DD212748A5 - Verfahren zur bildung doppelstraengiger, hybride human-leukozyten-interferone kodierender dns - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bildung doppelstraengiger DNS, die hybride Human-Leukozyten-Interferone von etwa 165 bis 166 Aminosaeuren kodiert. Erfindungsgemaess wird (a) ein erstes doppelstraengiges DNS-Fragment, das die gesamte oder den aminoendstaendigen Teil der Aminosaeuresequenz eines ersten, natuerlich vorkommenden Leukozyten-Interferons kodiert und das eine Restriktionsstelle fuer eine bestimmte Endonuclease aufweist, mit dieser Endonuclease spaltet, (b) ein zweites doppelstraengiges DNS-Fragment, das die gesamte oder den carboxylendstaendigen Teil der Aminosaeuresequenz eines anderen natuerlich vorkommenden Leukozyten-Interferons kodiert u. eine identische Endonuclease-Restriktionsstelle an vergleichbarer Position bezueglich der Aminosaeuresequenz der beiden Interferone aufweist, mit der gleichen Endonuclease spaltet und (c) das aminoendstaendige DNS-Fragment des ersten Interferons mit dem carboxylendstaendigen DNS-Fragment des zweiten Interferons zusammenfuegt.

Description

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Ausscheidung aus 60 097 11

Verfahren zur Bildung doppelsträngiger, hybride Human-Leukozyten-Interf erone kodierender DNS

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf die mikrobielle Herstellung von Hybrid-Leukozyten-Interferonen durch rekombinante DNA-Technologie zur Verwendung bei der Behandlung von viralen und neoplastischen Erkrankungen sowie auf die Mittel, Maßnahmen und Endprodukte einer solchen Herstellung.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Verhältnismäßig homogene Leukozyten-Interferone sind aus Leukozyten normaler oder leukämischer Spender gewonnen worden. Diese· Interferone sind eine Familie von Proteinen, die sich durch ein starkes Vermögen, in ihren Target-Zellen einen Virus-resistenten Zustand herzustellen, auszeichnen. Außerdem vermag Interferon auf die Zellvermehrung hemmend und die Immunreaktion modulierend zu wirken· Diese Eigenschaften haben die klinische Verwendung von Interferon als therapeutisches Mittel zur Behandlung viraler Infektionen Ci# und bösartiger Erkrankungen veranlaLßt.

Ott :

In jüngster Zeit ist die rekombinante DNA-Technologie dazu herangezogen worden, die mikrobielle Herstellung einer Reihe verschiedener Leukozyten-Interferone zu veranlassen, deren Aminosäure-Sequenzen größenordnungsmäßig 70 % Homologie, relativ zueinander, zeigen, wie von David V. Goeddel et al· (Nature 220, 20 - 26 (1981) ) offenbart· Gene, die Aminosäuresequenzen verschiedener Leukozyten-Interferone verschlüsseln, die u. a* mit LeIF A, B, C, D, F, G bzw. H bezeichnet sind, werden aus dem von H. P. Koeffler und

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D. W. Golde (Science 200, 1153 - 1154 (1978)), von David V. Goeddel und Sidney Pestka beschriebenen Zellstamm KG-1 erkalten. Der Zellstamm KG1 ist bei der American Type Culture Collection, ATCC-Zugangsnummer CBL 8031, hinterlegt worden. Solche Gene, in Plasmidträgern für bakterielle Expression geeignet vorbereitet, können dazu verwendet werden, Wirtsbakterien, vorzugsweise S. coli K-12, Stamm 294, American )' type culture colleotion-Zugangsnummer 31446, hinterlegt am 28. Oktober 1978, zu transformieren.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung'ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bildung doppelsträngiger DNS₁ die hybride Human-Leukozyten-Interferone von etwa 165 bis 166 Aminosäuren kodiert.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Möglichkeiten für ^;> die Herstellung neuer therapeutisch wertvoller Interferone aufzufinden und diese chemisch komplizierten Verbindungen in größeren Mengen herzustellen.

Erfindungsgemäß ist das Verfahren zur Herstellung hybrider Human-Leukozyten-Interferone von etwa 165 bis 166 Aminosäuren, deren Aminosäuresequenzen sich von denen natürlich vorkommender Leukozyten-Interferone unterscheiden aber aus diskreten Unterseq.uenzen verschiedener, natürlich vorkommender Leukozyten-Interferone bestehen, gekennzeichnet dadurch, daß man eine doppelsträngige DlTS, deren einer Strang dieses hybride Interferon kodiert, in ein replizierbares Sxpres-

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sionsplasmid einbringt) einen Mikroorganismus mit ihm transformiert, den Mikroorganismus kultiviert unter Expression des kodierten Interferons, ihn lysiert und das Interferon isoliert. Dabei kann der N-terminale Teil des antiviralen Polypeptids im wesentlichen aus Aminosäuren 1 bis 92 von LeIF-D und der Carboxy1-Endteil im wesentlichen aus Aminosäuren 92 bis 165 von LeIP-A; oder N-terminale Teil des antiviralen Polypeptids im wesentlichen aus Aminosäuren 1 bis 91 von LeIE-A und der Carboxy1-Endteil im wesentlichen aus Aminosäuren 93 bis 166 von LeIP-D; oder N-terminale Teil des antiviralen Polypeptids im wesentlichen aus Aminosäuren 1 bis 63 von LeIP-D und der Carboxyl-terminal Teil im wesentlichen aus Aminosäuren 63 bis 165 von LeIP-A; oder IT-termina-Ie Teil des antiviralen Polypeptids im wesentlichen aus Aminosäuren 1 bis 62 von LeIP-A und der Carboxy1-Endteil im wesentlichen aus Aminosäuren 64 bis 166 von LeIP-D; oder N-terminale Teil des antiviralen Polypeptids im wesentlichen aus Aminosäuren 1 bis 91 von LeIP-A und der Carboxy1-Teil im wesentlichen aus Aminosäuren 93 bis 166 von LeIP-B; oder N-terminale Teil des antiviralen Polypeptids im wesentlichen aus Aminosäuren 1 bis 91 von LeIP-A und der Carboxyl-Endteil im wesentlichen aus Aminosäuren 93 bis 166 von LeIP-P bestehen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bildung doppelsträngiger, hybride Human-Leukozyten-Interferone von etwa 165 bis 166 Aminosäuren kodierender DHS wird in der Weise ausgeführt, daß man

(a) ein erstes doppelsträngiges DNS-Fragment, das die gesamte oder den aminoendständigen Teil der Aminosäuresequenz eines ersten, natürlich vorkommenden Leukozyten-Interferons kodiert und das eine Restriktionsstelle für ein©

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bestimmte Endonuclease aufweist, mit dieser Endonuclease spaltet,

(b) ein zweites doppelstrangiges DNS-Fragment, das die gesamte oder den carboxylendständigen Teil der Aminosäuresequenz eines anderen natürlich vorkommenden Leukozyten-Interferons kodiert und eine identische Endonuclease-Bestriktionsstelle an vergleichbarer Position bezüglich der Aminosäuresequenz der beiden Interferone aufweist, mit der gleichen Endonuclease spaltet und

(c) das aminoendständige DNS-Fragment des ersten Interferons mit dem carboxylendständigen DNS-Fragment des zweiten Interferons zusammenfügt.

Dabei kann das zweite natürlich vorkommende Leukozyten-Interferon LeIF-D und das zweite natürlich vorkommende Leukozyten-Interferon LeIF-A? oder das erste natürlich vorkommende Leukozyten-Interferon LeIF-A und das zweite natürlich vorkommende Leukozyten-Interferon LeIF-Dj oder das erste natürlich vorkommende Leukozyten-Interferon LeIF-A und das zweite natürlich vorkommende Leukozyten-Interferon LeIF-B; oder das erste natürlich vorkommende Leukozyten-Interferon LeIF-A und das zweite natürlich vorkommende Leukozyten-Interferon LeIF-B sein.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels mit einem antiviralen Polypeptid aus etwa Ϊ65 bis 166 Aminosäuren, wobei die Aminosäuresequenz des Polypeptids in Sequenz diskrete, in Aminosäureidentität und -zahl Untersequenzen verschiedener natürlich vorkommender

•

i .

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Laukozyten-Interferone entsprechende Untersequenzen aufweist, wobei die Aminosäuresequenz des Polypeptids in der Gesamtzusammensetzung von der Aminosäuresequenz natürlich vorkommender Leukozyten-Interferone verschieden ist. Dabei wird, das Polypeptid mit nicht-toxischen, inerten, therapeutisch kompatiblen Trägern gemischt und das anfallende Gemisch in eine geeignete pharmazeutische Dosierungsform gebracht.

Das Zugpferd der rekombinanten DNA-Technologie ist das Plasmid, eine nicht.chromosomale Schleife doppelsträngiger DNA in Bakterien und anderen Mikroben, häufig in Vielfach-Kopien pro Zelle* In der in der Plasmid-DNA verschlüsselten Information ist die enthalten, die zum Reproduzieren des Plasmids in Tochterzeilen erforderlich ist (d· h. ein "Eeplicon") und gewöhnlich ein oder mehrere Auswahlcharakteristika, wie im Falle von Bakterien, die Resistenz gegenüber Antibioticis, die Klone der das Plasmid von Interesse enthaltenden Wirtszelle zu erkennen und bevorzugt in selektiven Medien zu züchten erlauben. Die Brauchbarkeit von Plasmiden liegt in der Tatsache, daß sie durch die eine oder die andere Restrik- · tions-Endonuclease oder "Restrikt ions-Snzyms" spezifisch gespalten werden können, die jeweils eine andere Stelle an der Plasmid-DNA erkennen. Danach können heterologe Gene oder Genfragmente in das Plasmid durch das Verbinden der Enden an der Spaltstelle oder an rekonstruierten Enden nahe der ßpaltstelle eingebaut werden. Die DNA-Rekombination erfolgt außerhalb der Zelle, aber das anfallende "rekombinante" Plasmid kann nach einem als Transformation bekannten Verfahren in sie eingeführt werden und große Mengen des heterologen Gens enthaltenden rekombinanten Plasmids können durch Kultivierung der transformierten Zellen erhalten werden. ferner kann, wenn das Gen bezüglich Teilen des Plasmids,

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die die Transkription und Translation der verschlüsselten DNA-Botschaft steuern, geeignet eingesetzt ist, der sich ergebende Expressionsträger tatsächlich dazu verwendet werä^_7r die Polypeptidsequenz zu produzieren, für die das eingesetzte &W31 codiert, ein Verfahren, das als Expression bezeichnet wird.

