CN102264761A - 重组生产的干扰素的提纯 - Google Patents
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Abstract
本发明提供将所需干扰素同工型与不需要的干扰素同工型分离的方法,其包括对这些同工型施以阴离子交换柱色谱法和两阶段洗脱程序。在第一洗脱阶段中使用强洗脱溶液以促进所需同工型从该柱中洗脱,在第二阶段中使用弱洗脱溶液以抑制所需同工型的洗脱。
Description
发明领域
本发明涉及由重组生物体生产的干扰素的提纯。本发明特别涉及所需干扰素同工型,例如具有所需二级二硫键结构并缺乏化学加合物的同工型与此类生物体生产的不需要的干扰素同工型的色谱分离。
发明背景
干扰素是表现出抗病毒、抗增殖和免疫调节活性的细胞因子。由于这些活性,不同类型的干扰素已被批准用于治疗疾病,如肝炎、各种癌症和多发性硬化。
干扰素(IFNs)可以根据它们的生物和物理性质分成三大类。在人体中,I型IFNs由五类构成:alpha (IFN-α)、beta (IFN-β)、epsilon (IFN-ε)、kappa (IFN-К)和omega (IFN-ω)。干扰素gamma (IFN-γ)是唯一已知II型干扰素。III型包括IFN-λ。参见,例如,Antonelli, G., New Microbiol. 31:305-318 (2008)。
在人和许多其它物种中表达IFN-α蛋白质的多种亚型,在人体中识别了12种不同的成熟亚型(Bekisz, J.等人, Growth
Factors 22(4):243-251 (2004);Antonelli,
G., supra;Pestka, S.等人, Immunol. Reviews 202:8-32 (2004);Diaz, M.O.,等人, J.
Interferon Cytokine Res 16:179-180 (1996))。人IFN-α亚型共享75-99%氨基酸序列同源性和166 a.a.的成熟序列,IFN-α2除外,其由于在位置44处的缺失而具有165 a.a.。一些IFN-α亚型也以变体形式存在,如具有至少3种等位形式的IFN-α2:IFN-α2a、IFN-α2b和IFN-α2c。
I型IFNs共享的最保守特征是二硫键:在IFN-α和IFN-ω中存在2个二硫键,而在IFN-β中存在一个。IFN-α中的二硫键在Cys1-Cys 99(98)和Cys29-Cys139(138)之间,括号中的残基数是指IFN-α2。IFN-β中的单个二硫键在Cys31-Cys141之间。IFN-α
Cys29-Cys139(138)和IFN-β Cys31-Cys141键对这些IFNs键合到I型IFN受体复合物上并因此对它们生物活性的保持而言明显至关重要(Bekisz等人,见上文)。
尽管IFNs可以由它们的天然来源获得,但重组技术能够由已用编码所需IFN蛋白质的DNA分子转化的非天然来源,如细菌和其它微生物生产大量的这些蛋白质。重组生物体生产IFNs通常包括多步提纯法,包括在各种介质上的色谱法以除去源自宿主生物体或培养基的污染物以及想要生产的IFN蛋白质的结构同工型。参见,例如,美国专利号US 4765903、US
5196323;欧洲专利号EP 108585、EP
110302;EP 118808和EP
0679718;Staehelin等人, J.
Biol. Chem 256:9750-9754 (1981);和Secher等人, Nature 285:446-450 (1980)。
例如,未提纯和部分提纯的重组IFN-α制品常常含有要生产的IFN-α亚型的结构同工型的混合物。结构同工型可分成三大类:(1)二硫键同工型,(2)化学附加(chemical adjunct)同工型,和(3)具有改变的二硫键结构以及一种或多种化学附加物的混合同工型。二硫键同工型包括各含Cys1-Cys 99(98)和Cys29-Cys139(138)二硫键的氧化IFN-α单体同工型;分别不含一个或两个这些二硫键的部分和完全还原的单体IFN-α同工型;IFN-α单体的片段;和通过分子间二硫键形成的IFN-α低聚物,即二聚物、三聚物和四聚物。含有连接到IFN-α氨基酸链上的一个或多个化学基团的化学附加同工型包括:丙酮酸盐-附加的IFN-α同工型,其中该IFN-α蛋白质的N-末端氨基酸残基的α-氨基与丙酮酸盐的羰基缩合;和甲硫氨酸附加的同工型(国际专利申请公开WO 00/29440;美国专利No. 5,196,323)。重组IFN-α-2b的结构同工型的实例显示在图1中。
对治疗性干扰素组合物而言,通常不希望存在氧化单体IFN同工型以外的显著量同工型,因为担心此类同工型可能不利地影响该干扰素组合物的治疗或免疫性质。已经描述用于将不需要的结构同工型转化成所需同工型的各种技术。例如,美国专利No.
4,432,895涉及使用氧化还原剂将低聚干扰素转化成单体,WO 00/29440描述了依序从化学附加同工型中裂解丙酮酸根基团和将还原的巯基氧化成二硫键。但是,尽管此类同工型转化技术通常改进所需IFN同工型的收率,仍可能存在显著量的不需要的结构同工型,即使在转化步骤后进行阴离子交换色谱法。因此,需要改进重组IFN制品中所需的天然同工型(例如氧化的)与不需要的同工型的分离。本发明致力于解决这种需要。
发明概述
本发明基于本发明人的令人惊讶的发现,即使用新型两阶段洗脱程序而非标准单阶段洗脱程序对基本提纯的重组IFN-α-2b制品施以二乙基氨基乙基阴离子交换(DEAE)色谱法能将所需的氧化IFN-α-2b单体(图1中的同工型1)与不需要的同工型,特别是丙酮酸盐附加的、完全还原的单体(图1中的同工型4)有效分离。第一洗脱阶段促进所需IFN-α-2b同工型的洗脱,而第二洗脱阶段抑制不需要的同工型的洗脱。这种两阶段洗脱程序以低洗脱液体积和所需同工型的高收率产生高纯IFN-α-2b制品。本发明人在此预计,这种新型色谱程序也可用于有效分离其它IFN-α亚型和其它IFNs的结构同工型。
因此,一方面,本发明提供在重组生产的IFN同工型的混合物中将IFN的氧化单体同工型与该IFN的不需要的同工型分离的方法。
该方法包括提供在第一缓冲液中的IFN混合物和大于15厘米长并填充着用第一或第二缓冲液平衡的阴离子交换树脂的色谱柱。
将缓冲的IFN溶液加载到该柱上,随后用洗涤溶液洗涤该加载后的柱。
接着,通过将1至10床体积的强洗脱溶液施加到该洗过的柱上来进行第一洗脱阶段。该强洗脱溶液用10至30 mM的第一磷酸盐浓度缓冲并具有5.4至6.6的pH。
随后通过对该柱施加2至20床体积的弱洗脱溶液来进行第二洗脱阶段。该洗脱溶液用小于强洗脱溶液中的磷酸盐浓度的第二磷酸盐浓度缓冲。
为了获得高纯的所需IFN同工型,收集含有所需同工型的多个洗脱级分。任选合并其中不需要的干扰素同工型的量小于所需纯度标准的洗脱级分。
在一个优选实施方案中,本发明提供在重组生产的IFN-α2b同工型的混合物中将IFN-α2b同工型1与IFN-α2b同工型4分离的方法。
将IFN-α2b溶液在基本由10 mM Tris、40 mM
NaCl构成并具有7.5至8.0的pH的负载缓冲液中加载到平衡DEAE色谱柱上。该DEAE柱的长度为至少大约20厘米并用基本由10 mM Tris构成且pH为8.0的缓冲液平衡。加载流速为2厘米/分钟。
用3床体积的洗涤溶液以2厘米/分钟的流速洗涤该加载后的柱。该洗涤溶液基本由10 mM
Tris和13 mM NaCl构成并具有8.0的pH。
接着,以1厘米/分钟的流速对该柱施加6床体积的强洗脱溶液,接着以1厘米/分钟的流速施加弱洗脱溶液。该强洗脱溶液基本由pH
5.85的17.5 mM磷酸钠构成,且该弱洗脱溶液基本由pH
5.85的5 mM磷酸钠构成。
收集含有IFN-α2b同工型1的柱洗脱物级分,并任选仅合并其中IFN-α2b同工型4小于所需纯度标准的那些收集的级分。
附图简述
图1图解重组IFN-α-2b制品中常见的四种结构同工型。
