DE69920749T2

DE69920749T2 - Rekombinante bakterienstämme zur herstellung von natürlichen nucleosiden, sowie von modifizierten analogen davon

Info

Publication number: DE69920749T2
Application number: DE69920749T
Authority: DE
Inventors: Giuseppina Bestetti; Simona Cali'; Daniela Ghisotti; Gaetano Orsini; Giancarlo Tonon; Gabriele Zuffi
Original assignee: Keryos SpA
Current assignee: SICOR Societa Italiana Corticosteroidi SRL
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-23
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2019-12-24
Also published as: AU2103000A; US6911341B2; US20030059870A1; EP1141328B1; DE69920749D1; ITMI982792A1; US20050142645A1; ES2229807T3; ATE278021T1; US7781189B2; WO2000039307A3; IT1304500B1; JP2002533126A; WO2000039307A2; EP1141328A2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue genetisch modifizierte Bakterienstämme, die zur Expression von Polypeptiden mit einer Enzymaktivität der Enzyme UdP und PNP in der Lage sind; die fraglichen Stämme können zur Katalyse von Transglycosylierungsreaktionen zwischen einem Donornucleosid und einer Akzeptorbase verwendet werden.
Natürliche Nucleoside oder deren modifizierte Analoga besitzen wichtige Anwendungen, sowohl direkt als auch in Form von Intermediaten, im Bereich von Arzneimitteln mit anti-viraler und anti-tumoraler Wirkung, sowie bei der Herstellung von Oligonucleotiden zur therapeutischen und diagnostischen Verwendung.
Nucleoside können unter Verwendung von Methoden der chemischen Synthese hergestellt werden, die normalerweise eine große Zahl von Prozessschritten zum Schützen und Entschützen von labilen Gruppen sowie die Verwendung von Reagenzien und Arbeitsbedingungen erfordern, die auf industriellem Niveau sowohl schwierig anzuwenden als auch ökonomisch nachteilig sein können. Zusätzlich weisen diese Reaktionen im Allgemeinen keine hohen Gesamtausbeuten auf, auch wegen der Bildung von Mischungen von Stereo- und Regioisomeren, aus denen die Verbindung von Interesse abzutrennen ist.
Ein alternativer Weg zur Herstellung von Nucleosiden und modifizierten Analoga davon beruht auf Übertragungen zwischen einem Zucker-donierenden Nucleosid und einer Akzeptorbase mittels Enzymen, die die unten im Schema 1 angegebenen, allgemein reversiblen Reaktionen katalysieren (Hutchinson, Trends Biotechnol. 8, 348–353, 1990): Schema 1
worin Pi = organisches Phosphat.
Die Reaktion 1 wird durch das Enzym Uridinphosphorylase bzw. UdP (E.C.2.4.2.3.) katalysiert, während die Reaktion 2 durch das Enzym Purinnucleosidphosphorylase bzw. PNP (E.C.2.4.2.1.) katalysiert wird.
Die UdP- und PNP-Enzyme können einzeln zum Katalysieren von Transglycosylierungsreaktionen zwischen einem Donor-Pyrimidinnucleosid und einer Akzeptor-Pyrimidinbase bzw. zwischen einem Donor-Purinnucleosid und einer Akzeptor-Purinbase verwendet werden. Wenn beide Enzyme in Kombination verwendet werden, ist es darüber hinaus möglich, den Zucker aus einem Donor-Pyrimidinnucleosid auf eine Purin- oder Pyrimidin-Akzeptorbase wie auch von einem Donor-Purinnucleosid zu einer Pyrimidin- oder Purin-Akzeptorbase zu übertragen, je nach den verwendeten Ausgangsmaterialien. In jedem Fall beinhalten die Phosphorolysereaktionen eine Konfigurationsveränderung bei Position 1 des Zuckers, um ein α-Zucker-1-phosphat zu ergeben, das das Zwischensubstrat der Transglycosylierungsreaktionen bildet und das anschließend auf die Akzeptorbase unter Wiederherstellung der ursprünglichen β-Konfiguration übertragen wird.
Solche Enzymreaktionen können vorteilhafterweise ausgehend aus einer Mischung eines Donornucleosids und einer Akzeptorbase bei gleichzeitiger Gegenwart der beiden Enzyme sowie ohne Isolierung des intermediären Zuckerphosphats oder in zwei Schritten, die die Phosphorolyse unter Bildung des intermediären Zuckerphosphats, dessen Isolierung sowie der anschließenden Kondensation mit der Akzeptorbase einschließen, durchgeführt werden.
Im Vergleich zur chemischen Synthese besteht ein bedeutender Vorteil der durch Phosphorylasen katalysierten Transglycosylierungsreaktionen in der Beibehaltung der Stereoselektivität und Regioselektivität, was zu dem Ergebnis führt, dass das Endprodukt die β-Konfiguration natürlicher Nucleoside beibehält.
Die UdP- und PNP-Enzyme, die physiologisch im Catabolismus und bei Übertragungsreaktionen von Nucleosiden teilnehmen, stellen das jeweilige Produkt der udp- und deoD-Gene dar, die breit in der Natur vorkommen und sowohl in prokaryotischen als auch eukaryotischen Organismen identifiziert und untersucht wurden (Parks und Agarwal, Enzymes 7, 3. Ausgabe, 483–514, Academic Press, New York; Munch-Petersen, Metabolism of nucleotides, nucleosides and nucleobases in micro-organisms, Academic Press, London, 1982).
Aus der Sicht der Verwendung als Katalysatoren zu Synthesen von Nucleosiden und deren modifizierte Analoga, sind die Enzyme von prokaryotischen Organismen im Allgemeinen bevorzugt, weil sie eine niedrigere Substratspezifität aufweisen und weil sie Transglycosylierreaktionen katalysieren können, die auch von modifizierte Zucker enthaltenden Donornucleosiden und aus Akzeptorbasen ausgehen, die sowohl Purin- oder Pyrimidinstrukturen als auch unterschiedliche hetereocyclische, Stickstoff enthaltende Systeme umfassen können (Stoeckler et al., Bioche mistry 19, 102–107, 1980; Browska et al., Z. Naturforsch. 45, 59–70, 1990).
Die Transglycosylierreaktionen können unter Verwendung von gereinigten oder teilweise gereinigten Enzympräparationen (Krenitsky et al., Biochemistry 20, 3615–3621, 1981; EP-0 002 192) oder alternativ unter Verwendung von ganzen Bakterienzellen von ausgewählten Mikroorganismen durchgeführt werden, weil sie die erforderlichen Enzyme enthalten (Utagawa et al., Agric. Biol. Chem. 49, 3239–3246, 1985) (Zintchenko et al., Nucleic Acids Research Symposium Series 1.8, 137–140, 1987) oder ganze Zellen, die in Gegenwart von Induktoren zur Produktion dieser Enzyme kultiviert werden (Doskocil et al., Collect. Czech. Chem. Commun. 42, 370–383, 1977).
Für auf präparativem Niveau durchgeführte Biokatalysereaktionen führt die Verwendung ganzer Zellen dazu, dass sowohl die Notwendigkeit der Extraktion und Reinigung der Enzyme umgangen wird, als auch die leichte Wiedergewinnung am Ende der Reaktion, z.B. durch Zentrifugation oder Ultrafiltration und die Wiederverwendung für andere, anschließende Reaktionscyclen der Zellen möglich ist; alternativ ist es möglich, die aus den Zellen extrahierten UdP- und PNP-Enzyme in Form einer rohen oder gereinigten löslichen Zellfraktion zu verwenden. UdP und PNP sind Enzyme, die sich durch eine gute thermische Stabilität auszeichnen, was die Durchführung der Transglycosylierreaktionen bei Temperaturen von bis zu ungefähr 60°C ohne merkliche Aktivitätsverluste ermöglicht und die Wiederverwendung der wieder gewonnenen Enzympräparationen ermöglicht. Auch sind Ansätze beschrieben worden, wo das Recyceln von als Katalysatoren verwendeten Zellen durch Mikro-Verkapselung in sowohl hydrophilen Gelen (Votruba et al., Collect. Czech, Chem. Commun. 59, 2303–2330, 1994) als auch hydrophoben Gelen (Yokozeki et al., Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 14, 225–231, 1982) durchgeführt wurde.
Die Hauptgrenzen der bisher zur Herstellung von natürlichen Nucleosiden und modifizierten Analoga davon durch Transglycosylierreaktionen unter Verwendung von bakteriellen Zellen bekannter Methoden beruhen auf der niedrigen Enzymkonzentration, die selbst nach der Induktion erhältlich ist, sowie auf der Unmöglichkeit der Verwendung optimierter Mengen der beiden Enzymaktivitäten, die zur Katalyse der Übertragung des Zuckers vom Donornucleosid zur Akzeptorbase erforderlich sind.
Sowohl im Fall der Wahl von Wildtyp-Bakterienstämmen als auch im Fall der Kultivierung von Stämmen unter Induktionsbedingungen werden Zellen erhalten, die UdP- und PNP-Spiegel enthalten, die im Allgemeinen nicht höher als dem 10fachen der Grundspiegel sind (F. Ling et al., Process Biochem. 29, 355–361, 1994) und die in nicht vorherbestimmbaren Verhältnissen vorliegen. Da eines der beiden Enzyme (im Allgemeinen PNP) in den induzierten Zellen in niedrigeren Mengen vorliegt, ist es ferner gewöhnlicherweise nötig, einen Überschuss an Zellen zu verwenden, um das Vorliegen des begrenzten Enzyms auf Niveaus sicherzustellen, die mit den akzeptablen Gesamtkinetiken der Übertragungsreaktion kompatibel sind. Aus Sicht der Arbeitsweise bedeutet dies, dass ein beträchtlicher Teil der Reaktionsmischung durch die Zellsuspension aufgebaut wird, mit einer daraus folgenden Begrenzung des Volumens, das zur Solubilisierung der Substrate verwendet werden kann, und schließlich mit einer geringeren Volumenausbeute des Endprodukts.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich deshalb auf die Konstruktion von kinetisch modifizierten Bakterienstämmen, die zur Lösung der oben beschriebenen Probleme und insbesondere zur Katalyse von Transglycosylierreaktionen zwischen einem Donornucleosid und einer Akzeptorbase mit hohen Ausbeuten fähig sind, die vorhersehbar und vor allem auf industriellem Niveau reproduzierbar sind, und mit besonders schnellen Enzymkinetiken.
