JPH0646946B2 - 蛋白の産生方法 - Google Patents
蛋白の産生方法Info
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- JPH0646946B2 JPH0646946B2 JP59062981A JP6298184A JPH0646946B2 JP H0646946 B2 JPH0646946 B2 JP H0646946B2 JP 59062981 A JP59062981 A JP 59062981A JP 6298184 A JP6298184 A JP 6298184A JP H0646946 B2 JPH0646946 B2 JP H0646946B2
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- plasmid
- eco
- protein
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
- C07K14/67—Lipotropins, e.g. beta, gamma lipotropin
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
- C07K14/675—Beta-endorphins
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、蛋白の産生方法に関する。
大腸菌の外膜を構成する蛋白質のひとつであるOmpＦ蛋
白質は、大腸菌が最も多量に生産する蛋白質のひとつで
ある。その遺伝子ompＦのプロモーターやリポソーム結
合領域はきわめて効率よく機能しているものと考えられ
る。ompＦ遺伝子の発言は複雑な制御を受けるが、その
ひとつとしてompＦ遺伝子発現の正の制御遺伝子ompＢ遺
伝子が知られており、ompＢ欠損変異株ではompＦ遺伝子
は発現しない。また培地の浸透圧によつても制御を受
け、高浸透圧培地中ではompＦ遺伝子の発現は抑制され
る。
白質は、大腸菌が最も多量に生産する蛋白質のひとつで
ある。その遺伝子ompＦのプロモーターやリポソーム結
合領域はきわめて効率よく機能しているものと考えられ
る。ompＦ遺伝子の発言は複雑な制御を受けるが、その
ひとつとしてompＦ遺伝子発現の正の制御遺伝子ompＢ遺
伝子が知られており、ompＢ欠損変異株ではompＦ遺伝子
は発現しない。また培地の浸透圧によつても制御を受
け、高浸透圧培地中ではompＦ遺伝子の発現は抑制され
る。
ompＦ遺伝子の全塩基配列は本発明者らによつて決定さ
れたが、それによればOmpＦ蛋白質はまずアミノ末端に
２２個のアミノ酸よりなるシグナル・ペプチドを有する
前駆体として合成される。このシグナル・ペプチドはOm
pＦ蛋白質の細胞質膜からの分泌に必須の役割を果たし
ているものと考えられる。さらにOmpＦ蛋白質は外膜中
で細胞壁を構成するペプチドグリカンと強い親和性をも
つた非常に安定な形で多量に存在しており、この性質を
利用して菌体から容易に精製することのできる蛋白質で
もある。
れたが、それによればOmpＦ蛋白質はまずアミノ末端に
２２個のアミノ酸よりなるシグナル・ペプチドを有する
前駆体として合成される。このシグナル・ペプチドはOm
pＦ蛋白質の細胞質膜からの分泌に必須の役割を果たし
ているものと考えられる。さらにOmpＦ蛋白質は外膜中
で細胞壁を構成するペプチドグリカンと強い親和性をも
つた非常に安定な形で多量に存在しており、この性質を
利用して菌体から容易に精製することのできる蛋白質で
もある。
本発明者は、上記のような性質を有する大腸菌の外膜蛋
白質をコードするompＦ遺伝子に関する研究の一環とし
て、このompＦ遺伝子を含むプラスミドについて種々検
討を行ない、先に、大腸菌のシグナルペプチドをコード
する遺伝子および所望の蛋白をコードする遺伝子を含有
するプラスミドベクターを見い出した。同ベクターは、
遺伝子産物たる同蛋白の分泌を可能とする。
白質をコードするompＦ遺伝子に関する研究の一環とし
て、このompＦ遺伝子を含むプラスミドについて種々検
討を行ない、先に、大腸菌のシグナルペプチドをコード
する遺伝子および所望の蛋白をコードする遺伝子を含有
するプラスミドベクターを見い出した。同ベクターは、
遺伝子産物たる同蛋白の分泌を可能とする。
本発明は、このプラスミドベクターを用いて蛋白を産生
させる際に、産生量をさらに向上させる方法に関するも
のである。
させる際に、産生量をさらに向上させる方法に関するも
のである。
すなわち、本発明の要旨は、大腸菌由来のｏｍｐＦ蛋白
質のシグナルペプチドをコードする遺伝子および所望の
蛋白をコードする遺伝子を含有するプラスミドベクター
を、プロテアーゼ活性が欠失または減少した宿主大腸菌
に導入して同菌を培養し、産生する蛋白を菌体外に分泌
させることを特徴とする蛋白の産生方法である。
質のシグナルペプチドをコードする遺伝子および所望の
蛋白をコードする遺伝子を含有するプラスミドベクター
を、プロテアーゼ活性が欠失または減少した宿主大腸菌
に導入して同菌を培養し、産生する蛋白を菌体外に分泌
させることを特徴とする蛋白の産生方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
まず、本発明において用いられるベクターは、大腸菌由