"^ Ispression beginnt in einem Bereich, der als Promo tor bekamt ist, der von ENA-Polymerase erkannt und gebunden wird. In manchen Fällen, wie beim Tryptophan- oder "trp"-Promoter, der bei der praktischen Durchführung der Erfindung bevorzugt ist, überlappen.sich Promoter-Bereiche mit "Operator"-Bereichen unter Bildung eines kombinierten Promoter-Operators. Operatoren sind DNA-Sequenzen, die von sogenannten Eepressorproteinen erkannt werden, die dazu dienen, die Frequenz des Beginns einer Transkription an einem besonderen Promoter zu regeln. Die Polymerase geht an der DNA entlang und überträgt die im Codierstrang enthaltene Information vom 5'~ ^z^^m-3I-Ende auf Messenger-ΕΝΑ, die wiederum in ein Polypeptid übertragen wird, das die Aminosäuresequenz besitzt, die die

I DNA codiert. Jede Aminosäure wird durch ein Nucleotid-

Triplett oder "Codon" in etwas verschlüsselt, was für die vorliegenden Zwecke als "Strukturgen" bezeichnet werden kann, d. h. dem Teil, der die Aminosäuresequenz des exprimierten Produkts verschlüsselt. Nach der Bindung an den Promoter transkribiert die ENA-Polymerase zuerst Nucleotide, eine Eibosomen-Bindestelle verschlüsselnd, dann eine Translationsinitiation oder "Start"-signal (gewöhnlich ATG, das in der entstehenden Messenger-ΕΝΑ zu AUG wird), dann die Nucleotid-Codons innerhalb des Strukturgens selbst. Sogenannte Stop-Codons werden am Ende des Strukturgens transkribiert, worauf die Polymerase eine weitere Sequenz von Messenger-ΕΝΑ bilden

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kann, die aufgrund der Anwesenheit des Stopsignals von den Eibosomen unübersetzt bleiben» Eibosomen werden an die auf der messenger-ΕΝΑ vorgesehene Bindestelle gebunden, in Bakterien gewöhnlich, wenn die inRNA gebildet wird; und erzeugen selbst das verschlüsselte Polypeptld, beginnend am Translations-Startsignal und endend mit dem zuvor genannten Stopsignal. Das gewünschte Produkt wird gebildet, wenn ä£-^e die Eibosomen-Bindestelle verschlüsselnden Sequenzen bezüglich des AUG-Initiatorcqdons geeignet angeordnet sind und wenn alle übrigen Oodons dem Initiatorcodon in Phase folgen. Das anfallende Produkt kann durch Lyse der Wirtszelle und Gewinnen des Produkts durch geeignete Reinigung von anderem Bakterienprotein erhalten werden.

Nucleotid-Sequenzstudien von Genen, die die verschiedenen Leukozyten-Interferone verschlüsseln, lassen ein Maß an Allgemeinheit unter verschiedenen von ihnen im Hinblick auf die Gegenwart und Anordnung von Spaltstellen erkennen, die von bestimmten Eestriktions-Endonucleasen erkannt werden. Brfindungsgemäß kann diese Allgemeinheit zur Bildung neuer Hybridgene durch DNA-Eekombination benutzt werden, die bei der mikrobiellen Erzeugung von Hybrid-Leukozyten-Interferonen brauchbar sind, von denen erwartet werden kann, daß sie in mehr oder weniger großem Ausmaß die antiviralen und andere Eigenschaften von Interferonen, durch die elterlichen Gene verschlüsselt, zeigen. Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung können solche Hybrid-leukozyten-Interferone verstärkte Aktivität relativ zu den durch die elterlichen Gene verschlüsselten entwickeln.

Die elterlichen Leukozyten-Interferon-Gene, die die Familie der hier betrachteten Leukozyten-Interferon-Proteine codie-

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ren, zeigen individuell natürliche allelomorphe Variationen. Diese Variationen können durch einen oder mehrere Amino säur e-Unterschiedee) in der Gesamtproteinsequenz oder durch Lücken, Substitutionen, Einfügungen, Umkehrungen oder zusätzliche Aminosäure(n) in der Sequenz nachgewiesen werden· Für jedes elterliche Leukozyten-Interferon, mit LeIF Δ LeIi¹ B ... LeIF J usw. bezeichnet, fallen solche allelomorphen Variationen unter die Bezeichnung oder Definition und damit unter die Erfindung.

Weitere Aufgaben, Vorteile und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der folgenden näheren Beschreibung und den Figuren; von diesen zeigt:

Fig· 1: ITucleotidsequenzen der Codierbereiche von ß Leukozyten-Interferon ("LeIF")-Komplementär-DM ("cDNA")-Klonen* Von diesen ist eines, entsprechend mit LeiF B bezeichnet, ein offensichtliches "Pseudogen", das kein aktives Leukozyten-Interferon codiert, während ein weiteres, LeIF G-, weniger als die volle Sequenz für die entsprechende Interferon-Art enthält«, Das ATG~ü?ranslations-Startkodon und das Stop-OJriplett für jedes LeIF ist unterstrichen·

Fig· 2: Bestriktions-Endonuclease-Karten von acht Arten I

LeIF geklönter cDUAs (A bis H) · Die Klone enthalten- j de Plasmide wurden nach der dC:dG-Tailingmethode j

aufgebaut (D· V· Goeddel et al., ITature 287, 416 (1980))·. Daher können die cDITA-Inserte mit Pst I herausgeschnitten werden, d· h. jedes Ende eines jeden Inserts ist eine Pst I-Eestriktions-Endonuclease-Spaltstelle· Die Striche am Ende eines jeden cDNA-Inserts stellen die flankierenden Homopolymer-

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dC:dG-Schwänze dar. Die Positionen von Pvu II-, Eco EI- und BgI II-Eestriktionsstellen sind angegeben. Schattierbereiche in der Figur stellen die Codiersequenzen ausgereifter LeIFs dar;· die schraffierten Bereiche zeigen Signal-Peptidcodiersequen- - zen an; und die freien Bereiche zeigen nichtcodiergnde 3¹- und 5'-Sequenzen.

^w Fig. 3: ist ein Vergleich der acht von den Nucleoiid-Sequenzen vorausgesagten LeIF-Proteinsequenzen. Es werden die von der ΓϋΡΑΟ-IUB Commission on Biochemical Nomenclature empfohlenden einbuchstabigen Abkürzungen verwendet:. A = Alanin; C = Cystein; D = Asparaginsäure, B S= Glutaminsäure; F s Phenylalanin; G = Glycin; H = Histidin; I s Isoleucin; K =s Lysin, L s Leucin; M = Methionin; N = Asparagin; P s Prolin; Qs Glutamin; E = Arginin, S = Serin; ! s Ihreonin; T a Valin; W = Tryptophan und 1 - {Dyrosin. Die Zahlen beziehen sich auf die Aminosäureposition (S bezieht sich auf Signalpeptid). Der Strich in der 165 Aminosäure-LeIF Α-Sequenz an Position 44 wurde eingeführt, um diese Sequenz mit den 166 Aminosäuresequenzen der anderen LeIFs auszurichten. Die Sequenz von LeIF 1 wurde durch Ignorieren des Extra-iTucleo-• ' * tids (Position 187 der Fig. 1) in seinem Codierbereich bestimmt. Die Sternchen bezeichnen In-Phase-Stop-Codons. Allen LeIFs (ausgenommen das Pseudogen LeIF E) gemeine Aminosäuren sind auch gezeigt. Die unterstrichenen Beste sind Aminosäuren, die auch in menschlichem Fibroblasten-Interferon vorhanden sind.

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In Fig. 1 entsprechen die Nucleotide +1 bis 69 den S1 bis S23-Aminosäuren der Fig. 3. Das Oodon TGT_; (Nucleotide 70 bis 72) der Fig. 1 entspricht Cyste_y in (C, Aminosäure 1) der Fig. 3. In Fig. 3 tritt die Pvu II-Restriktions-Endonuclease-Spaltstelle zwischen den Codons für Aminosäuren 92 und 93 in LeIF A, B, D, F und G auf, d« h. zwischen den Nucleotiden 346 und 347 der Fig. 1.

Fig. 4» vergleicht die Aminosäuresequenzen ausgereifter Leukozyten-Interferone A und D, wobei ein Fehlen der Aminosäure 44 in LeIF A durch Striche angezeigt ist· Fur solche LeIF D-Aminosäuren, die sich von den entsprechenden Aminosäuren von LeIF A unterscheiden, sind dargestellt: Die Aminosäuresequenz von LeIF D ist sonst mit der von LeIF A identisch. _; Fig. 4 zeigt auch die relative Stellung von BgI II- und Pvu II-Eestriktions-Endonuclease-Spaltstellen, zur Bildung bevorzugter Hybrid-Leukozyten-Gene nach der Erfindung verwendet, am entsprechenden Gen an*

Fig· 5 und 6j veranschaulichen die Ergebnisse von Vergleichs-' tests eines bevorzugten Hybrid-Leukozyten-Interferons gemäß der Erfindung ("LeIF-A/D") auf Aktivität gegenüber Encephalomyocarditis-Virus ("EMC") und Vesicularstomatitis-Virus (¹¹VSV") in Mausezellen.

Fig. 7 und 8: zeigen die Ergebnisse eines Vergleichstests mit LeIF-A/D und anderen Interferonen gegenüber EBiC-Virus-Infektionen in Mäeaen bzw. Hamstern. Die Daten in Fig. 7 stammen aus Behänd-

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lungen i. p. 3 k vor der Infektion. Die Dosierungen von LeIF-A/D und LeIF-A sind, wie an Wish-Zellen titriert· " . .

9s zeigt die DNA-Sequenzen von fünf leiF-Proteinen einschließlich die Typen I und J.

O Bei den beschriebenen Arbeiten wurden zwei Mikroorganismen eingesetzt: E. ooli x1776, wie in der US-PS 4 190 495 beschrieben, und E, coli K-12 Stamm 294 (Ende A, thi~, hsr"", hsmj), wie in der GB-PS 2 055 382A beschrieben. Beide sind bei der American Type Culture Collection, ATCC-Zugangsnummer 31537 und 31446, am 3. Juli 1979 bzw. 28» Oktober 1978 hinterlegt worden. Alle Arbeiten über rekombinante DNA erfolgten nach anwendbaren Richtlinien der National Institutes of Health.

Die Erfindung wird in ihren am meisten bevorzugten Ausführungsformen unter Bezugnahme auf S. coli beschrieben, nicht nur /^v mit den oben beschriebenen Stämmen E. coli χ 1776 und E. coli K-12, Stamm 294, sondern auch mit anderen bekannten E. coli-Stämmen, wie E. coli B, oder anderen Mikroben-Stämmen, von denen viele hinterlegt und (möglicherweise) von anerkannten Hinterlegungsstellen für Mikroorganismen, wie der American Type Culture Collection,' ATCC, erhältlich sind. (YgI. die ATOC-Katalogaufstellung und auch die DE-OS 2 644 432). Diese weiteren Mikroorganismen umfassen z. B. Bazillen, wie Bacillus subtilis, und andere Enterobacteriaceae, unter denen beispielsweise Salmonelle typhimurium und Serratia marcescens erwähnt werden können, unter Verwendung von Plasmiden, die reduplizieren und heterologe Gensequenzen exprimieren können.

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Hefe, wie Sacoharomyces cerevisiae, kann auch vorteilhaft als Wirtsorganismus bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Interferonproteine durch Expression von sie codierenden Genen unter der Kontrolle eines Hefepromoters verwendet werden^

Die LeI3?-Hybriden werden erfindungsgemäß hergestellt, indem die Bestriktions-Endonuclease-Spaltstellen, die gewöhnlich in den einzelnen elterlichen Genen liegen, und deren jedes Ende in Verbindung mit den gleichen Stellen in Träger-Expressions-Plasmiden (Vektoren) genutzt werden. Beispielsweise kann das gro-ße (ca. 3900 bp) Fragment eines Xba I-Pst-I-Verdauungsprodukts des pLeli¹ A trp 25-Expressionsplasmids mit Xba I-Pvu II- und Pvu-Pst I-Verdauungsfragmenten der verschiedenen LeIF-Eiterngene zu Expressionsplasmiden verbunden werden, die das entsprechende Hybrid-LelF erhältlich machen·

Jedes LeIF-Expressionsplasmid wurde unabhängig mit Verdauungsfragmenten aufgebaut, die aus verschiedenen LelF-plasmiden isoiert waren, z. B. pLeltf A trp 25, pLelF B trp 7, pLeIF G trp 35, pLelf D trp 11, pLeIP F trp 1, pLeIF G, pLelP H und pLeiF I usw., deren Aufbau in Nature 28£, 411 (1980) beschrieben ist, oder aus pBE322, dessen Aufbau in Gene 2, 95 (1977) beschrieben ist. In bestimmten dieser Plasmide bezeichnet "trp¹¹ ein Tryptophanpromoter-Operator-System, für bakterielle Expression am meisten bevorzugt, wie in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung Nr. 36 776 beschrieben.