In der Literatur ist das Klonieren und Exprimieren einiger rekombinanter Phosphorylasen beschrieben worden, wie etwa z.B. humanes UdP (Watanabe und Uchida, Biochem. Biophys. Res. Commun. 216, 265–272, 1996), murines UdP (Watanabe et al., J. Biol. Chem. 270, 12191–12196, 1995), von Escherichia coli (Mikhailov et al., Biochem. Internat. 26, 607–615, 1992) und humanes PNP (Erion et al., Biochemistry 36, 11725–11734, 1997), des thermophilen Mikroorganismus Bacillus stearothermophilus (Hamamoto et al., Biosci. Biotech. Biochem. 61, 272–275, 1997; Hamamoto et al., Biosci. Biotech. Biochem. 61, 276–280, 1997) neben der UdP und PNP aus Klebsiella sp (Takehara et al., Biosci. Biotech. Biochem. 59, 1987–1990, 1995). Insbesondere beschreibt die japanische Patentanmeldung JP-06-253 854 die Expression bakterieller Plasmide in E. coli, die die Gensequenzen der Enzyme Purin- und/oder Pyrimidinnucleosidphosphorylase enthalten, welche allein aus thermophilen Bakterien stammen, das heißt Bakterien mit optimalem Wachstum bei Temperaturen von 50°C bis 60°C, wie etwa z.B. Bacillus stearothermophilus.
Neue genetisch modifizierte Bakterienstämme, die die Gene enthalten, welche für Polypeptide mit der Enzymaktivität der Enzyme Uridinphosphorylase (UdP) und Purinnucleosidphosphorylase (PNP) codieren, sind nun gefunden worden und bilden einen Teil des Gegenstands der vorliegenden Erfindung. Die Kultivierung dieser neuen Stämme ermöglicht sowohl hohe Biomassespiegel als auch hohe Grade an Expression der zu erhaltenden rekombinanten Enzyme; die hier offenbarten neuen Stämme können auch entweder direkt oder nach Extraktion der löslichen Zellfraktion als Katalysatoren zur Herstellung natürlicher Nucleoside und modifizierten Analoga davon mit wesentlichen Verbesserungen für den Prozess im Vergleich zum Stand der Technik verwendet werden.
Im Gegensatz zu dem, was in der JP-06-253 854 beschrieben wurde, können die Plasmidvektoren gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden, indem sowohl getrennt als auch gleichzeitig die udp- und deoD-Gene mesophiler Bakterien, das heißt Bakterien mit optimalem Wachstum bei Temperaturen von 30°C bis 37°C, wie etwa z.B. E. coli, kloniert werden. Genauer gesagt sind die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bevorzugt verwendeten Gensequenzen die E. coli-Sequenzen, die für die udp- und deoD-Gene codieren und die in der EMBL-Datenbank mit den Zugangsnummern X15689 (udp) und M60917 (deoD) hinterlegt sind; es ist jedoch auch möglich, andere breit verfügbare Sequenzen, wie etwa z.B. AC 0001747 (udp) und AC 0000327 (deoD), zu verwenden.
Die Expressions-Plasmidvektoren, die für die Zwecke der Erfindung verwendet werden können, sind daher dadurch gekennzeichnet, dass sie umfassen:

a) mindestens eine Gensequenz eines mesophilen Bakteriums, das für ein Polypeptid mit der Aktivität des Enzyms UdP und des Enzyms PNP codiert; und
b) mindestens eine Gensequenz, die für eine Antibiotikaresistenz codiert.

Die mindestens eine Sequenz, die für eine Antibiotikaresistenz codiert, ist eine Sequenz, die für Tetracyclin-, Kanamycin- und/oder Ampicillinresistenz codiert. Die Plasmidvektoren der vorliegenden Erfindung können erhalten werden, indem entweder die für UdP codierende Sequenz und die für deoD codierende Sequenz oder gegebenenfalls die zur Tetracyclin- und/oder Kanamycin-Resistenz codierende Sequenz in das Plasmid pUC18 (Yanish und Perron, Gene 33, 103–119, 1985; EMBL Zugangsnummer L08752), welches das Ampicillin-Resistenzgen bereits enthält, kloniert wird.
Die relative Position der für udp und deoD codierenden Sequenzen ist jedoch nicht für die Zwecke der Erfindung relevant; das heißt die für udp codierende Sequenz kann entweder stromabwärts oder stromaufwärts der für deoD codierenden Sequenz positioniert sein. Ferner – und wie aus den Beispielen, die folgen, erkannt werden wird – können die für udp und deoD codierenden Sequenzen auch miteinander fusioniert werden, um neue Fusionsproteine der Formel UdP-(L)-PNP zu exprimieren, worin L ein Polypeptidlinker von mehr als einer Aminosäureeinheit ist. In diesen neuen Fusionsproteinen ist jedoch die relative Position der beiden Komponenten für die Zwecke der Erfindung nicht relevant: das heißt, die PNP-Komponente kann entweder an der NH₂-terminalen oder an der COOH-terminalen Position des fusionierten Proteins sein. Die so erhältlichen neuen Proteine, die einen weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung bilden, sind durch den Besitz einer bifunktionellen Aktivität gekennzeichnet, da sie zur Ausführung sowohl der Aktivität des Enzyms UdP als auch derjenigen des Enzyms PNP in der Lage sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird dann durch das Verfahren zum Herstellen der oben erwähnten Fusionsproteine wiedergegeben, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Herstellen eines wie oben angegebenen Plasmid-Expressionsvektors;
(b) Transformieren einer Wirts-Bakterienzelle mit dem genannten Expressionsvektor; und
(c) Isolieren und Reinigen des Fusionsproteins aus der transformierten Bakterienzelle.

Die Methoden zum Transformieren einer Wirts-Bakterienzelle mit einem Expressionsvektor und zum Isolieren und Reinigen des exprimierten Peptids sind jedem Fachmann gut bekannt und sind z.B. in J.R. Swartz, Escherichia coli recombinant DNA technology und in F.C. Neidahrt et al. (Hrsg.), Escherichia coli und Salmonella thyphimurium: Cellular and molecular biology, 2.
Ausgabe, Seiten 1693–1711, ASM, Washington, offenbart, die hier unter Bezugnahme eingeschlossen sind.
Die zur Expression der rekombinanten Enzyme gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt verwendeten Wirte sind Bakterienzellen von Escherichia coli; die Stämme K12 (vorzugsweise DH5α oder MG1655) sind von besonderem Interesse. Jedoch ist es alternativ möglich, Zellen anderer prokaryotischer Mikroorganismen zu verwenden, die für den industriellen Gebrauch akzeptabel sind, da sie gegenüber den Anwendern und der Umwelt nicht gefährlich sind und da sie ohne Weiteres kultiviert werden können, um hohe Biomassenspiegel zu erhalten.
Wie aus den Beispielen gesehen wird, ist das Vorliegen eines bakteriellen Promotors und insbesondere des lac-Promotors kein wesentliches Element für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, da gefunden wurde, dass das Zellwachstum und die Expression von Polypeptiden nicht von der Gegenwart eines Induktors (IPTG) abhängen. Zur bequemen Ausführung wird die Gensequenz, die für ein Polypeptid mit der UdP-Enzymaktivität und/oder der PNP-Enzymaktivität codiert, in das Plasmid pUCl8 in den Leserahmen bezüglich des lac-Promotors kloniert.
Schließlich ist die Sequenz, die für die Tetracyclinresistenz codiert, vorzugsweise das Tet-Gen von pBR322; die für die Kanamycinresistenz codierende Sequenz ist das kan-Gen von pET29c.
Somit wurden gemäß gut bekannten Methoden, die aus den Beispielen klar werden, die folgenden Plasmide konstruiert, die in den 1, 3 und 4 wiedergegeben sind:

– pGM679: udp-Gen, welches in das Plasmid pUC18 (SEQ ID NO 1) kloniert ist. Bei der Sequenznummerierung fällt die Koordinate 1 von pGM679 mit derjenigen der pUC18-Vektorsequenz zusammen; vom Nucleotid 1 bis 242: pUC18- Sequenz; von 243 bis 1021: E. coli udp-Gensequenz; von 1022 bis 3444: pUC18-Sequenz.
– pGM708: udp-Gen, welches zusammen mit dem Tetracyclinresistenzgen in das Plasmid pUC18 kloniert ist (SEQ ID NO 2). Bei der Sequenznummerierung fällt die Koordinate 1 von pGM708 mit derjenigen der pUC18-Vektorsequenz zusammen; von Nucleotid 1 bis 242: pUC18-Sequenz; von 243 bis 1021: E. coli udp-Gensequenz; von 1022 bis 1039: pUC18-Sequenz; von 1040 bis 1482: pHP45Ω-Sequenz; von 1483 bis 2883: pBR322-Tet-Gensequenz; von 2884 bis 3151: pHP45Ω-Sequenz; von 3152 bis 5556: pUC18-Sequenz.
– pGM678: deoD-Gen, kloniert in das Plasmid pUC18 (SEQ ID NO 3). Bei der Sequenznummerierung fällt die Koordinate 1 von pGM678 mit derjenigen der pUC18-Vektorsequenz zusammen; von Nucleotid 1 bis 230: pUC18-Sequenz; von 231 bis 960: E. coli deoD-Gensequenz; von 961 bis 3383: pUC18-Sequenz.
– pGM707: deoD-Gen, kloniert zusammen mit dem Tetracyclinresistenzgen in das Plasmid pUC18 (SEQ ID NO 4). Bei der Sequenznummerierung fällt die Koordinate 1 von pGM707 mit derjenigen der pUC18-Vektorsequenz zusammen; von Nucleotid 1 bis 230: pUC18-Sequenz; von 231 bis 960: E. coli deoD-Gensequenz, von 961 bis 978: pUC18-Sequenz; von 979 bis 1422: pHP45Ω-Sequenz; von 1423 bis 2822: pBR322-Tet-Gensequenz; von 2823 bis 3090: pHP45Ω-Sequenz; von 3091 bis 5495: pUC18-Sequenz.
– pGM712: udp- und deoD-Gene, kloniert in das Plasmid pUC18 (SEQ ID NO 5). Bei der Sequenznummerierung fällt die Koordinate 1 von pGM712 mit derjenigen der pUC18-Vektorsequenz zusammen; von Nucleotid 1 bis 242: pUC18-Sequenz; von 243 bis 1021: E. coli udp-Gensequenz; von 1022 bis 1025; pUC18-Sequenz; von 1026 bis 1036: pBAD24-Sequenz; von 1037 bis 1766: E. coli deoD-Gensequenz; von 1767 bis 1792: pBAD24-Sequenz; von 1793 bis 4189: pUC18-Sequenz.