来のｏｍｐＦ蛋白質のシグナルペプチドをコードする遺
伝子および所望の蛋白をコードする遺伝子を含有する。
このようなベクターとしては、たとえば大腸菌由来リラ
ツクス型プラスミドにグラム陰性菌ompＦプロモーター
を含むAluＩフラグメント、AluＩ−BglIIフラグメント
またはAluＩ−PstＩ（部分消化）フラグメントを挿入し
て得られるプラスミドベクターが挙げられる。
来のｏｍｐＦ蛋白質のシグナルペプチドをコードする遺
伝子および所望の蛋白をコードする遺伝子を含有する。
このようなベクターとしては、たとえば大腸菌由来リラ
ツクス型プラスミドにグラム陰性菌ompＦプロモーター
を含むAluＩフラグメント、AluＩ−BglIIフラグメント
またはAluＩ−PstＩ（部分消化）フラグメントを挿入し
て得られるプラスミドベクターが挙げられる。
このベクターの製造法について説明するに、まず、原料
プラスミドとして用いられるのは、大腸菌由来で細胞当
り多数コピーとして存在するプラスミド、すなわちいわ
ゆる大腸菌由来リラツクス型プラスミドである。このよ
うなプラスミドとしては、特に制限されないが、たとえ
ばpBR322、pBR325、pACYC184等が挙げられるが、pBR322
が最も好ましい。
プラスミドとして用いられるのは、大腸菌由来で細胞当
り多数コピーとして存在するプラスミド、すなわちいわ
ゆる大腸菌由来リラツクス型プラスミドである。このよ
うなプラスミドとしては、特に制限されないが、たとえ
ばpBR322、pBR325、pACYC184等が挙げられるが、pBR322
が最も好ましい。
上記のプラスミドベクターは、この原料プラスミドに上
記したompＦプロモーターを含む特定のＤＮＡフラグメ
ントを導入して造成される。このＤＮＡフラグメント
は、ompＦプロモーターを含む下記フラグメント(I)、(I
I)または(III)である。
記したompＦプロモーターを含む特定のＤＮＡフラグメ
ントを導入して造成される。このＤＮＡフラグメント
は、ompＦプロモーターを含む下記フラグメント(I)、(I
I)または(III)である。
(I) AluＩフラグメント (II) AluＩ−BglIIフラグメント (III) AluＩ−PstＩ（部分消化）フラグメント このＤＮＡフラグメントはたとえば、次のようにして得
られる。
られる。
すなわち、大腸菌Ｋ−１２のompＦ形質導入フアージで
あるλompＦ１（Journal of Bacteriology,145,1085−1
090(1980)参照）を、それぞれ制限酵素(i) AluＩ、(ii)
AluＩとBgl IIまたは(iii) AluＩとPstＩ（部分消化）
を用いて切断して単離することにより上記(I)、(II)ま
たは(III)で示されるＤＮＡフラグメントが得られる。
あるλompＦ１（Journal of Bacteriology,145,1085−1
090(1980)参照）を、それぞれ制限酵素(i) AluＩ、(ii)
AluＩとBgl IIまたは(iii) AluＩとPstＩ（部分消化）
を用いて切断して単離することにより上記(I)、(II)ま
たは(III)で示されるＤＮＡフラグメントが得られる。
このようにして得られた上記フラグメントを大腸菌由来
リラツクス型プラスミドに挿入する方法としては、(1)
同プラスミドを上記フラグメントを得るに使用したのと
同じ制限酵素で切断して得られるＤＮＡフラグメントと
上記フラグメントとをＤＮＡリガーゼで連結して環化さ
せる方法（ただし、AluＩフラグメントは平滑末端を有
するので、同プラスミドを線状化して平滑末端としたＤ
ＮＡフラグメントとAluＩフラグメントとを連結して環
化させることもできる。）、(2)いわゆるホモポリマー
・テーリング法により、大腸菌由来リラツクス型プラス
ミドの適当な制限酵素切断部位（pBR322の場合、好まし
くはPstＩ部位）に上記フラグメントを挿入する方法、
および(3)１以上の制限酵素認識部位を有する合成リン
カー分子を上記フラグメントの両末端に連結させて後、
リンカー分子中に含まれる上記制限酵素認識部位を切断
する制限酵素で切断し、得られるＤＮＡフラグメントを
大腸菌由来リラツクス型プラスミドの同制限酵素切断部
位に挿入する方法があげられる。
リラツクス型プラスミドに挿入する方法としては、(1)
同プラスミドを上記フラグメントを得るに使用したのと
同じ制限酵素で切断して得られるＤＮＡフラグメントと
上記フラグメントとをＤＮＡリガーゼで連結して環化さ
せる方法（ただし、AluＩフラグメントは平滑末端を有
するので、同プラスミドを線状化して平滑末端としたＤ
ＮＡフラグメントとAluＩフラグメントとを連結して環
化させることもできる。）、(2)いわゆるホモポリマー
・テーリング法により、大腸菌由来リラツクス型プラス
ミドの適当な制限酵素切断部位（pBR322の場合、好まし
くはPstＩ部位）に上記フラグメントを挿入する方法、
および(3)１以上の制限酵素認識部位を有する合成リン
カー分子を上記フラグメントの両末端に連結させて後、
リンカー分子中に含まれる上記制限酵素認識部位を切断
する制限酵素で切断し、得られるＤＮＡフラグメントを
大腸菌由来リラツクス型プラスミドの同制限酵素切断部
位に挿入する方法があげられる。
以下上記した(3)の方法について詳しく述べる。
合成リンカー分子としては、Eco RI、Hind III、Bam H
I、SalＩ制限酵素認識部位を有するものが好ましいが、