图2图解使用20 mM磷酸钠、20 mM NaCl,pH 6作为洗脱缓冲液从DEAE Sepharose Fast Flow柱(1cm x
23 cm)中进行标准单阶段洗脱IFN-α2b同工型的结果,图2A显示在洗脱步骤中形成的pH梯度,图2B显示同工型1(IFN-α)和同工型4(ISO4)的洗脱分布,图2C显示各级分的纯度。
图3显示在仅使用负载缓冲液(对照物)或在相同负载缓冲液中的基本纯化的IFN-α-2b制品(IFN)作为进料的标准DEAE色谱法过程中获得的pH分布。
图4图解内部pH梯度对使用指定洗脱条件从DEAE Sepharose Fast Flow柱中洗脱IFN-α-2b的影响,左图显示A280吸光度、电导率和pH分布的覆盖图,右图显示通过RP-HPLC检测法测得的同工型1和同工型4的分离度。
图5图解在基本纯化的IFN-α-2b制品的标准DEAE色谱法过程中未洗脱的材料的表征,图5A和图5B分别显示通过RP-HPLC和SDS-PAGE从该柱中脱除(strip)的级分的分析。
图6图解从该柱中脱除并暴露在所示pH下的未洗脱材料在OD320和OD320/280下的吸光度。
图7图解0.5 cm X 20 cm柱上的IFNα-2b制品的DEAE色谱法,图7A显示pH梯度和吸光度状况,图7B显示同工型1和4的洗脱分布,图C显示各种洗脱级分中同工型1和4的百分比。
图8显示通过在含有20 mM磷酸钠/20 mM NaCl (20/20)、10 mM磷酸钠/20 mM NaCl (10/20)或5 mM磷酸钠/20 mM NaCl (5/20)的pH
6.0洗脱缓冲液中从DEAE色谱柱中洗脱IFNα-2b而获得的吸光度、pH和电导率状况。
图9图解洗脱缓冲液浓度对IFNα-2b的DEAE色谱法的影响。
图10图解盐浓度对通过在含有20 mM磷酸钠和20 mM NaCl (20/20)、10 mM
NaCl (20/10)、5 mM mM NaCl (20/5)盐浓度或不存在NaCl (20/0)的pH
6.0 洗脱缓冲液中从DEAE色谱柱中洗脱IFNα-2b而产生的吸光度、pH和电导率状况的影响。
图11图解由不同盐浓度产生的不同离子强度对从DEAE色谱柱中洗脱IFNα-2b同工型1和4的影响。
图12图解NaCl对在pH 6.0的10 mM磷酸钠缓冲液中的IFNα-2b同工型1和4洗脱的影响。
图13图解缓冲液和盐浓度对IFNα-2b同工型1和4的分离的影响。
图14图解pH对使用标准单阶段洗脱法的IFNα-2b洗脱的影响。
图15-27描述在实施例中。
发明详述
I. 定义
为了更容易理解本发明,下面具体定义某些术语。除非下文或本文中其它地方明确地另行指明,本文所用的所有其它术语,特别是科学和技术术语在与本文所用的那些类似的背景中使用时具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
除非文中清楚地另行规定,本文,包括所附权利要求中所用的单数形式的词语,如“a”、”an”和“该”包括它们相应的复数对象。
在用于修饰用数字规定的参数,例如流速、pH、磷酸钠浓度时,“大约”是指该参数可以在规定数值以上或以下变动多达10%。因此,例如,术语“大约2厘米/分钟的流速”是指该流速可具有1.8厘米/分钟至2.2厘米/分钟的任何数值。类似地,术语“大约10 mM Tris”是指Tris浓度可具有9.9 mM至10.1 mM的任何数值。
说明书和权利要求书通篇所用的“基本由...构成”和其变型是指包括任何列举的要素或要素集合并任选包括不会实质性改变指定组合物或项目的基本性质的具有与列举的要素类似或不同的性质的其它要素。作为非限制性实施例,基本由5 mM磷酸钠构成且pH为5.85的弱洗脱溶液还可以例如含有次要量的其它试剂,例如磷酸钾,其不会实质性影响该洗脱溶液的pH、缓冲能力或在将所需IFN同工型与不需要的同工型分离方面的其它性质。
“Iso1”或“ISO1”是指图1中所示的IFN-α2b同工型1。
“Iso4”或“ISO4”是指图1中所示的IFN-α2b同工型4。
“NaPi”是指磷酸钠。
“氧化IFN单体同工型”是指具有该IFN的天然二硫键结构且在多肽链中的任何氨基酸上没有化学附加物的单多肽链。天然二硫键结构是指该同工型中Cys-Cys键的数量和位置与天然表达的干扰素中相同。因此,例如,氧化IFN-β单体同工型在Cys31-Cys141之间具有单二硫键,而氧化IFN-α2a单体同工型具有Cys1-Cys99键和Cys29-Cys139键。
“还原IFN单体同工型”是指具有少于该IFN的天然二硫键数的二硫键且在多肽链中的任何氨基酸上没有化学附加物的单多肽链。还原IFN单体同工型可以根据天然形成的二硫键的数量部分或完全还原。因此,例如,部分还原的IFN-α2b单体同工型缺乏Cys1-Cys98键或Cys29-Cys138键,而完全还原的IFN-α2b同工型缺乏这两种键。
“混合IFN单体同工型”是指具有少于该IFN的天然二硫键数的二硫键且在多肽链中具有至少一个被化学附加物改性的氨基酸的单多肽链。
II. 优选实施方案描述
本发明提供将重组IFN制品中的所需IFN同工型,例如氧化的单体同工型与不需要的IFN同工型,例如还原的IFN同工型分离的色谱法。该方法适合从任何人或非人动物物种天然表达的任何重组生产的IFN中提纯所需同工型,包括任何I型、II型或III型IFN,或它们的嵌合或突变形式,其中已引入序列变异以例如提高稳定性或活性,如美国专利Nos. 5,541,293、4,897,471和4,695,629中描述的复合干扰素和美国专利Nos. 4,414,150、4,456,748和4,678,751中描述的含有不同亚型序列的组合的杂交干扰素。
本发明的方法优选用于从重组生产的I型IFNs中分离所需和不需要的同工型。特别优选的I型IFNs是重组生产的IFN-α蛋白质,包括任何天然存在的亚型IFN-α1、IFN-α2、IFN-α4、IFN-α5、IFN-α6、IFN-α7、IFN-α8、IFN-α10、IFN-α13、IFN-α14、IFN-α16、IFN-α17、IFN-α21、任何这些亚型的等位变异体或任何复合IFN-α蛋白质,其中已通过在各位置选择在各种天然IFN-α亚型中在该位置最常出现的氨基酸来设计氨基酸序列。更优选地,本发明中所用的重组生产的IFN-α蛋白质是IFN-α2 (2a, 2b或2c),最优选是IFN-α2b。
用于表达重组IFN的宿主生物体可以是原核生物或真核生物,例如大肠杆菌、枯草杆菌或酿酒酵母,优选大肠杆菌。各种宿主生物体的培养条件是本领域技术人员公知的并详细描述在例如Maniatis等人的教科书("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor
Laboratory, 1982)和Sambrook等人的教科书("Molecular Cloning-A Laboratory Manual", 第2版, Cold Spring
Harbor Laboratory, 1989)中。特别地,人IFN-α2蛋白质的重组生产描述在Pestka, S. Arch
Biochem Biophys. 221:1-37 (1983);国际专利申请公开WO
2004/039996;美国专利号US 5661009、US
5541293、US 4897471、US
4765903和US 4530901;和欧洲专利申请公开EP
032,134中。
可以使用本领域中已知的各种程序从重组宿主或培养基中提取重组IFN蛋白质。例如,在美国专利号US
4315852、US 4364863和US
5196323;欧洲专利号EP 0679718;和WO
2004/039996中描述了从微生物中提取IFN-α的合适方法。
在提取后,优选对包含结构同工型混合物的重组IFN制品施以一组提纯步骤以制造基本纯的IFN制品,这是指该制品基本不含非-IFN蛋白质和其它污染物,如细胞碎片和核酸,但可能含有最多20%的不需要的结构IFN同工型。本领域中已知的许多提纯方案适用于此目的。此类方案通常包括如U.S.
