DE4237113A1 - Fusionspeptide mit Bindungsaktivität für Streptavidin - Google Patents
Fusionspeptide mit Bindungsaktivität für StreptavidinInfo
- Publication number
- DE4237113A1 DE4237113A1 DE4237113A DE4237113A DE4237113A1 DE 4237113 A1 DE4237113 A1 DE 4237113A1 DE 4237113 A DE4237113 A DE 4237113A DE 4237113 A DE4237113 A DE 4237113A DE 4237113 A1 DE4237113 A1 DE 4237113A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- protein
- streptavidin
- peptide
- dna sequence
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/22—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a Strep-tag
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, welche einem
Protein, das mit einem solchen Peptid fusioniert ist, eine
Bindungsaffinität für Streptavidin verleihen, Fusionsprotei
ne, die ein solches Peptid enthalten sowie Verfahren zur
Herstellung eines derartigen rekombinanten Proteins durch
Expression einer dafür kodierenden DNA-Sequenz in geeigneten
Wirtszellen nach an sich bekannten Methoden.
Während Systeme zur effizienten Expression von Fremdproteinen
in einer Vielzahl von verschiedenen Wirtsorganismen weitge
hend etabliert sind, stellen der Nachweis und die Reinigung
des rekombinanten Genprodukts bei der gentechnologischen
Proteinherstellung nach wie vor ein Problem dar. Dies gilt
vor allem dann, wenn das natürliche Protein von Interesse
nicht zuvor isoliert worden ist, so daß es weder hinsichtlich
seiner biochemischen Eigenschaften charakterisiert werden
konnte, noch spezifische Antiseren oder monoklonale Antikör
per gegen das Protein erhältlich sind. Diese Situation ist in
letzter Zeit aufgrund der Entwicklung der Polymeraseketten
reaktion gehäuft aufgetreten (Bloch W. (1991) Biochemistry
30, 2736-2747), weil es dadurch oft leichter ist, Informatio
nen über ein das Protein kodierende Gen zu erhalten, als das
gereinigte natürliche Protein selbst.
Um den Nachweis eines rekombinanten Genprodukts in solchen
Fällen zu ermöglichen, wo spezifische Immunreagenzien für das
Protein nicht verfügbar sind, wurden kurze Peptid-Anhängsel
(Peptid-tags) verwendet, die mit dem rekombinanten Protein
auf Genebene fusioniert wurden. Solche Fusionspeptidsequenzen
werden von spezifischen Antikörpern erkannt, wenn sie am
amino- oder carboxyterminalen Ende einer Proteinsequenz ange
fügt werden. Beispiele für derartige Peptid-Anhängsel sind
das Myc-tag (Munro & Pelham (1986) Cell 46, 291-300; Ward et
al. (1989) Nature 341, 544-546), das Flag-Peptid (Hopp et
al. (1988) Bio/Technology 6, 1204-1210), das KT3-Epitop-
Peptid (Martin et al. (1990) Cell 63, 843-849; Martin et al.
(1992) Science 255, 192-194), ein α-Tubulinepitop-Peptid
(Skinner et al. (1991) J. Biol. Chem. 266, 14163-14166) und
das T7 Gen 10-Protein-Peptid-Tag (Lutz-Freyermuth et al.
(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393-6397), welche erfolg
reich für den Nachweis und in einigen Fällen auch für die
Reinigung des rekombinanten Genprodukts verwendet wurden.
Zusätzlich wurde in den meisten der genannten Beispiele
festgestellt, daß diese kurzen Peptid-Anhängsel, welche nor
malerweise 3 bis 12 Aminosäuren lang sind, nicht mit der
biologischen Funktion des Proteins interferieren und deshalb
nicht unbedingt nach der Expression abgespalten werden müs
sen.
Obwohl diese Fusionspeptide vorzüglich geeignet sind für die
Detektion eines Proteins und deshalb wichtige Hilfsmittel für
die Optimierung von Expressionsausbeuten und von Reinigungs
protokollen sind, sind die Anwendungsmöglichkeiten der ihnen
innewohnenden Affinitätseigenschaften in einem Reinigungs
schema begrenzt. Der Grund hierfür ist, daß die vorteilhaften
Eigenschaften der bisher beschriebenen Peptide auf ihrer
starken Bindung an einen Antikörper basieren. Folglich müs
sen, wenn das Protein über das Peptid-Anhängsel an eine Affi
nitätssäule gebunden ist, welche einen immobilisierten
Antikörper trägt, ziemlich extreme und damit wenig schonende
Bedingungen (d. h. unphysiologischer pH-Wert oder chaotrope
Reagenzien) angewandt werden, um das Protein wieder von der
Säule zu eluieren. Wenn das rekombinante Protein in einer
funktionellen Form produziert wurde, ist es jedoch wünschens
wert, potentiell denaturierende Bedingungen während der Rei
nigung zu vermeiden. Allerdings wurde nur für drei der oben
beschriebenen Beispiele (Hopp et al. (1988); Martin et al.
(1990); Skinner et al. (1991) supra) gezeigt, daß es möglich
ist, die Proteinpeptidfusion unter Verwendung milderer Bedin
gungen, d. h. z. B. kompetitiv mit dem synthetischen Peptid zu
eluieren. Auch in diesen Fällen verbleiben jedoch Nachteile,
da die gegen die Peptid-Anhängsel gerichteten monoklonalen
Antikörper entweder teuer oder schwer in ausreichenden Mengen
zu erhalten sind.
Es war daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, kurze Pep
tidsequenzen zu entwickeln, die
- i) mit einem rekombinanten Protein verbunden werden kön nen, ohne mit dessen Funktion zu interferieren,
- ii) den Nachweis mit einem leicht verfügbaren Reagenz ermöglichen und
- iii) leicht kontrollierbare Bindungseigenschaften zeigen.
Gelöst wird die Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Peptid,
umfassend die Aminosäuresequenz Trp-X-His-Pro-Gln-Phe-Y-Z,
wobei X eine beliebige Aminosäure darstellt und Y und Z ent
weder beide Gly oder Y Glu und Z Arg oder Lys bedeuten.
Im Rahmen der Erfindung wurde nämlich festgestellt, daß die
angegebene Peptidsequenz eine hohe Bindungsaffinität für
Streptavidin, bzw. "Kern"-Streptavidin (ein proteolytisches
Spaltprodukt von Streptavidin) (Bayer, E.A., Ben-Hur, H.,
Hiller, Y. und Wilchek, M. (1989) Biochem. J. 259, 369-376)
aufweist.
Wenn die angegebene Sequenz daher in einem Fusionsprotein
vorhanden ist, so weist auch dieses Fusionsprotein eine hohe
Affinität für Streptavidin auf. Ein entsprechendes Fusions
protein ist daher ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Er
findung. Die Peptidsequenz kann hierbei am carboxyterminalen
Ende des Fusionsproteins vorhanden sein, kann theoretisch
jedoch auch am aminoterminalen Ende oder innerhalb der Amino
säuresequenz des Proteins liegen, solange hiermit keine nega
tiven Eigenschaften verbunden sind, wie z. B. Hinderung oder
Zerstörung der biologischen Aktivität etc.
Das im Fusionsprotein vorhandene Protein kann sowohl ein
vollständiges Protein, sowie eine Mutante eines Proteins, wie
z. B. eine Deletionsmutante oder Substitutionsmutante sein,
und schließlich ist es auch möglich, hier lediglich einen
interessierenden Teil eines Proteins mit dem erfindungsge
mäßen verbunden zu erhalten.
Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine können leicht nachge
wiesen werden durch Bindung an ein Konjugat aus Streptavidin
und einer Markierung, wobei als Markierung sämtliche dem
Fachmann bekannte Markierungen verwendet werden können. Auch
der sonstige Ablauf eines solchen Proteinnachweises kann
unter dem Fachmann geläufigen Bedingungen durchgeführt wer
den.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Expressionsvek
tor, insbesondere ein bakterieller Expressionsvektor, der
exprimierbar unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors
und Operators plaziert eine DNA-Sequenz enthält, welche ein
erfindungsgemäßes Peptid kodiert, sowie mehrere Restriktions
schnittstellen in 5′-Richtung anschließend an diese DNA-Se
quenz aufweist, welche die Einbringung einer weiteren DNA-
Sequenz erlaubt, die für das zu exprimierende Protein oder
ein Proteinteil kodiert.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Expressionsvektors wird es
ermöglicht, die DNA-Sequenz für ein interessierendes Protein
in einfacher Weise vor eine DNA-Sequenz für das erfindungsge
mäße Peptid zu plazieren und nach Expression z. B. in Esche
richia coli also ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein zu
erhalten. Wird in die Restriktionsschnittstelle in 5′-Rich
tung von der Peptidsequenz die DNA-Sequenz für das Protein
inseriert, was wie auch die übrigen Verfahrensmaßnahmen bei
der Herstellung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors für
den Fachmann gängige Maßnahmen sind, so wird ein Fusionspro
tein erhalten, welches das die Streptavidin-Affinität vermit
telnde erfindungsgemäße Peptid am Carboxy-Terminus aufweist.