特にEco RIリンカーが好適である。
I、SalＩ制限酵素認識部位を有するものが好ましいが、
特にEco RIリンカーが好適である。
Eco RIリンカーを使用して上記したompＦプロモーター
を含むＤＮＡフラグメントにEco RI末端を形成させるに
は、たとえば以下のような方法が採用される。
を含むＤＮＡフラグメントにEco RI末端を形成させるに
は、たとえば以下のような方法が採用される。
i) AluＩフラグメントの場合 AluＩフラグメント（５２８bp）とEco RIリンカーを連
結させ、ついでEco RIで消化する。
結させ、ついでEco RIで消化する。
ii) AluＩ−Bgl IIフラグメントの場合 AluＩ−Bgl IIフラグメント（５１２bp）をＤＮＡポリ
メラーゼＩのKlenow フラグメントによりBgl II末端を
平滑末端とし、ついでEco RIリンカーと混合し、結合さ
せた後、Eco RIで消化する。
メラーゼＩのKlenow フラグメントによりBgl II末端を
平滑末端とし、ついでEco RIリンカーと混合し、結合さ
せた後、Eco RIで消化する。
iii) AluＩ−PstＩ（部分消化）フラグメントの場合 AluＩ−PstＩ（部分消化）フラグメント（４８２bp）を
Ｓ１ヌワレアーゼ処理してPstＩ消化で得られた一本鎖
部分を切除して平滑末端とし、ついでEco RIリンカーと
混合し、連結した後、Eco RIで消化する。このようにし
てEco RI等の特定の制限酵素消化により粘着末端あるい
は平滑末端を形成させたフラグメントは、ついで大腸菌
由来リラツクス型プラスミドを上記したと同じ制限酵素
で切断した部位に挿入される。
Ｓ１ヌワレアーゼ処理してPstＩ消化で得られた一本鎖
部分を切除して平滑末端とし、ついでEco RIリンカーと
混合し、連結した後、Eco RIで消化する。このようにし
てEco RI等の特定の制限酵素消化により粘着末端あるい
は平滑末端を形成させたフラグメントは、ついで大腸菌
由来リラツクス型プラスミドを上記したと同じ制限酵素
で切断した部位に挿入される。
本発明において用いられるプラスミドベクターは、上記
したように細胞当り多数コピーとして存在するリラツク
ス型プラスミドにompＦプロモータを含む特定のフラグ
メントを挿入して得られるものであり、同プロモータ近
辺の下流に存在する適当な制限酵素切断部位に生理活性
を有する有用な、産生すべき蛋白をコードする遺伝子Ｄ
ＮＡフラグメントを挿入して蛋白の産生に使用される。
したように細胞当り多数コピーとして存在するリラツク
ス型プラスミドにompＦプロモータを含む特定のフラグ
メントを挿入して得られるものであり、同プロモータ近
辺の下流に存在する適当な制限酵素切断部位に生理活性
を有する有用な、産生すべき蛋白をコードする遺伝子Ｄ
ＮＡフラグメントを挿入して蛋白の産生に使用される。
このようなＤＮＡフラグメントとしては、たとえばβ−
エンドルフインをコードするＤＮＡフラグメントが挙げ
られる。
エンドルフインをコードするＤＮＡフラグメントが挙げ
られる。
また、上記制限酵素切断部位としては、上記したompＦ
プロモータを含む特定のフラグメントの３′末端の制限
酵素切断部位（Bgl II部位等）、合成リンカーを使用し
た場合には、合成リンカー中の制限酵素切断部位（Eco
RI部位等）あるいは、上記した特定のフラグメント近辺
の下流に存在するリラツクス型プラスミド中の適当な制
限酵素切断部位が使用される。
プロモータを含む特定のフラグメントの３′末端の制限
酵素切断部位（Bgl II部位等）、合成リンカーを使用し
た場合には、合成リンカー中の制限酵素切断部位（Eco
RI部位等）あるいは、上記した特定のフラグメント近辺
の下流に存在するリラツクス型プラスミド中の適当な制
限酵素切断部位が使用される。
なお、遺伝子の発現を確実なものとするには、遺伝子の
転写・翻訳がompＦプロモータのコトロール下にあるこ
とはもちろん、ホモポリマー・テーリング法を使用した
場合を除き、常法により２Ｇ−Ｃ塩基対あるいは４Ｇ−
Ｃ塩基対をompＦプロモータを含むフラグメントに付加
する等の方法により遺伝子を正しい解読枠に置く必要の
ある場合がある。
転写・翻訳がompＦプロモータのコトロール下にあるこ
とはもちろん、ホモポリマー・テーリング法を使用した
場合を除き、常法により２Ｇ−Ｃ塩基対あるいは４Ｇ−
Ｃ塩基対をompＦプロモータを含むフラグメントに付加
する等の方法により遺伝子を正しい解読枠に置く必要の
ある場合がある。
また遺伝子を正しい方向性をもつて挿入するために遺伝
子の５′末端および３′末端の制限酵素認識部位を異な
つたものとすることができる。
子の５′末端および３′末端の制限酵素認識部位を異な
つたものとすることができる。
本発明方法においては、このようにして得られるプラス
ミドベクターを、プロテアーゼ活性が欠失又は減少した
宿主大腸菌に導入し、蛋白を菌体外に産生させる。プロ
テアーゼ(Protease)活性は、ペプチド結合を加水分解す
る酵素活性を意味するが、「欠失」は大腸菌中で見い出
されている数種類のプロテアーゼ活性の少なくとも一部
を欠失したものであり、「減少」は、通常の大腸菌株、
たとえばイー．コリ（E.coli） HB101が有する活性よ
りも減少していることを意味する。欠失した大腸菌とし
ては、たとえばイー．コリ（E.coli） Ｋ−12SM32，E.
