DD158797A5

DD158797A5 - Verfahren zur synthetisierung eines ausgewaehlten proteins oder polypeptids

Info

Publication number: DD158797A5
Application number: DD81229149A
Authority: DD
Inventors: Walter Gilbert; Karen Talmadge
Original assignee: Harvard College
Priority date: 1980-04-11
Filing date: 1981-04-10
Publication date: 1983-02-02
Also published as: JPH0773504B2; PT72834A; IL62614A0; KR830005355A; DK161681A; EP0038182A2; AU531566B2; DE3176493D1; NZ196768A; EP0038182B1; ES501196A0; ATE30336T1; ZA812382B; EP0038182B2; US4338397A; GR74459B; EP0038182A3; AU6935481A; PH18603A; BR8102164A

Abstract

Es wird eine Methode zur Synthetisierung eines voll entwickelten Proteins oder Polypeptids innerhalb eines Bakterienwirtes und die Sekretion durch die Membran des Wirtes zur Verfuegung gestellt. Die Methode umfasst: a) Spaltung eines Cloningvehikels zur Bildung einer Spaltungsstelle nach einem Promotor von entweder 1) einem Bakterien- oder Phagengen innerhalb des Chloningvehikels oder 2) einem DNA-Fragment des Bakterien- oder Phagengens, b) Bildung eines Hybridgens durch Einfuegen eines nichtbakteriellen DNA-Fragmentes, das fuer einen Vorlaeufer des ausgewaehlten Proteins oder Polypeptids, einschliesslich der Signalsequenz des ausgewaehlten Proteins oder Polypeptids kodiert, in die Spaltungsstelle, c) Transformieren des Wirtes mit dem Cloningvehikel und anschliessend d) Zuechten des transformierten Wirtes zur Ausscheidung des ausgewaehlten Proteins oder Polypeptids. Durch diese Methode koennen voll entwickelte Polypeptide erzeugt werden, die frei von Signalsequenzen oder anderen chemischen Substituenten wie einem f-met an den Proteinen oder Polypeptiden sind.

Description

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Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft allgemein eine Methode für die Synthetisierung eines ausgewählten Proteins oder Polypeptide innerhalb eines Bakterienwirtes und die Ausscheidung durch die Membran des Wirtes. Das Protein oder Polypeptid kann zum Beispiel ein eukaryotisches Zellprotein, ζ·Β.Proinsulin, Serumalbumin, Humanwachstumshormon, Parathyroidhormon und/oder Interferon sein· Die Erfindung betrifft vor allem eine Methode zur Gewinnung eines voll entwickelten Proteins oder Polypeptide von einem Bakterienwirt, wodurch die Notwendigkeit ausgeschaltet wird, daß das Protein oder Polypeptid weiter zur Entfernung der Signalsequenz oder anderer chemischer Substituenten wie eines f-met (d.h.· der Formaldehydgruppe an seiner ersten Methioningruppe), die an dem Protein- oder Pplypeptidvorläufer in der von dem Bakterienwirt synthetisierten Form vorhanden sind, behandelt werden muß» .

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen;

Aus dem Spanischen Patent 481·362 und aus Yilla-Komaroff, u.a·, P.H.A.S,, 22» 372? - 3731 (1978) ist bekannt, daß ein ausgewähltes Protein oder Polypeptid innerhalb eines Bakterienwirtes synthetisiert und durch die Membran des Wirtes ausgeschieden werden kann, und zwar durch:

Spaltung eines Cloningvehikles innerhalb seines Bakteriengens, das für ein extrazelluläres oder periplasmisches

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Trägerprotein oder -polypeptid kodiert;

Bildung eines Eybridgens durch. Einfügen eines nicht-bakteriellen DHA-Fragmentes, das für das ausgewählte Protein oder Polypeptid kodiert, in die Spaltungssteile;

Transformieren des-Wirtes .mit' dem Oloningvehikelj und anschließend Züchten des transformierten Wirtes zur Ausscheidung des ausgewählten Proteins ader Polypeptide·

Das Problem bei den mit Hilfe dieser Methode erzeugten ausgewählten Proteinen oder Polypeptiden besteht darin, daß sie als verschmolzene Proteine oder Polypeptide gewonnen werden - wobei die ausgewählten Proteine oder Polypeptide mit dem Bakterienträgerprotein oder -polypeptid verschmolzen sind« Infolgedessen sind zusätzliche Schritte zur Abspaltung des ausgewählten Proteins oder Polypeptide von dem Bakterienträgerprotein oder -polypeptid erforderlich, um das ausgewählte Protein oder Polypeptid frei von Bakterienträgerprotein oder -polypeptid gewinnen zu können·

Bine vorgeschlagene Lösung für das oben genannte Problem betraf die Ausschaltung des verschmolzenen Bakterienträgerproteins oder -polypeptids, indem ein Oodon für eine ungewöhnliche Aminosäure direkt vor dem nicht-bakteriellen DNA-Fragment für das ausgewählte Protein oder Polypeptid geclont wurde, und das ausgewählte Protein oder Polypeptid in der von dem transformierten Wirt erzeugten Form der chemischen Spaltung der ungev-röhniichen Aminosäure unterzogen wurde, Itakura, u.a., Science 198, 1056-

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1063 O977)· Aber diese Methode, die die zusätzlichen Schritte der Gewinnung des ausgewählten Proteins oder Polypeptide frei von der ungewöhnlichen Aminosäure erfordert, kann nicht zur Erzeugung eines ausgewählten Proteins oder Polypeptide, das die ungewöhnliche Aminosäure enthält, angewandt werden. Der Grund dafür ist, daß ein derartiges Protein oder Polypeptid durch die chemische Spaltung der ungewöhnlichen Aminosäure zerstört werden würde·

Eine andere Lösung, die für das aufgezeigte Problem vorgeschlagen worden ist, sieht das Zurückschneiden der DKA des Bakteriengens vor, so daß sich das nicht-bakterielle DHA-Fragment unmittelbar hinter dem !Eranslations-Startsignal (ATG) der Bakterlen-DHA befindet· Jedoch wird durch diese Methode das ausgewählte Protein oder Polypeptid in Bakterienwirten mit einem f-met erzeugt, so daß weitere Schritte zur einwandfreien Gewinnung des ausgewählten voll entwickelten Proteins oder Polypeptide erforderlich werden·

Ziel der Erfindung;'

Ziel der Erfindung ist es, die vorstehend aufgezeigten Probleme zu lösen·

Darlesung des Wesens der Erfindung:

Zur Lösung des oben genannten Problems wird erfindungsgemäß, eine Methode zur Synthetisierung eines ausgewählten Proteins oder Polypeptide innerhalb eines Bakterienwirtes

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und der Sekretion durch die Membran des Wirtes zur Verfügung gestellt, die die Spaltung eines Cloningvehikels zur Bildung einer Spaltungsstelle, Bildung eines Hybridgens durch Einfügen eines nicht-bakteriellen DNA-Fragmentes, das für ein ausgewähltes Protein oder Polypeptid kodiert, in die Spaltungsstelle; Transformieren des Wirtes mit dem Hybridgenj und Züchten des transformierten Wirtes zur Ausscheidung des ausgewählten !Proteins oder Polypeptids umfaßt, gekennzeichnet dadurch, daß das Cloningvehikel zur Bildung einer Spaltungsstelle nach einem Promotor eines Bakteriengens oder eines Phagengens oder einem DNA-Fragment davon innerhalb des Cloningvehikels gespalten wird, wobei das nicht-bakterielle DNA-Fragment für einen Vorläufer des ausgewählten Proteins oder Po lypeptids kodiert und eine Signalsequenz des ausgewählten Proteins oder Polypeptide enthält, wobei der transformierte Wirt das ausgewählte Protein oder Polypeptid als das voll entwickelte Protein oder Polypeptid verwirklicht· ' " ; . ' · ' : -.Τ ; . .";

Mit Hilfe dieser Methode können voll entwickelte Proteine oder Polypeptide erzeugt werden, die frei von Signalsequenzen und anderen chemischen Substituenten wie einem f-met an den Proteinen oder Polypeptiden sind«, In folgedessen können die Proteine oder Polypeptide entweder aus dem periplasmischen Raum der Bakterienwirtszelle oder aus dem Medium, in dem der Wirt gezüchtet wird, in Abhängigkeit von der Größe der Proteine oder Polypeptide gewonnen 'werden« .. .' ' — , - ' ·': ' . "' ^;:·' " .:: '' . ..