5196323、US 4765903、EP
0679718和WO 2004/039996中所述的在两种或更多种不同类型的树脂上的串联色谱法。
由这种串联色谱法获得的基本纯的IFN蛋白质制品通常包含缓冲溶液。根据这种溶液的组成以及其中的IFN浓度,可能必须通过调节该溶液以包含适合阴离子交换色谱法的负载缓冲液的组分来制备这种IFN溶液以加载到本发明中所用的阴离子交换柱上。可以通过本领域中已知的技术,如渗析或超滤进行这种调节。
该负载缓冲液可以是不影响IFN蛋白质结合到阴离子交换树脂上的任何生物相容的缓冲液。例如,该负载缓冲液可含有0至100 mM的盐,如NaCl、KCl和乙酸钠。优选的负载缓冲液基本由大约10 mM
Tris、0至40 mM
NaCl构成并具有7.0至8.5的pH。特别优选的负载缓冲液由10 mM Tris、40 mM NaCl构成并具有8.0的pH。
该负载缓冲液中的IFN 浓度可以显著变化。通常,调节该负载缓冲液的体积以实现便利的加载体积,例如0.5至1床的色谱柱体积并避免IFN沉淀。在一些实施方案中,使用大约1至大约5毫克/毫升的IFN浓度。对IFN-a2制品而言,同工型1的优选浓度为大约3.5毫克/毫升。可以使用本领域已知的技术,如RP-HPLC和WO
00/29440中描述的丙酮酸盐检测法识别和量化重组IFN制品中存在的各种同工型。
作为阴离子交换色谱法的树脂,二乙基氨基乙基阴离子交换(DEAE)介质是优选的,特别优选的树脂是来自GE
Healthcare (Uppsala Sweden或Piscataway, NJ
USA)的具有Q-Sepharose Fast Flow (FF) 的DEAE(DEAE Sepharose™ FF)。也可以使用具有与DEAE基本类似的性质的其它弱阴离子交换树脂。
将阴离子交换填充到长度大于15厘米的色谱柱中。在一个优选实施方案中,该柱为至少20厘米长。适用于本发明的其它柱尺寸包括1 x 29 cm柱。
在加载IFN溶液之前,用适合该阴离子交换树脂和IFN的缓冲水溶液平衡该阴离子交换柱。该平衡缓冲液可以与负载缓冲液相同或不同。在一个优选实施方案中,用基本由10 mM
Tris、0-40 mM NaCl构成且pH为7.0至8.5的缓冲液平衡该柱。在另一优选实施方案中,该平衡缓冲液由10 mM
Tris, pH 8.0构成。如果该柱之前已用过,其方便地通过用3床体积(B.V.)的0.5 N NaOH/1 M
NaCl;5 B.V.的H2O;3 B.V.的0.1 N HCl;6 B.V.的0.2 M Tris, pH
8.0和15 B.V.的10 mM
Tris, pH 8.0(都使用5厘米/毫升的流速)相继洗涤来再生和平衡。
在将缓冲的IFN溶液加载到该柱上后,向该柱施加洗涤溶液以除去未结合的污染物。该洗涤溶液含有不影响IFN与该柱的结合的生物相容缓冲液。例如,在一些实施方案中,该洗涤缓冲液具有与柱平衡缓冲液或负载缓冲液相同的组成,例如基本由10 mM
Tris、0-40 mM NaCl构成且pH为7.0至8.5。在一个优选实施方案中,该洗涤溶液由10 mM
Tris、13 mM NaCl构成并具有8.0的pH。
随后使用两阶段洗脱系统从该柱中洗脱所需同工型。通过向该柱相继施加两种缓冲溶液,建立这种两阶段系统:例如具有高离子强度和/或低pH的强洗脱溶液,接着例如具有与该强洗脱溶液相比更低离子强度和/或更高pH的弱洗脱缓冲液。
方便地,用磷酸盐缓冲这些洗脱溶液,但可以使用其它生物相容的缓冲液。强洗脱溶液中的磷酸盐浓度为10 mM至30 mM,在弱洗脱溶液中更低,例如2.5至7.5 mM。强和弱洗脱溶液中的磷酸盐浓度差随这两种洗脱溶液之一或两者中是否存在影响离子强度的其它试剂,例如NaCl或其它盐,以及各洗脱溶液的pH而变。例如,如果强洗脱溶液的pH低于弱洗脱溶液,则磷酸盐差可能略低。通常,强和弱洗脱溶液各自具有酸性pH,优选在5.4至6.6的范围中。技术人员可以容易测试强和弱洗脱溶液各自的缓冲液、盐和pH的各种组合以获得用于特定类型IFN的两阶段系统。
为了制备磷酸盐缓冲的洗脱溶液,可以使用磷酸一钠和磷酸二钠之一或两者并用合适的酸或碱,如HCl或NaOH调节pH。除磷酸钠外还可以额外使用其它磷酸盐,如磷酸钾,或可以使用其它磷酸盐,如磷酸钾代替磷酸钠。
在一个优选实施方案中,使用基本由17.5 mM磷酸钠,pH
5.85构成的强洗脱溶液和基本由5 mM磷酸钠,pH 5.85构成的弱洗脱溶液进行两阶段洗脱。
在切换成弱溶液前使用的强洗脱溶液的量通常为1至10床体积(B.V.),但可以凭经验针对任何特定的IFN和洗脱溶液组合确定。仅使用所选强洗脱溶液进行试验色谱法并监测洗脱级分中的IFN存在。比在单阶段洗脱中洗脱第一含IFN的级分所需的强洗脱溶液的床体积数少1个床体积通常是在两阶段系统中使用的强溶液的最大体积。在一个实施方案中,施加4至8 B.V.的强洗脱溶液。在更优选的实施方案中,用大约6
B.V.的强洗脱溶液进行第一洗脱阶段。
可以使用2至20 B.V.的弱溶液进行第二洗脱阶段,取决于需要多少来洗脱充足收率的所需同工型。例如,在一些情况下,可能需要收集还原的或化学附加的IFN同工型以研究其性质。在一个优选实施方案中,在6 B.V.的强洗脱溶液后对该柱施加大约15
B.V.的弱溶液。
所有上述溶液和缓冲液通常以0.2至10厘米/分钟的流速施加到阴离子交换柱上。所用流速将取决于若干因素,如实施该色谱法的设备、阴离子交换树脂的类型、柱尺寸、IFN溶液中的蛋白质浓度和洗脱溶液的组成。技术人员可以容易确定各步骤的合适流速。在一些实施方案中,以1至5厘米/分钟的流速施加负载缓冲液、洗涤溶液和洗脱溶液。在另一些实施方案中,流速为0.5至2.5厘米。优选使用2厘米/分钟的流速施加负载缓冲液和洗涤溶液,而洗脱溶液以1厘米/分钟的流速施加。
实施例
提供下列实施例以更清楚描述本发明且不应被视为限制本发明的范围。
本发明人进行一系列实验以研究使用DEAE-Sepharose Fast Flow色谱法分离重组生产的IFN-α2b同工型时涉及的机制。测试各种洗脱条件,包括缓冲液浓度、盐浓度和pH以阐明IFN-α2b同工型与DEAE Sepharose的相互作用。发现在同工型1和4的分离中涉及两种截然不同的机制。
第一机制符合色谱聚焦原理,其特征在于在柱内形成pH梯度并广泛用于根据它们的等电点提纯各种蛋白质,特别是密切相关的同工型。在使用下述标准方法提纯IFN-α2b的DEAE色谱法中,在洗脱过程中主要由于缓冲物类与DEAE树脂的相互作用而沿柱长度生成内部pH梯度。本发明人发现,沿该pH梯度,在不同pH下洗脱同工型1和4。根据常规色谱聚焦中的缓冲液浓度、pH梯度斜率和柱分离度之间的关系,可以使用较低浓度磷酸盐洗脱缓冲液降低pH梯度斜率以改进同工型1和同工型4的分离度。
第二机制涉及在同工型1的洗脱过程中同工型4选择性结合到该柱上。本发明人发现,同工型4在不存在盐的情况下在更低缓冲液浓度下更牢固结合到该柱上并因此可以在这些条件下有效地与同工型1分离。但是,同工型1的洗脱效率在较低缓冲液浓度下降低;因此,含有同工型1的汇集级分的体积始终大于有效商业蛋白质生产法所需的体积。
因此,本发明人进行第二系列实验以观察它们是否可确定在抑制IFN-α2b同工型4洗脱的同时实现IFN-α2b同工型1的稳固和有效洗脱的条件。
下面更详细描述这两个系列的实验,结果显示在图2-27中。在这些图中,术语IFN、IFN-a或IFN-alpha是指如图1中所示的IFN-α2b同工型1,术语iso4和ISO4是指如图1中所示的IFN-α2b同工型4。
I. 实验程序
DEAE SepharoseTM Fast Flow
色谱法。
使用AKTAexplorerTM (GE
Healthcare, Uppsala Sweden或Piscataway, NJ
USA)在4℃下进行DEAE色谱法。在0.5x20厘米柱(3.9毫升)或1 X 29厘米柱(23毫升)中填充DEAE SepharoseTM FF树脂 (GE Healthcare)。将足够树脂倒入该柱并在重力下沉降以形成在所需高度上方大约1厘米的初始床高。该柱用3床体积(B.V.)的0.5 N NaOH/1 M NaCl、5
B.V.的H20, 3 B.V.的0.1 N HC1、6 B.V.的0.2 M Tris, pH 8.0和15
B.V.的10 mM Tris, pH 8.0以5厘米/毫升的流速再生和平衡。
重组
IFN-
α
2b
制品
我们获得已在重组大肠杆菌中生成并通过一系列提纯步骤基本提纯的IFN制品。在含有10 mM Tris、40 mM
NaCl,pH 7.5-8.0的负载缓冲液中提供该IFN制品。
标准色谱法程序
将IFN溶液注射到用10 mM
Tris,pH 8以在3.9毫升柱的情况下0.4毫升/分钟或在23毫升柱的情况下0.8毫升/分钟的流速平衡的柱上。加载的IFN溶液的体积为柱B.V.的75%。使用3 B.V.的洗涤缓冲液(10 mM Tris,13 mM NaCl,pH
8.0)以相同流速从该柱中除去未结合的材料。最后,以0.2毫升/分钟的流速使用9 B.V.的20/20洗脱缓冲液(20 mM磷酸钠,20 mM NaCl,pH
6.0)以启动洗脱步骤。以每级分20% B.V.(0.8毫升)收集级分。通过RP-HPLC分析同工型1和4。通过将两个同工型峰的距离除以半峰高下的峰宽之和,计算同工型的分离度。
试验色谱法程序
为了检查IFN洗脱行为,使用标准程序但使用如结果和论述部分中所述的不同洗脱缓冲液进行DEAE色谱法。除非另行指明,流速与传统程序中的那些相同。
II. 结果和论述 – 实验系列I
A.