coli Ｋ−12 SM37，E.coli Ｋ−12 SM40（ジヤーナル
オブ バクテリオロジー（Journal of Bacteriolog
y），148,265−273,1981）等が挙げられ、他方、減少し
た大腸菌としては、イー．コリ（E.coli） N99（セル
（Cell），36,43−49,1984）等が挙げられる。
ミドベクターを、プロテアーゼ活性が欠失又は減少した
宿主大腸菌に導入し、蛋白を菌体外に産生させる。プロ
テアーゼ(Protease)活性は、ペプチド結合を加水分解す
る酵素活性を意味するが、「欠失」は大腸菌中で見い出
されている数種類のプロテアーゼ活性の少なくとも一部
を欠失したものであり、「減少」は、通常の大腸菌株、
たとえばイー．コリ（E.coli） HB101が有する活性よ
りも減少していることを意味する。欠失した大腸菌とし
ては、たとえばイー．コリ（E.coli） Ｋ−12SM32，E.
coli Ｋ−12 SM37，E.coli Ｋ−12 SM40（ジヤーナル
オブ バクテリオロジー（Journal of Bacteriolog
y），148,265−273,1981）等が挙げられ、他方、減少し
た大腸菌としては、イー．コリ（E.coli） N99（セル
（Cell），36,43−49,1984）等が挙げられる。
上記の、宿主大腸菌へのプラスミドベクターの導入、培
養は常法によることができる。
養は常法によることができる。
プラスミドベクターとして上記のompＦ遺伝子を含むベ
クターを用いる場合、ompＦプロモータを含む上記した
フラグメントはompＦプロモータの下流にOmpＦ蛋白のシ
グナルペプチドをコードする遺伝子およびOmpＦ蛋白の
構造遺伝子の一部を含むので、目的とする蛋白はＮ末端
にOmpＦ蛋白の一部を含む安定な融合蛋白として得られ
る。
クターを用いる場合、ompＦプロモータを含む上記した
フラグメントはompＦプロモータの下流にOmpＦ蛋白のシ
グナルペプチドをコードする遺伝子およびOmpＦ蛋白の
構造遺伝子の一部を含むので、目的とする蛋白はＮ末端
にOmpＦ蛋白の一部を含む安定な融合蛋白として得られ
る。
得られた融合蛋白は、必要に応じ目的蛋白として単離さ
れる。
れる。
本発明方法によれば、菌の増殖期に依存することなく、
高産生量を持続して蛋白を菌体外に産生することができ
るので、目的蛋白の高産生、分離・精製が容易であり、
実用的価値は大きい。
高産生量を持続して蛋白を菌体外に産生することができ
るので、目的蛋白の高産生、分離・精製が容易であり、
実用的価値は大きい。
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、
本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例により
限定されるものではない。
本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例により
限定されるものではない。
実施例１ 大腸菌Ｋ−12のompＦ形質導入フアージであるλompＦ１
ＤＮＡ（Journal of Bacteriology 145,1085−1090(198
0)）を用いてompＦ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを
単離した。λompＦ１の増殖はSchrenkとWeisbergの方法
（Molecular & General Genetics,137,101−107）に従
つた（Ｌ培地、30℃）。λompＦ１のＤＮＡを常法に従
いフェノール抽出によつて得た後、エタノール沈澱によ
つて回収した。
ＤＮＡ（Journal of Bacteriology 145,1085−1090(198
0)）を用いてompＦ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを
単離した。λompＦ１の増殖はSchrenkとWeisbergの方法
（Molecular & General Genetics,137,101−107）に従
つた（Ｌ培地、30℃）。λompＦ１のＤＮＡを常法に従
いフェノール抽出によつて得た後、エタノール沈澱によ
つて回収した。
このλompＦ１ＤＮＡを制限酵素AluＩで完全切断し、ア
ガロース電気泳動にかけた。ompＦプロモーター部分を
含むAluＩフラグメント（５２８bp）を切り出し（図
２）、ＤＮＡフラグメントの溶出精製を行なつた一方、
図１に示すようにプラスミドpBR３２２をHind IIIで３
７℃、１時間、完全消化し、ついでＳ１ヌクレアーゼで
処理（２０℃、１時間）し、一本鎖部分を除去した。さ
らに、Eco RIリンカー存在下に、４℃、１２時間、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼで処理した後、Eco RI消化（３７℃、１
時間）を行なつた。ついでＴ４ＤＮＡリガーゼで処理し
て環化させたプラスミドで大腸菌HB101を形質転換し、
形質転換株よりpKEN005を得た。
ガロース電気泳動にかけた。ompＦプロモーター部分を
含むAluＩフラグメント（５２８bp）を切り出し（図
２）、ＤＮＡフラグメントの溶出精製を行なつた一方、
図１に示すようにプラスミドpBR３２２をHind IIIで３
７℃、１時間、完全消化し、ついでＳ１ヌクレアーゼで
処理（２０℃、１時間）し、一本鎖部分を除去した。さ
らに、Eco RIリンカー存在下に、４℃、１２時間、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼで処理した後、Eco RI消化（３７℃、１
時間）を行なつた。ついでＴ４ＤＮＡリガーゼで処理し
て環化させたプラスミドで大腸菌HB101を形質転換し、
形質転換株よりpKEN005を得た。
ついで、このpKEN005をEco RIで３７℃、１時間消化し
た。一方、上記AluＩＤＮＡフラグメントとEco RIリン
カーを混合（モル比１：１０）し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
で４℃、１２時間処理し、さらにEco RIで消化し、Eco
RI粘着端を有するAluＩフラグメントを得た。これを上
記pKEN005のEco RI消化プラスミドに導入しpHF001を得
た。
た。一方、上記AluＩＤＮＡフラグメントとEco RIリン
カーを混合（モル比１：１０）し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
で４℃、１２時間処理し、さらにEco RIで消化し、Eco
