ES2235638B1

ES2235638B1 - Nuevo vector retroviral de alto titulo y metodos de transduccion.

Info

Publication number: ES2235638B1
Application number: ES200302976A
Authority: ES
Inventors: Manuel Angel Gonzalez De La Peña
Original assignee: Cellerix SA
Current assignee: Tigenix SA
Priority date: 2003-12-17
Filing date: 2003-12-17
Publication date: 2006-10-16
Anticipated expiration: 2023-12-17
Also published as: WO2005061721A1; ES2235638A1

Abstract

La presente invención se refiere a nuevos vectores retrovirales capaces de producir partículas retrovirales infectivas no replicativas de alto título. Dichas partículas retrovirales permiten la transducción retroviral de células primarias y líneas celulares difíciles de transducir hasta el momento gracias a la configuración optimizada del vector. Adicionalmente, se incluyen en la invención métodos para la producción estable o transitoria de partículas retrovirales así como aplicaciones de éstos.

Description

Nuevo vector retroviral de alto título y métodos de transducción.

La presente invención se refiere a nuevos vectores retrovirales capaces de producir partículas retrovirales infectivas no replicativas de alto título y métodos para la utilización de dichas partículas en la transferencia de construcciones génicas de interés.

Antecedentes de la invención

Los retrovirus son un grupo de virus caracterizados por poseer como material genético ARN+ de cadena sencilla. Todos los retrovirus contienen en su genoma tres regiones codificantes principales: Gag, que dirige la síntesis de las proteínas estructurales de la partícula viral (matriz, cápsida y nucleocápsida), Pro-Pol, que determina la síntesis de las proteínas con actividad enzimática (proteasa, transcriptasa reversa e integrasa), y Env, que codifica las glicoproteínas de envuelta (superficie y transmembrana) (Duesberg et al., 1970). El ciclo de los retrovirus se inicia con la interacción de las glicoproteínas de la envuelta del virión con receptores celulares específicos. Esta interacción conduce a la entrada de la partícula viral dentro del citoplasma celular. A su entrada en el citoplasma de la célula, este ARN genómico viral se convierte en ADN de doble cadena mediante el primero de los procesos fundamentales de su ciclo biológico: la transcripción reversa. Merced a este proceso, el ARN viral, que en su extremo 3' contiene la región denominada U3 (región única 3), da como resultado un ADN en que U3 se duplica y queda representada a ambos lados de la cadena, lo que permite la transcripción del provirus integrado, ya que U3 actúa como promotor. Un fenómeno análogo ocurre con la secuencia U5 (región única 5), que se localiza en el extremo 5' del ARN genómico retroviral y contiene la secuencia terminadora de la transcripción de éste. Estas duplicaciones de U5 y U3 durante la transcripción reversa, se deben a la existencia de secuencias tales como el tracto de polipurinas (PPT, inmediatamente anterior al extremo 5' de U3), el sitio de unión del primer (PBS, inmediatamente posterior al extremo 3' de U5) y regiones repetidas (denominadas R) situadas a ambos lados del genoma, que dirigen la síntesis de las cadenas del ADN proviral (Baltimore, 1970; Temin et al., 1970; Coffin et al., 1997). Una vez terminada la transcripción reversa, el ADN copia recién formado es objeto del segundo de los procesos fundamentales del ciclo retroviral: la integración, merced a la que el ADN viral queda inserto en lugares no predeterminados de los cromosomas celulares, constituyendo el llamado provirus. Este ADN viral se comporta como un locus celular en el transcurso de las divisiones celulares y es el que codifica los materiales necesarios para la formación de las nuevas partículas virales, que constituyen la progenie de la partícula viral que originó el proceso.

En los extremos de las regiones LTR (Siglas en inglés de Repeticiones Terminales Largas, formadas por la sucesión de las secuencias U3-R-U5) existen sitios clave para la integración del ADN proviral en la célula diana. Adyacentes a las regiones LTR, tal como se ha descrito anteriormente, se sitúan secuencias necesarias para la transcripción reversa del genoma viral, el PBS y el PPT respectivamente, además de una secuencia necesaria para la eficiente encapsidación del ARN viral en partículas retrovirales (la secuencia \Psi). La región de 800 nucleótidos del genoma del virus Moloney de la leucemia murina (MoLV) que comienza justo a continuación del SD (Sitio donador de splicing) y se extiende dentro de la región que codifica la poliproteína gag es suficiente para dirigir el eficiente empaquetamiento de un tránscrito heterólogo (Adam et al., 1988; Dornburg et al., 1988).

El procesamiento del ARNm (ARN mensajero) viral se lleva a cabo desde el SD, situado a continuación del PBS, hasta el sitio aceptor de splicing (SA), este último, incluido dentro de la región codificante de la poliproteína pol.

Los vectores retrovirales y sus diversas aplicaciones han sido descritas por numerosos autores, (Mann et al., 1983; Cone et al., 1984; Miller, 1990), y U.S. Patent Nos. 4,405,712; 4,861,719; 4,980,289 y solicitudes PCT Nos. WO 89/02,468; WO 89/05,349 y WO 90/02,806. De estas publicaciones se infiere que lo habitual con relación a este tipo de vectores es sustituir una porción del ARN retroviral por un gen heterólogo de interés, manteniendo intactas las secuencias de LTR, \Psi, PBS y PPT, de tal manera que cuando la partícula retroviral recombinante introduce su ARN dentro de la célula diana durante el proceso infectivo, el gen heterólogo de interés también es introducido dentro de la célula, y de esta forma es incorporado dentro del genoma celular en forma de ADN tal y como si fuese parte del genoma celular. De esta forma, la presencia del gen de interés dentro del genoma de la célula hospedadora conlleva la expresión de la proteína heteróloga en dicha célula.

Los vectores retrovirales como método para introducir genes heterólogos en las células diana han sido utilizados ampliamente por las siguientes razones: (1) Por su amplio tropismo celular y por su elevada eficiencia a la hora de incorporar material genético en el núcleo de células diana replicativas; (2) Por los relativamente altos niveles de expresión génica; (3) Porque el tipo de expresión génica que producen es estable debido a la integración del genoma viral dentro del genoma celular; (4) Porque la infección retroviral per se no produce efectos tóxicos en las células infectadas; (5) Porque las partículas retrovirales no suelen inducir respuestas inmunes significativas; (6) Por la capacidad potencial que estos vectores poseen para regular su expresión de manera dependiente de tejido y/o diana celular, así como para regular su expresión en el tiempo; (7) Por el conocimiento que ya se tiene de este tipo de vectores y de sus diversas aplicaciones (Romano et al., 2000).