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Direkte Expression eines ersten reifen Leukozyten-Interferons

Die Arbeitsweise, die befolgt wurde, um LeIf A direkt als reifes Interferon-Polypeptid auszudrücken, umfaßte die Kombination von synthetischen (N-terminalen) und komplementären -DNAs. .

Eine Sau 3a-E©striktion-Endonuclease-Stelle wird passenderweise zwischen Oodons 1 und 2 von Le-IF A angeordnet. Zwei synthetische Desoxyoligonucleotide wurden geschaffen, die ein ATG-Translations-Startcodon aufweisen, das Codon für Aminosäure 1 (Cystein) wieder herstellen und ein Eco BI-kohaesives Ende schaffen. Diese Oligomeren wurden an ein 34 b*p. Sau 3a - Ava II-Fragment von pL31 geheftet. Das anfallende 45 b.p.-Produkt wurde an zwei weitere DNA-Fragmente gehängt, um ein 865-Basenpaar-synthetisch/natürliches Hybridgen aufzubauen, das Le-IF A codiert und durch Eco EI- und Pst I-Eestriktionsstellen gebunden wird. Dieses Gen wurde zwischen Eco EI und Pst I-Stellen in pBE322 eingefügt, um das Plasmid pLe-IF A1 zu ergeben.

Das Plasmid pGM1 trägt das E. coli-Tryptophan-Operon mit der Fehlstelle «4LE1413 (G. F. Miozzari et al., J· Bacteriology 133» 1457 - 1466 (1978)) und führt folglich zur Expression eines Fusionsproteins mit den ersten 6 Aminosäuren des trp-Leaders und etwa dem letzten Drittel des trp-E.Polypeptids (nachfolgend im Zusammenhang als Le¹ bezeichnet) sowie das trp-D-Polypeptid in seiner Gesamtheit, alle unter der Kontrolle des trp-Promotor-Operator-Systenis. 20/Ug des Plasmids wurden mit dem Eestriktionsenzym Pvu II verdaut, das das Plasmid an fünf Stellen spaltet. Die Genfragmento wurden

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sodann mit EcoRi-Verknüpfern (bestehend aus einem selbstkomplenientären^Oligpnucleotid der Sequenz pCATGAATTCATG) unter Bildung einer EcoRi-Spaltstelle für ein späteres Klonen 25U einem Plasmid mit einer EcoRI-Stelle kombiniert. Die 20 /Ug der aus pGM1 erhaltenen DNA-Fragmente wurden mit 10 Einheiten T^-DKA-Ligase in Gegenwart von 200 pioo-Mol des 5J-phosphorylierten synthetischen Oligonuoleotids pCATGAATTCATG und in 20 ,ul T^-DNA-Ligase-Puffer (20 mMol Tris, pH 7,6, 0,5 mMol ATP, 10 mMol MgCl₂, 5 mMol Dithiothreitol) bei 4 ⁰G über Nacht behandelt. Die Lösung wurde dann 10 min auf 70 ⁰G erwärmt, um das Binden aufzuhalten· Die Bindeglieder wurden durch EcoEI-Abbau gespalten und die Fragmente, nun mit EcoBI-Enden, wurden mittels 5 % Polyacrylamidgel-Elektrophorese (nachfolgend ¹¹PAGE") 'aufgetrennt und die drei größten Fragmente vom Gel zunächst durch Anfärben mit Ethidiumbromid, Lokalisieren der Fragmente mit UV-Licht und Herausschneiden der interessierenden Teile aus dem Gel isoliert. Jedes Gelfragment wurde mit .300 /Ul 0,1 χ TBE in einen Dialysebeutel gebracht und bei 100 Y 1 h in 0,1 χ TBE-Puffer der Elektrophorese unterworfen (TBS-Puffer enthält 10,8 g -Iris-Base, 5,5 g Borsäure, 0,09 g Ha₂EDTA in 1 1 H₂O). Die wäßrige Lösung wurde aus dem Dialysebeutel geholt, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und 0,2-molar an Natriumchlorid gemacht und die DlIA nach Äthanol-Fällung in Wasser gewonnen. Das trp-Promoter-Operator-haltige Gen mit EcoEI-kohäsiven Enden wurde in der nachfolgend beschriebenen Arbeitsweise identifiziert, die den Einbau von Fragmenten in ein Tetracyclin-empfindliches Plasmid zur Folge hat, das nach dem Einbau von Promoter-Operator Tetracyclin-resistent wird.

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Das Plasmid pBEH1 (E. I. Rodriguez et al·, Nucleic Acids Research 6, 3267 - 3287 (1979)) drückt Ampicillin-Resistenz aus und enthält das Gen für Tetracyclin-Resistenz, da aber kein zugeordneter Promoter vorliegt, kommt diese Resistenz nicht zum Ausdruck. Das Plasmid ist folglich Tetracycunempfindlich. Durch Einführen eines Promoter-Operator-Systems an der EcoRI-Stelle kann das Plasmid letracyclin-resistent C) gemacht werden.

Bin pBRH1 wurde mit EcoRI verdaut und das Enzym durch Phenolextraktion und anschließende Chloroform-Extraktion entfernt und nach Ithanolfällung in Wasser gewonnen. Das anfallende DNA-Molekül wurde in getrennten Reaktionsgemischen jeweils mit den drei oben erhaltenen DNA-Fragmenten kombiniert und mit Qk-DNA-Ligase, wie zuvor beschrieben, verknüpft. Die im Reaktionsgemisch vorliegende DNA wurde zum Transformieren eines angemessenen E₀ coli-K-12-Stammes 294 (K. Backman et alj, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 21» 4174 - 4198 (1976)) nach Standard-Techniken (V. Hershfield et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 21* 34-55 - 3459 (1974)) verwendet und die Bakterien auf LB-Platten aufgebracht, die 2Ö/Ug/ml Ampicillin und 5/Ug/ml Tetracyclin enthielten. Mehrere Tetracyclin-resistente Kolonien wurden ausgewählt, Plasmid DNA isoliert und die Anwesenheit des gewünschten Fragments durch Restriktions-Enzymanalyse bestätigt. Das anfallende Plasmid wird mit pBRGtrp bezeichnet.

Ein EcoRI- und BamHI-Abbauprodukt des viralen Genoms oder Chromosomensatzes von Hepatitis B wurde nach herkömmlichen Maßnahmen erhalten und zu EcoRI und BamHI-Stellen von Plasmid pGH6 (D. V. Goeddel et al., Nature 281., 544 (1979)) zu dem Plasmid pHS32 geklont. Das Plasmid pHS32 wurde mit Zbal

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gespalten, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und mit Äthanol gefällt. Dann wurde es mit 1/Ul E. coli-Polymerase I, Klenow-Fragment (Boehringer, Mannheim) in 30 ml Polymerase-Puffer (50 mMol Kaliumphosphat, pH 7,4 7 nMol , 1 mMol ß-Mercaptoathanol) mit 0,1 mMol dTTP und 0,1

mMol dCTP 30 min bei 0 ⁰C, dann 2 h bei 37 ⁰G behandelt* Diese Behandlung führt dazu, daß zwei der vier Nucleotide J komplementär zu dem vorragenden 5·-Ende der Xbal-Spaltstelle aufgefüllt wurden ins

5« CTAGA $1 CTAGA

y Qj , V TCT

Zwei Nucleotide, dC und dT, wurden eingeführt und bildeten ein Ende mit zwei vorragenden 5'-Nucleotiden. Dieser lineare Eest von Plasmid pHS32 (nach Phenol- und Chloroform-Extraktion und Rückgewinnung in Y/asser nach Ithanol-Fällung) wurde mit EcoEI gespalten. Das große Plasmid-Fragment wurde vom kleineren EcoEI-Xbal-Fragment durch PAGE getrennt und nach Elektroelution isoliert. Dieses DNA-Fragment aus pHS32 (0,2yUg) wurde unter Bedingungen ähnlich den oben beschriebenen an das EcoRI-Taq I-Fragment des Tryptophan-Operons (ca. 0,01/Ug), aus pBRHtrp stammend, gebunden.

Bei dem Verfahren zum Binden des Fragments von pHS32 an Eco EI-Taq I-Pragment, wie oben beschrieben, wird das vorragende Taq I-Ende an das verbleibende vorragende Ende von Xba I gebunden, bogieich es nicht vollständig nach Watson-Crick Basen-gepaart ist:

— T ₊ CTAGA _^ —TCTAGA

AGC TCT AGCTCT

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Ein Teil dieses Binde-Reaktionsgemisches wurde in E. coli 294-Zellen transformiert, wärmebehandelt und auf Ampicillin enthaltende LB-Platten gebracht. 24 Kolonien wurden ausge- , wählt, in 3 ml LB-Medium vermehrt und Plasmid isoliert. Bei sechs von ihnen wurde festgestellt, daß die 2bal-^stelle durch E. coli-katalysierte DNA-Reparatur und.Replikation regeneriert wars

TOTAGA TCTAGA

AGOTCT . -AGATCT

Auch wurde gefunden, daß diese Plasmide sowohl mit EcoRI als auch mit Hpal spalteten und die erwarteten Restriktionsfragmente ergaben.¹ Ein Plasmid, als pTrp 14 bezeichnet, wurde zur Expression heterologer Polypeptide verwendet, wie nachfolgend erörtert.

Das Plasmid pHGH 107 (D. Vi Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)) enthält ein Gen für menschliches Wachstumshormon aus 23 Aminosäurecodons, hergestellt aus synthetischen DNA-Pragmenten und 163 Aminosäurecodons, erhalten aus Komplementär-DNA, hergestellt über reverse Transkription von menschlicher V/achstumshormon-messenger-RNA. Dieses Gen enthält, obgleich die Oodons der "Vor^M-Sequenz von menschlichem Wachstumshormon fehlen, ein ATG-Translations-Startcodon. Das Gen wurde aus 10/Ug pHGH 107 nach Behandlung mit EcoRI und dann E. coli-Polymerase-I-Klenow-Fragment und dTTP und dATP, wie oben beschrieben, isoliert. Nach Phenol- und Chloroformextraktion und Ä'thanolfällung wurde das Plasmid mit BamHI behandelt.