RI粘着端を有するAluＩフラグメントを得た。これを上
記pKEN005のEco RI消化プラスミドに導入しpHF001を得
た。
また、pKEN005をECo RIで消化し、Ｓ１ヌクレアーゼ処
理した後、AluＩフラグメントと混合し、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼにより平滑末端リゲーシヨンさせ（４℃、１２時
間）、形質転換株よりpHF002を得た。
理した後、AluＩフラグメントと混合し、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼにより平滑末端リゲーシヨンさせ（４℃、１２時
間）、形質転換株よりpHF002を得た。
このpHF002を制限酵素Bgl IIおよびSalＩで消化して得
られる大きいフラグメントと、pHF001をBgl IIおよびSa
lＩで消化して得られる小さいフラグメントを混合し
て、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結し（４℃、１２時
間）、大腸菌HB101を形質転換させ、形質転換株よりpHF
006を得た。
られる大きいフラグメントと、pHF001をBgl IIおよびSa
lＩで消化して得られる小さいフラグメントを混合し
て、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結し（４℃、１２時
間）、大腸菌HB101を形質転換させ、形質転換株よりpHF
006を得た。
上記のようにして、目的とするプラスミドpHF001、pHF0
02およびpHF006を得た。
02およびpHF006を得た。
（β−エンドルフイン様ペプチドの産生） Ｉ ヒトβ−エンドルフインをコードする遺伝子を含む
ＤＮＡフラグメントの調製 (A) 原料プラスミドpA22の調製： プラスミドpA22は、C.Weissmannらが構築したものであ
り、アンププロモータ・オペレータ領域と開始コドンＡ
ＴＧの直後にEco RI部位を有する環状プラスミドであ
る。
ＤＮＡフラグメントの調製 (A) 原料プラスミドpA22の調製： プラスミドpA22は、C.Weissmannらが構築したものであ
り、アンププロモータ・オペレータ領域と開始コドンＡ
ＴＧの直後にEco RI部位を有する環状プラスミドであ
る。
pBR322を制限酵素Mbo IIで３７℃、１時間、部分的に消
化し、次いで、Ｓ１ヌクレアーゼで３７℃、１５分間処
理する。次いでPstＩリンカーで１５℃、１０時間反応
させ、連結させる。PstＩで３７℃、１時間消化後、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼで１５℃、１４時間反応させて連結
し、環状化する。さらにEco RIで３７℃、１時間消化
し、Ｓ１ヌクレアーゼで処理する。Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼで１５℃、１４時間反応後PstＩで３７℃、１時間消
化させ、Ｓ１ヌクレアーゼで３７℃、１５分間処理す
る。Eco RIリンカーで処理後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで１
５℃、１４時間反応させ、ついでEco RIで３７℃１時間
消化する。さらにＴ４ＤＮＡリガーゼで１５℃、１４時
間処理して環状化し、目的物を得た。
化し、次いで、Ｓ１ヌクレアーゼで３７℃、１５分間処
理する。次いでPstＩリンカーで１５℃、１０時間反応
させ、連結させる。PstＩで３７℃、１時間消化後、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼで１５℃、１４時間反応させて連結
し、環状化する。さらにEco RIで３７℃、１時間消化
し、Ｓ１ヌクレアーゼで処理する。Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼで１５℃、１４時間反応後PstＩで３７℃、１時間消
化させ、Ｓ１ヌクレアーゼで３７℃、１５分間処理す
る。Eco RIリンカーで処理後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで１
５℃、１４時間反応させ、ついでEco RIで３７℃１時間
消化する。さらにＴ４ＤＮＡリガーゼで１５℃、１４時
間処理して環状化し、目的物を得た。
次に、これを大腸菌HB101に形質転換し、得られた形質
転換株より、ヘレンスキーの方法（Biochemistry,22,44
28−4440,1970）によりプラスミドＤＮＡを調製した。
このＤＮＡの塩基配列をマキサム−ギルバートの方法に
より、解析し、目的とするＤＮＡであることが確認され
た。
転換株より、ヘレンスキーの方法（Biochemistry,22,44
28−4440,1970）によりプラスミドＤＮＡを調製した。
このＤＮＡの塩基配列をマキサム−ギルバートの方法に
より、解析し、目的とするＤＮＡであることが確認され
た。
(B) ヒトコルチコトロピン−β−リポトロピン（ACTH
−β−LPH）前駆体遺伝子由来のＤＮＡフラグメントの
調製： まず約１１．５Kbpの前駆体遺伝子が原料として使用さ
れる。この前駆体は、２６７のアミノ酸残基を有すると
考えられ、たとえば、中西らの方法（Nature 278,423−
427,1979）によつて、一般的に入手しうるヒト胎盤等由
来のＤＮＡより得られる。
−β−LPH）前駆体遺伝子由来のＤＮＡフラグメントの
調製： まず約１１．５Kbpの前駆体遺伝子が原料として使用さ
れる。この前駆体は、２６７のアミノ酸残基を有すると
考えられ、たとえば、中西らの方法（Nature 278,423−
427,1979）によつて、一般的に入手しうるヒト胎盤等由
来のＤＮＡより得られる。
この１１．５KbpのACTH−β−LPH前駆体フラグメント
と、Eco RIで３７℃、１時間消化されたpBR322とをin v
itro で１５℃、１２時間、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで処理
し、連結する。
と、Eco RIで３７℃、１時間消化されたpBR322とをin v
itro で１５℃、１２時間、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで処理
し、連結する。
次いで、これを用いて大腸菌Ｘ1776を形質転換し、Grun
stein−Hognessのコロニー・ハイブリダイゼーシヨン法
（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72,3961−3965,1975）に