Die Restriktionsschnittstelle muß im erfindungsgemäßen Ex
pressionsvektor nicht unbedingt unmittelbar neben der ersten
oder letzten Base der für das Peptid kodierenden DNA-Sequenz
liegen. Vorzugsweise sollte sie jedoch so liegen, daß bei
Transkription das Leseraster nicht beeinträchtigt wird und
eine Verbindung von nur wenigen, vorzugsweise höchstens zehn
zusätzlichen Aminosäuren zwischen dem Peptid und der Amino
säuresequenz des Proteins entsteht.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins durch
Expression einer dafür kodierenden DNA-Sequenz in geeigneten
Wirtszellen nach an sich bekannten Methoden, bei denen man
eine DNA-Sequenz exprimiert, welche für ein erfindungsgemäßes
Fusionsprotein kodiert. Die Vorteile dieses Verfahrens liegen
darin, daß die Anwesenheit des Expressionsprodukts über ein
Konjugat von Streptavidin und einer Markierung leicht nachge
wiesen werden kann oder/und die Abtrennung zur Aufreinigung
des gewünschten Proteins als Fusionsprotein über eine Strept
avidin-Affinitäts-Chromatographie bewirkt werden kann.
Wie bereits oben ausgeführt, kann zum Nachweis der Anwesen
heit des Expressionsproduktes, also des Fusionsproteins,
Streptavidin als Konjugat mit einer beliebigen Markierung
verwendet werden, wobei im Rahmen der Erfindung eine Enzym
markierung bevorzugt ist. Es können im übrigen die an sich
bekannten Methoden zum Nachweis von Proteinen dabei zur An
wendung kommen, z. B. ELISA, RIA, Western-Transfer etc.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt
darin, daß die Aufreinigung des exprimierten Fusionsproteins
leicht durch Affinitätschromatographie über eine Säule mit
immobilisiertem Streptavidin durchgeführt werden kann. Die
Elution kann dann vorteilhaft unter sehr milden Bedingungen
durchgeführt werden, z. B. durch Zugabe von Biotin oder bio
tinähnlichen Verbindungen, oder auch mit Hilfe der durch
Peptidsynthese gewonnenen Streptavidin-Affinitätspeptide.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die Elution mit
Biotin bevorzugt. Ebenso bevorzugt wird zur Affinitätschroma
tographie eine Säule verwendet, welche mit einer Streptavi
din-Agarose-Matrix oder auch mit an EupergitTMC gekoppeltem
Streptavidin gepackt ist.
Aus obiger Darlegung der vorliegenden Erfindung ist zu erse
hen, welche überragenden Vorteile dem erfindungsgemäßen Pep
tid und Fusionsproteinen, welche dieses Peptid enthalten,
insofern innewohnen, als ein schneller und sicherer Nachweis
des Expressionsproduktes Fusionsprotein ermöglicht wird,
wobei zu erwähnen ist, daß Streptavidin ein billiges und
leicht verfügbares Reagenz darstellt, das auch in Verbindung
mit Markierungen wie Fluoreszenzmarkierung oder Enzymmarkie
rung erhältlich ist. Desweiteren zeigt das exprimierte Fu
sionsprotein leicht kontrollierbare Bindungseigenschaften an
Streptavidin aufgrund der Anwesenheit des erfindungsgemäßen
Peptids, so daß eine leichte Aufreinigung des Expressionspro
duktes ermöglicht wird, die auch im großtechnischen Maßstab
durchführbar ist.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren wird die
Expression eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins erleich
tert, wobei ein solcher Expressionsvektor universell für alle
zu exprimierenden Proteine anwendbar ist. Das erfindungsge
mäße Peptid stört im Fusionsprotein die biologische Aktivität
des übrigen Proteinanteils nicht und muß daher nicht unbe
dingt vor Weiterverwendung abgespalten werden. Sollte jedoch
aus irgendwelchen Gründen eine Abspaltung erwünscht sein, so
kann der erfindungsgemäße Expressionsvektor auch derart auf
gebaut sein, daß er zwischen der Restriktionsschnittstelle
zur Einbringung der DNA-Sequenz für das Protein und der für
das Peptid kodierenden Sequenz noch eine DNA-Sequenz auf
weist, welche für eine spezifische Protease-Schnittstelle
kodiert. Somit wäre nach Expression und gegebenenfalls Auf
reinigung oder Nachweis des Expressionsproduktes eine leichte
Abspaltung der Peptidsequenz möglich.
Die folgenden Beispiele erläutern in Verbindung mit den Figu
ren die Erfindung weiter:
Hierbei zeigen die
Fig. 1 die DNA-Sequenz von pASK46 sowie die davon kodier
ten Aminosäuresequenzen in allen drei Leserastern
und Angabe der singulären Restriktions-Schnittstel
len;
Fig. 2 eine Restriktionskarte von pASK46;
Fig. 3 den Nachweis erfindungsgemäßer Protein-Peptidfusio
nen in einem Filter-Sandwich-Test mit jeweils 4
Kolonien von E.coli, transformiert mit verschiede
nen Plasmiden;
Fig. 4 den Nachweis einer erfindungsgemäßen Protein-Pep
tidfusion im Western Transfer;
Fig. 5 die in einem ELISA beobachteten Bindungssignale für
ein Streptavidinkonjugat mit Verdünnungsreihen der
Periplasmafraktionen von induzierten E.coli TG1-
Zellen, transformiert mit Plasmiden, die für ver
schiedene erfindungsgemäße Fusionen aus einem Anti
körperfragment und einem Streptavidin-Affinitäts
peptid kodieren;
Fig. 6A die Elutionsprofile der Streptavidin-Affinitäts
chromatographie mit Periplasmafraktionen, wie in
Fig. 5;
Fig. 6B eine analoge Streptavidin-Affinitätschromatographie
wie Fig. 6A, wobei hier das Antigen Lysozym der
Periplasmafraktion zugesetzt worden war;
Fig. 7 eine Restriktionskarte von pASK60-Strep;
Fig. 8 die DNA-Sequenz von pASK60-Strep mit den davon ko
dierten Aminosäuresequenzen in allen drei Lese
rastern sowie den singulären Restriktions-Schnitt
stellen; und
Fig. 9 die kommentierte Sequenz des Polylinkers von
pASK60-Strep.
DNA-Manipulationen wurden nach gängigen gentechnischen Metho
den (Sambrook J., Fritsch, E.F. und Maniatis T. (1989),
Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) durchgeführt. Für
Klonierung und Expression wurden die Stämme Escherichia coli
K12 TG1 (supE, hsdΔ5, thi, Δ(lac-proAB) [F′, traD36, proAB,
lacI⁹ZΔM15]) (Gibson, T.J. (1984) Ph. D. Thesis, Cambridge
University, England) und Escherichia coli K12 JM83 (ara,
Δ(lac-pro AB), rpsL (= strA), Φ80, LacZΔM15) (Yanisch-Perron,
C., Vieira, J. und Messing, J. (1985), Gene 33, 103-119)
verwendet. Restriktionsenzyme wurden bei Boehringer Mannheim,
New England Biolabs und Gibco BRL, Taq DNA Polymerase bei
Promega erworben. Restriktionsverdau und Polymerase-Ketten
reaktion (PCR) wurden unter den vom Hersteller empfohlenen
Bedingungen durchgeführt. Für die ortsgerichtete Mutagenese
wurde eine modifizierte Vorschrift nach Kunkel verwendet
(Geisselsoder, J., Witney, F. und Yuckenberg, P. (1987),
Biotechniques 5, 786-791). Oligodesoxynukleotid-Synthese
wurde unter Verwendung eines Applied Biosystems DNA-Synthese
automaten durchgeführt. Das kovalente Streptavidin-alkalische
Phosphatase-Konjugat wurde bei Amersham erworben und die
Streptavidin-Agarose stammte von Biomol oder Sigma. Alle
diese Reagenzien enthielten Kern-Streptavidin, eine proteoly
tisch verkürzte Form des Proteins (Bayer, E.A., Ben-Hur, H.,
Hiller, Y. und Wilchek, M. (1989) Biochem. J. 259, 369-376).
