 み、本発明者らは、モデル系としての原核宿主中で腫瘍遺伝子の発現を変化させ る物質を同定するインビトロ検定法におけるキメラ腫瘍遺伝子構築物の使用を研 究した。

これらの努力により本発明者らは、一般的にタンパク質パートナ−を同定するた めに使用でき、また具体的には転写調節タンパク質のパートナ−を同定するため に使用できる筒便で安価な検定法を開発するに至った。

本発明の方法は、転写調節タンパク質、特に腫瘍タンパク質活性に影響を与える パートナ−の同定にとりわけ有用である。

さらに本発明の方法は、このようなパートナ−形成の阻害剤、とりわけ腫瘍タン パク質活性の阻害剤を同定し、単離し、特徴づける方法をも提供する。

さらに本発明は、ヒトの医薬品を含む化合物を腫瘍遺伝子活性の阻害剤として客 観的に分類するための迅速で信頼性が高く正確な方法をも提供する。

さらに本発明の方法は、ｃｌ　ＤＮＡ結合ドメインおよびパートナ−Ｂ三員化ド メインを含有する融合タンパク質を発現する細菌宿主においてλｃＩが誘発する 溶菌的成長の抑制を破壊するタンパク質パートナ−の能力によってタンパク質パ ートナ−を同定する方法をも提供する。このように同定されたパートナ−は既に クローン化された形態にあり、さらなる特徴づけが容易である。

図面の簡単な説明 図１は、ヒトｃ−ｍｙｃエクソン３の配列ならびにＣ−ＪＩＣのＨＬＨ／ＬＺお よびＨＬＨ断片を合成するために用いた部位を表す。

好ましい態様の説明 以下の記述では、組換えＤＮＡ技術において用いられるいくつかの用語を多用す る。本明細書の理解をより明確にし、より首尾一貫したものとするために、この ような用語が包含すべき範囲を含めて、以下に定義づけを行う。

機能的に連結された　本明細書で用いる場合、２つの巨大分子要素が、第１の要 素の活性に影響を与える因子が第１の要素をして第２の要素に対する影響を誘発 させるような物理的配置にあるとき、これら２つの巨大分子要素が機能的に連結 されているという。

融合タンパク質　本明細書で用いる場合、”融合タンパク質”とは、２つの異な るタンパク質由来のドメインを含有するように構築された雑種タンパク質をいう 。

用語“融合タンパク質遺伝子”は、融合タンパク質をコード化するＤＮＡ配列に 言及することを意味し、適切な場合には、その転写および翻訳調節要素を含む。

東！　融合タンパク質の“変種”とは、天然に存在するドメイン（即ち天然型の アミノ酸配列を含有するドメイン）から構築された融合タンパク質のアミノ酸配 列と本質的に類似しているが、同一ではないアミノ酸配列を含有するタンパク質 をいう。

“本質的に類似している°アミノ酸配列とは、融合タンパク質中に認められるア ミノ酸配列と高度に相同であるが、同一ではないアミノ酸配列を意味する。高度 に相同なアミノ酸配列には８０％以上の相同性を有する配列が含まれ、特にその 相同性が重要なドメイン中に濃縮されている場合には、より低い相同性を有する 配列も含まれ得る。

機能的誘導体　融合タンパク質の“機能的誘導体”とは、パートナ−タンパク質 との三量化能力および／または望ましいＤＮＡ標的に結合する能力を有するタン パク質であって、その能力が本発明の融合タンパク質構築物の三量化能力と本質 的に類似しているタンパク質をいう。“本質的に類似している”という表現は、 上述の生物学的活性が本発明の融合タンパク質と定性的に類似しているが、定量 的には異なることを意味する。例えば、融合タンパク質の機能的誘導体は融合タ ンパク質と同じ標的を認識し得るか、あるいは同じパートナ−タンパク質とへテ ロ二量体を形成し得るが、同じ親和性を有さない。

例えば本明細書で用いる場合、あるペプチドが融合タンパク質のアミノ酸骨格と 、通常は融合タンパク質の一部でない追加の化学的部分を含有する場合、そのペ プチドを“機能的誘導体″であるという。このような部分はその誘導体の溶解度 、吸収、生物学的半減期などを改善し得る。あるいは、これらの部分がその誘導 体の毒性を減少させたり、その誘導体の望ましくない副作用などを排除もしくは 緩和するものであり得る。このような効果を媒介し得る部分は、Ｒｅｍｉｎｇｔ ｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）に 開示されている。このような部分を分子に結合させる方法は当該技術分野でよく 知られている０融合タンパク質の機能的誘導体は、共有結合した炭水化物などの 翻訳後修飾を、本発明の方法を実行するうえでのそのような修飾の必要性に応じ て、含有してもよいし、含有しなくてもよい。

用語“機能的誘導体”は、ある分子の機能的な“断片”、゛変種“、“類縁体“ 、あるいは“化学的誘導体”を包含すると見なされる。

プロモーター　“プロモーター”とは、転写される配列の５′末端での転写開始 位置の近傍に位置するＤＮＡ配列であって、この部分でＲＮＡポリメラーゼが結 合するか、もしくは転写を開始する。プロモーターは、機能的に連結された遺伝 子の転写を変動させる際に相互に作用する複数の調節要素を含有し得る。