Aun así, una desventaja que presentan los vectores retrovirales es que sólo infectan células replicativas, existiendo serias dificultades a la hora de infectar aquellas células caracterizadas como no replicativas o quiescentes (Roe et al., 1993). Además, existen diversos tipos celulares que tradicionalmente han sido difíciles de transducir mediante vectores retrovirales aun cuando se han estimulado para que entrasen en ciclo replicativo, algunos ejemplos incluyen linfocitos T, linfocitos B, células monocíticas y células dendríticas. Esto es particularmente frecuente para células primarias, entre las que se incluyen las células madre. Para este tipo de células anteriormente enumeradas, expertos en la materia han sugerido otros métodos de transferencia génica entre los que se incluyen la administración directa de ADN purificado como método para incorporar material genético dentro de las células diana.

Para tratar de mejorar la eficacia de los vectores retrovirales, se han sugerido métodos enfocados hacia la inducción de la replicación de las células diana o hacia el incremento de la eficiencia de replicación de dichas células, para permitir la infección retroviral de las células diana. En el caso de células T, existen diversos métodos de estimulación no específica in vivo que son bastante eficientes para inducir su replicación (tal como IL-2, mitógenos, y anticuerpos anti-CD3 o anti-CD28). No obstante, existen dificultades a la hora de obtener una transducción eficiente de linfocitos T utilizando métodos de estimulación que sean compatibles con usos clínicos y comerciales, ya que frecuentemente alteran la proporción relativa de las diferentes subpoblaciones celulares presentes en el riego sanguíneo (Movassagh et al., 2000). Los vectores retrovirales de la presente invención permiten la transducción eficiente de células primarias estimuladas con métodos compatibles con usos clínicos de dichas células, aunque dichos métodos no produzcan una estimulación tan potente como otros más inespecíficos e incompatibles con la clínica.

Tal y como hemos mencionado anteriormente, la realización de una transferencia génica retroviral eficiente en células primarias tales como linfocitos T o células madre no es algo trivial. Los métodos utilizados actualmente para la transducción retroviral de dichas células presentan un número de limitaciones prácticas, entre las cuales una de las más importantes radica en los bajos títulos retrovirales obtenidos con la mayor parte de los vectores retrovirales disponibles, títulos que están normalmente en el rango de 1x10^{4} a 1x10^{6} unidades infectivas por mililitro (UI/ml).

Los métodos de producción de partículas retrovirales por transfección estable rinden bajos títulos, y se suele requerir incluso el cocultivo de las líneas estables productoras de las partículas retrovirales con la célula diana. Además, con frecuencia ha sido necesario adicionar grandes volúmenes de la preparación que contiene los vectores retrovirales a las células que van a ser transducidas para lograr una frecuencia de transducción útil. El método de producción de partículas retrovirales infectivas por transfección transitoria de la célula empaquetadora es mucho más eficiente que las líneas empaquetadoras estables, pero sólo algunos vectores retrovirales como los de la presente invención están diseñados para poder ser utilizados mediante transfección transitoria.

Adicionalmente, muchos de los vectores retrovirales más frecuentemente empleados codifican genes que confieren resistencia a ciertos antibióticos a las células que los expresan. Esta selección contribuye a compensar una baja eficiencia de transducción retroviral, pero a la vez puede tener ciertos efectos asociados no deseables. Trabajos previos indican que el cultivo prolongado in vitro de linfocitos humanos durante las más de dos semanas que exige la selección por antibióticos induce un empobrecimiento del repertorio inmune de dichas células. Este efecto es independiente del proceso de infección retroviral (Ferrand et al., 2000). La presión selectiva inducida por la selección con antibióticos puede inducir reorganizaciones estructurales en el vector integrado y/o el silenciamiento del gen de interés (Bandyopadhyay et al., 1984; Breuer et al., 1993; Schott et al., 1996). Además, algunos de los productos derivados de los genes de resistencia a antibióticos muestran una capacidad inmunogénica en estudios clínicos que afecta a la supervivencia de las células utilizadas como agente terapéutico (Riddell et al., 1996). Los vectores retrovirales de alto título de la presente invención permiten infectar células primarias con una eficiencia que hace innecesaria la selección subsiguiente con antibióticos. Además, su diseño permite albergar otro tipo de genes marcadores que impliquen procesos de selección de las células infectadas más rápidos que la selección por resistencia a antibióticos.

Es un objeto de la presente invención proporcionar nuevos vectores retrovirales derivados del virus Moloney de la leucemia murina MoMLV con capacidad para producir sobrenadante retroviral de alto título constituido por partículas retrovirales infectivas y deficientes en replicación y métodos para la utilización de dichos sobrenadantes retrovirales en la transferencia génica a células resistentes a técnicas estándar de transducción, tal y como son linfocitos T, células madre o cualquier otro tipo de líneas celulares o células primarias. Estas células transducidas pueden ser utilizadas en investigación o ser administradas a pacientes mediante técnicas conocidas por el experto medio en la materia.

Breve descripción de la invención

Un primer aspecto de la invención consiste en proporcionar nuevos vectores retrovirales derivados de MoMLV deficientes en replicación que comprenden un conjunto específico de secuencias con una disposición optimizada para la producción de una partícula retroviral infectiva pero deficiente en replicación, que confiere a dichos vectores la capacidad de producir sobrenadantes retrovirales de alto título para la transducción retroviral de células y líneas celulares difíciles de transducir hasta el momento.

Un segundo aspecto de la invención consiste en proporcionar células hospedadoras transfectadas, transformadas y/o infectadas con los vectores retrovirales de la presente invención.

Un tercer aspecto de la presente invención consiste en proporcionar métodos para la producción estable o transitoria de partículas retrovirales infectivas y para la infección de células diana con dichas partículas retrovirales.

Un cuarto aspecto de la presente invención consiste en la aplicación de los vectores retrovirales de la presente invención para la producción de animales transgénicos mediante la infección de células madre embrionarias con dichas partículas retrovirales, para terapia génica, producción de librerías retrovirales y expresión y/o sobreexpresión de proteínas o ARN.

Otros aspectos de la presente invención resultarán evidentes para un experto en la materia a la vista de la descripción de la invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la estructura del genoma proviral de pRV. MCS y MCS2, sitios de policlonaje; SD, sitio donador de splicing; SA, sitio aceptor de splicing; \Psi^{+}, señal de empaquetamiento extendida de MoMLV; CMV, promotor temprano de citomegalovirus; U3, R y U5, elementos del LTR de MoMLV y PBS, sitio de unión del primer. Los sitios de restricción indicados son únicos dentro del plásmido pRV.

