DE602004004796T2

DE602004004796T2 - Expressionsvektoren, transformierte wirtszellen und fermentationsverfahren zur herstellung rekombinanter polypeptide

Info

Publication number: DE602004004796T2
Application number: DE602004004796T
Authority: DE
Inventors: Jörg Windisch; Kurt Schoergendorfer; Norbert Palma; Franz Knauseder; Hans Boehling
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 2003-08-13
Filing date: 2004-08-12
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2024-08-13
Also published as: EP1656452A2; ATE353969T1; JP2007501623A; ES2281822T3; WO2005017162A2; DE602004004796D1; US20060228783A1; US7785830B2; JP5544063B2; WO2005017162A3; EP1656452B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Expressionsvektor, der ein Polynukleotid umfasst, das für ein Fusionsprotein kodiert, welches die Signalsequenz des gac Gens von Pseudomonas diminuta und ein Polypeptid von Interesse umfasst, eine prokaryontische Wirtszelle, die mit einem solchen Expressionsvektor transformiert ist und ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids von Interesse mittels dieser Wirtszelle und dieses Expressionsvektors.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur effizienten und direkten Bildung eines reifen, rekombinanten Polypeptids in einer prokaryontischen Wirtszelle bereitstellen. Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise vorzugsweise zur Herstellung von rekombinantem, humanem Interferon alpha 2B (rhlFNα2B) in Escherichia coli (E. coli) verwendet werden.
Bei der Herstellung von rekombinanten Proteinen in prokaryontischen Mikroorganismen wie der Expression von humanen oder anderen eukaryontischen Proteinen in bakteriellen Zellen ist es oft schwierig, einen klar definierten N-Terminus zu erhalten, der so weit wie möglich zu 100% homogen ist. Dies trifft insbesondere auf rekombinante, pharmazeutische Proteine zu, deren Aminosäuresequenz in vielen Fällen zur natürlich bei Menschen/Tieren vorkommenden Aminosäuresequenz identisch sein sollte. Jede Inhomogenität oder Abweichung von der natürlichen Sequenz ist jedoch in vielen Fällen unakzeptabel, da diese Produkte häufig unterschiedliche immunologische (beispielsweise Induktion einer Antikörperbildung) und pharmakologische (Halbwertszeit, Pharmakokinetik) Eigenschaften aufweisen. Aus diesen Gründen ist es in den meisten Fällen erforderlich, ein naturidentisches Produkt herzustellen (homogen und ohne fremde Aminosäuren am N-Terminus).
Bei der natürlichen Expression beispielsweise bei Menschen werden viele pharmazeutische Proteine, die verwendet werden, in den extrazellulären Raum transportiert und die Spaltung der Signalsequenz, die in dem Vorläuferprotein für diesen Zweck vorhanden ist, führt zu einem klar definierten N-Terminus. Ein solcher homogener N-Terminus ist aus mehreren Gründen, beispielsweise in Bakterienzellen, nicht immer einfach herzustellen.
Die Synthese aller cytoplasmatischer Proteine in prokaryontischen Mikroorganismen beginnt mit einem Methionin aufgrund des Startcodons ATG, das sowohl eine Translationsinitiationsstelle als auch das Codon für Methionin ist. In Abhängigkeit der Struktur der zweiten Aminosäure nach dem N-terminalen Methionin kann dieses Methionin durch eine Methioninaminopeptidase (MAP) der Wirtszelle abgespalten werden, was zu einem Produktgemisch führt, das entweder mit Met oder mit der zweiten Aminosäure beginnt. Die Trennung dieser zwei Spezies ist sehr schwierig und führt zu verringerten Ausbeuten. Bei der rekombinanten cytoplasmatischen Herstellung eines Polypeptids ist es für einen nicht unbeträchtlichen Teil (1 bis 50%) des Polypeptids nicht ungewöhnlich, von der MAP unbeeinflusst zu bleiben. Daher ist die Herstellung von rekombinanten Polypeptiden mittels eines cytoplasmatischen Met-Expressionssystems oft sehr nachteilig.
Eine weitere Möglichkeit zur Bildung eines reifen rekombinanten Polypeptids über einen cytoplasmatischen Weg ist die Herstellung eines N-terminalen Fusionsproteins mit einer anschließenden chemischen oder enzymatischen in vitro Spaltung. Jedoch ist in vielen Fällen der N-Terminus des Fusionsproteins für eine enzymatische Spaltung nicht leicht zugänglich, was zu niedrigen Spaltungsraten oder zu überhaupt keiner Spaltung führt. Dies kann darauf beruhen, dass der N-Termrinus strukturell unzugänglich ist.
Zusätzlich werden rekombinante Proteine im Cytoplasma von prokaryontischen Mikroorganismen in einem reduzierten Zustand exprimiert, was den Effekt hat, dass Disulfidbindungen, die oft zur korrekten Proteinfaltung und -funktion notwendig sind, nicht oder nicht korrekt gebildet werden. Rekombinante Polypeptide, die Disulfidbindungen enthalten, können daher eine schwierige in vitro Oxidation erfordern.
Ebenfalls führt eine cytoplasmatische Expression oft zur Bildung von Einschlusskörperchen, die unter denaturierenden Bedingungen aufgelöst werden müssen, wonach eine Rückfaltung in die native Struktur vor dem tatsächlichen Reinigungsprozess erfolgt.
Die periplasmatische Expression kann andererseits direkt ein Produkt mit den gewünschten Eigenschaften ergeben:

(i) Korrekter, reifer N-Terminus durch Abspaltung einer periplasmatischen Signalsequenz durch den Signalpeptidaseapparat der Zelle,
(ii) Lösliche Expression aufgrund von korrekter Faltung,
(iii) Korrekte Disulfidbindungsbildung aufgrund des oxidativen Milieus im Periplasma, das sehr ähnlich zu dem ist, das sich in der humanen extrazellulären Flüssigkeit findet (wo das Molekül natürlicherweise gefunden wird).