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Das Human-Wachstumshormon ("HGH" )-Gen-enthaltende Fragment wurde durch PAGE- isoliert, dann folgte Blektroelution. Das anfallende DNA-Fragment enthält auch die ersten 350 Nucleotide des Tetracyclin-resistenten Strukturgens, ihm fehlt aber das Tetracyolin-Promoter-Operator-ßystem, so daß beim anschließenden Klonen zu einem Expressionsplasmid die das Insert enthaltenden Plasmide durch die Wiederherstellung der !Petracyclin-Kesistenz lokalisiert werden können. Da das EcoKI-Ende des Fragments durch die Klenow-Polymerase !-Arbeitsweise aufgefüllt worden ist, hat das Fragment ein stumpfes und ein kohäsives Ende, was die richtige Orientierung bei späterem Einschieben in ein Expressionsplasmid gewährleistet·

Sodann wurde das Expressionsplasmid plrp 14 hergestellt, um das oben hergestellte HGH-Gen-haltige Fragment zu erhalten. So wurde pTrp 14 mit Xbal verdaut und die erhaltenen kohäsiven Enden nach der Klenow-Polymerase !-Arbeitsweise unter Verwendung von dA£P, dTTP, dG£P und dCTP gefüllt· Nach der Phenol- und Chloroformextraktion und der Ithanolfällung wurde die anfallende DNA mit BamHI behandelt, und das anfallende große Plasmid-Fragment wurde durch PAGE und Elektroelution isoliert. Das aus pTrp 14 abgeleitete Fragment hatte ein stumpfes und ein kohäsives Ende, was die !Rekombination in geeigneter Orientierung mit dem das EGH-Gen enthaltenden Fragment, zuvor bfschrieben, erlaubt.

Das HGH-Gen-Fragment und das pTrp 14 Δ Xba-BamHI-Fragment wurden kombiniert und unter ähnlichen Bedingungen, wie oben beschrieben, aneinander gehängt· Die aufgefüllten Xbal- und EcoEI-Enden verbanden sich miteinander über die Verbindung

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24.8.83

über die stumpfen Enden unter !Rückbildung sowohl der Xbalals auch der EcoEI-Stelle:

Xbal aufgefüllt EcoEI aufgefüllt HGH-Gen-Anfang TCOJAG ₊ · ' AATTOTATG—* . —TCTAGAATTCTATG—

AGATO TTAAGATAC — AGATCTTAAGATAO

Xbal EcoEI

Dieser Aufbau bildet auch wieder das Tetracyclin-resistente Gen zurück. Da das Plasmid pHGH 107 Tetracyclin-Eesistenz von einem Promoter vor dem HGH-Gen (dem Lac-Promoter) exprimiert, ermöglicht dieser Aufbau, mit pHGH 207 bezeichnet, die Expression des Gens für Tetracyclin-Resistenz unter der Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operators· So wurde das Bindegemisch in E. coli 294· transformiert und Kolonien auf LB-Platten, die 5/Ug/ml Tetracyclin enthielten, selektiert.

Das Plasmid pHGH 207 wurde mit Eco EI verdaut und der trp-Promoter, ein 300 b.p. Eco EI-Fragment enthaltend, durch PAGE und anschließende Elektroelution gewonnen· Das 300 p.p· Eco Ei-Fragment enthält den S. coli-trp-Promoter, Operator und trp-Leaderribosomen-Bindestelle, ihm fehlt aber eine ATG-Sequenz für das 'Einführen der Translation. Dieses DNA-Eragment wurde in die Eco Ei-Stelle von pLe-IF A geklont.

Das eben erwähnte trp-Fragment ist ein Analogon des E. coli-Tryptophan-Operons, dessen sogenannter trp-Abschwächer besei tigt worden ist, um Expressionswerte kontrollierbar zu erhöhen. Expressionsplasmide, die das modifizierte trp-Regulon enthalten, können in Hährmedien, die zusätzliches Tryptophan in genügenden Mengen zum Unterdrücken des Promoter-

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24.8.83

Operator-Systems enthalten, bis auf vorbestimmte Werte vermehrt werden, dann von Tryptophan befreit werden, um das System von Repressor zu befreien, und die Expression des gewünschten Produkts veranlassen.

Im einzelnen wurden 250 ,ug Plasmid pL31 mit Pst I verdaut und das 1000 b.p.-Insert durch Gelelektrophorese an einem

) 6 %-Polyacrylamidgel isoliert. Etwa 40 /Ug Insert wurden aus dem Gel elektroeluiert und in drei !eilmengen zu weiterem Aufschluß unterteilt? a) eine 16/Ug-Probe dieses Fragments wurde mit 40 Einheiten BgI II 45| bei 37 ⁰O teilweise verdaut und das Reaktionsgemisch an einem 6 ^-Polyaorylamidgel gereinigt. Etwa 2/Ug des gewünschten 670 b.p.-Fragments wurden gewonnen, b) Eine weitere Probe (8>ug) des 1000 b.p.-Pst I-Inserts wurde mit Ava II und BgI II behandelt. 1,ug dfs angegebenen 150 b.p.-Fragments wurde nach Gelelektrophorese gewonnen, c) 16/Ug des 1000 b.p.-Stücks wurden mit Sau 3a und Ava II behandelt. Nach Elektrophorese an einem 10 %~ Polyacrylamidgel wurden etwa 0,25/Ug (ca. 10 pMol) des 34 b.p.-Fragments gewonnen. Die zwei angegebenen Desoxyoli-

' ' gonucleotide, 5^dAATTCAIGTGT (Fragments) und 5 · -dGATOACACATG (Fragment 2) wurden nach der Phosphotriester-Methode (Maxam und Gilbert, Methods Enzymol. 6£, 499 - 560 (198O)) synthetisiert. Das Fragment 2 wurde wie folgt phosphoryliert.

200,Ul (ca. 40 pMol) ( f ³²p) ATP (Amersham, 5000 Ci/mltol) wurden durchgetrocknet und erneut in 30/Ul 60 mmol. Tris-KOl (pH 8), 10 mmol. MgCl₂, 15 mmol. ß-Mercaptoäthanol, 100 pMol DUA-Fragment und 2 Einheiten T4-Polynucleotidkina3e enthaltend, suspendiert. Nach 15 min bei 37 ⁰C wurde 1/ul 10 mmol· ATP zugesetzt und die Reaktion weitere 15 min ablaufen gelassen. Das Gemisch wurde dann I5 min auf ?0 ⁰C erwärmt, mit

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'%... 24.8.83

100 pMol 5»^DH-Fragment 1 und 10 pMol des 34 b.p.-Sau 3a-Ava II-Fragments zusammengebracht. Das Binden erfolgte 5 h bei 4 ⁰O in 50 /Ul 20 mmol. Tris-HCl (pH 7,5) , 10 mmol. MgCl₂J 10 mmol. Dithiothreitol, 0,5 mmol. AiDP und 10 Einheiten 2?4-DNA-Ligase. Das Gemisch wurde an einem 6-Polyacrylaiaidgel elektrophoretisch behandelt, und das 45 b.p.-Produkt durch Elektroelution gewonnen. 860 000 Oerenkov-cpm wurden gewonnen (ca. 30 ng, 1 pMol) kombiniert mit 0,5/Ug (5 pMol) des 150 b.p.-Ava H-BgI II-Fragments und 1/Ug (2 pMol) de3 670 b.p.-Bgl-II-Pst-I-Fragments. Das Binden erfolgte bei 20 ⁰C 16 h unter Verwendung von 20 Einheiten 0}4-DEA.-Ligase· Die Ligase wurde durch lOminütiges Erwärmen auf 65 ⁰O inaktiviert. Das Gemisch wurde dann mit Eco EI und Pst I zum Beseitigen von Polymeren des Gens verdaut. Das Gemisch wurde durch 6 % Polyacrylamidgel-Elektrophorese gereinigt. 36 cpm (ca. 0,04 pMol, 20 ng) 865 b.p.-Produkt wurden isoliert. Die Hälfte hiervon (10 ng) wurde an pBH322 (0,3 /Ug) zwischen Eco EI und Pst I-Stellen gebunden. Die {Transformation von E_# ^; coli 294 ergab 70 Tetracyclin-resistente Ampicillinempfindliche Transformanten. Aus 18 dieser Transformanten isolierte Plasmid-DNA wurde mit Eco EI und Pst I verdaut. 16 der 18 Plasmide hatten ein Eco EI-Pst I-Fragment von b.p. Länge. 1/Ug von einem von diesen, pLe-IF A1, wurde mit Eco EI verdaut und an ein 300 b.p. Eco EI-Fragment (0,1/Ug), das E. coli-trp-Promoter und trp.Leader-Eibosomen-Bindestelle enthielt, hergestellt wie oben beschrieben, gebunden. Den trp-Promoter enthaltende Transformanten wurden mit einer ^TP-trp-Sonde nach der Grunstein-Hogness-Kolonie-Screening-Methode identifiziert - Grunstein et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) £2, 3961 (1975)). Sine asymmetrisch angeordnete Xba-I-Stelle im trp-Fragment erlaubte die Bestimmung von Eekombinanten, in denen der trp-Promoter in Eichtung des Le-IF-A-Gens orientiert war.

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24.8.83

Extrakte wurden für den IF-Assay wie folgt hergestellt: 1 ml-Kulturen wurden in L-Brühe mit 5 ,ug/ml Tetracyclin zu einem AtC₀ ^{von etwa} %0 gezüchtet, dann in 23 ml M9-Medien mit 5/Ug/ml Tetraoyclin verdünnt. 10 ml-Proben wurden durch Zentrifugieren gewonnen, wenn A™ 1,0 erreichte, und Zellkuchen wurden in1 ml 55 %iger Saccharose, 50mmol· Tris-HCl (pH 8,0), 50 mmol. EKPA suspendiert. 1 ing Lysozym wurde zugesetzt, und nach 5 min bei 0 ⁰C wurden die Zellen durch Beschallung aufgebrochen. Die Proben wurden 10 min bei 15 000 UpM in einem Sorvall-SM-24-Rotor zentrifugiert. Die Interferon-Aktivität in den überstehenden flüssigkeiten wurde durch Vergleich mit Le-IF-Standards mit Hilfe des Hemmtests des cytopathisohen Effekts (CPE) bestimmt. Zur Bestimmung der Zahl der IF-Moleküle pro Zelle wurde eine Le-IP-spezifische Aktivität von 4 χ 10 Sinheiten/mg verwendet (Eubinstein et al·, Proc. Natl. Acad· Sei«, (USA) £§> 640 (1979)).

Der Klon pLe-IF-A-trp 25, in den der trp-Promoter in der gewünschten Orientierung eingesetzt worden war, ergibt hohe

.Aktivitätswerte (sogar 2,5 x 10 Einheiten/1). Das von E» coli Κ-12-Stamm 294/pl©-Ii¹-A-trp 25 gebildete IF verhält sich wie authentisches Humah-Le-IF; es ist gegenüber einer Behandlung bei pH 2 stabil und wird durch Eaninchen-Antihuman-Leukozyten-Antikörper neutralisiert. Das Interferon hat ein wahrnehmbares Molekulargewicht von etwa 20 000.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.