Descripción detallada de la invención

En un primer aspecto, la invención proporciona nuevos vectores retrovirales derivados de MoMLV caracterizados porque consisten en un conjunto específico de secuencias con una disposición optimizada para la producción de una partícula retroviral infectiva pero deficiente en replicación, que confiere a dichos vectores la capacidad de producir sobrenadantes retrovirales de alto título para la transducción retroviral de células y líneas celulares dificiles de transducir hasta el momento. Estos vectores comprenden el plásmido retroviral pRV (SEQ ID NO. 1), cuya construcción se ilustra en el ejemplo 1 de la presente invención, que incluye secuencias, derivadas de MoMLV o heterólogas, optimizadas para la transcripción, la encapsidación y retrotranscripción del ARN genómico retroviral, para el correcto procesado (splicing) del ARNm, para la integración del ADN proviral en el genoma de la célula diana y para la correcta traducción del ARNm y expresión de genes heterólogos de interés en las células diana de las partículas retrovirales producidas a partir del vector pRV y otros derivados del mismo. La figura 1 muestra la estructura del ADN proviral de pRV. La presente invención también incluye la hebra complementaria de la SEQ ID NO. 1 y secuencias de ADN que hibridan bajo condiciones de alta astringencia con la SEQ ID NO. 1 o su hebra complementaria.

Los ácidos nucleicos con identidad de secuencia o un alto grado de homología pueden ser detectados por hibridación bajo condiciones de alta astringencia, por ejemplo, a 50ºC o más en solución SSC 0,1x (cloruro sódico 15 mM/citrato sódico 1,5 mM). Los ácidos nucleicos que tengan una región de alta homología o identidad con las secuencias descritas en la presente invención, p.ej. variantes alélicas, o versiones alteradas por ingeniería genética, etc, se unen a las secuencias descritas en la invención bajo condiciones de alta astringencia. Son conocidas otras condiciones de alta astringencia en el estado de la técnica que también podrían ser usadas para identificar ácidos nucleicos que conserven un alto grado de homología con las secuencias descritas.

Las regiones de MoMLV que codifican env y pol han sido completamente eliminadas del vector retroviral derivado de MoMLV deficiente en replicación de la presente invención, y la región que codifica gag ha sido eliminada parcialmente. La región de gag que no se ha eliminado forma parte de la señal empaquetadora extendida, que comprende las posiciones 215-1038 del virus MoMLV. La eliminación de todas estas secuencias tiene por objeto la reducción al máximo de secuencias virales que por recombinación homóloga puedan originar partículas retrovirales competentes para replicación. Además, la eliminación de estas secuencias reduce el tamaño del genoma proviral del vector de la presente invención hasta 2,5 kb, lo que permite clonar insertos de hasta 7,0 kb.

Los vectores retrovirales que sólo conservan la señal de empaquetamiento mínima, (posiciones 215-563 de
MoMLV), producen títulos retrovirales de 10 a 100 veces inferiores a aquellos que poseen la señal de empaquetamiento extendida tal y como sucede en el vector de la presente invención, que incluye 455 pb procedentes de la región codificante de gag. (Naviaux et al., 1992)

El vector retroviral derivado de MoMLV deficiente en replicación de la presente invención presenta la región U3 de MoMLV 5' LTR sustituida por el promotor temprano de Citomegalovirus (CMV). La producción del ARN genómico retroviral, al estar bajo el control del promotor CMV, permite aumentar sensiblemente el número de copias de genoma retroviral en el interior de la línea empaquetadora, con lo que los títulos retrovirales de este vector son en torno a un orden de magnitud superiores a los de aquellos que conservan el LTR 5' nativo de MoMLV. En otra realización preferida de la invención, se proporcionan otros promotores heterólogos en la misma posición que la del promotor de CMV, entre los que se incluye pero no se limitan al promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV).

El vector retroviral derivado de MoMLV deficiente en replicación de la presente invención incluye sitios donador y aceptor de splicing que favorecen la exportación al citoplasma del ARN subgenómico, lo que potencia la expresión en la célula diana de los genes heterólogos incluidos en el vector.

El vector retroviral de MoMLV deficiente en replicación de la presente invención incluye un sitio de policlonaje (MCS2) que precede al sitio aceptor de splicing que incluye, pero no se limita a, los siguientes sitios de restricción: Bgl II, Hpa I, Sph I. Este sitio de policlonaje MCS 2 permite la inclusión de secuencias heterólogas (ej. secuencias reguladoras en cis o promotores internos).

El vector retroviral de MoMLV deficiente en replicación de la presente invención incluye como sitio aceptor de splicing (SA), una secuencia sintética basada en una secuencia consenso parcialmente degenerada del virus Spleen focus-forming (SFFV), que no incluye fases de lectura abiertas (ORF) o inicios de traducción (ATG) aberrantes, procedentes del extremo 3' del gen Pol de MoMLV. Esta secuencia sintética sólo conserva 26 pares de bases homólogos al gen Pol de MoMLV. Muchos de los vectores retrovirales que contienen sitios SA incluyen marcos abiertos de lectura (ORF) que pueden interferir con la correcta expresión de los genes heterólogos codificados por el vector retroviral. La secuencia u oligonucleótido sintético incluido en el vector retroviral de la presente invención para actuar como sitio SA, al no contener ORFs, elimina la ulterior posibilidad de expresión de péptidos aberrantes, anormalmente elongados, que puedan interferir con la correcta expresión de los genes heterólogos incluidos en el ADN proviral. Adicionalmente, se disminuye el tamaño del vector en aproximadamente 350 pares de bases y se eliminan secuencias virales (del gen Pol) que pueden originar eventos de recombinación capaces de generar virus competentes para replicación.

Adicionalmente, el vector retroviral de la presente invención posee un sitio de policlonaje denominado MCS situado a continuación del sitio SA, que incluye, pero no se limita, a los siguientes sitios de restricción: Bam HI - Xho I - Eco RI - Swa I - Sac II - Cla I - Not I - Sal I. La presencia de este MCS permite la inclusión en el vector retroviral de todo tipo de secuencias heterólogas (ej. genes aplicados en terapia génica o investigación, marcadores de selección tales como gfp, \DeltaNGFR, \DeltaGHR, Neo, LacZ y/o \beta-Geo [la mayoría de estos marcadores se describirán en más detalle en los ejemplos], promotores u otras secuencias reguladoras de la expresión o sitios internos de entrada de ribosomas, IRES). El sitio MCS permite introducir una sola secuencia (Ejemplo 2) o varias simultáneamente en la misma construcción (Ejemplos 3 y 4). La inclusión de uno o dos TRES en el MCS de pRV permite realizar construcciones bi- o tricistrónicas para la expresión simultánea de dos o tres genes en la célula donde dichas construcciones sean introducidas, ya sea por transfección o por transducción retroviral (Ejemplo 4). Las secuencias heterólogas se pueden introducir indistintamente en el sitio de policlonaje MCS, MCS 2 o en ambos simultáneamente.