Demnach ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein periplasmatisches Expressionssystem bereitzustellen, das zur Herstellung eines rekombinanten Polypeptids von Interesse in einer prokaryontischen Wirtszelle geeignet ist.
Es wurde nun überraschenderweise im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass ein Expressionsvektor, der für die Signalsequenz des Glutaryl-7-ACA-Acylasegens (gac-gens) von Pseudomonas diminuta und ein Polypeptid von Interesse kodiert, zur Verwendung in einem Verfahren zur rekombinanten Herstellung des Polypeptids besonders geeignet ist.
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung daher einen Expressionsvektor, der ein Polynukleotid umfasst, das für ein Fusionsprotein kodiert, welches die Signalsequenz des gac Gens von Pseudomonas diminuta und ein anderes Polypeptid von Interesse als gac von Pseudomonas diminuta umfasst, worin die Signalsequenz und das Polypeptid von Interesse so verbunden sind, dass bei der Expression des Polynukleotids in einer geeigneten Wirtszelle die Signalsequenz des Fusionsproteins abgespalten wird und das Polypeptid von Interesse in das Periplasma der Wirtszelle freigesetzt wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Vielzahl an Polypeptiden von Interesse durch die Verwendung des Expressionsvektors hergestellt werden. Beispielsweise kann das Polypeptid von Interesse aus der Gruppe ausgewählt sein, die besteht aus einem Interferon, einem Interleukin, einem Wachstumshormon, einem Wachstumsfaktor, einem Cytokin, einem Enzym, einem Enzyminhibitor, einem Antikörper und einem Antikörperfragment und dergleichen, beispielsweise Interferon alpha 2A, Interferon alpha 2B, Interleukin 3, Interleukin 6, humanes Wachstumshormon, Insulin, Granulocytenkoloniestimulierender Faktor, Granulocyten-Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor, Makrophagenkoloniestimulierender Faktor, Interferon Beta 1, Rindersomatropin, Schweinesomatropin, Interleukin 11, Interleukin 2, ein Fab Fragment und kleine Peptide, wie Calcitonin, Parathormon (PTH) oder Glucagon. Vorzugsweise ist das Polypeptid von Interesse innerhalb des Umfangs der Erfindung ein rekombinantes humanes Interferon 2, insbesondere humanes Interferon alpha 2A oder humanes Interferon alpha 2B, wobei das letztere insbesondere das bevorzugte Polypeptid von Interesse ist.
In Bezug auf das Polypeptid, das den Teil des Fusionsproteins kodiert, der das Polypeptid von Interesse ist, kann eine cDNA oder ein synthetisches Polynukleotid verwendet werden. Falls eine gegebene cDNA oder ein synthetisches Polynukleotid, das einer natürlich vorkommenden Gensequenz entspricht, nur schwach exprimiert wird, kann die Struktur der cDNA oder des synthetischen Polynukleotids an die jeweilige Wirtszelle durch Codonoptimierung angepasst werden.
Daher umfasst innerhalb einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung das Polynukleotid, das für das Polypeptid von Interesse kodiert, welches rhlFNα2B ist, die folgende Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 1)
worin 48 aus 165 Codons des natürlich vorkommenden humanen Interferon alpha 2B in Bezug auf die Nukleotidsequenz ohne der Veränderung der Aminosäuresequenz verändert wurden.
In Bezug auf den Pseudomonas diminuta Stamm weist jeder Pseudomonas diminuta Stamm, der eine Glutaryl-7-aminocephalosporansäureacylaseaktivität zeigt, ein gac Gen auf, das für eine geeignete Signalsequenz kodiert.
Beispielsweise wurde ein solcher Pseudomonas diminuta Stamm in CZ 0 278 515 A unter der Bezeichnungsnummer CCM 3987 beschrieben.
Ein solcher Pseudomonas diminuta Stamm trägt das für das Enzym Glutaryl-7-ACA-acylase kodierende Enzym, das als gac abgekürzt wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft den erfindungsgemäßen Expressionsvektor, worin die Signalsequenz des gac Gens von Pseudomonas diminuta, die einen Teil des Fusionsproteins bildet, die folgende Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) umfasst
MLRVLHRAASALVMATVIGLAPAVAFA.
Beispielsweise kann eine solche Aminosäuresequenz durch die folgende Polynukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 3) kodiert werden
5'-ATG CTG AGA GTT CTG CAC CGG GCG GCG TCC GCC TTG GTT ATG GCG ACT GTG ATC GGC CTT GCG CCC GCC GTC GCC TTT GCG-3'
Ähnlich kann eine Polynukleotidsequenz, worin die Nukleotide so verändert wurden, dass sie eine Restriktionsenzymschnittstelle erzeugen, verwendet werden, solange die Mutationen still sind, das heißt sie nicht die Aminosäuresequenz der gac Signalsequenz verändern, wie sie oben angegeben ist.
Demnach kann ein weiteres Beispiel für eine geeignete Polynukleotidsequenz, die für die gac Signalsequenz kodiert, folgende sein (SEQ ID Nr. 4)
5'-ATG CTG AGA GTT CTG CAC CGG GCG GCG TCC GCC TTG GTT ATG GCG ACT GTG ATC GGC CTT GCG CCC GCG GTC GCC TTT GCG-3',
worin im Vergleich zur oben erwähnten Polynukleotidsequenz eine einzelne Mutation (G → C) in Bezug auf das letzte Nukleotid von Codon 23 eingeführt wurde, um eine Restriktionsenzymschnittstelle (SacII Schnittstelle) zu erzeugen, die bei der weiteren Klonierung verwendet werden kann.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft den erfindungsgemäßen Expressionsvektor, worin der Vektor ein Plasmid ist. Es kann ein Plasmid mit niedriger (etwa 1 bis 10 Kopien pro Zelle), mittlerer (etwa 10 bis 50 Kopien pro Zelle) oder hoher Kopiezahl (etwa > 50 Kopien pro Zelle) verwendet werden. Diese Definitionen treffen zu, falls ein solches Plasmid in einer bevorzugten Umgebung verwendet wird und diese Kopiezahlen können unter bestimmten Fermentationsbedingungen geringer sein, beispielsweise unter verringerten Temperaturbedingungen. Für stark induzierbare Systeme kann ein Basisreplikon mit mittlerer Kopiezahl (beispielsweise pBR322) passend sein, für eine starke Grundexpression aus schwachen oder mittelstarken Expressionselementen (Promotor, RBS, Strukturgen) kann ein Replikon mit hoher Kopiezahl besser geeignet sein (beispielsweise Plasmide der pUC Reihe). Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung, insbesondere in Bezug auf die Bildung von rhlFNα2B wird vorzugsweise ein Plasmid mit hoher Kopiezahl verwendet. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung, worin der Vektor ein Plasmid mit hoher Kopiezahl ist.
Weitere Elemente des erfindungsgemäßen Expressionsvektors umfassen Transkriptions- und Translationselemente, insbesondere einen Promotor und eine Ribosomenbindungsstelle (RBS).
Für eine periplasmatische Expression sollte die Ribosomenbindungsstelle weder zu stark noch zu schwach sein. Ersteres könnte zu einer Überlastung des periplasmatischen Exportapparats (Translokase etc.) und der Ablagerung eines (oft unlöslichen) ungespaltenen Fusionsproteins im Cytoplasma führen. Zweiteres könnte zu schlechten Proteinausbeuten führen. Die Situation auf Transkriptionsebene (Promotor) ist zu der auf Translationsebene (RBS) ähnlich. Die Transkription sollte weder zu stark noch zu schwach sein, um das oben beschriebene Phänomen zu vermeiden. Ebenfalls kann das plötzliche Einsetzen der Proteinproduktion, wenn ein induzierbarer Promotor verwendet wird, Probleme mit einem "Verstopfen" des Exportapparats verursachen oder zumindest ein ausgiebiges Feintuning des Induktionsschritts und der Fermentationsparameter erfordern. Dies führt oft zu wenig robusten Prozessen.
Es wurde festgestellt, dass im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die Promotorregion und die Ribosomenbindungsstelle des gac Gens von Pseudomonas diminuta besonders geeignet ist, um als regulatorische Transkriptions- und Translationselemente zu dienen.
Daher umfasst eine bevorzugte Ausführungsform einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor, worin der Vektor ferner ein Polynukleotid umfasst, das die Promotorregion und die Ribosomenbindungsstelle des gac Gens von Pseudomonas diminuta umfasst, wobei das Polynukleotid operativ an das Polynukleotid gebunden ist, das für das Fusionsprotein kodiert, welches die Signalsequenz und das Polypeptid von Interesse enthält.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hiervon umfasst das Polynukleotid, das die Promotorregion und die Ribosomenbindungsstelle umfasst, die folgende Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 5)
5'-ATCCTGGTTCGTACGCGCCGCCTACAAGTGGTGATCTAGGGGAACGTTCCGGGGGCGTCG CTGCAACGGCGTCTCCGGATCTGGGTGAGAGGGGAAPTCC-3'
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hiervon umfasst das Polynukleotid, das die Promotorregion und die Ribosomenbindungsstelle umfasst, die folgende Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 6)
Weitere Elemente können in einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor vorkommen, wie dies gewünscht wird.
Beispielsweise kann ein Expressionsvektor gemäß der Erfindung ein Polynukleotid umfassen, das einen oder mehrere Transkriptionsterminatoren umfasst.
Ähnlich kann ein Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung ein Polynukleotid umfassen, das einen oder mehrere Selektionsmarker umfasst, um beispielsweise eine Antibiotikumresistenz für die transformierte Wirtszelle bereitzustellen. Es sind geeignete Selektionsmarker in der Technik bekannt. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung umfasst der Expressionsvektor vorzugsweise ein Polynukleotid, das ein Tetracyclinresistenzgen umfasst.
Zusätzlich können, wo dies geeignet ist, weitere regulatorische Elemente auf einem Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung vorhanden sein. Regulatorische Elemente sind in der Technik gut bekannt, wie ein Repressor oder ein Enhancer.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung prokaryontische Wirtszellen, die mit einem Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert sind, um die Expression des Polypeptids von Interesse herbeizuführen.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung eine prokaryontische Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der mit der Wirtszelle kompatibel ist, wobei der Vektor ein Polynukleotid umfasst, das für ein Fusionsprotein kodiert, welches die Signalsequenz des gac Gens von Pseudomonas diminuta und ein anderes Polypeptid von Interesse als gac von Pseudomonas diminuta umfasst, worin die Signalsequenz und das Polypeptid von Interesse so verbunden sind, dass bei der Expression des Polynukleotids in einer geeigneten Wirtszelle die Signalsequenz des Fusionsproteins abgespalten wird und das Polypeptid von Interesse in das Periplasma der Wirtszelle freigesetzt wird.
Beispiele für geeignete Polypeptide von Interesse sind jene, die oben erwähnt sind. Eine bevorzugte Ausführungsform hiervon betrifft eine solche prokaryontische Wirtszelle, worin das Polypeptid von Interesse ein Interferon alpha 2 ist. Insbesondere wird ein solches Interferon alpha 2 aus der Gruppe ausgewählt, die aus Interferon alpha 2A und Interferon alpha 2B besteht, wobei das letztere bevorzugt ist.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform hiervon betrifft eine Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung, worin der Vektor ein Plasmid ist, vorzugsweise ein Plasmid mit hoher Kopiezahl.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung, worin die Signalsequenz des gac Gens von Pseudomonas diminuta die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) umfasst
MLRVLHRAASALVMATVIGLAPAVAFA.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die erfindungsgemäße Wirtszelle, worin der Vektor ferner ein Polynukleotid umfasst, das die Promotorregion und die Ribosomenbindungsstelle des gac Gens von Pseudomonas diminuta umfasst, wobei das Polynukleotid operativ an das Polynukleotid gebunden ist, das für das Fusionsprotein kodiert, das die Signalsequenz und das Polypeptid von Interesse umfasst.
Ein solches Polynukleotid, das die Promotorregion und die Ribosomenbindungsstelle umfasst, umfasst vorzugsweise die Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 5)
5'-ATCCTGGTTCGTACGCGCCGCCTACAAGTGGTGATCTAGGGGAACGTTCCGGGGGCGTCG CTGCAACGGCGTCTCCGGATCTGGGTGAGAGGGGAAATCC-3'.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hiervon umfasst ein solches Polynukleotid, das die Promotorregion und die Ribosomenbindungsstelle umfasst, die folgende Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 6)
Bezüglich der prokaryontischen Wirtszellen ist diese erfindungsgemäße Wirtszelle eine Gramnegative Wirtszelle. Vorzugsweise ist eine solche bakterielle Wirtszelle aus der Gruppe ausgewählt, die besteht aus Escherichia coli (E. coli), Pseudomonas sp., Enterobacter sp., Campylobacter sp., und Vitreoscilla sp., wobei E. coli besonders bevorzugt ist. Vorzugsweise werden Derivate von E. coli K12 verwendet, da solche Stämme eine lange Historie für eine sichere Verwendung aufweisen und besonders geeignet für eine periplasmatische Expression sind. Genauso können andere E. coli Typen verwendet werden, wie beispielsweise E. coli B Derivate.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die prokaryontische Wirtszelle von E. coli W3110 (ATCC 27325) abgeleitet. Ein solcher Stamm wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA am 28. Februar 2001 unter der Bezeichnungsnummer PTA-3132 hinterlegt.
E. coli W3110 (ATCC 27325) und der hinterlegte Stamm ATCC PTA-3132 können genetisch folgendermaßen charakterisiert werden:
Escherichia coli K-12 [F^– mcrA mcrB IN rrnD-rrnE) I Lambda]
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids von Interesse, das umfasst

(i) Bereitstellung einer prokaryontischen Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, welcher mit der Wirtszelle kompatibel ist, wobei der Vektor ein Polynukleotid enthält, das für ein Fusionsprotein kodiert, welches die Signalsequenz des gac Gens von Pseudomonas diminuta und ein anderes Polypeptid von Interesse als gac von Pseudomonas diminuta umfasst, worin die Signalsequenz und das Polypeptid von Interesse so verbunden sind, dass bei der Expression des Polynukleotids in einer geeigneten Wirtszelle die Signalsequenz des Fusionsproteins abgespalten wird und das Polypeptid von Interesse in das Periplasma der Wirtszelle freigesetzt wird, und
(ii) Kultivierung der prokaryontischen Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des Polynukleotids veranlassen, wobei bei der Bildung des Fusionsproteins die Signalsequenz des Fusionsproteins abgespalten wird und das Polypeptid von Interesse in das Periplasma der Zelle freigesetzt wird.

