PL207775B1

PL207775B1 - Sposób izolowania biologicznie czynnego poprawnie zwiniętego czynnika stymulującego kolonie granulocytów (G-CSF)

Info

Publication number: PL207775B1
Application number: PL369669A
Authority: PL
Inventors: Porekar Vladka Gaberc; Viktor Menart
Original assignee: Lek Pharmaceuticals
Priority date: 2001-12-19
Filing date: 2002-12-05
Publication date: 2011-01-31
Also published as: SI1458757T1; HK1064681A1; HUP0402547A3; EP2053061A1; CA2469984C; NZ533305A; AU2002366275B2; EP1458757B1; US20050159589A1; MXPA04006076A; RU2358980C2; DE60231243D1; KR20040071212A; HUP0402547A2; HRP20040572A2; CA2469984A1; BR0215191A; WO2003051922A1; CN1606568A; RU2004121982A

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy nowego izolowania biologicznie czynnego poprawnie zwiniętego czynnika stymulującego kolonie granulocytów (G-CSF) przez zastosowanie chromatografii powinowactwa do unieruchomionego metalu (immobilized metal affinity chromatography - IMAC).

G-CSF należy do grupy czynników stymulujących kolonie, które regulują różnicowanie i proliferację hematopoetycznych komórek prekursorowych i aktywację dojrzałych neutrofili. G-CSF jest stosowany w medycynie w dziedzinie hematologii i onkologii. Klinicznie dostępne są dwa typy G-CSF: forma glikozylowana (lenograstim), która jest produkowana przez zastosowanie ekspresji w komórkach ssaków i postać nieglikozylowana (filgrastim), która jest produkowana przez stosowanie ekspresji w bakterii Escherichia coli (E. coli).

Nieglikozylowana forma G-CSF (filgrastim) i jej wytwarzanie są opisane w EP 237545 podczas gdy glikozylowana forma G-CSF (lenograstim) i jej wytwarzanie są opisane w EP 169566.

Procesy izolowania G-CSF, które są znane z opisów patentowych i literatury naukowej obejmują różne kombinacje chromatografii jonowymiennej, chromatografii ogniskowania, chromatografii interakcji hydrofobowych, sączenia w żelu i kilka innych metod.

Na ogół pierwszy etap procesu izolowania G-CSF zależy od organizmu gospodarza dla heterologicznej ekspresji G-CSF. Dla ekspresji w E. coli, G-CSF spotyka się w nierozpuszczalnych ciałach inkluzyjnych. Konwencjonalne procesy zawierają więc na ogół dodatkowe etapy w celu izolowania G-CSF z ciał inkluzyjnych prowadzące do prawidłowo zwiniętej biologicznie czynnej formy.

Te etapy na ogół obejmują płukanie detergentami lub substancjami chaotropowymi, stabilizację silnymi czynnikami denaturującymi (np. chlorowodorek guanidyny (GndHCI), mocznik) lub wysokimi stężeniami detergentów (np. N-lauroilosarkozyna (sarkozyl) lub sól sodowa siarczanu dodecylu (SDS)), częściowe oczyszczenie solubilizowanego denaturowanego białka stosując sączenie w żelu, HPLC fazy odwróconej (RP-HPLC) i renaturację przez stosowanie rozcieńczenia czynnika denaturującego lub przez zastosowanie dializy. Dla ekspresji G-CSF w drożdżach lub komórkach ssaków ciała inkluzyjne lub podobne struktury są spotykane rzadko i proces oczyszczania i/lub izolacji w tych przypadkach zaczyna się bezpośrednio po sekrecji G-CSF. Procesy oczyszczania i/lub izolacji G-CSF są opisane w następujących zgłoszeniach i patentach: EP 169566, EP 237545, EP 215126, EP 243153, US 5055555 i WO 0104154. Procesy dla G-CSF są także opisane w literaturze naukowej: Lu, H.S. i wsp. w Protein Expr Purif 4, 465-472 (1993), Kang, S.H. i wsp. w Biotechnol. Lett. 17, 687-692 (1995), Wingfield, P i wsp. w Biochem J 256, 213-218 (1988), Kang, S.H. i wsp. w Biotechnol. Lett. 17, 687-692 (1995), Yamasaki, M. i wsp. w Biosci Biotechnol Biochem 62, 1528-1534 (1998), Wingfield, P. i wsp. w Blochem J 256, 213-218 (1988), Bae, CS. i wsp. w Biotechnol. Bioeng. 57, 600609 (1998).

W przypadku pewnych innych białek stosowano także IMAC do częściowego oczyszczania i renaturacji. IMAC po raz pierwszy opisano w Porath i wsp. w Nature 258, 598-599 (1975) i jest oparty na wiązaniu białek do immobilizowanych jonów metali, które są chelatowane do różnych nośników IMAC. Grupy dawcy elektronów w sekwencji aminokwasów białka są odpowiedzialne za koordynowane wiązanie do nośnika, szczególnie pierścienie imidazolowe reszt histydyny. Izolacja zrekombinowanych białek z uzyskanymi, za pomocą technik inżynierii genetycznej, znacznikami powinowactwa histydyny na N-albo C-końcach białka przez zastosowanie IMAC było opisane przez Hochuli, E. i wsp. w Bio/Technology 1321-1325 (1988), Chaga, G. i wsp. w Biotechnol Appl Biochem 29 (część 1), 19-24 (1999) i Jeong, J.K. i Lee S.Y. Białko Expr. Purif, 23: 311-318 (2001). Zastosowanie IMAC do badania małych topograficznych różnic między cząsteczkami białka opisał Sulkowski w Trends Biotechnol 3, 1-7 (1985) i Hemdan i wsp. w Proc NatI Acad Sci USA 86, 1811 - 1815 (1989).

Proces oczyszczania pewnych innych białek, które zawierają reszty histydyny z zastosowaniem IMAC był opisany w US 5932102.

Proces oczyszczania białek z powierzchniowymi aminokwasami zdolnymi do wiązania jonów metali jest opisany w WO 9012803. W tym procesie IMAC jest opisany jako dodatkowy etap po częściowym oczyszczeniu białek przez stosowanie kilku innych metod chromatograficznych. Nie są opisane ani izolacja ani rozdzielanie niezdenaturowanych lub biologicznie czynnych cząsteczek G-CSF od zdenaturowanych lub biologicznie nieczynnych cząsteczek G-CSF w warunkach natywnych przez zastosowanie IMAC.

Porównawcze badania G-CSF, i interakcji jego postaci znakowanych Ser-17 i (His6)-tag do specyficznego kompleksu jonów metalu z barwnikiem były opisane (Zaveckas, M. i wsp. w J Chromatogr

PL 207 775 B1

A 904, 145-169 (2000). W oparciu o ocenę zachowania chromatograficznego bromelainy i czystego G-CSF na kolumnach IDA wolnych od metalu i naładowanych Hg(II) (iminodioctan), Gelunaite, L. i wsp. w J Chromatogr A 904, 131-143 (2000) próbowali ocenić zdolność naładowanego Hg (II)-IMAC (Sepharose IDA) do wyekstrahowania G-CSF w warunkach denaturujących z solubilizowanych detergentem ciał inkluzyjnych.

IMAC z immobilizowanymi jonami Zn (II) lub Ni (II) był stosowany także jako metoda renaturacji denaturowanej GndHCI interleukiny-3, G-CSF i czynnika kolonii granulocytów makrofagów (GM-CSF) (Rozenaite, V. i wsp. w skrócie plakatu, P-104, Cordoba, Hiszpania, 19-22 kwietnia (1998)). Denaturowane białka były związane z nośnikiem IMAC w warunkach denaturujących.

Opis rozdziału biologicznie czynnych, monomerycznych, prawidłowo zwiniętych cząsteczek G-CSF od oligomerycznych, polimerycznych lub biologicznie nieczynnych monomerycznych form lub nieprawidłowo zwiniętych cząsteczek G-CSF przez stosowanie IMAC w warunkach natywnych nie jest spotykany ani w literaturze naukowej ani patentowej.

W stanie techniki nie ma też ż adnych opisów oczyszczania i/lub izolacji biologicznie czynnego G-CSF z surowego roztworu lub mieszaniny zawierającej cząsteczki biologicznie czynnego G-CSF i zanieczyszczenia przez wiązanie prawidłowo zwiniętych biologicznie czynnych monomerycznych form G-CSF (tzn. te cząsteczki, które są już obecne w roztworze lub mieszaninie) do nośnika IMAC w warunkach natywnych. Dodatkowo rozdzia ł czą steczek G-CSF według ich stanu konformacji nie by ł opisany.

Wszystkie sposoby oczyszczania i/lub izolacji G-CSF spotykane w stanie techniki obejmują kilka etapów. Zastosowanie tylko jednego etapu chromatografii tak jak przy rozdziale G-CSF według jego aktywności biologicznej i prawidłowego zwinięcia jak i dla rozdziału od zanieczyszczeń obecnych w roztworze lub mieszaninie i takż e jako skuteczny sposób zatężania G-CSF i produkcję biologicznie czynnego G-CSF z czystością większą niż 95% tak, że potrzebne jest tylko dodatkowe polerowanie, nie było opisane w stanie techniki.

Celem wynalazku jest polepszenie stopnia izolowania G-CSF i dostarczenie biologicznie czynnego G-CSF w wysoce oczyszczonej i aktywnej postaci, oraz jako zawierającą go kompozycję farmaceutyczną.

Według tego wynalazku nieoczekiwanie stwierdzono, że prawidłowo zwinięte i biologicznie czynne cząsteczki G-CSF mogą być oddzielone od nieprawidłowo zwiniętych lub biologicznie nieczynnych cząsteczek G-CSF w warunkach natywnych przez stosowanie IMAC. Proces izolowania biologicznie czynnego G-CSF według wynalazku obejmuje rozdział prawidłowo zwiniętych i biologicznie czynnych cząsteczek G-CSF od nieprawidłowo zwiniętych lub biologicznie nieczynnych cząsteczek G-CSF i także od większości białek gospodarza stosując IMAC w warunkach natywnych. Za pomocą tego procesu prawidłowo zwinięte i biologicznie czynne cząsteczki G-CSF specyficznie wiążą się do nośnika IMAC podczas gdy nieprawidłowo zwinięte i biologicznie nieczynne formy G-CSF i większość zanieczyszczeń pozostaje w eluacie. Proces izolowania według wynalazku także obejmuje rozdział biologicznie czynnych monomerycznych form G-CSF od oligomerycznych, polimerycznych i biologicznie nieczynnych monomerycznych form G-CSF. Biologicznie czynne monomeryczne formy G-CSF są specyficznie związane z nośnikiem IMAC podczas gdy oligomeryczne, polimeryczne i biologicznie nieczynne monomeryczne formy G-CSF zasadniczo pozostają w eluacie.

Proces według wynalazku przedstawia skuteczny etap oczyszczania i zatężania prawidłowo zwiniętych biologicznie czynnych monomerycznych form cząsteczek G-CSF i może być stosowany jako kluczowy etap w całym procesie oczyszczania i izolowania G-CSF.

Przedmiotem wynalazku jest sposób izolowania biologicznie czynnego poprawnie zwiniętego czynnika stymulującego kolonie granulocytów (G-CSF), polegający na tym, że biologicznie czynny poprawnie zwinięty G-CSF izoluje się z mieszaniny zawierającej niepoprawnie zwinięty biologicznie nieaktywny G-CSF i zanieczyszczenia, przez poddanie tej mieszaniny chromatografii powinowactwa do unieruchomionego metalu (IMAC), którą prowadzi się w środowisku wolnym od czynnika denaturującego w następujących etapach:

- nanosi się mieszaninę , która zawiera biologicznie czynną formę G-CSF w obecnoś ci zanieczyszczenia, na nośnik IMAC,

- biologicznie czynna forma G-CSF selektywnie wiąże się z noś nikiem IMAC,

- pł ucze się kolumnę IMAC,

- eluuje się biologicznie czynną formę G-CSF z nośnika IMAC,

PL 207 775 B1 i w sposobie tym przeprowadza się IMAC z chelatowanym jonem metalu zwią zanym do noś nika IMAC, przy czym jonem metalu nie jest Hg.

Korzystnie w sposobie według wynalazku biologicznie czynny poprawnie zwinięty G-CSF izoluje się z mieszaniny zawierającej zanieczyszczenie, które jest przynajmniej jedną substancją wybraną z grupy substancji złożonej z biologicznie nieczynnych monomerycznych form i nieprawidłowo zwiniętych cząsteczek G-CSF, oligomerycznych i polimerycznych form G-CSF, zdenaturowanych form G-CSF, białek komórek gospodarza i innych zanieczyszczeń (składników) komórek gospodarza; przy czym IMAC jest przeprowadzony tak, że zanieczyszczenie jest zasadniczo nie związane z nośnikiem IMAC i eluowane z kolumny IMAC przed elucją biologicznie czynnej formy G-CSF.

Korzystnie izolowanie sposobem według wynalazku dotyczy przynajmniej jednego biologicznie czynnego G-CSF, wybranego z grupy obejmującej nieglikozylowany G-CSF, glikozylowany G-CSF, metionylo G-CSF, analogi G-CSF, enzymatycznie lub chemicznie modyfikowane formy G-CSF i białka fuzyjne zawierające G-CSF.

Korzystnie również mieszanina zawierająca G-CSF jest wybrana z grupy złożonej z: mieszaniny, podłoża lub roztworu, uzyskanych po denaturacji a następnie renaturacji; roztworu lub zawiesiny ciał inkluzyjnych w warunkach natywnych; mieszaniny lub roztworu uzyskanego z supernatantu po ekspresji w systemach sekrecyjnych lub podłożu hodowlanym systemu ekspresyjnego; eluatu, który uzyskano za pomocą uprzedniej elucji G-CSF i kolumny IMAC lub dowolnej innej kolumny chromatograficznej.

Korzystnie także mieszanina zawiera roztwór ciał inkluzyjnych lub zawiesinę w warunkach natywnych.

W sposobie wedł ug wynalazku korzystnie prowadzi się IMAC z chelatowanym jonem metalu związanym do nośnika IMAC, gdzie chelatowany jon metalu związany z nośnikiem IMAC jest wybrany z grupy zł o ż onej z M(II)-iminodioctanu, M(II)-kwasu nitrilotrioctowego i M(II)-karboksymetylo-asparaginianu, przy czym M jest wybrany z grupy złożonej z Zn, Cu, Co i Ni. Korzystnie chelatowany jon metalu związany z nośnikiem IMAC jest wybrany z grupy złożonej z Zn (Il)-iminodioctanu, Ni(II)-iminodioctanu i Ni(II)-kwasu nitrilotrioctowego.

Korzystnie w sposobie według wynalazku kolejno przeprowadza się etapy obejmujące chromatografię kationowymienną i/lub chromatografię sączenia w żelu.

Również korzystnie w sposobie według wynalazku, mieszaninę zawierającą G-CSF poddaje się etapom chromatografii, które składają się tylko z IMAC, i ewentualnie dowolnie z przynajmniej jednej z metod oczyszczania wybranych z wymiany jonowej i sączenia w żelu.

Korzystnie mieszanina G-CSF jest wolna od detergentów lub środków solubilizujących, lub zawiera detergenty lub środki solubilizujące w takim stężeniu, w którym G-CSF jest obecny w formie natywnej.

Korzystnie cały proces prowadzi się w warunkach natywnych.

Proces izolowania według wynalazku może być stosowany w przypadkach gdy po ekspresji G-CSF jest wydzielany bezpośrednio poprzez szlak sekrecyjny do podłoża, lub gdy G-CSF jest tworzony w formie ciał inkluzyjnych w cytoplazmie, peryplazmie lub dowolnej innej organelli komórkowej. Może być także stosowany do oczyszczania i/lub izolacji biologicznie czynnego G-CSF bezpośrednio z solubilizowanych ciał inkluzyjnych i we wszystkich przypadkach gdy G-CSF był uprzednio denaturowany i następnie renaturowany. Proces oczyszczania i/lub izolacji biologicznie czynnego G-CSF według wynalazku może być utrzymany w warunkach natywnych w czasie całego procesu.

Proces izolowania biologicznie czynnego G-CSF według wynalazku daje jako produkt biologicznie czynny G-CSF o czystości powyżej 95%.

Przeprowadzenie dwóch dodatkowych etapów, chromatografia kationowymienną i sączenie w żelu, które są stosowane w korzystnym wykonaniu według wynalazku, powoduje usunięcie śladów pozostałych zanieczyszczeń (polerowanie).

Cały proces według wynalazku prowadzi więc do produktu o czystości powyżej 99%. Proces jest odpowiedni do produkcji dużych ilości biologicznie czynnego G-CSF i jest odpowiedni do przemysłowej produkcji biologicznie czynnego G-CSF.

Obecny wynalazek dotyczy stosowania IMAC jako skutecznego sposobu chromatografii w procesie izolowania biologicznie czynnego G-CSF. Prawidłowo zwinięte biologicznie czynne monomeryczne formy cząsteczek G-CSF są selektywnie wiązane do nośnika IMAC w warunkach natywnych podczas gdy nieprawidłowo zwinięte lub agregowane cząsteczki G-CSF i większość pozostałych zanieczyszczeń, szczególnie solubilizowane białka z ciał inkluzyjnych po ekspresji z np. E. coli zasadniPL 207 775 B1 czo nie są wiązane do tych nośników i są eluowane bez zatrzymywania. Uważa się, że ta cecha jest wynikiem specyficznej dystrybucji naturalnych reszt histydyny.

Określenie „warunki natywne tu stosowane dotyczy warunków, w których cząsteczka (białko G-CSF) zachowuje natywną konformację i aktywność biologiczną.

Określenie „warunki denaturujące dotyczy warunków, za pomocą których natywna konformacja białka G-CSF nie jest zachowywana, aktywność biologiczna jest zmieniona i nie jest zachowywana.

Określenie „zagregowane cząsteczki'' tu stosowane dotyczy cząsteczek, które tworzą skupienia cząsteczek utrzymywane razem przez interakcje hydrofobowe lub także jakieś inne (np. wiązania dwusiarczkowe). Te cząsteczki nie są biologicznie czynne.

Określenie „elucja tu stosowane dotyczy płukania lub ekstrakcji adsorbowanego materiału z kolumny chromatograficznej.

Określenie „eluat tu stosowane dotyczy roztworu, który jest otrzymywany przez płukanie i ekstrakcję z kolumny chromatograficznej.

Określenie ciała inkluzyjne tu stosowane dotyczy nierozpuszczalnych zbitych agregatów nieprawidłowo zwiniętych lub częściowo prawidłowo zwiniętych białek.

Określenie „roztwór ciał inkluzyjnych tu stosowane dotyczy roztworu, który zawiera ciała inkluzyjne.

Określenie „biologicznie czynny G-CSF tu stosowane dotyczy G-CSF, który jest zdolny do promowania różnicowania i proliferacji hematopoetycznych komórek prekursorowych i aktywacji dojrzałych komórek układu hematopoetycznego.

Określenie „biologicznie czynna forma (lub cząsteczka) G-CSF tu stosowane dotyczy formy lub cząsteczki G-CSF, która jest w stanie monomerycznym i nie zdenaturowanym i która jest zdolna do zapewnienia uprzednio wymienionej aktywności biologicznej.

Określenie zanieczyszczenie tu stosowane dotyczy substancji, która różni się od biologicznie czynnej cząsteczki G-CSF tak, że biologicznie czynna cząsteczka G-CSF nie jest czysta. Zanieczyszczenie może zawierać przynajmniej jedną substancję z grupy złożonej z biologicznie nieczynnych monomerycznych form i nieprawidłowo zwiniętych cząsteczek G-CSF, oligomerycznych i polimerycznych form G-CSF, denaturowanych form G-CSF i białek komórki gospodarza. Zanieczyszczenia mogą także zawierać dalsze substancje gospodarza takie jak DNA, (lipo)polisacharydy itd. i dodatki, które były stosowane w przygotowaniu i obróbce G-CSF.

Wskazana tu czystość dotyczy czystości HPLC.

Cały proces według wynalazku skutkuje wytworzeniem biologicznie czynnego G-CSF odpowiedniego do klinicznego stosowania w medycynie.

Biologicznie czynny G-CSF odpowiedni do stosowania klinicznego w medycynie może już być otrzymany w wydajny i korzystny sposób przez zastosowanie procesu oczyszczania i/lub izolacji, w którym zanieczyszczona mieszanina zawierają ca G-CSF w warunkach natywnych jest poddawana etapowi (etapom) chromatograficznym, które składają się tylko z IMAC i ewentualnie przynajmniej jednej z metod oczyszczania wybranych z technik jonowymiennych i sączenia w żelu. Proces według wynalazku może być też stosowany w przypadku oczyszczania i/lub izolacji pochodnych G-CSF takich jak metionylo G-CSF (Met-G-CSF), glikozylowany, enzymatycznie lub chemicznie modyfikowany (np. pegylowany) G-CSF, analogi G-CSF i białek fuzyjnych, które zawierają G-CSF.

Znaczące korzyści sposobu izolowania według wynalazku:

1) cząsteczki G-CSF są rozdzielone według ich stanu konformacyjnego i w konsekwencji według ich aktywności biologicznej.

2) proces pozwala na wiązanie biologicznie czynnych cząsteczek G-CSF do nośnika IMAC w warunkach natywnych i w efekcie rozdział biologicznie czynnych czą steczek G-CSF od biologicznie nieczynnych cząsteczek G-CSF, w warunkach natywnych,

3) proces pozwala na wiązanie prawidłowo zwiniętych cząsteczek G-CSF do nośnika IMAC w warunkach natywnych i w efekcie rozdział prawidłowo zwiniętych cząsteczek G-CSF od nieprawidłowo zwiniętych cząsteczek G-CSF, w warunkach natywnych,

4) proces pozwala na wiązanie biologicznie czynnych monomerycznych form G-CSF do nośnika IMAC w warunkach natywnych i w efekcie rozdział biologicznie czynnych monomerycznych form G-CSF od biologicznie nieczynnych monomerycznych form G-CSF,

5) proces pozwala na wiązanie monomerycznych form G-CSF do nośnika IMAC i w efekcie rozdział monomerycznych form G-CSF od oligo- i polimerycznych form G-CSF w warunkach natywnych,

PL 207 775 B1

6) proces pozwala na rozdział w warunkach natywnych prawidłowo zwiniętych monomerycznych biologicznie czynnych cząsteczek G-CSF od innych białek i zanieczyszczeń, które są obecne w roztworze, mieszaninie lub podł o ż u,

7) stosując proces według wynalazku, możliwe jest znaczące zwiększenie aktywności specyficznej oczyszczonego G-CSF, na przykład do zakresu aktywności specyficznej przynajmniej 1x10⁷ lU/mg, bardziej korzystnie do zakresu aktywności specyficznej 7-8x10⁷ lU/mg, najbardziej korzystnie do zakresu aktywności specyficznej około 1x10⁷ lU/mg, gdzie aktywność specyficzna jest mierzona za pomocą metody opartej na stymulacji proliferacji komórek jak opisano w przykładzie 5.

8) stosując proces według wynalazku możliwa jest produkcja G-CSF z wysoką wydajnością i z czystością przynajmniej 95% lub, gdy dodatkowo obejmuje oczyszczanie z chromatografią kationowymienną i sączeniem w żelu według korzystnego wykonania, nawet przynajmniej 99%, w związku z tym proces jest odpowiedni do przemysłowej produkcji biologicznie czynnego G-CSF,

9) cały proces według korzystnego wykonania izolowania biologicznie czynnego G-CSF, który obejmuje dalsze oczyszczanie za pomocą chromatografii kationowym lennej lub sączenia w żelu nie wymaga żadnych dodatkowych etapów oczyszczania G-CSF i może być korzystnie przez cały czas utrzymywany w warunkach natywnych.

Proces według wynalazku nie jest procesem renaturacji nieprawidłowo zwiniętych cząsteczek G-CSF, ale jest procesem, który obejmuje specyficzne wiązanie do nośnika IMAC niezdenaturowanych lub prawidłowo zwiniętych biologicznie czynnych monomerycznych cząsteczek G-CSF, które są już obecne w roztworze, mieszaninie lub podłożu zawierającym nieoczyszczony G-CSF.

Rozdział monomerycznych od oligo- i polimerycznych form G-CSF zachodzi w taki sposób, że biologicznie czynne monomeryczne formy G-CSF są związane z nośnikiem IMAC podczas gdy formy oligo- i polimeryczne, które mogą także występować w formie zagregowanej, zasadniczo pozostają w eluacie.

Zamiast IMAC, sączenie w żelu mogłoby być stosowane do rozdziału monomerycznej formy G-CSF od oligo- i polimerycznych form G-CSF. Przewagą IMAC nad sączeniem w żelu jest jego zdolność do zatężania, wyższa pojemność wiązania i zdolność rozdzielania prawidłowo zwiniętych monomerycznych form G-CSF od nieprawidłowo zwiniętych i monomerycznych form G-CSF. Prawidłowo zwinięte monomeryczne formy G-CSF nie mogą być oddzielone od nieprawidłowo zwiniętej monomerycznej formy G-CSF za pomocą sączenia w żelu. Tak więc stosując IMAC uzyskuje się lepsze wydajności.

Inną zaletą sposobu izolowania biologicznie czynnego G-CSF według wynalazku w stosunku do innych procedur znanych z uprzedniego stanu wiedzy jest umożliwienie (w warunkach natywnych utrzymywanych cały czas w procesie) izolacji prawidłowo zwiniętych cząsteczek G-CSF z mieszaniny różnych białek i także z mieszaniny cząsteczek G-CSF występujących w różnych stanach konformacyjnych. W konsekwencji możliwa jest bezpośrednia izolacja G-CSF z podłoża hodowlanego (korzystnie rozcieńczonego) lub szczególnie z ciał inkluzyjnych w warunkach natywnych.

Dodatkowe korzyści sposobu według wynalazku w stosunku do konwencjonalnych procesów to także: możliwość zmniejszenia lub wykluczenia stosowania detergentów, możliwość pracy przy braku czynników denaturujących, które są albo toksyczne albo niekorzystne dla środowiska (np. GndHCI lub mocznik), i możliwość zmniejszenia lub pominięcia stosowania buforów i innych roztworów.

Zaletą sposobu izolowania biologicznie czynnego G-CSF według wynalazku w stosunku do metod, w których stosowane są silne czynniki denaturujące jest fakt, że nie ma potrzeby stosowania aktywnych czynników redukujących jak ditiotreitol lub beta-merkaptoetanol.

Przy wydzielaniu G-CSF bezpośrednio do podłoża, sposób izolowania biologicznie czynnego G-CSF według wynalazku pozwala na skuteczne i bezpośrednie zatężenie biologicznie czynnego G-CSF z rozcieńczonych podłoży. W eluacie z kolumny IMAC otrzymuje się biologicznie czynny G-CSF o wysokiej czystości.

Ponieważ skuteczny rozdział biologicznie czynnej cząsteczki G-CSF od biologicznie nieczynnych cząsteczek G-CSF i innych zanieczyszczeń można uzyskać albo przez izolację biologicznie czynnej cząsteczki G-CSF z ciał inkluzyjnych i/lub przez izolację biologicznie czynnej cząsteczki G-CSF bezpośrednio z roztworu lub mieszaniny go zawierającej, ekonomika izolowania G-CSF jest znacznie poprawiona w porównaniu z innymi metodami.

Czystość G-CSF wyższa niż 95% może więc być uzyskana stosując tylko jeden etap oczyszczania.

PL 207 775 B1

Następujący etap (etapy) chromatograficzny jest (są) szczególnie odpowiedni(e) do ostatecznego oczyszczania (polerowanie) biologicznie czynnego G-CSF po elucji z IMAC.

• Chromatografia kationowymienną i/lub • Są czenie w ż elu

Chromatografia kationowymienną jest szczególnie skuteczna dla usuwania śladów kwasów nukleinowych, lipopolisacharydów i białek pochodzących z komórek gospodarza i dla usuwania jonowych izomerów G-CSF i zmienionych (uszkodzonych) form G-CSF ze zmienionymi wartościami pl. Chromatografia sączenia w żelu jest szczególnie skuteczna do usuwania śladów dimerów i wyżej agregowanych form G-CSF.

Stosowanie tylko dodatkowych dwóch końcowych etapów daje czystość biologicznie czynnego G-CSF większą niż 99%.

Zaletami całego sposobu izolowania biologicznie czynnego G-CSF według korzystnego wykonania wynalazku, które dodatkowo obejmuje chromatografię kationowymienną i sączenie w żelu są: oprócz odpowiednich etapów obróbki wstępnej takich jak solubilizacja i ewentualne następne usuwanie rozpuszczalnika przez dializę, wymianę jonów, ultrasączenie, diasączenie lub tym podobne, proces może wydajnie obejmować tylko trzy wymienione powyżej etapy chromatograficzne; między trzema etapami chromatograficznymi korzystnie nie ma etapów pośrednich (jak zatężanie, dializa, strącanie itd.), i natywne warunki są korzystnie utrzymywane przez cały czas procesu oczyszczania i/lub izolacji.

Pośrednie etapy zatężania niekorzystnie powodowały tworzenie dimerów i innych form agregatów, prowadząc do zmniejszonej wydajności. Cały proces oczyszczania i/lub izolacji może być przeniesiony na skalę przemysłową i do produkcji biologicznie czynnego G-CSF z czystością przynajmniej 99%.

Biologicznie czynny G-CSF uzyskany za pomocą całego procesu oczyszczania i/lub izolacji według wynalazku jest odpowiedni do przygotowania kompozycji farmaceutycznej, która zawiera terapeutycznie skuteczną ilość biologicznie czynnego G-CSF i jest odpowiednia do stosowania klinicznego.

Możliwość utrzymania aktywnej formy G-CSF w krótkim procesie oczyszczania i izolacji wpływa nie tylko na poprawioną wydajność ale także na lepszą czystość i skuteczność biologicznie czynnego G-CSF i zawierającej go kompozycji farmaceutycznej.

Określenie „terapeutycznie skuteczna ilość tu stosowane dotyczy ilości biologicznie czynnego G-CSF, która ma efekt terapeutyczny biologicznie czynnego G-CSF.

Odpowiednie farmaceutycznie dopuszczalne substancje dodatkowe obejmują odpowiednie rozcieńczalniki, adiuwanty i/lub nośniki pożyteczne w terapii G-CSF.

Biologicznie czynny G-CSF, który uzyskano przez stosowanie procesu według wynalazku, szczególnie przy przeprowadzaniu dodatkowych etapów chromatografii kationowymiennej i sączenia w ż elu, moż e być stosowany do przygotowania leków, które są wskazane dla wskazań wybranych z grupy, która obejmuje: neutropenię i związane z neutropenią konsekwencje kliniczne, skrócenie hospitalizacji przy neutropenii z gorączką po chemioterapii, mobilizację hematopoetycznych komórek progenitorowych, jako alternatywę dla wlewu leukocytów dawcy, przewlekłą neutropenię, zakażenia neutropeniczne i nie-neutropeniczne, biorców przeszczepów, przewlekłe stany zapalne, posocznicę i szok septyczny, zmniejszenie ryzyka, chorobowości, śmiertelności, liczby dni hospitalizacji w zakażeniach neutropenicznych i nie-neutropenicznych, zapobieganie zakażeniom i komplikacjom związanym z zakażeniem u pacjentów z neutropenią i bez neutropenii, zapobieganie zakażeniom szpitalnym i obniżenie częstości zgonów i częstości zakażeń szpitalnych, jelitowe podawanie u noworodków, wspomaganie układu odpornościowego u noworodków, poprawianie wyników klinicznych u pacjentów oddziałów intensywnej opieki i krytycznie chorych pacjentów, gojenie i leczenie ran/wrzodów skóry/oparzeń, intensyfikację chemioterapii i/lub radioterapii, pancytopenia, zwiększenie cytokin przeciwzapalnych, skrócenie przerw chemioterapii o wysokiej dawce przez profilaktyczne stosowanie filgrastimu, umożliwienie efektów przeciw guzom nowotworowym terapii fotodynamicznej, zapobieganie i leczenie chorób powodowanych przez róż ne zaburzenia pracy mózgu, leczenie chorób trombotycznych i odzyskanie erytropoezy po napromieniowaniu.

Może być też stosowane do leczenia wszystkich innych chorób, które są charakterystyczne dla G-CSF.

Kompozycja farmaceutyczna zawierająca czysty i biologicznie czynny G-CSF uzyskany sposobem według wynalazku może więc być podawana w sposób znany specjalistom, pacjentom w ilości terapeutycznej, która jest skuteczna w leczeniu wyżej wymienionych chorób.

PL 207 775 B1

Korzystna forma przeprowadzenia IMAC w sposobie według wynalazku jest szczegółowo opisana dalej.

Proces rozpoczyna się od nanoszenia próbki i wiązania przynajmniej biologicznie czynnej formy białka G-CSF do nośnika IMAC.

Nośnik IMAC zawiera materiał fazy stałej i chelat jonu metalu związanego do materiału fazy stałej. Mogą być użyte konwencjonalne materiały fazy stałej, odpowiednio takie jak Sepharose, Fractogel i inne materiał y noś ników ż elu. Chelat jonu metalu związany do noś nika IMAC jest odpowiednio wybrany z jonów metali korzystnie mających dwie wartościowości, szczególnie jonów metali przejściowych. Hg jest mniej odpowiedni ze względu na jego toksyczność i jego skłonność do wymywania z kolumny IMAC. Korzystne przykłady chelatów jonu metalu związanych z nośnikiem IMAC obejmują: M(II)-iminodioctan (IDA), kwas M(II)-nitrilotrioctowy (NTA), M(II)-karboksymetyloasparaginian itd., gdzie M reprezentuje Zn, Cu, Co, Ni itd. Szczególnie skuteczne są Zn(II)-IDA, Ni(II)-IDA i Ni (II)-NTA.

Przed naładowaniem na kolumnę IMAC, ciała inkluzyjne są korzystnie dostarczane jako roztwór lub w przypadku rozdziału partiami lub rozdziału w rozszerzonym złożu, jako zawiesina w obecności niskich stężeń detergentu lub solubilizanta. G-CSF może więc być trzymany w warunkach natywnych, albo gdy detergenty pozostają w roztworze lub zawiesinie albo gdy są usunięte przez stosowanie wymieniaczy jonowych, dializę, strącanie itd. Detergent lub czynnik solubilizujący jest korzystnie usuwany przed nanoszeniem roztworu lub mieszaniny na kolumnę IMAC.

Roztwór lub zawiesina ciał inkluzyjnych (lub mieszanina) w obecności silnych czynników denaturujących takich jak 8M mocznik lub 6M GndHCI i roztwory w obecności denaturujących stężeń detergentów (np. 1% sarkosyl, 2% sarkosyl lub 1% siarczan dodecylu sodu) może być też stosowany jako próbka wyjściowa, jeśli próbka wyjściowa była poddana uprzedniej renaturacji np. przez rozcieńczenie, dializę, ultrasączenie lub usunięcia czynników/czynnika denaturujących.

W razie ekspresji w systemach sekrecyjnych takich jak linie komórkowe droż d ż y, grzybów lub ssaków supernatant lub zatężony supernatant lub podłoże hodowlane, które do mieszaniny mogły być obrobione uprzednio, z pH w zakresie od 6,5 do 9,0 mogą być nanoszone na nośnik IMAC. Eluat wynikający z pierwszej elucji z kolumny IMAC lub mieszanina może być też stosowany jako roztwór do nanoszenia do IMAC. pH eluatu powinno było być dopasowane np. przez dodanie roztworu NaOH lub roztworu buforu o wysokim pH, do zakresu pH od 6,5 do 9,0. Eluat może być wówczas ponownie nanoszony na ten sam nośnik IMAC taki jak np. Zn(II)-IDA, Ni(II)-IDA, Ni(II)-NTA lub na inny nośnik IMAC. Możliwa jest też kombinacja z innymi immobilizowanymi jonami metali (np. Zn(II), Cu(II), Co(II), Ni (II) itd.) i pozwala na lepszy rozdział i usuwanie specyficznych) białek gospodarza.

Niezależnie od przygotowania i pochodzenia roztworu do nanoszenia pH roztworu do nanoszenia powinno być w zakresie od 6,5 do 9,0. Korzystny pH roztworu do ładowania jest od 7,0 do 8,5, najbardziej korzystny pH jest od 7,8 do 8,2.

Różne bufory, które mogą utrzymywać pH w zakresie od 6,5 do 9,0 mogą być stosowane do nanoszenia i wiązania G-CSF do nośnika IMAC. Fosforan, octan, hydroksymetyloaminometan (Tris)/HCI, Tris/octan, cytrynian i inne bufory dające pH od 6,5 do 9,0 są odpowiednie. Korzystnie stosowany jest Tris/HCI.

Bufor, szczególnie bufor Tris/HCI jest korzystnie stosowany w zakresie stężeń od 5 do 50 mM, najbardziej korzystnie w zakresie od 10 do 40 mM.

Po wiązaniu do nośnika proces kontynuuje się przez płukanie kolumny i elucję białek z kolumny. Elucję można przeprowadzić przez stosowanie albo nieciągłego gradientu skokowego albo gradientu liniowego przez spadające pH lub kompetytywną elucję w wysokim pH (np. z imidazolem, histydyną, chlorkiem amonu i podobnymi).

Określenie „gradient liniowy tu stosowane dotyczy płukania kolumny chromatograficznej roztworem, którego skład jest zmieniany w taki sposób, że proporcja jednego buforu (jednego składnika buforu) jest zwiększana liniowo podczas gdy proporcja drugiego buforu (lub innego składnika buforu) jest zmniejszona liniowo.

Określenie „nieciągły gradient skokowy tu stosowane dotyczy płukania kolumny chromatograficznej roztworem, który jest złożony z pewnej proporcji jednego buforu (lub jednego składnika buforu) i pewnej proporcji innego buforu (lub innego składnika buforu) przez określony okres. Proporcje obu buforów są szybko (gwałtownie) zmieniane i kolumna jest płukana przez inny określony okres. Kompozycja roztworu (zmiana proporcji buforu lub proporcji składnika) nie jest zmieniana liniowo.

PL 207 775 B1

Określenie „elucja kompetytywna” tu stosowane dotyczy elucji w pH buforu wiążącego gdzie cząsteczki współzawodniczące takie jak imidazol, histydyna, chlorek amonu, itd. w buforze do elucji same wiążą chelatowaną z metalami macierz i w ten sposób zastępują cząsteczki białkowe.

Korzystnie stosowany jest nieciągły gradient skokowy powodujący elucję w niskim pH. Mianowicie wysoki pH mógłby powodować aktywację reszt cysteinowych i tworzenie dimerów. Stabilność G-CSF jest wysoka także w niskim pH.

Można stosować kilka buforów do elucji dla płukania nieciągłego skokowego, lub liniowe płukanie i elucję, i są one wybrane z grupy złożonej z: octan, Tris/octan, fosforan, cytrynian i inne odpowiednie bufory. Zakres pH dla elucji może być od 3,0 do 5,0, korzystnie 3,5 do 4,5. Przez nieciągły gradient skokowy pH jest szybko zmieniane w kolejności od pH ładowania do pH elucji tak jak z 7,0 do 4,0, i punkt izoelektryczny jest w ten sposób przeskakiwany, unikając strącania białka. Mianowicie środowisko z pH punktu izoelektrycznego białka może powodować jego strącanie.

W eluacie, monomeryczny, biologicznie czynny, prawidłowo zwinięty G-CSF uzyskuje się z czystością większą od 95%.

Jeśli jest do pożądane eluat uzyskany z kolumny IMAC może być naładowany bezpośrednio na kolumnę do chromatografii kationowymiennej, bez wymagania dodatkowych etapów pośrednich. Można stosować różne nośniki do chromatografii kationowymiennej i mogą być one wybrane z grupy złożonej z: SP Sepharose FF, SP Sepharose HP, CM Sepharose FF, TSK gel SP-5PW, TSK gel SP-5PW-HR, Toyopearl SP-650M, Toyopearl SP~ 650S, Toyopearl SP-650C, Toyopearl CM-650M, Toyopearl CM-650S, nośnik Macro-Prep High S, nośnik Macro-Prep S, nośnik Macro-Prep CM itd. Korzystnie stosowane są SP Sepharose FF lub TSK gel SP-5PW.

Zakres pH roztworu do nanoszenia do chromatografii kationowymiennej jest w zakresie od 3,0 do 5,8, korzystnie w za kresie od 4,0 do 5,0.

Stężenie soli w roztworze do nanoszenia do chromatografii kationowymiennej musi być dostatecznie niskie aby pozwolić na wiązanie, co także zależy od pH roztworu.

Różne bufory z zakresem pH od 3,0 do 5,8 mogą być stosowane do ładowania i wiązania do nośnika do chromatografii kationowymiennej i mogą być wybrane z grupy złożonej z: octanu, cytrynianu, Tris/HCI, Tris/octan, fosforanu, bursztynianu, malonianu, 2-(N-morfolinoetansulfonianu) (MES) i innych buforów. Korzystnie stosowany jest bufor octanowy.

Bufor octanowy może być stosowany w zakresie stężeń od 10 do 60 mM, korzystnie w zakresie stężeń od 10 do 30 mM.

W chromatografii kationowymiennej po ładowaniu kolumny nastę puje pł ukanie kolumny i elucja białek z kolumny. Elucja zachodzi ze względu na zwiększoną moc jonową po dodaniu wysokiego stężenia soli w roztworze buforu. Można stosować nieciągły gradient skokowy, gradient liniowy i odpowiednią kombinację gradientu skokowego i liniowego.

Bufory do elucji, które mogą być stosowane do płukania, mogą być wybrane z grupy złożonej z: octanu, cytrynianu, Tris/HCI, Tris/octan, fosforanu, bursztynianu, malonianu, MES i innych odpowiednich buforów z dodatkiem soli takich jak NaCI lub KCl. Moc jonowa i stężenie soli, za pomocą której uzyskiwana jest elucja zależy od pH roztworu buforu. Im wyższe jest pH buforu tym niższa moc jonowa jest potrzebna do elucji białek z kolumny.

W eluacie monomeryczny, biologicznie czynny, prawidłowo zwinięty G-CSF uzyskuje się z czystością większą od 98%.

Jeśli jest to pożądane eluat uzyskany z IMAC lub korzystnie, po kolejnej kolumnie chromatografii kationowymiennej może być naładowany bezpośrednio na kolumnę do sączenia w żelu, bez wymagania jakichkolwiek etapów pośrednich.

Mogą być stosowane różne nośniki do sączenia w żelu i są wybrane z grupy obejmującej: Sephacryl S-200HR, Sephacryl S-100HR, Superose 12, Superose 6, Superdex 75, TSK gel G-2500PW, TSK gel G-3000 PW, Bio-Gel P-60, Bio-Gel P-100 itd. Korzystnie, stosowany jest Superdex 75.

Można stosować szeroki zakres pH roztworu do nanoszenia do sączenia w żelu i eluat bezpośrednio z IMAC i korzystnie, z kolejnej chromatografii kationowymiennej jest więc odpowiedni jako roztwór do nanoszenia. Nanoszenie roztworu, wiązanie białka do nośnika do sączenia w żelu i elucja białka mogą być przeprowadzone stosując ten sam bufor. Różne bufory mogą być stosowane i mogą być wybrane z grupy złożonej z: cytrynianu, octanu, Tris, fosforanu i innych odpowiednich buforów, które mogą utrzymywać pH w zakresie od 3,5 do 8,0. Korzystnie, stosowane są bufory fosforanowe z pH od 6,0 do 7,0.

PL 207 775 B1

Korzystnie, bufory fosforanowe (do nanoszenia) mogą być stosowane w zakresie stężeń od 2 do 100 mM, korzystnie w zakresie stężeń między 3 i 10 mM.

Stężenia soli w buforze do sączenia w żelu mogą być w zakresie od 30 do 100 mM, korzystnie około 50 mM.

W eluacie, monomeryczny, biologicznie czynny, prawidłowo zwinięty G-CSF uzyskuje się z czystością większą od 99% i aktywnością biologiczną 1x10⁸ lU/mg,

Fig. 1 przedstawia rozdział chromatograficzny białek z solubilizowanych ciał inkluzyjnych po zastosowaniu nośnika IMAC: Zn(II)-IDA Chelating Sepharose fast flow (Pharmacia).

Chromatogram przedstawia zmiany absorbancji przy 280 nm (A280) (—) i proporcje buforu P3 (-----) w zależności od czasu (min).

Pik A - białka E. coli i zagregowany G-CSF; pik B - monomeryczny prawidłowo zwinięty biologicznie czynny G-CSF i ślady białek E coli.

Fig. 2 przedstawia analizę z elektroforezą w żelu poliakrylamidowym w obecności siarczanu dodecylu sodu (SDS-PAGE) wyjściowej próbki i próbek reprezentowanych w pikach chromatograficznych po rozdziale z zastosowaniem Zn-IDA Chelating Sepharose fast flow (Pharmacia), według fig. 1.

Objaśnienia dotyczące fig. 2:

1. Standardy masy cząsteczkowej (Bio-Rad) i G-CSF (Neupogen) (oznaczony strzałką).

2. Próbka wyjściowa przed rozdziałem chromatograficznym.

3. Białka w piku A na fig. 1 (zagregowany G-CSF i białka E coli).

4. Białka w piku B na Fig. 1 (monomeryczny, prawidłowo zwinięty, biologicznie czynny G-CSF i ślady białek E. coli).

Fig. 3 przedstawia rozdział chromatograficzny przez stosowanie kolumny XK50/20, z nośnikiem IMAC Zn-IDA Chelating Sepharose Fast Flow (Pharmacia).

Chromatogram przedstawia zmiany absorbancji w 280 nm (A280) (—) i proporcję buforu P6 (----) w zależ noś ci od czasu (min).

Pik A - białka E. coli i zagregowany G-CSF; pik B - monomeryczny prawidłowo zwinięty biologicznie czynny G-CSF i ślady białek E. coli.

Fig. 4 przedstawia rozdział chromatograficzny po zastosowaniu kolumny XK16/20, naładowanej kationowym nośnikiem do chromatografii TSK gel SP-5PW (TosoHaas).

Chromatogram przedstawia zmiany absorbancji w 280 nm (A280) (—) i proporcję buforu P8 (---) w zależ noś ci od czasu (min).

Główny pik - monomeryczny prawidłowo zwinięty biologicznie czynny G-CSF; mniejsze piki izoformy G-CSF i ślady białka E. coli.

Fig. 5: Chromatograficzny rozdział po zastosowaniu kolumny XK26/70, naładowanej nośnikiem do sączenia w żelu Superdex^TM 75 klasy preparatywnej (Pharmacia).

Chromatogram przedstawia zmiany absorbancji w 280 nm (A280) w zależności od (min). Główny pik - monomeryczny prawidłowo zwinięty biologicznie czynny G-CSF

Następujące przykłady są podane w celu ilustrowania różnych wykonań wynalazku i nie ograniczają wynalazku.

P r z y k ł a d 1

Oczyszczanie i/lub izolacja biologicznie czynnego G-CSF po zastosowaniu IMAC: Zn-IDA (Chelating Sepharose fast flew)

Kolumna chromatograficzna (h=10 cm, d=10 mm) była naładowana nośnikiem Chelating Sepharose fast flow (Pharmacia), na którym były związane jony Zn²⁺ i kolumnę zrównoważono pięcioma objętościami kolumny buforu P2 przy stałym przepływie 2 ml/min. Ciała inkluzyjne solubilizowano w buforze P1 (0,2% sarkozyl, 40 mM Tris/HCI, pH 8,0) i sarkozyl usunięto przez stosowanie wymiany jonowej. Na kolumnę nanoszono 10 ml roztworu do nanoszenia (17 mg całkowitego białka), który zawierał biologicznie czynny G-CSF, przy stałym przepływnie 1 ml/min. Rozdział przeprowadzono przez stosowanie nieciągłego gradientu skokowego buforu P3 przy stałym przepływie 2 ml/min (fig. 1). W pierwszym piku chromatograficznym (pik A) znaleziono białka E. coli i większość nieprawidłowo zwiniętego i zagregowanego G-CSF. Przy 100% buforu P3 (0% buforu P2) eluowano zasadniczo czysty biologicznie czynny G-CSF (7 mg) z czystością większą od 95% (fig. 2).

Aktywność biologiczną próbki z piku szczytu A mierzono jak opisano w przykładzie 5 poniżej i wynosiła około 1 x 10⁶ lU/mg białka, mierzona aktywność biologiczna próbki piku B wynosiła 0,8-1,0 x 10⁸ lU/mg białka, podczas gdy aktywność biologiczna standardu wynosiła 1 x 10⁸ lU/mg białka. Jednoetapowy IMAC przez stosowanie roztworu wyjściowych ciał inkluzyjnych prowadzi do

PL 207 775 B1 izolacji monomerycznej formy G-CSF, z czystością większą niż 95% i aktywnością biologiczną, która jest porównywalna ze standardem.

P r z y k ł a d 2:

Oczyszczanie i/lub izolacja biologicznie czynnego G-CSF za pomocą IMAC: Zn~IDA (Fractogel EMD Chelate)

Kolumna chromatograficzna (h=2 cm, d=10 mm) była naładowana nośnikiem Fractogel EMD Chelate (Merck) na którym były związane jony Zn²⁺. Kolumnę płukano wodą i równoważono pięcioma objętościami kolumny buforu P2 przy stałym przepływie 1 ml/min. Ciała inkluzyjne były solubilizowane w buforze PI i sarkozyl usunięto przez stosownie wymieniacza jonowego. Kolumnę naładowano 3,3 ml solubilizowanych ciał inkluzyjnych w całkowitej ilości 4 mg. Rozdział przeprowadzono za pomocą nieciągłego gradientu skokowego buforu P3 przy stałym przepływie 1 ml/min (Gradient: 0% bufor P3 (100% bufor P2) 13 min, 25% bufor P3 (75% bufor P2) 12 min, 100% bufor P3 (0% bufor P2) 14 min, 0% bufor P3 (100% bufor P2) 11 min). Przy 100% buforze P3, eluowano monomeryczny biologicznie czynny G-CSF (0,7 mg).

P r z y k ł a d 3:

Oczyszczanie i/lub izolacja biologicznie czynnego G-CSF przez zastosowanie IMAC: Ni-NTA (Superflow)

Kolumna chromatograficzna (h=10 cm, d= 10 mm) była naładowana nośnikiem Ni-NTA Superflow (Qiagen) i była równoważona pięcioma objętościami kolumny buforu P4 przy stałym przepływie 2 ml/min. Ciała inkluzyjne solubilizowano w buforze P1 i sarkozyl usuwano stosując wymieniacz jonowy. Na kolumnę nanoszono 10 ml solubilizowanych ciał inkluzyjnych (10 mg całkowitego białka) przy stałym przepływie 1 ml/min. Rozdział przeprowadzono stosując nieciągły gradient buforu P6 przy stałym przepływie 2 ml/min (taki sam gradient jak w rozdziale na Zn-IDA Chelating Sepharose fast flow, przedstawionym na fig. 1). Przy 100% buforu P5 (0% bufor PA) eluowano monomeryczny biologicznie czynny G-CSF (3,6 mg) z czystością większą od 95%. W pierwszym piku chromatograficznym znaleziono tylko nieprawidłowo zwinięty i zagregowany G-CSF oprócz białek E. coli. Monomeryczne formy G-CSF z drugiego piku po kilku rozdziałach chromatograficznych przez stosowanie Ni-NTA Superflow połączono i ostateczne oczyszczanie (polerowanie) przeprowadzono stosując chromatografię kationowymienną i sączenie w żelu.

P r z y k ł a d 4:

Proces oczyszczania i/lub izolacji, w tym dodatkowe etapy chromatograficzne, do produkcji biologicznie czynnego G-CSF

Ten proces oczyszczania i/lub izolacji biologicznie czynnego G-CSF zaczął się od roztworu ciał inkluzyjnych, który był uzyskany po ekspresji G-CSF w E. coli. 4,5 g przepłukanych ciał inkluzyjnych zawieszono w 225 ml buforu P1 i były pozostawione do solubilizacji w 20°C przez 18 godzin z łagodnym (lekkim) wytrząsaniem stosując wytrząsarkę liniową. Po 15 min wirowania usunięto sarkozyl przez zastosowanie wymieniacza jonów. Próbkę rozcieńczono wodą aby osiągnąć podwójną objętość i uzyskano około 430 ml roztworu ciał inkluzyjnych; ze stężeniem białka około 1,4 mg/ml (według Bradford z G-CSF jako standardem). Roztwór białka nanoszono w dwóch równych objętościach na kolumnę chromatograficzną XK50/20 (Pharmacia), naładowaną nośnikiem Chelating Sepharose fast flow (45-165 μm, Pharmacia) do wysokości 10 cm (h=10 cm, d=5 cm, V=200 ml), na którym były związane jony Zn²⁺. Nanoszenie próbki i elucję przeprowadzono przy stałym przepływie 7 ml/min. Po naniesieniu na kolumnę przepłukano nieciągłym gradientem skokowym (fig. 3): 15 min z buforem P2, następnie 45 min z mieszaniną buforów P2 i P6 w stosunku objętości 75:25 i 86 min z buforem P6. Monomeryczna forma biologicznie czynnego G-CSF eluowała przy 100% buforu P6. Wszystkie frakcje (dwa rozdziały), które zawierały monomeryczny biologicznie czynny G-CSF połączono i uzyskano 271 ml roztworu ze stężeniem białka około 0,7 mg/ml. Do tego roztworu dodano EDTA do końcowego stężenia 2 mM. Roztwór rozcieńczono trzy razy 20 mM CH3COOH, pH 4,0 i stosowano jako roztwór do nanoszenia do kationowej chromatografii jonowymiennej.

Eluat IMAC nanoszono w dwóch próbkach na kolumnę chromatograficzną XK16/20 (Pharmacia), wypełniono nośnikiem chromatograficznym SP-5PW (30 μm; TosoHaas) do wysokości 16 cm (h=16 cm, d=1,6 cm, V=32 ml). Nanoszenie próbki i elucję kolumny przeprowadzono przy stałym przepływie 5 ml/min. Po naładowaniu próbki kolumnę płukano U min buforem P7, a następnie przeprowadzono elucję stosując liniowy gradient z buforem P8 przez 30 min od 0% do 25% buforu P8 (od 100% do 7 5% buforu P7. Kolumnę płukano ponownie przez 16 min mieszaniną buforów P7 i P8 w stosunku objętości 75:25 i następnie 22 min buforem P8 (fig. 4). Frakcje głównego piku chromatograficznego,

PL 207 775 B1 które były eluowane w liniowej części gradientu linowego przy około 18% buforu P8 i należały do prawidłowo zwiniętego G-CSF (z czystością większą od 98%), łączono i stosowano bezpośrednio jako roztwory do nanoszenia na kolumnę do sączenie w żelu.

Eluat z chromatografii kationowymiennej (V= 46 ml, stężenie białka około 2,4 mg/ml), nanoszono w 5 próbkach na kolumnę chromatograficzną XK2 6/70 (Pharmacia), wypełnioną nośnikiem do sączenia w żelu Superdex 75 (klasa preparatywna, 34 pm (Pharmacia) do wysokości 57 cm (h=57 cm, d=2,6 cm, V=300 ml). Rozdział przeprowadzono w buforze P9 przy stałym przepływie 2,5 ml/min. Pik, który reprezentuje dimer białkowy jest wyraźnie oddzielony od głównego u, który reprezentuje monomeryczne białko (fig. 5). Główne frakcje piku chromatograficznego połączono, zmieniono bufor i uzyskano 100 mg czystej monomerycznej formy G-CSF z czystością większą od 99% i aktywnością biologiczną 1 x 10⁸ lU/mg, który odpowiada aktywności biologicznej standardu.

P r z y k ł a d 5:

Oznaczenie aktywności biologicznej G-CSF in vitro. Aktywność biologiczną G-CSF oznaczono metodą opartą na stymulacji proliferacji komórkowej (komórki NFS-60) stosując znaną metodę (Hammerling, U. i wsp. w J Pharm Biomed Anal 13, 9-20 (1995)) i międzynarodowy standard zrekombinowanego G-CSF (88/502, pochodzące od komórek drożdży; NIBSC Potters Bar, Hertfordshire, UK; patrz Mire-Sluis,A.R. i wsp. w J Immunol Methods 179, 117-126 (1995).

Składy buforów:

P1: 0,2% sarkozyl, 40 mM Tris/HCI, pH 8,0

P2: 20 mM Tris/HCI, 150 mM NaCI pH 8,0

P3: 20 mM acetic acid, 150 mM NaCI, pH doprowadzone do 4,5 przez dodanie 1 M NaOH

P4: 10 mM Tris/HCI, 200 mM NaCI, pH 8,0

P5: 20 mM acetic acid, 200 mM NaCI, pH doprowadzone do 4,0 przez dodanie 1 M NaOH

P6: 20 mM CH3COOH, 150 mM NaCI, pH 4,0

P7: 20 mM CH3COOH, pH 5,5

P8: 20 mM CH3COOH, 500 mM NaCI, pH 5,5

P9: 5 mM Na fosforan, 50 mM.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób izolowania biologicznie czynnego poprawnie zwiniętego czynnika stymulującego kolonie granulocytów (G-CSF), znamienny tym, że biologicznie czynny poprawnie zwinięty G-CSF izoluje się z mieszaniny zawierającej niepoprawnie zwinięty biologicznie nieaktywny G-CSF i zanieczyszczenia, przez poddanie tej mieszaniny chromatografii powinowactwa do unieruchomionego metalu (IMAC), którą prowadzi się w środowisku wolnym od czynnika denaturującego w następujących etapach:

- nanosi się mieszaninę , która zawiera biologicznie czynną formę G-CSF w obecnoś ci zanieczyszczenia, na nośnik IMAC,

- biologicznie czynna forma G-CSF selektywnie wiąże się z noś nikiem IMAC,

- pł ucze się kolumnę IMAC,

- eluuje się biologicznie czynną formę G-CSF z nośnika IMAC, i w sposobie tym przeprowadza się IMAC z chelatowanym jonem metalu zwią zanym do noś nika

IMAC, przy czym jonem metalu nie jest Hg.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mieszanina zawiera zanieczyszczenie, które jest przynajmniej jedną substancją wybraną z grupy substancji złożonej z biologicznie nieczynnych monomerycznych form i nieprawidłowo zwiniętych cząsteczek G-CSF, oligomerycznych i polimerycznych form G-CSF, zdenaturowanych form G-CSF, białek komórek gospodarza i innych zanieczyszczeń (składników) komórek gospodarza; przy czym IMAC jest przeprowadzony tak, że zanieczyszczenie jest zasadniczo nie związane z nośnikiem IMAC i eluowane z kolumny IMAC przed elucją biologicznie czynnej formy G-CSF.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że biologicznie czynny G-CSF jest przynajmniej jednym wybranym z grupy obejmującej nieglikozylowany G-CSF, glikozylowany G-CSF, metionylo G-CSF, analogi G-CSF, enzymatycznie lub chemicznie modyfikowane formy G-CSF i białka fuzyjne zawierające G-CSF.

PL 207 775 B1
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mieszanina zawierająca G-CSF jest wybrana z grupy zł oż onej z:

mieszaniny, podłoża lub roztworu, uzyskanych po denaturacji a następnie renaturacji; roztworu lub zawiesiny ciał inkluzyjnych w warunkach natywnych; mieszaniny lub roztworu uzyskanego z supernatantu po ekspresji w systemach sekrecyjnych lub podłożu hodowlanym systemu ekspresyjnego;

eluatu, który uzyskano za pomocą uprzedniej elucji G-CSF i kolumny IMAC lub dowolnej innej kolumny chromatograficznej.
5. Sposób według zastrz. 1 albo 4, znamienny tym, że mieszanina zawiera roztwór ciał inkluzyjnych lub zawiesinę w warunkach natywnych.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się IMAC z chelatowanym jonem metalu związanym do nośnika IMAC, gdzie chelatowany jon metalu związany z nośnikiem IMAC jest wybrany z grupy złożonej z M(II)-iminodioctanu, M(II)-kwasu nitrilotrioctowego i M(II)-karboksymetylo-asparaginianu, przy czym M jest wybrany z grupy złożonej z Zn, Cu, Co i Ni.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że chelatowany jon metalu związany z nośnikiem IMAC jest wybrany z grupy złożonej z Zn (Il)-iminodioctanu, Ni(II)-iminodioctanu i Ni(II)-kwasu nitrilotrioctowego.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ż e kolejno przeprowadza się etapy obejmują ce chromatografię kationowymienną i/lub chromatografię sączenia w żelu.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mieszaninę zawierając ą G-CSF poddaje się etapom chromatografii, które składają się tylko z IMAC, i ewentualnie dowolnie z przynajmniej jednej z metod oczyszczania wybranych z wymiany jonowej i sączenia w żelu.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że mieszanina G-CSF jest wolna od detergentów lub środków solubilizujących, lub zawiera detergenty lub środki solubilizujące w takim stężeniu, w którym G-CSF jest obecny w formie natywnej.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że cały proces prowadzi się w warunkach natywnych.