En otra realización de la invención se incluye el método para la obtención de partículas virales infectivas deficientes en replicación mediante la transfección en líneas celulares empaquetadoras del vector pRV (SEQ ID NO 1 o su hebra complementaria o secuencias de ADN que hibridan con éstas bajo condiciones de alta exigencia) o construcciones retrovirales directamente derivadas de dicho vector retroviral. Estas líneas empaquetadoras pueden o no expresar de manera estable los genes necesarios (gag, poi, env) para la formación de partículas retrovirales que contengan los vectores retrovirales de la presente invención. En el caso de que la célula empaquetadora no exprese dichos genes auxiliares, el vector retroviral se cotransfecta con los mismos en dicha célula (Ejemplo 5). La línea empaquetadora transfectada tal como se ha descrito anteriormente, se cultiva en unas condiciones y un medio de cultivo que favorezcan la producción y liberación a dicho medio de partículas virales infectivas que contengan los vectores retrovirales descritos en la presente invención. Los títulos obtenidos a partir de los vectores retrovirales directamente derivados a partir de pRV (descritos en la presente invención) son muy altos, con unos valores que no bajan en ningún caso de 1x10^{6} UI/ml, y que llegan incluso a 1x10^{8} UI/ml (Tabla I). La importancia de estos títulos retrovirales queda patente cuando se comparan con los producidos a partir de otros vectores retrovirales (Tabla III). Sólo son comparables con los vectores descritos en la presente invención los títulos de vectores que producen un mayor número de copias de su ADN proviral en la célula empaquetadora mediante la inclusión de secuencias que confieren a dicho plásmido retroviral una capacidad autorreplicativa en la célula empaquetadora. Los altos títulos retrovirales producidos por los vectores descritos en la presente invención facilitan la transducción retroviral de líneas celulares y células primarias con una eficiencia superior a la obtenida por los medios más usuales de transfección (Tabla II).

En otra realización de la invención se incluye la secuencia de ARN derivada del vector retroviral de la presente invención, la secuencia de ADN del provirus retroviral producido en la célula diana durante el proceso de transcripción reversa del ARN derivado del vector retroviral y el ARNm producido desde dicho provirus retroviral.

En otra realización más de la invención se incluyen partículas retrovirales obtenidas mediante la transfección de células hospedadoras (comúnmente denominadas células empaquetadoras) con el vector retroviral de la presente invención o ARN derivado de dicho vector, células hospedadoras transformadas o transfectadas con dichos vectores retrovirales y células hospedadoras infectadas o transducidas con las partículas retrovirales obtenidas a partir de los vectores retrovirales descritos en la presente invención.

Otro aspecto de la invención se relaciona con un método para introducir secuencias nucleotídicas heterólogas u homólogas en células diana que comprende la infección de las células con las partículas retrovirales obtenidas a partir de los vectores retrovirales descritos en la presente invención.

Otros usos preferidos de estos vectores retrovirales consisten en la producción de animales transgénicos mediante la transducción de células madre embrionarias con partículas retrovirales producidas a partir de los vectores retrovirales descritos en la presente invención, la producción y escrutinio de librerías retrovirales construidas en estos vectores retrovirales, para la preparación de una composición farmacéutica aplicable para uso en terapia génica y aquellos vehículos farmacéuticamente compatibles con dicha composición, para el clonaje y selección de genes y para la expresión y/o sobreexpresión de proteínas o ARN.

En otro aspecto de la invención se incluye el uso de los vectores retrovirales descritos en la presente invención para la producción y/o purificación de péptidos o proteínas heterólogas cuyos genes son clonados en alguna posición del sitio de policlonaje MCS descrito en la figura 1 y en el ejemplo 1 de la presente invención. Las proteínas se obtienen a partir de células hospedadoras transfectadas con el vector retroviral que contiene el o los genes de las proteínas heterólogas, o transducidas con las partículas infectivas producidas a partir de dichos vectores retrovirales. Las células hospedadoras se cultivan en unas condiciones que favorezcan la expresión de la proteína cuya secuencia nucleotídica ha sido donada en el MCS, de manera que la proteína producida se recoge del medio de cultivo y/o las propias células hospedadoras.

A continuación, los Ejemplos describen en mayor detalle ciertas realizaciones de la presente invención.

Ejemplos

Los siguientes Ejemplos se presentan para ilustrar, pero no limitan la presente invención:

Ejemplo 1 Construcción del vector retroviral pRV

1.1.- Construcción de pUCm. El vector pUC18 se digiere con las enzimas Aat II y Afl III y en dicho fragmento se clona un sitio de policlonaje sintético constituido por la hibridación de los oligonucleótidos con secuencias SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3. Se origina el vector denominado pUCm.

1.2.- Construcción de pUCRV-1. Se amplifica por PCR el promotor de CMV desde el vector pcDNA3, se usan los oligonucleótidos SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO 5. El producto de la PCR se clona en algún vector destinado a la recepción de productos de PCR (pCR 2.1 o pCR-Blunt, de Invitrogen o pGEM-T de Promega, p. ej.), la construcción resultante se digiere con Pme I y Sac I y el fragmento correspondiente se clona en las dianas Pme I y Sac I de pUCm. El vector resultante se denomina pUCRV-1.

1.3.- Construcción de pUCRV-2. El vector retroviral pFB se digiere con las enzimas Sac I y Bgl II, el fragmento correspondiente a la región RU5 de MoMLV y la señal de empaquetamiento extendida se clona en las correspondientes dianas Sac I y Bgl II de pUCRV-1, el vector resultante se denomina pUCRV-2.

1.4.- Construcción de pUCR V-3. El vector pUCRV-2 se digiere con las enzimas Bgl II y Bam HI. En dichas dianas se introduce el fragmento sintético constituido por la hibridación de los oligonucleótidos SEQ ID NO 6 y SEQ ID NO 7, correspondiente al sitio de policlonaje MCS2 y a la región del sitio aceptor de splicing. El vector resultante se denomina pUCRV-3.

1.5.- Construcción de pUCRV-4. El vector pUCRV-3 se digiere con las enzimas Bam HI y Sal I. En dichas dianas se introduce el fragmento sintético constituido por la hibridación de los oligonucleótidos SEQ ID NO 8 y SEQ ID NO 9, correspondiente al sitio de policlonaje MCS. El vector resultante se denomina pUCRV-4.

1.6.- Construcción de pUCRV-5. El vector pUCRV-4 se digiere con las enzimas Sal I y Nhe I. En dichas dianas se introduce el fragmento sintético constituído por la hibridación de los oligonucleótidos SEQ ID NO 10 y SEQ ID NO 11, correspondiente al tracto de polipurinas y a un fragmento del LTR 3' de MoMLV. El vector resultante se denomina pUCRV-5.