発現　発現とは、遺伝子内にコード化されている情報が転写され、タンノくり質 に翻訳される過程をいう。

ＤＮＡや遺伝子などの核酸分子が、あるポリペプチドをコード化する配列と、そ のＤＮＡに含有される遺伝情報を適当な宿主環境中で転写し、加工し、タンｌ＜ り質屋物に翻訳する発現制御配列とを含有し、そのような発現制御配列がそのポ リペプチドをコード化するヌクレオチド配列に対して機能的に連結されている場 合に、その核酸分子がそのポリペプチドを“発現し得る”という。

クローニング媒体　“クローニング媒体”とは、クローニングのために宿主に核 酸配列を提供し得るあらゆる分子体をいう。クローニング媒体の例にはプラスミ ドやファージゲノムが含まれる。宿主細胞中で自律的に複製できるプラスミドが 特に望ましい。あるいは、宿主細胞の染色体ＤＮＡ中に挿入し得る核酸分子も特 に有用である。

クローニング媒体はしばしば１または少数のエンドヌクレアーゼ認識部位によっ て特徴づけられ、そのエンドヌクレアーゼ認識部位でそのようなりＮＡ配列を媒 体の基本的な生物学的機能を失うことなく限定的に切断することができ、またＤ ＮＡの複製およびクローニングを達成するためにそのエンドヌクレアーゼ認識部 位中にＤＮＡを挿入することができる。

クローニング媒体はさらに、そのクローニング媒体で形質転換された細胞を同定 する際に利用するに適した標識を含有し得る。標識は、例えばテトラサイクリン 耐性やアンピシリン耐性である。用語“ベクター”を“クローニング媒体”のか わりに使用することもある。

発現媒体　“発現媒体“とは、クローニング媒体と類似の媒体もしくはベクター であるが、特に宿主中に導入された後、クローン化された遺伝子を発現し得る配 列を提供すべく設計された媒体をいう。

発現媒体では、クローン化されるべき遺伝子がプロモーター配列などのいくつか の制御配列に対して機能的に連結されている。発現制御配列は、そのベクターが 機能的に連結された遺伝子を原核宿主中で発現するよう設計されるか、あるいは 真核宿主中で発現するよう設計されるかに依存して変化するであろう。また発現 制御配列は、上流アクチベーター領域、エンハンサ−要素、終止配列、組織特異 的要素、オペレーター要素などの宿主特異的要素転写要素、および／または翻訳 開始および終止部位を追加して含有し得る。

し記述するために使用し得るあらゆるパラメーターの変化を言及するものとする 。

応答は物理的変化（例えば表現型の変化）として表され得るし、あるいは分子変 化（例えば反応速度あるいは親和性定数の変化）としても表され得る。応答の検 出はあらゆる適当な手段を用いて行われ得る。

化合物　用語“化合物”は、固相にあるか、液相にあるか、あるいは気相にある かにかかられらず、化学物質に言及するものとする。この用語は、合成化合物、 天然産物およびポリペプチド、ポリヌクレオチドあるいは脂質などの巨大分子物 質、ならびに神経伝達物質、配位子、ホルモンあるいは元素化合物などの小物質 を包含すると見なされるべきである。

ヘテロニ量体タンパク質は、例えば水素結合、イオン相互作用、疎水相互作用、 ジスルフィド結合などによって互いに結合するが、アミノ酸結合によって互いを 結合するのではない２つの真なるポリペプチド鎖を含有するタンパク質である。

本明細書では、ヘテロニ量体タンパク質の２つのポリペプチド鎖を互いの“パー トナ−”と呼ぶ。ヘテロニ量体転写調節タンパク質が、二量体が起こるために必 要な独立したドメインを保持することがわかった。ＤＮＡ結合が起こるためには 第２の独立したドメインが必要である。

り質のパートナ−の同定を可能にした。このようなタンパク質パートナ−は、自 分自身の二量体ドメインを保持するが宿主細胞（好ましくは大腸菌などの細菌宿 主細胞）に表現型発現を付与し得るＤＮＡ結合ドメインを含有するキメラペプチ ドの構築によって同定され得る。このような表現型を監視することによって、ヘ テロニ量体の形成および活性を監視することができる。最も好ましいキメラペプ チドは、推定上のへテロニ量体タンパク質パートナ−の二量体ドメインおよびバ クテリオファージ抑制因子（例えばバクテリオファージ・ラムダ（λ）抑制因子 ）のＤＮＡ結合ドメインを含有する。

バクテリオファージλは細菌宿主に感染する能力を有し、（ａ）感染性、溶菌性 の様式で複製し成長する（溶菌サイクル）か、あるいは（ｂ）非感染性、溶原性 の様式で宿主の染色体中に組み込まれる（溶原化サイクル）。細菌の染色体の一 部として組込まれた場合、挿入ファージＤＮＡをプロファージと呼ぶ。プロファ ージを保持するがゆえに、溶原菌は同じ型の別のファージ粒子による重感染に対 して免疫を有する。バクテリオファージλはラムドイド（ｌａｍｂｄｏｉｄ）バ クテリオファージ（４３４，２１、およびφ８０など）のファミリーの構成要素 である。これらはすべて本発明の目的にとってはλと等価である。