在
IFN
DEAE
色谱法过程中的内部
pH
梯度的形成
监测标准DEAE色谱法程序中的UV吸光度、电导率和pH并显示在图2中。观察到三个UV峰,细菌蛋白质为早期小峰,IFN-α2b同工型1为主要中间峰,接着是作为后期宽次要峰的IFN-α2b同工型4和其它污染物。
有意思地,流出物的pH在大约前3.2床体积的洗脱内相对恒定,接着才开始沿该柱内部形成非线性梯度(pH 6至7)。该流出物只有在14.2床体积的洗脱缓冲液流过该柱后才达到最终pH 6。可能由于洗脱缓冲液与琼脂糖树脂上的DEAE部分之间的相互作用而生成pH梯度。pH梯度开始前的洗脱体积被称作饱和体积,其在图2A中由箭头表示。该饱和体积可能与缓冲剂强度和pH以及树脂类型相关。
IFN并未表明有助于形成内部pH梯度,因为在仅对该柱施加负载缓冲液(图3)的“空白”运行上观察类似的pH分布。这一结果表明,pH梯度形成的驱动力以洗脱缓冲液物类与DEAE部分之间的相互作用为主,而IFN没有表现出显著作用。不同于pH,流出物电导率正好在大约1床体积的洗脱后开始改变,但在初始下降后相对恒定(图2A)。
这些数据表明,pH梯度形成对IFN-α2b同工型1的适当洗脱而言至关重要。通过HPLC检测定量分析IFN-α2b同工型1和4表明它们未完全拆分(图2B和2C)。同工型1和同工型4分别在大约pH 6.3和6.1下洗脱。
B. pH
梯度对
IFN
洗脱的影响
为了评估内部pH梯度对IFN-α2b同工型分离度的重要性,在不改变其它参数的情况下在各种洗脱条件下进行色谱法。含10 mM磷酸钠、10 mM柠檬酸和20 mM NaCl的pH 6.0洗脱缓冲液的使用产生具有相当锐的S-形分布的pH梯度和作为两个锐峰洗脱的IFN-α2b(图4A,左图)。
当使用具有降低的柠檬酸盐和磷酸盐浓度(5 mM磷酸钠、2.5
mM柠檬酸、20 mM NaCl)的pH
6.0缓冲液进行洗脱时,pH更缓慢降低,花费几乎两倍之多的洗脱体积才能达到该洗脱缓冲液的pH(pH 6.0)(图4B,左图)。此外,pH分布看似为两步级联,而非标准程序中观察到的一步,其中观察到更平滑更浅的凹入梯度。直至pH在该梯度的后部降至大约6.2才洗脱峰IFN(图4B,左图)。
当pH梯度斜率在pH 6.4至6.0范围内急剧提高时(图4A和4B,左图),用这些柠檬酸盐/磷酸盐洗脱缓冲液几乎至完全没有观察到同工型1和4的拆分(图3A和3B,右图)。
用40 mM磷酸盐缓冲液(40 mM磷酸钠,20 mM NaCl,pH 6)洗脱产生锐IFN峰(图4C,左图)。但是,同工型1和4拆分不好(图4C,右图)且pH梯度明显比标准运行中的更锐,即使试验洗脱缓冲液和标准20/20缓冲液都具有pH
6.0。
这些数据表明,适当的pH梯度对IFN-α2b同工型1和4的有效分离而言至关重要且该pH梯度的斜率可极大影响该柱的分离度。较锐的pH梯度促进这两种同工型的洗脱,但都具有差的分离度。
C.
在
DEAE Sepharose
柱上的
IFN
的色谱聚焦
如上所述,我们发现,在洗脱步骤过程中在DEAE Sepharose 柱内产生内部pH梯度,且这种pH梯度对柱性能而言至关重要。因此,我们假设在DEAE Sepharose 色谱法上的IFN同工型的色谱分离通过与用于提纯许多蛋白质(特别是具有各种等电点的密切相关的同功酶的蛋白质)的被称作色谱聚焦的独特色谱技术相符的原理工作(参见,例如,Hutchens
TW, 1989 Chromatofocusing in Protein Purification: Principles,
High Resolution Methods and Applications, Janson JC和Ryden L. eds, VCH Publishers, NY, 第149-174页;Giri L. Chromatofocusing
in Methods in Enzymology, Deutscher MP. Eds, Academic Press, San Diego, 第182卷, 第380-392页)。
在典型的色谱聚焦程序中,用促进带负电荷的蛋白质结合的高pH缓冲液平衡弱阴离子交换柱。随后引入常使用市售聚合两性电解质缓冲液的低pH缓冲液以在该柱内产生内部线性pH梯度。蛋白质根据它们的等电点从该柱中洗脱。当蛋白质在该柱中达到相当于其pI的pH时,该蛋白质的电荷为净0,因此损失其与该柱的结合亲合力并开始洗脱。随着其沿该柱下移,随着柱的pH提高至高于其pI,蛋白质前沿再结合到该柱上。同时,由于其仍不带电荷或带正电荷,样品区后部的蛋白质继续沿该柱向下流动以赶上蛋白质前沿。因此,聚焦该蛋白质。继续重复该方法直至该蛋白质最终从该柱中洗脱。
不同于常规色谱法中所用的聚两性电解质缓冲液,IFN DEAE色谱法中的洗脱缓冲液仅由磷酸盐构成,其含有pKa
12.3、7.3和2的三种不同的电离共轭物。但是,我们的数据证实,标准程序中的简单磷酸盐缓冲液能够形成在pH 6-7(洗脱缓冲液pH和第二磷酸盐pKa(7.3)之间的范围)内的近线性或凹形pH梯度。在pH梯度的这种窄范围内洗脱IFN。
D.