Das in dieser Studie verwendete Plasmid pASK46 wurde aus
früheren Gen-Konstrukten für die Expression des D1.3Fv-Frag
mentes in E.coli (Ward E.S., Güssow, D., Griffith, A.D.,
Jones, P.T. und Winter, G. (1989) Nature 341, 544-546) und
aus pASK40 (Skerra, A., Pfitzinger, I. und Plückthun, A.
(1991) Bio/Technology, 9, 273-278) zusammengesetzt.
Die vollständige DNA-Sequenz von pASK46 ist in Fig. 1 darge
stellt. Eine Restriktionskarte desselben Plasmids zeigt Fig.
2.
Es wurden sechs Derivate von pASK46 hergestellt, die für vier
verschiedene Peptide am C-Terminus von VH bzw. zwei Peptide
am C-Terminus von VL des D1.3 Fv-Fragments (Boulot, G.,
Eisel´, J.-L., Bentley, G.A., Bhat, T.N., Ward, E.S., Winter,
G. und Poljak, R.J. (1990), J. Mol. Biol., 213, 617-619) kodie
ren.
Die die Basenpaare 686-706 umfassende DNA-Sequenz auf
pASK46 wurde durch die unten angegebenen, jeweils 30 Basen
paare langen Sequenzen, die für Nonapeptide kodieren, er
setzt.
Die die Basenpaare 1127-1169 umfassende DNA-Sequenz auf
pASK46 wurde durch die unten angegebenen, 36 bzw. 44 Basen
paare langen Sequenzen ersetzt.
Zur Produktion der rekombinanten Proteine wurden die mit dem
entsprechenden Expressionsplasmid transformierten E. coli-
Zellen bei 22°C in LB-Medium, das 100 µg/ml Ampicillin ent
hielt, inkubiert, bis eine OD550 von 0,5 erreicht war. Dann
wurde IPTG mit einer Endkonzentration von 1mM zugesetzt, die
Temperatur wurde ggf. auf 20°C gesenkt und die Induktion der
Proteinexpression wurde 3 Std. lang fortgesetzt. Die Zellen
wurden dann abzentrifugiert und in einem geeigneten Puffer
resuspendiert. Für die Herstellung der periplasmatischen
Zellfraktion wurden die Zellen von 1 l Kultur in 10 ml 50 mM
Tris pH 8,0, 500 mM Saccharose, 1 mM EDTA resuspendiert und
30 Min. lang auf Eis inkubiert. Die Sphäroplasten wurden
durch Zentrifugation sedimentiert, und der Überstand wurde
vor der weiteren Verwendung sterilfiltriert. Wenn der Ansatz
für die Reinigung mit einer Streptavidin-Agarose Säule vorge
sehen war, wurde Avidin bis zu einer Endkonzentration von 40
µg/ml zugegeben, um freie Biotin-Gruppen zu komplexieren. Die
Proteinlösung wurde durch Ultrafiltration auf ein Endvolumen
von ca. 1 ml konzentriert und über Nacht gegen 1 l 50 mM
Tris, pH 8,0, bei 4°C dialysiert. Geringe Mengen an Präzipi
tat wurden vor der Säulenchromatographie durch Zentrifugation
(Microfuge, 14000 rpm, 10 Min., 4°C) oder Filtration mit
einer Spin-X-Filtriereinheit (Costar) entfernt. Zur Herstel
lung des löslichen Teils des Gesamt-Zellproteins wurden die
Zellen von 1 l Kultur in 10 ml 50 mM Tris, pH 8,0, resuspen
diert und mit Hilfe eines Hochdruck-Homogenisators (French
pressure cell) bei 18000 psi aufgeschlossen. Das Homogenisat
wurde zentrifugiert (45000 g, 30 Min., 4°C) und dem Überstand
zur Komplexierung freier Biotingruppen Avidin bis zu einer
Konzentration von 40 µg/ml zugesetzt. Nach einer 30-minütigen
Inkubation bei 4°C wurde die Proteinlösung sterilfiltriert
und auf die Streptavidin-Agarose-Säule aufgetragen. Für die
SDS-PAGE des Gesamt- Zellproteins wurden die Zellen aus 4 ml
E.coli-Kultur in 400 µl 50 mM Tris, pH 8,0, resuspendiert und
mit 100 µl 5× SDS-PAGE Auftrags-Puffer versetzt (siehe un
ten). Chromosomale DNA wurde durch Ultraschallbehandlung vor
der Gel-Elektrophorese fragmentiert.
Der Filter-Sandwich Test wurde in Anlehnung an eine Strate
gie, die vorher von Skerra et al. (Skerra, A., Dreher, M.L.
und Winter, G. (1991) Anal. Biochem. 196, 151-155) beschrie
ben wurde, durchgeführt. Die transformierten E.coli-Zellen
wurden auf einer Nitrocellulose-Filtermembran (82 mm Durch
messer, Schleicher & Schuell) ausplattiert oder punktförmig
aufgebracht, die auf einer Agar-Platte lag (mit LB-Medium,
welches 100 µg/ml Ampicillin und 10 mg/ml Glucose enthielt).
Die Platte wurde ungefähr 8 Std. lang bei 37°C inkubiert, bis
kleine Kolonien sichtbar wurden. Parallel dazu wurde eine
zweite Nitrocellulose-Filtermembran 6 Std. lang mit einer
Lösung von 5 mg/ml Hühnereiweiß-Lysozym (Sigma), dem Antigen
des D1.3 Antikörpers, in PBS-Puffer (4 mM KH2PO4, 16 mM
Na2HPO4, 115 mM NaCl) beladen und anschließend 2 Std. lang in
PBS-Puffer mit 3% w/v BSA (Sigma, Fraktion V) und 0,5% v/v
Tween 20 (Sigma) blockiert. Diese "Antikörper-Fang-Membran"
wurde zweimal mit PBS gewaschen, mit flüssigem LB-Medium
getränkt, das 100 µg/ml Ampicillin und 1 mM IPTG (Isopropyl
β-D-Thiogalactopyranosid, Biomol) enthielt, auf eine Agar-
Platte mit der gleichen Medienzusammensetzung aufgebracht und
mit der die E.coli-Kolonien tragenden ersten Membran bedeckt.
Die Zellen auf diesem Filter-Stapel wurden über Nacht (14
Std.) bei Raumtemperatur inkubiert um eine Expression der Fv-
Fragmente mit C-terminalem Peptidanhängsel zu erreichen. Die
obere Membran wurde dann abgehoben und auf eine frische LB
Agar Platte gelegt, die 100 µg/ml Ampicillin und 10 mg/ml
Glucose enthielt, um die E.coli-Kolonien zur späteren Vermeh
rung bei 4°C aufzubewahren. Die "Fang"-Membran wurde vom Agar
abgehoben und dreimal mit PBS/Tween (PBS mit 0,1% v/v Tween)
gewaschen. Der Nachweis von immobilisierten Fv-Fragmenten,
die Peptide mit Streptavidin-bindender Aktivität trugen,
wurde durch einstündige Inkubation mit einem Streptavidin-
alkalische Phosphatase-Konjugat erreicht, (1 : 2000 verdünnt in
PBS/Tween), in Gegenwart von 2 µg/ml Avidin (Polyscience),
das 10 Min. vorher zugefügt worden war. Nach gründlichem
Waschen (3× PBS/Tween; 2× PBS) wurde die Membran in 10 ml AP-
Puffer inkubiert (100 mM Tris pH 8,8; 100 mM NaCl; 5 mM
MgCl2), dem 30 µl BCIP-Stammlösung (50 mg/ml 5-Brom-4-Chlor-3
Indolyl-Phosphat 4-Toluidin Salz (Biomol) in Dimethyl-For
mamid) und 5 µl NBT-Stammlösung (75 mg/ml Nitro-Blau Tetrazo
lium (Biomol) in 70% v/v Dimethyl Formamid) zugesetzt worden
waren (Blake, M.S., Johnston, K.H. Russel-Jones, G.J. und
Gotschlich, E.C. (1984) Anal.Biochem., 136, 175-179). Die
chromogene Reaktion wurde nach 30-60 Min. durch mehrmaliges
Waschen in destilliertem Wasser gestoppt und der Filter an
der Luft getrocknet.
Fig. 3 zeigt jeweils 4 Kolonien von Escherichia coli TG1,
transformiert mit den Plasmiden pASK46-p141H (1), pASK46-
p111H (2), pASK46 (3) (als Negativkontrolle), und pASK46-
p111L (4). Abgesehen von der Negativkontrolle wird in allen
Fällen ein intensives Bindungssignal für das Streptavidin-
Konjugat beobachtet. Ein etwas schwächeres Bindungssignal
wurde mit den Plasmiden pASK46-p11XH, pASK46-p11XL und
pASK46-p14XH nachgewiesen (nicht gezeigt).