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Die Isolierung von cDNAs für weitere Leukozyten-Interferone

DNA aus dem vollständig charakterisierten Le-IF-A cDNA-haltigen Plasmid wurde mit Pst I herausgeschnittenj "elektrophoretisch isoliert und nach.einer veröffentlichten Arbeitsweise (Taylor et al.* Biochenu Biophys. Acta. 442, 324 (1976)) mit -*TP markiert. Die radioaktiv markierte DNA wurde als Sonde für das Screening weiterer E. coli 294-Transformanten durch ein in situ-Kolonie-Testverfahren, Grünstein et al·, wie oben, verwendet. Kolonien wurden isoliert, die mit der Sonde in unterschiedlichen Mengen hybridisierten. Plasmid-DNA aus diesen Kolonien und die oben erwähnten 10 hybridisierenden Kolonien wurde durch Herausschneiden mit Pst isoliert und nach drei verschiedenen Methoden charakterisiert. Zuerst wurden diese Pst-Fragmente durch ihre Eestriktions-Endonuclease-Abbaumuster mit den Enzymen BgI II, Pvu II und Eco EI charakterisiert. Diese Analyse erlaubte die Klassifizierung von wenigstens 8 verschiedenen Typen (Le-IE A, Le-IF B, Le-IF C, Le-IF D, Le-IF E, Le-IF F, Le-IF G und Le-IF H), was die Lokation verschiedener Restriktionsschnitte relativ zu der derzeit bekannten Vorsequenz und. Codiersequenz von Le-IF A nahekommt· Einer von diesen, Le-IF D, ist vermutlich identisch mit dem von Nagata et al., Nature 284, 316 (1980) beschriebenen·

Sodann wurden bestimmte der DlTAs nach einem veröffentlichten Hybridisierungs-Auswahltest, Cleveland et al., Cell 20, 95 (1980), auf ihr Vermögen zur selektiven Entfernung von Le-IF mEEA aus Poly-A-haltiger ES-I-ZeIl-ENA getestet. Bei diesem Test waren Le-IF A, B, C und F positiv· Drittens wurden die letzteren P3t-Fragmente in ein Expressionsplasmid insertiert, E· coli 294 mit dem Plasmid exprimiert und die

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24,8·83

Fragmente ausgedrückt» Die Expressionsprodukte, vermutlich Vor-Interferone, waren alle positiv beim CPE-^est auf Interferon-Aktivität, wenngleich nur am Rande aktiv im Falle des Le-IF-F-Fragments· Außerdem wurden alle beschriebenen Le-IF-Typeri In Sequenzen aufgeteilt. "

Zweites reifes Leukozyten-Interferon

Die Sequenz des isolierten Fragments mit dem Gen für reifes Le-IF-B zeigt, daß die ersten 14 nucleotide der Typen A und B identisch sind· Wir schlügen daher vor, ein fragment aus pLe-IF A 25 zu -isolieren, das den trp-Promoter-Operator, Eibosömen-Bindesteile und den Beginn des Le-IF (A = B)-Gens trägt, und dieses mit dem übrigen Teil der B-Sequenz in einem Expressionsplasmid zu kombinieren.

Um das etwa 950 b.p. Sau 3a- Pst I-Fragment aus der in Fig. 7a dargestellten Sequenz zu erhalten, waren mehrere Schritte nötig aufgrund des Vorliegens einer oder mehrerer störender Sau Sa-Restriktionsstellen, d. h.:

1, Die folgenden Fragmente.wurden isoliert:

a) 110 b.p. aus Sau 3a - Eco EIj

b) 132 b.p. aus Eco EI - Xbaj

c) über 700 b.p. aus XBa - Pst»

2· Die Fragmente (1a) und (1b) wurden gebunden und mit Xba und BgI II gesqbnitten, um Selbstpolymerisation durch Sau 3a u&d Xba-Endsteilen auszuschließen (die relevante Sau-3a-Stelle war innerhalb einer BgI Il-Stelle; BgI II-Sohnitte hinterlassen ein Sau 3a-kohäsives Ende)· Ein 242 b.p,-Fragment wurde isoliert.

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24·8.83

3· Die Produkte von (2) und (1c) wurden verbunden und mit Pst I und BgI II geschnitten, wiederum, um Selbstpolymerisation zu verhindern· Ein Fragment von etwa 950 b,p., Sau 3a -Pst I, wurde isoliert· Dieses Fragment umfaßte den Teil des Le-IF-B-Gens, den Le-IF A nicht hatte·

4. Ein etwa 300 b,p,-Fragment (Hind III - Sau 3a) mit trp-Γ) Promoter-Operator, Ribosomen-Bindestelle, ATG-Startsignal und Cysteincodon von Le-IF A wurde aus pLe-IF A 25 isoliert. "· ' ".

5· Ein etwa 3600 b.p,-Fragment Pst I - Hind III wurde aus pBr 322 isoliert· Dies umfaßte das Replikon und codierte die Tetracyclin-, nicht aber Ampicillin-Resistenz,

6· Die in den Stufen 3, 4 und 5 erhaltenen Fragmente wurden dreifach verbunden und mit diesem Plasmid E, coli K-12-Stamm 294 transformiert·

Kleine Mengen Transformanten wurden minigetestet, Birnboim S/ ' et al·, Nucleic Acid Research £, 1513 (1979)» und Plasmid-Proben wurden mit Eco RI verdaut· Das verdaute Material lieferte 3 Fragmente, charakteristisch für

1) das Eco-RI-Eco RI-trp-Promoter-Fragmentj 2) das innere Eco RI - Eco RI-Fragment von pL4; und 3) das Fragment vom Protein-Translations-Startsignal bis zur Eco RI-Spaltstelle von pL4·

Beim CPE-Test ergeben bakterielle Extrakte von Klonen, herge stellt in der obigen Weise, typischereeise Testwerte von etwa 10 χ 10 Einheiten Interferon-Aktivität pro 1 bei Α 1· Ein so hergestellter repräsentativer Klon ist

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294/pLIF B tip 7.

Weitere reife Leukozyten-Interferone

Weitere Gen-Fragmente voller Länge, die andere Le~IF-Typen haben, können maßgeschneidert und in Expressionsträger zur Expression, wie im Falle von Le-IF A, gebracht werden. Voll-ν ständige Sequenzaufklärung nach herkömmlichen Maßnahmen wird zeigen, ob eine Hestriktionssteile nahe genug dem ersten Aminosäurecodon des reifen Interferon-Typs liegt, um eine bequeme Zuflucht zu der Lösung zu ermöglichen, die Beseitigung der Vorsequenz durch Bestriktionsschnitt und Ersatz der Codons aminoendständig zusammen mit der Vorsequenz verlorengegangenen Aminosäurecodons durch Anhängen eines synthetischen DNA-Fragments, wie oben beschrieben, anzuwenden. Geht dies nicht, kann die oben beschriebene Arbeitsweise von Kleid et al. angewandt werden. Kurz zusammengefaßt gehört hierzu die Spaltung des die Vorsequenz enthaltenden Fragments genau vor dem Punkt, an dem der Codon für die erste Aminosäure des reifen Polypeptids beginnt, und zwar durch

1« Umwandeln der doppelsträngigen DlTA in Einzelstrang-DNA in einem Bereich um diesen Punkt herum j

2· Hybridisieren des in Stufe 1 gebildeten Einzelstrang-Bereichs mit einer komplementären Starter-Sequenz von Einzelstrang-DFA, wobei das 5»-Ende des Starters dem Nuoleotid gegenüberliegt, das an die beabsichtigte Spaltungsstelle grenzt;

3· Wiederherstellung des Teils des zweiten Stranges, in Stufe 1 eliminiert, der in 3'-Richtung des Starters liegt,

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24·8·83

durch Reaktion mit DNA-Polymerase in Gegenwart von Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin enthaltenden Desoxynucleotidtriphosphaten und

4· Abbauen der verbleibenden Einzelstranglänge der MA, die über den gewünschten 'Spaltungspunkt hinwegreicht.

Ein kurzes Stück synthetischer DNA, das am 3'-Ende des codie-'^ renden Stranges mit dem Translations-Startsignal ATG endet, kann dann, z. B. durch Verbinden mit dem stumpfen Ende, an das anfallende maßgeschneiderte Gen für die reifen Interferone gebunden werden, und das Gen in ein Expressionsplasmid eingesetzt und unter die Kontrolle eines Promoters und die zugehörige Ribosomen-Bindestelle gebracht werden·

Ähnlich wie oben wurden Genfragmente mit Codierung für Le-IF-O und Le-IF-D in geeigneter Weise für direkte bakterielle Expression aufgebaut. Die Expressionsstrategie für diese zusätzlichen Leukozyten-Interferone beinhaltete in jedem Falle den Rückgriff auf das etwa 300 b.p.-Fragment . (Hind III - Sau 3a) mit dem trp-Promoter-Operator, Ribosomen-Bindestelle, ATG-Startsignal und Cysteincodon von Le-IF-A von pLe-IF A25· Hiermit wurden Genfragmente aus weiteren Interferbngenen kombiniert, die ihre jeweiligen Aminosäure-Sequenzen über das allen gemeine anfängliche Cystein hinaus codieren. Jedes anfallende Plasmid wurde zur Transformation von E. coli K-12 Stamm 294 verwendet· Bindungen zur Bildung der jeweiligen Gene waren wie folgt:

Le IF-C

Man isoliert die folgenden Fragmente aus pLe IF-C:

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24.8.83

(a) 35 b.p. von Sau 3a bis Sau 96

(b) 900 b.p. Sau 96 bis Pst I

(o) Man isoliert ein etwa 300 b.p.-Fragment (Hind III Sau 3a) aus pLe Ii¹ A-25 wie in Teil N (4) oben.

(d) Man isoliert das etwa 3600 b.p.-Fragment von Teil N (5) oben·' - * .

Konstruktion

1) Man verknüpft (a) und (c). Man spaltet mit BgI II, Hind III und isoliert das Produkt von etwa 335 b.p. (Easenpaaren)·¹

2) Dreifachverknüpfung von 1) + (b) + (d) und Transformieren von E. coli mit ,dem erhaltenen Plasmid.

Ein so hergestellter repräsentativer Elon ist E. coli K-12 Stamm 294/pLe IF 0 trp 35·

Le-IF D

Man isoliert aus pLe IF-D:

(a) 35 b.p. von Sau 3a bis Ava II

(b) 150 b.p. von Ava II bis BgI II

(c) ca. 700 b.p. von BgI II bis Pst I .

Man isoliert aus pLe IF A 25:

(d) 300 b.p. von Hind III bis Sau 3a *.

Man isoliert aus PBr 322:

(e) etwa 3600 b.p. von Hind III bis Pst

Konstruktion ·

1) Man verknüpft (a) + (b), spaltet rait BgI II und reinigt: 185 b.p.-Produkt (1).

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24.8,83

2 0 Man verknüpf t 1) + (d), spaltet mit Hind III, BgI II und

reinigt das ca. 500 b_#p.-Produkt (2).

3 ) Man verbindet (2) + (c) + (e) und transformiert E* coli

mit dem anfallenden Plasmid· .

Ein so hergestellter repräsentativer Klon ist E. coli K-12 Stamm 29VpLeIF D trp 11·

-Le-IF F

Das Le-IF F enthaltende Fragment kann zur direkten Expression durch "Wiederzusammensetzen zurechtgeschnitten werden, bequem gemacht "durch die vollständige Homologie von Aminosäuren 1-13 von Le-IF B und Le-IF F. Ein trp-Promoter-haltiges Fragment (a) mit geeignet konfigurierten Enden wird aus pH(xH"207j oben beschrieben, über Pst I und Xba I-Behandlung mit anschließender Isolierung des ca· 1050 b.ρ»-Fragments erhalten· Ein zweites Fragment (b) wird als größeres der Fragmente aus dem Pst I- und BgI II-Abbau des Plasmids pHky 10 erhalten, ein Derivat von PBE322, das eine BgI II-Stelle zwischen dem Tetracyclin-resistenten Promoter und dem Strukturgen enthält· Fragment (a) enthält etwa die Hälfte des die Ampicillin-Eesistenz codierenden Gensj Fragment (b) enthält den Rest jenes Gens und das gesamte Gen "für die Tetracyclin-Eesistenz, ausgenommen den zugehörigen Promoter· Die Fragmente (a) und (b) werden über T4-Ligase kombiniert und das Produkt mit Xba I und BgI II behandelt, um Dimerisierung zu beseitigen, was zu einem Fragment (c) mit dem trp-Promoter-Operator und Genen.für Tetracyclin- und Ampicillin-Resistenz führt.