– pGM716: udp- und deoD-Gene, kloniert zusammen mit dem Tetracyclin-Resistenzgen in das Plasmid pUC18 (SEQ ID NO 6). Bei der Sequenznummerierung fällt die Koordinate 1 von pGM716 mit derjenigen der pUC18-Vektorsequenz zusammen; von Nucleotid 1 bis 242: pUC18-Sequenz; von 243 bis 1021: E. coli udp-Gensequenz; von 1022 bis 1025; pUC18-Sequenz; von 1026 bis 1036: pBAD24-Sequenz; von 1037 bis 1766: E. coli deoD-Gensequenz; von 1767 bis 1792: pBAD24-Sequenz; von 1793 bis 1794: pUC18-Sequenz; von 1795 bis 2228: pHP45Ω-Sequenz; von 2229 bis 3628: pBR322-Tet-Gensequenz; von 3629 bis 3896: pHP45Ω-Sequenz; von 3897 bis 6301: pUC18-Sequenz.
– pGM709: deoD-Gen, kloniert in pBAD24 (SEQ ID NO 7). Bei der Sequenznummerierung fällt die Koordinate 1 von pGM709 mit derjenigen der pBAD24-Vektorsequenz zusammen; von Nucleotid 1 bis 1311: pBAD24-Sequenz; von 1312 bis 2042: Sequenz entsprechend 230–960 von pGM678; von 2043 bis 5241: pBAD24-Sequenz.
– pGM769: pGM716 mit Deletion des HpaI-Fragments (SEQ ID NO 8). Bei der Sequenznummerierung fällt die Koordinate 1 von pGM769 mit derjenigen der pGM716-Sequenz zusammen; von Nucleotid 1 bis 914: pGM716-Sequenz; von Nucleotid 915 bis 5822: Sequenz entsprechend 1394–6301 von pGM716.
– pGM77l: udp- und deoD-Gene, kloniert in pUC18, um eine Fusion zwischen den beiden Proteinen zu schaffen; das Plasmid trägt ebenfalls das Tetracyclinresistenzgen (SEQ ID NO 9). Bei der Sequenznummerierung fällt die Koordinate 1 von pGM771 mit derjenigen der pGM716Sequenz zusam men; von Nucleotid 1 bis 1011: pGM716-Sequenz; von Nucleotid 1012 bis 6269: Sequenz entsprechend 1044–6301 von pGM716.
– pGM795: udp- und deoD-Gene, kloniert in pUC18, um eine Fusion zwischen den beiden Proteinen zu schaffen, die über einen Aminosäurelinker miteinander verbunden sind; das Plasmid trägt ebenfalls das Tetracyclin-Resistenzgen (SEQ ID NO 10). Bei der Sequenznummerierung fällt die Koordinate 1 von pGM795 mit derjenigen der pGM716Sequenz zusammen; von Nucleotid 1 bis 1011: pGM771-Sequenz; von 1012 bis 1041: Linkersequenz; von 1042 bis 6299: Sequenz entsprechend 1044–6301 von pGM716.
– pGM746: von pUC18 stammender Klonierungsvektor (SEQ ID NO 11). Bei der Sequenznummerierung fällt die Koordinate 1 von pGM746 mit derjenigen der pUC18-Vektorsequenz zusammen; von Nucleotid 1 bis 54: pUC18-Sequenz; 55 bis 109: pUC18-Polylinkersequenz; von 110 bis 2297: pUC18-Sequenz.
– pGM747: deoD-Gen, kloniert in pGM746 ohne Promotor stromaufwärts (SEQ ID NO 12). Bei der Sequenznummerierung fällt die Koordinate 1 von pGM747 mit derjenigen der pGM746 zusammen; von Nucleotid 1 bis 79: pGM746-Sequenz; von 80 bis 837: Sequenz entsprechend 1301–2058 von pGM709; von 838 bis 3031: pGM746-Sequenz.
– pGM751: deoD-Gen, kloniert stromabwärts des ptac-Promotors (SEQ ID NO 13). Bei der Sequenznummerierung fällt die Koordinate 1 von pGM751 mit derjenigen der pGM747 zusammen; von Nucleotid 1 bis 72: pGM747-Sequenz; von 73 bis 171: ptac-Sequenz aus pGZ119; von 172 bis 3128: pGM747-Sequenz.
– pGM800: udp- und deoD-Gene, kloniert stromabwärts des ptac-Promotors in einen von pUC18 stammenden Vektor (SEQ ID NO 14). Bei der Sequenznummerierung fällt die Koordinate 1 von pGM800 mit derjenigen der pGM751 zusammen; von Nucleotid 1 bis 923: pGM751-Sequenz; von 924 bis 1741: udp-Sequenz entsprechend 203–1020 von pGM679; von 1742 bis 3934: pGM751-Sequenz.
– pGM807: udp- und deoD-Gene, kloniert stromabwärts des ptac-Promotors in einen das Tetracyclin-Resistenzgen enthaltenden Vektor (SEQ ID NO 15). Bei der Sequenznummerierung fällt die Koordinate 1 von pGM807 mit derjenigen der pGM800 zusammen; von Nucleotid 1 bis 1742: pGM800-Sequenz; von 1743 bis 3855: Tc-Sequenz aus pHP45α; von 3856 bis 6046: pGM800-Sequenz.

Die so erhaltenen rekombinanten Stämme exprimieren Polypeptide mit UdP- und PNP-Aktivität in großen Mengen, dabei jegliche Kompatibilitäts- und/oder Solubilitätsprobleme minimierend, die bei Gegenwart von heterologen Proteinen verursacht werden können.
Insbesondere die bakteriellen Stämme mit der Bezeichnung DH5α/pGM678, MG1655/pGM678, DH5α/pGM707 und MG1655/pGM707, die das Enzym PNP überexprimieren; die Stämme DH5α/pGM679, MG1655/pGM679, DH5α/pGM708 und MG1655/pGM708, die das Enzym UdP überexprimieren; die Stämme DH5α/pGM712, DH5α/pGM716, MG1655/pGM716, DH5α/pGM800 und DH5α/pGM807, die die Enzyme PNP und UdP gleichzeitig in der selben Zelle überexprimieren; und die Stämme DH5α/pGM771, MG1655/pGM771, DH5α/pGM795, MG1655/pGM795, die die bifunktionellen Fusionsproteine UdP-(L)-PNP überexprimieren, wurden konstruiert. Die Wirksamkeit dieser neuen Stämme sowohl als Produzenten der Enzyme PNP und UdP als auch als Biokatalysatoren zur Herstellung von Nucleosiden mittels Bioumwandlungsreaktionen wurde mit der Herstellung von Enterobacter aerogenes-Zellen verglichen, die in Ge genwart von Induktoren kultiviert wurden, da dieser Mikroorganismus nach den in der Literatur verfügbaren Daten bisher als einer der besten zur Katalyse von Transglycosylierreaktionen angesehen wurde (Utagawa et al., Agric. Biol. Chem. 49, 1053–1058, 1985; Utagawa et al., Agric. Biol. Chem. 49, 2711–2717, 1985). Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung der neuen rekombinanten Stämme bei der Herstellung von Polypeptiden mit UdP-Enzymaktivität und PNP-Enzymaktivität und/oder als Katalysatoren von Transglycosylierreaktionen zwischen einem Donornucleosid und einer Akzeptorbase.
Die Enzymaktivität der rekombinanten Stämme wurde bestimmt durch direktes Inkubieren der Zellsuspension oder Zellextrakte, die mittels mechanischer und/oder enzymatischer Lyse erhalten wurden, in Phosphatpuffer mit einem Pyrimidinnucleosid (z.B. Uridin) zum Testen der UdP-Aktivität, oder mit einem Purinnucleosid (z.B. Inosin) zum Testen der PNP-Aktivität und durch Bestimmung der Bildung der Pyrimidinbase (Uracil) bzw. der Purinbase (Hypoxanthin) mittels Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC), wie in Beispiel 7 angegeben.
Unter Anwendung dieses Tests wurden die Enzymaktivitäten von UdP und PNP bei den rekombinanten bakteriellen Stämmen, auf die sich die vorliegende Erfindung bezieht, sowie beim E. aerogenes-Vergleichsstamm gemessen, um die in den Tabellen 1 und 2 angegebenen Ergebnisse zu ergeben, die zeigen, dass die rekombinanten Stämme der vorliegenden Erfindung Enzymaktivitäten bis ungefähr 10mal bis 30mal höher als denjenigen des Vergleichsstamms, der unter Induktionsbedingungen kultiviert wurde, und bis ungefähr 120mal bis 1.000mal höher als denjenigen der nicht transformierten E. coli-Wirtsstämmen.
Tabelle 1 Vergleich der Enzymaktivitäten der Uridinphosphorylase (UdP) und der Purinnucleosidphosphorylase (PNP) bei rekombinanten E. coli-Stämmen und im E. aerogenes-Vergleichsstamm
Tabelle 2 Vergleich der Enzymaktivitäten der Uridinphosphorylase (UdP) und der Purinnucleosidphosphorylase (PNP), getestet mit Zellextrakten der rekombinanten E. coli-Stämme MG1655 und DH5α in den entsprechenden Wildtyp-Stämmen sowie in den nicht induzierten und induzierten E. aerogenes-Vergleichsstämmen
Der überraschend hohe Grad an Enzymaktivität dieser neuen rekombinanten Stämme wird durch einen indirekten Vergleich mit den in JP-06-253 854 beschriebenen Stämmen bestätigt: Die in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogenen Stämme ermöglichen Enzymaktivitäten vom 340fachen bis 1040fachen (bezüglich der Aktivität von UdP) und vom 120fachen bis 200fachen (bezüglich der Aktivität von PNP) der Enzymaktivitäten der nicht transformierten Wildtyp-Stämme; die in JP-06-253 854 beschriebenen Stämme besitzen andererseits eine Enzymaktivität in E. coli von 150mal bzw. 91mal höher als derjenigen des entsprechenden Wildtyp-Stamms. Es ist ebenfalls bemerkenswert, dass die Enzymaktivität der Stämme der vorliegenden Erfindung bei 30°C bestimmt wurde, wohingegen die Stämme der JP-06-253 854 beim Arbeiten bei 70°C bzw. bei einer Temperatur, die deutlich höhere Kinetiken erlaubt, festgestellt wurden.