SDS-PAGE wurde in vertikalen Flachgelkammern unter Verwendung
des Puffersystems von Fling, S.P. und Gregerson, D.S.((1986)
Anal. Biochem., 155, 83-88) durchgeführt. Für den Western
Transfer wurde das Gel nach der Elektrophorese in Transfer
puffer (Elektrophorese-Laufpuffer mit 20% (v/v) Methanol)
getränkt. Das Protein wurde mit der "Semi-dry"-Technik auf
eine Immobilon-P Membran (Millipore) transferiert bei einer
konstanten Stromstärke von 1 mA/cm2 im Verlauf einer Stunde
bei 4°C. Anschließend wurde die Membran mit PBS, das 0,5%
v/v Tween und 3% BSA w/v enthielt, 1 Std. lang bei Raumtem
peratur blockiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS/Tween
wurde die Membran 10 Min. lang mit Avidin inkubiert (2 µg/ml
in PBS/Tween), um das Biotincarboxyl-Carrierprotein zu kom
plexieren. Danach wurde mit einem Streptavidin-alkalische
Phosphatase-Konjugat 1 : 4000 verdünnt in PBS/Tween eine Stunde
lang inkubiert. Nach gründlichem Waschen (3× PBS/Tween; 2×
PBS) wurde der Transfer unter Verwendung des BCIP/NBT Proto
kolls (siehe Beispiel 1) entwickelt.
Fig. 4 zeigt den Nachweis der entsprechenden Protein-Peptid
fusionen im Western-Blot. Es wurden gleiche Aliquots der
periplasmatischen Fraktionen von induzierten Escherichia coli
TG1 Zellen, transformiert mit den Plasmiden pASK46-p141H (1),
pASK46-p11iH (2), pASK46-p111L (3) und pASK46 (4) (als Nega
tivkontrolle) durch SDS-PAGE aufgetrennt. Nach dem Transfer
der Proteine auf eine Immobilon-P Membran wurde die entspre
chende Peptid-Protein Fusion mit dem Streptavidin-Konjugat
spezifisch nachgewiesen. Ein etwas schwächeres Signal in
einem analogen Experiment lieferten die Plasmide pASK46-
p11XH, pASK46-p11XL und pASK46-p14XH (nicht gezeigt). Ver
gleichbare Resultate wurden erzielt, wenn das Gesamtzellpro
tein im SDS-PAGE aufgetrennt wurde.
Sieben Reihen einer Mikrotiter-Platte mit 96 Vertiefungen
(Falcon #3912) wurden mit 100 µl einer Lösung von 3 mg/ml
Lysozym in 50 mM NaHCO3, pH 9,6, bei 4°C über Nacht beladen.
Anschließend wurde bei Raumtemperatur mit 2% w/v fettfreier
Trockenmilch (BioRad) in PBS 2 Std. lang blockiert. Nach dem
Waschen (3× PBS/Tween) wurden je 50 µl der periplasmatischen
Zellfraktionen der entsprechenden Klone als Verdünnungsreihe
in PBS/Tween zupipettiert und 1 Std. lang inkubiert. Die
Konzentrationen der Fv-Fragmente in den unverdünnten Fraktio
nen betrugen ungefähr 50-100 µg/ml (geschätzt durch SDS-
PAGE). Nach dem Waschen (3× PBS/Tween), wurden 50 µl Strept
avidin-alkalische Phosphatase-Konjugat in einer Verdünnung
von 1 : 1000 in PBS/Tween zugesetzt und 1 Std. lang inkubiert.
Ungebundenes Konjugat wurde durch jeweils zweifaches Waschen
mit PBS/Tween und PBS entfernt und 100 µl NPP-Lösung (0,5
mg/ml p-Nitrophenyl-Phosphat; 0,9 M Diethanol-Amin, pH 9,6; 1
mM MgCl2) zupipettiert. Das Farbsignal wurde 5-10 Min. lang
entwickelt und durch Zugabe von 100 µl 10 mM EDTA, pH 8,0,
gestoppt. Die Absorptionswerte wurden unter Verwendung eines
Mikrotiterplatten-Photometers bestimmt, und die Daten wurden
als A405-A450 Differenzwerte nach Abzug des Blindwertes für
jede Verdünnung aufgezeichnet. Die Blindwerte wurden durch
eine Verdünnungsreihe der periplasmatischen Zellfraktion
bestimmt, die das D1.3 Fv-Fragment ohne Peptidanhängsel ent
hielt, und erwiesen sich als konstant über den gesamten Ver
dünnungsbereich (A405-A450 = 0,199 ± 0,009).
Fig. 5 zeigt die beobachteten Bindungssignale für das
Streptavidin-Konjugat mit Verdünnungsreihen der Periplasma
fraktionen von induzierten Escherichia coli TG1-Zellen,
transformiert mit den entsprechenden Plasmiden.
Eine Säule, die mit 6 ml Streptavidin-Agarose (ungefähr 1 mg
Streptavidin pro 1 ml Gel) gepackt war, wurde mit 10 Volumen
von 50 mM Tris, pH 8,0 equilibriert. Die periplasmatische
Zellfraktion von 0,5 l der mit dem entsprechenden Plasmid
transformierten E.coli-Zellen wurde auf die Säule aufgetragen
und mit dem Tris-Puffer nachgewaschen. Das hybride D1.3 Fv-
Fragment wurde dann mit einer Lösung von 1mM Iminobiotin
(Sigma) oder 5 mM Liponsäure (Sigma) in dem gleichen Puffer
spezifisch eluiert. Da diese Biotin-Analoga sehr viel schwä
cher an Streptavidin binden als Biotin selbst (Green, N.M.
(1975) Adv. Protein Chem., 29, 85-133), konnte die Säule
durch einfaches Waschen mit 10 Volumen Tris-Puffer regene
riert werden. Alle chromatographischen Schritte wurden bei
einer Durchflußrate von 30 ml/Std. bei einer Temperatur von
4°C durchgeführt. Die Streptavidin-Affinitätschromatographie
des löslichen Teils des gesamten Zellproteins wurde bei einer
Durchflußrate von ungefähr 20 ml/Std. unter sonst identischen
Bedingungen durchgeführt. Die Ausbeute an gereinigtem hybri
den Fv-Fragment lag normalerweise im Bereich von 0,5
mg/L·OD550 E.coli-Kultur. Zur Streptavidin-Affinitätsreini
gung des D1.3 Fv-Lysozym-Komplexes wurde eine periplasmati
sche Zellfraktion, die das D1.3 Fv(p111L) Fragment enthielt
und gegen 50 mM NaH2PO4, pH 7,0, 115 mM NaCl, 1 mM EDTA dia
lysiert worden war, mit der ca. dreifachen molaren Menge an
Lysozym versetzt. Nach 1-stündiger Inkubation bei 4°C und
anschließender Zentrifugation wurde die resultierende Pro
teinlösung der Streptavidin-Agarose Affinitätschromatographie
unterworfen (wie oben), wobei der letztgenannte Puffer ver
wendet wurde.
Fig. 6A zeigt die Elutionsprofile (Absorption bei 280 nm)
der Streptavidin-Affinitätschromatographie, welche mit den
Periplasmafraktionen von Escherichia coli TG1-Zellen, die mit
pASK46-p111H bzw. pASK46-p111L transformiert waren, durchge
führt wurde. Darunter sind mit Coomassie-Brilliantblau
(Serva) angefärbte SDS-Polyacrylamidgele der nach Anlegen
einer Iminobiotin-Lösung erhaltenen Fraktionen wiedergegeben.
Daraus ist zu ersehen, daß beide Untereinheiten des Fv-Frag
ments gemeinsam in reiner Form und spezifisch eluiert wurden,
obwohl nur jeweils eine Kette des heterodimeren Proteins mit
dem Streptavidin-Affinitätspeptid fusioniert war. Im Fall von
pASK46-p111L wiesen die beiden Ketten gleiche Mobilität in
der SDS-PAGE auf. Die Funktionalität des gereinigten Proteins
wurde daher durch ein ELISA-Experiment (wie in Beispiel 3)
zusätzlich nachgewiesen. Bei einer analog durchgeführten
Chromatographie, bei der das Gesamtzellprotein von Escheri
chia coli TG1-Zellen, die mit pASK46-p111H transformiert
waren, aufgetragen wurde, wurde ebenfalls das rekombinante
Protein als intaktes Heterodimer in reiner Form erhalten.