Ein Fragment (d) von etwa 580 b,p. wird über Ava II und BgI II-Abbau von pLe IF-F erhalten· Es weist Codons für Aminosäuren 14 - 166 von Le-IF F auf. . . .

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24.8,83

Ein Fragment (e) (49 tup.) wird durch Xba I und Ava II-Abfeaü von pLe-IF B erhalten. Fragment (e) codiert die Aminosäuren 1-13 von Le-IF F. '

Fragmente (c), (d) und (e) werden in Gegenwart von T4~Ligase dreifach verbunden. Die aneinanderhängenden Enden der jeweiligen Fragmente sind so, daß das zusammengesetzte Plasmid korrekt gebildet wird, wobei das Tetracyclin-Resistenz-G-en unter die Eontrolle des trp-Promoter-Operators zusammen mit dem Gen für reifes Le-IF F gebracht wird, so daß mit dem gewünschten Plasmid transformierte Bakterien auf Tetracyclinhaltigen Platten ausgewählt werden können. Ein so hergestellter repräsentativer Klon ist E* coli K-12 Stamm 294 pLeIF F trp. 1.

Le-IF H

Das vollständige Le-IF Η-Gen kann wie folgt zur Expression als ausgereiftes Leukozyten-Interferon konfiguriert werden:

1* Plasmid-pLe-IF-H wird dem Hae II- und Esa I-Abbau Isolierung des 816-Basenpaar-Fragments, das von der Signalpeptid-Aminosäure 10 bis zum 3'-nichtcodierenden Bereich reicht, unterworfen.

2# Das Fragment wird denaturiert, und der Reparatursynthese mit Klenow-Fragment unterworfen, Klenow et al., Proc. Natl. Acad.^Sci. USA 6£, 168 (1970), wobei das synthetische Desoxyribooligonucleotid-Starter 5'-dATG ¹SQT AAT OTG TCT verwendet wird. Diese allgemeine Arbeitsweise wird auch von Goeddel et al·, US-SU I90 799 (25· 9· 1980) beschriebene

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24,8.83

3· Das anfallende Produkt wird mit Sau 3a gespalten und ein 452-Basenpaar ("bp")-Fragment, das die Aminosäuren I-I50 darstellt, wird isoliert.

4V Sau 3a- und Pst I-Abhau von pLeIF H und Isolierung des anfallenden 500 b.p.-Fragments liefert ein Gen, das die Aminosäuren I50 bis zum Ende der codierenden Sequenz codiert.

5* Die in den Stufen (3) und (4) isolierten Fragmente werden zum folgenden Fragment miteinander verknüpft:

1 * " 166 '

met cys asp Stop ATG TGT .._[_..GAT TGA .....Pst I

Sau 3a

das die 166 Aminosäuren von Le-IF H codiert.

6. pLeIF A trp 25 wird mit Xba I aufgeschlossen, mit DUA-Polymerase I mit stumpfem Ende versehen und das Produkt mit Pst I abgebaut. Das große anfallende Fragment kann mit dem Produkt der Stufe (5) zu einem Expressions-Plasmid verknüpft werden, das nach Transformation von E. coli K-12 Stamm 294 oder anderen Wirtsbakterien reifes Le-IF H ' zu exprimieren vermag.

LeIF-I

Die von Lawn et al., Cell 1j5, II57 (1978) konstruierte Genbibliothek des menschlichen Genoms im Phagen X> Charon 4A wurde nach Leukozyten-Interferon-Genen durch von Lawn et al., oben, und Maniatis et al., Cell 1£, 687 (1978) beschriebenen

· "

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24.8.83

Arbeitsweisen durchsucht. Eine radioaktive LeIF-Sonde, aus der cDNA, Klon LeIF A, stammend (Goeddel et al·, Nature 287, 411 (1980)), wurde verwendet, um etwa 500 000 Plaques zu prüfen· Dabei wurden 6 LeIF-Genom-Klone erhalten. Nach erneutem Screening und Plaque-Reinigung wurde, einer dieser Klone, HLeIF2, zur weiteren Analyse ausgewählt.

Nach dem oben beschriebenen Verfahren können weitere Sonden vorteilhaft zur Isolierung zusätzlicher LeIF-Klone aus dem Human-Genom verwendet werden. Diese wiederum können zur Herstellung weiterer Leukozyten-Interferon-Proteine gemäß der Erfindung eingesetzt werden·

1* Das 2000 Basenpaar-Eco SI-Fragment des Genom-Klons

(λ/ HLeIF2) wurde an der Eco Einstelle in pBE325 nochmals kloniert. Das anfallende Plasmid LeIF I wurde mit Eco EI gespalten und das 2000 Basenpaar-Fragment isoliert· Das Desoxyoligonucleotid dAATTCTGCAG (ein Eco RI > Pst I-Konverter) wurde an das 2000 Basenpaar-Exo EI-Fragment geknüpft und das anfallende Produkt mit Pst I"zu einem 2000 Basenpaar-Fragment mit Pst I-Enden gespalten· Dies wurde mit Sau 96 gespalten und ein 1100 Basenpaar-Fragment isoliert, das ein Pst I-Ende und ein Sau 96-Ende aufweist.

2* Das Plasmid pLelF 0 trp 35 wurde mit Pst I und Xba I abgebaut. Das große Fragment wurde isoliert.

3. Das kleine Zba I-Pst I-Fragment von pLelF C trp 35 wurde · mit Xba I und Sau 96 abgebaut. Ein 40 Basenpaar-Xba I-Sau 96-Fragment wurde isoliert.

.4· Die in den Stufen 1), 2) und 3) isolierten Fragmente wurden zu dem Expressions-Plasmid pLelF I trp 1 verknüpft.

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24.8,83

1. Das Plasmid pLeIF J enthält ein 3800-Basen-Hind III-Fragment von Humangenom-DNA, das die LeIF J-Gen-Sequenz aufweist· Ein 760 Basenpaar-Dde I-Rsa-I-Fragment wurde aus diesem Plasmid isoliert.

2, Das Plasmid pLeIF B trp 7 wurde mit Hind III und Dde I gespalten und ein 340 bP Hind III - Dde I-Fragment iso-

^w liert.

3« Das Plasmid pBR322 wurde mit Pst I gespalten, erhielt durch Inkubation mit DHA Pol I (Klenow-Fragment) ein stumpfes Ende, wurde dann mit Hind III verdaut. Das große (ca. 3600 bp) Fragment wurde isoliert.

4. Die in den Stufen 1), 2) und 3) isolierten Fragmente wurden zu dem Expressions-Plasmid pLeIF J trp 1 verknüpft«

Die bei den folgenden Aufbauvorgängen eingesetzten Methoden und Materialien waren wie in der obigen Beschreibung. Die folgende Tabelle 1 liefert die Einzelheiten für den speziellen Zusammenbau von Hybrid-LelF-Plasmiden:

Tabelle 1

LeIF Amino- Expres-Hybrid säuren sionsinsge- Plasmid samt* (Vektor)

"Vorderteil Fragment Aminosäuren Hinterteil

Fragment Aminosäuren

165

166

165

166

165

165

165

Xba I-Pvu II von 1-91 pLeIF A trp 25 (285 bp)

Xba I-Pvu II von 1-92 pLelF D trp 11 (288 bp)

BgI Il-Pst I großes 1-62 Fragment von pLeIF A trp 25

BgI Il-Pst I großes 1-63 Fragment pLelF D trp 11

Xba I-Pvu II von 1-91

LeIF A trp 25 (285 bp)

Xba I-Pvu II von 1-91 LeIF A trp 25 (285 bp)

Xba I-Pvu II.von 1-91 LeIF A trp 25 (285 bp)

anfallendes Expressions-Plasmid

Pvu II-Pst I von 93-166 . pLeIF D trp 11 (~55O-bp)

Pvu Il-Pst I von 92-165 pLelF A trp 25 t~55Obp)

BgI Il-Pst I von 64-166 pLeIF D trp 11 (~600 bp)

BgI II partial- 63-165 Pst I von pLeIF A trp 25 (~7OO bp)

Pvu II partial-Pst I 93-166 von pLeIF B trp 7 (~75O bp)

Pvu II Pst I von pLeIF F trp 1 (^7OO bp)

Pvu Il-Pst I von pLelF.G (-750 bp)

93-166

93-166

pLeIF AD trp (Pvu II)

pLeIF DA trp (Pvu II)

pLeIF AD trp (BgI II)

pLelF DA trp (BgI II)

pLeIF AB trp (Pvu II)

pLeIF AF trp (Pvu II)

pLelF Aß trp (Pvu II)

u>

4=·

fo cn

OO CX3

•

cn u)

UJ

Tabelle 1 (Fortsetzung)

LeIF Amino- Erpres-

Hybrid säuren sions-

insge- Plasmid

samt ^s (Velcbor)

Vorderteil Fragment Aminosäuren Hinterteil anfallendes Fragment Aminosäuren Express ions-

Plasmid

165

166

166

166

166

166

166

Xba I-Bgl II partial von A trp 25 (~

1-150

bp)

Hind III-Pvu II von 1-92 pLeIF B trp (~630 bp)

1-92

1-92

1-92

1-92

1-92

Hind"III-Pvu II von pLeIF B trp (a, 630 bp)

Hind III-Pvu II von pLeIF B trp (^ 630 bp)

Hind III-Pvu II von pLeIF B trp (^ 630 bp)

Xba I-Pvu II von pLeIF D trp II (288 bp)

Xba I-Pvu II von pLeIF D trp II (288 bp) BgI .II-Pst I von LeIF I trp I (a.650 bp)

Pvu II-Pst I von pLeIF A trp 25 (-550 bp)

Pvu II-Pst I von pLeIF D trp 11 (/v/ 550 bp)

Pvu II-Pst I von pLeIF F trp 1 (~ 700 bp)

Pvu II-Pst I pLeIF α (7 bp)

von

Pvu II partial-Pst I von pLeIF B trp 7 (- 750 bp)

Pvu II-Pst I von pLeIF F trp 1 (^ 700 -bp)

151-165 pLeIF Al trp (BgI II)

92-165 pLeIF BA trp (Pvu II)

93*166 pLeIF BD trp (Pvu II)

93-166 pLeIF BF trp (Pvu II)

93-166 pLeIF BG trp (Pvu II)

93-166 pLeIF DB trp (Pvu -II)

93-166 pLelF DF trp (Pvu II)

Tabelle 1 (Fortsetzung)

LeIP Amino- Expres-

Hybrid säuren sions-

insge- Plasmid

samt⁵⁵ (Vektor)

Torderteil Hinterteil

Fragment Aminosäuren Fragment Aminosäuren

anfallendes Expressions-Plasmid

166

166

166

166

166

a Xb a I-Pvu II von 1-92 pLeIF D trp II (288 -bp)

a Xba I-Pvu II von 1-92 pLeIF F trp • (288 bp)

a Xba I-Pvu II von 1-92 pLeIF F trp (288-bp)

a Xba I-Pvu II von 1-92 pLeIF F trp (288 bp)

a Xba I-Pvu II von 1-92 pLeIF F' trp (288 bp) Pvu II-Pst I von 93-166 pLeIF G

(^/ 750 bp)

Pvu II-Pst I von . 92-165 pLeIF A trp 25 (^550 bp)

Pvu II partial-Pst I 93-166 von pLeIF B trp 7 (75O bp)

93-166

93-166

Pvu II-Pst I von pLeIF D trp 11 <>55O bp)

Pvu-II-Pst I von pLeIF G ( bp)

pLeIF DG trp (Pvu-II)

pLeIF FA trp (Pvu II)

pLelF FB trp (Pvu II)

pLeIF FD trp (Pvu II)

pLeIF FG trp (Pvu-II)

166

Xba I-Bgl II von I-I5I BgI II-Pst I von pLeIF I trp 1 . pLelF A trp 25

" bp) (a/430 bp)

152-166 pLelF IA trp (BgI II)

s ohne N-endständiges Methionin

a großes (ca. 3900 bp) Fragment von Xbal bis Pstl-Verdauung von pLeIF A trp 25.

b großes (ca· 3600 bp) Fragment von Hind III bis Pstl-Verdauung von pBE322.