Dieser höhere Grad an Enzymaktivität wird auch bestätigt durch die Überexpression der Enzyme UdP und PNP, was sowohl durch Elektrophoreseanalyse (5) als auch durch die quantitative Bestimmung mittels RP-HPLC-Analyse demonstriert werden kann, was Niveaus der spezifischen Expression von 55 bis 120 mg UdP/g nasser Zellpaste und/oder von 15 bis 65 mg PNP/g nasser Zellpaste zeigte, wie im Beispiel der Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 3 Quantitative Bestimmung der UdP- und PNP-Expressionsniveaus durch RP-HPLC-Analyse
Die ganzen Zellen der hier beschriebenen rekombinanten Stämme oder ihrer rohen gereinigten Extrakte können vorteilhafterweise als Biokatalysatoren zur Herstellung natürlicher Nucleoside und modifizierter Analoga davon, ausgehend von einem Zucker donierenden Nucleosid und einer Akzeptorbase, mittels Bioübertragungsreaktionen verwendet werden, die die Gegenwart nur einer Art von Phosphorylase (UdP oder PNP) oder die gleichzeitige Gegenwart von UdP und PNP erfordern, gemäß den folgenden allgemeinen Schemata:

a) Pyrimidinnucleosid P1 + Pyrimidinbase P2 → Pyrimidinnucleosid P2 + Pyrimidinbase P1 in Gegenwart der rekombinanten Zellen, die UdP überexprimieren;
b) Purinnucleosid P1 + Purinbase P2 → Purinnucleosid P2 + Purinbase P1 in Gegenwart von rekombinanten Zellen, die PNP überexprimieren;
c) Pyrimidinnucleosid + Purinbase → Purinnucleosid + Pyrimidinbase in Gegenwart einer Mischung rekombinanter Zellen, die UdP und PNP getrennt überexprimieren, oder von Zellen eines einzelnen rekombinanten Stamms, der UdP und PNP coexprimiert;
d) Purinnucleosid + Pyrimidinbase → Pyrimidinnucleosid + Pyrimidinbase in Gegenwart einer Mischung rekombinanter Zellen, die UdP und PNP getrennt überexprimieren, oder von Zellen in einem einzelnen rekombinanten Stamm, der UdP und PNP coexprimiert.

Gemäß der in der Literatur gegebenen Information über Bioübertragungsreaktionen, die durch UdP und PNP katalysiert werden, kommen als Donornucleoside sowohl natürliche oder modifizierte Nucleoside, die D-Ribose und 2'-Deoxyribose enthalten, als auch Nucleoside, die eine in den 2'-, 3'- und/oder 5'-Positionen modifizierte Ribosegruppe enthalten, und insbesondere Nucleoside in Betracht, bei denen der Zucker durch α-D-arabinose, α-L-Xylose, 3'-Deoxyribose, 3',5'-Dideoxyribose, 2',3'-Dideoxyribose, 5'-Deoxyribose, 2',5'-Dideoxyribose, 2'-Amino-2'-deoxyribose, 3'-Amino-3'-deoxyribose oder 2'-Fluor-2'-deoxyribose gebildet wird. Die Akzeptorbasen, die bei den durch UdP und PNP katalysierten Bioübertragungsreaktionen verwendet werden können, sind natürliche oder substituierte Pyrimidin- und Purinbasen, insbesondere Purinbasen, die in den 1-, 2- und/oder 6-Positionen substituiert sind, Pyrimidinbasen, die in den 3- und/oder 5-Positionen substituiert sind, und auch andere heterocyclische Systeme, die einen oder mehrere Stickstoffatome enthalten, wie etwa z.B. Purin, 2-Azapurin, 8-Azapurin und substituierte Analoga davon, 1-Deazapurin (Imidazopyridin), 3-Deazapurin, 7-Deazapurin und substituierte Ana loga davon, Triazol und substituierte Analoga davon, Pyrazol und substituierte Analoga davon, Imidazolverbindungen und substituierte Analoga davon.
Eine andere Methode zur Herstellung natürlicher und modifizierter Nucleoside besteht in der Verwendung rekombinanter Zellen oder entsprechender roher oder gereinigter Zellextrakte zur Katalyse der Phosphorolysereaktion eines Donornucleosids (je nach der im Donornucleosid vorliegenden Base unter Verwendung von UdP oder PNP) und dem Erhalt von α-Zucker-1-phosphat, das wahlweise mittels Chromatographie-, Extraktions- oder Präzipitationstechniken isoliert werden kann und in der nachfolgenden Reaktion der Übertragung des Zuckers auf die passende Akzeptorbase in Gegenwart von UdP oder PNP (je nach der Art der Akzeptorbase) verwendet werden kann.
Die Verfügbarkeit der rekombinanten bakteriellen Stämme, die die UdP- und PNP-Enzyme getrennt überexprimieren, ermöglicht es auch, dass die Bedingungen der Transglycosylierreaktionen festgelegt werden im Hinblick auf die optimale Aktivität von jedem der beiden Enzyme durch vorläufige Tests, in denen die Reaktion in Gegenwart von Mischungen durchgeführt werden, die variierende Anteile von Zellen von jedem der beiden Stämme enthalten. Für jede Transglycosylierreaktion ist es deshalb möglich, im analytischen Maßstab die optimalen Verhältnisse der UdP- und PNP-Enzymaktivität zu definieren, während es bei der anschließenden präparativen, maßstäblichen Vergrößerung möglich ist entweder eine Mischung von Zellen der beiden Stämme, die einzeln UdP und PNP exprimieren, oder nur den Stamm, der UdP und PNP coexprimiert, wenn ihre Verhältnisse bereits optimal sind, oder gegebenenfalls den UdP und PNP coexprimierende Stamm, der mit Zellen von Stämmen zusammengefasst ist, die UdP oder PNP exprimieren, zu verwenden. Eine solche Optimierung der Reaktionsbedingungen kann unter Verwendung von rohen oder gereinigten Zellextrakten durchgeführt werden, die aus der Zellpaste von UdP und PNP überexprimierenden, rekombinanten Stämmen hergestellt werden.
Als Beispiel der Optimierung der Bioübertragungsreaktionen der vorliegenden Erfindung wird eine detaillierte Beschreibung der sich auf die Herstellung von 9-β-D-Arabinofuranosyladenin(Ara-A) und 1-β-D-Ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-carboxamid (Ribavirin) beziehenden Prozesse gegeben, was anzeigte, dass die besten Ergebnisse erhalten wurden mit UdP:PNP-Aktivitätsverhältnissen von 2:1 bzw. 1:1 sowie mit einer Konzentration von 10 Einheiten/ml UdP und 5 Einheiten/ml PNP für Ara-A und 10 Einheiten/ml entweder von UdP oder PNP für Ribavirin. Diese Enzymaktivitätsverhältnisse oder andere, die als Optimum für die betreffende Reaktion gefunden werden, können ohne Weiteres unter Verwendung der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen rekombinanten Stämme verwirklicht werden, um die Konzentration an Zellen, die als Biokatalysatoren zu verwenden sind, zu optimieren, während gleichzeitig die maximale Bioübertragungsausbeute, die mit den Gleichgewichtskonstanten der Enzymreaktionen kompatibel ist, sowie eine Verringerung der Reaktionszeiten erhalten wird. Entsprechend ist es möglich, alle Transglycosylierreaktionen zur Herstellung von Nucleosiden und modifizierten Analoga davon zu optimieren.
Wenn die neuen rekombinanten Stämme, die die Fusionsproteine UdP-(L)-PNP exprimieren (oder die entsprechenden hohen oder gereinigten Extrakte), für die Bioübertragungsreaktionen verwendet werden, gibt es den Vorteil der Verwendung bifunktioneller Polypeptide, bei denen die Komponenten mit der Aktivität der Enzyme UdP und PNP in dem stöchiometrischen Verhältnis 1:1 vorliegen. Da die Nucleosidproduktion über Bioübertragung auf dem Wege zweier aufeinander folgender Rektionen, die jeweils durch UdP und PNP katalysiert werden, durchgeführt wird, vermag ferner die Verwendung von Biokatalysatoren auf der Basis der bifunktionellen Fusionsproteine UdP-(L)-PNP gemäß der vorliegenden Erfindung die Gesamtkinetik der Reaktionen dank einer effizienteren Übertragung der Zwischenprodukte von einer Reaktionsstelle zur anderen zu verbessern.
Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen neuen rekombinanten Stämme ermöglichen die Herstellung natürlicher Nucleoside und modifizierter Nucleoside mit deutlich besseren Ergebnissen wie denen, die durch bisher bekannte Enzymtechniken erhalten wurden, die auf der Verwendung von isolierten Enzymen oder auf der Verwendung von bakteriellen Zellen von Wildtyp-Mikroorganismenstämmen sowie kultivierten Mikroorganismenstämmen unter Bedingungen zur Induktion der Aktivitäten der Phosphorylaseenzyme beruhen.
Ein Vergleich verschiedener Transglycosylierreaktionen, die durch Verwendung konstanter Verhältnisse zwischen der Konzentration des Donornucleosids (60 mM) und der Akzeptorbase (20 mM) durchgeführt wurden und in denen ein Produktivitätsparameter berechnet wurde (Simon et al., Angew. Chem. 24, 539–553, 1985), der zusätzlich zur spezifischen Aktivität ebenfalls Betriebsfaktoren, wie etwa z.B. den intrazellulären und extrazellulären Transportphänomene und die Volumenkonzentration der Endprodukte in Betracht zieht, zeigt, dass die Verwendung der rekombinanten Stämme oder der entsprechenden rohen oder gereinigten Extrakte, auf die sich die vorliegende Erfindung bezieht, stets durch eine größere Bioübertragungseffizienz und durch eine höhere Produktivität pro Zeit- und Volumeneinheit im Vergleich zur Verwendung von herkömmlichen Mikroorganismen gekennzeichnet ist (Tabelle 4).
Tabelle 4
Vergleich der Effizienz von Transglycosylierreaktionen, die durch rekombinante Escherichia coli-Zellen (E) und durch Enterobacter aerogenes-Kontrollzellen (C) katalysiert wurden
Die Reaktionen wurden bei 60°C für die angegebene Zeit durchgeführt unter Verwendung der selben Konzentrationen an Donornucleosid (60 mM) und an Akzeptorbase (20 mM). Die Bioübertragungsausbeute wurde relativ zur Akzeptorbase mittels RP-HPLC-Analyse der Reaktionsmischung berechnet. Die Effizienz der Reaktion wird durch den Produktivitätsindex (P) ausgedrückt, berechnet durch die folgende Formel P = n·m^–1·t^–1·1000, wobei n = Konzentration des Endprodukts (g/l); m = nasse Zellpaste (g/l Reaktionsmischung) und t = Reaktionszeit in Stunden.
Insbesondere ermöglicht, wie im in Tabelle 5 gezeigten Beispiel bezüglich der Herstellung von Ara-A aus Ara-U und Adenin gezeigt, die Verwendung der rekombinanten Stämme die Verbesserung herkömmlicher Bioübertragungsprozesse sowohl vom technischen Gesichtspunkt als auch vom ökonomischen Gesichtspunkt aus und ermöglicht höhere Bioübertragungsausbeuten, kürzere Reaktionszeiten und höhere Volumenausbeuten des zu erhaltenden Endprodukts unter Verwendung einer niedrigeren Konzentration an Zellen oder des entsprechenden rohen oder gereinigten Extrakts.