λが感染細菌において溶菌型で成長する場合、その細菌は最終的に溶菌される。

この溶菌によって、細菌培養の存在に伴う濁りゃ不透明な外観が透明になる。溶 菌サイクルで細菌細胞を溶解するファージの成長および複製活性は、その細菌溶 解能力を調べることによって、したがって、寒天上に生育した細菌培養中にプラ ーク（細菌が溶解されている透明な領域）を形成する能力を調べることによって 、検定することができる（ゴｈｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｌａｔａｂｄ ａ”、　Ｈｅｒｓｈｅｙ、　Ａ、　Ｄ、　１１７１．　Ｃｏ１п@Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９７１） 　；　”Ｌａｍｂｄａ　ＩＩ″、Ｈｅｎｄｒｉｘ、　Ｒ，？Aら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９ ８３）；　１ｌａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、ら、′麗ｏ１ｅｃｕｌ≠秩@Ｃｌｏｎｉｎ ｇ（＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１ｌａｎｕａｌ）”、第２版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　xｏｒｋ（１９ ８８））。

λｃｌ遺伝子は、溶原性を維持するために必要なリプレッサー（抑制因子）タン パク質ｃｌをコード化している。ｃＩはその天然型の状態ではホモニ量体（２つ の同−鎖からなる二量体）であり、このリプレッサーがλＤＮＡに強固に結合す るためにはこの二量体状態が必要である。ｃｌは、溶菌的成長に寄与する遺伝子 の発現に必要な産物をコード化する隣接遺伝子の転写を制御する２つのオペレー ターに結合する。これらのオペレーターに結合することによって、ｃＩリプレッ サーは自分以外のすべてのλ遺伝子の転写を防止する。ｃｌ遺伝子の完全なアミ ノ酸配列およびヌクレオチド配列がわかっている（“Ｌａｍｂｄａ　ＩＩ”、　 ｔｌｅｎｄｒｉｘ、　Ｒ，１，ら編。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ（１９８３））。

本発明の構築物として、ｃｌのＤＮＡ結合ドメイン（λｃＩのＮ末端の１１２ア ミノ酸）および推定上のへテロニ量体タンパク質パートナ−の二量体ドメインを 含有する融合タンパク質を作製する。極めて好ましい態様として、ｃ−ｓｙｃの 二量体ドメイン、即ちｂＨＬＨＨ域を使用する（ｃ−＋ｅｙｃのアミノ酸２５５ 〜４１０）。

所望により、他の二量体ドメインも使用できる。

二量体ドメインは、アミノ酸配列と当該技術分野で一般に知られているコンピュ ーター分析技術（例えばチョウ・フアメマン・アルゴリズム）を用いてそのタン パク質の３次元構造を分析することによって予言することができる。このような 技術によって、そのペプチド構造中のらせん状ドメインや他の重要な領域（例え ば疎水性ドメインまたは親水性ドメイン）の同定が可能になる。

あるタンパク質のＩ（ＬＨ二態量化ドメイン、アミノ酸配列を既に知られている １０種のＨＬＨ二量化量化ドメインミノ酸配列（Ｅ１２のアミノ酸３３６〜３９ ３、Ｅ４７のアミノ酸３３６〜３９３、ドーターレス（ｄａｕｇｈ　ｔｅｒｌｅ ｓｓ）のアミノ酸５５４〜６１３、ツイスト（ｔｗｉｓｔ）のアミノ酸３５７〜 ４０７、ヒトＮ−ａｙｅのアミノ酸３９３〜４３７、ヒトＬ−ｔａｙｃの２８９ 〜３３８、ヒトｃ−ｍｙｃのアミノ酸３４６〜４０１、ＭｙａＤのアミノ酸１０ ８〜１６４、アカエテースクート（ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅ）遺伝子座の遺 伝子群：Ｔ４のアミノ酸１０１〜１６７、Ｔ５のアミノ酸２６〜９５　（Ｍｕｒ ｒｅ、　Ｃ，ら、Ｃｅ１ｌ　５６：７７７−７８３（１９８８９））と比較する ことによッテ明らかにすることができる。ＨＬＨ二量化量化ドメイン介在ループ によって隔てられた２つの両親媒性ヘリックスを含有している。最初のへワック スは１２アミノ酸を含有し、第２のへワックスは１３アミノ酸を含有する。ＨＬ Ｈ形式中にはいくつかのアミノ酸、特にヘリックス中に存在する疎水性残基、が 保存されているようである。

上に挙げた２配列を比較すると、相同領域の５°末端内に５つの基本的に同一な 親水性残基が存在し、また一般にプロリンまたは集団状グリシンを含有する配列 によって互いに隔てられた２つの短いセグメント中に存在する主として疎水性の 残基の一部が存在することがわかる。

ロイシンジッパ−ドメインは通常約３５アミノ酸長であり、ヘリックス内イオン 対形成に適した様式で近接する極めて高密度の反対に荷電したアミノ酸（酸性残 基および塩基性残基）およびロイシンからなる反復する７つぞろいの配列を含有 する。１つのポリペプチドのへワックスから突き出したロイシンが第２のペプチ ド（パートナ−）の類似のへワックスのロイシンと交互嵌合し、ロイシンジッパ −と呼ばれる連結を形成するものと考えられる。