C30 OO

- 37 - 62 803

24.8.83

Unter weiterer Bezugnahme auf Tabelle 1 wurden die ersten vier beschriebenen Hybrid-LelFs aus zwei LelF-Expressions-Plasmiden hergestellt. Eine BgI II-Stellej wie sie LeIP A und D cDNAs gemein ist, wurde zum Aufbau eines Expressions-Plasmids pLelF trp AD (BgI II) verwendet, was die 63 in Aminogruppen endenden Aminosäuren von LeIP A und die 102 als Carboxylgruppen endenden Aminosäuren von LeIP D codiert. Die gleiche Stelle wurde beim Aufbau eines Expressions-' Plasmids pLelP trp DA (BgI II) verwendet, das 64 in Aminogruppen endende Aminosäuren von LeIP D und 102 in Carboxylgruppen endende Aminosäuren von LeIP A codiert.¹ Die Pvu II-^ötelle ist beim Aufbau der beiden anderen Hybrid-Interferon-Expressions-Plasmide verwendet worden: 91 in Aminogruppen endende Aminosäuren von A mit 74 in Carboxylgruppen endenden Aminosäuren von D (pLelP trp AD (Pvu II)) und 92 in Aminogruppen endende Aminosäuren von LeIP D mit 74 in ^; Carboxylgruppen endenden Aminosäuren von LeIP A (pLelP trp DA (Pvu II))· Zusammengefaßt: " ~ " *

pLelP AD trp (PvuII)s Das große (ca. 3900 bp) Fragment eines Xba I- und Pst I-Abbaus von pLelF A trp 25 wurde mit einem 285 bp Xba I-Pvu II-Pragment von pLelP A trp 25 und einem ca. 550 bp Pvu II-Pst I-Pragment von pLelP D trp 11 ver-' knüpf tj " ...-..

pLelP DA trp (Pvu II): Das große (ca. 3900 bp) Fragment von einem Xba I- und Pst I-Abbau von pLelP A trp 25 wurde mit einem 288 bp Xba I-Pvu II-Pragment von pLelP D trp 11 und einem ca. 550 bp Pvu II-Pst I-Pragment von pLelP A trp 25 verknüpft} · " · ~

- 38 - 62 803 11

24.8.83

pLeIF AD trp (BgI II): Da3 große fragment von einem Bgl II-, Pst I-Abbau von pLeIF A trp 25 wurde mit einem ca. 600 bp BgI II-Pst I-Fragmerit von pLelF D trp 11 verknüpft, und

pLelF DA trp -(BsI II) ? Das große Fragment von einem BgI II-, und Pst I-Abbau von pLelF D trp 11 wurde mit einem ca. 700 bp-Fragment, erhalten durch Pst I-Spaltung von pLelF A trp 25 und nachfolgende BgI Il-Verdauung, verknüpft.

Beim 5. angegebenen Hybridi ... -' . pLelF AB trp (Pvu II); Das große (ca. 3900 bp) Fragment von einem Xba I und Pst I-Abbau von pLeIF A trp 25 wurde mit einem 285 bp Xba I-Pvu II-Fragment von pLeIF A trp 25 und einem ca, 750 bp Pvu°II-(partial)-Pst I-Fragment von pLeIF B trp 7 verknüpft. " . ~ \

Ähnlich sind die anderen in tabelle 1 wiedergegebenen Zusammensetzungen festgelegt. Als weiteres Beispiel kann man beim Aufbau eines LeIF O und/oder LeIF H-O?eil enthaltenden Hybrids Vorteil ziehen aus gemeinsamen Bbv !-Stellen, die etwa beim Nucleotid 294 (d. h. GCIGO) der Gen-Sequenzen auftreten.

Ähnlich können Plasmide, die sich zur mikrobiellen E&pres- sion anderer neuer Hybrid-Leukozyten-Interferone eignen, durch geeignete Manipulation der alle oder Teile der Aminosäuresequenz en natürlich auftretender Leukozyten-Interferone codierenden Doppelstrang-DNA gebildet werden. So wird ein erstes Doppelstrang-DNA-Fragment gewählt, das das Aminoende einer ersten, natürlich vorkommenden Leukozyten-Interferon-Aminosäuresequenz und, in 3'-Richtung fortschreitend, einen erheblichen leil der Aminosäuresequenz codiert. Das Fragment

- 39 - 62 803 11

24.8.83

weist eine Eestriktions-Endonuclease-Spaltstelle nahe den Codons für die Aminosäure ^lfn^t! des ersten Leukozyten-Interferons auf, wobei η Aminosäuren einen erheblichen Teil der Aminosäuresequenz des ersten Interferons bilden. Die Spaltung mit der Restrikt ions-Endonuclease liefert ein Fragment mit dem Aminoende des ersten Interferons und Codons für etwa η Aminosäuren. Ein zweites Fragment mit allen oder einem Teil der Codons tür die Aminosäure-Sequenz eines zweiten, anderen (J Leukozyten-Interferons wird gewählt, wobei das Fragment eine Spaltstelle für eine identische Sestriktions-Endonuclease nahe Codons für jene Aminosäure des zweiten Interferons aufweist, deren Aminosäurezahl (vom Aminoende des zweiten Interferons fortschreitend) etwa 166-n ist. Die Spaltung des zweiten Fragments mit der Restriktions-Endonuclease liefert ein Produkt komplementär zu dem "n"-Endte£l des Verdauungsprodukts des ersten Fragments, so daß das Verdauungsprodukt des zweiten mit dem des ersten verknüpft werden kann, unter Rückbildung der Restriktions-Endonuclease-Erkennungsstelle und erneuter Bildung des Codons für die Aminosäure η des ersten Interferons, sofern bei der ersten Verdauung verloren-.gegangen. Das Produkt der Restriktions-Endonuclease-Verdauung des zweiten Fragments läuft vorzugsweise von dem Ende aus ab, das bei der Spaltung in 3!-Stellung durch Nucleotide anfällt, die das Carboxylende des zweiten Leukozyten-Interferons codieren.

Andererseits können Hybride, die erhebliche Teile der Aminosäure-Sequenzen von mehr als zwei natürlich vorkommenden Leukozyten-Interferonen enthalten, gebildet werden, wobei dann z. B. das oben erwähnte zweite Fragment außerdem dazu ausgewählt wird, eine zweite Eestriktions-Endonuclease-Stelle hinter der ersten zu enthalten, wobei die zweite Stelle iden-

- 40 - · 62 803 11

24.8.83

tisch einer ähnlich gelagerten Stelle innerhalb eines Fragments ist, das das Carboxyl-Endteil eines dritten Leukozyten-Interferons codiert usw. In dem genannten Beispiel kön-' nen die Produkte der aufeinanderfolgenden Restriktions-Endonuclease-Sinsätze dreifach verknüpft werden, um ein Hybridgen zu bilden, das den Amino-Endgruppenteil eines ersten Interferons, den Mittelbereich der Aminosäuresequenz des zweiten und den Carboxyl-Endteil des dritten codiert (oder J einer weiteren Variante des ersten, wobei das erste und das dritte Interferon gleich sind).

Vorzugsweise leitet sich das erste oben erwähnte Fragment von einem Expressions-Plasmid ab, d· h. einem solchen, bei dem Codons für den Amino-Endteil des ersten Leukozyten-Interferons als Vorgänger ein ATG- oder anderes Traaslations-Initiations-Codon und einen Promoter oder Promoter-Operatorßystem haben» Im Ergebnis wird das Endprodukt der oben beschriebenen Manipulationen ein Plasmid sein, das das vom Hybridgen in Bakterien oder anderen mikrobiellen, mit den Plasmid transformierten Organismen codierte Polypeptid zu % exprimieren vermag. Weitere Maßnahmen zur Gestaltung des Hybridgens für mikrobielle Expression liegen für den Fachmann auf der Hand.

Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung codieren die Hybridgene eine neue Leukozyten-Interferon-Aminosäure-Sequenz von etwa 165 bis 166 Aminosäuren, ein Konjugat wesentlicher Aminosäure-Sequenzen von zwei oder mehr verschiedenen Leukozyten-Interferonen darstellend, ausgewählt unter LeIF A, LeIF B, LeIF 0, LeIFD, LeIF E, LeIF F, LeIF G und LeIF H, wie"in Fig. 3 dargestellt. Am meisten bevorzugt weisen die neuen, von den Hybridgenen codierten Leukozyten-Interferone

• 41 - . ' 62 803

. 24,8.83

die genannten und wie in der Sequenz "alle" der Fig, 3 angegeben angeordneten Aminosäuren auf. Die Expressionsprodukte von Plasmiden, erfindungsgemäß hergestellt, können in herkömmlicher Welse auf antivirale Aktivität getestet werden, wie in den nachfolgend beschriebenen biologischen Aktivitätsbestimmungen· ." :

nachweis der antivlralen Aktivität

E· coli K-12 Stamm 294 wurden in herkömmlicher Weise unabhängig mit den Plasmiden pLelF trp A 25, pLelF trp D, pLelF trp A/D (BgI II) und pLelF trp D/A (BgI II) transformiert· Die Transf ormanten wurden getrennt in 5 ml-Kulturen in L-Brühe mit 5 mg/ml Tetracyclin zu einem AccQ-Wert von 1,0 gezüchtet, dann in 1 1 M9-Medium mit 5/Ug/ml Tetracyclin verdünnt. Die Zellen wurden geerntet, wenn Accq 1,0 erreich- - te, und die Zellen in 10 ml 15 %iger Saccharose, 50 mmol· . . Tris-HCl (pH 8,0), 50 mmol· EDTA suspendiert. 10 mg Lysozym wurden zugesetzt, und nach 5 ^i^ bei O ⁰C wurden die Zellen durch Schalleinwirkung aufgebrochen. Die Proben wurden 10 min • bei 15 000 UpM in einem Sorvall SM-24-Rotor zentrifugiert. Die Interferon-Aktivität der überstehenden Flüssigkeiten wurde auf antivirale Aktivität getestet.

Die Ausbeuten pro 1 Kultur dieser Interferone, an einem menschlichen Zellstamm (Wish) titriert, sind in Tabelle 2 gezeigt, aus der klar wird, daß die LelF-A/D-Aktivität in größerem Maße hervorgerufen wird als die anderer Interferone·* Dieser Unterschied könnte auf der größeren vorgegebenen Aktivität des LeIF-A/D- oder auf größerer Ausbeute, ausgedrückt in mg Protein dieses Interferons, beruhen. Da die genetische Verbindung für alle diese Interferone identisch war, er-

_;, . - 42 - 62 803

J 24.8e83

scheint es am wahrscheinlichsten, daß LeIF-A/D praktisch eine größere Aktivität als die anderen Interferone besitzt.