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Ausf uhmngsbeispiel s

Figur 1 zeigt schematisch die Methode, die in den. Beispielen für die Insertion eines DNA-Fragmentes, das für Hatten-Präproinsulin kodiert, in ein von dem Plasmid pBR322 erzeugtes und ein DNA-Fragment von S· eoli Penicillinasegen enthaltendes Clcningvehikel angewandt wird·

Figur 2 zeigt die vollständige Basensequenz für ein DNA-Fragment (pKT 241) des B. coli Penicillinasegens nach seiner EcoRI-Eestriktionsstelle, das an seinem 3*-Snde eine eingefügte Pst-Restriktionssteile enthält (gezeigt wie sie nach Zerschneiden mit Pstl erscheint)· Figur 2 zeigt gleichfalls die entsprechende Aminosäuresequenz, für die dieses DNA-Fragment kodiert» Der am genauesten identifizierbare Promotor für dieses DNA-Fragment befindet sich in der Hegion 14 bis 20 nucleotide vor seinem Translations-Startsignal, Sutcliffe, PJ5T.A.S,, J^, 3737 - 37^1 (1978)* In den Beispielen war das 3'-^nde dieses Ξ. coli DKA-Fragmentes (pET 241) an die Signal-DNA-Sequenz des DNA-Fragmentes (19) für Hatten-Präproinsulin von Figur 4 angefügt·

Figur 3 zeigt die vollständige Basensequenz für ein anderes DNA-Fragment (pED 218) des B, coli Penicillinasegens nach seiner EcoHI-Restriktionssteile, das an seinem 3*- eine eingefügte Pst-Restriktionsstelle enthält (dargestellt wie sie nach Zerschneiden mit Pstl auftritt)· Figur 3 zeigt ebenfalls die entsprechende Aminosäuresequenz, für die dieses DNÄ-Fragment kodiert· Der am genauesten identifizierbars Promotor für dieses DNA-Fragment befindet sich in der Eegion 14 bis 20 Nucleotide vor seinem Sranslations-Starfcsignal, Sutcliffe, supra« In den Beispielen war das 3*-Ende

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dieses Β· £oli DNA-Fragmentes (pKT 218) an die Signal-DNA-Sequenz des DNA-Fragmentes (CB6) für Eatten-Präproinsulin von Figur 5 angefügt·

Figur 4· zeigt die vollständige Basensequenz für die Signal-DNA-Sequenz eines DNA-Fragmentes (19) fü£ Batten-Präproinsulin, die an ihrem 5*-Ende eine eingefügte Pst-Restriktionsstelle enthält (dargestellt, wie sie nach dem Zerschneiden mit Pstl erscheint)· Figur 4 zeigt gleichfalls die entsprechende Aminosäuresequenz, für die die Signal-DNA-Sequenz kodiert· Die Signal-DHA-Sequenz reicht von der -21 Position bis zur -1 Position dieses DHA-Fragmentes und die Struktur-DHA-Sequenz beginnt an der +1 Position dieses DHA-Fragmentes· In den Beispielen war das 5^f-Snde dieses DNA-Fragmentes (19) ^ür Hatten-Präproinsulin an das E. coli DHA-Fragment (pKT 241) von Figur 2 angefügt«

Figur 5 zeigt die vollständige Basensequenz für die Signal-DHA-^equenz eines anderen DNA-Fragmentes (CB6) für Hatten-Präproinsulin, die an ihrem 5^f-Ende eine eingefügte Psjb-Eestriktionsstelle enthält (dargestellt, wie sie nach dem Zerschneiden mit Pstl erscheint)· Diese Figur zeigt gleichfalls die entsprechende Aminosäuresequenz, für die die Signal-DNA-Sequenz kodiert· Die Signal-DNA-Sequenz reicht -von der -21-Position bis zur -1 Position dieses DNA-Fragmentes für Ratten-Präpro insulin, und die Struktur-DNA-Sequenz beginnt an der +1 Position dieses DNA-Fragmentes· In den Beispielen war das 5'-Ende dieses DNA-Fragmentes (GB6) für Hatten-Präproinsulin an das E· coli DNA-Fragment (pEE 218) von Figur 3 angefügte

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In Verbindung mit dieser ausführlichen Beschreibung gelten folgende Definitionen:

Protein - Ein Polypeptid, das eine lineare Eeihe von mehr als fünfzig Aminosäuren enthält, z.B. Proinsulin, Serumalbumin, Humanwachstumshormon, Parathyroidhormon und Interferon·

Polypeptid - Bine lineare Reihe von Aminosäuren, die miteinander durch Peptidbindungen zwischen den Amino- und Carboxylgruppen benachbarter Aminosäuren verbunden sind.

Vorläufer eines Proteins oder Polypeptids - Ein innerhalb einer Wirtszelle synthetisiertes Polypeptid oder Protein mit einer Signalsequenz, z„B· Präproinsulin, Präserumalbumin, Prähunian-Wachstumshormon, Präparathyroidhormon und Präinterferon· Erfindungsgemäß wird ein voll entwickeltes Polypeptid oder Protein durch die Membran einer Wirtszelle mit dem damit verbundenen Verlust oder Abklemmender Signalsequenz seines Vorläufers ausgeschieden»

Nucleotid - Eine Monomereinheit von DHA oder HUA, die aus einer Zuckerkomponente (P^ntose), einem Phosphat und einer stickstoffhaltigen heterozyklischen Base besteht· Die Base ist über den Glycosid-Kohlenstoff (1*-Kohlenstoff der Pentose) mit der Zuckerkomponente verknüpft, und diese Kombination von Base und Zucker ist ein Hucleosid. Die Base kennzeichnet das Nucleotid. Die vier DNA-Basen sind Adenin ("A"), Guanin("G"), Cytosin("C") und Thymin Die vier BHA-Basen sind A, G, C und Uracil ("ü")»

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DKA-Se quenz - Eine lineare Reihe von Nucleotiden, die miteinander durch Phosphodiesterbindungen zwischen den 3¹- und 5'-Kohlenstoffen benachbarter Pentosen verbunden

Codon — Sine DNA-Sequenz von drei Nucleotiden (ein Triplett), das durch Messenger-REEA ("rnRNA¹')» 'eine'Aminosäure,'· ein Translations-Startsignal oder ein Translations-Terminationssignal kodiert. Zum Beispiel kodieren die Nucleotid-Tripletts TTA, TTG, CTT, CTC, CTA und CTG für das Aminosäureleucin ("Leu")» TAG, TAA und TGA sind Translations-Stoppsignale und ATG ist ein Translations-Startsignal·

Plasmid - Sine nicht-chromosome doppelsträngige DHA-Sequenz, die ein intaktes "Heplicon" enthält, so daß das Plasmid in einer Wirtszelle repliziert wird· Wenn das Plastnid in einem einzelligen Wirfcsorganismus untergebracht wird, werden die Charakteristika dieses Organismus infolge der DKA des Plasmids verändert oder transformiert· Zum Beispiel transformiert ein das Gen für Tetracyclin-Resistenz (Teti ) tragendes Plasmid eine Wirtszelle, die vorher gegenüber Tetracyclin sensitiv war, in eine, die diesem gegenüber resistent ist· Eine durch ein Plasmid transformierte Wirtszelle wird als "Transformant¹¹ bezeichnet·

Phas;e oder Bakteriophage - Bakterienviren, von denen viele in eine Proteinhülle oder Coat ("Capsid") eingekapselte DNA-Sequenzen enthalten·

Cloningvehikel - Ein Plasmid, eine Phagen-DNA oder eine andere DHA-Sequenz, die sich in einer Wirtszelle replizie-

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ren kann, gekennzeichnet durch eine oder eine geringe Anzahl von Endonaclease-Erkennungssteilen, an denen ihre DM-Sequenz in einer vorb.es timmbare η Weise ohne damit verbundenen Verlust einer wichtigen biologischen Funktion der DHA zerschnitten werden kann, ζ·Β· Eeplikation, Erzeugung eines Coatproteins oder Verlust von Promotor- oder Bindestellen, und das einen Markierer enthält, der für die Identifikation von transformierten Zellen geeignet ist, z«B. Tetracyclin-Resistenz oder Ampicillin-Hesistenz· Ein Cloningvehikel ist auch als Vektor bekannt»

Wirt - Ein Organismus, der nach Transformation durch ein Oloningvehikel das Cloningvehikel in die Lage zum Replizieren und zur Ausübung seiner anderen biologischen Punktionen versetzt, ζ·Β_β Erzeugung von Polypeptiden oder Proteinen durch Expression der Gene eines Plasmids»

Expression - Der Prozeß, den ein Gen zur Erzeugung eines Polypeptide oder Proteins durchläuft. Es handelt sich um eine Kombination von Transcription und Translation·

Transcription - Der Prozeß der Erzeugung von mRHA von einem Gen·

Translation - Der Prozeß der Erzeugung eines Proteins oder Polypeptide von mMA·

Promotor — Die Region der DHA eines Gens, an die sich RUA-Polymerase bindet und Tränscription initiiert· Ein Pro-

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motor befindet sich vor der Ribosom-Bindestelle des Gens·

Kibosom-Bindestalle - Die Eegion der DNA eines Gens, die für eine Stelle an mBNA kodiert, die die Bindung von mBNA an das Ribosom unterstützt, so daß die Translation beginnen kann·"* Die Hibosota-Bindestelle befindet sich, hinter dem Promotor und vor dem. Translations-Startsignal des Gens·

Gen" -»Bine DNA-Sequenz, die als Template für mRNA eine Sequenz von Aminosäuren kodiert, die für ein spezifisches Polypeptid oder Protein charakteristisch sind_e Bin Gen enthält einen Promotor, eine Bibosom-Bindestelle, ein Translations-Startsignal und eine Struktur-DNA-Sequenz. Im PaI-Ie eines ausgeschiedenen Proteins oder Polypeptides weist das Gen auch eine Signal-DNA-Sequenz auf·