IFN-α 2b 同工型 4 的选择性结合
如质量平衡结果所示,在标准程序中的洗脱步骤后,大比例的同工型4和其它污染物仍结合到该柱上。这些未洗脱材料的检查可能提供关于IFN-α2b同工型在洗脱过程中在柱中如何表现的信息。
为此,使用低pH缓冲液(40 mM乙酸钠、20 mM NaCl,pH 4)从该柱中脱除未洗脱的材料,并通过RP-HPLC检测同工型1和同工型4的级分(图5A)。这两种同工型是如SDS-PAGE(图5B)所示从该柱中脱除的主要材料。测定洗脱和脱除的级分中所含的同工型1和4的量且结果表明从该柱中洗脱总同工型1的绝大多数,同时留在该柱中的同工型4比洗脱的多几乎2X(数据未显示)。因此,当使用标准程序时,同工型4具有比同工型1大的对DEAE柱的亲合力。
为了理解未洗脱的材料为何如此牢固地结合到该柱上,我们检查这些材料的一些性质。图6显示在脱除的材料暴露在各种pH下后在OD320和OD320/280下的吸光度的测定。OD320是指示聚集或沉淀的有用参数。当pH降至大约6时,OD320或OD320/OD280显著提高,表明在大约6的pH下已发生聚集。在低pH下的聚集可能部分构成这些材料在洗脱过程中与该柱的强结合的原因。
基于上述数据,我们断定,DEAE Sepharose 柱上的IFN-α2b同工型分离通过两种截然不同的机制发生——归因于pH梯度形成的色谱聚焦和在标准洗脱条件下同工型4与该柱的选择性结合。
为了降低加载、洗涤和洗脱步骤的周期时间,我们检查了柱尺寸可按比例减至更小的DEAE Sepharose
FF柱(0.5 cm x 20 cm, 3.9毫升)的可能性。小柱能够产生与23毫升柱类似的pH梯度,IFN-α2b的UV状况和使用不同洗脱缓冲液的同工型1和4的分离也类似于在较大柱的情况下获得的结果(图7)。因此,使用0.5 cm x 20 cm, 3.9毫升柱进行下述大多数实验。
E.
缓冲液浓度的影响:
pH
梯度斜率和分离度之间的关系
在色谱聚焦程序中,常通过控制若干变量,包括pH梯度的范围和斜率来优化柱性能。为了研究具有较浅梯度的较窄pH范围是否可用于改进同工型1和4的分离度,我们检查了洗脱缓冲液中的磷酸盐浓度对pH梯度斜率和同工型分离度的影响。
使用20、10或5 mM磷酸钠在20 mM NaCl,pH 6.0存在下进行洗脱。图8显示用各缓冲液获得的色谱法分布图的覆盖图。清楚地,当磷酸钠浓度降低时,从该柱中洗脱IFN峰延迟且峰增宽(顶图)。如预期的那样,在低缓冲液浓度10或5 mM磷酸钠下,pH梯度的形成也延迟,且斜率比用标准20/20洗脱缓冲液(图8,中图)观察到的浅。
RP-HPLC检测证实当洗脱缓冲液磷酸盐浓度从20降至5 mM时,同工型1和4的峰都增宽,但改进这些同工型的分离(图9,上3个左图)。对3个磷酸盐浓度各自而言,洗脱的同工型1和同工型4的总量类似(图9,左下图)。
磷酸盐浓度、pH梯度和同工型分离度之间的关系显示在图9的右下图中。在降低的磷酸盐浓度下同工型分离度的显著改进与在最低的流动缓冲液浓度下表现出最好分离度的常规色谱聚焦一致。其原因在于,低缓冲液浓度有助于产生窄pH梯度,这又提高分离度。
F. 盐和磷酸盐浓度对 IFN-α2b 同工型 4 结合的影响
我们通过使用含20 mM磷酸钠和20 mM、10 mM、5 mM或0 mM NaCl的pH 6.0洗脱缓冲液进行洗脱来检查离子强度对IFN洗脱的影响。结果显示在图10和11中。
同工型1的洗脱在峰位置和锐度方面几乎不受20 mM磷酸盐缓冲液中的NaCl浓度的影响(图10,上图;图11,左上的4个图)。但是,随着NaCl浓度降低,同工型4峰逐渐增宽(图11,左上的4个图),表明在不存在盐的情况下从该柱中洗脱同工型4的速率降低。pH看起来不随盐浓度而变(图10中图)。在汇集级分中,从该柱中洗脱的同工型1和4的总量和它们的分离度在不同盐条件下类似。
由于我们已经确定在洗脱过程中在低缓冲液浓度下可以改进同工型1和4的分离度,我们评估降低10 mM磷酸钠,pH
6.0洗脱缓冲液中的盐浓度(20 mM、10 mM或0 mM NaCl)的影响。结果显示在图12中。
类似于使用20 mM磷酸钠洗脱缓冲液观察到的结果,当NaCl浓度从20降至10 mM时,用10 mM磷酸钠缓冲液洗脱的同工型4峰增宽,而几乎不影响同工型1峰(图12,左上2个图和右图)。但是,当盐浓度进一步降至0 mM时,同工型1作为两个截然不同的峰洗脱(图12,第三个左图和右图),但仅与第一同工型1峰一起洗脱少量(1.6 %)的总同工型4(图12,第三个右图和左图)。相反,使用标准20 mM磷酸钠/20
mM NaCl/pH 6.0洗脱缓冲液与同工型1峰一起洗脱总同工型4的36%。
定量分析表明,在10 mM磷酸钠下盐浓度不改变从该柱中洗脱的同工型1的总量,而随着盐浓度降低,极大抑制同工型4洗脱(图12,左下图)。这些结果表明当使用无盐的低缓冲液浓度进行洗脱时,该DEAE Sepharose FF柱对同工型4的亲合力大于同工型1。通过RP-HPLC检测法进行的纯度分析表明几乎所有IFN级分都具有低百分比的同工型4(< 1 %)(图12,右下图)。
为了进一步检查IFN-α2b同工型在低缓冲液浓度下与该柱的结合,我们在磷酸钠浓度为20、17.5、15,、12.5或10 mM且无盐的pH 6.0缓冲液中进行洗脱。结果显示在图13中。
与用标准20/20缓冲液洗脱相比,在20 mM磷酸钠/0 mM NaCl下的同工型4峰增宽,但其总洗脱不受影响。当磷酸钠从20减至17.5、15、12.5和10 mM时,同工型4的洗脱越来越延迟或受阻,同工型1峰相应增宽(图13,左图)。RP-HPLC检测表明,使用低缓冲液浓度(≤ 15 mM磷酸钠)洗脱的几乎所有同工型1级分含有极低百分比的同工型4。结合到该柱上的同工型4的过渡点出现在15和20 mM磷酸钠之间,可能归因于在这种磷酸盐浓度下提高的同工型4沉淀。
G. pH
的影响
由于pH影响蛋白质分子上的净电荷和表面电荷分布,改变流动缓冲液的阴离子组成并可以调节阴离子交换树脂的电荷状况,我们评估从5.8至6.3改变pH对用20 mM磷酸钠/20mM NaCl
(20/20)或17.5 mM磷酸钠/0 mM
NaCl (17.5/0)洗脱缓冲液洗脱IFN-α2b同工型1和4的影响。结果显示在图14和15中。
使用20/20缓冲液洗脱在pH 5.8、6.0和6.3下对这两种同工型产生极类似的分布图;但是,在pH 6.3下观察各同工型峰的增宽(图14)。在各pH下从该柱中洗脱的各同工型的总量也非常类似(数据未显示)。这些结果表明使用标准缓冲液和盐浓度的IFN-α2b洗脱对缓冲液pH相对不敏感。
相反,当用17.5 mM磷酸钠/0 mM NaCl进行洗脱时,在5.8和6.3之间改变pH具有显著影响。在pH 6.0下几乎不洗脱同工型4(图15,中图)。但是,在pH 5.8下,同工型1峰变锐并从该柱中洗脱明显更多的同工型4(图15,顶图)。在pH 6.3下,同工型1作为两个峰洗脱且基本不洗脱同工型4(图15,底图)。因此,在不存在NaCl的情况下在17.5 mM磷酸钠下IFN-α2b洗脱对相对较小的pH变化非常敏感。
H.
总的和可汇集的回收率
同工型1在上述所有条件下的总洗脱非常类似并接近100%,而同工型4洗脱在不存在NaCl的情况下在磷酸钠≤ 17.5 mM下显著降低。但是,与用标准20/20缓冲液洗脱相比用含有≤ 17.5 mM磷酸钠/0 mM
NaCl的洗脱缓冲液实现的这些同工型的改进的分离度具有相当大的效率成本:需要汇集明显更大体积的级分以实现高的同工型1收率,例如≥90%,并由于减慢或延迟的IFN峰的洗脱而具有低同工型4污染,例如<3%。
因此,进行附加实验以尝试确定实现同工型1和4的高分离度的洗脱条件。
III. 结果和论述 – 实验系列II
在第二系列实验中,使用几种不同的基本纯化的IFN-α2b制品并列在下面
A.