より形質転換を得、これよりプラスミドpHLA−１を得
た。このpHLA−１をEco RIで３７℃、１時間、Bgl IIで
３７℃、１時間消化し、５％ポリアクリルアミドゲルよ
り２．０kbpのフラグメントを単離する。次いでこのフ
ラグメントをpBR322のEco RI−Bam HI３７５bpフラグメ
ントの代わりに導入する。上記と同様にして形質転換株
を得、これよりプラスミドpYT１を得る。次いで、XmaＩ
で３７℃、１時間消化し、５％ポリアクリルアミドゲル
より１．１Kbpフラグメントを単離する。ACTH−β−LPH
前駆体遺伝子の大部分を含むこの１．１kbpフラグメン
トをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端としたのち（３
７℃、３０分）、Eco RIリンカーに１５℃、１４時間で
連結し、のりしろ付のACTH−β−LPH前駆体由来のＤＮ
Ａフラグメントを得た。
stein−Hognessのコロニー・ハイブリダイゼーシヨン法
（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72,3961−3965,1975）に
より形質転換を得、これよりプラスミドpHLA−１を得
た。このpHLA−１をEco RIで３７℃、１時間、Bgl IIで
３７℃、１時間消化し、５％ポリアクリルアミドゲルよ
り２．０kbpのフラグメントを単離する。次いでこのフ
ラグメントをpBR322のEco RI−Bam HI３７５bpフラグメ
ントの代わりに導入する。上記と同様にして形質転換株
を得、これよりプラスミドpYT１を得る。次いで、XmaＩ
で３７℃、１時間消化し、５％ポリアクリルアミドゲル
より１．１Kbpフラグメントを単離する。ACTH−β−LPH
前駆体遺伝子の大部分を含むこの１．１kbpフラグメン
トをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端としたのち（３
７℃、３０分）、Eco RIリンカーに１５℃、１４時間で
連結し、のりしろ付のACTH−β−LPH前駆体由来のＤＮ
Ａフラグメントを得た。
(C) プラスミドpYT３の調製： 上記プラスミドpA22およびACTH−β−LPH由来フラグメ
ントをそれぞれ３７℃、１時間Eco RIで消化した。次
に、この両者をＴ４ＤＮＡリガーゼで１５℃、１０時間
反応させ、結合し、プラスミドpYT３を得た。
ントをそれぞれ３７℃、１時間Eco RIで消化した。次
に、この両者をＴ４ＤＮＡリガーゼで１５℃、１０時間
反応させ、結合し、プラスミドpYT３を得た。
(D) ヒトβ−エンドルフインをコードする遺伝子を含
むＤＮＡフラグエントの調製： 上記プラスミドをHae IIIを用いて３７℃で消化し目的
とするフラグメント（１６０bp）を得た。
むＤＮＡフラグエントの調製： 上記プラスミドをHae IIIを用いて３７℃で消化し目的
とするフラグメント（１６０bp）を得た。
II プラスミドpBR322trpＥの調製 プラスミドRSF2124−trp（Gene，１（1977），141−15
2）を制限酵素Bgl IIで３７℃、１時間消化し、１％ア
ガロース電気泳動により２．３KbのBgl IIフラグメント
を得た。一方、フアージＭ13mp7(7238bp)（Bethesda Re
search Laboratories,Inc.（米国）より入手）を制限酵
素Bgl IIで３７℃、１時間消化し、これと上記Bgl IIフ
ラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて１５℃、１４
時間処理して、結合させた。ついでこれを用いて大腸菌
JM103（上記Bethesda Research製）を形質転換し、Xgal
の色（青から白への変化）を指標として、形質転換株を
得、これよりＲＦをとり、ついでこれを制御酵素Eco RI
で３７℃、１時間消化し、Eco RIフラグメントを得た。
すなわち、このフラグメントは、プロモーター、オペレ
ーターおよびリーダー領域とtrpＥの一部とを含有し、
末端はEco RI部位を形成してなる。
2）を制限酵素Bgl IIで３７℃、１時間消化し、１％ア
ガロース電気泳動により２．３KbのBgl IIフラグメント
を得た。一方、フアージＭ13mp7(7238bp)（Bethesda Re
search Laboratories,Inc.（米国）より入手）を制限酵
素Bgl IIで３７℃、１時間消化し、これと上記Bgl IIフ
ラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて１５℃、１４
時間処理して、結合させた。ついでこれを用いて大腸菌
JM103（上記Bethesda Research製）を形質転換し、Xgal
の色（青から白への変化）を指標として、形質転換株を
得、これよりＲＦをとり、ついでこれを制御酵素Eco RI
で３７℃、１時間消化し、Eco RIフラグメントを得た。
すなわち、このフラグメントは、プロモーター、オペレ
ーターおよびリーダー領域とtrpＥの一部とを含有し、
末端はEco RI部位を形成してなる。
つぎに、プラスミドpBR322を制御酵素Eco RIで３７℃、
１時間消化し、これと上記Eco RIフラグメントをＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて１５℃、１４時間処理して、結合
させた。ついでこれを大腸菌HB101に形質転換し、形質
転換株から、プロモータの上流及び下流にEco RI部位を
有するプラスミドを得た。さらにこのプラスミドEco RI
で３７℃で部分消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで３７
℃、３０分間処理し、ついでＴ４ ＤＮＡリガーゼで１
５℃、１４時間処理して結合させた。ついで大腸菌HB10
1形質転換し、形質転換株より目的とするプラスミドpBR
322trpＥを得た。（６．６kb）。
１時間消化し、これと上記Eco RIフラグメントをＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて１５℃、１４時間処理して、結合
させた。ついでこれを大腸菌HB101に形質転換し、形質
転換株から、プロモータの上流及び下流にEco RI部位を
有するプラスミドを得た。さらにこのプラスミドEco RI
で３７℃で部分消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで３７