1.7.- Construcción de pRV. El vector pBabePuro (Morgenstern et al, 1990) se digiere con las enzimas Nhe I y Sap I. El fragmento correspondiente al LTR 3' de MoMLV se clona en las dianas Nhe I y Sap I de pUCRV-5. La construcción resultante se denomina pRV (Figura 1, SEQ ID NO 1). La localización de las secuencias más relevantes de pRV es la siguiente:

a.: Promotor temprano-intermedio del citomegalovirus (CMV) humano: posiciones 23-604 de la SEQ ID NO 1

b.: Región RU5 del LTR 5': posiciones 641-785 de la SEQ ID NO 1

c.: Sitio de unión del primer (PBS): posiciones 786-803 de la SEQ ID NO 1

d.: Sitio donador de splicing: posiciones 846-847 de la SEQ ID NO 1

e.: Señal de empaquetamiento extendida: posiciones 855-1700 de la SEQ ID NO 1

f.: Sitio de policlonaje 2 (MCS 2): posiciones 1703-1726 de la SEQ ID NO 1

g.: Región del sitio aceptor de splicing: posiciones 1727-1783 de la SEQ ID NO 1

h.: Sitio aceptor de splicing: posiciones 1780-1781 de la SEQ ID NO 1

i.: Sitio de policlonaje (MCS): posiciones 1784-1861 de la SEQ ID NO 1

j.: Tracto de polipurinas: posiciones 1862-1903 de la SEQ ID NO 1

k.: LTR 3': posiciones 1904-2497 de la SEQ ID NO 1.

Ejemplo 2 Expresión de un gen heterólogo clonado en el sitio de policlonaje (MCS) de pRV

2.1.- Construcción de pRV-gfp. Digestión del vector pEGFP-N1 con las enzimas Xho I y Not I, el fragmento resultante, gfp, se clona en pRV cortado con Xho I y Not I. La construcción originada se denomina pRV-gfp.

Ejemplo 3 Construcción de vectores retrovirales con un cassette de traducción constituido por una secuencia de entrada interna del ribosoma (IRES) y un gen heterólogo cualquiera

3.1.- Construcción de pRV-IRES-gfp. El vector pIRES-2-EGFP se corta con Bam HI, se trata con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa de E. Coli y se ligan los extremos romos para eliminar la diana Bam HI del vector. El vector así tratado se corta con Xho I y Not I, y el fragmento IRES-gfp se clona en pBacPAK8 digerido con Xho I y Not I. La construcción resultante se denomina pB-IRES-gfp.

pB-IRES-gfp se corta con las enzimas Sac II y Not I y se clona en pRV cortado con Sac II y Not I para obtener el vector retroviral pRV-IRES-gfp.

3.2.- Construcción de pRV IRES-\DeltaGHR (Receptor truncado de la hormona de crecimiento). Amplificación del receptor truncado de la hormona de crecimiento \DeltaGHR (Garcia-Ortiz et al., 2000) con oligonucleótidos de las siguientes características:

Oligo sense: con extremo cohesivo en el extremo 5' para la diana Ncol, seguido de los primeros 10 a 25 nucleótidos correspondientes a la secuencia de \DeltaGHR. El extremo correspondiente a Nco I contiene la secuencia de la metionina inicial y el primer nucleótido del primer codón de \DeltaGHR (CATGG).

Oligo antisense: con extremo cohesivo en su extremo 5' para la diana Not I, seguido de los primeros 10 a 25 nucleótidos correspondientes a la secuencia de \DeltaGHR.

El producto de la PCR se clona en algún vector destinado a la recepción de productos de PCR (pCR 2.1 o pCR-Blunt, de Invitrogen o pGEM-T de Promega, p. ej.), la construcción resultante se digiere con Nco I. y Not I y el fragmento correspondiente a \DeltaGHR se clona en pB-IRES-gfp (Ejemplo 3.1) en los correspondientes sitios Nco I y Not I.

La construcción pB-IRES-\DeltaGHR se corta con Sac II y Not I y el fragmento IRES-\DeltaGHR se clona en pRV cortado con Sac II y Not I. La construcción originada se denomina pRV-IRES-\DeltaGHR.

Este método es aplicable para la construcción de vectores análogos, pRV-IRES-Gen, siempre que la primera base del primer codón tras la metionina inicial del gen sea una G (guanina).

3.3.- Construcción de pRV-IRES-Neo. Amplificación de Neo por PCR a partir del plásmido pcDNA3.1

Oligos utilizados:

Oligo sense: en el extremo 5' tiene una diana Bsa I (GGTCTC) seguida de la secuencia NCATG (donde N puede ser indistintamente A, T, C o G) que contiene el extremo cohesivo de la diana Nco I, seguida de los primeros 10 a 25 nucleótidos correspondientes a la secuencia de Neo. El fragmento correspondiente a Nco 1 contiene la secuencia de la metionina inicial y el primer nucleótido del primer codón de Neo (CATGA).

Oligo antisense: con extremo cohesivo en su extremo 5' para la diana Not I, seguido de los primeros 10 a 25 nucleótidos correspondientes a la secuencia de Neo.

El producto de la PCR se clona en algún vector destinado a la recepción de productos de PCR (pCR 2.1 o pCR-Blunt, de Invitrogen o pGEM-T de Promega, p. ej.), la construcción resultante se digiere con Bsa I y Not I y el fragmento correspondiente a Neo se clona en pB-IRES-gfp en los correspondientes sitios Nco I y Not I.

La construcción pB-IRES-Neo se corta con Sac II y Not I y el fragmento IRES-Neo se clona en pRV cortado con Sac II y Not I. La construcción originada se denomina pRV-IRES-Neo.

Este método es aplicable para la construcción de vectores análogos, pRV-IRES-Gen, independientemente de que la primera base del primer codón tras la metionina inicial del gen sea una G (guanina), como por ejemplo el receptor truncado del factor de crecimiento nervioso (\DeltaNGFR), el gen de la (\beta-Galactosidasa (LacZ) o el marcador combinado \beta-Galactosidasa/Neo (\beta-Geo).

Ejemplo 4

Construcción de vectores retrovirales bicistrónicos para la expresión simultánea de dos genes heterólogos dispuestos de la siguiente forma: un gen heterólogo cualquiera precede a un cassette de traducción constituido por una secuencia de entrada interna del ribosoma (IRES), preferiblemente derivada de picornavirus, y más preferiblemente del virus de la encefalomiocarditis, y un segundo gen heterólogo cualquiera.

El conjunto se clona en el sitio de policlonaje (MCS) de pRV, utilizando para ello cualquier tipo de combinación posible de los sitios de restricción presentes en dicho sitio de policlonaje.

4.1.- Clonaje de pRV-WASp-IRES gfp. Amplificar la secuencia codificante de WASp (Wiscott Aldrich Sindrome Protein) por PCR con oligos que dejen extremos cohesivos para BamHI y Eco RI en los extremos 5' y 3' respectivamente del ADNc de WASp. El producto de la PCR se clona en algún vector destinado a la recepción de productos de PCR (pCR 2.1 o pCR-Blunt, de Invitrogen o pGEM-T de Promega, p. ej.), la construcción resultante se digiere con Bam HI y Eco RI y el fragmento correspondiente a WASp se clona en las dianas Bam HI y Eco RI de pRV-IRES-gfp, dando lugar a la construcción pRV-WASp-IRES-gfp.