在
pH 6.0
下缓冲液和
IFN
浓度对洗脱体积的影响
为了评估在pH 6.0下缓冲液和IFN浓度对洗脱体积的影响,我们将使用标准20 mM磷酸钠/20
mM NaCl洗脱缓冲液在两种不同IFN-α2b浓度(1.77毫克/毫升和3.49毫克/毫升)下获得的洗脱体积与在不存在盐的情况下使用更低的缓冲液浓度在这些IFN浓度下获得的洗脱体积进行比较。结果显示在下表IIIA中。
表IIIA. 同工型1峰在不同条件下的洗脱体积
。
对IFN制品1而言,与使用标准20/20缓冲液的洗脱体积(表IIIA,第二栏)相比,在15、12.5和10 mM磷酸盐下洗脱的同工型1峰的洗脱体积分别提高35%、95%和220%。对含有几乎两倍之多的IFN的IFN制品观察到洗脱体积随磷酸钠浓度降低而提高的类似图(表IIIA,第3栏)。但是,在较高IFN浓度下,磷酸钠浓度对洗脱体积的这种影响的量级提高。在不含NaCl的缓冲液中,IFN浓度不会显著影响同工型1和4的分离度,因为来自任一批的同工型1作为两个宽峰洗脱且几乎不共同洗脱同工型4,其大部分留在该柱上(数据未显示)。
B.
在
pH 5.85
下
IFN
洗脱体积不依赖于缓冲液浓度
如上述II.G部分中所述,在洗脱缓冲液中不存在NaCl的情况下在17.5 mM磷酸钠浓度下pH显著影响IFN洗脱,pH 5.85洗脱缓冲液产生锐峰形式的同工型1并提高同工型4洗脱,而pH 6.3洗脱缓冲液抑制同工型4洗脱但产生宽同工型1峰。为了检查在pH下缓冲液浓度和同工型洗脱的关系,我们使用不含盐和含有17.5 mM、15 mM、12.5 mM或10 mM磷酸钠的洗脱缓冲液在pH 5.85下在IFN制品1上进行标准DEAE色谱法程序。结果显示在图16A和16B中。
当磷酸盐缓冲液浓度从17.5降至10 mM时,IFN的洗脱逐渐延迟(图16A,顶图)。如预期的那样,在较低缓冲液浓度下,电导率降低和pH梯度形成也延迟(图16A,中图和底图)。但是,当重叠IFN洗脱分布图(将各缓冲液浓度下的IFN峰归一化至相同分数以供比较)时,我们观察到在受试磷酸盐浓度中同工型1峰的形状尖锐并明显类似,而在IFN峰的后级分中越来越多地洗脱同工型4(图16B)。在低pH(5.85)下降低缓冲液浓度不会像在较高pH(6.0-6.2)下那样显著增宽同工型1峰的观察结果表明,较低pH和较低缓冲液浓度可能有助于洗脱同工型1而不显著增加洗脱体积。
IV.
两阶段洗脱–基本原理、结果和论述
上述试验程序无一提供同工型1与同工型4的令人满意的分离以及在可接受的小体积下的同工型1洗脱。用促进同工型4结合或改进同工型1和4分离的洗脱条件,例如较低磷酸盐缓冲液浓度始终获得较大的同工型1汇集体积。另一方面,尽管我们可以用更高的磷酸盐缓冲液浓度或更低的pH获得更锐的同工型1峰和因此更小的汇集洗脱体积,但与同工型1一起洗脱更多同工型4,由此降低符合所需纯度标准的同工型1的收率。在第一系列实验中,我们观察到同工型4在大多数情况下直到已洗脱同工型1的前1/4或1/2峰才开始洗脱。
基于这些观察结果,我们假设,在洗脱前一半同工型1峰后将洗脱缓冲液换成较低浓度缓冲液或高pH缓冲液,即经由两步或“两阶段”洗脱程序,在后一半同工型1峰中出现同工型4洗脱的抑制,由此以更小洗脱体积洗脱同工型1。为了试验这种假设,在3.9毫升柱上进行上述标准DEAE色谱法程序,只是将单洗脱步骤换成两步,即两阶段洗脱法 。在步骤1中,在洗涤步骤后对该柱施加强洗脱溶液,在步骤2中,施加具有不同组成的较弱洗脱溶液。流速与用于标准单洗脱步骤的相同。下面描述用各种组成的强和弱洗脱溶液获得的结果。
在相同
pH
下用不同磷酸盐浓度的两阶段洗脱。
1. 第一阶段洗脱用 20 mM 磷酸盐, pH
6.1 ;第二阶段洗脱用 15 或 12.5 mM 磷酸盐, pH 6.1。
用6.7床体积的强洗脱溶液(20 mM磷酸钠,pH 6.1),接着19床体积的弱洗脱溶液(15 mM或12 mM磷酸钠,pH 6.1)进行IFN-α2b(IFN制品2)的两阶段洗脱。结果显示在图17中。
从该柱中有效洗脱同工型1,与使用标准20/20条件进行的洗脱相比显著改进与同工型4的分离(图17,顶上的两个图)。但是,RP-HPLC分析分布图看起来非常类似于在pH
6.1下使用单一的高磷酸盐(20 mM磷酸钠)洗脱缓冲液获得的分布图(图17,底图)。在后一半同工型1峰的后级分内洗脱一些同工型4,其会使得这些级分根据所需纯度标准不可汇集。在通过不同洗脱溶液产生的同工型洗脱分布中没有观察到显著差异,只是使用12.5
mM磷酸钠洗脱的同工型1峰宽(图17,中图)大于用15 mM磷酸钠洗脱的。因此,在pH 6.1下使用两种不同磷酸盐浓度(15或12.5 mM)的两阶段洗脱看起来不是最优的。
2.
第一阶段洗脱用
17.5 mM
磷酸盐,
pH
5.85
;第二阶段洗脱用
5 mM
磷酸盐,
pH 5.85
。
在pH 5.85下使用两种不同的磷酸盐浓度进行IFN-α2b的两阶段洗脱(IFN制品5,加载体积3.2毫升)时,获得非常不同的分布图。用5或6 B.V的17.5 mM磷酸钠,pH 5.85进行第一洗脱阶段,接着用19床体积的5 mM磷酸钠,pH 5.85洗脱。结果显示在图18中。
在这两个实验中,在该同工型1峰中洗脱的基本每一级分都大于97%纯度,含少于0.5%同工型4(图18)。但是,当用6而非5 B.V.的强洗脱溶液进行第一阶段洗脱时同工型1作为锐得多的峰洗脱。同工型1峰级分为2.5毫克/毫升IFN-α2b,接近在标准程序中获得的该峰级分的IFN浓度(1.3毫克/毫升)的两倍。下表显示详细级分分析,其比较使用6 B.V.的强洗脱溶液用标准单阶段和两阶段实验实现的收率和纯度。
在使用6 B.V.的强洗脱溶液的两阶段洗脱程序中的pH分布显示在洗脱过程中沿柱长度形成的几个pH位移区(图19)。这些区域与洗脱过程中的电导率变化相关联(图19,下方图)。在pH
5.5和pH 6.1之间出现锐位移前沿。同工型1在pH 5.5下快速洗脱并沿该柱下移,聚焦在pH位移前沿。因此,离散pH前沿的形成解释了同工型1在两阶段洗脱过程中作为锐峰洗脱的事实。
要指出,可能由于洗脱缓冲液中的低电导率条件,特别在具有高IFN浓度的几个级分中在室温下出现一些沉淀,其可通过调节pH或盐浓度溶解。在根据所需纯度标准汇集的级分中同工型1的总回收率高达99%。用不同的IFN-α2b制品和柱长度获得类似性能(数据未显示)。
C. 在相同磷酸盐浓度下使用不同pH的两阶段洗脱
我们还检查在两阶段洗脱程序中在改变pH的同时使磷酸盐缓冲液保持恒定的影响。使用低pH缓冲液作为强洗脱溶液以锐化同工型1峰的洗脱。随后使用高pH缓冲液抑制同工型4洗脱。
1.
第一阶段洗脱用
17.5 mM
磷酸盐,
pH
5.85
;第二阶段洗脱用
17.5 mM
磷酸盐,
pH 6.3
。
在DEAE柱中加载IFN制品IFN制品4并根据标准程序洗涤。分别使用6.5 B.V.或5.0
B.V.的17.5 mM磷酸钠,pH
5.85,接着19 B.V.的17.5
mM磷酸钠,pH 6.3进行两阶段洗脱。结果显示在图20中。
使用6.5 B.V.的强洗脱溶液的这种两阶段洗脱程序产生与单独用17.5
mM磷酸钠,pH 5.85获得的分布图类似的同工型1和4的RP-HPLC分析分布图(图20,图A和C)。尽管与标准程序相比改进了IFN纯度(>96%)和可汇集收率,但在IFN峰的后级分中洗脱低量同工型4。将强洗脱步骤缩短至5 B.V.不改进同工型分离度;相反在同工型1峰的后级分中洗脱更多同工型4(图20,图B)。
2.