Ausbeute an Leukozyten-Interferonen aus Schüttelkolbenkulturen von E, coli *

Art des Interferons Aktivität, Ausbeute/l __ (Einheiten an Wish) +)

A 8 χ 1O⁷

,6

D 5 χ

AD (BgI II) 2 χ 10⁸

DA (BgI II) ^ 1 χ 10⁶

+) getestet durch Hemmung des cytopathischen Effekts an Wish-Zellen mit VSY als Testsubstanz.

Die Wirksamkeit der verschiedenen Interferone in einer Reihe von Säugetier-Zellstämmen wurde bestimmt (vom Menschen Wish; von der afrikanischen grünen Meerkatze Veroj Hamster-• Fibroblast BHKj Nierenzellen vom Kaninchen, EK-13; Maus I-929·, und Einderniere, MDBK-Zellen). Um die relative Aktivität der Interferone zu vergleichen, wurde ihre Aktivität an verschiedenen Zellen, relativ zu ihrer Aktivität an Wish-Zellen als 100 angesetzt, berechnet. Die Ergebnisse in !Tabelle 3 zeigen, daß LeXF-A/D eine sehr hohe Aktivität in VERO und L-929-Zellen hat, während LeIF-D/A eine geringe Aktivität in diesen Zellstämmen hat· Diese Ergebnisse zeigen, daß die Kombination des IT-Endteils von LeIF-A und des C-Endteils von LeIF-D innerhalb eines Moleküls (LeIF-A/D) zu der besonderen Wirksamkeit des Hybrid-Proteins beiträgt, die in verschiedenen Säugetierarten ihren Ausdruck findet. Weiter

- 43 -

62 803 11 24·8.83

sind diese Eigenschaften nicht eine einfache Summierung der Eigenschaften der Ausgangs-Interferone· Dies zeigt sich deutlich im Fall der Aktivität an L-929-Zellen (Tabelle 3), in welchem Fälle weder ein Gemisch aus LeIF-A und LeIF-D noch das andere Hybrid, LeIF-D/A, eine erhebliche Aktivität aufweist· - . - ·

Tabelle 3

Titration verschiedener Leukozyten-Interferone in Zellstämmen aus verschiedenen Säugetierarten

Leukozyten-Interferone A/D D/A AD

Zell	A	B .	A/D	D/A	A+D	Leukozytenfilm in	100
stamm						zentrifugiertem	200
						Blut	20
WISH	100	100	100	100	100	120
VERO	250	75	1670	20	200	0,1
BHK	400	200	833	2000	400
EK-13	12	500	6	N.D·	SUD,
L-929	150	5	33OO	2	10

Interferone, getestet gegen VSV-Infektion der verschiedenen Zellstämme. Aktivitäten ausgedrückt als Prozentsatz der in WISH-Zellen beobachteten Aktivität.^

Die Aktivität von LeIF-A/D gegen andere Viren wurde auch untersucht· Die Daten"in Fig· 5 zeigen antivirale Effekte gegenüber EMC-Virusinfektion von L-Zellen, und die Daten in Fig· 6 zeigen Effekte gegenüber VSV-Infektion von L-Zellen; Aus diesen Daten wird klar, daß die größere Aktivität von LeIF-A/D nicht auf ein Virus (VSV) beschränkt ist und die größere Aktivität offenbar eine allgemeine Eigoaschaft gegenüber vielen Viren ist· Natürliche Human-Leukozytenfilm-

- 44 - 62 803

24.8.83

Interferon-Präparate haben keine Wirkung gegenüber Mauszellen (siehe Tabelle 2). Die Aktivität von LeIF-A/D gegen EMC-Virusinfektiön von CD~1~Mäusen wurde daher untersucht· Die Ergebnisse in Fig. 7 zeigen, daß LeIF-A/D extrem wirksam ist gegenüber letaler EMC-Virusinfektion und LeIF-A auch antivirale Aktivität hat, wie von der Aktivität in Zellstämmen (Tabelle 2) zu erwarten ist. Die Daten in Fig. 7 stammen aus Behandlungen i.p. 3 k vor der Infektion. Die Dosen an LeIF-A/D und LeIF-A sind wie an YiISH titriert.

Letale EMC-Virusinfektion von Hamstern wird auch durch LeIF-A/D und LeIF-A (Fig. 8) beeinträchtigt, wobei ersteres das wirksamste isfr, und Leukozytenfilm-Interferon zeigt nur einen kleinen und statistisch insignifikanten Effekt. Im Falle von Fig. 8 wurden alle Interferone i.p. 3 h vor der Infektion in einer Dosis von 5 χ ICr,ug/kg, titriert an WISH-Zellen, gegeben.

Diese Ergebnisse zeigen an, daß die ausgeprägten antiviralen Effekte von LeIF-A/D bei einer Reihe von Säugetierarten nicht auf Zellkulturen beschränkt sind, sondern auch bei letalen Virusinfektionen beobachtet werden.

EMO-Virus kann als Modellsystem angesehen werden, wobei eine Demonstration der antiviralea Wirkung gegen dieses System eine Voraussage der antiviralen Wirkung gegen die verkörperte Virusfamilie ermöglichen mag, z. B. die Picornavirus-Familie, für die Maul- und Klauenseuche und Polio Vertreter sind. VSV-Virus kann als Modellsystem betrachtet werden, und eine Demonstration der antiviralen Wirkung gegen dieses mag eine Voraussage zur antiviralsn Wirkung gegen die verkörperte Virusfamilie gestatten, z« B. die Rhabdovirus-Familie, deren wichtiger Vertreter Rabies ist.

62 803 11 24.8.83

Tabelle 4 enthält eine Zusammenstellung der Aktivitäten versohiedener LeIF-Hybride an WISH- und MDBK-Zellen und deren AktivitätsverJiältnisse: · · - .

Tabelle 4	Einheiten/1	Einheiten/1	Aktivitäts
LeIF Hybrid	Kultur	Kultur	verhältnis
(Pvli II)	YttSH-Zellen	MDBK-ZeIlen	WISH/MDB
	2.4 x 108	4 χ 107	6
AB	1.2 χ 108	2 χ 107	6
AD	6 χ 107	1 χ 107	6
AF	4 x 107	1,5 x 107	2.7
AG	3.2 χ 107	1.2 χ 107	2.7
AI	1.5 x 107	1 χ 107	1.5
BA	6 χ 107	1.5 χ 107	4
BD	1 χ 106	3.5 χ 105 .	0.3
BF	2 χ 107	6 χ 107	0.3
BG	3 χ 106	1.2 χ 108	0.025
DA	2 χ 106	5 x 107	0.04
DB	2 χ 105	4 χ 106	0.05
DF	2 χ 105	1.5 x 107	0.014
DG	2 χ 105	6 χ 107	0.003
FA	2 χ 106	8 χ 107	0.025
FB	1 x 107	2 χ 107	0.5
FD	1 χ 106	4 x 107	0.025
FG	2.4 χ 106	6 χ 107	0.04
IA	8 χ 107	1.3 x-108	0.7
A35	8 . 107	4 χ 108	0.-2
B35	2 χ 107	1.5 x 107	1.3
C*	5 x 106	1.5 X 107	0.2
DS	2 χ 107	2 χ 108	0.1
F*	1.6 χ 107	1.2 χ 107	1.3
Is

» zu Vergleichsaweoken

- 46 - 62 803 11

' ' 24·8.83

Parenterale Verabreichung;

Die Hybrid-Leukozyten-Interferone können Personen, die Antitumor- oder antivirale Behandlung benötigen, und solchen, die immunsuppressive Bedingungen zeigen, parenteral verabreicht werden. Dosierung und Dosisrate können denen gleichen, die derzeit bei klinischen Untersuchungen von aus Menschen stammenden Materialien angewandt werden, z. B. etwa (1 bis 10) χ 10 Einheiten täglich, und im Falle von Materialien größerer Eeinheit als 1 %, ohne weiteres bis zu beispielsweise 5 x 10' Einheiten täglich. Vorläufige Hinweise bei der oben beschriebenen Affenuntersuchung lassen vermuten, daß Dosierungen von bakteriell erhaltenem Le-Ii¹ zwecks größerer Wirkung erheblich erhöht werden könnten, dank dem praktischen Fehlen von anderen menschlichen Proteinen als Le-IF, die in aus Leukozyten stammenden Materialien als Fieber erzeugende Stoffe wirken können und dabei nachteilige Effekte, z. B. Unwohlsein, Temperaturerhöhung, usw» zeigen.

Als ein Beispiel für eine geeignete Dosierungsform für im wesentlichen homogenes bakterielles Le-IF in parenteraler Form, hier mit den nötigen Änderungen anzuwenden, können

3 mg Le-IF der spezifischen Aktivität von z, B. 2 χ 10- E/mg in 25ml 5 η Serumalbumin (human) -USP gelöst werden, die Lösung durch ein bakteriologisches Filter geführt und die filtrierte Lösung aseptisch in 100 Ampullen unterteilt werden, von denen diese 6 χ 10° Einheiten^reines Interferon, für parenterale Verabreichung geeignet, enthält. Die Ampullen werden vor ihrer Verwendung vorzugsweise in der Kälte (-20 ⁰C) gelagert.

- 47 - 62 803 11

%. 24.8.83

""ΐί :< *

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können nach bekannten Methoden zur Herstellung pharmazeutisch brauchbarer Mittel zusammengestellt werden, wodurch das Polypeptid mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger zusammengemischt wird« Geeignete Träger und deren Zusammenstellung sind in Remington's Pharmaceutical Sciences von E. W. Martin beschrieben, dessen Offenbarung durch diese Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen wird. Solche Mittel ent- Cj) halten eine -wirksame Menge des Interferon-Proteins zusammen mit einer geeigneten Menge eines Trägers zur Herstellung pharmazeutisch annehmbarer Mittel, die sich zur wirksamen Verabreichung eignen.

Claims (5)

1. Verfahren zur Bildung doppelsträngiger, hybride Human-Leukozyten-Interferone von etwa 165 bis 166 Aminosäuren kodierender DNS, gekennzeichnet dadurch, daß man

a) ein erstes doppelsträngiges DNS-Fragment, das die gesamte oder den aminoendständigen "Teil der Aminosäuresequenz eines ersten, natürlich vorkommenden Leukozyten-Interferons kodiert und das eine Restriktionsstelle für eine bestimmte Endonuclease aufweist, mit dieser Sndonuclease spaltet,

b) ein zweites doppelsträngiges DNS-Fragment, das die gesamte όder^ den carboxylendständigen Teil der Aminosäuresequenz eines anderen natürlich vorkommenden Leukozyten-Interferons kodiert und eine identische Endonuclease-Eestriktionsstelle an vergleichbarer Position bezüglich der Aminosäuresequenz- der beiden Interferone aufweist, mit der gleichen Endonuclease spaltet und

c) das aminoendständige DNS-Fragment des ersten Interferons mit dem carboxylendständigen DNS-Fragment des zweiten Interferons zusammenfügt,

2·* Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das erste natürlich vorkommende Leukozyten-Interferon LeIF-D und das zweite natürlich vorkommende-Leukozyten-Interferon LeIF-A ist.

3* Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das erste natürlich vorkommende Leukozyten-Interferon LeIF-A und das zweite natürlich vorkommende Leukozyten-Interferon LeIF-D ist.

- 49 -τ 62 803 11

%, 24,8,83

4·· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das erste natürlich vorkommende Leukozyten-Interferon LeIF-A und das zweite natürlich vorkommende Leukozyten-Interferon LeIF-B ist· · .

5·' Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das erste natürlich vorkommende Leukozyten-Interferon LeIF-A und das zweite natürlich vorkommende Leukozyten-Interferon LeIF-F ist.

Zeichnungen