Tabelle 5 Vergleich der Arbeitsbedingungen für die Herstellung von Ara-A mittels Transglycosylierung, katalysiert durch rekombinante E. coli-Zellen und durch eine E. aerogenes- Vergleichspräparation
Ein weiterer Vorteil, der von der Verwendung der rekombinanten Stämme, auf die sich die vorliegende Erfindung bezieht, herrührt, ist die Vereinfachung der Prozesse zur Wiedergewinnung und Wiederverwendung der Zell-Biomasse oder des entsprechenden rohen oder gereinigten Zellextrakts, was sich aus der Gegenwart einer geringeren Zellkonzentration ergibt; somit ist z.B. jegliche Wiedergewinnung der Zellen oder des Extrakts durch Filtration oder Ultrafiltration und ihr anschließendes Recyceln deutlich schneller, wenn die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen rekombinanten Stämme verwendet werden. In einigen Fällen, insbesondere wenn Substrate mit einer hohen Affinität gegenüber Enzymen verwendet werden, ist die Konzent ration an rekombinanten Zellen oder des entsprechenden rohen oder gereinigten Zellextrakts auf solch niedrige Werte reduziert, dass es ökonomisch vorteilhaft sein kann – mit einer weiteren Vereinfachung des Herstellungsprozesses –, das Erfordernis deren Wiedergewinnung zu umgehen.
Zweck der unten gegebenen Beispiele ist es, die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen, ohne eine Begrenzung des Anwendungsgebiets davon zu bilden.
Beispiel Nr. 1
Klonieren des udp-Gens von Escherichia coli in einen Expressionsvektor
Die E. coli udp-Gensequenz wurde in der EMBL-Datenbank mit der Zugangsnummer X15689 gefunden. Das Gen wurde mittels PCR mit den Oligonucleotiden 5'-ATCGGTACCATCCATGRCCAAGTCTGATGTTTTTCATCTC-3' und 5'-AGACGGTCGACAAGAGAATTACAGCAGACGACGC-3' aus dem E. coli-Stamm K12 MG1655 amplifiziert (Sieger et a., Microbiol., Rev. 53, 1–24- 1989). Die amplifizierte Region umfasst die vollständige Sequenz des udp-Gens beginnend mit dem Startcodon ATG bis 7 bp stromabwärts des Stoppcodons TAA. Eine KpnI-Restriktionsstelle wurde bei 5' des Gens eingeführt, gefolgt von 4 Basen, die willkürlich ausgewählt wurden. Eine SalI-Stelle gibt es beim 3' des Gens. Das amplifizierte Fragment, welches durch KpnI und SalI verdaut wurde, wurde in die Polylinker-Region des pUC18-Vektors einkloniert, der das Amplicillin-Resistenzgen trägt (Yanish und Perron, Gene 33, 103–119, 1985; EMBL-Zugangsnummer L08752). Nach der Transformation des DH5α-Stamms (Hanahan, J. Mol. Biol. 166, 557–580, 1983) wurde das pGM679-Plasmid erhalten (1). Im Konstrukt ist zwischen den ersten Codons des lacZ-Gens von pUC18 und der gesamten udp-Sequenz eine Fusion geschaffen (2), und die Transkription steht unter der Kontrolle des lac-Promotors des Vektors.
Die klonierte Region wurde vollständig sequenziert, und es wurde gefunden, dass sie vollständig identisch mit der Sequenz der Datenbank ist. Die pGM679-Plasmidsequenz ist aufgelistet.
Das pBR322-Tet-Gen, das eine Tetracyclin-Resistenz verleiht (Bolivar et al., Gene 2, 95–113, 1977; EMBL-Zugangsnummer J01749), wurde dann in das pGM679-Plasmid insertiert. Das Gen, dem sein Promotor vorangeht, wurde durch HindIII-Verdauung aus dem Interposon pHP45W708-Tet erhalten (Fellay et al., Gene 52, 147–154, 1987) und in die HindIII-Stelle von pGM679 kloniert. Das resultierende Plasmid wurde pGM708 genannt (1). Die vollständige Sequenz ist aufgelistet.
Beispiel Nr. 2
Klonieren des deoD-Gens von Escherichia coli in einen Expressionsvektor
Die E. coli deoD-Gensequenz wurde in der EMBL-Datenbank mit der Zugangsnummer M60917 gefunden. Das Gen wurde mittels PCR mit den Oligonucleotiden 5'-CTGAATTCTTCCATGGCTACCCCACACATTAATGCAG-3' und 5'-TCATGGTCGACTTACTCTTTATCGCCCAGCAGAACG-3' aus dem E. coli-Stamm K12 MG1655 amplifiziert (Singer et al., Microbiol. Rev. 53, 1–24, 1989). Die amplifizierte Region umfasst die vollständige Sequenz des deoD-Gens, ausgehend vom Startcodon ATG bis zum Stoppcodon TAA. Eine EcoRI-Restriktionsstelle wurde beim 5' des Gens insertiert, gefolgt von vier zufällig ausgewählten Basen. Eine SalI-Stelle liegt beim 3' des Gens vor. Das amplifizierte Fragment, welches mit EcoRI und SalI verdaut wurde, wurde in die Polylinkerregion des pUC18-Vektors kloniert, der das Gen für die Ampicillin-Resistenz trägt (Yanish und Perron, Gene 33, 103–119, 1985; EMBL-Zugangsnummer L08752). Nach Transformation des DH5α-Stamms (Hanahan, J. Mol. Biol. 166, 557–580, 1983), wurde das pGM678-Plasmid erhalten (1). Im Konstrukt wird eine Fusion zwischen den ersten Codons des lacZ-Gens von pUC18 und der gesamten deoD-Sequenz gebildet (2), und die Transkription steht unter der Kontrolle des lac-Promotors des Vektors. Die klonierte Region wurde vollständig sequenziert und wurde als vollständig identisch mit der Datenbanksequenz befunden. Die pGM678-Plasmidsequenz ist aufgelistet.
Das Tet-Gen, welches Tetracyclin-Resistenz verleiht, wurde dann in das pGM678-Plasmid insertiert auf eine der in Beispiel Nr. 1 beschriebenen analogen Weise. Das resultierende Plasmid wurde pGM707 (1) genannt. Seine vollständige Sequenz ist aufgelistet.
Das deoD-Gen wurde ebenfalls in einen anderen Vektor kloniert, wie unten berichtet.
Die Region] PvuII-NdeI des pUC18-Plasmids (mit Klenow gefülltes Ende), die den Replikationsursprung enthielt, wurde mit dem den Polylinker enthaltenden Fragment EcoRI (gefüllt)-HindIII (gefüllt) verknüpft, um das resultierende Plasmid pGM746 zu erhalten, dessen Sequenz aufgelistet ist. pGM746 wurde anschließend mit BamHI (gefüllt)-SphI verdaut und mit dem Fragment NheI (gefüllt)-SphI des Plasmids pGM709 verknüpft, in dem das deoD-Gen enthalten ist, dem eine Shine-Dalgarno Sequenz für die Ribosomenbindungsstelle vorangeht (siehe Beispiel 3). Das resultierende Plasmid wurde pGM747 genannt, und seine Sequenz ist ebenfalls aufgelistet.
Die den tac-Promotor enthaltende Region wurde mittels PCR-Amplification mit Oligonucleotiden 5'-ATTGAGCTCGACATCATAACGGTTCTGGC und 5'-ATTGGATCCTGTGTGAAATTGTTATCCGC des Plasmids pGZ119 (Lessl et al., J. Bacteriol. 174, 2493–2500, 1992), Verdau des Fragments mit BamHI-SacI und Insertion in BamHI-SacI von pGM747 stromaufwärts von deoD erhalten. Das resultierende Plasmid pGM751 (3) enthält das deoD-Gen, beginnend vom tac-Promotor, und exprimiert das zum Wildtyp identische PNP-Enzym. Die pGM751-Sequenz ist aufgelistet.
Beispiel Nr. 3
Klonieren der udp- und deoD-Gene in einen einzelnen Expressionsvektor
Die udp- und deoD-Gene wurden in den selben Vektor kloniert, um die UdP- und PNP-Enzyme gleichzeitig innerhalb der selben Zelle zu exprimieren. Dies wurde bewirkt durch Insertieren des deoD-Gens in das pGM679-Plasmid, stromabwärts von udp. Zur Konstruktion wurde das EcoRI-SalI-Fragment von pGM678, das das deoD-Gen enthielt, in den pBAD24-Vektor kloniert (Guzman et al., J. Bacteriol. 177, 4121–4230, 1995; EMBL-Zugangsnummer X81838), dadurch das Plasmid pGM709 erhalten. Das Fragment NheI (mit gefüllten Enden)-SphI dieses Konstrukts wurde in pGM679 kloniert, mit SalI (gefüllt)-SphI verdaut, um pGM712 zu ergeben (1). In pGM712 werden beide udp- und deoD-Gene, ausgehend vom lac-Promotor transkribiert, jedoch ist die Translation von deoD von derjenigen von udp abhängig, da die Sequenz zum Anbringen der Ribosomen stromaufwärts von deoD vorliegt (2). Es dürfte klar werden, dass das durch pGM712 exprimierte PNP-Protein zu den Wildtyp-Proteinen identisch ist, da die Fusion mit den ersten Codons von lacZ am 5' des Gens beseitigt wurde (2). Die vollständige pGM712-Sequenz ist aufgelistet.
Das Tet-Gen, welches Tetracyclin-Resistenz verleiht, wurde anschließend in das im Beispiel Nr. 1 beschriebene pGM712-Plasmid insertiert. Das resultierende Plasmid wurde pGM716 genannt (1). Seine vollständige Sequenz ist aufgelistet.
Die udp und deoD-Gene wurden auch in einen anderen Vektor kloniert, in dem sie in dieser Reihenfolge, ausgehend von tac-Promotor, gleichzeitig exprimiert werden, wie unten berichtet.
Das Fragment SalI-HindIII, das unter Verwendung der pGM679-DNA als einem Templat und den Oligonucleotiden 5'-TCCAGTCGACACAGGAAACAGCTATGA und 5'-TACGAAGCTTA AGAGAATTACAGCAGACG erhalten wurde, wurde in das Plasmid pGM751 insertiert, mit SalI-HindIII verdaut, um das Plasmid pGM800 zu erhalten, das das stromabwärts von deoD klonierte Gen udp trägt. Beide Gene werden ausgehend vom ptac transkribiert, aber die Transduktion ist unabhängig. Die vollständige Sequenz von pGM800 ist aufgelistet.
Das Gen Tc für die Tetracyclin-Resistenz wurde anschließend in pGM800 insertiert gemäß einem in Beispiel 1 berichteten analogen Prozess, somit das Plasmid pGM807 erhaltend (3), dessen Sequenz ebenfalls aufgelistet ist.