Wahlweise umfasst das erfindungsgemäße Verfahren ferner die Isolierung des Polypeptids von Interesse.
Beispiele für geeignete Polypeptide von Interesse sind jene, die oben erwähnt sind. Eine bevorzugte Ausführungsform hiervon betrifft eine prokaryontische Wirtszelle, worin das Polypeptid von Interesse ein Interferon alpha 2 ist. Insbesondere ist ein solches Interferon alpha 2 aus der Gruppe ausgewählt, die besteht aus Interferon alpha 2A und Interferon alpha 2B, wobei letzteres bevorzugt ist.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform hiervon betrifft das erfindungsgemäße Verfahren, worin der Vektor ein Plasmid ist, vorzugsweise ein Plasmid mit hoher Kopiezahl.
Die vorliegende Erfindung begrifft ferner ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, worin die Signalsequenz des gac Gens von Pseudomonas diminuta die folgende Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) umfasst
MLRVLHRAASALVMATVIGLAPAVAFA.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung das erfindungsgemäße Verfahren, worin der Vektor ferner ein Polynukleotid umfasst, das die Promotorregion und die Ribosomenbindungsstelle des gac Gens von Pseudomonas diminuta umfasst, wobei das Polypeptid operativ an das Polynukleotid gebunden ist, das für das Fusionsprotein kodiert, welches die Signalsequenz und das Polypeptid von Interesse umfasst.
Ein solches Polynukleotid, das die Promotorregion und die Ribosomenbindungsstelle umfasst, umfasst vorzugsweise die folgende Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 5)
5'-ATCCTGGTTCGTACGCGCCGCCTACAAGTGGTGATCTAGGGGAACGTTCCGGGGGCGTCG CTGCAACGGCGTCTCCGGATCTGGGTGAGAGGGGAAATCC-3'.
In einer weiteren Ausführungsform hiervon umfasst ein solches Polynukleotid, das die Promotorregion und die Ribosomenbindungsstelle umfasst, die folgende Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 6)
In Bezug auf die prokaryontischen Wirtszellen ist die Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise eine E. coli Zelle, wobei die Auswirkungen hiervon oben im Detail beschrieben wurden.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung den Kultivierungsteil (oder Fermentationsteil) des Verfahrens, der die transformierte Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet.
Es können viele Faktoren die Produktivität der Fermentationsprozesse beeinflussen, die rekombinante Organismen verwenden. Die angewendete Fermentationsstrategie muss die empfindlichen Beziehungen zwischen der mikrobiellen Physiologie und der Plasmidkopiezahl, Plasmidstabilität und Genexpression berücksichtigen, die nicht nur auf Genebene bestimmt werden, sondern auch durch die Medienzusammensetzung und die Verfahrensbedingungen. Neben der Stabilität des Wirtsstamms ist die Stabilität des Produkts von großer Bedeutung für eine starke Produktion von rekombinanten Proteinen.
Zur Entwicklung eines Fermentationsverfahrens unter Verwendung eines konstitutiven Expressionssystems werden die Wachstumsbedingungen und die rekombinante Produktbildung eng in Bezug zueinander gesetzt. Daher ist der Aufwand für optimales Wachstum und Kontrolle der Wachstumsbedingungen, die zur Produktbildung während dem gesamten Fermentationslauf in enger Beziehung stehen, höher im Vergleich zu induzierten Expressionssystemen.
Typische E. coli Fermentationsprozesse zur Herstellung von rekombinanten Proteinen sind durch kurze Fermentationszeiten zwischen wenigen Stunden und etwa 100 Stunden Kultivierung gekennzeichnet. Meistens werden nicht nur eine Kohlenstoffquelle sondern auch verschiedene komplexe oder anorganische Stickstoffquellen, unterschiedliche Salze und Spurenelemente E. coli Kulturen zugefüttert. Die Kohlenstofffütterung folgt gewöhnlich Zeitprofilen mit einer stufenweisen Zunahme oder exponentiellen Zunahme der Fütterungsraten. Manchmal werden auch Gemische aus Kohlenstoffquellen während E. coli Fermentationen verwendet. Die Fütterung der Kohlenstoffquelle ist gewöhnlich an die Sauerstofftransferkapazität des Bioreaktors durch die Verwendung verschiedener Kontrollstrategien gekuppelt.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, einen robusten und reproduzierbaren Fermentationsprozess basierend auf dem gac Expressionssystem und entsprechend transformierten Wirtszellen gemäß der vorliegenden Erfindung zur periplasmatischen Expression eines Polypeptids von Interesse mit hohen Ausbeuten ohne die Verwendung einer ausgiebigen Stickstoffquellenfütterung und optional ohne die Zugabe von Spurenelementen zum Fermentationsmedium bereitzustellen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird im Prinzip durch die anfängliche Kultivierung der bakteriellen Wirtszelle, das heißt dem Expressionsstamm, gemäß der an sich bekannten mikrobiologischen Praxis ausgeführt. Der Stamm wird im allgemeinen ausgehend von einer Einzelkolonie auf einem Nährmedium angezogen, es ist aber auch möglich, kryokonservierte Zellsuspensionen (Zellbänke) zu verwenden. Der Stamm wird im allgemeinen in einem Multistufenverfahren kultiviert, um ausreichend Biomasse für eine weitere Verwendung zu haben.
Im kleinen Maßstab kann dies in Schüttelkolben stattfinden, wobei es in den meisten Fällen möglich ist, ein komplexes Medium (beispielsweise LB Medium) zu verwenden. Jedoch ist es auch möglich, definierte Medien (beispielsweise Citratmedium) zu verwenden. Zur Kultivierung wird eine kleinvolumige Vorkultur des Wirtsstamms (angeimpft mit einer Einzelkolonie oder mit einer Zellsuspension aus einer Kryokultur) angezogen, wobei die Temperatur für diese Kultivierung im allgemeinen nicht für das spätere Expressionsergebnis entscheidend ist, so dass es möglich ist, routinemäßig bei relativ hohen Temperaturen zu arbeiten (beispielsweise 30°C oder 37°C). Die Hauptkultur wird in einem größeren Volumen (beispielsweise 500 ml) angesetzt, wobei es insbesondere notwendig ist, eine gute Belüftung sicherzustellen (großes Kolbenvolumen im Vergleich zum Volumen des Inhalts, schnelle Rotation). Da es beabsichtigt ist, dass die Expression in löslicher Form stattfindet, wird die Hauptkultur in den meisten Fällen bei einer etwas geringeren Temperatur (beispielsweise 22°C oder 28°C) ausgeführt. Sowohl induzierbare Systeme (beispielsweise trp, lac, tac oder pho A Promotor) und konstitutive Systeme (wie das bevorzugte System der vorliegenden Erfindung, das den gac Promotor enthält) sind zur Bildung von löslichen Proteinen geeignet. Die entstehenden Zellen können geerntet und weiterverarbeitet werden.
Im großen Maßstab besteht das Mehrstufenverfahren aus einer Mehrzahl an Bioreaktoren (Fermentern), die vorzugsweise definierte Nährmedien, um die Verfahrenstechnikkontrolle des Verfahrens zu verbessern oder komplexe Nährmedien enthalten, um das Wachstum des Mikroorganismus zu verbessern und die Robustheit des Verfahrens zu erhöhen. Zusätzlich ist es möglich, die Biomasse und die Produktbildung durch Fütterung von bestimmten Nährstoffen stark zu erhöhen (Fad Batch Modus). Beispielsweise werden ein Vorfermenter und ein Hauptfermenter verwendet. Der Vorfermenter wird mit einem sogenannten Inokulum angeimpft, das im allgemeinen aus einer Einzelkolonie oder einer Kryokultur in einem Schüttelkolben angezogen wurde. Eine gute Belüftung muss auch im Fermenter und speziell in der Hauptstufe hiervon sichergestellt werden. Die entstehenden Zellen werden erneut für eine weitere Prozessierung geerntet.
Demnach wird in einer bevorzugten Ausführungsform die Kultur (oder Kultivierung) des erfindungsgemäßen Verfahrens als Mehrstufenprozess ausgeführt, der einen Vorkulturschritt und einen Hauptkulturschritt umfasst. In einer Alternative ist eine Einstufenfermentation ohne Vorkultivierungsschritt möglich. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren, wie es hierin beschrieben ist, als Mehrstufenfermentationsverfahren ausgeführt, das einen Schüttelkolbenschritt, optional einen Vorkulturschritt und einen Hauptkulturschritt umfasst.
Insbesondere wird die Kultivierung der prokaryontischen Wirtszelle im Hauptkulturschritt in einem Kulturmedium ausgeführt, das ein Substrat für mehr als etwa 90% der Kultivierungszeit mit einer Substratkonzentration umfasst, die geringer ist als die Sättigungskonstante des Substrats, das von großen Mengen an gelöster Sauerstoffkonzentration begleitet wird und ferner durch eine stetig abnehmende spezifische Wachstumsrate der bakteriellen Wirtszellen begleitet wird, wobei das Verfahren bei einer Temperatur ausgeführt wird, die geringer ist als die optimale Temperatur für das Wachstum der Wirtszelle.