Ejemplo 5 Generación y titulación de partículas retrovirales

El siguiente ejemplo ilustra la generación de partículas retrovirales infectivas y defectivas en replicación para uso en investigación, terapia génica u otros.

Para generar partículas recombinantes, construcciones tales como las citadas en los anteriores ejemplos 1 a 4 se co-transfectan, en la línea 293, o derivadas de 293, tales como 293T; con construcciones empaquetadoras que codifiquen las proteínas de los genes gag-pol y env, expresadas desde un solo vector o más preferiblemente desde dos construcciones diferentes, preferiblemente una construcción para expresar gag-pol y otra para env. La cotransfección se realiza mediante el método de precipitación con fosfato cálcico (Ref 11 DE PAT.157718). El medio de la transfección se renueva a las 8 horas. 24 horas después de la transfección se añade a las células empaquetadoras el medio para la recogida del sobrenadante retroviral. 48 horas después de la transfección se recoge el sobrenadante con las partículas retrovirales. Este sobrenadante se filtra con un filtro de baja retención proteica y un tamaño de poro de 0,45 \mum. El sobrenadante puede usarse fresco para la transducción retroviral o guardarse congelado a -80ºC.

Para titular el sobrenadante retroviral se emplearon distintos procedimientos según la naturaleza del gen de selección codificado por el vector retroviral.

5.1.- Vectores retrovirales que codifican marcadores seleccionables por citometría (p. ej. GFP, \DeltaNGFR, \DeltaGHR). 24 horas antes de la infección se plaquean 1,5x10^{5} células NIH 3T3 en DMEM completo, por pocillo de una placa de 6 pocillos (p6). En el momento de la titulación contamos las células de un pocillo, típicamente hay en tomo a 3x10^{5} células por pocillo. Para la titulación, se prepara DMEM completo con 8 \mug/ml de polibreno. Se pone 1 ml de medio de infección por pocillo de p6 y un volúmen adecuado de sobrenadante para no saturar el ensayo. Dicho volúmen, en el caso de sobrenadantes retrovirales obtenidos en 293T por transfección transitoria de vectores tales como los descritos en los ejemplos 1 a 4, es de 1-20 \mul lo que supone una dilución 1:1000 a 1:50.

Tras 4 a 6 horas de incubación a 37ºC, se reemplaza el medio con DMEM completo fresco. Los cultivos se mantienen durante 2-3 días adicionales, hasta la cuantificación por citometría del porcentaje de células que expresan el marcador, así evitamos la obtención de resultados erróneos debidos al fenómeno de la pseudoinfección, causada por genomas retrovirales no integrados pero transcripcionalmente activos. El título se calcula como unidades infectivas por ml (UI/ml), mediante la expresión:

(% de células positivas) x (número de células en el momento de la infección/100) x (factor de dilución).

5.2.- Vectores retrovirales que codifican un gen de resistencia a antibióticos (p. ej. Neomicina). Para su titulación, se realizan diluciones seriadas (10^{-3} a 10^{-7}) del sobrenadante en DMEM completo con 8 \mug/ml de polibreno. Los sobrenadantes diluidos se añaden sobre células NIH 3T3 plaquedas 24 horas antes (1m1 sobrenadante diluido/1x10^{5} células/pocillo p6) y se incuban de 4 a 6 horas a 37ºC. Después se reemplaza el medio con DMEM completo fresco y, a las 24 h desde la transducción, se inicia la selección con 0,5 mg/ml de G418. De diez a quince días después, las colonias resistentes al antibiótico se tiñen con violeta cristal (0,2% en metanol al 20%), y finalmente se cuentan. Una colonia positiva ha de contener al menos 20 células. El título se calcula como unidades formadoras de colonias resistentes al antibiótico por ml (CFU Antib.^{R}/ml) mediante la expresión: (Nº de colonias resistentes x factor de dilución del sobrenadante).

5.3.- Vectores retrovirales que codifican el gen de la \beta-galactosidasa (LacZ). El procedimiento es análogo al del ejemplo 5.1, lo que varia es el método de detección de la expresión del gen marcador. La expresión de este marcador puede evaluarse de forma cuantitativa mediante citometría de flujo, utilizando el kit FluoReporter lacZ Flow Cytometry Kit de Molecular Probes (Cat. F-1930). También puede detectarse la expresión del gen LacZ por tinción con X-Gal, un sustrato de la \beta-galactosidasa que origina un producto azul cuando es procesado por dicha enzima, coloreando así las células donde se expresa.

Ejemplo 6 Títulos de los vectores retrovirales

La tabla I muestra ejemplos representativos de rangos de títulos retrovirales para partículas retrovirales obtenidas a partir de vectores retrovirales derivados de pRV y descritos en los ejemplos 2 a 4.

Las partículas retrovirales fueron obtenidas según el ejemplo 5 y tituladas según los ejemplos 5.1 y 5.2 dependiendo de la naturaleza del marcador de selección. Además del vector y su título, se muestra la envuelta viral con la que las respectivas partículas retrovirales se han producido en cada caso.

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TABLA I

1

La tabla muestra los rangos típicos de títulos retrovirales, obtenidos con diferentes envueltas, para diferentes vectores retrovirales directamente derivados del vector retroviral pRV descrito en la presente invención. n.d.: no determinado.

Ejemplo 7 Eficiencias de transducción retroviral

La tabla II muestra ejemplos representativos de las eficiencias de transducción que se obtienen con los vectores retrovirales derivados de pRV y descritos en los ejemplos 2 a 4. Entre los ejemplos figuran líneas celulares y células primarias, tales como linfocitos T, células madre o progenitores no diferenciados. Estos niveles de transducción se comparan, cuando el dato está disponible, con los métodos de transfección usuales más eficientes de entre los ensayados, tales como electroporación, lipocomplejos (lipofectamina) o transfección con fosfato cálcico.

TABLA II

2

La tabla muestra las eficiencias de transfección retroviral para distintas líneas celulares y células primarias transducidas con partículas retrovirales obtenidas a partir de los vectores retrovirales derivados de pRV descritos en la presente invención. Los porcentajes de transducción retroviral (estable) corresponden a los resultados de un experimento característico. En el caso de los métodos no retrovirales, los valores corresponden a los obtenidos de forma transitoria con el método de transfección más eficiente de entre los tres siguientes: electroporación, fosfato cálcico y lipoplejos (reactivo comercial). n.d., no determinado.