第一阶段洗脱用
17.5 mM
磷酸盐,
pH
5.85
;第二阶段洗脱用
17.5 mM
磷酸盐,
pH 7.9
。
由于高pH磷酸盐缓冲液(pH 6.3)未克服在IFN峰后部的同工型4洗脱,在弱洗脱步骤中尝试更高的pH。对于这种实验,使用IFN-α2b制品5。用6.5 B.V.的17.5 mM磷酸钠,pH 5.85和随后15 B.V.的17.5 mM磷酸钠,pH 7.9处理加载和洗涤过的柱。结果显示在图21中。
同工型1作为锐峰以小体积洗脱,但令人惊讶地,在该峰中也洗脱大量同工型4(图21,图A)。相悖于我们的假设——即在pH 5.85下使用较小体积的强洗脱缓冲液会减少同工型4洗脱,当仅使用3.7 B.V.的强洗脱溶液时同工型A的分离度甚至更差(图21,图B)。
3.
低电导率在抑制同工型
4
洗脱中的关键作用
用17.5 mM磷酸钠缓冲液在pH
6.3或pH 7.9下的洗脱不降低而是提高同工型4洗脱的事实是令人困惑的,因为高pH条件本应促进同工型4结合到DEAE树脂上。图22图解若干两阶段洗脱实验的电导率、pH和OD280的覆盖图。在这些实验中在类似pH范围中洗脱的IFN,但同工型1峰下方的电导率表现出不同分布。在所有情况下,洗脱过程中的电导率先下降,平稳,随后提高,从而在同工型1峰内或周围形成杯形。但是,杯底尺寸随强洗脱的床体积而变。当第一洗脱步骤的长度提高时,该杯变深和变大,尤其是在pH
7.9缓冲液用于第二洗脱步骤时。更重要地,电导率在同工型1的后半峰内,尤其是在短的第一洗脱步骤后升高(图22,图A-D和E)。弱洗脱步骤中的电导率提高与随同工型1共同洗脱的同工型4的量密切相关。这表明电导率在iso4洗脱中起到关键作用。高pH缓冲液,特别是pH 7.9缓冲液显著提高流出物的电导率并由此提高同工型4洗脱速率。
D. 在不同pH值下使用不同磷酸盐浓度
由于较高电导率可能是同工型4洗脱的原因,我们如下在IFN-α2b制品5上进行两阶段洗脱:使用各种体积(2至6
B.V.)的强洗脱溶液(17.5 mM磷酸钠,pH
5.85),接着在pH 7.9下用15
B.V.的低得多的磷酸盐浓度(5 mM磷酸钠)进行第二阶段洗脱以测试这种洗脱抑制同工型4洗脱的可能性。如预期的那样,在这些条件下在第二洗脱阶段过程中检测到低得多的电导率(0.73 mS/cm)(数据未显示)。洗脱结果显示在图23中。
在同工型1作为锐峰有效洗脱的同时,洗脱相对少量的同工型4。与在弱洗脱阶段中使用更高浓度磷酸盐(17.5 mM磷酸钠,pH
7.9)的两阶段洗脱相比,极大改进同工型分离效率(比较图20和21与图23)。这进一步证实低电导率在同工型4洗脱抑制中的重要性。
使用强缓冲液的第一阶段洗脱步骤的长度不会显著改变同工型1和4的洗脱分布,只是提高第一阶段洗脱步骤的长度看似降低这两种同工型在该柱上的停留时间(图23),当使用更短长度(3 B.V.)的强缓冲液洗脱时,也有更大量(12%)的未洗脱的同工型1留在该柱上。当用6 B.V.的缓冲液进行强洗脱时,洗脱的同工型1峰更锐且只有3%未洗脱的同工型1。
总之,用17.5 mM磷酸盐,pH 5.85和5 mM磷酸盐,pH 7.9的两阶段洗脱程序与标准DEAE色谱法程序相比提供显著改进。但是,同工型1峰中最后的一个或两个级分仍含有更高到不允许将这些级分与较早级分汇集的同工型4百分比。
E. 其它参数对使用17.5 mM和5 mM磷酸盐,pH 5.85的两阶段洗脱的影响
检查可能影响柱性能的几个其它参数,包括IFN的量、第二缓冲液浓度、柱长和流速。
1.
加载
通过从标准载量(大约3.5毫克/毫升,其为柱体积的75%)的0.5X、1X和1.5X改变进料量,检查加载到该柱上的IFN浓度的影响。用6 B.V.的17.5 mM磷酸钠,pH 5.85进行第一阶段洗脱,接着用15 B.V.的5.0
mM磷酸钠,pH 5.85进行第二阶段洗脱。结果显示在图24中。
常规载量的0.5-1.5X的IFN载荷产生类似洗脱分布,从而产生同工型1和4的类似分离效率。如预期的那样,在0.5X载量下峰高低于常规载量(1X)。但是,在1.5X载量下的峰高不是比1X载量下更高而是更宽。另外,在1.5X载量下洗脱OD320的峰(OD280峰的大约2%),这在1X载量下没有观察到。这表明在1.5X洗脱过程中出现一些沉淀。RP-HPLC分析表明在所有这些加载条件下在整个同工型1峰中同工型4少,尽管在高载量(1.5X)下在同工型1峰的后级分中的同工型4百分比略高于(1-2%)在较低载量下(在0.5X和1X中<0.6%同工型4)。这些数据表明柱性能在进料载量的0.5-1.5X范围内非常一致。
2.
弱洗脱缓冲液中的磷酸盐浓度
检查弱洗脱缓冲液中的不同磷酸盐浓度以进一步检查第一阶段洗脱步骤后的同工型1洗脱,结果显示在图25中。有意思地,在pH 5.85下12.5至5 mM的磷酸盐浓度能够抑制同工型4从该柱中洗脱。大多数同工型1级分含有少于0.5%同工型4。但是,在洗脱缓冲液的浓度从5提高到12.5 mM时,同工型1的峰高从2.5降至大约0.8毫克/毫升。因此,在受试范围(5-12.5 mM)内的弱洗脱缓冲液浓度影响同工型1峰的聚焦或锐度,但电导率仍足够低以抑制同工型4洗脱。
3.
柱长
在三个不同长度(5、10和20厘米)的0.5厘米直径的柱上和在1厘米直径×29厘米长度的柱上进行DEAE色谱法上的两阶段洗脱。结果显示在图26中。
清楚地,柱长对同工型4洗脱具有一定影响。尽管使用这些柱的同工型1峰的锐度表现出类似的轮廓,但同工型1和4的分离效率随柱长而变。随着长度降低,在同工型1后级分中洗脱的同工型4的量从20厘米长度下的<0.5%显著提高用长5或10厘米的柱时的大约2.5%。较大的柱(1.0 cm x 29 cm)显示同工型1和4的高度有效分离,所有同工型1峰级分都含有少于0.5%同工型4。此外,同工型1峰级分的浓度达到高达3.6毫克/毫升。该浓度足够高以致甚至在4℃下也出现IFN的一定沉淀;但可以如上所述通过调节pH或盐浓度来使这种沉淀溶解。这些结果表明,令人满意的性能需要大约20厘米的柱长。
4.