Fig. 6B stellt eine analoge Streptavidin-Affinitätschro
matographie dar, wobei hier Lysozym, das Antigen des D1.3 Fv-
Fragments, der Periplasmafraktion von Escherichia coli TG1-
Zellen, transformiert mit pASK46-p111L, zugesetzt worden war.
Das unter dem Elutionsprofil wiedergegebene, mit Coomassie-
Brilliantblau (Serva) angefärbte SDS-Polyacrylamidgel zeigt
die durch Elution mit der Iminobiotin-Lösung erhaltene Pro
duktfraktion (2) und zum Vergleich gereinigtes Lysozym (3)
sowie das separat gereinigte rekombinante Fv-Fragment (4).
Spur (1) gibt den Molekulargewichtsstandard wieder. Es wird
ersichtlich, daß der Immunkomplex aus rekombinantem Fv-Frag
ment und dem Antigen Lysozym spezifisch gereinigt worden
ist.
pASK60-Strep wurde ausgehend von pASK40 (Skerra, A., Pfitzin
ger, I. und Plückthun, A. (1991) Bio/Technology, 9, 273-278)
unter Verwendung ortsgerichteter Mutagenese und PCR herge
stellt. Eine Restriktionskarte sowie die gesamte DNA-Sequenz
von pASK60-Strep sind in den Fig. 7 und 8 gezeigt. Der
Polylinker auf pASK60-Strep enthält einen verbesserten Satz
singulärer Restriktionsschnittstellen, einschließlich zweier
Restriktionsschnittstellen, die direkt am 3′-Ende der für das
OmpA-Signalpeptid kodierenden Region liegen, und wird von
einer für das Streptavidin-Bindungspeptid "(Ser-Ala-)Trp-Arg-
His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly" kodierenden DNA-Sequenz gefolgt
(vgl. Fig. 9). Die direkte Expression eines Fremdgens in
E.coli, d. h. ohne Verwendung der OmpA-Signalsequenz, kann
erreicht werden unter Verwendung der XbaI-Schnittstelle und
Rekonstruktion des 16 Basenpaare umfassenden Bereichs zwi
schen dem Stop-Codon des lacZ Mini-Cistrons und dem Start-
Codon des Strukturgens (vormals OmpA-Signalsequenz). Um dage
gen eine Fusion mit der OmpA-Signalsequenz herzustellen, die
auf pASK60-Strep kodiert ist, kann das Strukturgen direkt
unter Verwendung der StuI- oder BsaI-Schnittstellen einklo
niert werden. StuI (Erkennungssequenz "AGG CCT") erzeugt ein
glattes Ende nach dem ersten Nukleotid des letzten Codons
(Ala) der Signal-Sequenz. Eine präzise Fusion kann somit
unter Zuhilfenahme einer kompatiblen Restriktionsstelle (z. B.
StuI, PvuII, NruI) direkt vor dem Strukturgen geschaffen
werden. BsaI ist ein Restriktionsenzym vom Typ IIa, dessen
Schneidestelle von der Erkennungsstelle entfernt liegt
("GAGACC", unterstrichen in Fig. 9). Durch Schneiden mit
diesem Enzym wird ein 5′-überhängendes DNA-Ende erzeugt
("GGCC", in kleinen Buchstaben gedruckt in Fig. 9), das am
äußersten 3′-Ende der Signal-Sequenz liegt, ohne in die Ko
dierungsregion des maturen Teiles des zu klonierenden Gens
hineinzuragen. Dieses kohäsive Ende kann mit den Enden, die
von den Restriktionsenzymen EaeI und EagI erzeugt werden,
ligiert werden. Weiterhin ist es möglich, z. B. durch PCR bei
der Herstellung des zu klonierenden DNA-Fragments, eine kom
patible Restriktionsstelle einzuführen, die die reife amino
terminal kodierende Region des Gens nicht beeinträchtigt,
wenn die BsaI-(oder ein anderes IIa-Enzym, wie BspMI etc.)
Erkennungssequenz auf die gegenüberliegende Seite des kohäsi
ven Endes, das erzeugt werden soll, plaziert wird. Die Fusion
des Strukturgens an die für das Streptavidin-Bindungspeptid
kodierende Region kann unter Verwendung der Eco47III-Restrik
tionsschnittstelle (Erkennungssequenz "AGC GCT") erreicht
werden, was zu einem glatten Schnitt direkt zwischen dem Ser-
Codon ("AGC", in kleinen Buchstaben gedruckt in Fig. 9) und
dem Ala-Codon vor der eigentlichen Peptidsequenz nach An
spruch 1 führt. Wenn das Ser-Codon wiederhergestellt werden
soll, können verschiedene Restriktionsstellen für die Erzeu
gung eines kompatiblen Endes benutzt werden, außer Eco47III
z. B. auch ScaI und NruI.
Der menschliche "Low density lipoprotein"-Rezeptor besteht,
abgesehen von einer N-terminalen Signalsequenz, die im matu
ren Rezeptor abgespalten ist, aus fünf Proteindomänen, von
denen die vierte den Transmembrananteil darstellt. Zur Klo
nierung der ersten, N-terminalen Proteindomäne, die die Ami
nosäuren 1 bis 292 umfaßt, wurde das Plasmid pLDLR3 (ATCC Nr.
57004) (Yamamoto, T., Davis, C.G., Brown, M.S., Schneider,
W.J., Casey, M.L., Goldstein, J.L. und Russell, D.W. (1984)
Cell 39, 27-38) verwendet. Das entsprechende DNA-Fragment
wurde mit Hilfe der Oligodesoxynukleotid-Primer "5′-TAG CAA
CGG CCG CAG TGG GCG ACA GAT GT" (für den N-Terminus, mit der
Restriktionsschnittstelle EagI) und "5′-TTC GTT AGT ACT GCA
CTC TTT GAT GGG TTC" (für den C-Terminus, mit der Restrik
tionsschnittstelle ScaI) durch PCR amplifiziert, isoliert und
mit den Restriktionsenzymen EagI und ScaI geschnitten. Dieses
DNA-Fragment wurde in pASK60-Strep über dessen Restriktions
schnittstellen BsaI und Eco47III unter Verwendung des E.coli-
Stamms K12 JM83 kloniert. Nach Überprüfung des erhaltenen
Plasmids durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung
wurde von einem Klon eine Kultur hergestellt und die Protein
expression induziert, wie weiter oben beschrieben. Das Ge
samtzellprotein der erhaltenen Zellen wurde in einer 15%igen
SDS-PAGE aufgetrennt und durch Western-Transfer auf eine
Immobilon P-Membran überführt. Mit Hilfe des Streptavidin-
alkalische Phosphatase-Konjugats (vgl. Beispiel 2) konnte die
rekombinante Rezeptordomäne von ca. 40 000 Dalton spezifisch
nachgewiesen werden.
Claims (8)
1. Peptid, umfassend die Aminosäuresequenz
Trp-X-His-Pro-Gln-Phe-Y-Z,
wobei X eine beliebige Aminosäure darstellt und Y und
Z entweder beide Gly oder Y Glu und Z Arg oder Lys
bedeuten.
2. Fusionsprotein,
dadurch gekennzeichnet,
daß es aus der Aminosäuresequenz eines vollständigen
Proteins, einer Protein-Mutante, wie einer Deletions-
oder Substitutions-Mutante, oder einem Proteinteil
verbunden mit der Sequenz des Peptids nach Anspruch 1
besteht.
3. Expressionsvektor,
dadurch gekennzeichnet,
daß er, exprimierbar unter der Kontrolle eines geeig
neten Promotors und gegebenenfalls Operators, eine
DNA-Sequenz enthält, welche für ein Peptid nach An
spruch 1 kodiert sowie eine Restriktionsschnittstelle
in 5′- oder/und 3′-Richtung anschließend an diese DNA-
Sequenz aufweist, welche die Einbringung einer weite
ren DNA-Sequenz erlaubt, die für ein zu exprimierendes
Protein oder einen Proteinteil kodiert.
4. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins
durch Expression einer dafür kodierenden DNA-Sequenz
in geeigneten Wirtszellen nach an sich bekannten Me
thoden,
dadurch gekennzeichnet,
daß man eine DNA-Sequenz verwendet, welche für ein
Fusionsprotein gemäß Anspruch 2 kodiert und gegebenen
falls die Anwesenheit des Expressionsproduktes über
ein Konjugat von Streptavidin und einer Markierung
nachweist bzw. die Abtrennung des gewünschten Proteins
als Fusionsprotein über eine Streptavidinaffinitäts
chromatographie bewirkt.