本発明の融合タンバグ質は、細菌宿主中で融合タンパク質を発現し得る組換えＤ ＮＡ分子として構築される。このような融合タンバグ質を発現し得る組換えλ構 築物による大腸菌宿主の形質転換は、その融合タンパク質（特にそのｃｌドメイ ン）の適当なλＤＮＡオペレーターに結合し得るホモニ量体型としての二量体ゆ えに、その細菌宿主の免疫をもたらす。したがって、形質転換および融合タンパ ク質発現の後はλ溶菌成長もしくはλによる以降の感染が防止される。

好ましくは、細菌宿主を大過剰の融合タンパク質で圧倒しないように、融合遺伝 子の転写には低コピー数プラスミドを弱いプロモーター（例えばβ−ラクタマー ゼプロモーターおよびラクトースオペレーター）と共に使用する。もし大過剰の 融合タンパク質が合成されれば、融合タンパク質へテロニ量体（後述）に対する 融合タンパク質ホモニ量体の比率が高過ぎるために、ホモニ量体がファージ成長 を高効率で抑制し、ヘテロニ量体の検出を阻害することになるであろう。

融合タンパク質とへテロニ量体を形成し得る結合ドメインを有するタンパク質は いずれも、融合タンパク質ホモ二量体の形成を損なうか、あるいは防止するであ ろう。したがって、融合タンパク質が媒介するファージ成長の抑制を妨害するそ の能力によってこのようなタンパク質を同定することができる。

−態様として、上述の融合タンパク質を発現している細菌宿主を、クローン化真 核遺伝子を発現するλ発現ライブラリーで形質転換する。例えば、ｍＲＮＡから 発現ライブラリーを作成するためのλｇｔｌｌバッキング系は本発明の方法に有 用であり、当該技術分野で知られており一市販品もある（例えばＰｒｏｍｅｇａ 　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）。さら に、特注のゲノム発現ライブラリーも市販されている。

市販のキットを利用することによって、あらゆる望ましい哺乳動物源から得た細 胞質ポリ（Ａ）含有ｍＲＮＡを用いてオリゴ（ｄＴ）プライマーｃＤＮＡライブ ラリーをλｇｔｌｌ中に作成することができる。その中に含まれるクローン化タ ンパク質の発現を誘導するために１．０ｍ１ｔ　Ｉ　ＰＴＧ（イソプロピル−チ オガラクトシド）を加えることができる。

重要なことは、宿主細胞はすべて融合タンパク質λリプレッサーを生産するので 、感染性λ発現ライブラリーの溶菌的増殖が抑制されるであろうということであ る。融合タンパク質の二量体ドメインに結合し得る二量体ドメインを有するタン パク質を発現しないλ発現ライブラリーの感染性要素は、融合タンパク質ホモ二 量体が媒介するファージ抑制を損なわないであろう。したがって、λファージの 溶菌的成長は認められないであろう。（例えば融合ペプチドのｂＨＬＨドメイン などとへテロニ量体を形成することによって）融合タンパク質のホモニ量化を妨 害し得るタンパク質を発現するλ発現ライブラリーの要素がもしあれば、リプレ ッサー機能が失われ、λ溶菌成長が起こるであろう。したがりて、プラークを形 成するファージについてスクリーニングすることによって、ヘテロニ量体を形成 するパートナ−を容易に同定することができる。

本発明の方法は、別のタンパク質とパートナ−（特にヘテロニ量体）を形成する あらゆるタンパク質についてのパートナ−の同定にも一般に適用できる。タンパ ク質パートナ−の同定に関する本発明の方法の利点は、同定されるパートナ−が ホモニ量体の親和性よりも高い融合タンパク質との親和性を有するパートナ−で あること、そしてそれゆえに、同定されるそのパートナ−がそのタンパク質の生 物学的活性の重要な調節因子である可能性が極めて高いタンパク質であるという ことである。さらに、同定されるパートナ−は既に、当該技術分野で既知のタン パク質および分子生物学技術によってそのタンパク質を単離し、さらに特徴づけ る目的でそのタンパク質をより大量に得るために使用し得る、クローン化された 発現型である。

発現ライブラリー中のタンパク質パートナ−の同定は、化合物のプラーク形成阻 害能力についてスクリーニングすることによる、このようなパートナ−のへテロ 二量体形成能力を阻害する化合物の同定を可能にする。

例えば、上述のようにプラークの透明な外観または濁った外観によってパートナ −を同定し終たら、化合物のプラーク形成を阻害する能力についてスクリーニン グすることによって、そのタンパク質パートナ−のへテロニ量体形成を防止もし くは池の方法で妨害する化合物を同定することができる。この例でプラーク形成 を阻害することがわかった化合物は、（ａ）その融合タンパク質がやはりその宿 主中で発現されているパートナ−ペプチドと結合するのを防止する化合物であり 、かつ、（ｂ）ホモニ量体形成（即ち、融合タンパク質のｃｆドメインの二量体 ）を防止しない化合物であろう。このような化合物は、ホモニ量体中で二量体ド メインが相互作用することを防止するかも知れないし、防止しないかも知れず、 （Ｃ）このプラーク検定条件下で細胞の成長を阻害しない。

上記の方法で選択されるパートナ−が融合タンパク質の二量体の調節に特異的で あって、転写一般を阻害するのではないことを確かめるために、他のタンパク質 由来の二量体ドメインを用いて構築した融合タンパク質を発現する細菌宿主株を 、このようなパートナ−を発現するλに感染させ、そのパートナ−の、そのよう な宿主中での溶菌的成長を誘発する能力を調べる。例えば、ｂＨＬＨ二量化を阻 害するがｂＺ［’二量体を阻害しない化合物を同定することに興味がある場合、 上述にようにｃＩと、ｂｚｔｐタンパク質由来の適当な二量体形成ドメインとを 含有する融合タンパク質を構築する。