Ejemplo 8 Comparación entre los títulos de las series de vectores retrovirales pRV, pL, pCL y pLZR

En este ejemplo se comparan los títulos de sobrenadantes retrovirales obtenidos, según el procedimiento descrito en el ejemplo 5, a partir de vectores retrovirales derivados de pRV y descritos en los ejemplos 2 a 4, y de los vectores pLXS\DeltaN, pCLXSN y pLZR-CMV-gfp. El vector pLXS\DeltaN (Ruggieri et al., 1997) posee un LTR derivado directamente de MoMLV, que dirige la expresión del gen heterólogo X, y un promotor interno de SV40, que dirige la expresión del marcador \DeltaNGFR. Este vector carece del promotor mixto CMV-LTR, y tiene un sitio aceptor de splicing derivado de MoMLV. El vector pCLXSN (Naviaux et al., 1996), al contrario que el anterior, sí posee un LTR mixto, con un promotor CMV, sin embargo, comparte con éste la secuencia leader y, en concreto, la zona correspondiente al sitio aceptor de splicing. El vector pCLXSN tiene un marcador de selección consistente en el gen de resistencia a neomicina, su expresión es dirigida por el promotor de SV40. El vector más moderno es el pLZR-CMV-gfp (Yang et al., 1999), con un promotor mixto CMV y un diseño para la producción de partículas retrovirales de alto título basado en la presencia, en la construcción plasmídica que soporta el genoma proviral, de las secuencias EBNA-1 y OriP, origen de replicación y antígeno nuclear del virus Epstein Barr, que confieren al plásmido una capacidad autorreplicativa en la célula empaquetadora. El leader de pLZR-CMV-gfp está, sin embargo, derivado de MoMLV.

La comparación de títulos se hace entre vectores que comparten el mismo marcador de selección y que están pseudotipados con la misma envuelta, siempre que es posible. En la tabla III se muestran los resultados de esta comparación. Los vectores derivados de pRV poseen títulos sensiblemente superiores a los de vectores con diseños más antiguos, tales como pLXS\DeltaN y pCLXSN. Los títulos son comparables para pLZR-CMV-gfp y los vectores descritos en la presente invención, aunque carezcan de las secuencias autorreplicativas de los vectores de la serie pLZ.

TABLA III

3

La tabla muestra una comparativa de títulos retrovirales típicos obtenidos a partir de diferentes vectores retrovirales directamente derivados del vector retroviral pRV descritos en la presente invención, con los de otros vectores retrovirales. * Tomado de Yang et al. 1999.

Bibliografía

Abad, J. L., Serrano, F., San Roman, A. L., et al. (2002). "Single-step, multiple retroviral transduction of human T cells."J Gene Med 4(1): 27-37.

Adam, M. A. and Miller, A. D. (1988). "Identification of a signal in a murine retrovirus that is sufficient for packaging of nonretroviral RNA into virions."J Virol 62 (10): 3802-6.

Baltimore, D. (1970). "RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses."Nature 226(252): 1209-11.

Bandyopadhyay, P. K. and Temin, H. M. (1984). "Expression of complete chicken thymidine kinase gene inserted in a retrovirus vector."Mol Cell Biol 4(4): 749-54.

Breuer, B., Steuer, B. and Alonso, A. (1993). "Genomic rearrangements of retroviral vectors carrying two genes in F9 EC cells."Virus Genes 7(1): 53-65.

Coffin, J. M., Hughes, S. H. and Varmus, H. E. (1997). "Retroviruses."Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York(Plainview, New York).

Cone, R. D. and Mulligan, R. C. (1984). "High-efficiency gene transfer into mammalian cells: generation of helper-free recombinant retrovirus with broad mammalian host- range."Proc Natl Acad Sci USA 81(20): 6349-53.

Dornburg, R. and Temin, H. M. (1988). "Retroviral vector system for the study of cDNA gene formation."Mol Cell Biol 8(6): 2328-34.

Duesberg, P. H., Martin, G. S. and K., Vogt P. (1970). "Glicoprotein components of avian and murine RNA tumor viruses." Virology 41: 631-646.

Ferrand, C., Robinet, E., Contassot, E., et al. (2000). "Retrovirus-mediated gene transfer in primary T lymphocytes: influence of the transduction/selection process and of ex vivo expansion on the T cell receptor beta chain hypervariable region repertoire." Hum Gene Ther 11(8): 1151-64.

Garcia-Ortiz, M. J., Serrano, F., Abad, J. L., et al. (2000). "DeltahGHR, a novel biosafe cell surface-labeling molecule for analysis and selection of genetically transduced human cells."Hum Gene Ther 11(2): 333-46.

Mann, R., Mulligan, R. C. and Baltimore, D. (1983). "Construction of a retrovirus packaging mutant and its use to produce helper-free defective retrovirus."Cell 33(1): 153-9.

Miller, A. D. (1990). "Retrovirus packaging cells."Hum Gene Ther 1(1): 5-14.

Morgenstern J. P. (1990). "Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper free packaging cell fine." Nucleic Acids Research 18(12): 3587-3596.

Movassagh, M., Boyer, O., Burland, M. C., et al. (2000). "Retrovirus-mediated gene transfer into T cells: 95% transduction efficiency without further in vitro selection."Hum Gene Ther 11(8): 1189-200.

Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., et al. (1996). "The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses."J Virol 70(8): 5701-5.

Naviaux, R. K. and Verma, I. M. (1992). "Retroviral vectors for persistent expression in vivo."Curr Opin Biotechnol 3(5): 540-7.

Riddell, S. R., Elliott, M., Lewinsohn, D. A., et al. (1996). "T-cell mediated rejection of gene-modified HIV-specific cytotoxic T lymphocytes in HIV-infected patients."Nat Med 2(2): 216-23.

Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., et al. (1993). "Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis."Embo J 12(5): 2099-108.

Romano, G., Michell, P., Pacilio, C., et al. (2000). "Latest developments in gene transfer technology: achievements, perspectives, and controversies over therapeutic applications."Stem Cells 18(1): 19-39.

Ruggieri, L., Aiuti, A., Salomoni, M., et al. (1997). "Cell-surface marking of CD(34+)-restricted phenotypes of human hematopoietic progenitor cells by retrovirus-mediated gene transfer."Hum Gene Ther 8(13): 1611-23.

Schott, B., Iraj, E. S. and Roninson, I. B. (1996). "Effects of infection rate and selection pressure on gene expression from an internal promoter of a double gene retroviral vector."Somat Cell Mol Genet 22(4): 291-309.

Temin, H. M. and Mizutani, S. (1970). "RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus."Nature 226(252): 1211-3.

Yang, S., Delgado, R., King, S. R., et al. (1999). "Generation of retroviral vector for clinical studies using transient transfection."Hum Gene Ther 10(1): 123-32.

<110> Genetrix SL

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<120> Nuevo vector retroviral de alto título y métodos de transducción

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<130> Número de Referencia:

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<160> 11

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 4449

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Secuencia formada por la combinación de fragmentos nucleotídicos sintéticos y otros procedentes de las siguientes especies: E. Coli, MoMLV.