Expressions-Kontroll-Seq uenz - Eine DNA-Sequenz in einem Cloningvehikel, die die Expression von Genen des Cloningvehikels kontrolliert und reguliert, wenn sie operativ mit diesen Genen verknüpft ist·

Signal-DNA-Sequenz - Eine DNA-Sequenz innerhalb eines Gens für ein Polypeptid oder Protein, die als Template für mRNA eine Sequenz hydrophober Aminosäuren am Aminoterminus des Polypeptides oder Proteins kodiert, d.h· eine "Signalsequenz" oder "hydrophobe Führersequenz" des Polypeptide oder Proteins. Eine Signal-DNA-Sequenz befindet sich in einem Gen für ein Polypeptid oder Protein unmittelbar vor der Struktur-DNA-Sequenz des Gens und hinter dem Transla-

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tions-Startsignal (ATG) des Gens· Sine Signal-DNA-Sequenz kodiert für die Signalsequenz eines Polypeptids oder Proteins, die (Signalsequenz) charakteristisch für einen Torläufer des Polypeptids oder Proteins ist· Man nimmt an, daß nur ein Teil einer Signalsequenz eines Vorläufers eines Proteins oder Polypeptids für den Vorlaufer des Proteins oder Polypeptids, das durch, die Zellmembran eines Wirtes transportiert werden soll, und für das Auftreten des einwandfreien Abklemmens der Signalsequenz des Vorläufers zur Bildung des voll entwickelten Proteins oder Polypeptids während der Sekretion wichtig ist· Somit wird mit dem Ausdruck "Signal-DEA-Sequenz" die DNA-Sequenz bezeichnet, die für den wesentlichen Abschnitt der Signalsequenz eines Vorläufers eines Proteins oder Polypeptids, das innerhalb der Wirtszelle erzeugt wurde, kodiert·

Struktur-DNA-Bequenz - Eine DNA-Sequenz innerhalb eines Gens, die als Template für mBNA eine Sequenz von Aminosäuren kodiert, die für ein spezifisches voll entwickeltes Polypept id oder Protein charakteristisch ist, d«h· die aktive Form des Polypeptids oder Proteins·

In Übereinstimmung mit der Erfindung kann jedes Gloningvehikel, das ein Bakterien- oder Phagengen für ein Protein, ein Polypeptid oder ein ENA-Molekül oder ein DNA-ITragment eines solchen Bakterien- oder Phagengens, einschließlich eines Promotors des Bakterien- oder Phagengens enthält, und das zur Bildung einer Spaltungsstelle nach dem Promotor gespalten werden kann, verwendet werden· Vorzugsweise enthält das Gloningvehikel ein Bakterien- oder Phagengen oder ein DNA-Fragment davon, das für ein extra-

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zelluläres oder periplasmisches Protein oder Polypeptid kodiert (d,h· ein Protein oder Polypeptid, das normalerweise aus einer Wirtszelle ausgeschieden wird)· Beispiele für ein solches Gen umfassen das Gen für antibiofeische Resistenz, ZeB* das Gen für Penicillin-Resistenz (d,h« Penicillinase), das Gen für Chloramphenicol-Resistenz und das Gen für Tetracyclin-Resistenz, das Gen für alkalische Phosphatase und das Gen für Bakterien-Ribonuclease· Es können aber auch Cloningvehikel, die andere Bakterienoder Phagengene oder DBA-Fragmente davon enthalten, erfolgreich angewandt werden, wie ζ·Β· die Phagengene für den Lactose-Operon-Promotor, Beta-^Galactosidase (vorausgesetzt sie ist innerhalb ihrer allerersten Aminosäuren gespalten) und das Phagen-Lambda P-r, das an einer Phage oder einem Plasmid sitzt»

Außerdem kann jedes DM-Fragment eines nicht-bakteriellen und nicht-phagen Gens ("nicht-bakterielles DNA-Fragment") in die Spaltungsstelle im CIoningvehike1 zur Bildung eines Hybridgens eingefügt werden, unter der Voraussetzung, daß das nicht-bakterielle DNA-Fragments .

1) die vollständige Struktur-DITA-Sequenz ihres Gens für das ausgewählte Protein oder Polypeptid und die Signal-DHA-Sequenz ihres Gens enthält, so daß das nichtbakterielle DHA-Fragment für einen Vorläufer des ausgewählten Proteins oder Polypeptide, einschließlich der Signalsequenz des Vorläufers, kodiert? und

2) das Eranslations-Startsignal seines Gens enthält und vorausgesetzt, daß sich die Spaltungsstelle in dem Cloningvehikel vor oder innerhalb des Translations-

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Startsignals des Bakterien- oder Phagengens oder des DNA-Fragments davon befindet.

Vorzugsweise enthält das verwendete nicht-bakterielle DNA-Fragment die vollständige DNA-Sequenz seines Gens, die für einen Vorläufer eines !Proteins oder Polypeptide, das normalerweise aus einer Wirtszelle ausgeschieden wird, kodiert· Zu den vorzugsweise verwendeten nicht-bakteriellen DNA-Fragmenten sind die zu zählen, die für einen Vorläufer eines eukaryotischen Zellproteins kodieren, wie Präproinsulin, Präserumalbumin, Prähuman-Wachstumshormon, Präparathyroidhormon und Präinterferon· Bs können aber auch andere nicht-bakterielle DNA-Fragmente verwendet werden, ζ·Β· die für Vorläufer von Virusproteinen kodierenden. Vorzugsweise enthält das verwendete nichtbakterielle DM-Fragment auch das Btoppsignal seines Gens,

Die spezifische Lage der Spaltungsstelle im Cloningvehikel, in die das nicht-bakterielle DNA-Fragment eingefügt wird, ist für die Erzeugung des ausgewählten voll entwickelten Proteins oder Polypeptide nicht kritisch· Aus diesem Grund kann die Spaltungsstelle irgendwo im Cloningvehikel liegen: 1) hinter dem Promotor des Bakterienoder Phagengens oder dem DNA-Fragment davon, vorzugsweise hinter der Ribosoat-Bindestelle des Bakterien- oder Phagengens oder des DNA-Fragments davon? und 2) vor dem Ende der Struktur—DNA-Sequenz des Bakterien— oder Phagengens oder des DITA-Fragments davon — unter der Voraussetzung, daß das Bakterien- oder Phagengen oder das DNA-Fragment davon für ©in Protein oder Polypeptid kodiert, das norma« !erweise aus einer Wirtszelle ausgeschieden wird. Bei ei-

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nem Bakterien- oder Phagengen oder einem DNA-Fragment davon, das für ein normalerweise nicht aus einer Wirtszelle ausgeschiedenes Protein oder Polypeptid kodiert, kann die Spaltungsstelle vor dem oder innerhalb des Translations-Startsignals des Gens oder des DNA-Fragments davon oder kurz dahinter liegen, d»iu nicht mehr als etwa 40 nucleotide hinter dem Translations-Startsignal des Gens oder dessen DNA-Fragments. Bei einem Bakterien- oder Phagengen oder einem DNA-Fragment davon, das für ein normalerweise aus einer Wirtszelle ausgeschieden nes Protein oder Polypeptid kodiert, kann die Spaltungsstelle vor dem, innerhalb des oder hinter dem, vorzugsweise nicht mehr als etwa 60 nucleotide hinter dem Translations-Startsignal des Gens oder dessen DM-Fragment liegen (d„fcu die Spaltungsstelle läßt vorzugsweise nicht mehr als etwa 20 Aminosäuren der Signalsequenz des Bakterien- oder Phagenproteins oder -polypeptide zurück)· Im allgemeinen ist es ganz besonders günstig, wenn sich die Spaltungsstelle innerhalb des Translations-Startsignals des Bakterien- oder Phagengens oder des DNA-Fragments davon oder nicht mehr als etwa 40 Nucleotide dahinter befindet - unabhängig davon, ob das Bakterien- oder-Phagengen des das DNA-Fragment davon für ein normalerweise ausgeschiedenes oder normalerweise nicht ausgeschiedenes Protein oder Polypeptid kodiert·

Srfindungsgemäß wird das nicht-bakterielle DNA-Fragment in die Spaltungsstelle hinter dem Promotor entweder des Bakterien- oder Phagengens oder des DNA-Fragments davon eingefügt, wodurch ein Hybridgen entsteht, das der Reihe nach aufweist den Promotor des Bakterien- oder Phagengens oder des DNA-Fragments davon; ein Translations-Startsig-

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nal (entweder von dem Bakterien- oder Phägengen oder dem DHA-Fragment davon oder von dem nicht-bakteriellen DlTA-Fragment); die Signal-DHA-Sequenz des nicht-bakteriellen DIIi-Fr agme nt sj and die Struktiir-DFA-Sequenz des nichtbakteriellen DHA-Fragments. Vorzugsweise wird für die wirksamste Expression des ausgewählten Proteins oder PoIypeptids in dem Hybridgen zwischen dem Promotor und dem Translations-Startsignal eine Ribosom-Bindestelle (entweder von dem Bakterien- oder Phägengen oder dem DHA-Fragment davon oder dem nicht-bakteriellen DNA-Fragment) vorgesehen· Außerdem sollte, wenn das nicht-bakterielle DM-Fragment hinter dem Translations-Startsignal eines Bakterien- oder Phagengens oder eines DBA-Fragments davon eingefügt wird, das Orientierungssystem (reading frame) des nicht-bakteriellen DNA-Fragmentes in dem durch das Translations-Startsignal des Bakterien- oder Phagengens oder des DHA-Fragments davon definierten Orientierungssystem (reading frame) liegen.