5. Verfahren nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet,
daß man ein Konjugat aus Streptavidin und einer Enzym
markierung verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß man als Enzymmarkierung alkalische Phosphatase
verwendet.
7. Verfahren nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet,
daß man zur Affinitätschromatographie eine Streptavi
din-Agarosematrix verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet,
daß man bei der Affinitätschromatographie das Fusions
protein durch Zugabe von natürlichen Liganden des
Streptavidins, insbesondere Biotin, synthetischen
Derivaten davon, insbesondere 2-Iminobiotin oder Li
ponsäure, oder synthetischen Peptiden nach Anspruch 1
eluiert.
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4237113A DE4237113B4 (de) | 1992-11-03 | 1992-11-03 | Peptide und deren Fusionsproteine, Expressionsvektor und Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins |
GB9322501A GB2272698B (en) | 1992-11-03 | 1993-11-01 | Fusion peptides with binding activity for streptavidin |
JP27416393A JP3865792B2 (ja) | 1992-11-03 | 1993-11-02 | ペプチド、融合ペプチド、発現ベクター及び組換えタンパク質の製造方法 |
US08/148,675 US5506121A (en) | 1992-11-03 | 1993-11-03 | Fusion peptides with binding activity for streptavidin |
FR9313066A FR2697525B1 (fr) | 1992-11-03 | 1993-11-03 | Peptides de fusion ayant une activité de liaison à la streptavidine. |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4237113A DE4237113B4 (de) | 1992-11-03 | 1992-11-03 | Peptide und deren Fusionsproteine, Expressionsvektor und Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE4237113A1 true DE4237113A1 (de) | 1994-05-05 |
DE4237113B4 DE4237113B4 (de) | 2006-10-12 |
Family
ID=6472003
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE4237113A Expired - Lifetime DE4237113B4 (de) | 1992-11-03 | 1992-11-03 | Peptide und deren Fusionsproteine, Expressionsvektor und Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5506121A (de) |
JP (1) | JP3865792B2 (de) |
DE (1) | DE4237113B4 (de) |
FR (1) | FR2697525B1 (de) |
GB (1) | GB2272698B (de) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0835934A3 (de) * | 1996-10-10 | 1999-09-01 | Institut für Bioanalytik GmbH | Streptavidinmuteine |
EP1061128A1 (de) * | 1999-06-18 | 2000-12-20 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung biochemischer Reaktionen mit hohem Durchsatz |
US7863015B2 (en) | 1999-06-18 | 2011-01-04 | Roche Diagnostics Gmbh | Method and device for carrying out biochemical reactions with a high throughput |
Families Citing this family (105)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AUPN480095A0 (en) * | 1995-08-15 | 1995-09-07 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Epitope tagging system |
DE19729248C1 (de) * | 1997-07-09 | 1998-07-09 | Jochen Uhlenkueken | Standardprotein |
JP2002502977A (ja) | 1998-02-04 | 2002-01-29 | インビトロジェン コーポレイション | マイクロアレイとその使用 |
DE69922365T2 (de) * | 1998-04-30 | 2005-04-14 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Neue methode zur selektion von klonen einer expressionsbibliothek mittels "rearraying" |
JP4540846B2 (ja) * | 1998-04-30 | 2010-09-08 | マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ | 所望の生物学的特性を与えるクローンを発現ライブラリーから同定する新規方法 |
US20020119579A1 (en) * | 1998-07-14 | 2002-08-29 | Peter Wagner | Arrays devices and methods of use thereof |
US20030138973A1 (en) * | 1998-07-14 | 2003-07-24 | Peter Wagner | Microdevices for screening biomolecules |
US6780582B1 (en) * | 1998-07-14 | 2004-08-24 | Zyomyx, Inc. | Arrays of protein-capture agents and methods of use thereof |
US6406921B1 (en) * | 1998-07-14 | 2002-06-18 | Zyomyx, Incorporated | Protein arrays for high-throughput screening |
US6576478B1 (en) * | 1998-07-14 | 2003-06-10 | Zyomyx, Inc. | Microdevices for high-throughput screening of biomolecules |
KR100334702B1 (ko) * | 1999-08-31 | 2002-05-04 | 박원배 | 다단계 프로토콜 처리 장치 |
GB9928787D0 (en) * | 1999-12-03 | 2000-02-02 | Medical Res Council | Direct screening method |
JP2004511753A (ja) * | 2000-05-04 | 2004-04-15 | イエール ユニバーシティー | タンパク質活性のスクリーニング用タンパク質チップ |
US7355019B2 (en) * | 2000-06-06 | 2008-04-08 | Sibtech, Inc. | Cysteine-containing peptide tag for site-specific conjugation of proteins |
US20030059461A1 (en) * | 2000-06-06 | 2003-03-27 | Sibtech, Inc. | Molecular delivery vehicle for delivery of selected compounds to targets |
WO2002030962A2 (en) | 2000-10-12 | 2002-04-18 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Metal binding proteins, recombinant host cells and methods |
US6841359B2 (en) | 2000-10-31 | 2005-01-11 | The General Hospital Corporation | Streptavidin-binding peptides and uses thereof |
WO2002038580A1 (en) * | 2000-10-31 | 2002-05-16 | The General Hospital Corporation | Streptavidin-binding peptides and uses thereof |
EP1227321A1 (de) * | 2000-12-28 | 2002-07-31 | Institut für Bioanalytik GmbH | Funktionelle Reinigung von Antigen spezifischen T Lymphozyten durch Peptide-MHC Multimer Färbung |
DE10113776B4 (de) | 2001-03-21 | 2012-08-09 | "Iba Gmbh" | Isoliertes streptavidinbindendes, kompetitiv eluierbares Peptid, dieses umfassendes Fusionspeptid, dafür codierende Nukleinsäure, Expressionsvektor, Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Fusionsproteins und Verfahren zum Nachweis und/oder zur Gewinnung des Fusionsproteins |
US8076452B2 (en) * | 2002-03-01 | 2011-12-13 | Erdmann Volker A | Streptavidin-binding peptide |
WO2003078457A1 (en) * | 2002-03-19 | 2003-09-25 | Cincinnati Children's Hospital Medical Center | MUTEINS OF THE C5a ANAPHYLATOXIN, NUCLEIC ACID MOLECULES ENCODING SUCH MUTEINS, AND PHARMACEUTICAL USES OF MUTEINS OF THE C5a ANAPHYLATOXIN |
EP1517920A2 (de) * | 2002-05-14 | 2005-03-30 | Affitech AS | Produkt |
WO2004013290A2 (en) * | 2002-08-05 | 2004-02-12 | Invitrogen Corporation | Compositions and methods for molecular biology |
US20040067532A1 (en) | 2002-08-12 | 2004-04-08 | Genetastix Corporation | High throughput generation and affinity maturation of humanized antibody |
US20050233473A1 (en) * | 2002-08-16 | 2005-10-20 | Zyomyx, Inc. | Methods and reagents for surface functionalization |
JP4773947B2 (ja) * | 2003-01-09 | 2011-09-14 | マクロジェニクス,インコーポレーテッド | 細菌細胞及び哺乳動物細胞における抗体発現のための二重発現ベクター系 |
AU2004236740A1 (en) * | 2003-05-02 | 2004-11-18 | Sigma-Aldrich Co. | Solid phase cell lysis and capture platform |
US20040248323A1 (en) * | 2003-06-09 | 2004-12-09 | Protometrix, Inc. | Methods for conducting assays for enzyme activity on protein microarrays |
GB0315525D0 (en) * | 2003-07-02 | 2003-08-06 | Nordlund Paer | A method of screening |
WO2006026248A1 (en) | 2004-08-25 | 2006-03-09 | Sigma-Aldrich Co. | Compositions and methods employing zwitterionic detergent combinations |
DE102005002969A1 (de) | 2005-01-21 | 2006-08-03 | Profos Ag | Verfahren zum Nachweis und zur Entfernung von Endotoxin |
US20070141548A1 (en) * | 2005-03-11 | 2007-06-21 | Jorg Kohl | Organ transplant solutions and method for transplanting organs |
DE102005040347A1 (de) * | 2005-08-25 | 2007-03-01 | Profos Ag | Verfahren und Mittel zur Anreicherung, Entfernung und zum Nachweis von Listerien |
WO2007035633A2 (en) * | 2005-09-16 | 2007-03-29 | President & Fellows Of Harvard College | Screening assays and methods |