℃、３０分間処理し、ついでＴ４ ＤＮＡリガーゼで１
５℃、１４時間処理して結合させた。ついで大腸菌HB10
1形質転換し、形質転換株より目的とするプラスミドpBR
322trpＥを得た。（６．６kb）。
III プラスミドpBR322trpＥβＥの調製 フアージＭ13mp７をHinc IIで３７℃、１時間消化して
得られるフラグメントと上記Ｉ(D)で得られたβ−エン
ドルフインをコードする遺伝子を含むHae IIIフラグメ
ント（１６０ｂｐ）とをＴ４ＤＮＡリガーゼで３７℃、
１４時間処理して連結し、ついで大腸菌JM103を形質転
換し、得られたＲＦをさらにEco RIで３７℃、１時間消
化し５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、β−
エンドルフインをコードする遺伝子を含むEco RIフラグ
メント（１９０bp）を得た。
得られるフラグメントと上記Ｉ(D)で得られたβ−エン
ドルフインをコードする遺伝子を含むHae IIIフラグメ
ント（１６０ｂｐ）とをＴ４ＤＮＡリガーゼで３７℃、
１４時間処理して連結し、ついで大腸菌JM103を形質転
換し、得られたＲＦをさらにEco RIで３７℃、１時間消
化し５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、β−
エンドルフインをコードする遺伝子を含むEco RIフラグ
メント（１９０bp）を得た。
次に、上記プラスミドpBR322trpＥをEco RIで３７℃、
１時間消化し、これと上記Eco RIフラグメントをＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで１５℃、１４時間処理して結合させ、つ
いで大腸菌HB101を形質転換し、ミニスクリーニングに
よる解析により形質転換株から目的とするプラスミドpB
R322trpＥβＥを得た。
１時間消化し、これと上記Eco RIフラグメントをＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで１５℃、１４時間処理して結合させ、つ
いで大腸菌HB101を形質転換し、ミニスクリーニングに
よる解析により形質転換株から目的とするプラスミドpB
R322trpＥβＥを得た。
IV プラスミドpBR322trpＥβＥΔλPLの調製 上記プラスミドpBR322trpＥβＥをＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼとともに制限酵素HpaＩで３７℃、１時間消化し、
ついで制限酵素SalＩで３７℃、１時間消化して１％ア
ガロース電気泳動により小さい方のフラグメントを得
た。一方、プラスミドpBR322をEco RIで３７℃、１時間
消化し、さらにＴ４ＤＮＡポリメラーゼで３７℃、３０
分間処理して、平滑末端を形成させたのち、SalＩで３
７℃、１時間消化して１％アガロース電気泳動により大
きい方のフラグメントを得る。ついで、この二つのフラ
グメントをＴ４ＤＮＡリガーゼで１５℃、１４時間処理
して連結させ、ついで大腸菌HB101を形質転換し、得ら
れる形質転換株より、プラスミドpBR322trpＥβＥΔλP
Lを得た。
ーゼとともに制限酵素HpaＩで３７℃、１時間消化し、
ついで制限酵素SalＩで３７℃、１時間消化して１％ア
ガロース電気泳動により小さい方のフラグメントを得
た。一方、プラスミドpBR322をEco RIで３７℃、１時間
消化し、さらにＴ４ＤＮＡポリメラーゼで３７℃、３０
分間処理して、平滑末端を形成させたのち、SalＩで３
７℃、１時間消化して１％アガロース電気泳動により大
きい方のフラグメントを得る。ついで、この二つのフラ
グメントをＴ４ＤＮＡリガーゼで１５℃、１４時間処理
して連結させ、ついで大腸菌HB101を形質転換し、得ら
れる形質転換株より、プラスミドpBR322trpＥβＥΔλP
Lを得た。
ついで、このプラスミドを制限酵素BamHIで消化（３７
℃、１時間）して、Bam HIフラグメント（１７１bp）を
得た。
℃、１時間）して、Bam HIフラグメント（１７１bp）を
得た。
プラスミドpUC8（Gene，19,259−268(1982)）をBam HI
で消化し、得られる大きい方のBam HIフラグメントと上
記１７１bpのBam HIフラグメントとをＴ４ＤＮＡリガー
ゼで連結（４℃、１２時間）した後、大腸菌HB101を形
質転換し、pUC8βＥを得た。これを制限酵素Eco RIおよ
びSalＩで消化（３７℃、１時間）し、Eco RI−SalＩフ
ラグメント（１８７bp）を得た。
で消化し、得られる大きい方のBam HIフラグメントと上
記１７１bpのBam HIフラグメントとをＴ４ＤＮＡリガー
ゼで連結（４℃、１２時間）した後、大腸菌HB101を形
質転換し、pUC8βＥを得た。これを制限酵素Eco RIおよ
びSalＩで消化（３７℃、１時間）し、Eco RI−SalＩフ
ラグメント（１８７bp）を得た。
一方、上記プラスミドpHF006を制限酵素Eco RIおよびSa
lＩで消化（３７℃、１時間）して、大きい方のフラグ
メントを得、これと上記Eco RI−SalＩフラグメントを
Ｔ４ＤＮＡリガーゼによつて連結（４℃、12時間）し、
大腸菌HB101を形質転換し、形質転換株より目的とする
プラスミドベクターpHF006βＥを得た。
lＩで消化（３７℃、１時間）して、大きい方のフラグ
メントを得、これと上記Eco RI−SalＩフラグメントを
Ｔ４ＤＮＡリガーゼによつて連結（４℃、12時間）し、
大腸菌HB101を形質転換し、形質転換株より目的とする
プラスミドベクターpHF006βＥを得た。
（蛋白の産生） 得られたプラスミドベクターpHF006βＥを、プロテアー
ゼ活性の減少した大腸菌イー・コリ（E.Coli）Ｎ99（セ
ル（Cell）．36,43-49,1984）に導入し、これをＭ−９
培地（エクスペリメンツ イン モレキユラー ゼネテ
ツクス（Experiments in Molecular Genetics），431
頁，Cold Spring Harbor Laboratory(1972)）上で前培
養し、その一部を植菌し本培養した。
ゼ活性の減少した大腸菌イー・コリ（E.Coli）Ｎ99（セ
ル（Cell）．36,43-49,1984）に導入し、これをＭ−９
培地（エクスペリメンツ イン モレキユラー ゼネテ
ツクス（Experiments in Molecular Genetics），431
頁，Cold Spring Harbor Laboratory(1972)）上で前培
養し、その一部を植菌し本培養した。