In diesem Zusammenhang ist die Sättigungskonstante die Konzentration eines Substrats (insbesondere der Kohlenstoffquelle), bei der die Wirtszelle bei einer spezifischen Wachstumsrate wächst, die zu 50% der maximalen spezifischen Wachstumsrate äquivalent ist.
In diesem Zusammenhang ist die spezifische Wachstumsrate die Zunahme der Biomassekonzentration in einem bestimmten Zeitintervall dividiert durch die mittlere Biomassekonzentration des Zeitintervalls.
Vorzugsweise ist das Kulturmedium der Hauptkultur wie auch, wo anwendbar, das der Vorkultur ein komplexes Medium, das eine komplexe Stickstoffquelle, vorzugsweise einen Hefeextrakt, verschiedene Salze und eine Kohlenstoffquelle umfasst, um das anfängliche Wachstum der Wirtszelle zu unter stützen. In einer bevorzugten Ausführungsform hiervon wird die Kohlenstoffquelle entweder zum Hauptkulturmedium durch Füttern der Kohlenstoffquelle nach der Beimpfung gegeben oder ist vorzugsweise in der Hauptkultur zum Zeitpunkt der Beimpfung vorhanden.
Vorzugsweise ist die Konzentration des gelösten Sauerstoffs im Hauptkulturschritt höher als etwa 20%, bevorzugter etwa 40% bis etwa 100% der Sättigung.
Vorzugsweise beträgt die stetig abnehmende Wachstumsrate im Hauptkulturschritt etwa 2 h^–1 bis etwa 0,001 h^–1.
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Temperatur im Hauptkulturschritt zwischen etwa 22°C und etwa 35°C, vorzugsweise zwischen etwa 25°C und etwa 31°C, vor allem etwa 28°C.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Kultivierung in der Vorkultur und/oder Hauptkultur bei einem pH Wert im Bereich von etwa 6,7 bis etwa 7,3 ausgeführt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Substrat Glycerin oder vorzugsweise ein Kohlenhydrat. Vorzugsweise ist das Kohlenhydrat Glucose.
Wie hierin erwähnt sind Beispiele für geeignete Proteine von Interesse jene, die oben erwähnt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid von Interesse ein Interferon alpha 2. Insbesondere ist ein solches Interferon alpha 2 aus der Gruppe ausgewählt, die besteht aus Interferon alpha 2A und Interferon alpha 2B, wobei das letztere bevorzugt ist.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform bezüglich aller Aspekte der Prozesse der vorliegenden Erfindung ist die Wirtszelle eine E. coli Zelle.
Das Polypeptid von Interesse kann dann durch Proteinreinigungsverfahren isoliert werden, die dem Fachmann bekannt sind (siehe beispielsweise M.P. Deutscher in: Methods in Enzymology: Guide to Protein Purification, Academic Press Inc., (1990), 309-392). Eine Reinigungssequenz umfasst im allgemeinen einen Zellzerstörungsschritt, einen Klärschritt (Zentrifugation oder Mikrofiltration) und verschiedene chromatographische Schritte, Filtrationen und/oder Fällungen. Ein geeignetes Beispiel für die Isolierung eines Polypeptids von Interesse, das gemäß der vorliegenden Erfindung gebildet wird, wird im folgenden angegeben.
Hinterlegung von Mikroorganismen
Der E. coli Stamm W3110 (ATCC 27325) wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA 28. Februar 2001 unter der Hinterlegungsnummer PTA-3132 hinterlegt.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung, ohne den Schutzumfang hiervon zu beschränken. Der in den Beispielen beschriebene Gegenstand bezieht sich auf bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
Beispiel
Beispiel 1: Konstruktion eines Wirtszellstamms zur Herstellung eines rekombinanten humanen Interferons alpha 2B (rhlFNα2B).
1.1 Allgemeine Betrachtungen
Das Polypeptid rhlFNα2b (rekombinantes humanes Interferon α2b) wird im Escherichia coli K12 Stamm W3110 gebildet, der mit einem Plasmid transformiert ist, das ein optimiertes synthetisches Gen enthält, das für rhlFNα2b kodiert. rhlFNα2b wird unter der Kontrolle des Promotors und der Ribosomenbindungsstelle (RBS) des Glutaryl-7-ACA Acylasegens (gac) von Pseudomonas diminuta CCM 3987 durch Fermentation des rekombinanten E. coli K12 gebildet. rhlFNα2b wird als N-terminales Fusionsprotein mit der Signalsequenz vom selben Gen (gac) exprimiert, die das Protein in das Periplasma mit anschließender Prozessierung (Abspaltung) der Signalsequenz dirigiert. Der Fermentationsprozess ergibt daher direkt reifes rhlFNα2b mit einer Primärsequenz, die zu der von natürlich vorkommendem humanem Interferon alpha 2b identisch ist. Das Expressionsplasmid wird als pMG414 bezeichnet, der Produktionsstamm als W3110 [pMG414].
1.2. Konstruktion des Expressionsvektors pNG414
pUC19 dient als Ausgangspunkt zur Konstruktion des Vektorplasmids. pUC19 wird häufig verwendet und ist ein gründlich charakterisiertes Plasmid mit hoher Kopiezahl. Es enthält einen sehr effizienten Replikationsursprung und ein Ampicillinresistenzgen (amp oder bla) (Yanish-Perron et al., 1985, Vieira und Messing, 1982, GenBank Hinterlegungsnummern L09137 und X02514).
Obwohl pUC19 häufig zur Konstruktion der Expressionsplasmide verwendet wird, kann das amp Gen kein idealer Selektionsmarker für industrielle Zwecke sein. Aus diesem Grund werden der Promotor und die kodierende Region des amp Gens entfernt und durch den Promotor und die kodierende Region des Tetracyclinresistenzgens (tet) vom gut bekannten Sicherheitsplasmid pBR322 ersetzt (Bolivar et al., 1977a, 1977b, 1978, Zusammenfassung: Balbás et al., 1986, GenBank Hinterlegungsnummern J01749, K00005, L08654, M10283, M10286, M10356, M10784, M10785, M10786, M33694, V01119). Diese Klonierungsarbeit wird mit Hilfe der Hochleistungs PCR Techniken ausgeführt.
Um dies zu erreichen, wird das Fragment, das die Basenpaare 1743 bis 679 von pUC19 umfasst, mit Hochleistungs PCR (Pwo DNA Polymerasesystem von Roche Biochemicals) und den folgenden 5'-phosphorylierten Oligonukleotiden amplifiziert:
Oligo 235: 5'-Phosphat-TAACTGTCAG ACCAAGTTTA CTC-3' (SEQ ID Nr. 7)
Oligo 236: 5'-Phosphat – GCGTTTCGGT GATGACGGTG-3' (SEQ ID Nr. 8)
Das entstehende PCR Fragment ist 1624 bp lang und enthält das vollständige pUC19 Rückgrad, dem der amp Promotor und die kodierende Sequenz fehlt, das aber das Stopcodon und den Transkriptionsterminator des amp Gens enthält.
Wie oben erwähnt wird der tet Promotor und die kodierende Sequenz (ausschließlich das Stopcodon) aus pBR322 amplifiziert. Es wird erneut eine Hochleistungs PCR verwendet, um die Basenpaare 4 bis 1273 von pBR322 zu amplifizieren. Es werden die folgenden 5'-phosphorylierten Oligonukleotide zur Amplifikation verwendet:
Oligo 237: 5'-Phosphat – TCATGTTTGA CAGCTTATCA TCG-3' (SEQ ID Nr. 9)
Oligo 238: 5'-Phosphat – GGTCGAGGTG GCCCGGCTC-3' (SEQ ID Nr. 10)
Das entstehende PCR Fragment ist 1270 bp lang. Die zwei PCR Fragmente werden durch eine präparative Agarosegelelektrophorese gereinigt und mittels T4 DNA Ligase ligiert (Rapid DNA Ligation Kit, Roche Biochemicals). Die ligierte DNA wird gereinigt und in Escherichia coli K12 DH10B elektroporiert (Life Technologies ElectroMAX DH10B elektrokompetenten Zellen des folgenden Genotyps: F^– mcrA Δ(mrr – hsdRMS – mcrBS) Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ^– rpsL nupG). Die transformierten Zellen werden auf LB Agar mit 15 mg/l Tetracyclin und 3 g/l Glucose ausplattiert. Es werden Flüssigkulturen in LB Medium angezogen, worin 15 mg/l Tetracyclin und 3 g/l Glucose enthalten sind und die Plasmid DNA wird aus diesen Kulturen mittels Standardminipräparationsverfahren isoliert. Die Plasmid DNAs werden durch Restriktionsanalyse auf die korrekte Integration des tet Fragments in das pUC19 Rückgrad analysiert. Da die Integration des Fragments in Bezug auf die Orientierung unspezifisch ist, haben nur etwa 50% aller Insert-enthaltenden Klone das Fragment in der korrekten Orientierung inseriert, das heißt dass das tet Gen in dieselbe Richtung läuft, wie das amp Gen in pUC19. Es wird eine größere Menge an DNA aus den Flüssigkulturen einiger weniger Klone isoliert und detaillierteren Restriktionsanalysen unterzogen. Von diesen Klonen, die die korrekten Restriktionsmuster zeigen, wird einer für die weitere Klonierungsarbeit ausgewählt.
Das entsprechende Plasmid wird mit pMG402 bezeichnet. Es ist zu pUC19 in allen Merkmalen und Funktionen identisch bis auf die Tatsache, dass es auf/in Tetracyclin-enthaltenden Medien anstelle von Ampicillin-enthaltenden Medien angezogen werden muss. Auf diese Weise wird ein tet resistenter Vektor mit hoher Kopiezahl erzeugt, der für industrielle Zwecke geeignet ist.
Merkmale von Plasmid pMG402:

Basenpaare 1954-680: pUC19 Rückgrad (= pUC19, dem der amp Promotor und das Strukturgen fehlen)
Basenpaare 681-1953: tet Promotor und das Strukturgen von pBR322

Das rhlFNα2b wird als N-terminale Fusion mit der Signalsequenz von Glutaryl-7-ACA Acylase von Pseudomonas diminuta CCM 3987 (gaclss = SEO ID Nr. 2) exprimiert, die das Protein in das Periplasma unter gelichzeitiger Prozessierung (Abspaltung) der Signalsequenz des Signalpeptidaseapparats der Wirtszelle dirigiert.
Die Aminosäuresequenz von gac1ss (27 AA): MLRVLHRAAS ALVMATVIGL APAVAFA
In der 3'-Region der kodierenden Sequenz von gac1ss wird durch den 3' PCR Primer eine SacII Restriktionsendonukleasestelle eingeführt, was eine stille Mutation erzeugt (unveränderte Aminosäuresequenz). Diese SacII Schnittstelle erlaubt die Fusion der für gac1ss kodierenden Region mit dem rhlFNα2b Gen.
Das Strukturgen für rhlFNα2b wird chemisch synthetisiert. Es unterscheidet sich von der natürlichen humanen cDNA Sequenz in 48 von 165 Codons und ist entworfen worden, um alle schwachen und fehlerträchtigen Codons zu eliminieren.
In der folgenden Tabelle sind die Codonveränderungen angegeben. In der Tabelle steht "Natürliches Codon" für die von Streuli et al, 1980 publizierte cDNA Sequenz (GenBank Hinterlegungsnummer V00548). Die Aminosäurenummern beziehen sich auf reifes hlFNα2b (beginnend mit Cys 1). Die durch das synthetische Gen zu kodierende Aminosäuresequenz wird von der SwissProt Database mit der Hinterlegungsnummer P01563/P01564 (Aminosäuren 24 bis 188) entnommen.
Das resultierende Gen erlaubt eine effiziente und präzise Transkription und Translation von rhlFNα2b in Escherichia coli. Da das Gen zur Expression in einem bakteriellen System entworfen wurde, enthält es keine untranslatierten Sequenzen (Introns etc.)
Das Strukturgen wird chemisch synthetisiert. Kurz gesagt werden überlappende komplementäre Oligonukleotide mit einer Länge von etwa 30 bis 50 Nukleotiden auf eine Weise synthetisiert, um beide Stränge der Strukturgensequenz ohne Lücken abzudecken. Die Oligonukleotide werden miteinander hybridisiert und mittels T4 DNA Ligase ligiert. Das Reaktionsprodukt wird mit Restriktionsendonukleasen geschnitten und in den pUC18 Vektor kloniert. Das entstehende Plasmid wird sequenziert und zeigt die korrekte Sequenz.
Das synthetische Gen auf diesem Plasmid enthält keine gac Signalsequenz. Dieser Teil der kodierenden Region wird über den das gac Fragment enthaltenden Promotor, die RBS und die Signalsequenz eingeführt und an das rhlFNα2b Strukturgen fusioniert.
Das gac Fragment wird durch chemische Synthese erzeugt. Beispielsweise werden überlappende komplementäre Oligonukleotide mit einer Länge von etwa 30 bis 50 Nukleotiden auf eine Weise synthetisiert, um die volle Länge beider Stränge des gac Fragments (einschließlich der Restriktionsendonukleaseerkennungsstellen auf beiden Seiten plus ein Minimum von 6 zusätzlichen Basenpaaren, um eine effiziente Spaltung zu erlauben) ohne Lücken abzudecken. Die Oligonukleotide werden dann miteinander hybridisiert (beispielsweise durch Erhitzen und anschließendes Kühlen) und mittels T4 DNA Ligase ligiert. Das Reaktionsprodukt wird dann mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen (XbaI und EcoRI) geschnitten und in den pMG402 Vektor (siehe später) kloniert.
In einer Alternative kann das gac Fragment, das den Promotor, die RBS und die Signalsequenz enthält, aus einem Plasmid amplifiziert werden, das solche Elemente umfasst, wie das Plasmid pKS55, dessen Konstruktion in CS 278 515 A beschrieben ist. Das hierin klonierte gac Gen wurde von einem Stamm von Pseudomonas diminuta (CCM 3987) abgeleitet. Die Amplifizierung wird mittels eines Hochleistungs PCR Systems ausgeführt. Die Restriktionsendonukleasestellen, die zur Klonierung erforderlich sind, werden über die folgenden PCR Primer eingeführt.
Primer:

1. 5'-Phosphat – GGGGGGTCTAGACCAACAACATCTTCAACGTCTACC-3' (SEQ ID Nr. 11)
2. 5'-Phosphat – CC CCC CGA ATT CAC TAG TAC GCG TCT CTC TCC-3' (SEQ ID Nr. 12)

Es besteht kein Unterschied in der Wirksamkeit zwischen einem gac Fragment, das über eine Hochleistungs PCR Amplifikation erzeugt wurde und einem gac Fragment, das durch chemische Synthese erzeugt wurde.
Das so erzeugte gac Fragment hat die folgende Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 13):
Das gac Fragment (entweder synthetisch oder über PCR erzeugt) und das Vektorplasmid pMG402 werden mittels der XbaI und EcoRI Schnittstellen ligiert. Auf diese Weise wird der Expressionsvektor pMG412 erzeugt.
Der Expressionsvektor pMG412 enthält die Codons 1 bis 23 plus das erste Nukleotid von Codon 24 der gac Signalsequenz. In die Codons 22-24 wird die SacII Schnittstelle durch eine stille Mutation eingeführt. Alles stromabwärts der SacII Schnittstelle in pMG412 ist Primer oder Vektorsequenz.
Die letzten 2 Nukleotide von Codon 24 und die Codons 25 bis 27 werden durch den Vorwärts PCR Primer für das Zielstrukturgen (rhlFNα2B, siehe oben) eingeführt. Ein solcher Primer enthält daher die folgenden Elemente:
Schnittstellenüberhang (beispielsweise 6 Nukleotide) – Sac II Schnittstelle – tc gcc ttt gcg (SEQ ID Nr. 14) – Hybridisierungsregion, die dem 5' Ende des "reifen" Zielgens entspricht.
Insbesondere hat ein geeigneter Primer die folgende Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 15):
TT GCG CCC GCG GTC GCC TTT GCG – Hybridisierungsregion (Sac II unterstrichen)
Die letzten Aminosäuren (24 bis 27) der gac Signalsequenz sind V A F A (SEQ ID Nr. 16).
Aus dem oben beschriebenen Plasmidkonstrukt wird das rhlFNα2b Gen mittels eines Hochleistungs PCR Systems amplifiziert. Der 5' PCR Primer enthält die zur Fusion des Gens mit dem gac Fragment verwendete SacII Schnittstelle plus die letzten vier Codons der gac Signalsequenz. Der 3' Primer enthält das TAA (ochre) Stopcodon und die MluI Schnittstelle zur Klonierung. Die Amplifikation des Interferon alpha Strukturgens erzeugt das folgende Fragment (SEQ ID Nr. 17)

Dieses rhlFNα2b PCR Fragment und pMG412 werden mittels der SacII und MluI Schnittstellen ligiert. Auf diese Weise wird das schließliche Produktions-/Expressionsplasmid pMG414 erzeugt. Beide Stränge von pMG414 werden sequenziert und zeigen keine Unterschiede zur erwarteten Sequenz. Merkmale von Plasmid pMG414 (Gesamtgröße 3668 Basenpaare):

Basenpaare 2728-256:	pUC19 Rückgrad, Teil 1
Basenpaare 257-546:	gac Fragment (Promotor, RBS, Signalsequenz)
Basenpaare 547-1044:	Synthetisches rhlFNα2b Gen (einschließlich des TAA Stopps)
Basenpaare 1045-1454:	Klonierungsstellen + pUC19 Rückgrad, Teil 2
Basenpaare 1455-2727:	tet Gen aus pBR322 (Promotor/RBS 1455-1536, kodierende Sequenz einschließlich TAA Stop 1537-2727).

Hierbei wird das gac Fragment, das den Promotor, die RBS und die Signalsequenz enthält, an das rhlFNα2b Strukturgen unter Verwendung einer Restriktionsendonukleasestelle am 3' Ende des gac Fragments fusioniert, die durch einen PCR Primer eingeführt wurde. Dieselbe Stelle wird an das 5' Ende des rhlFNα2b Strukturgens durch einen PCR Primer fusioniert. So wird nach dem Klonieren beider Elemente (gac Fragment und rhlFNα2b Strukturgen) in den Basisvektor ein Gen erzeugt, das für ein gac1ssrhlFNα2b Fusionsprotein erzeugt wird. Von den insgesamt 192 Codons (576 Nukleotide) kodieren die ersten 27 die gac Signalsequenz, die nicht im schließlichen Protein vorhanden ist und die Aminosäuren 28 bis 192 kodieren das reife rhlFNα2b (165 Aminosäuren, Cystein 1 bis Glutaminsäure 165).
Die Nukleotidsequenz der im rhlFNα2b Expressionsplasmid pMG414 (807 bp) (siehe später) verwendeten Expressionskassette und die Aminosäuresequenz des gac1ss-rhlFNα2b Fusionsproteins sind im folgenden gezeigt (SEQ ID Nr. 18):
Die gezeigte Sequenz ist in Unterabschnitte/Regionen eingeteilt, die umfassen:

1. Den gac Promotor und die RBS (erster Abschnitt, Basenpaare 257 bis 465 von pMG414, siehe später)
2. Die für die gac Signalsequenz kodierende Region (zweiter Abschnitt, Basenpaare 466 bis 546 von pMG414, siehe später)
3. Das synthetische Gen für rhlFNα2b (dritter Abschnitt, Basenpaare 547 bis 1044 von pMG414 (siehe später) – einschließlich des TAA Stopcodons) und
4. Den 3' Klonierungslinker (vierter Abschnitt, Basenpaare 1045 bis 1063 von pMG414, siehe später).