Beispiel Nr. 4
Klonieren des Fusionsproteins UdP-PNP und UdP-(L)-PNP
Die für UdP und PNP kodierenden Sequenzen wurden entweder direkt oder durch einen kurzen Aminosäurelinker getrennt zusammen fusioniert. Die Plasmide wurden durch anschließende Schritte, ausgehend von pGM716, erhalten. Insbesondere wurde das Plasmid pGM716 mit HpaI verdaut und wieder geschlossen, um die Deletion des terminalen Bereichs des Gens udp und im Startbereich von deoD zu haben und das Plasmid pGM769 mit der einzigartigen Stelle HpaI zu schaffen. Der 3'-Abschnitt von udp wurde mittels PCR mit den Oligonucleotiden 5'-GGCCGTTAACCGCACCCAGCAAGAG und 5'-AGCCATGGACAGCAGACGACGCGCC amplifiziert; der 5'-Abschnitt von deoD wurde auf die gleiche Weise mit den Oligonucleotiden 5'-GCTGTCCATGGCTACCCCACACATTAAT und 5'-CCGGGTTAACTTTGGAATCGGTGCAGG amplifiziert. Anschließend wurde unter Verwendung des Produkts der beiden PCRs als einem Templat und den beiden äußeren Sequenzen die komplette Region amplifiziert: Das erhaltene Fragment bildet eine Fusion zwischen udp und deoD, wobei das udp-Stoppcodon mit dem Codon für Serin ersetzt wird, gefolgt vom deoD-ATG-Codon. Das Fragment wurde mit HpaI (der Stelle, die an den beiden Enden vorliegt) verdaut und in die pGM769-HpaI-Stelle kloniert. Das resultierende Plasmid wurde pGM771 genannt (4). Im pGM771 wird dann das Fusionsprotein UdP-PNP, ausgehend vom lac-Promotor, transkribiert. Die Plasmidsequenz ist aufgelistet.
Das Plasmid pM771 wurde anschließend modifiziert durch Einführen des 5'-CATGGGCGGTGGCAGCCCGGGCATTCTGGCCATG-Linkers in die einzige NcoI-Stelle, unmittelbar stromaufwärts des deoD-ATG-Starts. Das resultierende Plasmid, genannt pGM795 (4), exprimiert ein Fusionsprotein, das durch UdP + einem 11-Aminosäurelinker (ser-met-gly-gly-gly-ser-pro-gly-ile-leu-ala) + PNP gebildet ist. Die pGM795-Sequenz ist aufgelistet.
Beispiel Nr. 5
Transformation von E. coli
Der E. coli-Stamm K12 DH5α, der die recAl-Mutation (Hanahan, J. Mol. Biol. 166, 557–580, 1983) trägt, und der Wildtyp-Stamm MG1655 (Singer et al., Microbiol. Rev. 53, 1–24, 1989) wurden mit den Plasmiden pGM678, pGM679, pGM707, pGM708, pGM712, pGM716, pGM771, pGM795, pGM751, pGM800 und pGM807 transformiert. Der Genotyp der Stämme und einige Charakteristika der rekombinanten Stämme sind in den Tabellen 6 und 7 gegeben. Die pGM678-, pGM679-, pGM712-, pGM751- und pGM807-Transformanten wurden auf einem Medium, das Ampicillin (50 μg/ml) enthielt, selektiert, und die pGM707-, pGM708-, pGM716-, pGM771-, pGM795- und pGM907-, pGM771-, pGM795- und pGM807-Transformanten wurden auf einem Medium, das Tetracyclin (12,5 μg/ml) enthielt, selektiert.
Tabelle 6 Genotyp der Wirtsstämme
Tabelle 7 Charakteristika der neuen rekombinanten Stämme
Die Gegenwart des Plasmids in den transformierten Stämmen wurde durch Extraktion der Plasmid-DNA und Analyse auf 0,6%igem Agarosegel bestätigt.
Das Wachstum der transformierten Stämme in LD-Brühe (Zusammensetzung pro Liter: 10 g Bactotrypton (Difco), 5 g Hefeextrakt (Difco), 5 g NaCl) oder in festem Medium (LD + 10 g/l Agar), zu dem Ampicillin (50 μg/l) oder Tetracyclin (12,5 μg/ml, nur für die Stämme, die mit pGM707, pGM708, pGM716, pGM771, pGM795 und pGM807 transformiert wurden) hinzugefügt wurde, ist vergleichbar zu dem der Kontroll-Stämme, die mit dem pUC18-Vektor transformiert wurden. Zusätzlich zeigen die Stämme, die mit den Plasmiden pGM707, pGM708, pGM716, pGM771, pGM795 und pGM807 transformiert wurden, die beiden Resistenzgene tragen, keine Unterschiede im Wachstum in Gegenwart von Ampicillin und Tetracyclin.
Beispiel Nr. 6
Beurteilung der Expression der UdP- und PNP-Proteine in den rekombinanten Stämmen
Vorkulturen der rekombinanten Stämme wurden erhalten, indem einzelne Klone in LD-Medium, in welches ein Antibiotikum hinzugegeben worden war, inokuliert wurden und indem über Nacht ohne Bewegung bei 37°C inkubiert wurde. Die Kulturen wurden 1:20 in LD-Medium + Antibiotikum in einem flachbödigen Kolben verdünnt und bei 37°C mit Bewegung inkubiert, bis die stationäre Phase erreicht war, entsprechend Zelldichtewerten von ungefähr 2 Einheiten der optischen Dichte bei 600 nm. Die aus 1 ml der Kultur extrahierten Gesamtproteine wurden auf 15%igem Polyacrylamidgel unter reduzierenden Bedingungen (SDS-PAGE) aufgetrennt, und die Proteine wurden wurde anfärben mit Coomassie Blue sichtbar gemacht. Die PNP- und UdP-Proteine wurden auf der Basis des Molekulargewichts von ungefähr 26,6 kDa für PNP und 28,2 kDa für UdP identifiziert. Das aus den Extrakten der Stämme MG1655/pGM707, pGM708 und pGM716 erhaltene Ergebnis ist in der 5 gegeben. Die elektrophoretische Analyse zeigt, dass in allen untersuchten Proben eine Überexpression von UdP und PNP auftrat, da die entsprechenden Proteinbanden einen beträchtlichen Prozentsatz der Gesamtzellproteine ausmachen; dieses Ergebnis wird durch die quantitative Bestimmung der Enzymaktivitäten, die in den Tabellen 1 und 2 angegeben sind, und durch die quantitative Bestimmung der UdP- und PNP-Expression, die durch Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) bewirkt wurde, bestätigt. Zu diesem Zweck wurde das lösliche Extrakt auf einer analytischen C4-Vydac-Analysensäue mit den Dimensionen 4,6 × 250 mm unter Verwendung einer mobilen Phase, die durch 0,1% Trifluoressigsäure enthaltendes Acetonitril-H₂O gebildet ist, und durch Arbeiten gemäß den folgenden Parametern analysiert:
Fließrate von 0,75 ml/min; Elution mit einem Gradienten von 40% Acetonitril bis 65% Acetonitril in 30 min; Temperatur von 45°C; UV-Detektion bei einer Wellenlänge von 215 nm. Unter den angewandten Analysebedingungen betrugen die Elutionszeiten für UdP bzw. PNP ungefähr 13 min bzw. 15 min. Die quantitative Bestimmung wurde durch Vergleich der Fläche des Peaks von Interesse mit der Fläche des Peaks von Standard-UdP- und -PNP-Präparationen, die unter den selben Bedingungen, wie die Proben getrennt wurden, durchgeführt.
Da in den rekombinanten Stämmen die deoD- und udp-Gene unter der Kontrolle des lac-Promotors kloniert sind, wurden das Wachstum der Zellen und die Expression der UdP- und PNP-Proteine sowohl in Abwesenheit als auch in Gegenwart von 40 mg/l IPTG als Transkriptionsinduktor verfolgt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Gegenwart von IPTG das Zellwachstum nicht verändern und den Grad der PNP- und UdP-Expression nicht erhöhen (möglicherweise aufgrund einer unzureichenden Menge an Repressor in diesen Stämmen). Das letzte Ergebnis zeigt, dass in den rekombinanten Stämmen, auf die sich die vorliegende Erfindung bezieht, die Expression der deoD- und udp-Gene konstitutiv ist und sehr hohe Spiegel erreicht, ohne Phänomene von Zellschädigungen oder verminderter Zellvitalität.
Beispiel Nr. 7
Bestimmung der Enzymaktivität der intrazellulär in rekombinanten Bakterienzellen exprimierten Uridinphosphorylase und Purinnucleosidphosphorylase
Die Stämme wurden, wie in Beispiel Nr. 5, wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, in Form einer nassen Zellpaste eingewogen und bei –20°C gelagert, bis die Enzymanalyse durchgeführt wurde.
Die Aktivität des UdP-Enzyms wurde in einem Phosphorolysetest bestimmt, indem die durch Ultraschallbehandlung erhaltene, lösliche Fraktion (Zellextrakt) einer bekannten Menge einer Suspension der Zellpaste 5 min bei 30°C inkubiert wurde und in dem das Homogenat in 100 mM-pH 7 Phosphatpuffer, das 60 mM des Uridin-Substrats enthielt, zentrifugiert wurde. Die Enzymreaktion wurde durch Ansäuerung mit 0,1N HCl abgestoppt; die Suspension wurde filtriert und mittels RP-HPLC auf einer C18-Säule (Hypersyl 100; 4,6 × 250 mm), bei Elution unter isokratischen Bedingungen mit einer mobilen Phase, die durch 0,02 M K₂HPO₄ in Methanol-H₂O (4 : 96 v/v) gebildet war und mit NH₄OH auf pH 4,5 eingestellt war, analysiert. Die Menge des in der Reaktion gebildeten Uracils wurde durch Vergleich mit einer Standardkurve bestimmt, und die Enzymaktivität der Zellpräparation wurde in μmol Uracil/min/g nasser Zellpaste (Einheiten/g) berechnet. Die Aktivität des PNP-Enzyms wurde in einem Phosphorolysetest bestimmt, in dem die mittels Ultraschallbehandlung erhaltene, lösliche Fraktion (Zellextrakte) einer bekannten Menge einer Suspension der Zellpaste für 10 min bei 30°C inkubiert wurde, und in dem das Homogenat in 100 mM-pH 7 Phosphatpuffer, das 50 mM des Inosinsubstrats enthielt, zentrifugiert wurde. Die Enzymreaktion wurde durch Ansäuerung mit 0,1N HCl abgestoppt; die Suspension wurde filtriert und durch RP-HPLC auf einer C18-Säule (Hypersyl 100; 4,6 × 250 mm) bei einer Elution unter isokratischen Bedingungen mit einer mobilen Phase, die durch 0,02 M K₂HPO₄ in Methanol-H₂O (4: 96 v/v) gebildet war und mit NH₄OH auf pH 4,5 eingestellt war, analysiert. Die Menge an bei der Reaktion gebildetem Hypoxanthin wurde durch Vergleich mit einer Standardkurve bestimmt, und die Enzymaktivität der Zellpräparation wurde in μmol Hypoxanthin/min/g nasser Zellpaste (Einheiten/g) berechnet.