結合して二量体を形成するあらゆる型の転写調節タンパク質のパートナ−および そのようなパートナ−の結合を阻害する化合物を、本発明の細菌法で同定するこ とができる。

上述の技術を用いることによって、本発明者らは生体内でｃ−ｍｙｃと結合し、 ＤＮＡに対するｃ−ｓ＋ｙｃの結合を援助する特異的パートナータンパク質をも 発見した。

これらのパートナ−は、ｃ−ｅｙｅの結合要素であるＤＮＡμＥ２配列に対する ｃ−ｓｙｃの結合の程度と持続時間を増強する。これらのパートナ−タンパク質 の１つは４６０００ダルトンの分子量を有し、ｃ−ｍｙｃの非存在下で１ＩＥ２ 配列に結合する。

あるタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの同定は、当該技術分野で既に知られてお り、過去にそのようなドメインの同定に用いられた種々の技術によって行うこと ができる（そのようなドメインについてはＪｏｈｎｓｏｎ、　Ｐ、　Ｅ、ら、　 Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５８ニア９９−８３９（１９８９） を参照のこと）。

ＤＮＡ結合タンパク質およびそのようなタンパク質中のＤＮＡ結合ドメインは、 ＤＮＡに対するそれらの親和性によって同定され、精製される。例えば、タン、 （り質（通常、検出を容易にするために標識されたもの）をフィルター上に固定 化したＤＮＡと結合させるか、あるいはその逆、即ちＤＮＡ結合部位（通常、標 識されたもの）を予めタンパク質を固定化しておいたフィルターに結合させるこ とからなるフィルターハイブリッド形成実験で、ＤＮＡ結合を明らかにすること ができる。そのような結合の配列特異性および親和性は、ＤＮＡ保護検定および ゲル遅延検定によって明らかになる。このようなタンパク質の精製は、配列特異 的ＤＮＡアフィニティークロマトグラフィー技術（即ち、そのドメインが結合す るＤＮＡで誘導体化した樹脂を用いるカラムクロマトグラフィー）を用いて行う ことができる。ＤＮＡ結合タンパク質のタンパク加水分解減成を用いることによ って、ＤＮＡ結合能を保持するドメインを明らかにすることができる。

あるタンパク質中の二量体ドメインは既知の配列との相同性によって認識され、 上述のようにコンピューターによる構造分析を利用することによって、そのタン パク質のアミノ酸配列から予言できる。

結合ドメインおよび二量体ドメインを、どちらのドメインの機能も破壊しない様 式で融合タンパク質中に組込む。即ち、適切に二量体した場合、そのＤＮＡ結合 ドメインはそれが元来天然に結合するＤＮＡ要素を認識することができ、その二 量体ドメインはそのパートナ−との二量体能力を保持する。当業者は、対照検定 を行うことによって、融合タンパク質か適切な様式で機能することを明らかにす ることができるであろう。

本発明の融合タンパク質構築物をプラスミドとして染色体外で維持することがで き、また宿主細胞のゲノム中に挿入することもできる。

本発明の方法を用いることによって、化合物をその純粋な形態で、種々の濃度で 、また不純な形態でスクリーニングすることができる。本発明の方法は、粗抽出 物中のこのような阻害剤の存在を同定し、次いでそこからその阻害剤を精製する ためにも使用できる。また本発明の方法は、種々の調製物の効力を評価するため に、上述のように同定された阻害剤の安定性を評価する際にも有用である。

細菌宿主細胞膜を通過する透過性がより高いこのような化合物の類縁体を使用す ることもできる。例えば、ジブチリル誘導体はしばしば増大した透過性を示す。

また本性を、膜に局在化したタンパク質および／または細胞質に局在化したタン パク質を妨害する化合物およびパートナ−の同定にも、そのようなタンパク質が 融合タンパク質の二量体ドメインと結合し得る場合には、使用することができる 。

融合タンパク質および／または標的遺伝子のＤＮＡ配列を化学的に構築すること ができ、あるいは当該技術分野で知られている組換え手段によって構築すること もできる。化学的にＤＮＡを合成する方法は、当該技術分野でよく知られている （”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａ　Ｐｒａｃｔｉ ｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ”、　Ｉｌ、　Ｊ、　ＧａｌＬ編A　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓ ｓ。

Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、　Ｃ，、１０９４；　”５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａ ｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　ａｎｄ　qＮＡ″、　Ｓ、　 Ａ、　Ｈａ ｒａｎｇ編、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ 、　１９８７）。遺伝子コードは縮重しているので、ある特定のアミノ酸をコー ド化するＤＮＡ配列を構築するには１より多数のコドンを用いることができる（ Ｗａｔｓｏｎ、　Ｊ、　Ｄ、　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　 ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ”（第３版。

Ｗ、＾、　Ｂｅｎ　ｊａｍｉｎ、　Ｉｎｃ、　、　１ｌｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、　 ＣＡ、　１９７７）、　３５６−３５７頁）。