Ein ausgewähltes Protein oder Polypeptid kann in hohen Ausbeuten aus einem mit einem erfindungsgemäßen Cloningvehikel transformierten Bakterienwirt ausgeschieden werden, ohne daß eine hydrophobe Führersequenz oder irgendwelche anderen chemischen Substituenten wie ein f-met am ausgeschiedenen Protein oder Polypeptid vorhanden sind. Die hydrophobe Führersequenz und irgendwelche anderen chemischen Substituenten, die am Vorläufer des ausgev/ählten Proteins oder Polypeptide nach der Synthese innerhalb des Wirtes vorhanden sind, werden von dem ausgewählten Protein oder Polypeptid abgespalten. Man nimmt an, daß das während der Ausscheidung aus dem Wirt geschieht»

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Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung noch besser erläutern· Alle Temperaturen sind in Grad Celsius (°0) und alle Prozentangaben (%) auf das Gewicht bezogen angegeben. Alle Losungen sind wäßrig, wenn nichts anderes ausdrücklich angeführt wird· "ug^rt steht für Hikrogramm, und "ul" für Mikroliter.

In den Beispielen wurden folgende Ausgangsstoffe, Puffer, Zellmedien und Routinemethoden angewandt. Wenn Standardmaterialien oder -schritte angewandt wurden, wird (durch Zahlen) auf die folgenden Artikel verwiesen:

1) Bolivar et al, Gene 2, 95-113 (1977)

2) Villa-Komaroff et al, P.IT.£,S. 21> 3727-3731 (1978)

3) Johnsrud, P.lToA»S, 75, 5314-4318 (1978)

4) Boyer et al, J· Mol· Biol· £[, 459-472 (1969)

5) Bedbrook et al, Cell % 707-716 (1976)

6) Heiner, JV Bact. 97, 1522-1523 (1969)

7) Legerski et al, Hucl· Acids Bes. £, 1445-1464 (1978)

8) Helling et al, J. Vir. 14, 1235-1244 (1974)

9) Maxaia et al, P_ON>A.S. 74, 560-564 (1977)

10) Maizel et al, Methods in Vir, ^, 179-246 (1970)

11) Broome et al, P.CT.A.S, 75, 274-6-2749 (1978)

12) Makula et al, Diabetes 18, 660-689 (1969)

13) Kessler, J. Immunol· 115,1617 (1975).

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* Ausgangsstoff e

Gloningvehikel» Die in den Beispielen verwendeten GIo ningvehikel stammten von einem Ausgangscloningvehikel, bei dem es sich, um das kleine Plasmid pBR322 handelte, das von 1) gebildet and beschrieben wurde· Die Cloning vehikel konnten alle an einer Pstl-Restriktionsstelle innerhalb des Gens für Bscherichia coli CBU coli) Peni .cillinase gespalten werden·

Nicht-bakterielle DNA-Fragmente für einen Vorläufer eines Proteins oder Polypeptids« Bei den in den Beispielen verwendeten nicht-bakteriellen DNA-Fragmenten handelte es sich um: eine Pst-endende, Poly-G-geschweifte eDNA-Kopie des DNA-Fragments des Gens für Ratten-Präproinsulin, das von 2) erzeugt und beschrieben wurde, und das anschließend als "DNA-Fragment 19" bezeichnet wird ("PI 19" von 2) ge^ nannt)s und ein Derivat von DM^Iragment 19· Die nichtbakteriellen DNA-Fragmente kodieren alle bis auf das Translations-Startsignal (ATG) und die ersten beiden Oodons des Gens für Ratten-Präproinsulin·

Bakterienwirte« In den Beispielen wurden vier gut bekannte Stämme von B. coli £-12 verwendet: MM294, beschrieben von 3)ϊ HB101, beschrieben von 4)| FMIO/Lambdaclgcn oder "FMA 10", beschrieben von 5)» und PR13, beschrieben von 6)· Die Wirte wurden unter dem Gesichtspunkt gewählt, daß in ihnen ein Plasmid vorhanden sein mußte, das für Puesistenz gegenüber dem Antibiotikum Tetracyclin kodiert, das Gen, für das Resistenz auch an pBR322 kodiert wird·

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Puffer

Trisaccharose-Puffer Tri to a-Lysis-Puf f er

Tri-SDIA-Puffer ("iS-Puffer")

BAL31 -Puffer

liET-Puffer

100 BiM CDri-HCl (pH-Wert 8) und 20 % Saccharose

0,3 % Triton X-100, 150 Tri-HCl (ph-Wert 8) und 0,2 M EDCDA (pH-Wert 8)

10 mM CDri-HCl (pH-Wert 8) und 1 Π3Μ EDO)A

20 mM Tri-HCl (pH-Wert 8), 12,5InM MsOl₂, 12,5 mM CaCl₂, 0,2 M NaCl und 1 mM IDTA (pH-Wert 8)

50 ail Tri-HCX (pH-Wert 7,5), 5 mM ED¹EA und 0,15 M ITaCl

2IT-Medium

Zellmedien

Glucose-Mininialniedium 6 s Bacto Trypton (Difco), 10 g Hefeextrakt und 5 ITaCl je Liter

6 s Na₂HFO₄, 3 g 0,5 S ^aCl und 1 s O'e Liter, wozu 10 ml 20 %ige Glucose, 1 ml 1 %iges "Vitamin

und

1,5 ml 11 MgSO₄ gegeben werden

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S-Medium 2 g HH₄Cl, 6 g UaHPO₄, 3 g

KH₂PO₄, 3 g HaCl und 10 mg MgCl₂ je Liter, wozu 10 ml 20 %ige Glucose und 1 ml 1 %iges Vitamin B^ gegeben werden·

Schritte der Routine-Methode

In den Beispielen wurden verschiedene^Verfahrensweisen wiederholt ausgeführt» Wenn nichts-anderes spezifiziert wird, wurden sie bei jeder Anwendung genau wie folgt ausgeführt :

!Transformationen; Zellen von E· coIi K-12, die mit einem Plasmid transformiert werden sollten, wurden in 2YT-Medium bis zu einer 0D_CCA von 0,5 bis 1,0 (2,5 χ 5 χ 10 Zellen/ ml) gezüchtet. 2 χ 10-⁷ Zellen wurden durch Zentrifugieren in einem Sorvall-Rotor SS-34 in 10 Minuten bei 5OOO TT/min geerntet, und die Zellen wurden 20 Minuten lang auf Eis in 0,5 ml 50 mM Tri-HCl (pH-Wert 8) und 50 mM CaCl₂ um sie einzuengen, inkubiert· Die konzentrierten Zellen wurden wie oben geerntet und in 50 ul eines Puffers von 50 mM TriHCl (pH-Wert 8) und 30 mM CaCl₂ erneut suspendiert.

Bis zu 0,2 ug Plasmid-DHA wurde zu dem Gemisch aus Zellen und Puffer gegeben, und die Zellen wurden 15 Minuten lang auf Eis inkubiert und anschließend 3 Minuten lang bei 37° C und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (25° C) inkubiert· Das Zellen-Puffer-Gemisch wurde mit 2YCQ-Medium auf 2 ml verdünnt und auf einer Rolle 30 Minuten lang bei 37° C inkubiert· Die transformierten Zellen wurden in einer herkömmlichen Weise aufgrund ihrer Üetracyclin-Resi-

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stenz ausgewählt, and zwar entweder in flüssiger EaItur durch, die Zugabe von 8 ml 2TT-Medium, das 20 ug/ml Tetracyclin enthielt, oder auf Platten durch Ausstreichen für einzelne Kolonien auf gehaltvollen Platten, die 2ΪΤ-Medium 0,15 % Bacto-Agar (Difco) und 20 ug/ml Tetracyclin enthielten.