Beispiel Nr. 8
Fermentation der rekombinanten Stämme
Die rekombinanten Stämme, auf die sich die vorliegende Erfindung bezieht, wurden bei hoher Biomasse unter Fermentationsbedingungen von entweder dem Chargen-(batch)-Modus oder dem Zufuhrchargen(fed-batch)-Modus kultiviert.
Die Chargenmodus-Fermentationen wurden unter Verwendung eines Fermenters mit einem Arbeitsvolumen von 10 l durchgeführt, der mit 9 Litern Medium mit der folgenden Zusammensetzung (pro Liter): 0,6 g KH₂PO₄; 3,2 g K₂HPO₄; 20 g Soyton (Difco); 36 g Hefeextrakt (Difco); 1 g MgSO₄-7H₂O; 0,0125 g Tetracyclin (oder einem anderen Antibiotikum, das als Selektionsmarker verwendet wurde) gefüllt war und der mit 1 l einer Bakteriensuspension inokuliert wurde, die zuvor für 20 h bei 30°C in einem Medium kultiviert wurde, die die folgenden Zusammensetzung pro Liter aufwies: 20 g Trypton; 10 g Hefeextrakt; 10 g NaCl; 0,0125 g Tetracyclin.
Die Fermentation wurde gemäß den folgenden Betriebsbedingungen durchgeführt: 30°C; Luftstrom von 1 l/l Kultur/min; Anfangsbewegung 250 U/min, automatisch modifiziert, um einen Grad an O₂ von 20% der Sättigungskonzentration aufrecht zu erhalten; durch Zugaben von H₃PO₄ oder NH₄OH bei 7 gehaltener pH; Dauer von 24 h. Als die Fermentation beendet war, wurde das Kulturmedium zentrifugiert, das Zellpellet wurde in 30 mM-pH 7 Phosphatpuffer gewaschen. Die erhaltene Biomasse (40 bis 50 g an nasser Zellpaste/l Kulturmedium) wurde bei –20°C gelagert, bis sie dem Gebrauch zugeführt wurde.
Die Zufuhrchargenmodus-Fermentationen wurden unter Verwendung eines Fermenters mit einem Arbeitsvolumen von 10 l durchgeführt, der mit 7 l des Mediums bei pH 6,8 bis 7 mit der folgenden Zusammensetzung pro Liter gefüllt war:
13,3 g KH₂PO₄; 4 g (NH₄)₂HPO₄; 1,25 g Soyton (Difco); 0,125 g Hefeextrakt (Difco); 1,7 g Citronensäure; 2,5 g Glycerin; 1,5 g MgSO₄-7H₂O; 0,08 g CaCl₂; 0,01 g Thiamin, 0, 0125 g Tetracyclin (oder einem anderen antibiotischen Selektionsmittel); 0,08 g FeSO₄-7H₂O; 0,02 g MnSO₄-H₂O; 0.03 g ZnSO₄-7H₂O; 0,003 g H₃BO₃; 0,06 g CuSO₄-5H₂O; 0.008 g CoCl₂-6H₂O; 0,004 g NaMoO₄-2H₂O. Der Fermentor wurde mit 1 Liter bakterieller Suspension inokuliert, die zuvor für 18 bis 20 h bei 30° in einem Medium mit der folgenden Zusammensetzung pro Liter kultiviert worden war: 13,3 g KH₂PO₄; 4 g (NH₄)₂HPO₄; 5 g Soyton (Difco); 1,7 g Citronensäure; 10 g Glycerin; 0,01 g Thiamin; 0,0125 g Tetracyclin; 0,05 g CaCl₂-2H₂O; 1 g MgSO₄-7H₂O; 0,03 g FeSO₄-7H₂O; 0,01 g MnSO₄-H₂O; 0,01 g ZnSO₄-7H₂O; 0,003 g H₃BO₃; 0,02 g Cu-SO₄-5H₂O; 0,002 g CoCl₂-6H₂O; 0,002 g NaMoO₄-2H₂O.
Die Fermentation wurde gemäß den folgenden Betriebsparametern durchgeführt: 30°C; Luftstrom 1–1,2 l/l Kultur/min; Anfangsbewegung 150 U/min, automatisch verändert zum Aufrechterhalten eines O₂-Spiegels bei 20% der Sättigungskonzentration für ungefähr 8–10 h (Chargen (batch) -Phase) und anschließend eines O₂-Spiegels bei 10% der Sättigungskonzentration (Zufuhrchargen (fed-batch) -Phase); durch Zugaben von H₃PO₄ oder NH₄OH bei 6,8–7 gehaltenem pH. Während der Zufuhrchargen (fed-batch) -Phase wurde der Fermentation automatisch insgesamt 2 l einer Lösung mit der folgenden Zusammensetzung pro Liter zugeführt: 400 g Glycerin; 200 g Soyton; 20 g Hefeextrakt; 3 g MgSO₄-7H₂O; 0,0125 g Tetracyclin. Als die Fermentation beendet war (nach ungefähr 50 h), wurde das Kulturmedium zentrifugiert, das Zellpellet wurde in 30 mM-pH 7 Phosphatpuffer gewaschen. Die erhaltene Biomasse (150–200 g an nasser Zellpaste/l Kulturmedium) wurde bei –20°C gelagert, bis sie dem Gebrauch zugeführt wurde.
Beispiel Nr. 9
Transglycosylierreaktionen im Labormaßstab sowie Berechnung des Produktivitätsindex
Die Transglycosylierreaktionen wurden unter Verwendung verschiedentlicher Zucker-donierender Nucleoside bei einer Konzentration von 60 mM (Uridin, 2-Deoxyuridin, Ara-U) und unterschiedlicher Akzeptorbasen bei einer Konzentration von 20 mM (1,2,4-Triazol-3-carboxamid, Guanin, Adenin, Thymin, 2,6-Diaminopurin) bei pH 7 in Phosphatpuffer (30 mM) in Gegenwart verschiedener Konzentrationen an Zellpaste oder entsprechendem rohen oder gereinigten Zellextrakt, die entweder aus Kulturen des Kontrollmikroorganismus E. aerogenes oder aus Kulturen des rekombinanten E. coli-Stamms MG1655/pGM716, die die UdP- und PNP-Enzyme überexprimierten, stammten, durchgeführt. Die Reaktionen wurden für unterschiedliche Zeiträume (von 1 h bis 25 h) bei 60°C durchgeführt, und die prozentuale Bioumwandlung wurde im Vergleich zur Anfangskonzentration der Akzeptorbase mittels RP-HPLC-Analyse der verdünnten Reaktionsmischung bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 gegeben.
Der Produktivitätsindex P wurde für jede Reaktion durch Anwenden der folgenden Formel berechnet: P = n·m–1·t–1·1000worin

n: = Konzentration des Endprodukts (g/l)
m: = nasse Zellpaste (g/l Reaktionsmischung)
t: = Reaktionszeit in Stunden.

Der Produktivitätsindex gibt ein Gesamtmaß der Effizienz der Reaktion an, da er sowohl die Charakteristika der Enzym-Substrat-Wechselwirkung selbst als auch die Betriebsparameter, wie der Reaktionszeit, die Menge der verwendeten Zellen und die Volumenausbeute des Endprodukts in Betracht zieht.
Beispiel Nr. 10
Optimierung der Verwendung rekombinanter E. coli-Zellen in Transglycosylierreaktionen
Die Präparation von Ribavirin, ausgehend von Uridin (60 mM) und 1,2,4-Triazol-3-carboxamid (40 mM) und von Ara-A, ausgehend von Ara-U (40 mM) und Adenin (40 mM), wurden als Beispiele der Optimierung der Verwendung rekombinanter E. coli-Zellen bei Bioübertragungsreaktionen untersucht. In jedem Fall wurden die Reaktionen bei 60°C in Gegenwart von 30 mM Kaliumphosphat bei pH 7 und in Gegenwart verschiedener Mengen an Zellpaste, die durch Fermentation der Stämme MG1655/pGM707 (Überexpression des UdP-Enzyms) und MG1655/pGM708 (Überexpression des PNP-Enzyms) erhalten wurde, durchgeführt. Nach vorbestimmten Zeitabständen wurden Volumenteilmengen der Reaktionsmischung genommen und mittels RP-HPLC analysiert, um die prozentuale Bioübertragung (im Vergleich zur Konzentration der Akzeptorbase berechnet) zu bestimmen.
Die Untersuchung wurde anfänglich durch Inkubieren der Reaktionsmischung für 20 h in Gegenwart einer begrenzten Konzentration an Zellpaste (mit einer Gesamtenzymaktivität von gleich oder weniger als 2 Einheiten ml) und durch eine Arbeitsweise derart, dass variierende Verhältnisse der UdP-Enzymeinheiten zu den PNP-Enzymeinheiten in den Proportionen 5:1, 2:1; 1:1; 1:2 und 1:5 vorlagen, durchgeführt Die erhaltenen Ergebnisse der beiden Bioübertragungsreaktionen sind in Tabelle 8 gegeben.
Tabelle 8
Untersuchung der Transglycosylierreaktionsbedingungen
Die Reaktionen wurden für 20 h bei 60°C in Gegenwart begrenzender Konzentrationen an Zellpaste durchgeführt.
Die in der Tabelle gegebenen Ergebnisse zeigen, dass die optimalen UdP- und PNP-Aktivitätsverhältnisse jeweils 1:1 und 1:0,5 für die Reaktion der Bildung von Ribavirin bzw. Ara-A sind.
Diese Daten wurden in der anschließenden Untersuchung bestätigt, bei der 10mal höhere Enzymkonzentrationen verwendet wurden, wobei die selben Proportionen zwischen den UdP-Einheiten und den PNP-Einheiten beibehalten wurden; bei dieser Untersuchung wurden die Reaktionskinetiken ebenfalls durch Entnehmen von Proben den Reaktionsmischungen bei Zeitabschnitten von 1 h für die RP-HPLC-Analyse und durch Berechnung der prozentualen Bioübertragung bestimmt.
Tabellen 9 und 10 zeigen jeweils für die Ribavirin und die Ara-A-Präparationsreaktionen für die unterschiedlichen untersuchten Proportionen von UdP und PnP die optimalen Parameter in Bezug auf die prozentuale Bioübertragung und die Reaktionszeit.