び翻訳シグナルが必要である。上述の方法によって得られるクローン化された融 合タンパク質（好ましくはその二本鎖型）を発現ベクター中の転写発現を制御す る配列に対して機能的に連結し、例えば形貧転換によつてそれを宿主細胞中に導 入することによって、本発明の方法で使用するための組換え融合タンパク質また はその機能的誘導体を生産することができる。

所望により、融合構築物の発現を変化させ得るように、融合タンパク質をコード 化する遺伝子の発現の抑制もしくは活性化を可能にする転写開始調節シグナルを 選択することができる。温度を変化させることによって発現を抑制したり、開始 させたりすることができる温度感受性の調節シグナルや、例えば中間代謝物また は生育培地に添加した基質による化学的調節を受ける調節シグナルが興味深い。

別法として、融合構築物を宿主細胞中で構成的に発現させることもできる。

タンパク質のその生物学的機能を保持する能力が妨害されない宿主中でタンパク 質を発現させる必要がある。原核調節シグナルを用いて細菌宿主中でタンパク質 の発現を達成することが好ましい。

発現ベクターは典型的には独立したＤＮＡ要素、例えば（ａ）そのベクターの自 律的な複製を可能にする複製起源、あるいは宿主の染色体中へのそのベクターの 安定な様式での挿入を促進する要素、および（ｂ）形質転換された細胞の表現型 選択を提供し得る特殊な遺伝子など、を含有する。本発明の方法に有用な多くの 適切な発現ベクター系が市販されている。

上記構築物を含有するベクターまたはＤＮＡ配列を発現のために準備したら、種 々の適当な手段のいずれか（例えば形質転換）によって、そのＤＮＡ構築物を適 当な宿主細胞中に導入する。ベクターの導入後、ベクター含有細胞の生育を選択 する選択培地中で受容細胞を生育させる。クローン化遺伝子配列の発現は融合タ ンパク質の生産をもたらす。

融合タンパク質ＤＮＡコード化配列および機能的に連結されたプロモーターを、 直線状分子か、あるいはより好ましくは自律的に複製できない閉環共有結合環状 分子であってもよい非複製ＤＮＡ（またはＲＮＡ）分子として受容宿主細胞中に 導入する場合、融合タンパク質の発現が導入された配列の一時的発現を介して起 こり得る。

融合タンパク質ＤＮＡを宿主染色体中に組込むベクター系もしくは形質転換系を 用いて、遺伝学的に安定な形質転換体を構築することができる。このような組込 みは細胞内で新規（デノポ）に起こり得るか、あるいは宿主染色体中に自分自身 を機能的に挿入するベクター（例えばバクテリオファージ、トランスポゾンある −いはＤＮＡ配列の染色体への組込みを促進する他のＤＮＡ要素）での形質転換 による援助を受け得る。

本発明の融合タンパク質ＤＮＡベクターで形質転換された細胞に、そのベクター を含有する宿主細胞の選択を可能にする１以上の標識をも導入することによって 、本発明の融合タンパク質ＤＮＡベクターで形質転換された細胞を選択する。

この標識は例えば殺生物剤耐性（例：抗生物質耐性など）を提供するものであっ てもよい。

形質転換された宿主細胞を当該技術分野で知られている手段に従って培養するこ とにより、最適な細胞成長を達成することができ、またクローン化融合タンパク 賀配列断片の最適な発現を達成することもできる。融合タンパク質の最適な発現 は、発現されているパートナ−タンパク質のモル数に対して同モル数より多い融 合タンパク質を与えない発現である。しかしこの量は、それがヘテロニ量体型状 態にあるパートナ−のｅＩリプレッサー活性を無効にする能力を妨害しないので あれば、変化してもよい。

本発明の方法によって同定されるｃ−ｍｙｃのパートナ−タンパク質を、真核発 現系でさらに特徴づけることが望ましい。このような特徴づけは、ｒｃ−ｍｙｃ スクリーニング検定法」と題する本発明者らの同時係属米国特許出願第０７／２ １０２５３号（本出願の原出願と同日（１９９０年４月１９日）に出願）に記述 されている方法に従って行うことができ、この文献は本明細書の一部を構成する 。

本発明を実行する際に使用する物質および方法を以下の実施例にさらに記述する 。本実施例は本発明のいかなる限定をも意図しない。

実施例 実施例Ｉ Ｃ１ｙＣ融合タンパク質の構築 これらの構築物中のプロモーター／オペレーター領域はすべて同一であり、β− ラクタマーゼプロモーター、ｌａｃオペレーター配列およびシャイン・ダルガノ （Ｓ、Ｄ、）配列からなる。この配列は以下の通りである。

とＬ工虹ＡＧＧｗロ！ｉ鵠ＡＴＧ、　、　−ＣｈｘＳ、Ｄ、Ｘｈｏｌ　＋１　ｄ これらの各構築物中のｃｌは、ｒｅｃ　Ａ切断によって生成するＮ末端ポリペプ チドに対応する最初の３３０ｂｐ（１１２１アミノ酸）からなる。これを５゛お よび３゛末端にそれぞれＸｈｏｌおよびＸｂａ１部位を有するポリメラーゼ連鎖 反応（ＰＣＲ）プライマーを用いて合成した。上記プロモーター／オペレーター およびｃＩ　ＤＮＡを、ＢａｍＨＩおよびＸｂａｌで消化したｐＵｃ１８中にク ローン化した。