Verstärkungs-Plasmide» Bin Plasmid tragende Zellen wurden unter Schütteln bei 37° C in 1 Liter 2TT-Medium. bis zu einem OD^₀ von 0,5 bis 1,0 gezüchtet· 3,4 ml Chloramphenicol (5 mg/ml in Äthanol) wurden zugesetzt, und das Schütteln wurde weitere 8 bis 16 Stunden lang fortgesetzt·

isolier-Plasmide· Sin oder mehrere Liter Zellen von S· coil K-12 wurden durch Zentrifugieren mit 5000 U/min in einem Sorvall-Botor GSA geerntet und anschließend in 5 tal Tri-Saccharose-Puffer wieder suspendiert. Die Zellen wurden auf Eis 5 Minuten lang nach der Zugabe von: (1) 1 ml 5 mg/lml Lysozym (Sigma) in Wasser; (2) 2 ml 0,25 M SDTA (pH-Wert 8); und (3) 2,5 ml 5M ITaOl inkubiert· Die Zellen wurden durch die Zugabe von 1 ml 10 %igem Natriumdodecylsulfat ("SDS") und 25 ul 30 JSigem Polyäthylenglycol in 2 M UaOl lysiert, und das Lysat wurde 1 Stunde lang in einem ISC-Rotor A-160 mit 27 000 U/min zentrifugiert. Aus der geklärten obenstehenden Flüssigkeit wurde Plasmid-DKA mit 0,6 Volumen Isopropanol ausgefällt·

Die ausgefällte Plasmid-DUA wurde durch erneutes Suspendieren in 1 ml TE-Puffer gereinigt und anschließend 5 Minuten in einer klinischen Zentrifuge zur Entfernung des

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unlöslichen Proteinpräzipitats zentrifugiert. Die obenstehende Flüssigkeit wurde auf 0,3 M in HaQAc gebracht, und anschließend wurde die Plasmid-DHA durch die Zugabe von 3 Volumen Ithanol ausgefällt, erneut in 1 ml TE-Puffer suspendiert und zweimal mit einem gleichen Volumen von in TB-Puffer äquilibriertem Phenol extrahiert. Die Plasmid-DHA wurde mit 3 Volumen Ithanol ausgefällt,in 1 ml TE-Puffer resuspendiert und eine Stunde lang bei 50° O mit 100 ttg/ml Sibonuclease ;(Worthington Biochemical, Hew Jersey) digeriert· Die Plasmid-DHA wurde ein weiteres Mal mit einem gleichen Volumen Phenol extrahiert, mit 3 Volumen Ithanol ausgefällt, in 50 mM HaOAc (pH-Wert 4) resuspendiert und zwei- bis dreimal mit gleichen Volumen in 50 fflßi HaOAc (pH-Wert 4) äquilibriertem Phenol unter geringfügiger Abwandlung der von 7) beschriebenen Methode extrahiert· Die Plasmid-DHA wurde anschließend einmal mit einem gleichen Volumen Ither extrahiert, mit 3 Volumen Ithanol ausgefällt und in Äther bis zu einer Sndkonzentration von 1 mg/ml resuspendiert·

Pur Plasmid-DHA aus Zellvolumen von 1 bis 25 ml bei einem ODccq ^V0EL 0»5 bis 1,0 wurden die Zellen Wie oben beschrieben geerntet und durch Resuspendieren in 100 ul Iri-Saccharose-Puffer wie oben beschrieben, gereinigt· Die Zellen wurden anschließend auf Sis 15 Minuten lang mit 5 nig/ml Lysozym in 20 mM EDTA (pH-Wert 8) inkubiert und durch die Zugabe von 850 ul Triton-I^sis-Puffer lysiert» Das Lysat wurde in einem Sorvall-Rotor SA-600 eine Stunde lang mit 17 000 U/min zentrifugiert. Die Plasmid-DHA wurde anschließend aus der obenstehenden Flüssigkeit mit Isopropanol wie oben beschrieben ausgefällt, und das Plasmid-DHA-Präzipitat wurde wie oben beschrieben gereinigt·

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Zerschneiden oder Spalten von Blasmiden» Plasmide wurden mit herkömmlichen Restriktionsenzymen Psti, ScoEI, Sail, Hinll und Avail gespalten,.die von New England Bio Labs, Waltham, MA, bezogen worden waren· Die Restriktionsenzyme wurden in herkömmlichen Konzentrationen und bei üblichen Temperaturen mit von New England Bio Labs empfohlenen Puffern zu den Plasmiden gegeben·

Ligation von DNA-Fragmenten - Polymerisation und Zirkularisation· Alle DNA-Fragmente wurden bei 15° C in einem Ligationspuffer von 25 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,6), 10 mM MgOl₂, 10 mM Dithiothreitol ("DOT") und 100 uM Adenosintriphosphat ("AiEFO der Ligation unterzogen.

Das Ligationsverfahren wurde in zwei Schritten durchgeführt: Polymerisation und anschließende Zirkularisation, Die miteinander zu verbundenen DHA-Fragmente wurden in einem 5-ul-Seaktionsvolumen mit einer für eine vollständige Reaktion ausreichenden Menge T4—DNA-Ligase (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, Md_e) polymerisiert. Die polymerisieren Fragmente wurden anschließend durch Verdünnen mit Ligationspuffer bis auf ein 50-ul-Reaktionsvolumen und die Zugabe einer weiteren für die vollständigeiHeaktion ausreichenden Aliquote T4-DNA-Ligase zirkularisiert·

Agarosegel-Elektrophorese· Die Elektrophorese in 0,7 %igem Agarosegel wurde für die Abtrennung geschnittener Plasmidfragmente, supergewundener Plasmide und 1000 bis 10 000 Nucleotide langer DNA-Fragmente genau wie von 8) beschrieben vorgenommen·

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Polyacrylamidgel-Elektrophorese. Die Elektrophorese in 5 %igem Polyacrylamidgel wurde für die Abtrennung von bis 4000 Uucleotide langen DNA-Fragmenten genau wie von 9) beschrieben vorgenommen, Elektrophorese mit 15 %igem Polyacrylamidgel für die Abtrennung von Proteinen mit relativen Molekülmassen von 5000 bis 20 000 wurde genau wie von 10) beschrieben durchgeführt·

Gel-Eluierung, DNA-Fragmente wurden entweder aus Polyacrylamidgel- oder Agarosegel-Stückchen genau wie von 9) beschrieben eluiert·

DNA-Sequenzierung.» DNA-Fragmente wurden entweder · 5 * oder 3^!-Snde-markiert, und ihre DNA-Sequenzen wurden genau wie von 9) beschrieben bestimmt·

P2-Kapselung (containment)· Alle Arbeiten, die Zellen betreffen (einschließlich Zelltransformationen, Zellvermehrung und Zellfraktionierung), die mit DNA-Fragmenten von Batten-Präproinsulingen geklönte Plasmide enthielten, wurden unter P2-Kapselung (containment) in Übereinstimmung mit den überarbeiteten Ν·Ι·Η.-Richtlinien für Hekombinant-DNA-Forschung, veröffentlicht im Federal Eegister, 4-3, Nr. 24?, 60,080' - 60,105 (22· Dezember 1978), durchgeführt,

Beispiele

Erzeugung von Oloningvehikeln (II, 17 und VI) aus dem Cloningvehikel pBS322 (I) durch die in Fig. 1 gezeigten Schritte A bis E

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Schritt A, Eliminier uns; der Hinll-Sall-Stelle in PBR322. um die Penicillinasegen HinTE-Stelle einmalig: zu machen»

Die Hinll-Sall-Stelle in dem Gen für Tetracyclin-Besistenz (punktiert in Fig. 1) in dem Plasmid pBE322 wurde eliminiert, um die Hinll-Stelle in dem Penicillinasegen (schwarz in Pig* 1) des Plasmids einmalig zu machen· pBE322 wurde mutagenisiert und verstärkt, indem der Stamm. HM294 von S. coil, der pBR322 trägt, in 1 Liter 2YT-Medium, das 3*4 ^l Chloramphenicol enthielt, dem 25 ing IT-methyl-S'-nitro-N-nitrosoguanidin zugesetzt worden waren bei 34° Ö 24 bis 72 Stunden lang unter Schütteln gezüchtet wurde· Das Plasmid wurde isoliert und dann ausgiebig mit Sail zerschnitten· Die zerschnittenen Plasmidfraktionen wurden zum !Transformieren von MM294· verwendet· Die MM294-Zellen mit Tetracyclin-Resistenz wurden ausgev/ählt, und das Plasmid wurde aus den ausgewählten Zellen isoliert· Das Plasmid wurde anschließend wieder ausgiebig mit Sail zerschnitten, zum Transformieren von MM294 verwendet und von gegenüber Tetracyclin resistenten Zellen wie oben isoliert, bis eine gegenüber Sail resistente Fraktion als supergewundene Plasmide mit Hilfe der Agarosegel-Elektrophorese zu sehen waren. Diese Sall-resistenten Plasmide wurden aus einzelnen Kolonien isoliert und mit Hilfe der Agarosegel-Elektrophorese getestet, um eine Bestätigung zu erhalten, daß sie gegenüber Zerschneiden durch Sail und Hinll resistent sind. Es wurde dann ein einziges, gegenüber Sail und Hinll resistentes Isolat als das Plasmid (II) für den nächsten Schritt B in Fig· i gewählt» ' ' . ' : . :" : .'. . .-..'

