DE3111405A1

DE3111405A1 - Bakterielle expression von polypeptiden unter verwendung eines tryptophan-promoter-operator-systems

Info

Publication number: DE3111405A1
Application number: DE19813111405
Authority: DE
Inventors: Herbert L. 94010 Burlingame CA. Heyneker; Dennis G. 94404 San Mateo CA. Kleid; Guiseppe F. 4310 Rheinfelder Miozzari; Daniel G. 94134 San Francisco CA. Yansura
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1980-03-24
Filing date: 1981-03-23
Publication date: 1982-03-25
Also published as: YU26084A; FI853488L; AU6863681A; NZ196584A; FI853488A0; JPH0673469B2; FI72344C; IE51894B1; DD203746A5; DD204494A5; FR2555199A1; US6333174B1; FR2480781B1; FI72344B; DE3111405C2; JPH05268962A; JPH0734747B2; CS238612B2; KR860001230B1; IL71885A0

Description

Beschreibung

Mit dem Aufkommen der DNA-Rekombinations-Technologie ist die kontrollierte bakterielle Produktion einer enormen Vielfalt nützlicher Polypeptide möglich geworden. Man hat bereits Bakterien in der Hand, die durch diese Technologie verändert wurden, um die Produktion derartiger Polypeptid-Produkte zu ermöglichen, wie z.B. Somatostatin (K. Itakura, et al., Science 198, 1056 (1977)), die jeweils einzelnen A- und B-Ketten des menschlichen Insulins (D.V. Goeddel, et al., Proc Nat ¹I Acad Sei, USA 76, 106 (1979)) und menschliches Wachstumshormon (D.V. Goeddel, et al., Nature 281, 544· (1979)). Kürzlich wurde die DNA-Rekombinations-Technik dazu verwendet, um die bakterielle Herstellung von Thymosinoci zu ermöglichen, einer immunverstärkenden Substanz, die in der Thymusdrüse gebildet wird (US-Patentanmeldung von Roberto Orea und Ronald Vetzel vom 28. Februar 1980, übertragen auf die Anmelderin der vorliegenden Anmeldung). Die Möglichkeiten dieser Technologie sind derartig durchschlagend, daß so gut wie jedes nützliche Polypeptid bakteriell hergestellt werden kann und die kontrollierte Herstellung von Hormonen, Enzymen, Antikörpern und Impfstoffen gegen eine große Vielfalt von Krankheiten in Reichweite gebracht wird. Die zitierten Veröffentlichungen, die im Detail die obengenannten repräsentativen Beispiele beschreiben, sowie weitere, im folgenden genannten Veröffentlichungen, welche den Hintergrund der Erfindung bilden, sind durch Verweis in die Offenbarung mit einbezogen.

Das Arbeitspferd der DNA-Rekombinations-Technologie ist das Plasmid, ein nichtchromosomaler Ring doppelsträngiger DNA, der in Bakterien gefunden wird und oft in vielfacher

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Kopie pro Bakterienzelle vorliegt. Die BNA des Plasmids enthält eine Information, die benötigt wird, um das Plasmid in Tochterzellen zu reproduzieren (d.h. ein ¹RePUkOn") und normalerweise ein oder mehr Selektions-Charakteristika, wie z.B. Resistenz gegen Antibiotika, die es erlauben, diejenigen Clone der Wirtszelle, die das interessierende Plasmid enthalten, zu erkennen und bevorzugt in selektivem Medium wachsen zu lassen. Der Nutzen der bakteriellen Plasmide liegt in der Tatsache, daß sie durch die eine oder andere Restriktionsendonuklease oder "Restriktionsenzym" spezifisch geschnitten werden können, von denen jedes eine andere Stelle auf der Plasmid-DNA erkennt. Danach können heterologe Gene oder Genfragmente in das Plasmid eingefügt werden, wobei entweder die Enden der Schnittstellen oder unmittelbar an die Schnittstellen angefügte Enden miteinander verbunden werden. Im folgenden wird der Terminus "heterolog" für ein Gen verwendet, das normalerweise nicht in E.coli gefunden wird oder eine Polypeptidsequenz, die normalerweise nicht durch E.coli hergestellt wird. Der Terminus "homolog" wird für ein Gen oder Polypeptid verwendet, das in Wildtyp E.coli hergestellt wird. Die DNA-Rekombination wird außerhalb der Bakterie durchgeführt. Das resultierende "rekombinante" Plasmid kann durch ein Verfahren, das als Transformation bekannt ist, in Bakterien eingeführt werden, und man erhält große Mengen des rekombinanten Plasmids, das das heterologe Gen enthält, indem man die Transformanten wachsen läßt. Wenn das Gen im Hinblick auf Bereiche des Plasmids, die die Transkription und Translation der codierten DNA-Information regeln, richtig eingefügt ist, kann der resultierende Expressionsvektor . dazu verwendet werden, tatsächlich die Polypeptidsequenz zu produzieren, für die das inserierte Gen codiert, ein Prozeß, der Expression genannt wird.

Die Expression wird in einer Gegend initiiert, die als Promoter bekannt ist, der von der RNA-Polymerase erkannt wird und an den diese bindet. In einigen Fällen, wie z.B. beim trp-Operon, das im nachfolgenden noch ausführlich diskutiert werden wird, werden Promoterregionen von "Operator"· Regionen überlappt, wodurch ein kombinierter Promoter-Operator gebildet wird. Operatoren sind DNA-Sequenzen, die von sogenannten Repressorproteinen erkannt werden, die dazu dienen, die Häufigkeit der Initiation der Transkription an einem speziellen Promoter zu regulieren. Die Polymerase arbeitet sich an der DNA entlang, wobei sie die in dem codierenden Strang enthaltene Information vom 5¹- zum 3'-Ende in Messenger-RNA (mRNA) transkribiert, die ihrerseits wieder in ein Polypeptid translatiert wird, das die Aminosäuresequenz aufweist, für die die DNA codiert. Jede Aminosäure wird durch ein einziges Nukleotidtriplet oder "Codon" codiert, das innerhalb eines "Strukturgens" liegt, wie man es für die vorliegenden Zwecke nennen mag, d.h. in dem Teil, der für die Aminosäuresequenz des exprimierten Produkts codiert. Nach dem Binden an den Promoter transkribiert die RNA-Polymerase vorerst Nukleotide, die für eine Ribosomen-Bindestelle codieren, sodann ein Initiations- oder "Start"-signal (normalerweise ATG, das in der resultierenden mRNA zu AUG wird) und schließlich die Nukleotidcodons innerhalb des Strukturgens selbst. Sogenannte Stop-Codons werden am Ende des Strukturgens transkribiert, wonach die Polymerase eine zusätzliche Sequenz von mRNA bilden kann, die, aufgrund der Anwesenheit des Stopsignals, von den Ribosomen nicht mehr translatiert wird. Ribosomen binden an die auf der mRNA zur Verfügung gestellten Bindestelle, bei Bakterien normalerweise wenn die mRNA gebildet wird, und stellen selbst das codierte Polypeptid her, wobei sie am Translations-Startsignal beginnen und an dem oben erwähnten Stopsignal enden. Das gewünschte Produkt wird hergestellt,

wenn die Sequenzen, die für die Ribosomen-Bindestelle codieren, im Hinblick auf das AUG-Initiatorcodon richtig liegen und wenn alle übrigen Codons dem Initiatorcodon in Phase folgen. Das resultierende Produkt kann erhalten werden, indem man die Wirtszelle lysiert und das Produkt durch geeignete Reinigungsschritte von anderen bakteriellen Proteinen trennt.

Die durch die Anwendung der DNA-Rekombinations-Technik exprimierten Polypeptide können vollkommen heterolog sein, wie im Falle der direktion Expression des menschlichen Wachstumshormons, können aber auch andererseits ein heterologes Polypeptid enthalten, das zumindest mit einem Teil der Aminosäuresequenz eines homologen Peptids verbunden ist, wie im Fall der Herstellung von Zwischenprodukten für Somatostatin und die Bestandteile des menschlichen Insulins. Im letzteren Fall enthält beispielsweise das angefügte homologe Polypeptid einen Teil der Aminosäuresequenz für ß-Galactosidase. In diesen Fällen ist das angestrebte bioaktive Produkt durch das angefügte homologe Polypeptid so lange bioinaktiv, bis dieses durch extrazelluläre Maßnahmen abgeschnitten wird. Die ebengenannten "Fusionsproteine" können so hergestellt werden, daß ein hochspezifisches Schneiden des Vorläuferproteins von dem angestrebten Produkt ermöglicht ist, beispielsweise durch die Einwirkung von Bromcyan auf Methionin oder aber durch enzymatisches Schneiden; siehe auch GB-PS Nr. 2 007 676 A.

Wenn die DNA-Rekombinations-Technologie ihr Versprechen voll halten soll, müssen Systeme erdacht werden, die die Expression der Geninsertionen optimieren, so daß das angestrebte Polypeptid-Produkt in großen Mengen erhalten werden kann. Die ß-Lactamase- und Lactose-Promoter-Operator-Systeme, die in der Vergangenheit üblicherweise verwendet

wurden, haben, obwohl sie gut zu verwenden sind, vom Standpunkt der Menge her die Kapazität der Technologie nicht voll ausgenutzt. Es besteht ein Bedürfnis für einen bakteriellen Expressionsvektor,der fähig ist, das gewünschte Polypeptid-Produkt in größerer Menge kontrolliert zu exprimieren.

Tryptophan ist eine Aminosäure, die von Bakterien als Be~ standteil eines homologen Polypeptide verwendet wird und in einem Biosyntheseweg hergestellt wird, der folgende Schritte enthält: Chorisminsäure —> Anthranilsäure —3> Phosphoribosylanthranilsäure —> CDRP (Enol-1-(o-Carboxyphenylamino)-1-desoxy-D-Ribulose-5-Phosphat) —> Indol-3-Glycerinphosphat · und letztlich Tryptophan selbst. Die enzymatischen Reaktionen dieses Synthesewegs werden durch Produkte des Tryptophan- oder "trp"-Operons katalysiert, einem polycistronisehen DNA-Segment, das unter der Kontrolle des trp-Promoter-Operator-Systems transkribiert wird. Die resultierende polycistronische mRKÄ. codiert die sogenannte trp-Führer- (im folgenden "Leader"- genannte) Sequenz und dann, der Reihe nach, die Polypeptide, genannt trpE, trpD, trpC, trpB und trpA. Diese Polypeptide katalysieren und kontrollieren auf verschiedene Weise einzelne Schritte des Synthesewegs ausgehend von der Chorisminsäure bis zum Tryptophan.

Im Wildtyp E.coli ist das Tryptophan-Operon unter der Kontrolle mindestens dreier, deutlich zu unterscheidender Arten. Im ersten Fall, einer Promoter-Operator-Repression, handelt das Tryptophan als Corepressor und bindet an seinen Aporepressor, um einen aktiven Repressorkomplex zu bilden, der seinerseits an den Operator bindet, wodurch das Tryptophan seinen eigenen Syntheseweg vollkommen verschließt. Zweitens bindet Tryptophan in einem Prozeß von Rückkopp-

lungshemmung an einen Komplex der trpE- und trpD-Polypeptide und verhindert dadurch deren Beteiligung an dem Syntheseweg. Letztlich wird eine Kontrolle ausgeübt durch einen Prozeß, der als "Attenuierung" bekannt ist. Dieser Vorgang lauft unter der Kontrolle einer "Attenuator-Region" des Gens ab, einer Region, die innerhalb der trp-Leader-Sequenz liegt. Die Attenuierung ist ein Vorgang, der phänotypisch als eine Art Verdünnung des Tryptophans in der Zelle in Erscheinung tritt (siehe dazu allgemein G.F. Miozzari et al., J. Bacteriology 133, W7 (1978); The Operon 263-302, Cold Spring Harbor Laboratory (1978), Miller und Reznikoff, eds.; F. Lee et al., Proc Nat'l Acad Sei, USA 74, 4365 (1977) und K. Bertrand et al., J. Mol. Biol. 103, 319 (1976)). Das Ausmaß der Attenuierung scheint durch die intrazelluläre Konzentration des Tryptophans geregelt zu werden, und in Wildtyp E.coli beendet der Attenuator die Expression in ungefähr neun von zehn Fällen, möglicherweise durch die Bildung einer Sekundärstruktur, eines "Terminationsrings" in der mRNA, welcher die RITA-Polymerase dazu veranlaßt, sich verfrüht von der DNA zu lösen.

Andere Autoren haben das trp-Operon dazu verwendet, um bis zu einem gewissen Grad heterologe Polypeptide zu exprimieren. Mit diesen Arbeiten hat man sich versuchsweise mit Problemen der Repression und Attenuierung befaßt, wobei Indolacrylsäure zugegeben wird, ein Induktor und Analogon, das mit Tryptophan um das trp-Repressor-Molekül konkurriert, wobei durch kompetitive Hemmung auf Derepression abgezielt wurde. Gleichzeitig verringert der Induktor durch Hemmung der enzymatischen Umwandlung von Indol zu Tryptophan die Attenuierung und bewirkt dadurch, daß der Zelle Tryptophan entzogen wird. Als Ergebnis davon lesen mehr Polymerasen erfolgreich über den Attenuator hinweg. Vom Standpunkt der

vollständig durchgehenden Translation und der angestrebten großen Mengen erscheint dieser Versuch jedoch problematisch, da die Tryptophan-enthaltenden Proteinsequenzen wahrend der Synthese infolge des Mangels von nutzbarem Tryptophan vorzeitig beendet werden. Tatsächlich ist bei diesem Versuch eine wirkungsvolle Unterstützung der Attenuierung vollständig von einer strengen Tryptophan-Aushungerung abhängig.

Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit Problemen im Zusammenhang mit Tryptophan-Repression und Attenuierung auf eine andere Weise und stellt Verfahren bereit, um

1. einen Expressionsvektor zu erhalten, der für eine direkte Expression heterologer Gene, ausgehend vom trp-Promoter-Operator, bestimmt ist;

2. Vektoren zu erhalten, bestimmt für die Expression von spezifisch schneidbaren Polypeptiden, die durch homologheterologe Genfusionen codiert werden, ebenfalls ausgehend vom trp-Operator-Promoter; und

3. heterologe Polypeptide kontrolliert, wirkungsvoll und in großen Mengen zu exprimieren.

Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf die zur Durchführung dieser Verfahren nützlichen Mittel.

Mit der vorliegenden Erfindung werden für das Herstellen von heterologen Polypeptid-Produkten in Bakterien neue, von Plasmiden abgeleitete Expressionsvektoren zur Verfügung gestellt. Die Vektoren haben eine Sequenz von doppelsträngiger DNA, die in Phase von einem ersten 5¹- zu einem zweiten 3'-Ende des codierenden Strangs folgende

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Bestandteile enthält: einen trp-Promoter-Operator, Nukleotide, die für die trp-Leader-Ribosomen-Bindestelle codieren und Fukleotide, die für die Translationsinitiation zur Expression eines Strukturgens codieren, welches für die Aminosäuresequenz eines heterologen Polypeptids codiert. Diese beschriebene DNA-Sequenz enthält weder eine trp-Attenuator-Region noch Nukleotide, die für die trpE-Ribosomen-Bindestelle codieren. Stattdessen wird die trp-Leader-Ribosomen-Bindestelle wirkungsvoll dazu verwendet, die Expression von Information zu bewirken, die durch inserierte Gene codiert wird.

Mit einem, einen trp-Promoter-Operator enthaltenden, erfindungsgemäßen Plasmid, das keinen Attenuator aufweist, werden Zellen transformiert und in Gegenwart von zugegebenem Tryptophan kultiviert. Mit der Verwendung von Tryptophan-reichem Medium steht ausreichend Tryptophan zur Verfügung, um im wesentlichen vollständig den trp-Promoter-Operator durch trp/Repressorinteraktionen zu reprimieren, so daß das Zellwachstum, ungehemmt.durch vorzeitige Expression großer Mengen von heterologen Polypeptiden, fortschreiten kann, wobei dieses Polypeptid durch eine Insertion codiert wird, die ansonsten unter der Kontrolle des trp-Promoter-Operator-Systems steht. Sobald einerseits die Kultur der Rekombinanten zu einer Dichte angewachsen ist, die für eine industrielle Herstellung des Polypeptids geeignet ist und andererseits das von außen zugeführte Tryptophan entfernt wurde, läßt man die Zellen lediglich mit dem Tryptophan wachsen, das sie selbst produzieren. Das Ergebnis ist eine schwache Tryptophanlimitierung, wodurch folglich der Syntheseweg dereprimiert wird und eine überaus wirksame Expression der heterologen Insertion auftritt, unbehindert durch Attenuierung, da die Attenuator-Region aus dem System entfernt wurde. Auf diese Weise

den Zellen niemals ernstlich Tryptophan entzogen, und alle Proteine, ob sie Tryptophan enthalten oder nicht, können in einem ausreichenden Umfang produziert werden.

Die Erfindung stellt weiter Mittel zur Verfügung, um dopp el strängige DNA an jeder "beliebigen, gewünschten Stelle zu schneiden, auch wenn eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym fehlt, eine Technik, die unter anderem für das Herstellen eines trp-Operons brauchbar ist, welches Attenuator-Deletionen aufweist, die sich von denjenigen unterscheiden, die man früher durch Selektion von Mutanten erhalten hat.

Schließlich stellt die Erfindung eine Vielzahl von brauchbaren Zwischenprodukten und Endprodukten zur Verfugung, einschließlich spezifisch spaltbarer, heterolog-homologer Fusionsproteine, die unter Expressionsbedingungen gegen Abbau stabil sind.

Die Art und Weise, auf welche diese und andere Ziele und Vorteile der Erfindung erreicht werden, wird aus der folgenden, detaillierten Beschreibung sowie aus den Zeichnungen ersichtlich. Es zeigen dabei:

Fig. 1 das Schema einer bevorzugten Ausführung der und Bildung eines Plasmids, das fähig ist, hetero-Fig. 2 löge Gene als Fusionen mit einem Teil des trpD-Polypeptids zu exprimieren, von dem sie später abgespalten werden können;

Fig. 3 das Ergebnis einer Polyacrylamid-Gel-Trennung von Zellprotein, das homolog(trpD*)-heterologe (Somatostatin oder Thymosin oci) Fusionsproteine enthält;

,3.11 U

Fig. 4-, aufeinanderfolgende Stufen in einem bevorzugten Fig. 5 Schema für die Herstellung eines Plasmids, das und fähig ist, direkt unter der Kontrolle eines trp-Fig. 6 Promoter-Operator-Systems ein heterologes Gen (menschliches Wachstumshormon) zu exprimieren;

Fig. 7 das Ergebnis einer Polyacryl amid-Gel-Trennung von Zellprotein, das menschliches Wachstumshormon enthält, welches direkt unter der Kontrolle des trp-Promoter-Operator-Systems exprimiert wurde;

Fig. 8, aufeinanderfolgende Stufen in einem bevorzugten Fig. 9a» Schema für die Herstellung eines Plasmids, das Fig. 9b fähig ist, heterologe Gene (in dem dargestellten und Fall für Somatostatin) fusioniert mit einem Teil Fig. 10 des trpE-Polypeptids zu exprimieren, wobei die Fusion später gespalten werden kann;

Fig. 11 das Ergebnis einer Polyacrylamid-Gel-Trennung von Zellprotein, das homolog(trpE)-heterologe Fusionsproteine zum Herstellen von Somatostatin bzw. Thymosinoc.1, menschlichem Proinsulin und der A- und B-Ketten des menschlichen Insulins enthält;

Fig. 12 aufeinanderfolgende Stufen der Art und Weise, und auf welche das Plasmid, das durch die Schemata Fig. 13 der Figuren 8 bis einschließlich 10 konstruiert wurde, manipuliert wird, um ein System zu bilden, in dem andere heterologe Gene als Fusion mit trpE-Polypeptidsequenzen austauschbar exprimiert werden können.

\J I I I Ί· KJ \i

In den Figuren werden aus Gründen der Klarheit der Darstellung in den meisten Fällen nur der codierende Strang des doppelsträngigen Plasmids und lineare DNA-Stränge gezeichnet. Gene, die für die Resistenz gegen ein Antibiotikum codieren, werden als ap (Ampicillin-Resistenz)

VJ

und te (Tetracyclin-Resistenz) bezeichnet. Die Bezeichnung

S
te bedeutet ein Gen für Tetracyclin-Resistenz, das nicht unter der Kontrolle eines Promoter-Operator-Systems steht, so daß Plasmide, die dieses Gen enthalten, dennoch Tetracyclin-sensitiv sind. Die Bezeichnung ap bezeichnet eine Ampicillin-Sensitivität, die durch die Deletion eines Teils des Gens entstanden ist, das für Ampicillin-Sensitivität codiert. Promotoren und Operatoren des Plasmids werden mit ρ und ο bezeichnet. Die Buchstaben A, T, G bzw. C bezeichnen die Nukleotide, die die Basen Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin enthalten. Weitere Legenden der Figuren werden aus dem Text ersichtlich.

Eine im folgenden beschriebene, bevorzugte Ausführungsform der Erfindung schließt die Verwendung einer Anzahl allgemein erhältlicher RestriktionsendoJiukleasen ein, die im folgenden bezeichnet und mit ihrer zugehörigen Erkennungssequenz sowie dem Schneidemuster (angezeigt durch Pfeile) beschrieben sind.

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Xbal:

EcoRI:

BgIII:

PvuII

BamHl:

CTAGA AGATCT

GAATTC CTTAAG.

GATCT TCTAGA

GAGCTG GTCGAC

GGATCC

CCTAGG t

Taql:	TCGA
	AGC_fT *
HindIII:	AAGCTT
	TTCGAA t I
Hpal:	GTTAAC
	CAATTG t
Pstl:	CTGCAG
	GACGTC t

Wo die Schnittpunkte auf den entsprechenden Strängen voneinander entfernt sind, werden die geschnittenen Enden "sticky", d.h. überstehend, und insofern in der Lage sein, sich wieder neu zu verbinden, bzw. diese "sticky-ends" können mit einer anderen, komplementären "sticky-end"-DNA durch Watson-Crick-Basenpaarung (A mit T und G mit C) korrekt miteinander verzapft werden. Einige Restriktionsenzyme, beispielsweise die oben beschriebenen Hpal und PvuII, hinterlassen nach dem Schnitt stumpfe Enden. Die oben gezeigten Nukleotidsequenzen sind gemäß einer diesbezüglichen Übereinkunft in der folgenden Veise dargestellt: Der obere Strang ist der Protein-codierende Strang, und man bewegt sich fortschreitend von links nach rechts vom 5¹- zum 3'-Ende dieses Strangs, d.h. in Richtung der Transkription von einem proximalen zu einem distalen Punkt.

Schließlich bezeichnet, im Hinblick auf die Übereinkunft, das Symbol "Δ" eine Deletion. Daher bezeichnet eine Benennung eines Plasmids, wie beispielsweise "AEcoRI-Xbal", dasjenige Plasmid, aus welchem die Nukleotidsequenz zwischen den EcoRI- und Xbal-Erkennungsstellen der entsprechenden Restriktionsenzyme durch Verdauung durch diese Enzyme entfernt wurde. Der Einfachheit halber wurden verschiedene Deletionen durch Zahlen bezeichnet. Die Bezeichnung "ΔΙ" bedeutet daher, beginnend vom ersten Basenpaar (Bp) der EcoRI-Erkennungsstelle, die auf das Gen für Tetracyclin-Resistenz in dem Elternplasmid pBR322 folgt, eine Deletion vom Bp 1-50 (d.h. ÄEcoRI-Hindlll) und daraus folgend ein Ausschalten des Tetracyclin-Promoter-Operator-Systems. Als "A 2" wird eine Deletion der Bp 1-375 verstanden (d.h. AEcoRI-BamHI) und infolgedessen ein Entfernen sowohl des Tetracyclin-Promoter-Operators und der Strukturgene, die für Tetracyclin-Resistenz codieren. Die Bezeichnung "Δ3" bedeutet eine Deletion der Bp 3611-4359 (d.h. APstl-EcoRl) und die Eliminierung der Ampicillin-Resistenz. "Δ4" wird verwendet, um das Entfernen der Bp ~9OO-~15OO vom trp-Operon-Fragment 5 (Fig. 1) zu bezeichnen, in dem die Strukturgene für das trpD-Polypeptid eliminiert sind.

Die trp-Leader-Sequenz ist aus den Basenpaaren (Bp) 1-162 aufgebaut, angefangen vom Startpunkt für die trpmRNA. Ein auf 14 Aminosäuren geschätzes trp~Leader-Polypeptid wird durch die Bp 27-71 codiert, die den ATG-Nukleotiden folgen, die für das Translations-Startsignal codieren. Die trp-Attenuator-Region enthält aufeinanderfolgend GC-reiche und AT-reiche Sequenzen, die zwischen den Bp 114 und 156 liegen. Die Attenuierung wird offensichtlich durch mRNA-Nukleotide bewirkt, die durch die

Bp ~134-141 der Leader-Sequenz codiert werden. Um heterologe Polypeptide unter dem Einfluß der trp-Leader-Ribosomen-Bindestelle zu exprimieren und gleichzeitig die Attenuierung zu verhindern, müssen die folgenden Kriterien beachtet werden:

1. Die Basenpaare 134-141 oder noch mehr über das Bp 141 hinaus müssen deletiert werden;

2. das ATG-Codon des inserierten Gens muß,wie bekannt, in der richtigen Lage zu einer Ribosomen-Bindestelle ausgerichtet sein (siehe z.B. J.A. Steitz "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA" in Biological Regulation and Control (ed. R. Goldberger) Plenum Press, N.Y. (1978));

3. wo ein homolog-heterologes Fusionsprotein produziert werden soll, sollte das Translations-Startsignal einer homologen Polypeptidsequenz verfügbar bleiben, und die Codons für den homologen Teil des Fusionsproteine müssen in Phase ohne dazwischenliegende Translations-Stopsignale inseriert werden.

Wenn beispielsweise alle Basenpaare innerhalb der Leader-Sequenz distal vom Bp 70 deletiert werden, wird die Attenuator-Region entfernt, die ATG-Sequenz, die für das Translations-Startsignal codiert, verbleibt und der dazwischenliegende Translations-Stop, codiert durch TCA (Bp 69-71), wird entfernt durch Eliminieren von A und die darauffolgenden Nucleotide. Eine derartige Deletion hätte als Ergebnis die Expression eines Fusionsproteine, das mit dem Leader-Polypeptid beginnt und mit demjenigen Polypeptid endet, das durch irgendeine heterologe Insertion codiert wird. Von diesen Polypeptiden wird eine distale Region

eines an die Leader-Sequenz anschließenden trp-Operon-Polypeptids eingeschlossen, die durch das Ausmaß der DeIetion in der 3'-Richtung bestimmt wird. Eine in das Gen E hineinreichende Deletion würde daher zur Expression eines homologen Vorläufers führen, der die L-Sequenz und die distale Region des Gens E (jenseits des Endpunkts der Deletion) enthält, verbunden mit der Sequenz, die durch irgendeine folgende Insertion codiert wird, usw.

Zwei besonders brauchbare Plasmide, aus denen die Attenuator-Region entfernt wurde, sind die Plasmide pGM1 und pGM3 (G.F. Miozzari et al., J. Bacteriology 133, W7 (1978)). Diese Plasmide tragen die Deletionen trp 4IE 14-13 und trp4lE 1417 und exprimieren (unter der Kontrolle des trp-Promoter-Operators) ein Polypeptid, das ungefähr die ersten sechs Aminosäuren des trp-Leaders und distale Regionen des E-Polypeptids enthält. In dem besonders bevorzugten Fall des Plasmids pGM1 wird lediglich etwa das letzte Drittel des E-Polypeptids exprimiert, wohingegen pGM3 nahezu die gesamte distale Hälfte des E-Polypeptid-Codons exprimiert. Der Stamm E.coli K-12 W3110 tna 2~tr£~A102, der pGM1 enthält, ist bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Nummer 31622 hinterlegt. Das Plasmid pGM1 kann auf herkömmliche Weise aus dem genannten Stamm zur Verwendung in den unten beschriebenen Verfahren entfernt werden.

Eine Möglichkeit, um mit den durch die Erfindung bereitgestellten Mitteln Deletionen einzuführen, ist das spezifische Schneiden von doppelsträngiger DNA an jeder gewünschten Stelle. Ein Beispiel dieser Schneidetechnik ist unten im Teil IV der Beschreibung der Experimente dargelegt. Dabei wird doppelsträngige DNA in einem den beabsichtigten Schneidepunkt umgebenden Bereich durch Reaktion mit λ,-Exonuklease in einzelsträngige DNA umge-

wandelt. Daraufhin wird ein synthetischer oder anderer Einzelstrang-DNA-Primer an das vorher gebildete Einzelstrangstück durch Watson-Crick-Basenpaarung hybridisiert. Dabei muß sichergestellt sein, daß das 5'-Ende der Primer-Sequenz exakt gegenüber demjenigen Nukleotid auf dem ersten Strang endet, das genau vor dem beabsichtigten Schneidepunkt liegt. Als nächstes wird der Primer durch Reaktion mit DNA-Polymerase in 3'-Richtung verlängert, wodurch derjenige Teil der ursprünglich doppelsträngigen DNA, der vor dem beabsichtigten Schnittpunkt liegt, wieder hergestellt wird, der im ersten Schritt verlorengegangen war. Gleichzeitig oder danach wird derjenige Teil des ersten Stranges, der jenseits des beabsichtigten Schnittpunkts liegt, wegverdaut. Das nachfolgende Schema veranschaulicht diesen Vorgang noch einmal, wobei "v" den beabsichtigten Schnittpunkt kennzeichnet:

j _v

a) ' ; beabsichtigter Schnittpunkt

"v"

b) ; " . Bilden eines Einzel-

; stranges im Bereich von "v"

c) j Primer-Hybridisierung

d) Verlängerung des Primers

e) i Einzelstrangverdauung

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Schritte (d) und (e) gleichzeitig ausgeführt, wobei eine Polymerase verwendet wird, die gleichzeitig die vorstehenden Einzelstrangenden in der 3' -> 5'-Richtung verdaut und den Primer (in Anwesenheit von dATP, dGTP, dTTP und dCTP) in der 5' 4 3'-Richtung verlängert. Besonders geeignet für diese Zwecke ist die Klenow-Polymerase I, d.h. dasjenige Fragment, das durch proteolytisches Spalten der DETA-Polymerase I erhalten wird und die 5¹ -> 3'-Polymerisierungsaktivität sowie die 3¹ -} 5¹-Exonukleaseaktivität des Elternenzyms aufweist, dagegen seine 5¹ "4 3'-Exonukleaseaktivität verloren hat (A. Kornberg, MA Synthesis, 98, V.H. Freeman und Co., SFO (1974))

Bei Verwendung des eben beschriebenen Verfahrens können Attenuator-Deletionen in einem ein trp-Operon enthaltenden Plasmid auf jede nur gewünschte Weise eingeführt werden. Das Plasmid wurde vorher in die lineare Form überführt, beispielsweise durch einen Schnitt an einer Restriktionserkennungsstelle stromabwärts von dem beabsichtigten Schnittpunkt, an dem das Molekül stumpfendig sein soll (siehe Bereich "v" im oben gezeigten Schema). Nach dem Deletieren der Attenuator-Region wird das Plasmid wieder in die Ringform gebracht. Dies kann beispielsweise durch Verbinden der stumpfen Enden oder auch durch andere Methoden geschehen, die dem Fachmann bekannt sind.

Obwohl die Erfindung die direkte Expression heterologer Polypeptide unter der Kontrolle des trp-Promoter-Operators umfaßt, ist der bevorzugte Fall die Expression von fusionierten Proteinen, die sowohl homologe als auch heterologe Sequenzen enthalten, wobei letztere vorzugsweise durch extrazelluläre Maßnahmen spezifisch von den homologen Proteinen abspaltbar sind. Ganz besonders bevorzugt sind

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Fusionen, in denen der homologe Teil eine oder mehrere Aminosäuren des trp-Leader-Polypeptids enthält und etwa ein Drittel oder mehr der trpE-Arainosäuresequenz (distales Ende). So erhaltene Fusionsproteine scheinen unter Expressionsbedingungen bemerkenswert stabil gegen Abbau zu sein.

Das Bakterium E.coli K-12, Stamm W311O tna 2""trp""A102 (pGMi), ATCC Nummer 31622, kann dazu verwendet werden, den Vorrat des Plasmids pGM1 zu vervielfachen, das bevorzugt für die Konstruktion des Attenuator-freien trp-Promoter-Operator-Systems der Erfindung verwendet wird. Dieser Stamm ist in Gegenwart von Anthranilat phänotypsich trp⁺ und kann in Minimalmedium, beispielsweise LB, das mit 50/ug/ml Anthranilat supplementiert wurde, wachsen.

Alle Bakterienstämme, die im Zusammenhang mit der Erfindung für die trp-Promoter-Operator dirigierte Expression verwendet werden, sind trp Repressor⁺ (trp R⁺) wie im Fall des Wildtyp E.coli, so daß die Repression sichergestellt ist, bis die heterologe Expression angestrebt wird.

In einer bevorzugten Aus führung s form wird die DBTA-Rekombination in E.coli K-12, Stamm 294 (end A, thi"", hsr", hsrn^), ATCC Nummer 3144-6, durchgeführt, einem Bakterienstamm, dessen Membraneigenschaften die Transformation erleichtern. Plasmide, die heterologe Polypeptide produzieren und im Stamm 294 gewachsen sind, werden auf die übliche Weise extrahiert und in Lösung gehalten (beispielsweise 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) bei Temperaturen von etwa -20°C bis 4°C. Für die Expression unter industriellen Bedingungen wird andererseits jedoch bevorzugt ein widerstandsfähigerer Stamm verwendet, nämlich E.coli K-12

X~F~RV 308 str^r , gal, J08", ATCC Nummer 31608. RV 308 ist ernährungsmäßig Wildtyp und wächst gut in Minimalmedium, in dem alle nötigen Macromoleküle aus einer üblichen Mischung von Ammonium-, Phosphat- und Magnesiumsalzen, Spurenelementen und Glukose synthetisiert werden. Nach der Transformation einer RV 308-Kultur mit dem aus dem Stamm 294· abgeleiteten Plasmid wird die Kultur auf einem Medium plattiert, das für einen Marker selektiv ist (beispielsweise Resistenz gegen ein Antibiotikum), den das Plasmid trägt. Eine Transformantenkolonie wird abgeimpft und in einer Flaschenkultur gezüchtet. Aliquots dieser Flaschenkultur werden in 10 % DMSO oder Glycerinlösung (in sterilen Vheaton-Fläschchen) in einem Äthanol-Trockeneisbad schockgefroren und auf -80⁰C tiefgefroren. Um das codierte heterologe Polypeptid zu produzieren, werden Proben der Kultur in einem Medium gezüchtet, das Tryptophan enthält, um den trp-Promoter-Operator zu reprimieren. Anschließend wird dem System das zugegebene Tryptophan entzogen, um die Expression zu ermöglichen.

Für die erste Wachstumsstufe kann beispielsweise LB-Medium verwendet werden (J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, 433, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)), das pro Liter wäßriger Lösung 10 g Bacto Trypton, 5 g Bacto Hefeextrakt und 10 g NaCl enthält. Vorzugsweise läßt man die beimpfte Kultur bis zu einer optischen Dichte (o.D.) von 10 oder mehr (bei 550 nm), insbesondere zu einer o.D. von 20 oder mehr, besonders bevorzugt jedoch zu einer o.D. von 30 oder mehr wachsen, jedoch nicht bis zur stationären Phase.

Für die Derepression und Expression wird die beimpfte Kultur als nächstes unter Bedingungen gezüchtet, unter denen der Zelle das zugegebene Tryptophan entzogen wird.

- 29 -

Ein geeignetes Medium für ein derartiges Wachstum ist M9 (J.H. Miller, Seite 4-31, a.a.O.), das wie folgt hergestellt wird (pro Liter):

KH₂PO₄ 3 g

NaGl 0,5 g

31 1g

Nach dem Autoklavieren wird dieser Mischung zugegeben;

10	ml	o,	01	M	CaCl₂
1	ml	1	M		MgSO₄
10	ml	20	%		Gluko

Vitamin B1 1 yug/ml

"Humko Hycase Amino"

oder DII¹CO Kasein-Amino säuren 40 /ig/ml.

Das AminosäureSupplement ist ein Hydrolysat von Kasein, dem Tryptophan fehlt.

Um die Expression des heterologen Polypeptids zu starten, kann man beispielsweise die in einem Tryptophan-reichen Medium gewachsene Impfkultur in einem größeren Volumen eines Mediums verdünnen, das kein zusätzliches Tryptophan enthält (beispielsweise in einer 2- bis 10-fachen Verdünnung). Man läßt die Kultur dann bis zu einer gewünschten Dichte wachsen (vorzugsweise bis kurz vor die stationäre Wachstumsphase) und erhält das angestrebte Produkt auf übliche Weise durch Lyse, Zentrifugieren und Reinigen. In dem Wachstums stadium des Tryptophanentzugs läßt man die Zellen vorzugsweise bis zu einer o.D. von mehr als 10,

insbesondere von mehr als 20 und besonders bevorzugt bis zu oder über eine o.D. von 30 (jeweils bei 550 nm) wachsen, ehe das angestrebte Produkt isoliert wird.

Alle DNA-Eekombinations-Experimente, die .in dem folgenden experimentiellen Teil beschrieben werden, wurden bei Genentech Inc. in Übereinstimmung mit den Eichtlinien des National Institutes of Health (WIH) bezüglich der Forschung mit rekombinanter DNA durchgeführt.

I. Expression des D-Polypeptid-Fusionsproteins

Mit Bezug auf die Figuren 1 bis 3 wird ein bevorzugtes Verfahren zur Expression von Fusionsproteinen beschrieben, die das gewünschte Polypeptid enthalten und, daran angebunden, einen Teil der Aminosäuresequenz des trpD-Polypeptids, das in vitro mittels einer Aminosäure Methionin, die spezifisch für ein CNBr-Spalten sensitiv ist, abgetrennt werden kann.

A) Konstruktion von pBRHtrp

Das Plasmid pGM1 (1, Fig. 1) trägt das E.coli-Tryptophan-Operon, das die Deletion ΔΙΕ 1413 enthält (G.F. Miozzari et al., (1978), J. Bacteriology 1457-14-66) und exprimiert somit ein Fusionsprotein, das die ersten sechs Aminosäuren des trp-Leaders und annähernd das letzte Drittel des trpE-Polypeptids (im nachfolgenden als die Verbindung IE¹ bezeichnet), ebenso wie das vollständige trpD-Polypeptid, enthält, alle unter der Eontrolle des trp-Promoter-Operator-Systems. 20 /ig des Plasmids werden mit dem Eestriktionsenzyra PvuII verdaut, das das Plasmid

an fünf Stellen schneidet. Das Genfragment 2 (Fig. 1) wird als nächstes mit einer EcoRI-Verbindungsstelle, einem sogenannten Linker (■bestehend aus einem in sich selbst komplementären Oligonükleotid 3 (Fig. 1) der Sequenz: pCATGAATTCATG) kombiniert, wodurch eine EcoRI-Schnittstelle für ein späteres Clonen in ein Plasmid 20 (Fig. 6), das eine EcoRI-Erkennungsstelle enthält, zur Verfügung gestellt wird. Die durch das Plasmid pGM1 erhaltenen 20 /ig des DEA-Fragments 2 (Fig. 1) werden mit 10 Einheiten T^-DNA-Ligase in Anwesenheit von 200 Picomolen des 5'~phosphorylierten, synthetischen Oligonukleotids 3 (Fig. 1) mit der Sequenz pCATGAATTCATG und in 20/il T^-DNA-Li gase -Puffer (20 mM Tris, pH 7,6; 0,5 mM ATP, 10 mM MgGl₂, 5 mM Dithiothreit) bei 4⁰C über Nacht behandelt. Die Lösung wird daraufhin 10 Minuten lang bei einer Temperatur von 70⁰C erhitzt, um die Ligasebindung zu stoppen. Die Linker werden durch EcoRI-Verdauung geschnitten und die Fragmente, die nun EcoRI-Enden enthalten, werden mittels 5 %iger Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (im folgenden PAGE genannt) voneinander getrennt. Die drei größten Fragmente werden sodann aus dem Gel isoliert, indem sie zuerst mit Äthidiumbromid markiert, danach die Fragmente mit Ultraviolett-Licht lokalisiert und schließlich die interessierenden Teile aus dem Gel herausgeschnitten werden. Jedes Gelfragment wird mit 300 Mikrolitern 0,IxTBE in einen Dialyseschlauch überführt und in einem Ο,ΙχΤΒΕ-Puffer bei 100 Y eine Stunde lang einer Elektrophorese unterworfen (der TBE-Puffer enthält: 10,8 <g Tris, 5»5 g Borsäure, 0,09 g Na₂EDTA in 1 1 H₂O). Die wäßrige Lösung

wird aus dem Dialyseschlauch gesammelt, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert, und 0,2 Natriumchlorid-molar gemacht und die DNA in Wasser überführt, nachdem sie mit Äthanol gefällt wurde. (Sämtliche DNA-Fragment-Isolierungen, die im folgenden beschrieben werden, wurden unter Verwendung von PAGE, gefolgt von der eben beschriebenen Methode des Elektroeluierens durchgeführt.) Das Gen 5 (Fig. 1)» das den trp-Promoter-Operator enthält sowie überstehende EcoRI-Enden aufweist, wird in einem Verfahren identifiziert, das als nächstes beschrieben werden wird, welches das Einfügen von Fragmenten in ein Tetracyclin-sensitives Plasmid (Fig. 1) zur Folge hat, das, infolge der Promoter-Operator-Insertion, Tetracyclin-resistent wird.

B) Herstellen des Plasmids pBRHtrp, das unter der Kontrolle des trp-Promoter-Operators Tetracyclin-Resistenz exprimiert sowie Identifizieren und Vervielfältigen des im obigen Abschnitt A) isolierten DRA-Iragments 5 (Fig. 1), das den trp-Promoter-Operator enthält.

Das Plasmid 6 (Fig. 1) mit der Bezeichnung pBRH1 (R.I. Rodriguez, et al., Nucleic Acids Research 6, 3267-3287 (1979)) exprimiert Ampicillin-Resistenz und enthält das Gen für Tetracyclin-Resistenz, welches allerdings, da kein dazugehöriger Promoter vorhanden ist, diese Resistenz nicht exprimiert. Dementsprechend ist das Plasmid letracyclin-sensitiv. Durch Einführen eines Promoter-Operator-Systems in die EcoRI-Erkennungsstelle kann das Plasmid Tetracyclin-resistent gemacht werden.

Das Plasmid pBRH1 wird mit EcoRI verdaut, worauf das Enzym durch Phenol-Extraktion entfernt wird, gefolgt durch eine Chloroform-Extraktion und Wiederaufnahme in Wasser nach einer Äthanolfällung. Das entstandene DNA-Molekül 7 (Fig· 1) wird, in getrennten Reaktionsmischungen, mit jedem der drei DNA-Iiragmente, die im oben geschilderten Teil A) erhalten wurden, kombiniert und mit T₂,-DNA-Ligase, wie vorstehend beschrieben, verbunden. Die in der Reaktionsmischung vorhandene DNA wird durch Standardtechniken (V. Hershfield et al., Proc Nat ¹I Acad Sei USA 71, 3455-34-59 097*)) dazu verwendet, um einen kompetenten E.coli K-12, Stamm (K. Backman et al., Proc Nat ¹I Acad Sei USA 73, 4174-4198 (1976)) (ATCC Nummer 314-4-8) zu transformieren, worauf die Bakterien auf LB-Platten, die 20 /ig/ml Ampicillin und 5 /ig/ml Tetracyclin enthalten, plattiert werden. Es v/erden einige Tetracyclin-resistente Kolonien selektiert, die Plasmid-DNA isoliert und die Anwesenheit des gewünschten Fragments durch eine Restriktionsenzym-Analyse sichergestellt. Das resultierende Plasmid (Fig. 1), mit der Bezeichnung pBRHtrp, exprimiert ß-Lactamase, verleiht Ampicillin-Resistenz, und es enthält ein DNA-Fragment, das den trp-Promoter-Operator einschließt und für ein erstes Protein codiert, das aus einer Fusion der ersten sechs Aminosäuren des trp-Leaders und annähernd des letzten Drittels des trpE-Polypeptids (dieses Polypeptid wird IE¹ genannt) besteht, sowie für ein zweites Protein, entsprechend der ungefähr ersten Hälfte des trpD-Polypeptids (dieses Polypeptid wird D¹ genannt) und weiterhin für ein drittes Protein, für das das Gen für Tetracyclin-Resistenz codiert.

C) Clonierende Gene für verschiedene Endprodukt-Polypeptide und die Expression dieser Gene als Fusionsproteine, die das Endprodukt und einen spezifisch spaltbaren trpD-Polypeptid-Vorläufer · enthalten (Pig. 2).

Aus dem Plasmid pBRHtrp erhält man ein, den trp-Promoter-Operator und Codons für die EE¹- und D'-Polypeptide aufweisendes DNA-Fragment, das in Plasmide inseriert wird, die Strukturgene für verschiedene gewünschte Polypeptide enthalten, im folgenden beispielhaft dargestellt für den Fall des Somatostatin (Fig. 2).

Das Plasmid pERHtrp wird mit dem Eestriktionsenzym EcoRI verdaut und das so entstandene Fragment 5 (Fig. 2) durch PAGE und Elektroeluierung isoliert. Das EcoKI-verdaube Plasmid pSom11 (E. Itakura et al., Science 198, 1056 (1977)); GB-PS 2 007 676 A) wird mit Fragment 5 (Fig. 2) vereint. Die Mischung wird, wie oben beschrieben, mit Tn-DNA-Ligase verbunden, und mit der resultierenden DNA wird E.coli K-12, Stamm 294-, wie bereits geschildert, transformiert. Transformierte Bakterien werden auf Ampicillin enthaltenden Platten selektiert. So erhaltene Ampicillin-resistente Kolonien werden durch Hybridisieren der Kolonien geprüft (M. Gruenstein et al., Proc !Tat ¹I Acad Sei USA 72, 3951-3965 (1975)), wobei als Vergleich das aus dem Plasmid pBRHtrp isolierte, den trp-Promoter-Operator enthaltende Fragment 5 (Fig. 2) verwendet wird, das mit P^ radioaktiv markiert wurde. "Verschiedene Kolonien, die sich bei der Hybridisierung der Kolonien als positiv herausgestellt haben, werden selektiert,

·Ύ

die Plasmid-DNA wird isoliert und die Orientierung des inserierten itagments durch Restriktionsanalyse bestimmt, wobei die Restriktionsenzyme BgIII und BamHI in einer Doppelverdauung verwendet werden. Der Stamm E.coli 294, der das Plasmid 11 (Fig. 2), mit der Bezeichnung pSom7ß2, enthält, welches das trp-Promoter-Operator-Iragment in der gewünschten Orientierung aufweist, wird in LB-Medium gezüchtet, das 10 jug/ral Ampicillin enthält. Man läßt die Zellen bis zu einer optischen Dichte von 1 wachsen (bei 550 ^nm)» sammelt sie durch Zentrifugieren und resuspendiert sie in M9-Medium in zehnfacher Verdünnung. Man läßt die Zellen daraufhin zwei bis drei Stunden lang wachsen, bis sie wieder eine optische Dichte von 1 aufweisen, lysiert sie und analysiert das vollständige zelluläre Protein mit SDS (Natriumdodecylsulfat), Harnstoff (15 %) und Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (J.V. Maizel Jr. et al., Meth Viral 5, 180-246 (1971)).

In KLg. 3 ist eine Protein-Gel-Analyse dargestellt, bei der sämtliches Protein von verschiedenen Kulturen der Große nach getrennt wurde. Die Dichte der einzelnen Banden gibt die Menge wieder, in der die entsprechenden Proteine vorliegen. In der Abbildung der Fig. 3 sind die Spalten 1 und 7 Kontrollen, die eine Vielzahl von Proteinen enthalten, deren Größe vorher bestimmt wurde und die als Referenz dienen. In den Spalten 2 und 3 ist zelluläres Protein von Kolonien des Stammes E.coli 294 gewandert, der mit dem Plasmid pSom7Ä2 transformiert wurde und entweder in LB-Medium (Spalte 2) oder in M9-Medium (Spalte 3) gezüchtet wurde. Die Spalten 4 und 5 enthalten zelluläres Protein, das

aus ähnlichen Zellen erhalten wurde, die mit dem Plasmid pThoc7<42 transformiert wurden. Hierbei handelt es sich um ein Thymosin-exprimierendes Plasmid, das durch ein im wesentlichen mit dem bereits beschriebenen identischen Verfahren erhalten wird, wobei von dem Plasmid pTh«,1 ausgegangen wird (siehe die gemeinsam von Roberto Crea und Ronald B. Wetzel auf die Anmelderin übergegangene US-Patentanmeldung, eingereicht am 28. Februar 1980 bezüglich der Thymosin 0G1-Produktion; durch dieses Zitat ist die Patentanmeldung in die Offenbarung mit einbezogen). Die Spalte 4 enthält zelluläres Protein von E.coli 29VpTh«7A2, das in LB-Medium gewachsen ist, wohingegen die Spalte 5 Zellprotein aus derselben Transformanten enthält, die jedoch in M9-Medium gewachsen ist. Spalte 6, eine weitere Kontrolle, ist das Proteinmuster von E.coli 294/ pBR322, gewachsen in LB-Mediura.

Ein Vergleich mit den Kontrollen zeigt, daß die oberste der beiden am stärksten hervortretenden Banden in den Spalten 3 und 5 Proteine derjenigen Größe enthalten, die im Fall der Expression eines Fusionsproteins erwartet wird, das das D'-PoIypeptid und Somatostatin bzw. Thymosin enthält (die andere ausgeprägte Bande enthält das LE¹-Polypeptid als Ergebnis der Deletion des Attenuators) Fig. 3 bestätigt, daß die Expression in Tryptophanreichem Medium reprimiert ist, jedoch unter Tryptophan-Mangelbedingungen dereprimiert ist.

D) Bromcyan-Spaltung und Radioimmunoassay des Hormonprodukts

Sowohl im Fall des Thymosins als auch des Somatostatins wird das vollständig^ zelluläre ' Protein mit Bromcyan gespalten, das Spaltprodukt wiedergewonnen und, nach dem Trocknen, in Puffer resuspendiert und durch Radioimmunoassay analysiert, wodurch sichergestellt wird, daß das Expressionsprodukt immunologisch identisch ist mit Somatostatin bzw. Thymosin. Das Spalten mit Bromcyan ist beschrieben bei D.Y. Goeddel et al., Proc Nat ¹I Acad Sei USA 76, 106-110 (1979).

II. Konstruktion von Plasmiden für die direkte Expression heterologer Gene unter der Kontrolle des trp-Promoter-Operator-Systems

Die Strategie für eine direkte Expression hat die Schaffung eines Plasmids zur Folge, das distal von allen Kontrollelementen des trp-Operons eine einzige Restriktionserkennungsstelle aufweist, in welche heterologe Gene anstelle der trp-Leader-Seguenz und in richtigem, räumlichem Verhältnis zu der trp-Leader-Ribosomen-Bindestelle des Polypeptide geclont werden können. Die Durchführung der direkten Expression wird im folgenden für den Fall der Expression des menschlichen Wachstumshormons beispielhaft beschrieben.

10/ig des Plasmids pSom7A2 werden mit EcoRI geschnitten vmt das DNA-Fragment 5 (Fig. 4-), das die genetischen Bestand-

2Q - » " "-.f.— — -*

311U05

teile für Tryptophan enthält, wird durch PAGE und Elektroeluierung isoliert. 2 ug dieses Fragments werden mit zwei Einheiten der Restriktionsendonuklease Taql verdaut, und zwar 10 Minuten bei 37⁰C» so daß im Durchschnitt nur eine der vermutlich fünf (Taql-Erkennungsstellen in jed-em Molekül geschnitten wird. Diese teilweise verdaute !Fragmentmischung wird durch PAGE getrennt und ein annähernd 300 Basenpaare langes !Fragment 12 (Fig-. 4-), das ein EcoRI-Ende und ein Taql-Ende enthält, wird durch Elektroeluierung isoliert. Die korrespondierende Taql-Erkennungsstelle ist zwischen den Startstellen für die !Transkription und die Translation angeordnet und liegt 5 Nucleotide stromaufwärts vom ATG-Codon des trp-Leader-Peptids. Die DNA-Sequenz dieses Bereichs ist in Fig. 4 gezeigt. Wenn man wie beschrieben verfährt, kann ein Fragment isoliert werden, das alle Kontrollelemente des trp-Operons enthält, d.h. das Promoter-Operator-System, das Transkriptions-Initiationssignal und die trp-Leader-Ribosomen-Bindestelle.

Als nächstes wird der, dem Translations-Startsignal für die trp-Leader-Sequenz benachbarte Taql-Rest am 3'-Ende des erhaltenen Fragments in eine Xbal-Erkennungsstelle umgewandelt, wie Fig. 5 zeigt. Dies erfolgt durch Anknüpfen des oben erhaltenen Fragments an ein Plasmid, das nur eine einzige EcoRI- und eine einzige Xbal-Erkennungsstelle enthält. Für diese Zwecke kann man im wesentlichen jedes plasmid verwenden, das aufeinanderfolgend ein Replikon, einen selektierbaren Marker, beispielsweise eine Antibiotikum-Resistenz, und EcoRI-, Xbal- und BamHI-Erkennungsstellen enthält. Hierzu kann beispielsweise eine Xbal-Erkennungsstelle zwischen die EcoRI- und BamHI-Erken-

-59- ■■-■··■··· ·-■-"-■··

nungsstelle auf dem Plasmid pBR322 eingefügt werden (F. Bolivar et al., Gene 2, 95-119 (1977)), und zwar beispielsweise in der Weise, daß an der einzigen Hindlll-Erkennungsstelle des Plasmids mit dem Restriktionsenzym Hindlll geschnitten wird, gefolgt von einer Einzelstrang-spezifischen TTukleaseverdauung der so entstandenen überstehenden Enden und Verknüpfen der stumpfen Enden eines sich selbst fest verbindenden doppelsträngigen, synthetischen Nukleotids, das beispielsweise eine Erkennungsstelle CCTCTiLGAGG enthält. Andererseits können auf natürliche Weise erhaltene DNA-Fragmente verwendet werden, wie im vorliegenden Fall, die eine einzelne Xbal-Erkennungsstelle zwischen EcoRI- und BamHI-Schneideresten enthalten. Mit üblichen Mitteln wurde somit ein EcoRI- und BamHI-Verdauungsprodukt des Genoms des Hepatitis B-Virus hergestellt und zwischen die EcoRI- und BamHI-Erkennungsstellen des Plasmids pGH6 eingefügt (D.V. Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979.)), wodurch das Plasmid pHS32 gebildet wird. Das Plasmid pHS32 wird mit Xbal geschnitten und aufeinanderfolgend mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Äthanol gefällt. Es wird dann mit 1 /il E.coli-Polymerase I, Klenow-Fragment (Boehringer-Mannheim) in 30 /*1 Polymerase-Puffer (50 mM Calciumphosphat pH 7Λ, 7 mM MgCl₂, 1 mM ß-Mercaptoäthanol) enthaltend 0,1 mM dTTP und 0,1 mM dCTP, vorerst 30 Minuten lang bei O⁰C und dann 2 Stunden bei 37⁰C behandelt. Diese Behandlung hat zur Folge, daß zwei der vier, zu der am 5'-Ende überstehenden Xbal-Schneidestelle komplementären XTukleotiden aufgefüllt werden:

5¹ CTAGA 5' CTAGA

3« rp ' 3' TCT-

Zwei Nucleotide, dC und dT, werden auf diese Weise eingebaut, wodurch ein Ende mit zwei 5'-überstehenden Uukleotiden entsteht. Dieser lineare Rest des Plasmids pHS32 wird (nach Phenol- und Chloroformextraktion und Wiederaufnahme in Wasser nach Ithanolfällung) mit EcoRI geschnitten. Das große Plasmidfragment 13 (Fig. 5) wird von dem kleineren EcoRI-Xbal-Fragment durch PAGE getrennt und nach Elektroeluierung isoliert, Dieses DlSTA-Fragment von pHS32 (~0,2 jug) wird, unter ähnlichen Bedingungen wie oben beschrieben, an das EcoRI-Taql-Eragment des Tryptophan-Operons (0,01 /ig) angeknüpft, wie in Fig. 5 dargestellt. Bei diesem Verfahren wird das überstehende' TaqJ-Ende mit dem verbleibenden überstehenden Xbal-Ende verknüpft, wobei sogar vermutet wird, daß nicht überall Watson-Crick-Basenpaarung vorliegt:

-T CTAGA TCTAGA-

T /

-AGC TCT AGCTCTr-

Ein Teil dieser Verknüpfungs-Reaktionsmischung wird in E.coli 294-Zellen transformiert, wie oben in Abschnitt I beschrieben, hitzebehandelt und auf LB-Platten, die Ampicillin enthalten, plattiert. 24- Kolonien werden selektiert, in 3 ml LB-Medium gezüchtet und das Plasmid isoliert. Sechs dieser Plasmide zeigten via E.coli katalysierter DNA-Reparatur und -Replikation eine völlig wiederhergestellte Xbal-Erkennungsstelle:

TCTAGA TCTAGA-T-

AGCTCT AGATCT

Diese Plasmide wurden auch sowohl durch EcoRI als auch Hpal geschnitten und ergaben die erwarteten Eestriktionsfragmente. Ein Plasmid 14 (Pig. 5), genannt pTrp 14, wurde für die Expression heterologer Polypeptide verwendet, wie im folgenden diskutiertwerden wird.

Das Plasmid pHGH1O7, mit dem Bezugszeichen 18 in Fig. 6 (D.V. Goeddel et al., Nature, 281, 544 (1979)) enthält ein Gen für menschliches Wachstumshormon, be- ' stehend aus 23 Aminosäurecodons, hergestellt aus synthetischen DNA-Fragmenten und weiteren 163 Aminosäurecodons, erhalten aus komplementärer DNA, die mittels reverser Transkription der m-RNA des menschlichen Wachstumshormons erhalten wurde. Dieses Gen 21 (Fig. 6) enthält, obwohl ihm die "pre"-Sequenz des menschlichen Wachstumshormons fehlt, ein ATG-Translations-Initiationscodon. Das Gen wird aus 10/ig pHGH1O7 nach Behandlung mit EcoRI und nachfolgend mit E.coli-Polymerase-I-Klenow-Fragment und dTTP und dATP, wie beschrieben, isoliert. Nach einer Phenol- und Chloroformextraktion und Äthanolfällung wird das Plasmid mit BamHI behandelt, siehe dazu Fig. 6. Das Fragment 21, welches das Gen für menschliches Wachstumshormon (HGH) enthält, wird durch PAGE, gefolgt durch Elektroeluierung, isoliert. Das erhaltene DNA-Fragment enthält weiterhin die ersten 350 Nukleotide des Strukturgens für Tetracyclin-Resistenz, nicht dagegen das Tetracyclin-Promoter-Operator-System, so daß:, wenn es anschließend in einem Expressionsplasmid geclont wird, Plasmide, die die Insertion tragen, dadurch gefunden werden können, daß die Tetracyclin-Resistenz wieder hergestellt ist. Da das EcoRI-Ende des Fragments 21 (Fig. 6) durch die Behandlung mit derlGenow-Polymerase-I aufgefüllt wurde,

weist das Fragment ein stumpfes und ein überstehendes Ende auf, wodurch beim späteren Einfügen in ein Expressionsplasmid die korrekte Orientierung sichergestellt ist, siehe dazu Pig. 6.

Als nächstes wird das Expressionsplasmid pTrp14- vorbereitet, um das vorstehend hergestellte, das HGH-Gen enthaltende !Fragment aufzunehmen. Dazu wird das Plasmid pTrpi4 Xbal-verdaut,und die erhaltenen überstehenden Enden werden mit dem Klenow-Polymerase-I-Verfahren unter Verwendung von dATP, dTTP, dGTP und dCTP aufgefüllt. Nach Phenol- und Chloroformextraktion und Äthanolfällung wird die resultierende DNA 16 (Fig. 6) mit BamHI behandelt und das so erhaltene große Plasmidfragment (Fig. 6) durch PAGE und Elektroeluierung isoliert. Das von pTrpi4 abgeleitete Fragment 17 (Fig. 6) hat ein stumpfes und ein überstehendes Ende, wodurch Rekombination mit dem das HGH-Gen enthaltenden Fragment, das oben beschrieben wurde, in korrekter Orientierung sichergestellt ist.

Das HGH-Genfragment 21 (Fig. 6) und das pTrpi4 Xba-BamHI-Fragment .17 (Fig. 6) werden unter ähnlichen Bedingungen wie oben beschrieben zusammengefügt und miteinander verknüpft. Die aufgefüllten Xbal- und EcoRI-Enden werden durch stumpfendige Verknüpfung miteinander verbunden, wodurch sowohl die Xbal- als auch die EcoRI-Erkennungsstellen wieder hergestellt werden:

Xbal, aufgefüllt	EcoRI, aufgefüllt	HGH-Gen- Initiation
(EGTAG	AAOJTGTATG	[IJGTAGJAATTCTATG
AGAiDC	TTAAGATAC	AGATCjTTA^GATAC
		Xbal EcoRI

Diese Konstruktion stellt auch das Gen für Tetracyclin-Resistenz wieder her. Da das Plasmid pHGH1O7 die Tetracyclin-^ si stenz von einem Promoter aus exprimiert, der stromaufwärts vom HGH-Gen liegt (dem lac-Promoter), erlaubt diese Konstruktion 22 (Fig. 6), genannt·pHGH2O?, die Expression des Gens für Tetracyclin-Resistenz unter der Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operators. Dazu wird E.coli 294 mit der Verknüpfungsmischung transformiert und die Kolonien auf LB-Platten, die 5 /ig/ml Tetracyclin enthalten, selektiert.

Um die direkte Expression des menschlichen Wachstumshormons vom Plasmid pHGH2O7 nachzuweisen, wird das gesamte zelluläre Protein aus der Kultur E.coli 294·/ pHGH2O7 gewonnen, nachdem die Kultur "bis zu einer optischen Dichte von 1 in LB-Medium mit 10 /ig/ml Ampicillin gezüchtet, danach in M9-Medium 1:10 verdünnt und wieder "bis zu einer optischen Dichte von 1 gezüchtet wurde. Das gesamte zelluläre Protein wird einer SDS-GeI-Elektrophorese, wie im obigen Abschnitt I geschildert, unterworfen und mit ähnlichen Elektrophore.sedaten für menschliches Wachstumshormon verglichen, die früher von anderen gefunden wurden (D.V. Goeddel et al., Nature, 281, 544 (1979)). Fig. 7 ist eine Fotografie des so erhaltenen, gefärbten Gels. Die Spalten 1 und 7 enthalten Vergleichsproteine verschiedener bekannter Größen; die Spalte 2 ist eine Kontrolle mit dem gesamten zellulären Protein des Stammes E.coli 294/pBR322; die Spalte 3 enthält Protein von E.coli 29VpHGEMO?, gewachsen in LB-Medium; die Spalte 4 enthält Protein von E.coli 294/pHGHiO7, gewachsen in M9-Medium; die Spalte 5 enthält Protein von E.coli 294/pHGH207, gewachsen in LB-Medium; und Spalte 6 enthält Protein E.coli 294/pHGH2O7, gewachsen in M9-Mediura. Die dichte

311U05

Bande in Spalte 6 ist menschliches Wachstumshormon, wie durch den Vergleich zu den ähnlichen Banden in den Spalten 2 bis 4 gezeigt ist. Wie durch die Erfindung vorausgesagt, produziert der Organismus E.coli 29VpHGH207, wenn er in Tryptophan-r ei ehern LB-Medium wächst, weniger Wachstumshormon aufgrund der Tryptophan-Repressor-Operator-Interaktion, und, gezogen in M9-Medium," beträchtlich mehr HGH als E.coli 294/pHGHiO7, bedingt durch die Induktion des im Gegensatz zum lac-Promoter-Operator-Systems in pHGH1O7 stärkeren Tryptöphan-Promoter-Operator-Systems.

III. Herstellen eines allgemeinen Expressionsplasmxds für die direkte Expression heterologer Gene unter der Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operators

Das im vorstehenden Abschnitt hergestellte Plasmid pHGH2O7 wird als nächstes dazu verwendet, um ein DNA-Fragment zu erhalten, das die Kontrollelemente des Tryptophan-Operons enthält (mit Ausnahme des Attenuators) und einen Plasmid-Expressions-Vektor herzustellen, der für die direkte Expression verschiedener, inserierter Strukturgene geeignet ist. Zur Strategie des Hersteilens des allgemeinen Expressionsplasmids gehört das Entfernen der Tryptophan-Kontrollregion von pHGH207 durch EcoEI-Verdauung und Inserieren in das EcoRI-verdaute Plasmid pBRH1, das oben in Abschnitt I verwendet wurde. pBRH1 ist, wie bereits erwähnt, ein Ampicillinresistentes Plasmid, das die Gene für Tetracyclin-Resistenz enthält, jedoch Tetracyclin-sensitiv ist, da ein geeignetes Promoter-Operator-System fehlt.

311H05

Das so erhaltene Plasmid, ρΗΚΥΊ, dessen Konstruktion unten detailliert "beschrieben wird und in Fig. 8 dargestellt ist, ist sowohl Ampicillin- als auch Tetracyclin-resistent, enthält das Tryptophan-Promoter-Operator-System, enthält nicht den Tryptophan-Attenuator und enthält eine einzige Xbal-Erkennungsstelle, die distal vom Tryptophan-Promoter-Operator liegt. Der Tryptophan-Promoter-Operator und die einzige Xbal-Erkennungsstelle sind von EcoRI-Erkennungsstellen eingefaßt, so daß das Fragment, das den Tryptophan-Promoter-Operator und die Xbal-Erkennungsstelle enthält, zum Zwecke des Einfügens in andere Struktur gene enthaltende Plasmide entfernt werden kann.

Andererseits können heterologe Strukturgene entweder in die Xbal-Erkennungsstelle oder (nach teilweiser EcoRI-Verdauung) in die EcoRI-Erkennungsstelle distal von der Tryptophan-Kontrollregion eingefügt werden, in jedem Fall mit dem Ziel, die Strukturgene der Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operator-Systems zu unterwerfen.

Das Plasmid pHGH20? wird EcoRI-verdaut und das den trp-Promoter enthaltende EcoRI-Fragment.23 (Fig. 8) wird durch PAGE, gefolgt von Elektroeluierung wiedergewonnen .

Das Plasmid pBRH1 wird EcoRI-verdaut und die geschnittenen Enden mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) behandelt (1 /ig, in 50 mM Tris pH8 und 10 mM MgCl₂, 30 Minuten lang bei 65⁰C), um die Phosphatgruppen an den überstehenden EcoRI-Enden zu entfernen. Der Überschuß an bakterieller alkalischer Phosphatase wird durch Phenol extrakt ion, Chloroformextraktion und Äthanolfällung entfernt. Die resultierende lineare

w> V * -

- 46 - -— *'

311H05

DNA 7a (Fig. 8) wird, da an ihren überstehenden Enden Phosphate fehlen, bei einer Verknüpfung nur Insertionen annehmen, deren komplementäre überstehende Enden phosphoryliert sind und wird nicht in sich selbst rezirkularisieren, wodurch das Aussieben nach Plasmiden, die die Insertion tragen, erleichtert wird. Das von pHGH207 abgeleitete EcoRI-Fragment und die vom Plasmid pBRH1 erhaltene lineare DNA werden in Anwesenheit von T^- Ligase, wie bereits beschrieben, vermischt und verknüpft. Mit einem Teil der so erhaltenen Mischung wird der Stamm E.coli 294, wie bereits beschrieben, transformiert, auf LB-Medium, enthaltend 5 /ig/ml Tetracyclin, plattiert, und es werden zwölf Tetracyclin-resistente Kolonien selektiert. Aus jeder Kolonie wird das Plasmid isoliert und auf die Anwesenheit einer DNA-Insertion durch Restriktionsendonuklease-Analyse unter Verwendung von EcoRI und Xbal überprüft. Ein Plasmid, das die Insertion enthielt, wurde pHKY1 genannt.

IV. Herstellen eines Plasmids, das das Tryptophan-Operon enthält, fähig zur Expression eines spezifisch spaltbaren Fusionsproteine, das aus sechs Aminosäuren des trp-Leader-Peptids, dem letzten Drittel des trpE-Polypeptids (genannt IE') sowie einem heterologen Strukturgen-Produkt besteht.

Die Strategie für das Herstellen eines Plasmids, das ein LE'-Fusionsprotein exprimiert, beinhaltet folgende Schritte:

a) Bereitstellen eines Genfragments, das aus Codons für die distale Region des EE'-Polypeptids be-

311H05

steht und überstehende Enden einer BgIII-Erkennungsstelle am 5'-Ende und einer EcoRI-Erkennungsstelle am 3'-Ende des codierenden Strangs aufweist;

b) Eliminieren der Codons von der distalen Region des LE'-Genfragments und derjenigen für die trpD-Gene aus dem Plasmid Som7A2 und Inserieren des in Stufe 1 gebildeten Fragments, wodurch, die LE'-Codonsequenz unmittelbar stromaufwärts von der für das heterologe Gen für Somatostatin codierenden Codonsequenz wiederhergestellt wird.

Fig. 9a zeigt die Hindlll-Verdauung des Plasmids pSom7A2, gefolgt von einer λ-Exonuklease-Verdauung (einer 5' —> 3'-Exonuklease) unter Bedingungen, die so gewählt werden, daß jenseits der BgIII-Restriktionserkennungsstelle innerhalb der LE¹ codierenden Region verdaut wird. 20 /ig des Hindlll-verdauten pSom7Ä2 werden in Puffer gelöst (20 mM Glycinpuffer pH 9*6, 1 mM MgCIo, 1 mM ß-Mercaptoäthanol). Das erhaltene Gemisch wird mit 5 Einheiten λ.-Exonuklease 60 Minuten lang bei Raumtemperatur behandelt. Die so erhaltene Reaktionsmischung wird dann Phenol-extrahiert, Chloroform-extrahiert und mit Äthanol gefällt.

Um letztlich einen EcoRI-Rest am distalen Ende des LE'Genfragments herzustellen, wird mittels der bewährten Phosphotriester-Methode (R. Crea et al., Proc Fat ¹I Acad Sei USA 75, 5765 (1978)) ein Primer ^J pCCTGTGCATGAT synthetisiert und an ein Einzelstrangende des LE'-Genfragments hybridisiert, das durch A-Exonuklease-Verdauung erhalten wurde. Die Hybridisierung wird im folgenden beschrieben.

20 /ig des λ,-Exonuklease behandelten Hxndlll-Verdauungsprodukts des Plasmids pSom7zl2 wird in 20 yul H₂O gelöst und mit 6/il einer Lösung vereint, die etwa 80 Picomole der 5'-phosphorylierten Oligonukleotide, wie oben beschrieben, enthält. Das synthetische Fragment wird an das 3'-Ende der LE¹ codierenden Sequenz hybridisiert, und der verbleibende Einzel strangteil des IiE'-Fragments wird durch das Klenow-Polymerase-I-Verfahren, wie oben beschrieben, aufgefüllt, wobei dATP, dTTP, dGTP und dCTP verwendet werden.

Die Eeaktionsmischung wird auf 50⁰G erhitzt und langsam auf 10°C abgekühlt, wonach 4jal Klenow-Enzym zugegeben werden. Nach 15 minütiger Inkubation bei Eaumtemperatur, gefolgt von 30 minütiger Inkubation bei 37⁰C, wird die Eeaktion durch Zugabe von 5 /al 0,25 molarem EDTA gestoppt. Die Eeaktionsmischung wird Phenol-extrahiert, ChIorοform-extrahiert und mit Äthanol gefällt. Anschließend wird die DNA mit dem Eestriktionsenzym BgIII geschnitten. Die Fragmente werden durch PAGE getrennt. Ein aus dem Gel erhaltenes Autoradiogramm zeigt ein ^J P-markiertes Fragment der erwarteten Länge von annähernd 470 Bp , das durch Elektroeluierung rückgewonnen wird. Wie bereits hervorgehoben, hat das Fragment LE¹(d) ein BgIII- und ein stumpfes Ende, das mit dem Anfang des Primers übereinstimmt.

Das Plasmid pThoei, das oben im Abschnitt I. (C) beschrieben wurde, enthält ein Strukturgen für Thymosino6i, das an seinem 5'-Ende des codierenden Strangs in eine EcoEI-Erkennungsstelle und an seinem 3'-Ende in eine BamHI-Erkennungsstelle geclont ist. Wie in Fig. 9b gezeigt, enthält das Gen für Thymosin eine zusätzliche Bglll-Erkennungsstelle.

3 11H05

Das Plasmid pThcti enthält weiterhin ein Gen für Atnpicillin-Resistenz. Um ein Plasxnid herzustellen, das in der Lage ist, das, wie oben geschildert, hergestellte LE¹(d)-Fragment aufzunehmen, wird das Plasmid pThoci mit EcoRI verdaut, gefolgt von einer Klenow-Polymerase-I-Reaktion mit dTTP und dATP, um die EcoRI-Reste stumpfendig zu machen. Durch Bglll-Verdauung des so erhaltenen Produkts wird ein lineares DNA-Fragment 33 (Fig. 9b) hergestellt, das die Gene für Ampicillin-Resistenz und, jeweils an den entgegengesetzten Enden, einen überstehenden Bglll-Rest und ein stumpfes Ende enthält. Das so erhaltene Produkt kann durch Reaktion mit dem LE' (d)-!Fragment, das ein überstehendes Bglll-Ende und ein stumpfes Ende enthält, in der Gegenwart von T^-Ligase rezirkularisiert werden, um das Plasmid pTrp24 (Fig. 9b) zu bilden. Während dieses Vorgangs wird eine EcoRI-Erkennungsstelle an der Position wiederhergestellt, wo die Verknüpfung ' der stumpfen Enden erfolgte.

Im weiteren Verlauf wird, wie in Fig. 10 gezeigt, nacheinander das Plasmid pTrp24- mit BgIII und EcoRI verdaut, danach PAGE behandelt und elektroeluiert, wodurch ein Fragment entsteht, das die Codons für das LE'(d)-Polypeptid mit einem überstehenden Bglll-Ende und einem überstehenden EcoRI-Ende, angrenzend an seinen 3'Terminus des codierenden Strangs aufweist. Das LE¹(d)-Fragment 38 (Fig. 10) kann in die BgIII-Erkennungsstelle des Plasmids pSom7-a2 geclont werden, um ein LE'-Polypeptid/Somatostatin-Fusionsprotein zu bilden, das unter der Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operators exprimiert wird, wie in Fig. 10 gezeigt. Ein solches Verfahren erfordert erstens eine partielle EcoRI-Verdauung des Plasmids pSom742, um die EcoRI-Erkennungsstelle distal vom Tryptophan-Promoter-

Operator zu schneiden, wie in Fig. 10 gezeigt, und zweitens eine korrekte Wahl der Primer-Sequenz (Fig. 9)> um den korrekten Codon-Leseraster zu erhalten und eine EcoRI-Schneidestelle wiederherzustellen.

Dazu werden 16/ig des Plasmids pSom742 in 200 /al Puffer, bestehend aus 20 mM Tris, pH 7,5, 5 mM MgCl₂, 0,02 % NP40 Detergens, 100 mM NaCl verdünnt und mit 0,5 Einheiten EcoRI behandelt. Nach 15 minütiger Behandlungszeit "bei 57⁰C wird die Eeaktionsmischung Phenol-extrahiert, Chloroform-extrahiert und mit Äthanol gefällt und anschließend mit BIgII verdaut, das größere, so erhaltene Fragment 36 (Fig. 10) wird durch die PAGE-Behandlung isoliert, gefolgt von Elektroeluierung. Dieses Fragment enthält die Codons IE¹(p) für das proximale Ende des LE■-Polypeptide, d.h., diejenigen Codons, die stromaufwärts von der BgIII-Erkennungsstelle liegen. Das Fragment 36 (Fig. 10) wird als nächstes an das Fragment 38 (Fig. 10) in Anwesenheit von T^-Ligase verknüpft, um das Plasmid pSom7Ä244 zu bilden, das, nach Transformation in den Stamm E.coli 294-» wie bereits beschrieben, wirksam unter die Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operators ein Fusionsprotein produziert, das aus dem vollständig rekonstituierten IE'-Polypeptid und Somatostatin besteht. Das Fusionsprotein, von dem das Somatostatin dank der Anwesenheit eines Methionins am 5'-Ende der Somatostatinsequenz spezifisch gespalten werden kann, wird durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese, wie bereits beschrieben, segregiert. Das Fusionsprotein-Produkt stellt die am deutlichsten sichtbare Bande; in der .. Spalte 6 der Fig. 11 dar, wie im Detail im noch folgenden Abschnitt VI beschrieben werden wird.

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V. Herstellen eines Expressionssystems für trp-LE^r-Polypeptid-Fusionsprodukte, wobei die Tetracyclin-Resistenz unter der Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operators steht.

Die Strategie für das Herstellen eines Expressionsvektors, der in der Lage ist, eine große Anzahl verschiedener heterologer Gene für Polypeptide als trp-IE¹-Fusionsproteine unter der Kontrolle des Tryptophan-Operons zu exprimieren, erfordert die Konstruktion eines Plasmids, das die folgenden Charakteristika aufweist:

1. eine Tetracyclin-Resistenz, die im Falle des Herausschneidens des Promoter-Operator-Systems, das die Gene für diese Resistenz kontrolliert, verlorengehen würde.

2. Durch Wieder einfüg en des Promoter-Operator-Systems, das die Tetracyclin-Resistenz kontrolliert, und Rezirkularisieren durch dessen Verknüpfen mit einem heterologen Gen sowie einem Tryptophan-Promoter-Operator-System in richtiger Lesephase wird Tetracyclin-Resistenz wieder hergestellt und entsprechend die Identifizierung von Plasmiden, die den heterologen Geneinschluß enthalten, ermöglicht.

In Kürze gesagt und in Übereinstimmung mit der Natur der beabsichtigten Insertionen, soll ein lineares Stück DNA hergestellt werden, das einen Pst-Rest an seinem 3'-Ende und einen BIgII-Rest an seinem 5'-Ende aufweist, die an ein Gen angrenzen, das fähig ist, Tetracyclin-Resistenz zu spezifizieren, wenn es unter die Kontrolle eines Promoter-Operator-Systems gebracht wird.

~⁵²~ **" 311U05

Dazu wird, wie in I¹Xg. 12 dargestellt, das Plasmid pBR322 mit Hindlll verdaut und das überstehende Hindlll-Ende daraufhin mit S1-Nuklease verdaut. Die S1-Nuklease-Verdauung besteht aus der Behandlung von 10 /ig eines Hindlll-geschnittenen Plasmids pBR322 in 30/il S1-Puffer (0,3 M NaCl, 1 mM ZnCl₂, 25 mM Natriumacetat, pH 4,5) mit 300 Einheiten S1-Nuklease 30 Minuten lang bei 15⁰C. Die Reaktion wird durch Zugeben von 1 /il von 30 X S1-Nuklease-Stoplösung (0,8 M Tris,·. - 50 mM EDTA) gestoppt. Die Mischung wird Fhenol-extrahiert, Chloroform-extrahiert und mit Äthanol gefällt, dann EcoRI-verdaut, wie bereits beschrieben, und das große Fragment 46 (Fig. 12) durch PAGE-Behandlung erhalten, worauf eine Elektroeluierung folgt. Das erhaltene Fragment hat ein erstes überstehendes EcoRI-Ende und ein zweites stumpfes Ende, dessen codierender Strang mit dem Nukleotid Thymidin beginnt. Vie im folgenden gezeigt wird, kann der S1-verdaute Hindlll-Rest, der mit Thymidin beginnt, mit einem Klenow-Polymerase-I-behandelten BgIII-Rest verbunden werden, so daß nach der Verknüpfung die Bglll-Restriktionserkennungsstelle wieder hergestellt ist.

Das Plasmid pSom742, das im obigen Abschnitt I vorbereitet wurde, wird Bglll-verdaut und die so entstandenen überstehenden Bglll-Enden mit dem Klenow-Polymerase-I-Verfahren doppelsträngig gemacht, wobei alle vier Desoxynukleotidtriphosphate verwendet werden. Das EcoR!-Schneiden des resultierenden Produkts, gefolgt durch PAGE und Elektroeluierung des kleinen Fragments 42 (Fig. 13),stellt ein lineares Stück DNA zur Verfügung, das den Tryptophan-Promoter-Operator

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311U05

und Codons der proximalen Sequenz des IiE'-Proteins stromaufwärts der Bglll-Erkennungsstelle (LE¹(p)) enthält. Das DNA-Stück hat ein EcoRI-Ende und ein stumpfes Ende als Ergebnis des Auffüllens der Bglll-Erkennungsstelle. Die Bglll-Erkennungsstelle kann jedoch durch Anknüpfen des stumpfen Endes des Fragments 42 (Fig. 13) an das stumpfe Ende des Fragments 46 (Fig. 13) wieder hergestellt werden. Dazu werden die beiden Fragmente in Anwesenheit von T^-DNA-Ligase verknüpft, um das rezirkularisierte Plasmid pHKYIO (siehe Fig. 12) zu bilden, das durch Transformation in kompetente Zellen des Stammes E.coli 294 vermehrt wird. Tetracyclinresistente Zellen, die das rekombinante Plasmid pHKYIO tragen, werden gezüchtet, die Plasmid-DNA extrahiert und nacheinander mit BgIII und Pst verdaut, daraufhin durch das PAGE-Verfahren isoliert und das große Fragment elektroeluiert, das als lineares Stück DHA vorliegt und überstehende Pst- und BgIII-Enden aufweist. Dieses DNA-Fragment 49 (Fig. 13) enthält den Origin (die Anfangsstelle) der Replikation und hat sich infolgedessen als erster Bestandteil bei der Konstruktion eines Plasmids als nützlich erwiesen, bei dem sowohl die Gene, die für das trp-LE'Polypeptid-Fusionsprotein codieren, als auch die Tetracyclin-Resistenz-Gene durch den trp-Promoter-Operator kontrolliert werden.

Das Plasmid pSom?4 2A4, das auf die in Abschnitt IV beschriebene Weise hergestellt werden kann, kann so manipuliert werden, daß es als zweite Komponente des Systems dient, das in der Lage sein soll, eine große Anzahl verschiedener heterologer Strukturgene aufzunehmen. Wie in Fig. 13 gezeigt, wird das Plasmid einer Teil-EcoRI-Verdauung unterworfen (siehe Abschnitt IV gefolgt von einer Pst-Verdauung. Das so erhaltene

fragment 51 (Fig. 12) enthält den trp-Promoter-Operator und wird durch das PAGE-Verfahren isoliert, gefolgt von Elektroeluierung. Die Teil-EcoRI-Verdauung ist nötig, um ein Fragment zu erhalten, das unmittelbar anschließend an das 5'-Ende des Somatostatingens geschnitten wird, jedoch nicht an der EcoEI-Erkennungsstelle geschnitten wird, die zwischen dem Gen für Ampicillin-Resistenz und dem trρ-Promoter-Operator liegt. Die durch den Pstl-Schnitt im Gen für Ampicillin-Resistenz verlorengegangene Ampicillin-Eesistenz kann durch Verknüpfung mit Fragment 51 (Fig. 12) wieder hergestellt werden.

In einer ersten Ausführungsform kann der dritte Bestandteil, ein Struktur gen für ThymosinOci durch EcoRI- und BamHI-Verdauung des Plasmids pThotf erhalten werden. Das so hergestellte Fragment 52 (Fig. 12) wird durch PAGE gereinigt und elektroeluiert.

Die drei Genfragmente 49, 51 und 52 können nun, wie in Fig. i2 dargestellt, in richtiger Orientierung miteinander verknüpft werden, um das Plasraid pThccTAlM zu bilden, das aufgrund der Wiederherstellung der Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz selektiert werden kann. Wenn mit diesem Plasmid der Stamm E.coli transformiert wird und der Stamm unter Bedingungen gezüchtet wird, wie sie im Abschnitt I beschrieben wurden, wird ein trp-LE'-Polypeptid-Fusionsprotein exprimiert, von dem Thymosincd durch Bromcyan-Behandlung spezifisch gespalten werden kann. Wenn andere heterologe Strukturgene, die EcoRI- und BamHI-Enden aufweisen, auf ähnliche Weise mit von pHKXIO und pSom7/ü2A4 abgeleiteten Bestandteilen verknüpft werden, können ähnlich wirksame trp-IE'-Polypeptid-

Fusionsproteine erhalten werden, die jeweils diejenigen Polypeptide enthalten, für welche die heterologen Gene codieren. Fig. 11 zeigt eine SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese-Trennung des totalen zellulären Proteins von E.coli 294·-Transformanten, wobei die dunkelsten Banden in jedem Fall das Fusionsprotein repräsentieren, das unter der Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operator-Systems produziert wurde. Die Spalte 1 in Fig. 11 ist eine Kontrolle, die das vollständige zelluläre Protein des Stammes E.coli 29VpBR322 enthält. Die Spalte 2 enthält das Somatostatin-Fusionsprodukt des Plastnids pSom7A2/il4, dessen Herstellung in Abschnitt IV beschrieben wurde. Spalte 3 ist das Somatostatin-enthaltende Expressionsprodukt des Plasmids pSom7A1-A4-. Spalte 4· enthält das Expressionsprodukt des Plasmids pThoc7Ä1A4, wohingegen Spalte 5 das Produkt enthält, das durch ein Plasmid exprimiert wird, das erhalten wird, wenn die pHKYIO-abgeleiteten und ρ3οτη7Δ2Δ4~abgeleiteten Fragmente, wie oben erörtert, mit einem EcoRI/BamHI-terminierten Struturgen verknüpft werden, das für menschliches Proinsulin codiert, das teilweise bei der Anmelderin hergestellt wurde. Die Spalten 6 bzw. enthalten, als dunkelste Banden, ein trp-IE'-Polypeptid-Fusionsprotein, von dem in dem einen Fall die B-Kette und in dem anderen Fall die Α-Kette des menschlichen Insulins gespalten werden kann. Die B- und A-Strukturgene des Insulins werden durch EcoEI- und BamHC-Verdauung des Plasmids pIB1 bzw. pIA11 erhalten, deren Herstellung bei D.V. Goeddel et al-, Proc Fat ¹I Acad Sei USA 76, 106 (1979), beschrieben ist. Die Spalte 8 enthält Größenmarker, wie bereits beschrieben.

311H05

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist unter Verwendung von E.coli beschrieben. Es können jedoch wahlweise andere Enterobacteriaceen als Wirtszellen für die Expression und als Quelle für die trp-Operons dienen, von denen beispielsweise Salmonella typhimurium und Serratia marcesans zu erwähnen sind. Somit ist die Erfindung nicht auf die geschilderten Ausführungsbeispiele beschränkt.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren neu zu konstruierenden Plasmide sind neue, in ihrer Struktur eindeutig definierbare chemische Substanzen.

Leerseite

Claims

311H05

PAT E N TA N Wy* tJ,E

'„AT

H. KINKELDEY

OR-INU

W. STOCKMAIR

DH ING

K. SCHUMANN

DR BfR NAT · DIPL-PHYS.

P. H. JAKOB

G.BEZOLD

8 MÜNCHEN 22 43

23. März 1981 P 15'964-602/ks

GEHENOiECH, IFC.

4-60 Point San Bruno Blvd.

South San Irancisco, CA. 94080 / USA

Bakterielle Expression von Polypeptiden

unter Verwendung eines
Tryptophan-Promoter-Operator-Systems

Patentansprüche

1. Verfahren zum Herstellen eines Polypeptid-Prodükts durch die Expression in Bakterien eines für dieses codierenden Gens, dadurch gekennzeichnet

daß

a) eine bakterielle Kultur geschaffen wird, die mit einem sich replizierenden, von einem Plasmid abgeleiteten Expressionsvektor transformiert wurde,
welcher eine Sequenz doppelsträngiger DNA enthält, die in Phase von einem ersten 5'-Ende bis zu einem zweiten 3'-Ende ihres codierenden Strangs die folgenden Elemente aufweist:

TELEFON (OBB) 33 28 02

TELEX Ο6-2Ο38Ο

TELEGRAMME MONAPAT

TELEKOPIERER

(i) ein bakterielles trp-Promoter-Operator-System,

(ii) Nucleotide, die für eine Ribosomen-Bindestelle für die Translation des Elements (iv) codieren,

(iii) Nukleotide, die für ein Translations-Startsignal für die Translation des Elements (iv) codieren, und

(iv) ein Strukturgen, das für die Aminosäuresequenz eines heterologen Polypeptids codiert,

wobei die genannte Sequenz weder irgendeine trp-Attenuierungs-Fähigkeit noch Nukleotide aufweist, die für die trpE-Kibosomen-Bindestelle codieren;

b) die transformierte Bakterienkultur in ein Fermentationsgefäß überführt und diese Kultur bis zu einer vorgegebenen Dichte in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet wird, welches zusätzliches Tryptophan enthält, und zwar in ausreichender Menge, um das genannte Promoter-Operator-System zu reprimierenj und

c) daß den genannten Bakterien das zusätzliche Tryptophan entzogen wird, um das genannte System zu dereprimieren und die Expression des Produkts, für welches das genannte Strukturgen,codiert, anlaufen zu lassen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das durch das genannte Strükturgen exprimierte Polypeptid vollständig heterolog ist.

311UOb

3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das exprimierte Polypeptid ein !"usionsprotein ist, das ein heterologes Polypeptid und mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz eines homologen Polypeptide aufweist.

4. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet , daß der genannte Teil ein Teil der Aminosäuresequenz eines Enzyms ist, das am Biosyntheseweg von der Chorisminsäure zum Tryptophan beteiligt ist,

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß das heterologe Polypeptid ein bioaktives Polypeptid und das angefügte homologe Polypeptid ein spezifisch spaltbares bioinaktivierendes Polypeptid ist.

6. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet , daß das homologe Polypeptid das trpE-Polypeptid ist und die genannte Eibosomen-Bindestelle diejenige für das trp-Leader-Polypeptid ist.

7· Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet , daß das homologe Polypeptid das trpD-Polypeptid ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß das Fusionsprotein ein heterologes und ein homologes Polypeptid enthält, wobei das

homologe Polypeptid selbst eine Fusion darstellt, und zwar aus etwa den ersten sechs Aminosäuren des trp-Leader-Polypeptids und der Aminosäuresequenz, die durch mindestens etwa dem distalen Drittel des trpE-Polypeptidgens codiert wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der Tryptophan-Entzug dadurch bewirkt wird, daß die Zugabe des zusätzlichen Tryptophane beendet und das Fermentationsmedium, in dem die Bakterienkultur zuerst gewachsen ist, verdünnt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9> dadurch g e k e η η zeichnet, daß das Virtsbakteriura E.coli ist.

11. Ein von einem Plasmid abgeleiteter Expressionsvektor zum Herstellen eines heterologen Polypeptid-Produkts in E.coli-Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor eine Sequenz doppelsträngiger MA enthält, die in Phase von einem ersten 5'-Ende bis zu einem zweiten 3'-Ende ihres codierenden Strangs die folgenden Elemente aufweist:

a) ein bakterielles trp-Promoter-Operator-System;

b) Hukleotide, die für eine Ribosomen-Bindestelle für die Translation des Elements (iv) codieren;

c) Nukleotide, die für ein Translations-Startsignal für die Translation des Elements (iv) codieren; und

1140b

d) ein Strukturgen, das für die Aminosäuresequenz eines heterologen Polypeptids codiert,

wobei die genannte Sequenz weder irgendeine trp-Attenuierungs-Fähigkeit noch Nukleotide aufweist, die für die trpE-Ribosomen-Bindestelle codieren.

12. Vektor nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , daß das durch das genannte Strukturgen exprimierte Polypeptid vollständig heterolog ist.

13. Vektor nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , daß das exprimierte Polypeptid ein Fusionsprotein ist, das ein heterologes Polypeptid und mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz eines homologen Polypeptide aufweist.

Vektor nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , daß der genannte Teil ein Teil der Aminosäuresequenz eines Enzyms ist, das am Biosyntheseweg von der Chorisminsäure zum Tryptophan beteiligt ist.

15· Vektor nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , daß das heterologe Polypeptid ein bioaktives Polypeptid und das angefügte homologe Polypeptid ein spezifisch spaltbares bioinaktivierendes Polypeptid ist.

-S-

16. Vektor nach Anspruch 13, dadurch. gekennzeichnet , daß das homologe Polypeptid das trpE-Polypeptid ist und die genannte Ribosomen-Bindestelle diejenige für das trp-Leader-Polypeptid ist.

17. Vektor nach Anspruch 131 dadurch gekennzeichnet , daß das homologe Polypeptid das trpD-Polypeptid ist.

18. Vektor nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet , daß das Fusionsprotein ein heterologes und ein homologes Polypeptid enthält, wobei das homologe Polypeptid selbst eine Fusion darstellt, und zwar aus etwa den ersten sechs Aminosäuren des trp-Le ader-Po Iypeptids und der Aminosäuresequenz, die durch mindestens etwa dem distalen Drittel des trpE-Polypeptidgens codiert wird.

19. Plasmid pBRHtrp.

20. Plasmid pSom72\2.

21. Plasmid pHGH207-

22. Plasmid pHKY1

23. Plasmid pSom7A2A4.

24. Plasmid

25· Verfahren zur Schaffung eines Expressionsplasmids für die Expression eines heterologen Gens, dadurch gekennzeichnet , daß in Phase die folgenden Elemente gleichzeitig verknüpft werden:

a) ein erstes lineares doppelsträngiges DNA-Fragment, das ein Eeplikon enthält und ein Gen, das eine selektierbare Eigenschaft exprimiert, wenn es unter die Steuerung eines bakteriellen Promoters gestellt wird, wobei das Fragment keinen derartigen Promoter aufweist;

b) ein zweites lineares doppe1strängiges DNA-Fragment, das das genannte heterologe Gen aufweist; und

c) ein drittes doppelsträngiges DNA-Fragment, das einen bakteriellen Promoter aufweist,

wobei die verknüpfbaren Enden der genannten Fragmente so gestaltet sind, daß nach dem Verknüpfen zum Bilden eines sich replizierenden Plasmids sowohl das Gen für die selektierbare Eigenschaft als auch das heterologe Gen unter die Steuerung des Promoters kommen, wodurch die Verwendung der selektierbaren Eigenschaft bei der Selektion von transformierten Bakterienkolonien möglich ist, welche zur Expression der heterologen Gene fähig sind.

26. Verfahren nach Anspruch 25» dadurch gekennzeichnet , daß die selektierbare Eigenschaft eine Antibiotikumresistenz ist.

O I I I 4U0

27· Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet , daß die selektierbare Eigenschaft Tetracyclin-Resistenz ist und der bakterielle Promoter der trp-Promoter ist.

28. Verfahren nach Anspruch 27» dadurch gekennzeichnet , daß die Verknüpfung ebenso ein Operon für die Expression von Ampicillin-Resistenz wiederherstellt.

29· Verfahren zum Schneiden doppelsträngiger DMA, dadurch gekennzeichnet , daß zum Schneiden an jeder beliebigen Stelle

a) die doppelsträngige DEA in einem die zu schneidende Stelle umgebenden Bereich in einzelsträngige DNA umgewandelt wird;

b) an die in Schritt a) gebildete EinzelStrangregion ein komplementäres Primerstück von einzelsträngiger DNA hybridisiert wird, wobei das 5'-Ende des Primers gegenüber demjenigen Nukleotid liegt, das an die beabsichtigte Schnittstelle angrenzt;

c) derjenige Teil des zweiten, in Schritt a) eliminierten Strangs wiederhergestellt wird, der in 3'-Eichtung des Primers liegt, und zwar durch eine Reaktion mit DNA-Polymerase in Anwesenheit von Adenin-, Thymin-, Guanin- und Cytosin-enthaltenden Desoxynukleotidtriphosphaten; und

d) das verbleibende DNA-Einzelstrangstück, das über

die beabsichtigte Schnittstelle vorsteht, verdaut wird.

30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet , daß die Schritte c) und d) gleichzeitig durchgeführt werden, durch Reaktion mit einer DNA-Polymerase, die in 5¹ —> 3 ·-!Richtung polymerisiert, die Exonukleasewirkung in 3¹ —l· 5'-Bichtung aufweist, jedoch keine Nukleasewirkung in 5' —^ 3' — Richtung zeigt.

31- Verfahren nach Anspruch 3O₅ dadurch gekennzeichnet , daß die Polymerase die Klenow~ Polymerase I ist.

32. Plasmid pTha.742.

33· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das heterologe Polypeptid ein wiedergewinnbares Polypeptid ist, das aus einer Gruppe von Polypeptiden ausgewählt wird, die menschliches Wachstumshormon, menschliches Proinsulin, Somatostatin, Thymosin oei, die Α-Kette des menschlichen Insulins sowie die B-Kette des menschlichen Insulins enthält.

34-. Vektor nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , daß das heterologe Polypeptid ein wiedergewinnbares Polypeptid ist, das aus einer Gruppe von Polypeptiden ausgewählt wird, die menschliches Wachstumshormon, menschliches Proinsulin, Somatostatin, Thymosin oc1, die Α-Kette des menschlichen Insulins sowie die B-Kette des menschlichen Insulins enthält.