Auf pMG414 sind diese 4 Regionen direkt miteinander verbunden. Sie werden in der Figur nur aus Gründen der Übersichtlichkeit getrennt.
Die Start-(ATG) und Stopcodons (TAA) Codons des offenen Leserahmens sind fett gezeigt.
Das erste (TGC) und das letzte (GAA) Codon des reifen rhlFNα2b sind unterstrichen.
Die zur Klonierung verwendeten Restriktionsschnittstellen befinden sich in Kästchen. Diese sind:

– XbaI (TCTAGA) und EcoRI (GAATTC) zur Einführung des gac Fragments (Promotor, RBS, Signalsequenz, SacII, MluI, SpeI Schnittstellen)
– SacII (CCGCGG) und MluI (ACGCGT) zur Einführung des rhlFNα2b PCR Fragments (einschließlich vier Codons für die letzten vier Aminosäuren des gac1ss, des synthetischen 495 bp Gens für reifes rhlFNα2b und des TAA(T) Stopcodons).

Der gac Promotor zeigt eine hohe konstitutive/basale Aktivität und die Zugabe eines chemischen Induktors oder eines physikalischen Stimulus (Veränderung der Kulturbedingungen) ist nicht erforderlich.
1.3 Klonierung und Etablierung der rekombinanten Zelllinie
Das Expressionsplasmid pMG414 wird in den Wirtsstamm ATCC PTA-3132 (= W 3110 (ATCC 27325)) durch Elektroporation eingeführt. Elektrokompetente Zellen werden gemäß einem Standardprotokoll hergestellt, wobei die Elektroporation in 0,1 mm Küvetten mit 1800 V mittels eines Eppendorf Elektroporators 2510 ausgeführt wird.
Nach der Elektroporation wird die Reaktion in flüssigem Medium suspendiert und auf Agarplatten plattiert, die Tetracyclin enthalten.
Der Ausgangspunkt zur Selektion eines geeigneten Zellklons ist eine so erhaltene Transformationsplatte. Es werden verschiedene Klone von dieser Platte in Flüssigkultur angezogen und als Forschungszellbänke kryokonserviert. Ihre Produktivität wird in Schüttelkolbenexperimenten getestet und verglichen. Der beste Klon (E1/116) wird zur weiteren Entwicklung verwendet.
Der beste Klon kann eine gute Produktivität, aber ein relativ schlechtes Wachstum zeigen. Das schlechte Wachstum kann aus verschiedenen Faktoren resultieren, beispielsweise Produkttoxizität gegenüber der Wirtszelle, metabolische Last aufgrund der Produktsynthese etc. Die Zugabe von Glucose bringt oft eine Verbesserung, da die Glucose viele Promotoren herunterreguliert (beispielsweise durch Katabolitrepression), die zur rekombinanten Proteinexpression verwendet werden. Glucose hat auch einen allgemein positiven Effekt auf das Wachstum von E. coli, da sie direkt in den Metabolismus als Kohlenstoffquelle eingeführt werden kann.
Im Fall von E1/116 wird ein deutlich positiver Effekt der Glucose auf das Wachstum beobachtet. Die besten Ergebnisse werden mit Glucosekonzentrationen zwischen 2 und 5 g/l erreicht. Um die Zelllinie so anzupassen, dass sie mit der Produktbildung besser zurechtkommt und anschließend besser in Abwesenheit von Glucose wächst, wird der Stamm daher in Flüssigmedium in Schüttelkolben für mehrere Passagen angezogen ("Schüttelkolbenkaskade").
Genauer gesagt wird ein Kryoröhrchen von E1/116 aufgetaut und die Zellsuspension wird auf Glucose-freien LB Agarplatten ausgestrichen, die Tetracyclin enthalten. Die Platte wird bei 37°C inkubiert, bis die Kolonien eine ausreichende Größe zur Beimpfung einer Flüssigkultur aufweisen. Die Kolonien werden dann von der Platte in kleine Schüttelkolben überführt, die mit 15 ml Glucose-freiem LB Medium gefüllt sind, das Tetracyclin enthält. Die Kulturen werden bei 37°C geschüttelt, bis sie eine optische Dichte bei 600 nm von etwa 0,5 (typischerweise > 1,0) enthalten. Für diese erste Runde werden bis zu 48 Stunden aufgrund der schlechten Wachstumcharakteristiken des ursprünglichen Isolats benötigt.
Das im obigen Abschnitt beschriebene Verfahren wird fünfmal nacheinander ausgeführt, wobei die Flüssigkultur der vorherigen Runde auf Platten ausgestrichen wird und die Kolonien von der Platte dazu dienen, die nächste Flüssigkultur anzuimpfen. Von jeder Flüssigkultur wird die optische Dichte bestimmt und es wird eine Probe zur Bestimmung des Produkttiters mittels SDS-PAGE – Western Blot entnommen. Klone aus der Kultur mit der besten Kombination aus Wachstum und Produktivität werden zur Initiierung der nächsten Runde verwendet.
Im Verlauf der unterschiedlichen Runden dieser Kulturenkaskade (das heißt mehrfachen Vermehrungs- und Reisolierungsschritten) verbessern sich die Wachstumseigenschaften der (Sub)Stämme graduell. Durch die Wahl des Stamms mit der besten Kombination aus Wachstum und Produktivität in jeder Runde erhöhen sich auch graduell die Titer. Nach der fünften Runde werden erneut Einzelkolonien auf LB Agarplatten erzeugt, die Tetracyclin enthalten und zur Beimpfung einer Flüssigkultur verwendet, die Tetracyclin enthält, um einen primären Beimpfungsansatz (PSL) zu erzeugen. Die Kultur wird bei 37°C bis zu einer optischen Dichte von etwa 1,5 angezogen, mit einer gleichen Menge an sterilem 40 G/V Glycerin gemischt, in Kryoröhrchen aliquotiert und bei –80°C eingefroren. Die PSL wird als Ausgangspunkt zur Erzeugung der GMP Zellbänke (Masterzellbank und Arbeitszellbank) des Interferon alpha 2b Produktionsstamms verwendet. Das Reisolat wird mit E1/116a bezeichnet. Reisolierungsverfahren, wie das oben beschriebene, haben gezeigt, dass sie reproduzierbare Ergebnisse ergeben.
E1/116a zeigt ausgezeichnete Wachstumscharakteristiken in Schüttelkolben und gerührten Bioreaktoren (Fermentern). Ein Inokulum, das zum Start eines Bioreaktors geeignet ist, kann in einem Schüttelkolben ausgehend von einem Röhrchen einer Arbeitszellbank in etwa 8 Stunden angezogen werden.
Es wird eine Masterzellbank unter cGMP Bedingungen aus dem oben beschriebenen primären Beimpfungsansatz hergestellt. Kurz gesagt wird ein PSL Röhrchen aufgetaut und auf Tetracyclin enthaltende Agarplatten plattiert. Es wird eine Einzelkolonie gepickt und zur Beimpfung der Masterzellbank (MCB) Schüttelkolbenkultur verwendet (LB Medium, das Tetracyclin enthält). Die Zellsuspension aus der logarithmischen Wachstumsphase 1+1 mit 40% G/V Glycerin gemischt, mit 1,8 ml in Kryoröhrchen aliquotiert, in Kryoschläuchen eingeschlossen und in der Flüssigphase eines Tanks mit flüssigem Stickstoff eingefroren.
Die Arbeitszellbank wird auf dieselbe Weise wie die Masterzellbank erzeugt, außer dass die Schüttelkolbenkultur mit einer Zellsuspension aus einem aufgetauten MCB Röhrchen beimpft wird.
Beispiel 2: Fermentationsprozess zur Herstellung von rekombinantem humanem Interferon alpha 2B (rhlFNα2B)
Das Fermentationsverfahren wird durch die Anzucht des Stamms E. coli K12 W3110 gestartet, der von der Arbeitszellbank wie oben beschrieben in Schüttelkolbenkulturen in Luria Bertani (LB) Medium bei 37°C mit der Zugabe des Antibiotikums Tetracyclinhydrochlorid zur Vermeidung des Wachstums von Nicht-Plasmid tragenden Zellen erhalten werden kann.
Die Schüttelkolbenkultur wird zur Beimpfung des Mediums der Animpfkultur (Pärkultur) verwendet (Inokulumgröße = 0,4%). Das Medium für diese Präkulturkultivierung basiert auf entionisiertem Wasser, das Glucose als einzige Kohlenstoffquelle und Hefeautolysat als komplexe Stickstoffquelle enthält. Zusätzlich werden anorganische Salze, wie KH₂PO₄, K₂HPO₄, (NH₄)₂SO₄ und MgSO₄ × 7 H₂O zum Medium gegeben. Als Antischaummittel wird Polypropylenglycol 2000 (PPG 2000) verwendet. Insbesondere hat das Vorkulturmedium die folgende Zusammensetzung:
Vorkulturgrundmedium:
Diese Medienkomponenten werden zusammen für 20 Minuten bei 121°C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Grundmediums wird ein Aliquot einer sterilen 5 g/l Stammlösung des Antibiotikums Tetracyclinhydrochlorid zum Grundmedium gegeben (die Sterilisation wird durch Filtration ausgeführt (0,22 μm Filter)).
Stammlösung Tetracyclinhydrochlorid (5 g/l):
Die Kultivierungszeit für die Animpfkultur beträgt etwa 16 Stunden. Während der Kultivierung der Animpfkultur wird der pH Wert auf einen Sollwert von 7,0 ± 0,2 mit Schwefelsäure und Natriumhydroxid oder konzentrierter Ammoniaklösung kontrolliert. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff wird auf Mengen gehalten, die höher als 20% Sättigung betragen, indem die Rührgeschwindigkeit erhöht wird. Die Rührgeschwindigkeit zu Beginn der Kultivierung wird auf 300 Upm gesetzt, der Rückdruck im Kessel auf 0,3 bar und die Belüftungsrate wird auf 30 l/min kontrolliert (Äquivalent zu "1 vvm"). Die Temperatur wird während der Kultivierung konstant auf 37°C gehalten. Als Transferkriterium der Brühe zur Hauptstufe des Fermentationsverfahrens wird die Erhöhung der gelösten Sauerstoffkonzentration nach dem Verbrauch der Kohlenstoffquelle verwendet.
