CS238646B2 - Fission method of two-fibre dna at any point - Google Patents

Description

Nástup technologie využívající řeko robino váné kyseliny desoxyribonukleové' (= = DNA) umožnil kontrolovanou bakteriální produkci enormní řady užitečných polypeptidů. V současné době jsou již к dispozici bakterie modifikované touto technologií, které umožňují výrobu takových polypeptidických produktů, jako jsou somatostatin (viz K. Itakura a spolupracovníci, Science 198, 1056 /1977/, komponenty А а В řetězců lidského insulinu (viz D. V. Goeddel a spolupracovníci, Proč. Naťl. Acad. Sci., USA 76, 106 /1979/J a lidský růstový hormon (viz D. V. Goeddel a spolupracovníci, Nátuře 281, 544 /1979/]. Nověji bylo rekombinačních DNA technologií použito к bakteriální produkci thymosinu alfa 1, imunopotenciační substance produkované thynem (publikovaná přihláška evropského patentu č. 0035454).

Význam této technologie je tak velký, že bakteriálně lze skutečně vyrábět každý potřebný polypeptid, přičemž je v dosahu kontrolovaná výroba hormonů, enzymů, protilátek a vakcin proti nejrůznějším onemocněním. Citované publikace, ve kterých jsou podrobněji popsány shora uvedené typické příklady bakteriální výroby polypeptidů, jsou na tomto místě uváděny, stejně tak, jako další níže uvedené publikace, za účelem bližšího objasnění podstaty vynálezu.

Výkonným útvarem rekombinační DNA technologie je plasmid, chromosomů prostá smyčka dvouvláknové DNA nalezená v bakteriích, často v mnohonásobných kopiích v jedné bakteriální buňce. V informaci zakódované v plasmidické DNA jest včleněna informace potřebná lk reprodukci plasmidu do dceřinné buňky (tzv. „replikón“) a obvykle jedna nebo více selekčních charakteristik, jako je rezistence vůči antibiotikům, které umožňují, že klony hostitelské buňky obsahující plasmid, který je předmětem našeho zájmu, mohou být rozpoznány, selektivně vybrány a přednostně pěstovány v selektivním růstovém prostředí.

Užitečnost bakteriálních plasmidů spočívá ve skutečnosti, že je lze specificky štěpit jednou nebo druhou restrikční endonukleázou, neboli „restrikčním enzymem“, přičemž každá z těchto endonukleáz rozpoznává na plasmidické DNA odlišné místo. Po rozštěpení lze vpravit do plasmidu heterologické geny nebo fragmenty genů buď přímým připojením v místě rozštěpení, nebo připojením na rekonstruovaných koncích sousedících s místem rozštěpení. Pod pojmem „heterologický“ používaným v popisu vynálezu se rozumí gen, který se obvykle nenachází v bakteriích E. coli, nebo polypeptidická sekvence, ikterá není těmito bakteriemi obvykle produkována, zatímco pojem „homologický“ se vztahuje na gen nebo polypeptid, který je produkován divoce rostoucím typem bakterií E. coli. Rekombinace DNA se provádí vně bakterií, ale vzniklý „rekombinovaný“ plasmid lze zavěsti do bakterií postupem známým jako transformace a kultivací zís kaného transformantu lze připravit velká množství rekombinovanéiho plasmidu obsahujícího heterologický gen. Kromě toho, podle toho kam se gen vhodně zavede vzhledem ik částem plasmidu, které řídí transkripci („přepis“) a translaci („překlad“) zakódovaných DNA informací, lze získaný vylučovací prostředek použít к aktuální produkci polypeptidické sekvence, pro kterou je vestavěný gen kódován; tento postup se v popisu vynálezu označuje jako vylučování (exprese).