Tabelle 9 Optimierung der Reaktionsbedingungen zur Herstellung von Ribavirin
Tabelle 10 Optimierung der Reaktionsbedingungen zur Herstellung von Ara-A
Die Ergebnisse der Optimierungsuntersuchung zeigen, dass die Ribavirin in 2 h mit einer Bioübertragungsausbeute von 91% unter Verwendung von 10 Einheiten/ml entweder von UdP oder PNP erhalten werden kann, wohingegen Ara-A in 2 h mit einer Bioübertragungsausbeute von ungefähr 71% unter Verwendung von 10 Einheiten/ml von UdP und 5 Einheiten/ml von PNP erhalten werden kann.
Auf der Basis des Emzym-Aktivitätstiters der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen rekombinanten E. coli-Stämme ist es deshalb möglich, die Menge an Zellpaste zu berechnen, die zur Herstellung von Ribavirin und Ara-A unter optimalen Bedingungen nötig ist. Z.B. im Fall der Stämme MG1655/pGM707 und MG1655/pGM716 mit den in Tabelle 1 gegebenen spezifischen Aktivitäten werden jeweils 0,4 und 0,2 g nasser Zellpaste/100 ml Reaktionsmischung für die Herstellung von Ribavirin bzw. Ara-A verwendet.
Beispiel Nr. 11
Herstellung von Ara-A im Pilot-Maßstab durch Transglycosylierreaktion, die mit dem E. aerogenes-Vergleichsstamm mit den rekombinanten E. coli-Stämmen und mit den entsprechenden Zellextrakten durchgeführt wird
Das Verfahren zur Herstellung von Ara-A durch Transglycosylierung, die durch E. aerogenes-Zellen oder durch rekombinante Zellen von MG1655/pGM716 oder DH5α/pGM716 E. coli UdP und PNP überexprimieren, wurde im Reaktionsmaßstab von 1000 l untersucht.
50 kg nasser Zellpaste, die durch Fermentierung von E. aerogenes erhalten wurden, wurden in ungefähr 200 l 30 mM Phosphatpuffer mit pH 7 resuspendiert und mit 800 L Phosphatpuffer vermischt, in dem bei erhöhter Temperatur 5,4 kg Adenin (Endkonzentration 40 mM) und 8,9 kg Ara-U (Endkonzentration 40 mM) aufgelöst worden war. Die Mischung wurde für 20 h unter Bewegung bei 60°C gehalten, mit heißem H₂O auf ungefähr 3000 l verdünnt und auf einer Membran einer Diafiltration unterzogen, wodurch ungefähr 5000 l an Ultrafiltrat gesammelt wurde. Die durch RP-HPLC bestimmte Bioübertragungsausbeute betrug ungefähr 55%. Der die Zellpaste enthaltende Rest wird für eine anschließende Reaktion verwendet. Das Ultrafiltrat wurde auf ungefähr 1000 l konzentriert und abgekühlt, um das Präzipitat zu sammeln, das durch Ara-A aufgebaut war, welches mit nicht reagiertem Adenin verunreinigt war (ungefähr 30 g Adenin/100 g Ara-A). 5 kg Ara-A (Gesamtausbeute ungefähr 46%) mit einem Reinheitsgrad von mehr als 99,5% wurden schließlich nach Kristallisation mit H₂O erhalten.
5 kg nasser Zellpaste oder das entsprechende rohe oder gereinigte Extrakt, was durch Fermentierung des Stammes MG1655/pGM716 oder des Stammes DH5α/pGM716 erhalten wurde, wurden in ungefähr 20 l 30 mM Phosphatpuffer bei pH 7 resuspendiert und mit 980 l Phosphatpuffer, in dem bei erhöhter Temperatur 10,1 kg Adenin (Endkonzentration ungefähr 74,6 mM) und 18,3 kg Ara-U (Endkonzentration ungefähr 74,6 mM) aufgelöst worden war, vermischt. Die Mischung wurde für 4 h unter Bewegung bei 60°C gehalten, um eine Bioübertragungsausbeute von ungefähr 70% zu erhalten. Die Zellpaste wurde wiedergewonnen, um wiederum in nachfolgenden Reaktionen durch Auflösung bei erhöhter Temperatur und Diafiltration gemäß der oben beschriebenen Prozedur wieder verwendet zu werden. Das Ultrafiltrat wurde auf ein Volumen von ungefähr 1000 l konzent riert, abgekühlt, um das durch Ara-A gebildete Präzipitat zu sammeln, welches anschließend aus Wasser kristallisiert wurde, um ungefähr 14 kg Ara-A mit einem Reinheitsgrad von mehr als 99,5% zu erhalten. Gemäß einer alternativen Prozedur, bei der Zellen nicht wieder gewonnen wurden und der Diafiltrationsschritt weggelassen wurde, wurde die Mischung am Ende der Reaktion auf ungefähr 90°C erwärmt und bei erhöhter Temperatur filtriert, um die Zellen zu entfernen, und das Filtrat wurde zum Präzipitieren von mit nicht reagiertem Adenin verunreinigtem Ara-A gekühlt (ungefähr 20 g Adenin/100 g Ara-A). 14 kg Ara-A (Gesamtausbeute 65%) mit einem Reinheitsgrad von mehr als 99,5% wurden schließlich nach Kristallisation aus der Reaktion von 1000 l erhalten.
SEQUENZLISTE

Claims

Transformierte E.coli-Wirtszellen, die Uridinphosphorylase- und Purinnucleosidphosphorylase-Enzymaktivitäten aufweisen, die 120–1.000 mal größer sind als bei den entsprechenden nicht-transformierten Zellen, wobei die transformierten E.coli-Wirtszellen einen rekombinanten Plasmid-Expressionsvektor enthalten, der umfaßt: a) mindestens eine Gensequenz eines mesophilen Bakteriums, die für ein Polypeptid kodiert, welches Uridinphosphorylase-Enzymaktivität aufweist, und mindestens eine Gensequenz eines mesophilen Bakteriums, die für ein Polypeptid kodiert, das eine Purinnucleosidphosphorylase-Enzymaktivität aufweist; und b) mindestens eine Gensequenz, die für Tetracyclin-, Kanamycin- und/oder Ampicillin-Resistenz kodiert.
Wirtszellen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine Gensequenz eines mesophilen Bakteriums, die für ein Polypeptid mit Uridinphosphorylase-Enzymaktivität kodiert, die mindestens eine Gensequenz eines mesophilen Bakteriums, die für ein Polypeptid mit Purinnucleosidphosphoylase-Enzymaktivität kodiert, und die Gensequenz, die für Tetracyclin- und/oder Kanamycin-Resistenz kodiert, in das Plasmid pUC18 kloniert sind.
Wirtszellen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das mesophile Bakterium E.coli ist.
Wirtszellen gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz, die für ein Polypeptid mit Uridinphosphorylase-Enzymaktivität kodiert, die Sequenz udp ist.
Wirtszellen gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz die EMBL-Sequenz mit der Zugangsnummer X15689 ist, wie sie in der SEQ ID NO:1 eingeschlossen ist.
Wirtszellen gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz, die für ein Polypeptid mit Purinnucleosidphosphorylase-Enzymaktivität kodiert, die Sequenz deoD ist.
Wirtszellen gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz die EMBL-Sequenz mit der Zugangsnummer M60917 ist, wie sie in SEQ ID NO:3 eingeschlossen ist.
Wirtszellen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz, die für Tetracyclin-Resistenz kodiert, das Tet-Gen von pBR322 ist.
Wirtszellen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz, die für Kanamycin-Resistenz kodiert, das kan-Gen von pET29c ist.
Wirtszellen gemäß Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Gensequenz, die für ein Polypeptid mit Uridinphosphorylase-Enzymaktivität kodiert, und die Gensequenz, die für ein Polypeptid mit Purinnucleosid-Phosphorylase-Enzymaktivität kodiert, miteinander verbunden sind, um ein Fusionsprotein zu exprimieren, wobei die Enzyme Uridinphosphorylase und Purinnucleosidphosphorylase durch einen Polypeptidlinker von mehr als einer Aminosäureeinheit miteinander verbunden sind.
Wirtszellen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasmidvektor ausgewählt ist unter denen, die die Sequenz SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 14 und SEQ ID NO 15 ausgewählt ist.
Wirtszellen gemäß den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie Zellen des Stamms K12 darstellen.
Verwendung von Wirtszellen gemäß Ansprüchen 1 bis 12 bei der Herstellung von Polypeptiden mit Uridinphosphorylase-Enzymaktivität und/oder Purinnucleosidphosphorylase-Enzymaktivität.
Verwendung von Wirtszellen gemäß Ansprüchen 1–12 als Katalysatoren von Transglycosilierungsreaktionen zwischen einem Donornucleosid und einer Akzeptorbase.
Verwendung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Akteptorbase eine Purin- und/oder Pyrimidinbase ist.
Verwendung gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Purin- und/oder Pyrimidinbasen ausgewählt sind aus natürlichen oder substituierten Pyrimidin- und Purinbasen; Purinbasen, die bei den 1-, 2- und/oder 6-Positionen des Purinrings substituiert sind; Pyrimidinbasen, die bei den 3- und/oder 5-Positionen des Pyrimidinrings substituiert sind; Purin, 2-Azapurin, 8-Azapurin, 1-Deazapurin (Imidazopyridin), 3-Deazapurin, 7-Deazapurin.
Verwendung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Akzeptorbasen durch heterozyklische Verbindungen, die min destens ein Stickstoffatom enthalten, aufgebaut sind, wie z.B. Imidazole, Triazole und Pyrazole.
Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Donornucleosid ausgewählt ist aus natürlichen und/oder modifizierten Nucleosiden, die D-Ribose und 2'-Deoxyribose enthalten; Nucleosiden, die eine in den 2', 3' und/oder 5'-Positionen modifizierte Ribosegruppe enthalten; Nucleoside, bei denen der Zucker β-D-Arabinose, α-L-Xylose, 3'-Deoxyribose, 3',5'-Dideoxyribose, 2',3'-Dideoxyribose, 5'-Deoxyribose, 2',5'-Dideoxyribose, 2'-Amino-2'-Deoxyribose, 3'-Amino-3'-deoxyribose, 2'-Fluoro-2'-deoxyribose ist.
Verwendung gemäß Anspruch 14 bei der Herstellung von Nucleosid-enthaltenden, heterozyklischen Systemen mit durch ein oder mehrere Stickstoffatom(e) substituierten Purin- und/oder Pyrimidinbasen.
Verwendung gemäß Anspruch 14 bei der Herstellung von α-Pentose-1-Phosphat-Zuckern mittels Phosphorylyse-Reaktionen.
Verwendung gemäß Anspruch 14 bei der Herstellung von Nukleosiden.
Verwendung von groben oder gereinigten Extrakten von Wirtszellen gemäß Anspruch 10 als Katalysatoren von Transglycosilierreaktionen zwischen einem Donornucleosid und einer Akzeptorbase.