Für die Hauptkulturkultivierung wird ein Medium verwendet, das auf entionisiertem Wasser, Glucose als Kohlenstoffquelle und Hefeautolysat als komplexer Stickstoffquelle basiert. Neben der Zugabe der anorganischen Salze (NH₄)₂SO₄, CaCl₂ × 2 H₂O und MgSO₄ × 7 H₂O wird PPG 2000 als Antischaummittel verwendet. Die anfängliche Glucose wird getrennt sterilisiert und zum sterilen Rest des Mediums gegeben. Die Inokulumgröße für das Hauptfermentermedium liegt im Bereich zwischen 0,75 und 3%. Im einzelnen hat das Hauptkulturmedium die folgende Zusammensetzung:
Hauptkulturgrundmedium:
Diese Medienkomponenten werden zusammen für 20 Minuten bei 121°C sterilsiert. Nach dem Abkühlen wird ein Aliquot einer getrennt hitzesterilisierten Glucosestammlösung mit 800 g/l zum Hauptkulturgrundmedium gegeben (die Sterilisation wird für mehr als 30 Minuten bei 120°C ausgeführt).
Glucosestammlösung, 800 g/l:
Der wichtigste Punkt während der Kultivierung ist die Erfordernis eines vollständigen Verbrauchs der anfänglich im Medium vorhandenen Glucose. Dies führt zu einer starken Erhöhung der gelösten Sauerstoffkonzentration nach etwa 9 Stunden Wachstum. Wenn man die Glucosefütterung vor dem vollständigen Verbrauch der anfänglichen Glucose startet, beobachtet man keine Produktbildung. Die Glucoselimitierung, die durch die Fütterung der Glucoselösung mit einer konstanten Geschwindigkeit kontrolliert wird, ist daher sehr wichtig. Die Temperatur während der Kultivierung wird auf einem konstanten Wert von etwa 28°C gehalten. Die anfängliche Rührergeschwindigkeit wird auf 300 Upm gesetzt, die Belüftungsrate wird auf 100 l/min kontrolliert (äquivalent zu "1 vvm") und der Rückdruck im Kessel wird auf 0,3 bar eingestellt. Der pH Wert wird auf 7,1 ± 0,2 mit Schwefelsäure und Natriumhydroxid oder konzentrierter Ammoniaklösung kontrolliert. Ein Peak des pH Werts bis zu 8,0 nach einem Verbrauch der anfänglich zur Verfügung gestellten Glucose ist akzeptabel.
Die Konzentration des gelösten Sauerstoffs wird auf Werte von mehr als 20% Sättigung kontrolliert. In Abhängigkeit der Sauerstofftransferkapazität des Bioreaktors wird die DO-Konzentration auf Werte über 20% Sättigung, vorzugsweise etwa 40% und 100% Sättigung gehalten, indem man zuerst die Rührgeschwindigkeit auf einen Maximalwert erhöht. Falls dies nicht ausreicht, wird zuerst die Belüftungsrate und danach der Rückdruck erhöht. Nach der Kultivierungszeit zwischen 48 und 192 Stunden (es wird eine lineare Zunahme der Produktbildung mit der Kultivierungszeit beobachtet) wird die Kultur geerntet und auf 15 ± 5°C gekühlt und für das Downstreamprocessing durch die Zugabe von Saccharose/EDTA zur gekühlten Kulturbrühe konditioniert.
Die Ergebnisse eines Fermentationsansatzes werden basierend auf der Western Blot Technik oder durch HPLC Messungen nach einer periplasmatischen Extraktion des Produkts im Labor oder der Pilotanlage analysiert.
Beispiel 3: Zellzerstörung und Extraktion
Eine Fermentationsbrühe, die wie oben beschrieben erhalten wird, welche die Wirtszellen enthält, die das exprimierte Interferon alpha 2B im periplasmatischen Raum enthalten, wird mit Schwefelsäure auf einen pH von 5,0 ± 0,1 unmittelbar nach der Fermentation eingestellt und auf 4°C ± 2°C abgekühlt. Der geringe pH und die geringe Temperatur helfen zur Inaktivierung der endogenen Proteasen.
Die Fermentationsbrühe wird auf 10°C bis 20°C eingestellt und dann werden ohne Konzentrierung oder Waschen der Zellen feste oder flüssige Saccharose (200 g Saccharose/kg Fermentationsbrühe) und EDTA (Konzentration 10 mM) zugegeben und der pH wird auf 8,0 eingestellt. Nach einem selektiven Einschrittzellpermeationsprotokoll mittels eines osmotischen Schocks (1+3 Verdünnungen) mit gekühltem Wasser, wobei die Fermentationsbrühe, die Saccharose und EDTA enthält, in das gekühlte Wasser (Temperatur etwa 4°C) gegossen oder gepumpt wird, wird der freigesetzte periplasmatische Extrakt geklärt. Polyethylenimin wird auf eine Endkonzentration von 0,05% zugegeben und der pH wird mit Essigsäure auf etwa 7,5 eingestellt. Nach 15 bis 45 Minuten flocken der Zelldebris und die DNA aus, wobei ein klarer Rohextrakt übrig bleibt, der Interferon enthält, der dann zur Verbesserung der Klarheit einer Zentrifugation unterzogen wird.
Dieses Verfahren führt zu einem klaren periplasmatischen Extrakt, der das gewünschte Interferon alpha 2B in hoher Ausbeute mit einer Reinheit von > 20% in Bezug auf den gesamten Proteingehalt enthält. Polyethylenimin hilft, den Zelldebris vom löslichen Proteinextrakt zu trennen, was zu einer sehr reinen Interferonlösung führt.
Beispiel 4: Chromatographische Reinigung von rekombinantem, humanem Interferon α 2B (rhlFNα2B)
4.1. Binden durch Kationenaustauschchromatographie (CEX)
Nach der pH Einstellung auf 4,8 bis 5,2 mit Essigsäure und einem Filtrationsschritt mittels eines 0,3 μm Filters wird der Rohextrakt von Beispiel 3 auf die CEX Säule aufgetragen (S Ceramic Hyper D F (Biosepra)). Nach einem Waschschritt mit einem Äquilibrierungspuffer (20 mM Natriumacetat und 70 mM NaCl bei pH 5,0) wird das Interferon mit einem Stufengradienten bei 175 mM NaCl eluiert. Die gesammelte Fraktion wird unmittelbar durch den Verfahrensschritt von Beispiel 4.2 weiterverarbeitet.
4.2. Anionenaustauschchromatographie (AEX)
Die Fraktion von Beispiel 4.1 wird auf einen pH von 7,3 bis 7,7 mit Natriumhydroxid eingestellt, verdünnt und mit Wasser auf eine Leitfähigkeit von 3,5 bis 4,5 mS/cm eingestellt und auf die AEX Säule (Q Ceramic Hyper D F (Biosepra)) aufgetragen. Nach dem Waschen wird das Interferon mit einem linearen Salzgradienten (0 bis 300 mM NaCl) bei etwa 150 mM NaCl eluiert. Es werden die Fraktionen gesammelt, die eine Reinheit von größer oder gleich 90 Flächenprozent gemäß IPC Umkehrphasen HPLC aufweisen und direkt im nächsten Schritt verwendet (siehe Beispiel 4.3).
4.3. Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC)
Die Fraktion von Beispiel 4.2 wird mit einer Stammlösung aus Natriumsulfat (0,5% Natriumsulaft verdünnt (1:1), mit NaOH oder HCl auf pH 7,3 bis 7,7 eingestellt und auf die HIC Säule aufgetragen (Source 15PHE (Pharmacia)). Nach dem Waschen wird die Interferonfraktion von Beispiel 3 mit einer linearen Natriumsulfatkonzentration (800 bis 0 mM Natriumsulfat) bei etwa 400 mM Natriumsulfat eluiert. Die gesammelten Fraktionen, die eine Reinheit von größer oder gleich 93 Flächenprozent aufweisen und keine Verunreinigung von größer oder gleich 3% gemäß IPC Umkehrphasen HPLC aufweisen, werden direkt im nächsten Reinigungsschritt verwendet.
4.4 Kationenaustauschchromatographie (CEX)
Die gesammelten Fraktionen von Beispiel 4 werden mit Wasser auf eine Endleüfähigkeit von 7,5 bis 8,5 mS/cm verdünnt, mit 99 bis 100% Essigsäure auf pH 4,3 bis 4,7 eingestellt und auf die CEX Säule (Toyopearl SP-650 S (Toso Haas)) aufgetragen. Nach einem Waschschritt wird das Interferon mit einem linearen NaCl Gradienten (0 bis 300 mM NaCl) bei etwa 250 mM NaCl eluiert. Es werden die Fraktionen gesammelt, die eine Reinheit von größer oder gleich 95 Flächenprozent und keine Verunreinigung von größer oder gleich 3% gemäß IPC Umkehrphasen HPLC aufweisen und werden direkt im nächsten Reinigungsschritt verwendet.
4.5 Größenausschlusschromatographie
Der letzte Reinigungsschritt ist ein Gelfiltrationsschritt zur Entfernung von Dimeren und anderen Aggregaten und zur Ausführung eines Pufferaustausches für die Endformulierung. Die in diesem Schritt verwendete Superdex 75 pg zeigt eine gute Auftrennung sogar bei hohem Auftragsvolumen (5% bis 15%). Die SEC wird in 25 mM Natriumphosphat und 130 mM NaCl + 0,3 mM EDTA bei einem pH von etwa 7,3 bis 7,7 ausgeführt.
Die Fraktionen mit der höchsten Reinheit (> 95% Hauptpeak in der RP-HPLC und ohne Nebenpeak > 3%) werden unter Bildung der schließlichen Bulklösung vereinigt, die das gewünschte rekombinante humane Interferon α 2B in reiner Form in einer hohen Ausbeute enthält.
Sequenzliste