BRPI0621413A2 (pt) | 2006-02-13 | 2011-12-06 | Agency Science Tech & Res | método de processamento de uma amostra biológica e/ou quìmica |
JP4987885B2 (ja) * | 2006-03-09 | 2012-07-25 | エージェンシー フォー サイエンス,テクノロジー アンド リサーチ | 小滴中で反応を行うための装置及びその使用方法 |
GB2442048B (en) * | 2006-07-25 | 2009-09-30 | Proimmune Ltd | Biotinylated MHC complexes and their uses |
GB2440529B (en) | 2006-08-03 | 2009-05-13 | Proimmune Ltd | MHC Oligomer, Components Therof, And Methods Of Making The Same |
CN101622340A (zh) * | 2006-11-15 | 2010-01-06 | 茵维特罗根戴纳股份公司 | 生物素化合物与支持物可逆结合的方法 |
WO2010120249A1 (en) | 2009-04-17 | 2010-10-21 | Curiox Biosystems Pte Ltd | Use of chemically patterned substrate for liquid handling, chemical and biological reactions |
US9874501B2 (en) | 2006-11-24 | 2018-01-23 | Curiox Biosystems Pte Ltd. | Use of chemically patterned substrate for liquid handling, chemical and biological reactions |
WO2008063135A1 (en) * | 2006-11-24 | 2008-05-29 | Agency For Science, Technology And Research | Apparatus for processing a sample in a liquid droplet and method of using the same |
US20090263870A1 (en) * | 2007-09-10 | 2009-10-22 | Agency For Science, Technology And Research | System and method for amplifying a nucleic acid molecule |
CA2697193C (en) | 2007-09-14 | 2017-06-06 | Adimab, Inc. | Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor |
US8877688B2 (en) | 2007-09-14 | 2014-11-04 | Adimab, Llc | Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor |
WO2013114217A1 (en) | 2012-02-05 | 2013-08-08 | Curiox Biosystems Pte Ltd. | Array plates and methods for making and using same |
US10725020B2 (en) | 2007-11-14 | 2020-07-28 | Curiox Biosystems Pte Ltd. | High throughput miniaturized assay system and methods |
JP5670755B2 (ja) | 2008-03-12 | 2015-02-18 | ザ ロックフェラー ユニバーシティ | 翻訳プロファイリング及び分子表現型解析のための方法及び組成物 |
WO2012011877A2 (en) | 2010-07-23 | 2012-01-26 | Curiox Biosystems Pte Ltd | Apparatus and method for multiple reactions in small volumes |
JP5691278B2 (ja) * | 2010-07-26 | 2015-04-01 | パナソニック株式会社 | 蛋白質固定化用アンカーペプチドを提供する方法 |
EP2527431A1 (de) | 2011-05-26 | 2012-11-28 | bioMérieux S.A. | Neuartiges Listeria-Bakteriophagen-Tailspike-Protein und dessen Verwendungen |
CN107843730B (zh) | 2011-07-18 | 2021-08-20 | Iba生命科学股份有限公司 | 使靶细胞可逆染色的方法 |
CA2850885A1 (en) | 2011-10-17 | 2013-04-25 | Westfaelische Wilhelms-Universitaet Muenster | Assessment of pml risk and methods based thereon |
US10228312B2 (en) | 2012-02-23 | 2019-03-12 | Juno Therapeutics Gmbh | Chromatographic isolation of cells and other complex biological materials |
EP2875359A4 (de) | 2012-03-30 | 2015-08-19 | Charles R Drew University Of Medicine And Science | Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung oder prävention von stoffwechselsyndromerkrankungen |
EP2725358A1 (de) | 2012-10-23 | 2014-04-30 | Miltenyi Biotec GmbH | Freisetzungssystem für Zell-Antikörper-Substrat-Konjugate mit einer Polyethylenglycol-Distanzeinheit |
JP6475630B2 (ja) | 2012-11-16 | 2019-02-27 | イーベーアー ゲーエムベーハー | ストレプトアビジン突然変異タンパク質およびそれらを使用する方法 |
EP2976622B1 (de) * | 2013-03-14 | 2019-11-27 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Proteinstandard |
CN103267841B (zh) * | 2013-05-15 | 2014-03-12 | 湖南农业大学 | 一种利用亲和素结合肽与亲和素结合的原理制备elisa酶标抗原的方法 |
US9557318B2 (en) | 2013-07-09 | 2017-01-31 | Curiox Biosystems Pte Ltd. | Array plates for washing samples |
LU92409B1 (en) | 2014-03-21 | 2015-09-22 | Philipps Universit T Marburg | Means and methods for itaconic acid production |
IL280738B (en) | 2014-04-16 | 2022-07-01 | Juno Therapeutics Gmbh | Methods, kits and device for increasing cell populations |
EP3647412A1 (de) | 2014-04-23 | 2020-05-06 | Juno Therapeutics, Inc. | Verfahren zur isolierung, kultivierung und genetischen manipulation von immunen zellpopulationen zur adoptiven therapie |
US11150239B2 (en) | 2014-04-30 | 2021-10-19 | Iba Lifesciences Gmbh | Method of isolating a target cell |
WO2016166568A1 (en) | 2015-04-16 | 2016-10-20 | Juno Therapeutics Gmbh | Methods, kits and apparatus for expanding a population of cells |
US10545139B2 (en) | 2015-06-16 | 2020-01-28 | Curiox Biosystems Pte Ltd. | Methods and devices for performing biological assays using magnetic components |
EP3349773A4 (de) | 2015-09-14 | 2019-05-01 | Cincinnati Children's Hospital Medical Center | Verfahren und zusammensetzungen zur behandlung der gaucher-krankheit durch modulation des c5a-rezeptors |
BR112018008111A2 (pt) | 2015-10-22 | 2018-11-06 | Juno Therapeutics Gmbh | métodos, kits, agentes e aparelhos para transdução |
MA45489A (fr) | 2015-10-22 | 2018-08-29 | Juno Therapeutics Gmbh | Procédés de culture de cellules, kits et appareil associés |
MA45488A (fr) | 2015-10-22 | 2018-08-29 | Juno Therapeutics Gmbh | Procédés, kits et appareil de culture de cellules |
CN108884164B (zh) | 2016-02-25 | 2022-12-27 | 细胞医学瑞士公司 | 用于免疫疗法的经修饰细胞 |
EP3443123B1 (de) | 2016-04-11 | 2021-08-11 | Board of Regents, The University of Texas System | Verfahren und zusammensetzungen zum nachweis der affinität einzelner t-zellrezeptoren und sequenz |
CA3016411A1 (en) | 2016-04-25 | 2017-11-02 | Iba Gmbh | Streptavidin muteins and methods of using them |
EP3488011A1 (de) | 2016-06-28 | 2019-05-29 | Technische Universität München | Kombination von reversibler und irreversibler zellmarkierung zur analyse der rezeptor-ligand-koff-rate |
US10294454B2 (en) | 2016-08-24 | 2019-05-21 | General Electric Company | Methods and kits for cell activation |
US11517627B2 (en) | 2017-01-20 | 2022-12-06 | Juno Therapeutics Gmbh | Cell surface conjugates and related cell compositions and methods |
IT201700009008A1 (it) * | 2017-01-27 | 2018-07-27 | St Biochimico Italiano Giovanni Lorenzini Spa | Multistep tumor targeting by tagged antibody derivatives and tagged drugs |
CN116693695A (zh) | 2017-02-12 | 2023-09-05 | 百欧恩泰美国公司 | 基于hla的方法和组合物及其用途 |
EP3607580B1 (de) | 2017-04-05 | 2023-05-31 | Curiox Biosystems Pte Ltd. | Verfahren, vorrichtungen und einrichtung zum waschen von proben auf arrayplatten |
MA49288A (fr) | 2017-04-27 | 2020-03-04 | Juno Therapeutics Gmbh | Reactifs particulaires oligomères et leurs méthodes d'utilisation |
WO2019027850A1 (en) | 2017-07-29 | 2019-02-07 | Juno Therapeutics, Inc. | CELL EXPANSION REAGENTS EXPRESSING RECOMBINANT RECEPTORS |
BR112020011215A2 (pt) | 2017-12-08 | 2020-11-17 | Juno Therapeutics Inc | processo para a produção de uma composição de células t modificadas |
MX2021001523A (es) | 2018-08-09 | 2021-05-27 | Juno Therapeutics Inc | Procesos para generar células modificadas y composiciones de las mismas. |
US20210246189A1 (en) | 2018-09-03 | 2021-08-12 | Technische Universitaet Muenchen | A double peptide tag combining reversibility and flexible functionalization |
MA53612A (fr) | 2018-09-11 | 2021-09-15 | Juno Therapeutics Inc | Procédés d'analyse par spectrométrie de masse de compositions cellulaires modifiées |
KR20210098450A (ko) | 2018-10-31 | 2021-08-10 | 주노 테라퓨틱스 게엠베하 | 세포의 선택 및 자극을 위한 방법 및 이를 위한 장치 |
BR112021008738A2 (pt) | 2018-11-06 | 2021-11-03 | Juno Therapeutics Inc | Processo para produzir células t geneticamente construídas |