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Schritt Β« Zerschneiden von Plasmid. (II) mit Hinll und Entfernen der Nucleotide zwischen dem geschnittenen Plasmidende und dem Translations-Startsignal (ATG) des PenicillinasegensÖ Das Plasmid (II) von Schritt A wurde mit Hinll zur Bildung des linearen Plasmids (III) zerschnitten· Das Translations-Startsignal (schraffiert in Pig. 1) des Penicillinasegens war etwa 300 Nucleotide von einem Hinll-geschnittenen Ende des linearen Plasmids (III) entfernt· Die Enden von 0,2 ug Plasmid (III) wurden mit 2 Einheiten der Exonuclease BAL31» beschrieben von 7),5 Minuten lang bei 15° in BAL31-Puf£er in einem Beaktionsvolumen von 20 ul zurückgezogen ("chewed back")· Die verschiedenen resultierenden zurückgezogenen ("chewed back") Plasmide wurden dann für den nächsten Schritt C in Fig· i verwendet* ·

Schritt C Insertion eines Pst-LJnkers (G Pst C) an ' einem der zurückgezogenen ("chewed back") Enden des Plasmids (III) und Zirkularisation des resultierenden Plasmids zur Erzeugung; von Plasmiden (17), .je mit einer Pst-Hestriktionsstelle nahe dem Translations-^tartsignal des Penicillinasegens« 0,2 ug zurückgezogene ("chewed back") Plasmide wurden 2 Stunden lang mit T4-DSA-Ligase bis 0,2 ug Pst-linker (Collaborative Research, Bethesda, MD) polymerisiert, und anschließend wurde das 5*-Snde jedes zurückgezogenen ("chewed back") Plasmids mit einem verbundenen Linker in Gegenwart von ATP und Polynucleotid-Kinase in der von 9) beschriebenen ?ieise kinasiert· Die Sequenz des Pst-Idnkers war 5'-GCTGCAGC^¹, wobei CTGCAG die Schnittstelle durch Pstl definiert? die von dem Pst-Linker kommenden Basen sind in.den Fig. 2 und 3 kursiv gedruckt» Die zurückgezogenen ("chewed back")

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Plasmide mit verbundenen Linkern wurden 5 Stunden lang zirkularisiert. Di© verschiedenen resultierenden Plasmide (IT) wurden zu MM294 transformiert, und die MM294 Zellen wurden für Tetracyclin-Resistenz in flüssiger Kultur ausgewählt· .

Schritt D* Isolierung von DNA-Fragmenten (7)mit Pst- : Restriktionsstellen nahe dem Translations-Startsignal des Penicillinasegens » Die verschiedenen Plasmide.CXV), jedes mit einem in Schritt 0 irgendwo nahe dem Translations-Startsignal des Penicillinasegens eingefügten Pst-Linker, wurden in HM294· verstärkt, aus 10 ml Verstärkten Zellen isoliert und dann mit den Restriktionsenzymen BcoRI und Psti zerschnitten· Das Translations-Startsignal 3'edes Plasmids (17) war etwa 200 Nucleotide von der BcoRI-Stelle entfernt. Daher wurden die DNA-Fragmente von zerschnittenen Plasmideη (IY) auf einem 5 %igen PoIyacrylamidg-el der Elektrophorese unterzogen, und die verschiedenen, etwa 150 bis 300 Hulceotide enthaltenden DNA-Fragmente (TT) wurden mit Hilfe von XyIo!cyano 1 als Matrizenmarkierer identifiziert* Die die DNA-Fragmente (7) von annähernd 150 bis 300 Nucleotiden enthaltende Gelscheibe wurde eluiert und für den nächsten Schritt S in Fig. 1 verwendet.

Schritt E. Ligation von DNA-Fragmenten (7) zurück in PBH322V pBR322 wurde mit BcoRI und Psti zerschnitten, und das große, das Gen für Resistenz gegenüber Tetracyclin enthaltende Fragment wurde durch Elektrophorese mit 0,7 %igem Agarosegel isoliert· 0,2 ug des großen pBR322-Fragmentes wurden mit 0,2 ug DNA-Fragmenten (7) durch zweistündige Polymerisation' und anschließende fünfstündige

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Zirkularisierung zur Bildung der geclonten PlaSinide (VI) der Ligation unterzogen· Zur Abtrennung der verschiedenen geclonten, die verschiedenen DM-Fragmente (Y) unterschiedlicher Länge enthaltenden Plasmide (71) wurden die geclonten Plasmide (VT) in 111294 transformiert und danach auf Platten ausgewählt· Zu diesem Zweck wurden transformierte MM294-Zellen für einzelne Kolonien auf Platten ausgestrichen, einzelne Kolonien wurden wahllos aufgenommen, und jedes einzelne Plasmid wurde aus 5 ml Zellen jeder einzelnen Kolonie isoliert· Die Plasmide wurden jeweils mit Avail zerschnitten, in der von 9) beschriebenen Weise mit 20 uM Desosyguanosintriphosphat und 2 uE Alpha-^²p-Adenosintriphosphat 3*-Ende markiert, mit ScoEI zerschnitten und in der von 9) beschriebenen Weise über der Pst-Stelle sequenziert· Zwei geclonte Plasmide (VI), d.h. "ρΚΪ24·1^Μ von Figur 2 und "pKT218^H von figur 3 wurden isoliert und in dieser Weise gekennzeichnet und danach als die Oloningvehikel (VI) in den Beispielen verwendet. Die Figuren 2 und 3 zeigen die DITA-Sequenzen und die Aminosäuresequenzen, die für die BcoSI-Pstl-Fragmente (V) kodieren, gebunden an ein Fragment des Penicillinasegens von pBH322, um die pK0?241- und pKT218-0loningvehikel (VI) zu erzeugen. Diese GIoningvehikeI enthalten je ein verändertes Penicillinasegen mit einer Pst-Hestriktionsstelle« die M- (im Falle von p£T218) oder 12 (im Falle von pKT241) Codons von dem Translations-Star,tsignal des Penicillinasegens entfernt ist.

Urzeugung der nicht-bakteriellen DNA-Fragmente, die in die Oloningvehikel (VI) seelont werden sollen

Figur 4 zeigt die DHA-Sequenz des 5'-Endes vom nicht-bakteriellen DNA-Fragment 19, das von 2) isoliert und sequenziert wurde. Das DEFA-Fragment 19 ist eine Pst-endende,

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Po ly-G-geschweifte cDHA-Kopie eines Fragments des Gens für Satten-Präproinsülin· DNA-Fragment 19 enthält die Signal-DNA-Sequenz and die Struktur-DNA-Sequenz des Gens für Satten-Präproinsulin sowie das Stoppsignal (TGA) ata 3*-Ε&<3.© des Gens· Die Aminosäuresequenz, für die dieses DNA-Fragment kodiert, ist auch in Fig. 4 eingezeichnet worden· Bei den in Fig. 4 kursiv gedruckten Aminosäuren handelt es sich um durch den Poly-G-Schweif und die Pst-Steile kodierte Aminosäuren· Das Dill-Fragment 19 von Fig· 4 enthält bis auf die ersten drei alle Codons des Ratten-Präproinsulingens· Das Ende der Signalsequenz und der Beginn des Prosinsulins, für die das DNA-Fragment kodiert, sind durch einen Pfeil vor der Aminosäure +1 angegeben. . ___„...

Figur 5 zeigt die DNA-Seque&z und die Aminosäuresequenz, die sie kodiert, des 5'-Endes eines anderen nicht-bakteriellen DM-Fragmentes "GB6" des Gens für Batten-Präproinsulin. DNA-Fragment GB6 wurde durch Inkubieren von 0,2 ug DM-Fragment 19 mit 2 Einheiten der von 7) beschriebenen Sxonuclease BAI»31 in 150 ml BAL31 -Puffer über einen Zeitraum von 45 Sekunden bei 15° C erzeugt. Die zurückgezogenen ("chewed back") DNA-Fragmente wurden 2 Stunden lang mit T4-DNA-Ligase bis 0,2 ug Pst-Linker polymerisiert und auf einem 5 %igen Polyacrylamidgel der Elektrophorese unterzogen. Es wurden um etwa 40 Nucleotide kleinere DNA-Fragmente als das DNA-Fragment 19 eluiert, mit Pstl zerschnitten und mit der Pst-Stelle von Pst-zerschnittenem pBS322 verbunden. Die resultierenden Plasmide wurden in den HB101-Stamm von E. coli transformiert und auf Platten wie oben ausgewählt. Ausgewählte einzelne Kolonien von HB101 wurden in 2YT-Medium bis 5 ml vermehrt. Die

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Plasmide wurden mit Avail zerschnitten, 3'-Ende markiert und über der Pst-Stelle wie oben sequenziert· Unter den sequenzierten DM-Fragmenten befand sich das DNA-Fragment CB6· Von der Signal-DNA-Sequenz für Ratten-Präproinsulin von DNA-Fragment GB6 wurde ermittelt, daß sie im wesentlichen mit der von DHA-Fragment 19 identisch war, aber in einem anderen System von DNA-Fragment 19 zu finden war und weniger G-Nucleotide enthielt, die durch den PoIy-G-Schweif hinzugefügt worden waren·

Cloning der nicht-bakteriellen DNA-Fragmente in die Oloningvehikel (YI) durch den inFigur 1 gezeigten Schritt F __„.