Claims

Expressionsvektor, der ein Polynukleotid umfasst, das für ein Fusionsprotein kodiert, welches die Signalsequenz des gac Gens von Pseudomonas diminuta und ein anderes Polypeptid von Interesse als gac von Pseudomonas diminuta umfasst, worin die Signalsequenz und das Polypeptid von Interesse so verbunden sind, dass bei der Expression des Polynukleotids in einer geeigneten Wirtszelle die Signalsequenz des Fusionsproteins abgespalten wird und das Polypeptid von Interesse in das Periplasma der Wirtszelle freigesetzt wird.
Vektor nach Anspruch 1, worin der Vektor ein Plasmid ist.
Vektor nach Anspruch 1, worin der Vektor ein Plasmid mit hoher Kopiezahl ist.
Vektor nach Anspruch 1, worin das Polypeptid von Interesse Interferon alpha 2 ist.
Vektor nach Anspruch 1, worin das Interferon alpha 2 aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Interferon alpha 2A und Interferon alpha 2B.
Vektor nach Anspruch 1, worin die Signalsequenz des gac Gens von Pseudomonas diminuta die folgende Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) umfasst MLRVLHRAASALVMATVIGLAPAVAFA.
Vektor nach Anspruch 6, worin der Vektor ferner ein Polynukleotid umfasst, das die Promotorregion und die Ribosomenbindungsstelle des gac Gens von Pseudomonas diminuta umfasst, wobei das Polynukleotid operativ an das Polynukleotid gebunden ist, das für das Fusionsprotein kodiert, welches die Signalsequenz und das Polypeptid von Interesse enthält.
Vektor nach Anspruch 7, worin das Polynukleotid, das die Promotorregion und die Ribosomenbindungsstelle enthält, die folgende Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 5) umfasst 5'-ATCCTGGTTCGTACGCGCCGCCTACAAGTGGTGATCTAGGGGAACGTTCCGGGGGCGTCG CTGCAACGGCGTCTCCGGATCTGGGTGAGAGGGGAAATCC-3'.
Vektor nach Anspruch 8, worin das Polynukleotid, das die Promotorregion und die Ribosomenbindungsstelle enthält, die folgende Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 6) umfasst
Prokaryontische Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der mit der Wirtszelle kompatibel ist, wobei der Vektor ein Polynukleotid umfasst, das für ein Fusionsprotein kodiert, welches die Signalsequenz des gac Gens von Pseudomonas diminuta und ein anderes Polypeptid von Interesse als gac von Pseudomonas diminuta umfasst, worin die Signalsequenz und das Polypeptid von Interesse so verbunden sind, dass bei der Expression des Polynukleotids in einer geeigneten Wirtszelle die Signalsequenz des Fusionsproteins abgespalten wird und das Polypeptid von Interesse in das Periplasma der Wirtszelle freigesetzt wird.
Wirtszelle nach Anspruch 10, worin der Vektor ein Plasmid ist.
Wirtszelle nach Anspruch 10, worin der Vektor ein Plasmid mit hoher Kopiezahl ist.
Wirtszelle nach Anspruch 10, worin das Polypeptid von Interesse Interferon alpha 2 ist.
Wirtszelle nach Anspruch 3, worin das Interferon alpha 2 aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Interferon alpha 2A und Interferon alpha 2B.
Wirtszelle nach Anspruch 10, worin die Signalsequenz des gac Gens von Pseudomonas diminuta die folgende Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) umfasst MLRVLHRAASALVMATVIGLAPAVAFA.
Wirtszelle nach Anspruch 10, worin der Vektor ferner ein Polynukleotid umfasst, das die Promotorregion und die Ribosomenbindungsstelle des gac Gens von Pseudomonas diminuta umfasst, wobei das Polynukleotid operativ an das Polynukleotid gebunden ist, das für das Fusionsprotein kodiert, welches die Signalsequenz und das Polypeptid von Interesse umfasst.
Wirtszelle nach Anspruch 16, worin das Polypeptid, welches die Promotorregion und die Ribosomenbindungsstelle enthält, die folgende Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 5) umfasst 5'-ATCCTGGTTCGTACGCGCCGCCTACAAGTGGTGATCTAGGGGAACGTTCCGGGGGCGTCG CTGCAACGGCGTCTCCGGATCTGGGTGAGAGGGGAAATCC-3'
Wirtszelle nach Anspruch 16, worin das Polypeptid, welches die Promotorregion und die Ribosomenbindungsstelle enthält, die folgende Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 6) umfasst
Wirtszelle nach Anspruch 10, worin die Wirtszelle eine E. coli Wirtszelle ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids von Interesse, das umfasst (i) Bereitstellung einer prokaryontischen Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, welcher mit der Wirtszelle kompatibel ist, wobei der Vektor ein Polynukleotid enthält, das für ein Fusionsprotein kodiert, welches die Signalsequenz des gac Gens von Pseudomonas diminuta und ein anderes Polypeptid von Interesse als gac von Pseudomonas diminuta umfasst, worin die Signalsequenz und das Polypeptid von Interesse so verbunden sind, dass bei der Expression des Polynukleotids in einer geeigneten Wirtszelle die Signalsequenz des Fusionsproteins abgespalten wird und das Polypeptid von Interesse in das Periplasma der Wirtszelle freigesetzt wird, und (ii) Kultivierung der prokaryontischen Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des Polynukleotids veranlassen, wobei bei der Bildung des Fusionsproteins die Signalsequenz des Fusionsproteins abgespalten wird und das Polypeptid von Interesse in das Periplasma der Zelle freigesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 20, das ferner die Isolierung des Polypeptids von Interesse umfasst.
Verfahren nach Anspruch 20, worin der Vektor ein Plasmid ist.
Verfahren nach Anspruch 20, worin der Vektor ein Plasmid mit hoher Kopiezahl ist.
Verfahren nach Anspruch 20, worin das Polypeptid von Interesse Interferon alpha 2 ist.
Verfahren nach Anspruch 24, worin das Interferon alpha 2 aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Interferon alpha 2A und Interferon alpha 2B.
Verfahren nach Anspruch 20, worin die Signalsequenz des gac Gens von Pseudomonas diminuta die folgende Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) umfasst MLRVLHRAASALVMATVIGLAPAVAFA.
Verfahren nach Anspruch 20, worin der Vektor ferner ein Polynukleotid umfasst, das die Promotorregion und die Ribosomenbindungsstelle des gac Gens von Pseudomonas diminuta umfasst, wobei das Polynukleotid operativ an das Polynukleotid gebunden ist, das für das Fusionsprotein kodiert, welches die Signalsequenz und das Polypeptid von Interesse enthält.
Verfahren nach Anspruch 27, worin das Polynukleotid, das die Promotorregion und die Ribosomenbindungsstelle enthält, die folgende Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 5) umfasst 5'-ATCCTGGTTCGTACGCGCCGCCTRCRAGTGGTGATCTAGGGGAACGTTCCGGGGGCGTCG CTGCAACGGCGTCTCCGGATCTGGGTGAGAGGGGAAATCC-3'
Verfahren nach Anspruch 27, worin das Polynukleotid, das die Promotorregion und die Ribosomenbindungsstelle enthält, die folgende Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 6) umfasst
Verfahren nach Anspruch 20, worin die Wirtszelle eine E. coli Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Kultivierung als Mehrstufenfermentationsverfahren ausgeführt wird, das einen Schüttelkolbenschritt, optional einen Vorkultivierungsschritt und einen Nauptkultivierungsschritt umfasst.
Verfahren nach Anspruch 31, worin die Kultivierung der prokaryontischen Wirtszelle im Hauptkulturschritt in einem Kulturmedium ausgeführt wird, das ein Substrat für mehr als 90% der Kultivierungszeit bei einer Substratkonzentation unterhalb der Sättigungskonstante des Substrats umfasst, welches durch hohe Mengen an gelöstem Sauerstoff begleitet wird und ferner durch eine stetig abnehmende spezifische Wachstumsrate der bakteriellen Wirtszellen begleitet wird, wobei das Verfahren bei einer Temperatur ausgeführt wird, die geringer ist als die optimale Temperatur für das Wachstum der Wirtszelle.
Verfahren nach Anspruch 32, worin die Konzentration des gelösten Sauerstoffs im Hauptkulturschritt zwischen etwa 40% bis etwa 100% Sättigung liegt.
Verfahren nach Anspruch 32, worin die stetig abnehmende Wachstumsrate im Hauptkulturschritt etwa 2 h^–1 bis etwa 0,001 h^–1 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 32, worin die Temperatur im Hauptkulturschritt zwischen etwa 22°C und etwa 35°C liegt.
Verfahren nach Anspruch 35, worin die Temperatur im Hauptkulturschritt zwischen etwa 25°C und etwa 31°C liegt.
Verfahren nach Anspruch 36, worin die Temperatur im Hauptkulturschritt etwa 28°C beträgt.
Verfahren nach Anspruch 32, worin das Verfahren bei einem pH Wert im Bereich von etwa 6,7 bis etwa 7,3 im Vorkulturschritt und/oder im Hauptkulturschritt ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 32, worin das Substrat ein Kohlenhydrat oder Glycerin ist.
Verfahren nach Anspruch 39, worin das Kohlenhydrat Glucose ist.
Verfahren nach Anspruch 32, worin die Wirtszelle eine E. coli Zelle ist.