各増殖期において、遠心分離により培地を分画し、培地
中のβ−エンドルフイン量を、β−エンドルフイン〔
125Ｉ〕を標識としてラジオイムノアセイ(RIA)して、測
定した。結果を表−１に示す。
中のβ−エンドルフイン量を、β−エンドルフイン〔
125Ｉ〕を標識としてラジオイムノアセイ(RIA)して、測
定した。結果を表−１に示す。
なお、後期対数増殖期（６時間後）の培地を１０ml重炭
酸アンモニウムで透析し、凍結乾燥により濃縮し、つい
で１９％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動
を行なつた。その結果、ＲＩＡにおいてβ−エンドルフ
イン活性を有する蛋白バンドが形成された。
酸アンモニウムで透析し、凍結乾燥により濃縮し、つい
で１９％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動
を行なつた。その結果、ＲＩＡにおいてβ−エンドルフ
イン活性を有する蛋白バンドが形成された。
比較例１ 実施例１において、宿主としてイー．コリ（E.Coli）Ｎ
９９を用いないで、イー．コリ（E.Coli）HB101を用い
て培養した以外は、実施例１と同様にしてβ−エンドル
フイン様蛋白を産生させ、ＲＩＡでその産生量を測定し
た。その結果を表−１に示す。
９９を用いないで、イー．コリ（E.Coli）HB101を用い
て培養した以外は、実施例１と同様にしてβ−エンドル
フイン様蛋白を産生させ、ＲＩＡでその産生量を測定し
た。その結果を表−１に示す。
第１図は、本発明において用いられるプラスミドベクタ
ーの一例の製造工程例の概略を示し、第２図はompＦプ
ロモーターを含むAluＩフラグメント（図１）の制限酵
素切断部位を示す。
ーの一例の製造工程例の概略を示し、第２図はompＦプ
ロモーターを含むAluＩフラグメント（図１）の制限酵
素切断部位を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特開 昭55−19092（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−154999（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏ．Ｍａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ. ＵＳＡ，80（14）Ｐ．4432−4436（1983) ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，137（２）Ｐ．171 −174（1982) Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，145（２) Ｐ．1085−1090（1981) Ｃｅｌｌ，36（Ｊａｎ．1984）Ｐ．43− 49
Claims (1)
- 【請求項１】大腸菌由来のｏｍｐＦ蛋白質のシグナルペ
プチドをコードする遺伝子および所望の蛋白をコードす
る遺伝子を含有するプラスミドベクターを、プロテアー
ゼ活性が欠失または減少した宿主大腸菌に導入して同菌
を培養し、産生する蛋白を菌体外に分泌させることを特
徴とする蛋白の産生方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59062981A JPH0646946B2 (ja) | 1984-03-30 | 1984-03-30 | 蛋白の産生方法 |
| DE8484401709T DE3484950D1 (de) | 1983-08-23 | 1984-08-23 | Plasmidvektoren. |
| EP84401709A EP0138644B1 (en) | 1983-08-23 | 1984-08-23 | Novel plasmid vectors |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59062981A JPH0646946B2 (ja) | 1984-03-30 | 1984-03-30 | 蛋白の産生方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60207596A JPS60207596A (ja) | 1985-10-19 |
| JPH0646946B2 true JPH0646946B2 (ja) | 1994-06-22 |
Family
ID=13216043
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59062981A Expired - Lifetime JPH0646946B2 (ja) | 1983-08-23 | 1984-03-30 | 蛋白の産生方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0646946B2 (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4411994A (en) * | 1978-06-08 | 1983-10-25 | The President And Fellows Of Harvard College | Protein synthesis |
| US4338397A (en) * | 1980-04-11 | 1982-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Mature protein synthesis |
-
1984
- 1984-03-30 JP JP59062981A patent/JPH0646946B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ｃｅｌｌ，３６（Ｊａｎ．１９８４）Ｐ．４３−４９ |
| ＦＥＢＳＬｅｔｔ，１３７（２）Ｐ．１７１−１７４（１９８２） |
| Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１４５（２）Ｐ．１０８５−１０９０（１９８１） |
| Ｐｒｏ．Ｍａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０（１４）Ｐ．４４３２−４４３６（１９８３） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60207596A (ja) | 1985-10-19 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |