MX2011006762A - Purificacion de interferon recombinantemente producido. - Google Patents

Abstract

La presente invención provee un método para separar isoformas de interferón deseadas de isoformas de interferón no deseadas que implica someter las isoformas a cromatografía en columna de intercambio de aniones y un procedimiento de elución bifásica; una solución de elución fuerte se usa en la primera fase de elución para facilitar la elución de la isoforma deseada de la columna y una solución de elución débil se usa en la segunda fase para suprimir la elución de las isoformas deseadas.

Description

PURIFICACIÓN DE INTERFERÓN RECOMBINANTEMENTE PRODUCIDO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la purificación de interferón producido por organismos recombinantes. En particular, la presente invención se refiere a la separación cromatográfica de isoformas de interferón deseadas, v.gr., isoformas que tienen una estructura de enlace de disulfuro secundaria deseada y carecen de aductos químicos, de isoformas de interferón no deseadas producidas por dichos organismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los interferones son citocinas que presentan actividades antivirales, antiproliferativas e inmunomoduladoras. Debido a dichas actividades, diferentes tipos de interferones han sido aprobados para tratar enfermedades tales como hepatitis, varios cánceres y esclerosis múltiple.

Los interferones (IFNs) se pueden dividir en tres grupos principales con base en sus propiedades fisiológicas y físicas. En humanos, los IFNs de tipo 1 consisten en cinco clases: alfa (IFN-a), beta (IFN-ß), épsilon (IFN-e), kappa (IFN-K), y omega (IFN-?). El interferón gamma (IFN-?) es el único interferón de tipo II conocido. El tipo III incluye IFN-lambdas. Véase, v.gr., Antonelli, G., New Microbiol. 31 : 305-318 (2008).

Subtipos múltiples de proteínas de IFN-a se expresan en humanos y muchas otras especies con 12 subtipos maduros diferentes identificados en humanos (Bekisz, J. et al., Growth Factors 22(4):243-251 (2004); Antonelli, G., supra; Pestka, S. et al., Immunol. Reviews 202:8-32 (2004); Díaz, M.O., et al., J. Inferieron Cytokine Res 16:179-180 (1996)). Los subtipos de IFN-a humanos comparten 75-99% de identidad de secuencia de aminoácidos y una secuencia madura de 166 a. a. excepto para IFN-a2, que tiene 165 a. a. debido a la deleción en la posición 44. También, algunos subtipos de IFN-a existen en formas variantes tales como IFN-a2 que tiene por lo menos 3 formas alélicas: IFN-a2a, IFN-a2b e IFN-a2c.

La característica más conservada compartida por los IFNs de tipo I es el enlace de disulfuro: dos enlaces de disulfuro están presentes en IFN-a y IFN-?, mientras que uno está presente en IFN-ß. Los enlaces de disulfuro en IFN-a son entre Cys1-Cys 99(98) y Cys29-Cys139(138), en donde los números de residuos entre paréntesis se refieren a IFN-a2. El enlace de disulfuro sencillo en IFN-ß es entre Cys31-Cys141 . Los enlaces de IFN-a Cys29-Cys139(138) y IFN-ß Cys31-Cys141 son aparentemente críticos en unión de estos IFNs al complejo de receptor de IFN de tipo I y por lo tanto en el mantenimiento de sus actividades biológicas (Bekisz et al., supra).

Aunque los IFNs se pueden obtener de fuentes naturales, las técnicas recombinantes permiten la producción de grandes cantidades de estas proteínas a partir de fuentes no naturales, tales como bacterias y otros microorganismos que han sido transformados con una molécula de ADN que codifica la proteína de IFN deseada. La producción de IFNs de organismos recombinantes típicamente incluye un proceso de purificación de pasos múltiples, que incluye cromatografía sobre varios medios, para remover contaminantes que se originan a partir del organismo hospedero o medio de cultivo así como isoformas estructurales de la proteína de IFN diseñada para ser producida. Véase, v.gr., patentes de E.U.A. números US 4765903, US 5196323; patentes europeas números EP 108585, EP 1 10302; EP 1 18808 y EP 0679718; Staehelin et al., J. Biol. Chem 256:9750-9754 (1981); y Secher et al., Nature 285:446-450 (1980).

Por ejemplo, preparaciones de IFN-a recombinantes no purificadas y parcialmente purificadas frecuentemente contienen una mezcla de isoformas estructurales del subtipo de IFN-a que ha de ser producida. Las isoformas estructurales se pueden dividir en tres clases principales: (1 ) isoformas de enlace de disulfuro, (2) isoformas auxiliares químicas y (3) isoformas mixtas, que tienen una estructura de enlace de disulfuro alterada así como uno o más auxiliares químicos. Las isoformas de enlace de disulfuro incluyen: una isoforma monomérica de IFN-a oxidada, que tiene cada uno de los enlaces de disulfuro Cys1-Cys 99(98) y Cys29-Cys139(138); isoformas de IFN-a monoméricas parcialmente y completamente reducidas que carecen de uno o ambos de estos enlaces de disulfuro respectivamente; fragmentos de monómeros de IFN-a; y oligómeros de IFN-a, es decir, dímeros, trímeros y tetrámeros formados por enlaces de disulfuro intermoleculares. Las isoformas auxiliares químicas, que contienen uno o más grupos químicos unidos a la cadena de aminoácido de IFN-a incluyen: una isoforma de IFN-a auxiliar de piruvato, en la cual el grupo alfa-amino del residuo de aminoácido N-terminal de la proteína IFN-a es condensado con el grupo carbonilo de piruvato; y la isoforma auxiliar de metionina (publicación de solicitud de patente internacional WO 00/29440; patente de E.U:A. No. 5,196,323). Las cuatro isoformas estructurales típicamente encontradas en preparaciones de IFN-a-2b recombinante se muestran a continuación: ISOFORMA 1 Para composiciones de interferón terapéuticas, la presencia de cantidades significativas de isoformas distintas a la isoforma de IFN monomérica oxidada es típicamente no deseada debido a las preocupaciones de que dichas isoformas pueden afectar negativamente las propiedades terapéuticas o inmunogénicas de la composición de interferón. Se han descrito varias técnicas para convertir isoformas estructurales no deseadas en la isoforma deseada. Por ejemplo, la patente de E.U:A. No. 4,432,895 se refiere a convertir interferones oligoméricos en monómeros usando un reactivo de oxido-reducción y WO 00/29440 describe la digestión secuencial de grupos piruvato de isoformas auxiliares químicas y la oxidación de grupo sulfhidrilo reducidos a enlaces de disulfuro. Sin embargo, aunque dichas técnicas de conversión de isoformas típicamente mejoran el rendimiento de la isoforma de IFN deseada, cantidades significativas de isoformas estructurales no deseadas aun pueden estar presentes, aun cuando se realice cromatografía de intercambio de aniones después del paso de conversión. Por lo tanto, existe la necesidad de mejorar la separación de la isoforma nativa deseada, v.gr., oxidada, de isoformas no deseadas en preparaciones de IFN recombinantes. La presente invención enfrenta esta necesidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el descubrimiento sorprendente de los inventores de que el sometimiento de una preparación de IFN-a-2b recombinante sustancialmente purificada a cromatografía de intercambio de aniones de dietilaminoetilo (DEAE) usando un procedimiento de elución bifásico novedoso en vez del procedimiento de elución de fase sencilla estándar permite la separación eficiente del monómero IFN-a-2b oxidado, deseado (isoforma 1) de las isoformas no deseadas, en particular el auxiliar de piruvato, monómero completamente reducido (isoforma 4). La primera fase de elución facilita la elución de la isoforma IFN-a-2b deseada, mientras que la segunda fase de elución suprime la elución a las isoformas no deseadas. El procedimiento de elución bifásico de por resultado una preparación de IFN-a-2b altamente purificada en un volumen eluido bajo y un alto rendimiento de la isoforma deseada. Los inventores de la presente esperan que este procedimiento cromatográfico novedoso también se pueda usar para separar eficientemente isoformas estructurales de otros subtipos de IFN-a y otros IFNs.

Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención provee un método de separación de una isoforma monomérica oxidada de un IFN de isoformas no deseadas del IFN en una mezcla de isoformas recombinantemente producidas del IFN.

El método comprende proveer la mezcla de IFN en una primera solución reguladora de pH y una columna de cromatografía que es mayor de 15 cm de largo y empacada con una resina de intercambio de aniones que es equilibrada con la primera o segunda solución reguladora de pH.

La solución de IFN regulada en su pH es cargada en la columna y después la columna cargada es lavada con una solución de lavada.

Enseguida, la primera fase de elución se realiza aplicando de 1 a 10 volúmenes de lecho de una solución de elución fuerte a la columna lavada. La solución de elución fuerte es regulada en su pH con una primera concentración de fosfato de 10 a 30 mM y tiene un pH de entre 5.4 y 6.6.

La segunda fase de elución después se realiza aplicando a la columna 2 a 20 volúmenes de lecho de una solución de elución débil. La solución de elución fuerte es regulada en su pH con una segunda concentración de fosfato de que es menor que la concentración de fosfato en la solución de elución fuerte.

Para obtener la isoforma de IFN deseada altamente purificada, una pluralidad de fracciones eluidas que contienen la isoforma deseada es recolectada. Opcionalmente, las fracciones eluidas en las cuales la cantidad de isoformas de interferón no deseadas es menor que un criterio de pureza deseado se combinan.

En una modalidad preferida, la presente invención provee un método de separación de isoforma 1 de IFN-a2b de la isoforma 4 de IFN-a2b en una mezcla de isoformas recombinantemente producidas de IFN-a2b.

La solución de IFN-c¡2b es cargada en una columna de cromatografía de DEAE equilibrada en un regulador de pH de carga que consiste esencialmente de 10 mM de Tris, 40 mM de NaCI, y tiene un pH de 7.5 a 8.0. La columna de DEAE es por lo menos de aproximadamente 20 cm de largo y equilibrada con una solución reguladora de pH que consiste esencialmente de 10 mM de Tris y un pH de 8.0. La velocidad de flujo de carga es 2 cm por minuto.

La columna cargada es lavada con tres volúmenes de lecho de una solución de lavado a una velocidad de flujo de 2 cm por minuto. La solución de lavado consiste esencialmente de 10 mM de Tris y 13 mM de NaCI, y tiene un pH de 8.0.

Enseguida, 6 volúmenes de lecho de una solución de elución fuerte se aplican a la columna a una velocidad de flujo de 1 cm por minuto seguido por una solución de elución débil a una velocidad de flujo de 1 cm por minuto. La solución de elución fuerte consiste esencialmente de 17.5 mM de fosfato de sodio a pH 5.85 y la solución de elución débil consiste esencialmente de 5 mM de fosfato de sodio a pH 5.85.

Fracciones de material eluido de la columna que contienen isoforma 1 de IFN-a2b son recolectadas y opcionalmente sólo aquellas fracciones recolectadas en las cuales la isoforma 4 de IFN-a2b es menor que un criterio de pureza deseado son combinadas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A-1 C ilustran los resultados de realizar la elución de fase sencilla estándar de isoformas de IFN-a2b de una columna de flujo rápido de sefarosa de DEAE (1cm x 23 cm) usando 20 mM de fosfato de sodio, 20 mM de NaCI, pH 6 como regulador de pH de elución, en donde la figura 1A muestra el gradiente de pH que se forma durante el paso de elución, la figura 1 B muestra los perfiles de elución para la isoforma 1 (IFN-a) y la isoforma 4 (IS04) y la figura 1 C muestra la pureza de las fracciones individuales.

La figura 2 muestra los perfiles de pH obtenidos durante cromatografía de DEAE estándar usando únicamente regulador de pH de carga (Control) o una preparación de IFN-a-2b sustancialmente purificada (IFN) en el mismo regulador de pH de carga a medida que se alimenta.

Las figuras 3A-3C ilustran los efectos del gradiente de pH interno sobre elución de IFN-a-2b desde una columna de flujo rápido de sefarosa de DEAE usando las condiciones de elución especificadas, con las gráficas a la izquierda mostrando traslapes de la absorbancia A280, conductividad y perfiles de pH y las gráficas a la derecha mostrando la resolución de la isoforma 1 y la isoforma 4 como se determina por la prueba de CLAR-FI.

Las figuras 4A-4B ilustran la caracterización de material que no fue eluido durante cromatografía de DEAE de una preparación de IFN-a-2b sustancialmente purificada, con la figura 4A y la figura 4B mostrando el análisis de fracciones separadas de la columna por CLAR-FI y SDS-PAGE, respectivamente.

La figura 5 ilustra la absorbancia a OD320 y OD320/280 de material no eluido que fue separado de la columna y expuesto al pH indicado.

Las figuras 6A-6C ilustran cromatografía de DEAE de una preparación de IFN-a-2b en una columna de 0.5 cm X 20 cm, en donde la figura 6A muestra el gradiente de pH y perfil de absorbancia, la figura 6B muestra los perfiles de elución para las isoformas 1 y 4 y la figura 6C muestra el porcentaje de isoforma 1 y 4 en varias fracciones de material eluido.

La figura 7 muestra los perfiles de absorbancia, pH conductividad obtenidos al eluir IFNa-2b de una columna de cromatografía de DEAE en un regulador de pH de elución a pH 6.0 que contiene 20 mM de fosfato de sodio/20 mM de NaCI (20/20), 10 mM de fosfato de sodio/20 mM de NaCI (10/20) o 5 mM fosfato de sodio/20 mM de NaCI (5/20).

Las figuras 8A-8H ilustran el impacto de la concentración reguladora de pH de elución sobre cromatografía de DEAE de IFNa-2b.

La figura 9 ilustra el impacto de concentración de sal sobre los perfiles de absorbancia, pH conductividad generados al eluir IFNa-2b de una columna de cromatografía de DEAE en un regulador de pH de elución a pH 6.0 que contiene 20 mM de fosfato de sodio y una concentración de sal de 20 mM de NaCI (20/20), 10 mM de NaCI (20/10), 5 mM de NaCI (20/5) o en ausencia de NaCI (20/0).

Las figuras 10A-10J ilustran el impacto de diferentes concentraciones iónicas generadas por concentraciones de sal diferentes sobre la elución de isoformas de IFNa-2b 1 y 4 de una columna de cromatografía de DEAE.

Las figuras 1 1A-11 G ilustran el efecto de NaCI sobre la elución de las isoformas 1 y 4 de IFNa-2b, elución en un regulador de pH de 10 mM de fosfato de sodio a pH 6.0.

Las figuras 12A-12L ilustra el efecto de regulador de pH y concentración de sal sobre la separación de las isoformas 1 y 4. de IFNa-2b.

Las figuras 13A-13F ilustra los efectos del pH sobre elución de IFNa-2b usando un perfil de elución de fase sencilla.

Las figuras 14A-14F muestran el efecto de pH en cromatografía de DEAE de IFN usando 17.5 mM de NaPi como regulador de pH de elución.

La figura 15A es el traslape de OD280, conductividad y perfiles de pH para cromatografía de DEAE de IFN-alfa eluido con diferentes concentraciones de fosfato a pH 5.85.

La figura 15B son los efectos de la concentración de regulador de pH sobre volumen de elución de IFN-alfa a pH 5.85. La fracción pico para cada corrimiento se normalizó a la misma fracción para comparación.

Las figuras 16A-16C muestran la elución bifásica de IFN-alfa usando dos concentraciones diferentes de fosfato a pH 6.1.

Las figuras 17A-17C muestran la elución bifásica de IFN-alfa usando dos concentraciones diferentes de fosfato (17.5 y 5 mM, pH 5.85, para elución de primera y segunda fase, respectivamente).

La figura 18 muestra la formación de zonas de desplazamiento de pH correspondientes a las zonas de conductividad formadas durante la elución bifásica. La columna mostrada indica el modelo para desarrollo de pH en la columna.

Las figuras 19A-19C muestran la elución bifásica con regulador de pH de fosfato de diferente pH (5.85 y 6.3) a 17.5 mM. Se indican los volúmenes de los pasos de pre-elución y elución así como las alimentaciones.

Las figuras 20A-20C muestran la elución bifásica con regulador de pH de fosfato de diferente pH (5.85 y 7.9) a 17.5 mM. Se indican los volúmenes de las soluciones de elución de primera y segunda fase.

Las figuras 21A-21 F muestran el perfil de pH y conductividad de elución bifásica usando 17.5 mM de regulador de pH de fosfato a diferente pH.

Las figuras 22A-22J muestran la elución bifásica con diferente concentración de pH y fosfato y los efectos del volumen de elución de primera fase. Se indican los reguladores de fosfato de elución.

Las figuras 23A-23F muestran los efectos de carga en elución bifásica con 6 BV, 17.5 mM de NaPi, pH 5.85 y luego, con 15 BV, 5.0 mM de NaPi, pH 5.85.

Las figuras 24A-24H muestran los efectos de la concentración de regulador de pH de elución de segunda fase en la separación de IFN-a e IS04.

Las figuras 25A-25H muestran la elución bifásica en diversas columnas de diferentes longitudes. La carga se redujo proporcionalmente de acuerdo al tamaño de columna. La elución de primera fase se realizó con 6 B.V. de 17.5 mM de NaPi, pH 5.85 y la elución de segunda fase con 15 B.V. de 5 mM de NaPi, pH 5.85.

Las figuras 26A-26B muestran la influencia de la velocidad de flujo en cromatografía de DEAE de IFN-alfa-2b. Los experimentos se realizaron en una columna de 0.5 cm x 10 cm (1.9 mi) a velocidades de flujo de 5 cm/ml o 0.5 cm/ml durante elución.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I. Definiciones Para que la invención se pueda entender más fácilmente, ciertos términos se definen específicamente a continuación. A menos que se definan específicamente más adelante o en otra parte en este documento, todos los otros términos usados aquí, en particular términos científicos y técnicos, tienen el significado que sería comúnmente entendido por un experto en la técnica al cual atañe esta invención cuando se usa en contextos similares a aquellos usados aquí.

Como se usa aquí, incluyendo las reivindicaciones anexas, las formas singulares de palabras tales como "un", "una", "el" y "la" incluyen sus referencias plurales correspondientes a menos que el contexto determine claramente otra cosa.

"Aproximadamente", cuando se usa para modificar un parámetro numéricamente definido, v.gr., velocidad de flujo, pH, concentración de fosfato de sodio, significa que el parámetro puede variar tanto como 10% por arriba o por abajo del valor numérico establecido. Por lo tanto, v.gr., el término "una velocidad de flujo de aproximadamente 2 cm/min" significa que la velocidad de flujo puede tener cualquier valor entre 1.8 cm/m y 2.2 cm/min. De manera similar, el término "aproximadamente 10 mM de Tris" significa que la concentración de Tris puede tener cualquier valor entre 9.9 mM y 10.1 mM.

"Consiste esencialmente de" y variaciones tales como "consiste esencialmente de" o "que consiste esencialmente de, como se usa a lo largo de la especificación y las reivindicaciones, indica la inclusión de cualesquiera elementos o grupo de elementos mencionados, y la inclusión opcional de otros elementos, de naturaleza similar o diferente que los elementos mencionados, que no cambian materialmente las propiedades básicas de la composición o artículo especificado. Como un ejemplo no limitante, una solución de elución débil que consiste esencialmente de 5 mM de fosfato de sodio y pH de 5.85, v.gr., también puede contener cantidades menores de otros agentes, v.gr., fosfato de potasio, que no afectan materialmente el pH, capacidad reguladora de pH u otras propiedades de la solución de elución con respecto a la separación de la isoforma de IFN deseada de isoformas no deseadas.

"Isol " o "IS01 " significa la isoforma 1 de IFN-a2b. "lso4" o "IS04" significa la isoforma 4 de IFN-a2b.

"NaPi" significa fosfato de sodio.

La "isoforma monomértica de IFN oxidada" significa una cadena de polipéptido sencilla que tiene la estructura de enlace de disulfuro natural para el presente IFN y no tiene auxiliares químicos en cualesquiera aminoácidos en la cadena de polipéptido. Por estructura de enlace de disulfuro natural se entiende que el número y localización de enlaces Cys-Cys en la isoforma son las mismas que en el interferón naturalmente expresado. Por lo tanto, v.gr., una isoforma monomérica de IFN-ß oxidada tiene un enlace de disulfuro sencillo entre Cys31-Cys141 , mientras que una isoforma monomerica de IFN-a2a oxidad tiene un enlace de Cys1-Cys99 y un enlace de Cys29-Cys139.

"Isoforma monomérica de IFN reducida" significa una cadena de polipéptido sencilla que tiene menos del número nativo de enlaces de disulfuro para el presente IFN y no tiene compuestos químicos auxiliares sobre cualesquiera aminoácidos en la cadena de polipéptido. Una isoforma monomérica de IFN reducida puede ser parcialmente o completamente reducida dependiendo del número de enlaces de disulfuro que ocurren naturalmente. Por lo tanto, v.gr., una isoforma monomérica de IFN-a2b parcialmente reducida carece ya sea del enlace de Cys1-Cys98 o el enlace de Cys29-Cys138, mientras que una isoforma de IFN-a2b completamente reducida carece de estos dos enlaces.

"Isoforma monomérica de IFN mixta" significa una cadena de polipéptido sencilla que tiene menos del número nativo de enlaces de disulfuro para el presente IFN y tiene por lo menos un aminoácido en la cadena de polipéptido modificada con un auxiliar químico.

II. Descripción de las modalidades preferidas La presente invención provee un proceso cromatográfico para separar las isoformas de IFN deseadas, v.gr., isoformas monoméricas oxidadas, de las isoformas de IFN no deseadas, v.gr., las isoformas de IFN reducidas, en preparaciones de IFN recombinantes. El proceso es adecuado para la purificación de un isoforma deseada de cualquier IFN recombinantemente producido que es naturalmente expresada por cualquier especie animal humana o no humana el tipo I, tipo II o tipo III IFN, o formas quiméricas o mutantes del mismo en el cual se han introducido modificaciones de secuencia, por ejemplo para incrementar la estabilidad o actividad, tales como interferones de consenso como se describe en las patentes de E.U.A. Nos. 5,541 ,293, 4,897,471 y 4,695,629, e interferones híbridos que contienen combinaciones de diferentes secuencias de subtipo como se describe en la patentes de E.U.A. Nos. 4,414,150, 4,456,748 y 4,678,751.

Preferiblemente, el proceso de la invención se usa para separar isoformas deseadas y no deseadas de IFNs de tipo I recombinantemente producidas. Los IFNs de tipo I particularmente preferidos son proteínas de IFN-a recombinantemente producidas, incluyendo cualesquiera de los subtipos que ocurren naturalmente IFN-a1 , IFN-a2, IFN-a4, IFN-a5, IFN-a6, IFN-a7, IFN-ad, IFN-a10, IFN-a13, IFN-a14, IFN-a16, IFN-a17, IFN-a21 , variantes alélicas de cualquiera de estos subtipos, o cualquier proteína de IFN-a de consenso en la cual la secuencia de aminoácidos ha sido designada al seleccionar en cada posición el aminoácido que más comúnmente ocurre en esa posición en los varios subtipos de IFN-a nativos. Muy preferiblemente, la proteína de IFN-a recombinantemente producida utilizada en la presente invención es una IFN-a2 (2a, 2b o 2c) y muy preferiblemente es IFN-a2b.

El organismo hospedero usado para expresar el IFN recombinante puede ser un procariota o eucariota, v.gr., E.coli, B. subtilis o Saccharomyces cerevisiae, preferiblemente E.coli. Las condiciones de cultivo para los varios organismos hospederos son bien conocidas por los expertos en la técnica y se describen con detalle, v.gr., en los libros de texto de Maniatis et al. ("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) y Sambrook et al. ("Molecular Cloning-A Laboratory Manual", 2a. ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). En particular, la producción recombinante de proteínas de IFN-a2 humanas se describe en Pestka, S. Arch Biochem Biophys. 221 : 1 -37 (1983); publicación de solicitud de patente internacional WO 2004/039996; patentes de E.U.A. número US 5661009, US 5541293, US 4897471 , US 4765903 y US 4530901 ; y publicación de solicitud de patente europea EP 032,134.

La proteína de IFN recombinante puede ser extraída del hospedero recombinante o el medio de cultivo usando cualquiera de una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, métodos adecuados para extraer IFN-a de microorganismos se describen en las patentes de E.U.A. números US 4315852, US 4364863, y US 5196323; patente europea número EP 0679718; y WO 2004/039996.

Después de la extracción, la preparación de IFN recombinante, que comprende una mezcla de isoformas estructurales, es preferiblemente sometida a un conjunto de pasos de purificación para producir una preparación de IFN sustancialmente pura, que significa que la preparación es sustancialmente libre de proteínas no IFN y otros contaminantes tales como residuos celulares y ácidos nucleicos, pero pueden contener hasta 20% de isoformas de IFN estructurales no deseadas. Muchos esquemas de purificación conocidos en la técnica son adecuados para este propósito. Dichos esquemas típicamente incluyen cromatografía en tándem en dos o más tipos diferentes de resina, como se describe en U.S. 5196323, US 4765903, EP 0679718, y WO 2004/039996.

La preparación de proteína de IFN sustancialmente pura obtenida de la cromatografía en tándem típicamente comprende una solución regulada en su pH. Dependiendo de la composición de esta solución, así como la concentración de IFN en la misma, puede ser necesario preparar esta solución de IFN para cargar en la columna de intercambio de aniones usada en la presente invención al ajustar la solución para comprender los componentes de un regulador de pH de carga apropiado para cromatografía de intercambio de aniones. Este ajuste se puede realizar mediante técnicas conocidas en el campo tales como diálisis o ultrafiltración.

El regulador de pH de carga puede ser cualquier regulador de pH biológicamente compatible que no impacte la unión de la proteína de IFN a la resina de intercambio de aniones. Por ejemplo, el regulador de pH de carga puede contener de 0 a 100 mM de sales tales como NaCI, KCI y acetato de sodio. Un regulador de pH de carga preferido consiste esencialmente de aproximadamente 10 m de Tris, 0 a 40 mM de NaCI, y tiene un pH de 7.0 a 8.5. Un regulador de pH de carga particularmente preferido consiste de 10 mM de Tris, 40 mM de NaCI y tiene un pH de 8.0.

La concentración del IFN en el regulador de pH de carga puede variar sustancialmente. Típicamente, el volumen del regulador de pH de carga es ajustado para lograr un volumen de carga conveniente, v.gr., de 0.5 a 1 volúmenes de lecho de la columna de cromatografía, y evitan precipitación del IFN. En algunas modalidades, se utiliza una concentración de IFN de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5 mg/ml. Para una preparación de IFN-a2, una concentración preferida de iosoforma 1 es aproximadamente 3.5 mg/ml. Las varias isoformas presentes en preparaciones de IFN recombinantes se pueden identificar y cuantificar usando técnicas conocidas en el campo, v.gr., tal como las pruebas de CLAR-FI y piruvato descritas en el documento WO 00/29440.

Como resina para cromatografía de intercambio de aniones, un medio de intercambio de aniones de dietilaminoetilo (DEAE) es preferido, en donde una resina particularmente preferida es DEAE con flujo rápido de Q-sefarosa (FF) (DEAE Sepharose™ FF) de GE Healthcare (Uppsala, Suecia o Piscataway, NJ, E.U.A.). También se pueden usar otras resinas de intercambio de aniones débiles que tienen propiedades sustancialmente similares a DEAE.

Las resinas de intercambio de aniones son empacadas en una columna de cromatografía que es mayor de 15 cm de longitud. En una modalidad preferida, la columna es por lo menos 20 cm de longitud. Otros tamaños de columna adecuados para usarse en la presente invención incluyen una columna de 1 x 29 cm.

Antes de la carga de la solución de IFN, la columna de intercambio de aniones es equilibrada con un regulador de pH acuoso adecuado para la resina de intercambio de aniones y el IFN. El regulador de pH de equilibrio puede ser el mismo o diferente del regulador de pH de carga. En una modalidad preferida, la columna es equilibrada con un regulador de pH que constituye esencialmente de 10 mM de Tris, 0-40 mM de NaCI y un pH de 7.0 a 8.5. En otra modalidad preferida, el regulador de pH de equilibrio consiste de 10 mM de Tris, pH 8.0. Si la columna ha sido previamente usada, es convenientemente regenerada y equilibrada por lavados secuenciales con: 3 volúmenes de lecho (B.V.) de NaOH 0.5 N/1 M de NaCI; 5 B.V. de H20; 3 B.V. de HCI 0.1 N; 6 B.V. de 0.2 M de Tris, pH 8.0 y 15 B.V. de 10 mM de Tris, pH 8.0, todos usando una velocidad de flujo de 5 cm/ml.

Después de que la solución de IFN regulada en su pH es cargada sobre la columna, una solución de lavado se aplica a la columna para remover contaminantes no unidos. La solución de lavado contiene un regulador de pH biológicamente compatible que no impacta la unión del IFN a la columna. Por ejemplo, en algunas modalidades, el regulador de pH de lavado tiene la misma composición que el regulador de pH de equilibrio o regulador de pH de carga de la columna, v.gr., que consiste esencialmente de 10 mM de Tris, 0 - 40 mM de NaCI y un pH de 7.0 a 8.5. En una modalidad preferida, la solución de lavado consiste de 10 mM de Tris, 13 mM de NaCI y tiene un pH de 8.0.

La isoforma deseada es entonces eluida de la columna usando un sistema de elución bifásico. Este sistema bifásico se establece al aplicar secuencialmente a la columna dos soluciones reguladas en su pH: Una solución de elución fuerte, v.gr., con una concentración iónica alta y/o pH bajo, seguido por regulador de pH de elución débil, v.gr., que tiene una concentración iónica más baja y/o pH más alto que la solución de elución fuerte.

Convenientemente, estas soluciones de elución son reguladas en su pH con un fosfato, pero se pueden usar otros reguladores de pH biológicamente compatibles. La concentración de fosfato en la solución de elución fuerte es de 10 mM a 30 mM y menor en la solución de elución débil, v.gr., 2.5 a 7.5 mM. La diferencia en concentración de fosfato en las soluciones de elución fuerte y débil variará dependiendo de si otros agentes que afectan la concentración iónica, v.gr., NaCI u otras sales, están presentes en una o ambas soluciones de elución, así como el pH de cada solución de elución. Por ejemplo, la diferencia de fosfato puede ser algo menor si la solución de elución fuerte tiene un pH más bajo que la solución de elución débil. Típicamente, cada una de las soluciones de elución fuerte y débil tendrá un pH ácido, preferiblemente en el intervalo de 5.4 a 6.6. El experto en la técnica puede probar fácilmente varias combinaciones de regulador de pH, sal y pH para cada una de las soluciones de elución fuerte y débil para obtener un sistema biofásico para usarse para un tipo de IFN particular.

Para preparar las soluciones de elución reguladas en su pH con fosfato, uno o ambos de monofosfato de sodio y difosfato de sodio se pueden usar y el pH se puede ajusfar con un ácido o base adecuado tal como HCI o NaOH. Otras sales de fosfato tales como fosfato de potasio se pueden usar además de o en lugar de fosfato de sodio.

En una modalidad preferida, la elución bifásica se lleva a cabo usando una solución de elución fuerte que consiste esencialmente de 17.5 mM de fosfato de sodio, pH 5.85 y una solución de elución débil que consiste esencialmente de 5 mM de fosfato de sodio, pH 5.85.

La cantidad de solución de elución fuerte para usarse antes de cambiar a la solución débil es típicamente de 1 a 10 volúmenes de lecho (B.V.), pero se puede determinar empíricamente para cualquier IFN particular y conjunto de soluciones de elución. Una cromatografía de prueba se realiza usando la solución de elución fuerte escogida únicamente y las fracciones eluidas son monitoreadas para la presencia de IFN. Un volumen de lecho menor que el número de volúmenes de lecho de solución de elución fuerte que son requeridas para eluir la primera fracción que contiene IFN en elución monofásica típicamente sería el volumen máximo de la solución fuerte usada en el sistema bifásico. En una modalidad, se aplican entre 4 y 8 B.V. de solución de elución fuerte. En una modalidad más preferida, la primera fase de elución se utiliza con aproximadamente 6 B.V. de solución de elución fuerte.

La segunda fase de elución se puede llevar a cabo usando 2 a 20 B.V. de la solución débil, dependiendo de cuánto se requiere para eluir una producción suficiente de la isoforma deseada. Por ejemplo, en algunos casos, se puede desear recolectar una isoforma de IFN reducida o de auxiliar químico para estudiar sus propiedades. En una modalidad preferida, aproximadamente 15 B.V. de la solución débil se aplica a la columna después de 6 B.V. de la solución de elución fuerte.

Todas las soluciones y reguladores de pH anteriores se aplican típicamente a la columna de intercambio de aniones a velocidades de flujo de 0.2 a 10 cm/minuto. La velocidad de flujo usada dependerá de varios factores, tales como el equipo para realizar la cromatografía, el tipo de resina de intercambio de aniones, tamaño de la columna, la concentración de proteína en la solución de IFN, y la composición de las soluciones de elución. Las velocidades de flujo adecuadas para cada paso las puede determinar fácilmente el experto en la técnica. En algunas modalidades, el regulador de pH de carga, solución de lavado y soluciones de elución se aplican a velocidades de flujo de 1 a 5 cm/min. En otras modalidades, la velocidad de flujo es de 0.5 a 2.5 cm. Preferiblemente, una velocidad de flujo de 2 cm/min se usa para aplicar el regulador de pH de carga y solución de lavado mientras cada una de las soluciones de elución se aplica a una velocidad de flujo de 1 cm/min.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proveen para describir en forma más clara la presente invención y no deben considerarse limitantes del alcance de la invención.

Los inventores realizaron una series de experimentos para investigar los mecanismos implicados en la separación de ¡soformas de IFN- a2b recombinantemente producidas usando cromatografía de flujo rápido de DEAE-Sepharose. Varias condiciones de elución que incluyen concentraciones de regulador de pH, concentración de sal, y pH se probaron para dilucidar la interacción de isoformas de IFN-a2b con DEAE Sepharose. Se encontró que dos mecanismos distintos estaban implicados en la separación de las isoformas 1 y 4.

El primer mecanismo es consistente con el principio de cromatoenfoque, que se caracteriza por la formación de un gradiente de pH dentro de la columna, y es ampliamente usado para purificar varias proteínas, particularmente isoformas estrechamente relacionadas, de conformidad con sus puntos isoeléctricos. En cromatografía de DEAE por purificación de IFN-a2b usando el procedimiento estándar descrito más adelante, un gradiente de pH interno es generado a lo largo de la longitud de la columna durante elución principalmente como resultado de la interacción de especies reguladoras de pH y resina de DEAE. Los inventores descubrieron que las isoformas 1 y 4 son eluidas a diferentes pHs a lo largo del gradiente de pH. La resolución de la isoforma 1 y la isoforma 4 se puede mejorar usando concentraciones de regulador de pH de elución de fosfato más bajas para reducir el gradiente de pH, consistente con la relación entre la concentración del regulador de pH, pendiente de gradiente de pH y resolución de columna en cromatoenfoque convencional.

El segundo mecanismo implica la unión selectiva de llevar la isoforma 4 a la columna durante la elución de la isoforma 1. Los inventores descubrieron que la isoforma 4 se une a la columna más apretadamente a concentraciones de regulador de pH más bajas en ausencia de sales, y por lo tanto podría ser separada de manera efectiva de la isoforma 1 bajo estas condiciones. Sin embargo, la eficiencia de elución para la isoforma 1 fue reducida a concentraciones de regulador de pH más bajas, por lo tanto, el volumen de fracciones en acervo que contenían la isoforma 1 fue invariablemente más grande que el deseado para un procedimiento de producción de proteína comercial eficiente.

Por lo tanto, los inventores llevaron a cabo una segunda serie de experimentos para ver se podrían identificar condiciones que permitieran una elución robusta y eficiente de isoforma 1 de IFN-a2b mientras suprime la elución de la isoforma 4 de IFN-a2b.

Estas dos series de experimentos se describen con más detalle más adelante, con los resultados mostrados en la figuras 1-26B. En estas figuras, los términos IFN, IFN-a o IFN-alfa se refieren a isoforma 1 de IFN-a2b, y los términos iso4 e IS04 se refieren a la isoforma 4 de IFN-a2b.

I. Procedimientos experimentales Cromatografía DEAE Sepharose™ de flujo rápido El AKTAexplorer™ (GE Healthcare, Uppsala, Suecia, o Piscataway, NJ, E.U.A.) se usó para realizar cromatografía de DEAE a 4°C. Una columna de 0 5x20 cm (3.9 mi) o columna de 1 X 29 cm (23 mi) se empacó con resina DEAE Sepharose™ de flujo rápido (GE Healthcare). Se vació suficiente resina en la columna y se dejó asentar bajo gravedad para formar una altura de lecho inicial de aproximadamente 1 cm por arriba de la altura deseada. La columna fue regenerada y equilibrada con 3 volúmenes de lecho (B.V.) de NaOH 0.5 N/NaCI 1 M, 5 B.V. de H20, 3 B.V. de HCI 0.1 N, 6 B.V. de 0.2 M de Tris, pH 8.0, y 15 B.V. de 10 mM de Tris, pH 8.0 a una velocidad de flujo de 5 cm/ml.

Preparación de IFN-a2b recombinante Los inventores de la presente obtuvieron preparaciones de IFN que se habían producido en E. coli recombinante, y sustancialmente purificadas por una serie de pasos de purificación. Las preparaciones de IFN se proveyeron en un regulador de pH de carga que contenía 10 mM de Tris, 40 mM de NaCI, pH 7.5-8.0.

Procedimiento de cromatografía estándar La solución de IFN se inyectó en la columna equilibrada con 10 mM de Tris, pH 8 a una velocidad de flujo de 0.4 ml/min para la columna de 3.9 mi o 0.8 mi para la columna de 23 mi. El volumen de solución de IFN cargada fue 75% de la columna B.V. Tres B.V. de regulador de pH de lavado (10 mM de Tris, 13 mM de NaCI, pH 8.0) se usaron para remover materiales no unidos de la columna a la misma velocidad de flujo. Finalmente, 9 B.V. de 20/20 de regulador de pH de elución (20 mM de fosfato de sodio, 20 mM de NaCI, pH 6.0) se utilizó a una velocidad de flujo de 0.2 ml/min para iniciar el paso de elución. Las fracciones se recolectaron a 20% de B.V. por fracción (0.8 mi). Las isoformas 1 y 4 se analizaron por CLAR-FI. La resolución de las isoformas se calculó al dividir la distancia de los dos picos de isoforma entre la suma de las anchuras de pico a la altura pico media.

Procedimientos de cromatografía de prueba A fin de examinar el comportamiento de elución de IFN, la cromatografía de DEAE se realizó usando el procedimiento estándar pero diferentes reguladores de pH de elución como se describe en los resultados y sección de discusión. Las velocidades de flujo fueron idénticas a las del procedimiento tradicional a menos que se indique otra cosa.

II. Resultados y discusión - Serie experimental I A. Formación de un gradiente de pH interno durante cromatografía de DEAE de IFN La absorbancia de UV, conductividad, y pH durante el procedimiento de cromatografía de DEAE estándar fueron monitoreados y se muestran en las figuras 1A-1 C. Se observaron tres picos de UV, las proteínas bacterianas como un pico pequeño temprano, la isoforma 1 de IFN-a2b como un pico mayor medio, seguido por la isoforma 4 de IFN-a2b y otros contaminantes como un pico menor, amplio, tardío.

De manera interesante, el pH del efluente fue relativamente constante durante los primeros aproximadamente 3.2 volúmenes de lecho de elución antes de que empezara a desarrollarse internamente un gradiente no lineal (pH 6 a 7) a lo largo de la columna. El efluente alcanzó el pH 6 final sólo después de 14.2 volúmenes de lecho del regulador de pH de elución que pasó a través de la columna. El gradiente de pH fue probablemente generado como un resultado de la interacción entre el regulador de pH de elución y la porción de DEAE sobre la resina de sefarosa. El volumen de elución antes del inicio del gradiente de pH se refiere como volumen de saturación, que es ilustrado por una flecha en la figura 1A. El volumen de saturación se pudo relacionar con la concentración del regulador de pH y el pH así como el tipo de resina.

IFN no pareció contribuir a la formación del gradiente de pH interno ya que un perfil de pH similar se observó en corrimientos "testigo", en los cuales el regulador de pH de carga sólo se aplicó a la columna (figura 2). Este resultado indicó que la fuerza impulsora para la formación de gradiente de pH fue dominada por la interacción entre la especie de regulador de pH de elución y la porción de DEAE, mientras que IFN no jugó un papel significativo. A diferencia del pH, la conductividad del efluente empezó a cambiar inmediatamente después de que aproximadamente un volumen de lecho de elución pero fue relativamente constante después de una declinación inicial (figura 1A).

Estos datos sugieren que la formación de gradiente de pH es crítica para la elución apropiada de la ¡soforma 1 de IFN-a2b. El análisis cuantitativo de isoformas 1 y 4 de IFN-a2b por prueba de CLAR indicó que no se resolvieron por completo (figuras 1 B y 1 C). La isoforma 1 y la isoforma 4 se eluyeron a aproximadamente pH 6.3 y 6.1 , respectivamente.

B. El impacto de gradientes de pH sobre la elución de IFN Para evaluar la importancia del gradiente de pH interno sobre la resolución de la isoforma de IFN-a2b, se realizaron cromatografías a varias condiciones de elución sin cambiar otros parámetros. El uso de un regulador de pH de elución a pH 6.0 que contenía 10 mM de fosfato de sodio, 0 mM de ácido cítrico y 20 mM de NaCI dio por resultado un gradiente de pH que tenía un perfil en forma de S más bien agudo y IFN-a2b eluido como dos picos agudos (figura 3A, gráfica de la izquierda).

Cuando la elución se realizó usando un pH 6.0 regulador de pH con concentraciones de citrato y fosfato reducidas (5 mM de fosfato de sodio, 2.5 mM de ácido cítrico, 20 mM de NaCI), el pH declinó más lentamente, tomando casi dos veces el volumen de elución para alcanzar el pH del regulador de pH de elución (pH 6.0) (figura 3B, panel de la izquierda). Más aún, el perfil de pH apareció como una cascada de dos pasos en oposición a un paso observado en el procedimiento estándar en donde un gradiente cóncavo más suave y más poco profundo se vio. El IFN pico no se eluyó hasta que el pH cayó a aproximadamente 6.2 dentro de la última parte del gradiente (figura 3B, panel de la izquierda).

Poca a nada resolución de isoformas 1 y 4 se observó con cualquiera de estos reguladores de pH de elución de citrato/fosfato (figuras 3A y 3B, paneles de la derecha), ya que la pendiente del gradiente de pH se incrementó abruptamente dentro de la región de pH 6.4 a 6.0 (figura 3A y 3B, paneles de la izquierda).

La elución con un regulador de 40 mM de pH fosfato (40 mM de fosfato de sodio, 20 mM de NaCI, pH 6) produjo un pico de IFN agudo (figura 3C, panel de la izquierda). Sin embargo, las isoformas 1 y 4 se resolvieron de manera deficiente (figura 3C, panel de la derecha), y el gradiente de pH fue notablemente más agudo que en las operaciones estándares, aun cuando tanto el regulador de pH de elución de prueba y 20/20 de regulador de pH estándar tuvo un pH de 6.0.

Estos datos sugieren que el gradiente de pH apropiado es crítico parar separación efectiva de isoformas 1 y 4 de IFN-a2b, y que la pendiente del gradiente de pH puede influir en gran medida la resolución de la columna. Un gradiente de pH más agudo facilitó la elución de ambas isoformas, pero con resolución deficiente.

C. Cromatoenfoque de IFN sobre la columna de DEAE Sepharose Como se describió antes, se descubrió que un gradiente de pH interno fue generado dentro de la columna de DEAE Sepharose durante el paso de elución y que este gradiente de pH fue crítico para el rendimiento de la columna. Por lo tanto, los inventores de la presente formularon la hipótesis de que la separación cromatográfica de isoformas de IFN sobre cromatografía de DEAE Sepharose funcionó mediante un principio consistente con una técnica cromatográfica única llamada cromatoenfoque, que se usa para la purificación de muchas proteínas, particularmente las de ¡sozimas estrechamente relacionadas de puntos isoeléctricos variables (véase, v.gr., Hutchens TW, 1989 Chromatofocusing en Protein Purification: Principies, High Resolution Methods, and Applications, Janson JC and Ryden L. eds, VCH Publishers, NY, p. 149-174; Giri L. Chromatofocusing en Methods in Enzymology, Deutscher MP. Eds, Academic Press, San Diego, vol 182, p. 380-392).

En procedimientos de cromatoenfoque típicos, una columna de intercambio de aniones débil es equilibrada con un regulador de pH con pH alto que facilita la unión de proteínas negativamente cargadas. Un regulador de pH con pH bajo que normalmente utiliza un regulador de pH de anfolito polimérico comercialmente disponible es después introducido para generar un gradiente de pH lineal interno dentro de la columna. Las proteínas serán eluidas de la columna de conformidad con sus puntos isoeléctricos. Cuando las proteínas alcanzan un pH en la columna que es equivalente a su pl, la carga de la proteína será neta-cero y por lo tanto pierde su afinidad de unión a la columna y empieza a eluir. A medida que migra hacia la columna, el frente de la proteína se volverá a unir a la columna a medida que el pH de la columna incremente por arriba de su pl. Mientras tanto, la proteína en el lado posterior de la zona de muestra continúa fluyendo hacia la columna hasta alcanzar el frente de la proteína, ya que aún está sin carga o positivamente cargada. Como resultado, la proteína es enfocada. El procedimiento se repetirá continuamente hasta que la proteína finalmente se eluye de la columna.

A diferencia del regulador de pH de polianfolito usado en cromatografía convencional, el regulador de pH de elución en cromatografía de DEAE de IFN consiste sólo de fosfato, que contiene tres diferentes conjugados de ionización de pKa 12.3, 7.3 y 2. Sin embargo, los datos de los inventores de la presente demostraron que el regulador de pH de fosfato simple en el procedimiento estándar fue capaz de formar un gradiente de pH casi lineal o cóncavo dentro del pH 6-7, el intervalo entre el pH del regulador de pH de elución y el segundo pKa del fosfato (7.3). IFN se eluyó dentro de este intervalo estrecho del gradiente de pH.

D. Unión selectiva de la isoforma 4 de IFN-a2b Como se indica por los resultados de equilibrio de masa, hubo una gran proporción de la isoforma 4 y otros contaminantes que aún se unen a la columna siguiendo el paso de elución en el procedimiento estándar. El examen de estos materiales no eluidos podría ser informativo acerca de cómo las isoformas de IFN-a2b se comportan en la columna durante la elución.

Para este fin, el material no eluido fue separado de la columna al usar un regulador de pH con pH bajo (40 mM de acetato de sodio, 20 mM de NaCI, pH 4), y las fracciones se probaron mediante CLAR-FI para la isoforma 1 e isoforma 4 (figura 4A). Estas dos isoformas fueron los materiales predominantes separados de la columna como se muestra por SDS-PAGE (figura 4B). Las cantidades de isoformas 1 y 4 contenidas en las fracciones eluidas y separadas se determinaron y los resultados mostraron que la vasta mayoría de isoforma 1 total fue eluida de la columna, mientras que casi 2X más isoforma 4 quedó en la columna que fueron eluidas (no se muestran datos). Por lo tanto, la isoforma 4 tuvo afinidad mayor que la isoforma 1 para la columna de DEAE cuando se usó el procedimiento estándar.

Para entender porqué los materiales no eluidos se unen a la columna tan apretadamente, los inventores de la presente examinaron algunas propiedades de estos materiales. La figura 5 muestra la determinación de absorbancia a OD320 y OD320/280 después del material separado se expuso a varios pHs. OD320 es un parámetro útil indicativo de agregación o precipitación. OD320 o OD320/OD280 incrementó marcadamente a medida que el pH disminuyó hasta alrededor de 6, indicando que la agregación había ocurrido a un pH de aproximadamente 6. La agregación a pH bajo parcialmente puede explicar la unión fuerte de estos materiales a la columna durante la elución.

Con base en los datos anteriores, los inventores de la presente concluyeron que la separación de la isoforma IFN-a2b sobre la columna de DEAE Sepharose ocurre por dos distintos mecanismos— cromatoenfoque debido a la formación de un gradiente de pH, y unión selectiva de la isoforma 4 a la columna bajo condiciones de elución estándares.

Para reducir los tiempos del ciclo para los pasos de carga, lavado y elución, se examinaron la posibilidad de que el tamaño de columna pudiera llevarse a escala descendente a una columna de DEAE Sepharose FF más pequeña (0.5 cm x 20 cm, 3.9 mi). La columna pequeña fue capaz de generar un gradiente de pH similar al de la columna de 23 mi y el perfil de UV para IFN-a2b, y separación de isoformas 1 y 4 usando diferentes reguladores de pH de elución también fueron similares a los resultados obtenidos para la columna más grande (figuras 6A-6C). Por lo tanto, la mayoría de los experimentos descritos más adelante se llevaron a cabo usando una columna de 0.5 cm x 20 cm, 3.9 mi.

E. Efectos de la concentración del regulador de pH: relación entre la pendiente del gradiente de pH y resolución En procedimientos de cromatoenfoque, el rendimiento de columna frecuentemente puede ser optimizado al manipular varias variables, incluyendo el intervalo y la pendiente del gradiente de pH. Para explorar si un intervalo de pH más estrecho con un gradiente más poco profundo sería útil para mejorar la resolución de las isoformas 1 y 4, examinamos los efectos de las concentraciones de fosfato en el regulador de pH de elución sobre la pendiente de gradiente de pH y resolución de isoforma.

La elución se realizó usando 20, 10 ó 5 mM de fosfato de sodio en presencia de 20 mM de NaCI, pH 6.0. La figura 7 muestra el tendido de los perfiles de cromatografía obtenidos con cada uno de estos reguladores de pH. Claramente, a medida que la concentración de fosfato de sodio disminuye, la elución de picos de IFN de la columna se retrasó y el pico se ensanchó (figura 7, panel superior). Como se esperaba, a concentraciones de regulador de pH, bajas 10 o 5 mM de fosfato de sodio, formación del gradiente de pH también se retrasó y la pendiente fue más poco profunda que la observada con el elución regulador de pH de 20/20 estándar (figura 7, panel medio).

Las pruebas de CLAR-FI demostraron el ensanchamiento de los picos para ambas isoformas 1 y 4, pero mejorando la separación de estas isoformas, ya que la concentración del regulador de pH fosfato de elución se redujo de 20 a 5 mM (figura 8A, 8C y 8E). Las cantidades totales de la isoforma 1 y la isoforma 4 que se eluyeron fueron similares para cada una de las 3 concentraciones de fosfato (figura 8G).

La relación entre la concentración de fosfato, gradiente de pH y resolución de la isoforma se muestra en la figura 8H. La mejora significativa en resolución de la isoforma con concentraciones de fosfato reducidas es consistente con cromatoenfoque convencional, que muestra la mejor resolución a concentraciones móviles más bajas de regulador de pH. La razón de esto es que la concentración de regulador de pH baja ayuda a generar un gradiente de pH poco profundo, que a su vez incrementa la resolución.

F. Impacto de la concentración de sal y fosfato sobre la unión de la ¡soforma 4 de IFN-a2b Los inventores de la presente examinaron el efecto de concentración iónica sobre la elución de IFN al realizar la elución usado un regulador de pH de elución a pH 6.0 que contenía 20 mM de fosfato de sodio y NaCS a 20 mM, 10 mM, 5 mM o 0 mM. Estos resultados se muestran en las figuras 9 y 10A-10J.

La elución de la isoforma 1 fue poco afectada por la concentración de NaCI en el regulador de pH de 20 mM de fosfato en términos de posición pico y agudeza (figura 9, panel superior; figuras 10A, 10C, 10E y 10G. Sin embargo, el pico de la isoforma 4 se ensanchó progresivamente a medida que la concentración de NaCI disminuyó (figuras 10A, 10C, 10E y 10G), indicando que la velocidad de elución de la isoforma 4 de la columna se redujo en ausencia de sales. El pH apareció relativamente sin cambiar por concentraciones de sal (figura 9, panel medio). En las fracciones en acervo, la cantidad total de isoformas 1 y 4 eluidas de la columna y su resolución fueron similares bajo diferentes condiciones de sal.

Puesto que los inventores de la presente habían determinado que la resolución de las isoformas 1 y 4 podría ser mejorada a concentraciones de regulador de pH bajas durante la elución, los inventores de la presente evaluaron el efecto de reducir la concentración de sal (ya sea 20 mM, 10 mM o 0 mM de NaCI) en un 10 mM de fosfato de sodio, regulador de pH de elución a pH 6.0. Los resultados se muestran en las figuras 1 1 A-11 G.

Similar a los resultados observados usando el regulador de pH de fosfato de sodio de elución 20 mM, el pico la isoforma 4 eluida con el regulador de pH de 10 mM de fosfato de sodio se ensanchó a medida que la concentración de NaCI disminuyó de 20 a 10 mM mientras el pico de la isoforma 1 fue poco afectada (figuras 1 1A-1 1 D). Sin embargo, a medida que la concentración de sal se redujo más a 0 mM, la isoforma 1 se eluyó como dos picos distintos (figuras 11 E-1 1 F), pero sólo una pequeña cantidad (1.6 %) de la isoforma 4 total se co-eluyó con el primer pico de la isoforma 1 (figuras 11 F-1 1 E). Por el contrario, 36% de la isoforma 4 total co-eluida con el pico de la isoforma 1 usando el regulador de elución a estándar de 20 mM de fosfato de sodio/20 mM de NaCI/pH 6.0.

El análisis cuantitativo indicó que la cantidad total de la isoforma 1 eluida de la columna no cambió por la concentración de sal a 10 mM de fosfato de sodio, mientras que la elución de la isoforma 4 fue suprimida mucho a medida que la concentración de sal era reducida (figura 1 1 G). Estos resultados sugieren que la columna de FF de DEAE Sepharose tiene más afinidad a la isoforma 4 que la isoforma 1 cuando la elución se realiza usando una concentración baja de regulador de pH sin sal. El análisis de pureza por prueba de CLAR-FI indicó que casi todas las fracciones de IFN tuvieron un porcentaje bajo de la isoforma 4 (< 1 %).

Para examinar adicionalmente la unión de las isoformas IFN-a2b a la columna a concentraciones bajas de regulador de pH, los inventores de la presente realizaron elución en un regulador de pH a pH 6.0 con una concentración de fosfato de sodio a 20, 17.5, 15, 12.5 ó 10 mM y sin sal. Los resultados se muestran en las figuras 12A-12L.

Comparado con la elución con el regulador de pH de 20/20 estándar, el pico de la isoforma 4 a 20 mM de fosfato de sodio/0 mM de NaCI se ensanchó pero su elución total no fue afectada. A medida que el fosfato de sodio se redujo de 20 a 17.5, 15, 12.5 y 10 mM, la elución de la isoforma 4 fue cada vez más retrasada o bloqueada con ensanchamiento correspondiente del pico de la isoforma 1 (figuras 12A.12C, 12E, 12G, 121 y 12K). Las pruebas ed CLAR-FI revelaron que casi todas las fracciones de la isoforma 1 que se eluyeron usando concentraciones bajas de regulador de pH (< 15 mM de fosfato de sodio) contenían un porcentaje muy bajo de isoforma 4. Un punto de transición para la isoforma 4 que se unía a la columna ocurrió entre 15 y 20 mM de fosfato de sodio, de manera similar debido a la precipitación incrementada de la isoforma 4 a esta concentración de fosfato.

G. Efecto de pH Debido a las influencias de pH, la carga neta y distribución de cargas de superficie sobre moléculas de proteína, cambia la constitución aniónica del regulador de pH móvil y puede modular el estado de carga de resinas de intercambio de aniones, los inventores de la presente evaluaron el efecto de variar el pH de 5.8 a 6.3 en la elución de las isoformas 1 y 4 de IFN-a2b con 20 mM de fosfato de sodio/20 mM de NaCI (20/20) o 17.5 mM de fosfato de sodio/0 mM de NaCI (17.5/0) de reguladores de pH de elución. Los resultados se muestran en la figuras 13A a 14F.

La elución usando el regulador de pH de 20/20 produjo perfiles muy similares para ambas isoformas a pH 5.8, 6.0 y 6.3; sin embargo, un ensanchamiento de cada pico de isoforma se observó a pH 6.3 (figuras 13A-13F). La cantidad total de cada isoforma que se eluyó de la columna también fue muy similar a cada pH (no se muestran datos). Estos resultados indicaron que la elución de IFN-a2b usando regulador de pH estándar y concentraciones de sal fue relativamente insensible al pH del regulador de pH.

Por el contrario, cuando la elución se realizó con 17.5 mM de fosfato de sodio/0 mM de NaCI, variando el pH entre 5.8 y 6.3 tuvo efectos significativos. Poca isoforma 4 se eluyó a pH 6.0 (figuras 14C y 14D). Sin embargo, a pH 5.8, el pico de la isoforma 1 se hizo más agudo y significativamente más isoforma 4 se eluyó de la columna (figuras 14A y 14B). A pH 6.3, la isoforma 1 se eluyó como dos picos, y básicamente no se eluyó isoforma 4 (figuras 14E y 14F). Por lo tanto, la elución de IFN-a2b fue muy sensible a cambios de pH relativamente pequeños a 17.5 mM de fosfato de sodio en ausencia de NaCI.

H. Recuperaciones totales y en acervo La elución total de la isoforma 1 bajo todas las condiciones descritas anteriormente fue muy similar y cercana a 100%, mientras que la elución de la isoforma 4 fue drásticamente reducida a fosfato de sodio < 17.5 mM en ausencia de NaCI. Sin embargo, la resolución mejorada de estas isoformas logradas con reguladores de pH de elución que contenían < 17.5 mM de fosfato de sodio/0 mM de NaCI en comparación con la elución con el regulador de pH de 20/20 estándar tiene un costo de eficiencia significativo: un volumen significativamente más grande de fracciones se necesitaría ponerse en acervo para lograr rendimientos de isoforma 1 altos, v.gr. >90%, con contaminación de isoforma 4 baja, v.gr., <3%, debido a la elución más lenta y retardada de picos de IFN.

Por lo tanto, se realizaron experimentos adicionales para intentar identificar las condiciones de elución que lograrían alta resolución de las isoformas 1 y 4.

III. Resultados y discusión - Serie experimental II En la segunda serie de experimentos, se usaron varias preparaciones de IFN-a2b sustancialmente purificadas diferentes, y se listan a continuación.

A. Efecto de regulador de pH y concentración de IFN sobre el volumen de elución a pH 6.0 Para evaluar el efecto sobre el volumen de elución de regulador de pH y la concentración de IFN a pH 6,0, los inventores de la presente compararon los volúmenes de elución obtenidos para dos de concentraciones de IFN-a2b diferentes (1.77 mg/ml y 3.49 mg/ml) usando el regulador de pH de elución de 20 mM de fosfato de sodio/20 mM de NaCI estándar a volúmenes de elución obtenidos para estas concentraciones de IFN usando concentraciones más bajas de regulador de pH en ausencia de sal. Los resultados se muestran en el cuadro MIA siguiente.

CUADRO MIA Volúmenes de elución para el pico de la isoforma 1 bajo condiciones diferentes Para la preparación de IFN 1 , el volumen de elución para el pico de la isoforma 1 incrementó en 35%, 95% y 220%, con elución a 15, 12.5 y 10 mM de fosfato, respectivamente, comparado con el volumen de usando el regulador de pH de 20/20 estándar (cuadro MIA, 2a. columna). Un patrón similar de volumen de elución cada vez mayor con disminución de la concentración de fosfato de sodio se observó para la preparación de IFN que contenía casi dos veces tanto IFN (cuadro NIA, 3a. columna). Sin embargo, la magnitud de este efecto de concentración de fosfato de sodio sobre el volumen de elución se incrementó a la concentración de IFN más alta. La concentración de IFN no afectó apreciablemente la resolución de las isoformas 1 y 4 en regulador de pH que carecía de NaCI, ya que la isoforma 1 de cualquier lote eluido como dos picos amplios con poca co-elución de la isoforma 4, la mayor parte de la cual se quedó en la columna (no se muestran datos).

B. Volumen de elución de IFN fue independiente de la concentración de regulador de pH a pH 585 Como se describe en la sección II. G anterior, el pH desplegó efectos notables sobre la elución de IFN a una concentración de fosfatos de sodio de 17 5 mM en ausencia de NaCI en el regulador de pH de elución, con un regulador de pH de elución a pH 5 85 que produce isoforma 1 como un pico agudo e incrementando la elución de la isoforma 4 mientras un regulador de pH de elución a pH 6 3 suprime la elución de la isoforma 4 pero generó un pico de isoforma 1 amplio. Para examinar la relación de la concentración de regulador de pH y elución de isoforma a pH, los inventores de la presente realizaron el procedimiento de cromatografía de DEAE estándar sobre la preparación de IFN 1 usando reguladores de pH de elución que no contenían sal y contenían fosfato de sodio a 17 5 mM, 15 mM, 12 5 mM o 10 mM a pH 5 85. Los resultados se muestran en las figuras 15A y 15B.

La elución de IFN fue progresivamente retardada a medida que la concentración del regulador de pH fosfato disminuyó de 17 5 a 10 mM (figura 15A, panel superior) Como se espera, la reducción de conductividad y la formación de gradiente de pH también fueron retardados a concentraciones de regulador de pH más bajas (figura 15A, paneles medio e inferior). Sin embargo, cuando los perfiles de elución de IFN fueron retardados excesivamente (los picos de IFN para cada concentración de regulador de pH fueron normalizados a la misma fracción para comparación), los inventores de la presente observaron que la forma del pico de la isoforma 1 fue aguda y remarcablemente similar entre las concentraciones de fosfato probadas, mientras que la isoforma 4 se eluyó cada vez más en las fracciones posteriores del pico de IFN (figura 15B). La observación de que la reducción de la concentración del regulador de pH a pH baja (5.85) no ensanchó significativamente el pico de la isoforma 1 como sería a un pH más alto (6 0-6 2), sugirió que un pH más bajo y una concentración de pH más baja de regulador de pH podría ser útil para la elución de la isoforma 1 sin incrementar drásticamente el volumen de elución.

IV Elución bifásica - Razonamiento, resultados y discusión Ninguno de los procedimientos de prueba anteriores proveyó separación satisfactoria de la isoforma 1 de la isoforma 4 acoplada con elución de la isoforma 1 en un volumen aceptablemente pequeño. Un volumen de acervo más grande de la isoforma 1 siempre se obtuvo con condiciones de elución, tal como concentraciones de regulador de pH fosfato más bajas, que ya sea facilitaron la unión de la isoforma 4 o mejoraron la separación de las ¡soformas 1 y 4. Por otra parte, aunque los inventores de la presente podrían obtener un pico de isoforma 1 más agudo y por lo tanto volúmenes de elución en acervo más pequeños con concentraciones de regulador de pH de fosfato más altas o pH más bajo, más isoforma se 4 co-eluyó con la isoforma 1 reduciendo así el rendimiento de la isoforma 1 que satisfizo los criterios de pureza deseados. En la primera serie de experimentos, los inventores de la presente observaron que la isoforma 4 no empezó a eluir en la mayoría de los casos hasta que el primer cuarto o mitad del pico de la isoforma 1 se había eluido.

Con base en estas observaciones, los inventores de la presente formularon la hipótesis de que el cambio de regulador de pH de elución a un regulador de pH de concentración más baja o regulador de pH a pH alto después de la elución de la primera mitad del pico de la isoforma 1 , es decir, mediante un procedimiento de elución de dos pasos o "bifásico", la supresión de la elución de la isoforma 4 ocurriría en la segunda mitad del pico de la isoforma 1 , permitiendo así que la isoforma 1 sea eluida en un volumen de elución más pequeño. Para probar esta hipótesis, el procedimiento de cromatografía de DEAE estándar descrito anteriormente se realizó en la columna de 3.9 mi excepto que el paso de elución individual fue reemplazado por un procedimiento de elución de dos pasos, es decir, bifásico. En el paso 1 , una solución de elución fuerte se aplicó a la columna después del paso de lavado y en el paso 2 se aplicó una solución de elución más débil con una composición diferente. Las velocidades de flujo fueron las mismas que se usaron para el paso de elución individual estándar. Los resultados obtenidos con varias composiciones para las soluciones de elución fuerte y débil se describen más adelante.

A. Elución bifásica con diferentes concentraciones de fosfato al mismo pH 1 , Elución de primera fase con 20 mM de fosfato, pH 6 1 , elución de segunda fase con 15 ó 12.5 mM de fosfato, pH 6 1 Una elución bifásica de IFN-a2b (preparación de IFN 2) se realizó con 6.7 volúmenes de lecho de la solución de elución fuerte (20 mM de fosfato de sodio, pH 6.1 ), seguido por 19 volúmenes de lecho de la solución de elución débil (15 mM o 12 mM de fosfato de sodio, pH 6.1 ). Los resultados se muestran en las figuras 16A-16C.

La isoforma 1 fue eficientemente eluida de la columna, con separación significativamente mejorada de la isoforma 4 en comparación con elución realizada usando las condiciones de 20/20 estándares (figura 16A). Sin embargo, el perfil de análisis de CLAR-FI se vio muy similar al obtenido usando un regulador de pH de elución de fosfato individual alto (20 mM de fosfato de sodio) a pH 6 1 (figura 16C). Alguna isoforma 4 eluida dentro de fracciones posteriores de la segunda mitad del pico de la isoforma 1 , que podría hacer a esas fracciones incapaces de formar acervo dependiendo de los criterios de pureza deseada. No se observó diferencia significativa en los perfiles de elución de la isoforma generados por las diferentes soluciones de elución, excepto que la anchura del pico de la isoforma 1 eluida usando 12.5 mM de fosfato de sodio (figura 16B) fue más grande que la elución con 15 mM de fosfato de sodio. Por lo tanto, la elución bifásica usando dos diferentes concentraciones de fosfato (15 ó 12.5 mM) a pH 6.1 no pareció óptima. 2. Elución de primera fase con 17.5 mM de fosfato, pH 5.85; elución de segunda fase con 5 mM de fosfato, pH 5.85 Se obtuvo un perfil muy diferente cuando la elución bifásica de IFN-a2b (preparación de IFN 5, volumen de carga de 3.2 mi) se realizó usando dos diferentes concentraciones de fosfato a pH 5.85. La primera fase de la elución se realizó con 5 ó 6 B.V. de 17 5 mM de fosfato de sodio, pH 585 seguido por elución con 19 volúmenes de lecho de 5 mM de fosfato de sodio, pH 5.85. Los resultados se muestran en las figuras 17A-17C.

En ambos experimentos, esencialmente cada fracción eluida a través del pico de la isoforma 1 fue mayor que 97% de pureza, con menos de 0 5% de isoforma 4 (figuras 17A-17C) Sin embargo, la isoforma 1 se eluyó con un pico mucho más agudo cuando la primera fase de la elución se realizó con seis en lugar de cinco B.V. de solución de elución fuerte. La fracción de pico de la isoforma 1 fue 2.5 mg/ml de IFN-a2b, casi dos veces la concentración de IFN de la fracción pico (1.3 mg/ml) obtenida en el procedimiento estándar. El siguiente cuadro muestra un análisis fraccional detallado que compara el rendimiento y la pureza logrados con la fase individual estándar y el experimento bifásico usando 8 B.V. de solución de elución fuerte.

CUADRO IV. B Comparación de procedimientos de elución estándar y bifásico El perfil de pH en el procedimiento de elución bifásico usando 6 B.V. de solución de elución fuerte demostró varias zonas de desplazamiento de pH formadas a lo largo de la longitud de la columna durante la elución (figura 18). Estas zonas se correlacionaron con cambios en conductividad durante la elución (figura 18, panel inferior). Un frente de desplazamiento agudo ocurrió entre pH 5.5 y pH 6.1. La isoforma 1 fue rápidamente eluida a pH 5.5 y se movió hacia abajo en la columna, y se enfocó en el frente de desplazamiento de pH. Por lo tanto, la formación de frentes de pH discretos explicaron el hecho de que la isoforma 1 se eluyó como un pico agudo durante la elución bifásica.

Se notó que algo de precipitación, disolvible al ajusfar el pH o concentración de sal, ocurrió particularmente a temperatura ambiente en varias fracciones con concentraciones de IFN altas, probablemente debido a las condiciones de conductividad bajas en el regulador de pH de elución. La recuperación total de la isoforma 1 en fracciones en acervo de conformidad con un criterio de pureza deseado fue tan alta como 99%. Se obtuvo un rendimiento similar con diferentes preparaciones de IFN-a2b y longitudes de columna (no se muestran datos).

C. Elución bifásica con diferente pH a la misma concentración de fosfato Los inventores de la presente también examinaron el efecto de mantener el regulador de pH de fosfato constante mientras se variaba el pH en un procedimiento de elución bifásico. Un regulador de pH, de pH más bajo, se usó a medida que la solución de elución fuerte para agudizar la elución del pico de la isoforma 1 . Un pH regulador de pH alto después se utilizó para inhibir la elución de la isoforma 4. 1 . Elución de primera fase con 17.5 mM de fosfato, pH 5.85; elución de segunda fase con 17.5 mM de fosfato, pH 6.3.

La columna de DEAE se cargó con preparación de IFN preparación de IFN4 y se lavó de conformidad con el procedimiento estándar. La elución bifásica se realizó usando 6.5 B.V. o 5.0 B.V. e 17.5 mM de fosfato de sodio, pH 5.85 seguido por 19 B.V. de 17.5 mM de fosfato de sodio, pH 6.3, respectivamente. Los resultados se muestran en las figuras 19A-19C.

Este procedimiento de elución bifásica usando 6.5 B.V. de solución de elución fuerte generó un perfil de análisis de CLAR-FI para las isoformas 1 y 4 que fue similar al perfil obtenido con 17.5 mM de fosfato de sodio, pH 5.85 solo (figuras 19A-19C). Aunque la pureza de IFN (>96%) y rendimiento formado en acervo fueron mejorados sobre el procedimiento estándar, una baja cantidad de isoforma 4 se eluyó en las últimas fracciones del pico de IFN. El acortamiento del paso de elución fuerte a 5 B.V. no mejoró la resolución de la isoforma; más bien, más isoforma 4 se eluyó durante las últimas fracciones del pico de la isoforma 1 (figura 19B). 2. Elución de primera fase con 17.5 mM de fosfato, pH 5.85; elución de segunda fase con 17.5 mM de fosfato, pH 7.9 Puesto que el fosfato regulador de pH con pH alto (pH 6.3) no superó a la isoforma 4 que se eluyó en la última parte del pico de IFN, un pH aún más alto se intentó para el paso de elución débil. Para este experimento, se usó la preparación 5 de IFN-a2b. La columna cargada y lavada se trató con 6.5 B.V. de 17.5 mM de fosfato de sodio, pH 5.85 y después 15 B.V. de 17.5 mM de fosfato de sodio, pH 7.9. Los resultados se muestran en la figura 20A-20C.

La isoforma 1 se eluyó como un pico agudo en un volumen pequeño, pero sorprendentemente, una cantidad grande de isoforma 4 también se eluyó en este pico (figura 20A). La resolución de isoformas A fue incluso peor cuando se usó sólo 3.7 B.V. de solución de elución fuerte (figura 20B), contrario a la suposición de los inventores de la presente de que el uso de menos volumen del regulador de pH de elución fuerte a pH 5.85 reduciría la elución de la isoforma 4. 3. Un papel crítico para conductividad baja en la supresión de la elución de la isoforma 4 El hecho de que la elución con 17 5 mM de regulador de pH de fosfato de sodio ya sea a pH 6.3 o pH 7.9 no redujo sino más bien incrementó la elución de la isoforma 4 fue perplejante ya que las condiciones de pH alto de otra manera facilitarían la unión de la isoforma 4 a la resina de DEAE. Las figuras 21A-21 F ilustran el traslape de la conductividad, pH y OD280 de varios experimentos de elución bifásicos. IFN se eluyó en un intervalos de pH similar en estos experimentos, pero la conductividad bajo el pico de la isoforma 1 desplegó los diferentes perfiles. En todos los casos, la conductividad durante la elución primero disminuyó, se niveló y después se incrementó, formando una forma de copa dentro de o alrededor del pico de la isoforma 1 . Sin embargo, el tamaño del fondo de la copa varió con los volúmenes de lecho de la elución fuerte. La copa se hizo más profunda y más grande a medida que la longitud del primer paso de elución se incrementó, especialmente cuando el regulador de pH con pH 7.9 se usó para el segundo paso de elución. De manera más importante, la conductividad elevada dentro de la segunda mitad del pico de la isoforma 1 , especialmente después de un primer paso de elución corto (figuras 21A-21 F). El incremento en la conductividad durante el paso de elución débil se correlacionó bien con la cantidad de isoforma 4 que se co-eluyó con la isoforma 1 . Esto sugiere que la conductividad jugó un papel crítico en la elución de la isoforma 4. El regulador de pH con pH alto, en particular, el pH 7 9 regulador de pH, incrementó significativamente la conductividad del efluente, y por lo tanto incrementó la velocidad de elución de la isoforma 4.

D Uso de diferentes concentraciones de fosfato a diferentes valores de pH Puesto que las conductividades más altas probablemente explicaron la elución de la isoforma 4, los inventores de la presente realizaron elución bifásica sobre la preparación 5 de IFN-a2b usando varios volúmenes (2 a 6 B.V. ) de solución de elución fuerte (17.5 mM de fosfato de sodio, pH 5.85) seguido por una elución de segunda fase con 15 B.V. de una concentración de fosfato mucho más baja (5 mM de fosfato de sodio) a pH 7 9 para probar la posibilidad de que esta elución suprimiera la elución de la isoforma 4. Como se espera, una conductividad mucho más baja (0.73 mS/cm) se detectó durante la segunda fase de la elución bajo estas condiciones (no se muestran datos). Los resultados de la elución se muestran en las figuras 22A-22J.

Una cantidad relativamente pequeña de la isoforma 4 se eluyó mientras la isoforma 1 fue eluida efectivamente como un pico agudo. La eficiencia de separación de la isoforma fue mejorada en gran medida sobre la elución bifásica usando concentración de fosfato más alta (17.5 mM de fosfato de sodio, pH 7.9) para la fase de elución débil (comparar las figuras 19A-19C y 20A-20C con 22A-22J). Esto demuestra además la importancia de la baja conductividad en la supresión de la elución de la isoforma 4.

La longitud del paso de elución de la primera fase usando regulador de pH fuerte no cambió drásticamente el perfil de elución para las isoformas 1 y 4, excepto que incrementó la longitud del paso de elución de la primera fase pareció reducir el tiempo de retención de ambas isoformas sobre la columna (figuras 22A-22J) y hubo también una cantidad más alta (12%) de isoforma 1 no eluida que quedó en la columna cuando se utilizó una longitud más corta (3 B.V.) de la elución del regulador de pH fuerte. El pico de la isoforma 1 eluida fue más agudo y hubo sólo 3% de isoforma 1 no eluida cuando la elución fuerte se realizó con 6 B.V, de regulador de pH.

Tomado en conjunto, el procedimiento de elución bifásica con 17.5 mM de fosfato, pH 5.85 y 5 mM de fosfato, pH 7.9 proveyó mejora significativa sobre la cromatografía estándar del procedimiento de DEAE. Sin embargo, una o dos de las últimas fracciones en el pico de la isoforma 1 aún contenían un porcentaje más alto de la isoforma 4 que sería aceptable para permitir que esas fracciones se formaran en acervo con las fracciones anteriores.

E. Efectos de parámetros adicionales sobre la elución bifásica usando 17 .5 mM y 5 mM de fosfato, pH 5.85 Se examinaron varios parámetros adicionales que podrían afectar el rendimiento de columna, incluyendo la cantidad de IFN, concentración del segundo regulador de pH, longitud de la columna, y velocidades de flujo. 1. Carga Efectos de la concentración de IFN cargada sobre la columna se examinaron al variar las cantidades alimentadas de 0.5X, 1X y 1.5X de la carga estándar (aproximadamente 3.5 mg/ml), que es 75% del volumen de columna. La elución de la primera fase se realizó con 6 B.V. de 17.5 mM de fosfato de sodio, pH 5.85 seguida por elución de segunda fase con 15 B.V, de 5.0 mM de fosfato de sodio, pH 5.85. Los resultados se muestran en las figuras 23A-23F.

Las cargas de IFN a 0.5-1.5X de la carga regular dieron perfiles de elución similares, dando eficiencias de separación similares de las isoformas 1 y 4. Como se espera, la altura pico fue más baja a una carga de 0.5X que la carga regular (1X). Sin embargo, la altura pico a una carga de 1.5X no fue más alta pero más amplia que en la carga de 1X. Además, un pico de OD320 (aproximadamente 2% del pico de OD280) se eluyó a la carga de 1.5X que no se observó a una carga de 1X. Esto indica que alguna precipitación ocurrió durante la elución a 1.5X. El análisis de CLAR-FI indicó que la isoforma 4 fue baja a través del pico de la isoforma 1 bajo todas estas condiciones de carga aunque el por ciento de la isoforma 4 fue ligeramente más alto (1-2%) en las últimas fracciones del pico de la isoforma 1 en la carga alta (1.5X) que en la carga más baja (<0.6% de isoforma 4 en 0.5X y 1 X). Estos datos sugieren que el rendimiento de la columna es muy consistente dentro del intervalo de 0.5-1.5X de la carga de alimentación. 2. Concentración de fosfato en el regulador de pH de elución débil Diferentes concentraciones de fosfato en el regulador de pH de elución débil se examinaron para examinar adicionalmente la elución de la isoforma 1 después del paso de elución de primera fase y los resultados se muestran en las figuras 24A-24H. De manera interesante, las concentraciones de fosfato que varían de 12.5 a 5 mM a pH 5.85 fueron capaces de inhibir la elución de la isoforma 4 de la columna. La mayoría de las fracciones de la isoforma 1 contenían menos de 0.5% de la isoforma 4. Sin embargo, la altura pico para la isoforma 1 disminuyó de 2.5 a aproximadamente 0.8 mg/ml a medida que la concentración del regulador de pH de elución incrementó de 5 a 12.5 mM. Por lo tanto, las concentraciones de regulador de pH de elución débil dentro del intervalo probado (5-12.5 mM) afectaron el enfoque o agudeza del pico de la isoforma 1 pero sin embargo fueron suficientemente bajas en conductividad para suprimir la elución de la isoforma 4. 3. Longitud de la columna La elución biofásica sobre cromatografía de DEAE se realizó en columnas de 0.5 cm de diámetro de tres longitudes diferentes (5, 10 y 20 cm) y en una columna de 1 cm de diámetro x 29 cm de longitud. Los resultados se muestran en las figuras 25A-25H.

Claramente la longitud de la columna tuvo algún efecto sobre la elución de la isoforma 4. Aunque la agudeza del pico de la isoforma 1 desplegó perfiles similares con estas columnas, la eficiencia de separación de las isoformas 1 y 4 difirió con las longitudes de la columna. A medida que la longitud disminuyó, la cantidad de isoforma 4 que se eluyó en las últimas fracciones de la isoforma 1 se incrementó significativamente de <0.5% con una columna de 20 cm de longitud a aproximadamente 2.5% con una columna de 5 ó 10 cm de longitud. La columna (1 .0 cm x 29 cm) mostró separación altamente efectiva de las isoformas 1 y 4 con todas las fracciones pico de la isoforma 1 conteniendo menos de 0.5% de la isoforma 4. Además, la concentración de las fracciones pico de la isoforma 1 alcanzaron tan alto como 3.6 mg/ml. La concentración fue tan alta que algo de precipitación de IFN ocurrió incluso a 4°C; esta precipitación sin embargo se pudo disolver ajusfando el pH o concentración de sal como se estableció anteriormente. Estos resultados sugieren que una longitud de columna de aproximadamente 20 cm se requiere para rendimiento satisfactorio. 4. Velocidad de flujo El impacto de la velocidad de flujo sobre la elución bifásica usando elución de primera fase con 17.5 mM de fosfato y elución de segunda fase con 5 mM de fosfato, pH 5.85, se examinó por corrimiento de la columna (0.5 x 10 cm) a 5 cm/min o 0.5 cm/min. Los resultados mostraron que la velocidad de flujo no alteró significativamente lo esperado de la separación bajo estas condiciones (figura 26A-26B). Sin embargo, el corrimiento a velocidades de flujo más bajas pareció mejorar la eficiencia de separación. Esto es consistente con la observación general de que la velocidad de flujo más baja mejora el rendimiento de columna.

Conclusiones Con base en los datos de los inventores de la presente en el reporte previo, un procedimiento de elución de dos pasos, o "bifásico", para cromatoenfoque de DEAE de IFN se desarrolló en este estudio, permitiendo la separación efectiva de la isoforma 1 de la isoforma 4 en un volumen de elución pequeño. El uso de concentraciones altas y bajas de regulador de pH de fosfato a pH 6, o regulador de pH con pH bajo y alto a diferentes concentraciones dio por resultado una mejora significativa sobre la elución de un solo paso usada en el procedimiento de cromatografía de DEAE estándar, aunque algunas fracciones muy tardías en el pico de la isoforma 1 contenían porcentajes relativamente altos de la isoforma 4. La combinación de la primera fase de elución con 17.5 mM de fosfato a pH 5.85 seguido por una segunda fase de elución con 5 mM de fosfato a pH 5.85 dio los resultados más satisfactorios en términos de la pureza, recuperación y volumen de acervo finales de la isoforma 1.

La conductividad generada durante la elución jugó un papel crítico en la elución de la isoforma. La conductividad por arriba del valor de umbral de 1 mS/cm pareció incrementar la elución de la isoforma 4.

El procedimiento de elución bifásica dio resultados razonablemente consistentes dentro del intervalo probado de carga de IFN (0.5-1.X del procedimiento actual), velocidades de flujo (0.5-5 cm/min) y las longitudes de columna (10-30 cm). La sobrecarga de la columna incrementó la elución de la isoforma 4 en las últimas fracciones del pico de la isoforma 1 . La longitud de columna tuvo un impacto sobre el rendimiento de la columna, con columnas de longitudes más cortas (<10 cm) produciendo menos separación eficiente de las isoformas 1 y 4.

La presente invención no ha de ser limitada en alcance por las modalidades específicas descritas en la presente. De hecho, varias modificaciones de la invención, además de aquellas descritas aquí, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior. Se pretende que dichas modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Las patentes, solicitudes de patente, publicaciones, descripciones de producto y protocolos se citan a lo largo de esta solicitud, cuyas descripciones son incorporadas aquí por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Claims (29)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para separar la ¡soforma monomérica oxidada de un interferón (IFN) de una o más isoformas no deseadas de ese IFN en una mezcla de isoformas producidas recombinantes del IFN, el método comprendiendo: (a) proveer la mezcla de isoformas de IFN en una primera solución reguladora de pH; (b) proveer una columna de cromatografía que es mayor que 15 cm de longitud y empacada con una resina de intercambio de aniones que es equilibrada con la primera o a una segunda solución reguladora de pH; (c) cargar la solución de IFN regulada en su pH en la columna de intercambio de aniones; (d) lavar la columna cargada con una solución de lavado; (e) aplicar a la columna lavada una solución de elución fuerte en una cantidad que es 1 a 10 volúmenes de lecho de la columna, en donde la solución de elución fuerte comprende una primera concentración de fosfato de 10 a 30 mM y tiene un pH de 5.4 a 6.6; (f) aplicar a la columna del paso (e) una solución de elución débil en una cantidad que es 2 a 20 volúmenes de lecho de la columna, en donde la solución de elución débil comprende una segunda concentración de fosfato que es menor que la primera concentración de fosfato y tiene un pH de 5.4 a 6.6; y (g) recolectar una pluralidad de fracciones eluidas que contienen la isoforma monomérica de IFN oxidada.

2 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la resina de intercambio de aniones es una resina de intercambio de aniones de dietilaminoetilo.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque la resina de intercambio de aniones es DEAE Sepharose de flujo rápido.

4 - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque el IFN es un IFN de tipo I.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el IFN es un interferón alfa (IFN-a).

6. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el IFN es un IFN-a2 y cada una de la primera y segunda soluciones reguladoras de pH consiste esencialmente de 10 mM de Tris, 0-40 mM de NaCI y tiene un pH de 7.0 a 8.5.

7. - El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque la primera solución reguladora de pH consiste esencialmente de 10 mM de Tris, 40 mM de NaCI y tiene un pH de 8.0, la segunda solución reguladora de pH consiste esencialmente de 10 mM de Tris y tiene un pH de 8.0 y la solución de lavado consiste esencialmente de 10 mM de Tris y 14 mM de NaCI y tiene un pH de 8.0.

8. - El método de conformidad con las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado además porque la primera concentración de fosfato es aproximadamente 17.5 mM y la segunda concentración de fosfato es aproximadamente 5 mM a aproximadamente 7 mM y cada una de las soluciones de elución fuerte y débil tiene un pH de 5.85.

9. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el IFN es un IFN-a2, la solución de elución fuerte consiste esencialmente de 17.5 mM de fosfato de sodio y la solución de elución débil consiste esencialmente de 5 mM de fosfato de sodio.

10. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado además porque cada uno de los pasos (c), (d), (e) y (f) se lleva a cabo a una velocidad de flujo de 0.5 a 2.5 cm/min.

11. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado además porque cada uno de los pasos (c) y (d) se lleva a cabo a una velocidad de flujo de 2 cm/min y cada uno de los pasos (e) y (f) se lleva a cabo a una velocidad de flujo de 1 cm/min.

12.- El método de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque el IFN es IFN-a2b y la concentración de la isoforma 1 de IFN-a2b en la solución de IFN es entre aproximadamente 1 .75 mg/ml y aproximadamente 5.25 mg/ml.

13. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la concentración de la isoforma 1 de IFN-a2b en la solución de IFN es aproximadamente 3.5 mg/ml.

14. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la cantidad de la solución de elución fuerte aplicada en el paso (e) es 6 volúmenes de lecho y la cantidad de la solución pico aplicada en el paso (f) es 15 volúmenes de lecho.

15. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado además porque el volumen de cada una de las fracciones eluidas recolectadas en el paso (g) es aproximadamente 20% del volumen de lecho.

16. - El método de conformidad con cualquiera . de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado además porque el IFN es IFN-a2b y de aproximadamente 3% a aproximadamente 20% de las isoformas en la solución de IFN comprende la isoforma 4 de IFN-a2b.

17. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque de 6% a 10% de las isoformas en la solución de IFN comprende la isoforma 4 de IFN-a2b.

18. - Un método para separar la isoforma 1 de ¡nterferón alfa-2b (IFN-a2b) de la isoforma 4 de IFN-a2b en una mezcla de isoformas recombinantemente producidas de IFN-a2b, el método comprendiendo: (a) proveer una columna de cromatografía de intercambio de aniones de dietilaminoetilo (DEAE) que es por lo menos aproximadamente 20 cm de longitud y está equilibrada con una solución reguladora de pH que consiste esencialmente de 10 m de Tris y un pH de 8.0; (b) cargar la mezcla de IFN-a2b en la columna de DEAE en un regulador de pH de carga que consiste esencialmente de 10 mM de Tris, 40 mM de NaCI, y tiene un pH de 7.5 a 8.0, en donde la mezcla de IFN-a2b es cargada a una velocidad de flujo de 2 cm por minuto; (c) lavar la columna cargada con 3 volúmenes de lecho de una solución de lavado a una velocidad de flujo de 2 cm por minuto, en donde la solución de lavado consiste esencialmente de 10 mM de Tris HCI y 13 mM de NaCI, y tiene un pH de 8.0; (d) aplicar a la columna lavada 6 volúmenes de lecho de una solución de elución fuerte a una velocidad de flujo de 1 cm por minuto, en donde la solución de elución fuerte consiste esencialmente de 17.5 mM de fosfato de sodio y tiene un pH de 5.85; (e) aplicar a la columna del paso (d) 15 volúmenes de lecho de una solución de elución débil a una velocidad de flujo de 1 cm por minuto, en donde la solución de elución débil consiste esencialmente de 5 mM de fosfato de sodio y tiene un pH de 5.85; y (f) recolectar una pluralidad de fracciones eluidas que contienen la isoforma 1.

19. - El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque comprende adicionalmente combinar las fracciones eluidas recolectadas en las cuales la cantidad de isoforma 4 es menor que un criterio de pureza deseado.

20. - El método de conformidad con la reivindicación 18 ó 19, caracterizado además porque el volumen de cada una de las fracciones recolectadas en el paso (f) es aproximadamente 20% del volumen de lecho.

21 . - Un método para separar una isoforma deseada de un interferón (IFN) de una o más isoformas no deseadas de ese IFN en una mezcla de isoformas del IFN recombinantemente producidas, el método comprendiendo: (a) proveer una columna de cromatografía que es por lo menos aproximadamente 20 cm de longitud y está empacada con una resina de intercambio de aniones de dietilaminoetilo que está equilibrada con una solución reguladora de pH, en donde la solución regulador de pH consiste esencialmente de aproximadamente 10 mM de Tris y un pH de aproximadamente 8.0; (b) aplicar la mezcla de isoforma de IFN a la columna de intercambio de aniones en una solución de carga de aproximadamente 10 mM de Tris y aproximadamente 40 mM de NaCI y que tiene un pH de aproximadamente 8.0; (c) lavar la columna del paso (b) con aproximadamente 3 volúmenes de lecho de una solución de lavado, en donde la solución de lavado consiste esencialmente de aproximadamente 10 mM de Tris HCI y aproximadamente 13 mM de NaCI, y tiene un pH de aproximadamente 8.0; (d) aplicar a la columna lavada aproximadamente 6 volúmenes de lecho de una solución de elución fuerte a una velocidad de flujo de 0.5 a 2.5 cm/min, en donde la solución de elución fuerte tiene una primera concentración de fosfato de 15 a 25 mM y un pH de entre 5.7 y 6.1 ; (e) aplicar a la columna del paso (d) aproximadamente 15 volúmenes de lecho de una solución de elución débil a una velocidad de flujo de 0.5 a 2.5 cm/min, en donde la solución de elución débil tiene una segunda concentración de fosfato que es menor que la primera concentración de fosfato y tiene un pH de entre 5.7 y 6.1 ; y (f) recolectar una pluralidad de fracciones eluidas que contienen la isoforma de IFN deseada; y (g) combinar las fracciones eluidas recolectadas en las cuales la cantidad de las isoformas de IFN no deseadas es menor que un criterio de pureza deseado.

22.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque la isoforma deseada es la isoforma monomérica oxidada del IFN.

23. - El método de conformidad con la reivindicación 21 ó 22, caracterizado además porque cada uno de los pasos (b) y (c) se llevan a cabo a una velocidad de flujo de 2 cm por minuto.

24. - El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque cada uno de los pasos (d) y (e) se llevan a cabo a una velocidad de flujo de 1 cm/min.

25. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-24, caracterizado además porque el IFN es un IFN-a2, la solución de elución fuerte consiste esencialmente de 17 mM de fosfato de sodio y tiene un pH de 5.85.

26. - El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque la solución de elución débil consiste esencialmente de 5 mM de fosfato de sodio y tiene un pH de 5.85.

27. - El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque la concentración de IFN-a2 en la solución de IFN es entre aproximadamente 1.75 mg/ml y aproximadamente 5.25 mg/ml.

28. - El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el IFN es IFN-a2b.

29. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 28, caracterizado además porque el IFN es producido en una bacteria recombinante.