Schritt Fo Gloning von DNA-Fragment GB6 in Oloningvehikel p£T218 und DNA-Fragment 19 in Oloningvehikel pKT241 · 0,2 ug Gloningvehikel pE2218 wurden mit Psti zerschnitten. 0,2 ug Pstl-zerschnittenes pKT218 wurden 2 Stunden lang bis 0,2 ug des Pst-endenden DNA-Fragments CB6 polymerisiert und anschließend 5 Stunden lang durch Verdünnen zirkularisiert. Das resultierende geclonte Plasmid (VII) "pK0?218-CB6ⁿ wurde in den FIiAIO Stamm von B. coli transformiert, auf Platten wie oben ausgewählt und bei 34·° C in 2YT-Medium, das durch §0 ug Thymidin je ml ergänzt worden war, gezüchtet· ' '

Unter Anwendung der gleichen Verfahrensweise wurden 0,2 ug von DNA-Fragment 19 in 0,2 ug von Cloningvehikel ρΚΠ?241 zur Bildung des geclonten Plasmids (VII) "ρΕ0}24-1.19^Μ geclont· Das pKI241,19-PIaSmId wurde anschließend transformiert, auf Platten ausgewählt und wie oben gezüchtet·

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Zur Isolierung von SmiO-Transformanten mit pKT218-0B6- oder pKT241»19-geclonten Plasmiden (JlI), die das nichtbakterielle DEA-Fragment (CB6 oder 19) in'dar richtigen Orientierung für die Auswahl (reading) von dem Promotor des Bakterien(Penicillinase)-Gens enthalten, so daß Satten-Präproinsulin in den Transformanten erzeugt wird, wurden einzelne Kolonien von Transformanten, die eines der geclonten Plasmide (ρΚΤ218·0Β6oder pKT241.19) enthielten, auf Kopieplatten gebracht, die 2XT-ffiedium, 0,15 % Bacto-Agar und 20 ug/ml Tetracyclin plus 40 ug/ml Ihymidin enthielten· Die Transformanten wurden bei 34· '.⁰C gezüchtet und auf der Platte durch Induktion ihrer lambda-Phage bei 42° C 2,Stunden lang lysiert· Genau wie von 11) beschrieben wurde.eine zweiseitige Festphasen-Eadioimmunoanalyse einer der Kopieplatten vorgenommen, wobei anstelle des normalen Kaninchenserums normales Meerschweinchenserum in dem Waschpuffer verwendet wurde· Geclonte Plasmide (pKT218.CB6 oder pKT241_e19) von federn Transformant, die beim Test positiv die Anwesenheit von Eatten-Insulin-Antigen ergaben, waren CIoningvehike1 (VTI) und wurden in einen Bakterienwirt, den Stamm PE13 von S. coli, transformiert·

Züchten von mit Cloningvehikel (TII) transformierten Bakterienwirten

PEI3, das mit dem Oloningvehikel (TII) ρΚΤ218·0Β6 oder pKT241,19f das Eatten-Insulin-Antigen verwirklicht, transformiert wurde, wurde in 100 ml Glucose-Minimalmedium mit einem Zusatz von 2 % cas (Caseinhydrolysat)-Aminosäuren (Difco) bis zu einem 0Dec₀ von 0,2 bis 0,4 bei 37° G gezüchtet·

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Analyse yon durch gezüchtete Wirte ausgeschiedenem Protein

!transformierte ER13-Wirtszellen wurden geerntet und anschließend durch Suspendieren in Trisaccharosepuffer gewaschen· Die gewaschenen Zellen wurden durch 10 Minuten Zentrifugieren mit 5000 U/min in einem Sorvall-Eotor SS-34 pelletisiert* Bine Portion der Zellen wurde anschließend zur Freisetzung des Inhaltes der ganzen Zelle lysiert· Bine andere Portion der gewaschenen Zellen wurde in den ^ehalt des Periplasms und den Gehalt des CSytoplasmas plus Zellmembran fraktioniert·

Die Zellen wurden auf ihren Inhalt an Insulin-Antigen der ganzen Zelle hin lysiert, indem sie erneut in 100 ul Trisaccharosepuffer suspendiert, 15 Minuten lang mit 50 ul 5 mg/ml Lysozym in 20 mM EDTA inkubiert und durch die Zugabe von 850 ul Iriton-Lysis-Puffer lysiert wurden· Die nach einstündigem Zentrifugieren mit 1? 000 U/min in einem Sorväll-Rotor SA-600 überstehende Flüssigkeit enthielt das Insulin-Antigen der ganzen Zelle·

Zellen wurden dadurch fraktioniert, daß sie in 900 ul

Trisaccharosepuffer resuspendiert und 15 Minuten lang auf Eis mit 100 ul 5 mg/ml Lysozym in 20 mM EDIA (pH-Wert 8) inkubiert wurden· Die Zellen wurden wie oben pelletisiert. Die obenstehende Flüssigkeit enthielt den Gehalt des Zellperiplasmas und das Pellet enthielt den Gehalt des Cytoplasmas und der Zellmembran. Uach der Abtrennung der obenstehenden Flüssigkeit zur Analyse auf ihren Insulin-Agtigen-Gehalt wurde das Pellet vorsichtig in 1 ml iEriöaccharosepuffer resuspendiert, repelletisiert und un-

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ter Hühren mit Hilfe eines Glasstabes in 100 al Trisäccharosepuffer resaspendiert. Die Zellen wurden mit Iriton-Lysepuffer lysiert und 1 Stunde lang in einem Sorvall-Rotor SA-600 mit 17 000 U/min zentrifugiert· Die obenstehende Flüssigkeit enthielt den Inhalt des Oytoplasmas und der Membran der Zelle·

Genau wie von 12) beschrieben wurden Standard-Flüssigkeits-Eadioimmunoanalysen durchgeführt, um den Insulin-Antigen-Gehalt jeder von den ER13-Zellen gewonnenen Fraktion zu bestimmen. Aliquoten der zu testenden Zellfraktionen wurden mit einer für eine 75 %ige Komplexbildung des eingesetzten markierten Insulins ausreichenden Menge AntiInsulin IgG vorinkubiert· Die IgG-Fraktion von Meerschweinchen-Anti-Insulinserum wurde sowohl für Eadioimmunoanalysen in der flüssigen als auch festen Phase verwendet und wurde genau wie von 11) beschrieben hergestellt·

In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse von der Züchtung von das ρΕΓ24·1·19 Cloningvehikel (YII) enthaltendem EB13 und Züchtung von das pKT218.CB6 Oloningvehikel (VII) enthaltendem ΪΕ13 ζusammengesteilte sie zeigen, daß etwa 90 % des Eatten-Insulin-Antigens in dem periplasmischen Eaum der ER13-Wirtszellen zu finden sind·

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Tabelle

Batfcen-Insulin-Antigen-Gehalt von PR13-Wirtszellen, die pKT218.0B6 oder pKT241.19 Oloningvehikel (YII) enthalten

Satten-Insulin-Antisen-Moleküle in der	* Peri- _	Cy to-	Ins	Zelle	% in
Cloning-	plasma	plasma	gesamt	Ganze	Peri-
vehikel	der	Sc Mem		Zelle*²	plas-
	Zelle	bran			_mQ2:
		der			ma
		Zelle
		_	_		—
pKID218.GB6	365	37	402	368	91 %
pKT218.CB6	-	mm	-	-	' —
pKT241.19	1320	298	1618	1555	82 %
pKT241,19	1592	105	1697	-	94 %
ρΚΤ241_β19

Yon fraktionierten Zellinhalten Yon ganzen Zellinhalten

Nachweis, daß vollentwickeltes Protein durch mit CIoningvehikel (YII) transformierte Bakterienwirte erzeugt wird '· '·.' ' ...

5 ml von mit dem Cloningvehikel (YII) pKT218»CB6 oder ρΚΤ241·19 transformiertem PRI3 wurden in S-Medium mit einem Zusatz von ^O ug/ml Leucin und 40 ug/ml Threonin bis zu einem ΟΏ,-cq von 0,3 gezüchtet und dann 1/2 bis 1 Stunde lang bei 34 O mit 5 mOi H₂^SO^ inkubiert· Die geernteten Zellen wurden wie oben beschrieben auf den Antigen-

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gehalt ganzer Zellen hin lysiert, und die obenstehende Flüssigkeit wurde mit 2 ul einer IgG-Fraktion von Meerschweinchen-Antischwelne-Insulinserum, das wie von 11) beschrieben hergestellt worden war, inkubiert· 2 ul dieser IgG-Fraktion konnten etwa 300 ug Insulinantigen binden, und somit war das ein 200facher Überschuß von Antikörper* Nach einer Inkubationszeit von 3 Stunden bei 37° 0 und 3 Stunden auf Eis wurden die Anti-Insulin-IgG-Ratten-Proinsulin-Komplexe wie von 13)' beschrieben immunoausgefällt: 100 ul mit Gliitararaldehyd behandelte Staph A (Staphylococcus aureus) Bakterien in NET-Puffer (10 Yol%/Vol) wurden zu den Komplexen gegeben und die Inkubation eine weitere Stunde lang auf Eis fortgesetzt.