Exprese je iniciována v oblasti známé jako promotor, která se vyznačuje tím, že je místem připojení RNA-polymerázy. V některých případech, jako v níže diskutovaném případu tryptofánového (trp) operónu, jsou oblasti promotoru překryty oblastmi „operátoru“ a vytváří se kombinovaný promotor-operátor. Operátory jsou sekvence DNA, které lze rozpoznat přítomností tak zvaných represorových proteinů, které slouží к regulování frekvence iniciace transkripce u specifického promotoru. Polymerasa se pohybuje podél řetězce DNA, transkribuje informace obsažené v kódovacím vláknu DNA z jeiho 5‘ místa na 3‘ konec informační kyseliny ribonukleové (m-RNA) a tyto informace ihned překládá do polypeptidické sekvence, která má takové pořadí aminokyselin, které je v DNA zakódované. Každá aminokyselina je zakódována jediným tripletem nukleotidů, neboli „kodónem“, pro který je v popisu vynálezu používán termín „strukturální gen“ a označuje tu část DNA, ve které je zakódována sekvence aminokyselin vyloučeného peptidického produktu. Poté, co se RNA-polymeráza naiváže na promotor, transkribuje nejprve nukleotidy kódováním na ribozómové vazebné místo, pak dojde к iniciaci translace neboli к signálu ,,start“ (obyčejně kodónem ATG, který se ve vzniklé informační RNA stane AUG) a poté к translaci nukleotidických kodónů do samostatného strukturálního genu. Na konec strukturálního genu se transkribují tak zvané stop-kodóny a polymeráza může poté vytvářet další sekvenci informační RNA, která vzhledem к přítomnosti stop-signálu zůstává nepřenesena do ribozómů. Ribozómy se naváží na vazebné místo připravené na informační RNA, v bakteriích obvykle poté, co se mRNA vytvoří, a samy produkují polypeptidy podle zakódované sekvence, počínaje start signálem translace a konče zmíněným stop signálem. Žádaný produkt se tvoří jen tehdy, když jsou sekvence kódující vazebné místo ribozómů umístěny správně vzhledem к AUG iniciačnímu kodónu a když všechny zbývající kodóny následují za iniciačním kodónem ve fázi. Vzniklý produkt lze získat lýzou hostitelské buňky a jeho oddělením od ostatních bílkovin vihodnou čistící metodou.

Polypoptidy získané expresí za použití rekombinační DNA technologie mohou být zcela heterologické, jako v případě přímého vylučování lidského růstového hormonu, nebo se alternativně mohou skládat z heterologického polypeptidů, na který je navázána [fúzována] alespoň část aminokyselinové sekvence homologického peptidů, jako v případě přípravy meziproduktů pro somatostin a složek lidského insulinu. V posléze uvedeném případu obsahuje například homologlcký peptid navázanou část aminokyselinové sekvence pro betagalaktosidázu. V takovýchto případech je žádaný bioaktivní produkt biologicky inaktivován navázaným homologickým polypeptidem do té doby, dokud není posléze uvedený peptid odštěpen působením extracelulárních prostředků. Fúzované bílkoviny, jako· ty, které byly zmíněny výše, lze pokládat za prekursory žádaných bílkovin, které se z nich dají získat vysoce specifickým štěpením, jako například působením bromkyanu obsahují-li methionin, nebo alternativně enzymatickým štěpením; viz například britský patent 2 ·007 676

A.

Má-li rekombinační DNA technologie splnit očekávané naděje, musí se nalézti systémy, které optimalisují expresi vložených genů a umožňují získávat žádané polypeptidické produkty ve vysokých výtěžcích. Beta-laktamázové a laktozové promotor-operátorové systémy, kterých se v minulosti nejběžněji používalo, poněvadž byly užitečné, nevyužívaly plně kapacitu technologie z hlediska výtěžků. Bylo· třeba nalézti prostředek pro. bakteriální vylučování peptidů, který by umožňoval kontrolovatelnou expresi žádaných polypeptidických produktů ve vysokých výtěžcích.

Tryptofan je aminokyselina produkovaná bakteriemi a používaná jimi jako komponenta homologických polypeptidů. Biosynthesa probíhá následujícím způsobem: kyselina chorismová -- kyselina antranilová - kyselina fosforibosylantranilová · CDRP [ enol-1- (o-karboxyfenylamino )-l-desoxy-D-ribulosa-5-fos'fát ] -* indol-3-glycerolfOsfát a posléze samotný tryptofan. Enzymatické reakce teto· biosyntézy jsou katalysovány produkty tryptofánovébo operónu, což je polycitrónový úsek DNA, který je transkri-bován pod řízením trp-promotorového-operátorového systému. Vzniklá polycistrónová informační RNA kóduje tak zvané hlavní tryptofanové sekvence a pak, v níže uvedeném pořadí, polypeptidy označované zde jako trp E> trp D, trp C, trp B a trp A. Tyto polypeptidy v různé míře katalysují a kontrolují individuální stupně biosyntesy tryptofanu z kyseliny chorismové.

V divokém typu bakterií E. coli je · tryptofánový operón pod vlivem alespoň tří různých forem regulačních kontrol. V případě represe promotoru-operát-oru působí sám tryptofan jako korepresor, váže se na svůj aporepresor a vytváří aktivní represorový komplex, který se ihned poté váže na operátor a ukončuje biosyntésu v jejím celku. Za druhé, mechanismem inhibice zpětné vazby, se tryptofan váže na komplex trp E a trp D polypeptidů a zamezuje tím jejich účast na biosyntése. Posléze se provádí regulace mechanismem známým jako útlumový faktor, pod kontrolou „útlumové •oblasti“ genu, oblasti, která je uvnitř hlavní trp-sekvence. Viz obecně G. F. Miozzari a spolupracovníci v časopise J. Bacteriology 133, 1457 (1978); monografie „The Opeřen“, str. 263 až 302, vydavatelé Miller a Reznikoff, Cold Spring Harbor Laboratory (1978); F. Lee a spolupracovníci, Proč. Nati. Acad. Sci USA 74, 4365 (1977); a K. Bertrand a spolupracovníci, J. Mol. Biol. 103, 319 (1976). Zdá se, že stupeň útlumu je ovládán intracelulární koncentrací tryptofanu, a u divokého typu bakterií E. coli ukončuje útlumový článek expresi přibližně v devíti z deseti případů, pravděpodobně vytvářením sekundární struktury neboli „terminační smyčky“ v informační RNA, což má za následek, že se R^/^--3(^ll^im^i^,áza předčasně vyprostí z připojení k DNA.

Jiní pracovníci použili trp operón za účelem, aby získali nějaké měřítko pro· expresi heterologických peptidů. Tento pracovní směr se pokouší řešit problémy represe a útlumu přidáváním kyseliny indolylakrylové, induktoru a analogu, který soutěží s tryptofanem o trp represory v molekule, a směřuje k vyvolání deprese pomocí kompetitivní inhibice. Induktor zmenšuje současně útlum inhibicí enzymatické konverse indolu na tryptofan a tak účinně zbavuje buňky tryptofanu. Výsledkem je, že více polymeráz úspěšně transkribuje přes útlumový článek. Tento přístup se však zdá problematický z hlediska důsledného dokončení translace a provedení ve vysokém výtěžku, neboť syntéza za bílkovinové sekvence obsahující tryptofan se předběžně ukončí v důsledku nedostatku využitelného tryptofanu. Účinné snížení útlumu při tomto přístupu jest ovšem úplně závislé· na silném tryptofánovém hladovění.

Vynález se věnuje problémům spojeným s represí a útlumem biosyntézy tryptofanu odlišným způsobem. Předmětem vynálezu je

1. způsob získávání plasmidických vylučovacích prostředků určených pro přímou expresi heterologických genů z trp promotoru—operátoru;

2. způsoby získávání plasmidických vylučovacích prostředků určených pro expresi, z tryptofánového •operátoru-promotoru, specificky štěpitelných polypeptidů kódovaných fúzemi homologických a heterologických genů, a

3. způsob výroby heterologických polyppetidů bakteriální expresí, vyznačující se tím, že ho lze provádět kontrolovatelně, účinně a ve vysokých výtěžcích, a způsob výroby potřebných prostředků.

Podle vynálezu lze připravovat nové plasmidické vylučovací prostředky určené pro bakteriální výrobu heterologických polypeptidických produktů, přičemž zmíněné plasmidické prostředky mají sekvenci dvojvlák238646

Μ nové DNA zahrnující, ve fázi od prvého· 5‘-konce k druhému 3‘-konci kódovacího řetězce, trp-promotor-operátor, nukleotidy kódující na hlavní trp vazebné místo ribozómů a nukleotidy kódující iniciaci translace pro expresi strukturálního genu, ve kterém je zakódovaná aminokyselinová sekvence heterologického polypeptidu. Uvedená DNA sekvence neobsahuje ani trp útlumovou oblast, ani nukleotidy kódující na trp E ribozómové vazebné místo. Místo toho je trp hlavní ribozómové místo, účinně využito k tomu, aby vykonávalo expresi informací zakódovaných ve vloženém genu.

Buňiky se transformují přidáním plasmidů připravených způsobem podle vynálezu a obsahujících trp promotor-operátor, kterým však chybí útlumový článek, a kultivují se v přítomnosti záměrně přidaného tryptofanu. Použití živného , prostředí bohatého na tryptofan umožňuje, aby dostatek tryptofanu v podstatě úplně potlačil interakce trp promotor-operátoru s trp-represorem, takže růst buněk může postupovat bez inhibice předčasným vylučováním velkých množství heterologických polypeptidů zakódovaných ve vloženém genu, jinak pod kontrolou trp promotorového-operátorového systému. Když se rekombinovaná kultura vypěstuje na úroveň vhodnou pro průmyslovou produkci polypeptidu, vnější zdroj tryptofanu se naopak odstraní a buňky se nechají odkázány pouze na tryptofan, který mohou samy produkovat. Výsledkem je slabé omezení tryptofanu, v důsledku toho. je potlačena biosyntéza a dojde k vysoce účinnému vylučování vloženého iheterologického genu, nebráněné útlumem, protože útlumová oblast je ze systému vypuštěna. Tímto způsobem nejsou buňky nikdy příliš zbaveny tryptofanu a všechny bílkoviny, ať -obsahují tryptofan nebo ne, mohou být produkovány ve vysokých výtěžcích.