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<220>

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<221> promotor

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<222> (23)..(604)

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<223> Promotor temprano-intermedio de CMV

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<220>

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<221> LTR

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<222> (641)..(785)

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<223> Región RU5 del LTR 5'

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<220>

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<221> primer_bind

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<222> (786)..(803)

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<223> Sitio de unión del primer

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<220>

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<221> S_región

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<222> (846)..(847)

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<223> Sitio donador de splicing

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (855)..(1700)

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<223> Señal de empaquetamiento extendida

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1703)..(1726)

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<223> Sitio de policlonaje 2

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<220>

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<221> S_región

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<222> (1727)..(1783)

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<223> Aceptor de splicing sintético

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<220>

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<221> S_región

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<222> (1780)..(1781)

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<223> Sitio aceptor de splicing

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1784)..(1861)

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<223> Sitio de policlonaje

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1862)..(1903)

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<223> Tracto de polipurinas

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<220>

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<221> LTR

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<222> (1904)..(2497)

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<223> LTR 3'

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<400> 1

4

5

6

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<210> 2

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<211> 78

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido para la inserción de un sitio de policlonaje.

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggccggccga agtggtttaa acagagctct agatcttgga tccagtcgac agctagctgc

\hfill

60

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\hskip-.1em\dddseqskip

tcttccgctt taattaag

\hfill

78

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<210> 3

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<211> 86

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido para la inserción de un sitio de policlonaje.

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

catgcttaat taaagcggaa gagcagctag ctgtcgactg gatccaagat ctagagctct

\hfill

60

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\hskip-.1em\dddseqskip

gtttaaacca cttcggccgg ccacgt

\hfill

86

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<210> 4

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<211> 28

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido para amplificar el promotor CMV por PCR.

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

agtttaaacg ttgacattga ttattgac

\hfill

28

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<210> 5

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido para amplificar el promotor CMV por PCR.

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

agagctctgc ttatatagac ctccc

\hfill

25

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<210> 6

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<211> 81

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido para la inserción de un sitio de policlonaje y un sitio aceptor de splicing.

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

gatcttgagt taactaagca tgctagtcga ggctcgacaa agttaagtaa tagtccctct

\hfill

60

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctccaagctc acttacaggc g

\hfill

81

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<210> 7

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<211> 81

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<400> 7

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\hskip-.1em\dddseqskip

gatccgcctg taagtgagct tggagagagg gactattact taactttgtc gagcctcgac

\hfill

60

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\hskip-.1em\dddseqskip

tagcatgctt agttaactca a

\hfill

81

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<210> 8

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<211> 72

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido para la inserción de un sitio de policlonaje,

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<400> 8

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gatcctaact cgagtaggaa ttctgattta aatctccgcg gtgaatcgat taggcggccg

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60

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ccagcacagt gg

\hfill

72

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<210> 9

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<211> 72

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido para la inserción de un sitio de policlonaje.

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<400> 9

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tcgaccactg tgctggcggc cgcctaatcg attcaccgcg gagatttaaa tcagaattcc

\hfill

60

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\hskip-.1em\dddseqskip

tactcgagtt ag

\hfill

72

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<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 78

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido para la inserción de un tracto de polipurinas y primeros nucleótidos del LTR3' de MoMLV.

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<400> 10

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tcgacgataa aataaaagat tttatttagt ctccagaaaa aggggggaat gaaagacccc

\hfill

60

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acctgtaggt ttggcaag

\hfill

78

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<210> 11

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<211> 78

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<400> 11

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ctagcttgcc aaacctacag gtggggtctt tcattccccc ctttttctgg agactaaata

\hfill

60

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\hskip-.1em\dddseqskip

aaatctttta ttttatcg

\hfill

78

Claims

1. Vector retroviral derivado de MoMLV que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo formado por:

a-: La secuencia SEQ ID NO: 1 o su hebra complementaria; y

b-: Secuencias de ADN que hibridan bajo condiciones de alta astringencia con las secuencias de ADN definidas en el apartado (a).

2. Vector retroviral, según la reivindicación 1, que comprende, al menos, una secuencia heteróloga clonada en cualquiera de las dianas de restricción del sitio de policlonaje MCS.

3. Vector retroviral, según la reivindicación 1, que comprende, al menos, una secuencia heteróloga clonada en cualquiera de las dianas de restricción del sitio de policlonaje MCS2.

4. Vector retroviral, según las reivindicaciones 2-3, donde dichas secuencias heterólogas comprenden una o más copias de la secuencia de un sitio interno de entrada del ribosoma (IRES).

5. Vector retroviral, según las reivindicaciones 2-3, en el que, al menos, una de dichas secuencias heterólogas comprende un gen marcador.

6. Vector retroviral, según la reivindicación 5, en el que dicho gen marcador es seleccionado entre el grupo constituido por: gfp, \DeltaNGFR, \DeltaGHR, Neo, Lac Z, \beta-Geo.

7. La secuencia de ARN genómico retroviral del vector retroviral según las reivindicaciones 1 a 6.

8. La secuencia de ADN del provirus retroviral producido en la célula diana durante el proceso de transcripción reversa del ARN genómico retroviral según la reivindicación 7.

9. El ARNm derivado del provirus retroviral según la reivindicación 8.

10. Una partícula retroviral infectiva caracterizada porque dicha partícula contiene el ARN genómico retroviral según la reivindicación 7.

11. Una célula hospedadora caracterizada porque está transfectada o transformada con un vector retroviral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o con el ARN genómico retroviral de la reivindicación 7.

12. Una célula hospedadora caracterizada porque está infectada con una partícula retroviral infectiva según la reivindicación 10.

13. Método para la producción de partículas retrovirales infectivas caracterizado porque una línea celular empaquetadora es transfectada con un vector retroviral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y la línea empaquetadora transfectada es cultivada bajo unas condiciones que permiten la liberación de partículas retrovirales que contienen el ARN genómico retroviral según la reivindicación 7.

14. Método para la producción de partículas retrovirales infectivas caracterizado porque una línea celular es cotransfectada con un vector retroviral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y construcciones que expresan genes auxiliares para el empaquetamiento del genoma retroviral y la línea celular transfectada es cultivada bajo unas condiciones que permiten la liberación de partículas retrovirales que contienen el ARN genómico retroviral según la reivindicación 7.

15. Método para introducir secuencias nucleotídicas heterólogas u homólogas en células diana que comprende la infección de dichas células diana con partículas retrovirales según la reivindicación 10.

16. Uso del vector retroviral, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la preparación de una composición farmacéutica para su uso en terapia génica.

17. Uso del vector retroviral, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para el clonaje y selección de genes y la construcción de librerías retrovirales.

18. Uso del vector retroviral, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la expresión y/o sobreexpresión de proteínas o ARN, y la producción y/o purificación de péptidos o proteínas.

19. Composición farmacéutica que comprende un vector retroviral, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que además comprende un vehículo farmacéuticamente compatible.