Die Staph A Zellen wurden durch 5 Minuten Zentrifugieren in einem Sorvall-Hotor SS-34 mit 10 000 U/min zur Entfernung von Insulin-Antigen Antikörper-Komplexen aus der obenstehenden Flüssigkeit pelletisiert. Die Zellen wurden durch Resuspendieren in 100 ul· ΝΞΤ-NON-Puffer (UET-Puffer plus Nonidet P-40 Detergens (Particle Data Labs, Inc., Elmhurst, 111.). 1 mg/ml Ovalbumin und 0,5 M HaCl) gewaschen. Anschließend wurden weitere 900 ul NET-NOE-Puffer zugesetzt, und die Zellen wurden wie vorher pelletisiert· Dieser Waschvorgang wurde dann noch dreimal wiederholt. Zwei abschließende Waschungen erfolgten in NST-Puffer, der 0,5 % Nonidet P-40 Detergens enthielt, und danach wurden die Ze-llen 3 Minuten lang in 50 ul Maizel-. Gel-Beschwerungspuffer (der SDS enthielt) wie von 10) beschrieben gekocht. Die Staph A Zellen wurden wieder durch Zentrifugieren wie oben pelletisiert.

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Die denaturierte Proteine (einschlieBlich radioaktives Proinsulin) enthaltende obenstehende Flüssigkeit wurde genau wie von 10) beschrieben auf 15 %iges Maizel-Gel von 10 χ 8 χ 0,2 cm gegeben. Das Gel wurde 1/2 Stunde lang bei 40 Volt und 4 bis 5 Stunden lang bei 110 Volt behandelt, bis der Bromphenolblau-Markierungsfarbstoff am Boden zu finden war, und anschließend 1 Stunde lang auf einem Kodak-Film 2S-5 autoradiographiert. Das Gelstück, das das überwiegend radioaktive Stück in dem Gel darstellt (wie aus dem Film zu erkennen ist) und das das radioaktive Proinsulin enthält, wurde von dem Gel ausgeschnitten, mit einem Glasstab zerstoßen und 8 Stunden lang bei Baumtemperatur in 50 ml Ammoniumhydrogencarbonat (pH-Wert 7>5)» 0,2 mg/ml Ovalbumin (Sigma) als Trägerprotein für die Sluierung, 0,1 % SDS und 0,2 mM DTT eluiert· Das zerkleinerte Gel wurde durch Filtration durch Glaswolle entfernt, und das Protein wurde bis zur Trockne lyophilisiert. Das Protein wurde in 100 ul Wasser resuspendiert und mit 5 Volumen Aceton ausgefällt·

Das Protein wurde in 200 ul 70 %iger Ameisensäure, der 3 mg Ovalbumin als Trägerprotein für die Sequenzierung und 3 nig Polybrene (Aldrich) in 200 ul 70 %iger Ameisensäure zur Unterstützung der Bindung des Proteins an die Sequenator-Schale zugesetzt worden waren, resuspendiert· Das Protein wurde auf einen Beckman-Sequenator vom neuesten Modell 860C aufgegeben, und jeder Zyklus konnte mit einem 0,1 M Quadrol-Puffer (Beckman) und dem entsprechenden Sequenator-Programm ablaufen· Hach jedem Zyklus wurde ein Aminosäurederivat des Proteins gesammelt und unter strömendem Stickstoff in einem Bad von 37° C getrocknet. Durch Besuspension in 200 ul 0,1 N HCl und In-

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kubation bei 80° C über einen Zeitraum, von 10 Minuten wurde jedes instabile Derivat in ein stabiles Derivat umgewandelt. 20 bis 100 ul jedes stabilen Derivats wurden za 2 ml Aquasol (New England Nuclear, Boston, MA.) gegeben, und die Strahlung jedes Derivats wurde durch Flüssigkeits-Szintillation bestimmt.

Die Zählungen der Flüssigkeits-Szintillation je Minute wurden über der Aminosäureposition für das Protein von jedem gezüchteten HJ13-$irt, der entweder das Gloningvehikel (VII) pKT241.19 oder pIiI218.CB6 enthielt, aufgetragen.

In der Uatur hat voll entwickeltes Proinsulin die schwefelhaltige Aminosäure, Cystein, an den Positionen 7 und 19 an seiner Aminosäurekette. Die graphische Darstellung zeigte die quantitative Gev/innung von radioaktivem Schwefel an'den Positionen 7 und 19 an der Aminosäurekette des von jedem gezüchteten PR13-Wirt erzeugten Proinsulins. Das ist der Beweis dafür, daß voll entwickeltes Proinsulin von jedem PE13-Wirt, der das pKT218.G36 CIoningvehikel oder das pET241.10 Cloningvehikel enthält, erzeugt worden ist·

Die Erfindung und viele ihrer damit verbundenen Vorteile sollten in der vorstehenden Beschreibung erläutert worden sein, und es dürfte klar sein, daß verschiedene Veränderungen in den Schritten der beschriebenen Methode für die" Synthese von voll entwickeltem Protein vorgenommen werden können, ohne daß vom Inhalt und Geltungsbereich der Er-

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findung abgewichen wird oder ihre wesentlichen Vorteile aufgegeben werden, wobei die oben beschriebene Methode lediglich eine bevorzugte Ausführungsform darstellt·

Claims

Erf indungsanspruch;

1· Verfahren zur Synthetisierung eines ausgewählten Proteins oder Polypeptide innerhalb eines Bakterienwirtes und Absonderung durch die Membran des Wirtes, umfassend die Spaltung eines Cloningvehikels zur Bildung einer Spaltungsstellej Bildung eines Hybridgens durch. Einsetzen eines für ein gewähltes Protein oder Polypeptid kodierenden nicht-bakteriellen DM-Fragmentes in die Spaltungsstelle 5 Transformieren des Wirtes mit dem Hybridgen; und Züchten des transformierten Wirtes zur Absonderung des gewählten Proteins oder Polypeptide, oder Züchten eines Wirtes, der mit einem Hybridgen, das durch ein in eine Spaltungsstelle in einem Cloningvehikel eingesetztes nicht- -bakterielles DM-Fragment gekennzeichnet ist, transformiert wurde, gekennzeichnet dadurch, daß das Cloningvehikel zur Bildung einer Spaltungsstelle hinter einem Promotor eines Bakteriengens oder Phagengens oder eines DM-Fragmentes davon innerhalb des Gloningvehikels gespalten wird, wobei das nicht-bakterielle DM-Fragment für einen Vorläufer des gewählten Proteins oder Polypeptids kodiert und eine Signalseqüenz des gewählten Proteins oder Polypeptids enthält, wobei der transformierte Wirt das gewählte Protein oder Polypeptid als ein ausgereiftes Protein oder Polypeptid verwirklicht·

2« Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Bakterien- oder Phagengen oder das DM-Fragment davon für ein normalerweise abgesondertes Protein oder Polypeptid kodiert und sich die Spaltungsstelle vor, innerhalb oder nicht mehr als etwa 60 nucleotide hinter einem Translationsstartsignal befindet·

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3· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Bakterien- oder Phagengen oder das DNA-Pragment davon für ein normalerweise nicht-abgesondertes Protein oder Polypeptid kodiert und sich die Spaltungsstelle vor, innerhalb oder nicht mehr als etwa 40 Nucleotide hinter dem Translationsstartsignal des Bakterien- oder Phagengens oder desDNA-Pragmentes davon befindet·

4, Verfahren nach einem der vorhergehenden Punkte, gekennzeichnet dadurch, daß das B« coli-Penicillinase-^Gen gespalten wird.

5· Verfahren nach einem der vorhergehenden Punkte, gekennzeichnet dadurch, daß das Cloningvehike1 von dem Plasmid pBH322 abgeleitet ist·

6· Verfahren nach einem der vorhergehenden Punkte, gekennzeichnet dadurch, daß das nicht-bakterielle DNA-Fragment für Präproinsulin, Präserumalbumin, Prähuman-Wachstumshormon, Präparathyroidhormon oder Präinterferon kodiert,

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Punkte, gekennzeichnet dadurch, daß das Hybridgen aufweist: einen Promotor eines Bakterien- oder Phagengensj ein Tran&lationsstartsignal; ein nicht-bakterielles DNA-Fragment, das für die Signalsequenz eines nicht-bakteriellen Proteins oder Polypeptide kodiertj und ein nicht-bakterielles DNA- -Pragment, das für das Protein oder Polypeptid kodiert·

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8· Verfahren nach. Punkt 7» weiterhin gekennzeichnet dadurch, daß das HybriLdgen eine Ribosom-Bindestelle zwischen dem Promotor und dem Translationsstartsignal enthält·

9· Verfahren nach Punkt 7 oder 8, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Promotor des Hybridgens uta den ProQotor des B. coli-Penicillinase-Gens handelt·

10. Verfahren nach einem der Punkte 7 bis 9» gekennzeichnet dadurch, daß das Hybridgen nicht mehr als etwa 40 Nucleotide des Bakterien- oder Phagengens hinter dem Translationsstartsignal und vor dem nicht-bakteriellen DNA-Fragment enthält»

11· Verfahren nach einem der Punkte 7 bis 10, gekennzeichnet dadurch, daß das nicht-bakterielle DNA-Fragment des Hybridgens für Präproinsulin, Präserumalbumin, Prähuman- -Wachstumshormon, Präparathyroidhormon oder Präinterferon kodiert.

Hierzu 4 Blatt Darstellungen