Ｘｂａ１部位周辺の配列は以下の通りである。

ｃｌフード化配７１１ ｃｍｍｙｃの）（ＬＨ断片およびＨＬＨ／ＬＺ（ヘリツタスールーブーへリツク ス／ロインンジッパー）を、ヒトｃ−ｒｔｒｙｃ　ｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ によって作成した。

ＨＬＨ／ＬＺは、５°および３゛にそれぞれＸｂａｌおよび５ｃｌ１部位を有し 、部位る。ＨＬＨは５゛および３°末端にそれぞれＸｂａｌおよびＰｓｔ１部位 を有する１７８ｂｐ断片であり、ＨＬＨの境界は＃２および＃１０で記した部位 である。部位＃１０で使用したプライマーは、部位＃９で使用したプライマーと 同様に、終止コドンを含む。このＣ−ｍｙｃ配列のＩ）Ｕ３３ｃｌへの挿入部位 を、上記ＰＣＲプライマー上の制限部位に対応する制限部位とした。

ｐＵｃ１８中の各構築物をｐＹＣ１７７中に以下のようにサブクローン化した。

ｐＹｃ１７７をＢｇｌｌ（クレノーで補充した）およびＢ朋Ｈ１で消化し、ｐＵ Ｃ１８ベースの構築物のそれぞれをＨｉｎｄＩＩＩ（クレノーで補充した）およ びＢａｍＨＩで消化した。得られたｐＹＣ構築物はカナマイシン耐性を与える。

実施例２ ｃｍＭｙｃのヘリックス−ルーブーへリックストメインと相互作用し得るタンパ ク質パートナ−についてのｃＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニングヒトｃ− １１ｙｃのヘリックス−ルーブーへリックス（ＨＬＨ）と相互作用できるタンパ ク質についてスクリーニングするために、ｃ−Ｍｙｃペプチドの塩基性領域およ びＨＬＨを含有するｃ−１１ｙｃのアミノ酸２５５〜４１０をコード化している ＤＮＡを、上述のように、λリプレッサー（ｃＩ）タンパク質のＮ末端の１１２ アミノ酸をコード化するＤＮＡ断片に枠を合わせて連結した。このキメラタンパ ク質の発現を極めて弱いβ−ラクタマーゼプロモーターおよびラクトースオペレ ーターの制御下に置いた。この発現単位を、カナマイシン１遺伝子を有する低コ ピー数プラスミド（１０〜１５コピー／細胞）であるｐＡＣＹＣ１７７中にサブ クローン化した。

この構築物で形質転換された細胞は、ドツトプラーク検定によってλフアージ感 染に対して耐性であることがわかった。ｃｌのＮ末端領域のみを発現する細胞が ＜　ｌ　Ｑ　２ｐｆｕで感染したのに対し、上記の構築物ｐＹｃ１９２ｃＩＨＬ Ｈは細胞を〉１０”ｐｆｕによるファージ感染に対して耐性にした。

ｐＹＣ１９２ｃｌＨＬＨで形質転換した大腸菌Ｙ１０９０株を用いて、製造者の 推奨（Ｐｒｏ■ｅｇａ）するところに従って構築したヒト扁桃／Ｂ細胞λｇｔ１ １発現ライブラリーをスクリーニングした。５　ｘ　１０’ｐｆｕを上記の形質 転換株ならびにＹ１０９０：：λ溶原菌株上で全く同一にスクリーニングした。

各試験プレート上には８００プラークが生じ、対照プレートにはプラークがなか った。プラーク精製を一回行い、単一プラークを採取して懸濁培地（ＳＭ）中に 懸濁した。１６０の精製プラークをプラークサイズに従って小２０、中７０、大 ７０に分類した。（“小”群の４つはプラーク精製段階でプラークを形成しなか った。次いでこれらのそれぞれを、ＧＣＮ４のロイシンジッパ−ドメインに融合 したｃｌのＮ末端からなるキメラタンパク質を発現するプラスミドｐＪＨ３７０ で形質転換した大腸菌ＪＭ１０９株上でドツトプラーク検定法によってスクリー ニングした。各ファージを、−次スクリーニングで用いた上述の株ならびにλ溶 原性株および親Ｙ１０９０株でも再試験した。

親Ｙ１０９０株およびｃ　ｌ−１ｙｃ発現株上でプラークを形成したが、溶原性 株もしくはｃｌ−ＧＣＮ４発現株のいずれかでプラークを形成しなかったファー ジを“陽性”と定義した。“陽性”体をこれら４種の株上で合計２回スクリーニ ングした。

ドツトプラーク検定において、５〜２０μｍの“陽性”ファージが典型的には５ ０〜１００プラークを与えた。単一の小さいプラークがｃ　Ｉ−Ｇ　ＣＮ　Ｊ上 で観測され得る場合には、そのファージを“陰性”と定義した。この検定法によ って、試験した１５６フア一ジ中合計１０個の“陽性”体が見つかった。これら のうち３プラークは“小”群に属し、７ブラークは“中“群に属した。これらの 陽性体は、ホモニ量体形成を破壊するに足る様式でｃ−ｓ＋ｙｃと結合するタン パク質を表している。