流速
通过在5厘米/分钟或0.5厘米/分钟下运行柱(0.5 x 10 cm),检查流速对使用17.5
mM磷酸盐第一阶段洗脱和5 mM磷酸盐,pH
5.85第二阶段洗脱的两阶段洗脱的影响。结果表明,在这些条件下流速不会显著改变分离预期(图27)。但是,在较低流速下运行看似改进分离效率。这与较低流速改进柱性能的大致观察结果一致。
结论
基于上述报道中我们的数据,在此研究中开发用于IFN DEAE色谱聚焦的两步或“两阶段”洗脱程序,其能以小洗脱体积将同工型1与同工型4有效分离。在pH 6下的高和低浓度磷酸盐缓冲液或在不同浓度下的低和高pH缓冲液的使用导致与标准DEAE色谱法程序中所用的单步洗脱相比显著改进,尽管同工型1峰中的一些极后的级分含有相对较高的iso 4百分比。在pH
5.85下使用17.5 mM磷酸盐的第一洗脱阶段和接着在pH
5.85下使用5 mM磷酸盐的第二洗脱阶段的组合在最终同工型1纯度、回收率和汇集体积方面产生最令人满意的结果。
洗脱过程中产生的电导率在同工型洗脱中起到关键作用。高于1 mS/cm阈值的电导率看似提高同工型4洗脱。
该两阶段洗脱程序在IFN载量(现有程序的0.5-1.X)、流速(0.5-5厘米/分钟)和柱长(10-30厘米)的受试范围内产生合理一致的结果。该柱的过载提高同工型1峰的后级分中的同工型4洗脱。柱长影响柱性能,长度较短的柱(<10厘米)造成同工型1和4的不那么有效的分离。
本发明在范围上不受本文描述的具体实施方案限制。实际上,本领域技术人员根据上述说明书可看出除本文描述的那些外的本发明的各种修改。此类修改意图落在所附权利要求的范围内。
本申请中各处引用了专利、专利申请、出版物、产品说明和规程,它们的公开内容出于各种目的全文经此引用并入本文。
Claims (29)
1. 在重组生产的IFN同工型的混合物中将干扰素(IFN)的氧化单体同工型与该IFN的一种或多种不需要的同工型分离的方法,该方法包括:
(a)提供在第一缓冲液中的IFN同工型的混合物;
(b)提供大于15厘米长并填充着用第一或第二缓冲液平衡的阴离子交换树脂的色谱柱;
(c)将缓冲的IFN溶液加载到该阴离子交换柱上;
(d)用洗涤溶液洗涤该加载后的柱;
(e)将该柱的1至10床体积的量的强洗脱溶液施加到该洗过的柱上,其中该强洗脱溶液包含10至30 mM的第一磷酸盐浓度并具有5.4至6.6的pH;
(f)对来自步骤(e)的柱施加该柱的2至20床体积的量的弱洗脱溶液,其中该弱洗脱溶液包含小于第一磷酸盐浓度的第二磷酸盐浓度并具有5.4至6.6的pH;和
(g)收集含有氧化IFN单体同工型的多个洗脱级分。
2. 权利要求1的方法,其中该阴离子交换树脂是二乙基氨基乙基阴离子交换树脂。
3. 权利要求2的方法,其中该阴离子交换树脂是DEAE Sepharose Fast Flow。
4. 权利要求1至3任一项的方法,其中该IFN是I型IFN。
5. 权利要求4的方法,其中该IFN是干扰素alpha (IFN-α)。
6. 权利要求5的方法,其中该IFN是IFN-α2且第一和第二缓冲液各自基本由10 mM Tris、0-40 mM NaCl构成并具有7.0至8.5的pH。
7. 权利要求6的方法,其中第一缓冲液基本由10
mM Tris、40 mM NaCl构成并具有8.0的pH,第二缓冲液基本由10 mM Tris构成并具有8.0的pH,洗涤溶液基本由10 mM
Tris和14 mM NaCl构成并具有8.0的pH。
8. 权利要求6或7的方法,其中第一磷酸盐浓度为大约17.5 mM,第二磷酸盐浓度为大约5 mM至大约7 mM,且强和弱洗脱溶液各自具有5.85的pH。
9. 权利要求8的方法,其中该IFN是IFN-α2,强洗脱溶液基本由17.5 mM磷酸钠构成,弱洗脱溶液基本由5 mM磷酸钠构成。
10. 权利要求1至9任一项的方法,其中步骤(c)、(d)、(e)和(f)各自以0.5至2.5厘米/分钟的流速进行。
11. 权利要求1至9任一项的方法,其中步骤(c)和(d)各自以2厘米/分钟的流速进行,步骤(e)和(f)各自以1厘米/分钟的流速进行。
12. 权利要求11的方法,其中该IFN是IFN-α2b且IFN溶液中IFN-α2b同工型1的浓度为大约1.75毫克/毫升至大约5.25毫克/毫升。
13. 权利要求12的方法,其中IFN溶液中IFN-α2b同工型1的浓度为大约3.5毫克/毫升。
14. 权利要求12的方法,其中步骤(e)中施加的强洗脱溶液的量为6床体积,步骤(f)中施加的弱溶液的量为15床体积。
15. 权利要求1至14任一项的方法,其中步骤(g)中收集的各洗脱级分的体积为床体积的大约20%。
16. 权利要求1至15任一项的方法,其中该IFN是IFN-α2b且IFN溶液中大约3%至大约20%的同工型包含IFN-α2b同工型4。
17. 权利要求16的方法,其中IFN溶液中6%至10%的同工型包含IFN-α2b同工型4。
18. 在重组生产的IFN-α2b同工型的混合物中将干扰素alpha-2b(IFN-α2b)的同工型1与IFN-α2b的同工型4分离的方法,该方法包括:
(a)提供至少大约20厘米长并用基本由10 mM Tris构成且pH为8.0的缓冲液平衡的二乙基氨基乙基(DEAE)阴离子交换色谱柱;
(b)将IFN-α2b混合物在基本由10 mM Tris、40 mM NaCl构成并具有7.5至8.0的pH的负载缓冲液中加载到DEAE柱上,其中该IFN-α2b混合物以2厘米/分钟的流速加载;
(c)用3床体积的洗涤溶液以2厘米/分钟的流速洗涤该加载后的柱,其中该洗涤溶液基本由10 mM Tris HCl和13 mM NaCl构成并具有8.0的pH;
(d)以1厘米/分钟的流速对该洗过的柱施加6床体积的强洗脱溶液,其中该强洗脱溶液基本由17.5 mM磷酸钠构成并具有5.85的pH;
(e)以1厘米/分钟的流速对来自步骤(d)的柱施加15床体积的弱洗脱溶液,其中该弱洗脱溶液基本由5 mM磷酸钠构成并具有5.85的pH;和
(f)收集含有同工型1的多个洗脱级分。
19. 权利要求18的方法,进一步包括合并其中同工型4的量小于所需纯度标准的收集的洗脱级分。
20. 权利要求18或19的方法,其中步骤(f)中收集的各级分的体积为床体积的大约20%。
21. 在重组生产的IFN同工型的混合物中将干扰素(IFN)的所需同工型与该IFN的一种或多种不需要的同工型分离的方法,该方法包括:
(a)提供至少大约20厘米长并填充着用缓冲液平衡的二乙基氨基乙基阴离子交换树脂的色谱柱,其中该缓冲液基本由大约10 mM Tris构成且pH为大约8.0;
(b)将IFN同工型混合物在大约10 mM Tris和大约40 mM NaCl的并具有大约8.0的pH的负载溶液中施加到该阴离子交换柱上;
(c)用大约3床体积的洗涤溶液洗涤来自步骤(b)的柱,其中该洗涤溶液基本由大约10 mM Tris HCl和大约13 mM NaCl构成并具有大约8.0的pH;
(d)以0.5至2.5厘米/分钟的流速对该洗过的柱施加大约6床体积的强洗脱溶液,其中该强洗脱溶液具有15至25 mM的第一磷酸盐浓度和5.7至6.1的pH;
(e)以0.5至2.5厘米/分钟的流速对来自步骤(d)的柱施加大约15床体积的弱洗脱溶液,其中该弱洗脱溶液具有小于第一磷酸盐浓度的第二磷酸盐浓度并具有5.7至6.1的pH;和
(f)收集含有所需IFN同工型的多个洗脱级分;和
(g)合并其中不需要的IFN同工型的量小于所需纯度标准的收集的洗脱级分。
22. 权利要求21的方法,其中所需同工型是IFN的氧化单体同工型。
23. 权利要求21或22的方法,其中步骤(b)和(c)各自以2厘米/分钟的流速进行。
24. 权利要求23的方法,其中步骤(d)和(e)各自以1厘米/分钟的流速进行。
25. 权利要求21-24任一项的方法,其中该IFN是IFN-α2,强洗脱溶液基本由17 mM磷酸钠构成并具有5.85的pH。
26. 权利要求25的方法,其中弱洗脱溶液基本由5 mM磷酸钠构成并具有5.85的pH。
27. 权利要求26的方法,其中IFN溶液中IFN-α2的浓度为大约1.75毫克/毫升至大约5.25毫克/毫升。
28. 权利要求27的方法,其中该IFN是IFN-α2b。
29. 权利要求21至28任一项的方法,其中在重组细菌中生产该IFN。
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