EP3899954A4 (de) | 2018-12-21 | 2022-09-14 | BioNTech US Inc. | Verfahren und systeme zur vorhersage von hla-klasse-ii-spezifischen epitopen und charakterisierung von cd4+-t-zellen |
EP3980530A1 (de) | 2019-06-07 | 2022-04-13 | Juno Therapeutics, Inc. | Automatisierte t-zell-kultur |
AU2020377043A1 (en) | 2019-10-30 | 2022-06-02 | Juno Therapeutics Gmbh | Cell selection and/or stimulation devices and methods of use |
JP2023512209A (ja) | 2020-01-28 | 2023-03-24 | ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド | T細胞形質導入のための方法 |
MX2022009832A (es) | 2020-02-12 | 2023-02-14 | Juno Therapeutics Inc | Composiciones de celulas t de receptor de antigeno quimerico dirigido a cd19 y usos de las mismas. |
US20230087953A1 (en) | 2020-02-12 | 2023-03-23 | Juno Therapeutics, Inc. | Bcma-directed chimeric antigen receptor t cell compositions and methods and uses thereof |
CN115776987A (zh) | 2020-03-31 | 2023-03-10 | 瑞佩尔托利免疫医药股份有限公司 | 可条码化可交换肽-mhc多聚体文库 |
WO2021231661A2 (en) | 2020-05-13 | 2021-11-18 | Juno Therapeutics, Inc. | Process for producing donor-batched cells expressing a recombinant receptor |
WO2022087154A1 (en) | 2020-10-20 | 2022-04-28 | Repertoire Immune Medicines, Inc. | Mhc class ii peptide multimers and uses thereof |
WO2022098787A1 (en) | 2020-11-04 | 2022-05-12 | Juno Therapeutics, Inc. | Cells expressing a chimeric receptor from a modified invariant cd3 immunoglobulin superfamily chain locus and related polynucleotides and methods |
WO2022234009A2 (en) | 2021-05-06 | 2022-11-10 | Juno Therapeutics Gmbh | Methods for stimulating and transducing t cells |
GB202107222D0 (en) | 2021-05-20 | 2021-07-07 | Quell Therapeutics Ltd | Method of treg isolation |
WO2023147510A1 (en) | 2022-01-28 | 2023-08-03 | Juno Therapeutics, Inc. | Chromatography arrays and related methods and kits |
WO2023213969A1 (en) | 2022-05-05 | 2023-11-09 | Juno Therapeutics Gmbh | Viral-binding protein and related reagents, articles, and methods of use |
WO2023230581A1 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | Celgene Corporation | Methods of manufacturing t cell therapies |
WO2024100604A1 (en) | 2022-11-09 | 2024-05-16 | Juno Therapeutics Gmbh | Methods for manufacturing engineered immune cells |
GB202307533D0 (en) | 2023-05-19 | 2023-07-05 | Quell Therapeutics Ltd | Method of treg isolation |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9220808D0 (en) * | 1992-10-02 | 1992-11-18 | Medical Res Council | Antibody genes |
-
1992
- 1992-11-03 DE DE4237113A patent/DE4237113B4/de not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-11-01 GB GB9322501A patent/GB2272698B/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-11-02 JP JP27416393A patent/JP3865792B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-11-03 US US08/148,675 patent/US5506121A/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-11-03 FR FR9313066A patent/FR2697525B1/fr not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0835934A3 (de) * | 1996-10-10 | 1999-09-01 | Institut für Bioanalytik GmbH | Streptavidinmuteine |
EP1061128A1 (de) * | 1999-06-18 | 2000-12-20 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung biochemischer Reaktionen mit hohem Durchsatz |
WO2000078444A2 (de) * | 1999-06-18 | 2000-12-28 | Roche Diagnostics Gmbh | Verfahren und vorrichtung zur durchführung biochemischer reaktionen mit hohem durchsatz |
WO2000078444A3 (de) * | 1999-06-18 | 2001-04-26 | Roche Diagnostics Gmbh | Verfahren und vorrichtung zur durchführung biochemischer reaktionen mit hohem durchsatz |
US7863015B2 (en) | 1999-06-18 | 2011-01-04 | Roche Diagnostics Gmbh | Method and device for carrying out biochemical reactions with a high throughput |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB2272698B (en) | 1996-07-10 |
FR2697525B1 (fr) | 1997-04-04 |
FR2697525A1 (fr) | 1994-05-06 |
JP3865792B2 (ja) | 2007-01-10 |
GB2272698A (en) | 1994-05-25 |
US5506121A (en) | 1996-04-09 |
JPH0776596A (ja) | 1995-03-20 |
GB9322501D0 (en) | 1993-12-22 |
DE4237113B4 (de) | 2006-10-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE4237113B4 (de) | Peptide und deren Fusionsproteine, Expressionsvektor und Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins | |
DE3050722C2 (de) | ||
EP0835934B1 (de) | Streptavidinmuteine | |
EP0307592B1 (de) | Varianten des pankreatischen Rinder-Trypsininhibitors, deren Herstellung und Verwendung | |
DE3390105C2 (de) | ||
DE69332740T2 (de) | Kationische peptide und verfahren zu deren herstellung | |
DD212403A5 (de) | Verfahren zur synthetisierung von rinderwachstumshormon | |
DE3855084T2 (de) | Herstellung und Reinigung eines Proteins, das mit einem Bindungsprotein fusioniert ist | |
WO2000075308A1 (de) | Muteine des bilin-bindungsproteins | |
WO1995032992A1 (de) | Synthetische peptidanaloge des lungenoberflächenproteins sp-c | |
DD158797A5 (de) | Verfahren zur synthetisierung eines ausgewaehlten proteins oder polypeptids | |
DE3901681A1 (de) | Signalpeptid fuer die sekretion von peptiden in escherichia coli, verfahren zu seiner gewinnung und seine verwendung | |
DE3390106T1 (de) | Ein DNA-Fragment, welches eine Signal-DNA-Sequenz enthält, ein Verfahren zu seiner Herstellung und ein damit transformierter Mikroorganismus | |
DE3751727T2 (de) | Polypeptide zur verwendung bei der diagnose von mycoplasmainfektionen bei schweinen, sowie rekombinant-dns-verfahren zur herstellung derselben | |
DE3332264A1 (de) | Plasmidvektoren zur expression in bacillus subtilis und verfahren zu ihrer herstellung | |
WO1993001287A1 (de) | Rekombinante antikörper an der oberfläche von e.coli | |
EP0292763A2 (de) | Gentechnologisches Verfahren zur Herstellung von Angiogeninen | |
EP0852623B1 (de) | Nucleinsäure-moleküle codierend proteine, die die adhäsion von neisseria-zellen an humane zellen vermitteln | |
DE3735379A1 (de) | Rna-polymerase-gen, verfahren zu seiner herstellung und mikroorganismus mit diesem gen | |
EP0393039B1 (en) | Process for producing peptides by specific cleavage of fusion proteins with collagenases obtained by genetic engineering | |
DE3226515A1 (de) | Expressionsvektoren | |
DE69104012T2 (de) | Rekombiniebares Hepatitis-Delta-Antigen, Verfahren zu seiner Reinigung und Verwendung. | |
DE4024187A1 (de) | Oligonucleotid-gerichtete mutagenese von plasmiden | |
DE69906729T2 (de) | Zusammensetzung und methode zur behandlung von pseudomonas aeruginosa infektionen | |
EP0198415B1 (de) | Veränderung der DNA-Sequenz zwischen Shine-Dalgarno-Sequenz und Startcodon des trp-Operons zur Steigerung der Proteinexpression |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8180 | Miscellaneous part 1 |
Free format text: DER ANMELDER IST ZU AENDERN IN: INSTITUT FUER BIOANALYTIK GGMBH, 3400 GOETTINGEN, DE |
|
8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: INSTITUT FUER BIOANALYTIK GGMBH, 37079 GOETTINGEN, |
|
8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: INSTITUT FUER BIOANALYTIK GMBH GOETTINGEN, 37079 G |
|
8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: ""IBA GMBH"", 37079 GOETTINGEN, DE |
|
8363 | Opposition against the patent | ||
8368 | Opposition refused due to inadmissibility | ||
R071 | Expiry of right | ||
R071 | Expiry of right |