実施例３ ｃｍＭｙｃパートナ−へテロニ量化を防止する化合物の同定実施例２に記述した ように“中“ｃ−ｍｙｃパートナ−タンパク質と同定されたタンパク質を発現す る大腸菌宿主細胞をさらに化合物ｗ、ｘ、ｙ、およびＺにさらし、溶菌的に成長 する能力に対するこのような化合物の効果を、該化合物のプラーク形成阻害能力 を固形寒天プレート中で観察することによって決定した。

このような実験の代表的な結果を表１に示す。

表１：ｃ−ａｙｅ−タンパク質パートナ−の同定上記の表の結果は、パートナ− タンパク質の非存在下で化合物Ｗがλｃｒタンパク質の二量体形成能力および溶 菌的成長抑制能力に対して効果を有さなかうたことを示している。さらに化合物 Ｗはパートナ−のｍｙｃ融合融合タンパ上質へテロニ量体形成能力に対しても効 果を有さなかった。したがって、化合物Ｗは目的の化合物ではないであろう。

化合物Ｘはホモニ量体形成を妨害し、ヘテロニ量体結合を妨害しなかった。した がって、化合物Ｘはｃ−ｓｙｃ機能の阻害剤ではない。

化合物Ｙはへテロニ量体形成の阻害剤である。化合物Ｙはホモニ量体形成を妨害 しなかったが、ヘテロニ量体形成を妨害した。したがって、化合物Ｙは生体内本 明細書に引用した文献はすべて完全に本明細書の一部を構成する。ここに本発明 を完全に記述し終えたので、本発明の範囲または目的あるいはそのいかなる態様 にも影響を及ぼすことなく、本発明の範囲を広く等価な範囲の条件やパラメータ ーなどで行い得ることを、当業者は理解するであろう。

要約書 ＤＮＡ結合ドメインおよび異なるタンパク質由来の態量化ドメインを含有する融 合タンパク質構築物を利用する、タンパク質をヘテロニ量体タンパク質のパート ナ−としてスクリーニングおよび分類するための迅速で簡便で安価な方法が記述 されている。本発明の方法によれば、ホモニ量体形成を置換し、したがってホモ ニ量体立体配置の維持に依存する細菌宿主中の表現型変化を示すタンパク質パー トナ−の能力によってヘテロニ量体の形成が検出される。このようなヘテロニ量 体形成を阻害する重要な化合物を同定するため、特に、ヘテロニ量体の形成およ び腫瘍遺伝子転写！Ｉ１節タンパク質の活性化を防止する化合物を同定するため に本発明の方法を用いることができる。

宝鵞調査報告 く 二、 １１２＾−”””　”’　ＰＣＴ／ｌｌｓ９１１０２０７６

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．タンパク質パートナーを同定および分類する方法であって、（ａ）ＤＮＡ結 合ドメインおよび二量化ドメインを含有する融合タンパク質であって、溶菌性バ クテリオファージの成長を抑制するホモ二量体を形成する融合タンパク質を発現 し得る遺伝子構築物による細菌宿主細胞の形質転換、（ｂ）該タンパク質パート ナーを発現し得る遺伝子構築物による（ａ）段階の該宿主細胞の形質転換、 （ｃ）該融合タンパク質および該タンパク質パートナーを発現する条件下におけ る（ｂ）段階の該宿主細胞の培養、 （ｄ）該溶菌性バクテリオファージの、該宿主細胞の溶菌を誘発する能力の決定 、および、 （ｅ）該溶菌の存否に基づく該タンパク質パートナーの分類、からなる方法。
2. ２．化合物をタンパク質パートナーの二量化の阻害剤として同定および分類する 方法であって、 （ａ）ＤＮＡ結合ドメインおよび二量化ドメインを含有する融合タンパク質であ って、溶菌性バクテリオファージの成長を抑制するホモ二量体を形成する融合タ ンパク質を発現し得る遺伝子構築物による細菌宿主細胞の形質転換、（ｂ）該タ ンパク質パートナーを発現し得る遺伝子構築物による（ａ）段階の該宿主細胞の 形質転換、 （ｃ）該融合タンパク質および該タンパク質パートナーを発現する条件下におけ る（ｂ）段階の該宿主細胞の培養、 （ｄ）該化合物の、タンパク質パートナーが誘発する該溶菌性バクテリオファー ジの成長および該宿主細胞の溶菌を防止する能力の決定、および、（ｅ）該溶菌 の存否に基づく該化合物のタンパク質パートナー形成の阻害剤としての分類、 からなる方法。
3. ３．該ＤＮＡ結合ドメインがバクテリオファージλｃＩリプレツサータンパク質 のＤＮＡ結合ドメインである第１項または第２項の方法。
4. ４．該ｃＩリプレッサータンパク質の該ＤＮＡ結合ドメインが該リプレッサータ ンパク質のＮ末端の１１２アミノ酸である第４項の方法。
5. ５．該ファージがλである第１項または第２項の方法。
6. ６．該二量化ドメインがｂＨＬＨドメインである第１項または第２項の方法。
7. ７．該ｂＨＬＨドメインがＭｙｃ由来である第６項の方法。
8. ８．該ｍｙｃがｃ−Ｍｙｃである第７項の方法。
9. ９．該ｂＨＬＨドメインがｃ−Ｍｙｃのアミノ酸２５５〜４１０である第８項の 方法。
10. １０．該二量化ドメインがｂＺＩＰドメインである第１項または第２項の方法。
11. １１．該二量化ドメインが亜鉛フィンガードメインである第１項または第２項の 方法。