Vynález rovněž zahrnuje způsoby dvojvláknové DNA vhodnými prostředky v kterémkoliv žádaném místě, dokonce i v nepřítomnosti restrikčního enzymového místa; uvedená pracovní technika je vhodná, mimo jiné, k sestrojení trp-operónů majících deletovaný útlumový článek, a to jiným způsobem než byly získávány dříve selekcí mutantů.

Předmětem vynálezu je tedy způsob štěpení -dvojvláknové DNA v kterémkoliv daném bodě, jehož podstata spočívá v tom, že

a) dvojvláknová DNA se převede v okolí obklopujícím daný bod na jednovláknovou DNA,

b) na jednovláknový úsek vytvořený ve stupni a) se hybridizuje komplementární délka jednovláknového DNA priméru, přičemž 5‘ konec priméru leží na · opačné straně nukleotidu připojeného k zamýšlenému štěpícímu místu,

c) obnoví se ta část druhého vlákna eliminovaného· ve stupni a), která leží v 3‘ směru · od uvedeného priméru, reakcí s DNA poymerázou v přítomnosti trifosfátů desoxynukleotldů obsahujících adenin, thymin, guanin a cytosin a

d) se zbývající jednovlaknová délka DNA, která vyčnívá za zamýšleným štěpícím místem.

Posléze vynález umožňuje výrobu různých užitečných meziproduktů a konečných produktů, včetně specificky štěpitelných heterologicky-homologlckých fúzovaných bílkovin, které jsou stabilizovány vůči odbourávání za podmínek vylučování.

Způsob podle vynálezu, jeho podstata a výhody jsou blíže objasněny v následujícím podrobném popisu a na přiložených výkresech na obr. 1 až 13.

Obr. 1 a 2 ilustrují výhodné schéma přípravy plasmidů schopných exprese heterologických genů ve formě fúzí s částí trp D polypeptidu; z těchto fúzovaných bílkovin je lze později specificky odštěpit.

Obr. 3 znázorňuje výsledek dělení buněčné bílkoviny · obsahující hoinologické [trp D‘j a heterologické (soinatostatin nebo thymosin a 1] fúzované bílkoviny, za použití elektroforézy na polyakrylamidovém gelu.

Obr. 4, 5· a -6 znázorňují postupné stupně výhodného schématu pro sestrojení plasmidu schopného přímého· vylučování heterologického genu (lidského růstovéiho hormonu -HGH-gen) za kontroly trp promotor ového-operátorového systému.

Obr. 7 znázorňuje výsledek dělení buněčné bílkoviny -obsahující lidský růstový hormon (HGH) přímo vylučovaný za kontroly trp-promotorového-operátorového systému, za použití elektroforézy -na polyakrylamidovém gelu.

Obr. 8, 9 (aažb)a 10 znázorňují postupné stupně výhodného schématu pro sestrojování plasmidů schopných vylučování heterologických genů (ve znázorněném případě somatostatinu j ve formě fúzí s částí trp E polypeptidu; z těchto fúzovaných bílkovin lze heterologické peptidy později specificky odštěpit. Na obr. 9a (a) znamená 5‘-» 3‘ digesci komplementárního vlákna LE‘ strukturálního genu lambda-exonunkleázou, (b) znamená připojení oligonukleotidu 26, 32pCCTGTGCATGAT na vzdálenější konec LE‘ kódujícího vlákna a (c) znamená Klenowovu polymerázu I (5‘- 3‘-polymeráza) + 4-4 dNTP (a 3‘ — 5‘ exonukleáza).

Obr. 11 znázorňuje výsledky dělení buněčné bílkoviny obsahující homologické (trp E) · a heterologické fúzované bílkoviny vhodné pro produkci například somatostatinu, thymosinu alfa 1, lidského proinsulinu A a B řetězců lidského insulinu, za použití elektroforézy na polyakrylamidovém gelu.

Obr. 12 a 13 znázorňují postupné stupně způsobu, při kterém plasmid vytvořený postupem znázorněným na obr. 8 až 10 včetně je zpracován tak, aby vytvořil systém, ve kterém se mohou zaměnitelně vylučovat jiné heterologické geny ve formě fúzí s polypeptidickými sekvencemi trp E peptidu.

Na uvedených obrázcích jsou z důvodu jasnosti ilustrace zobrazeny ve většině případů jen kódovací řetězce dvojvláknového plasmidu a lineárních DNA. Geny kódující resistenci vůči antibiotikům jsou označeny ap^R (resistence vůči ampicilinu] .a tc^K (resistence vůči tetracyklinu ]. Označení tc^s znamená gen pro tetracyklinovou resistenci, který není pod kontrolou promotorového-operátorového systému, takže plasmidy obsahující tento gen nemohou být nikdy citlivé na tetracyklin. . Legenda „ap^,s“ značí ampicilinovou citlivost vzniklati vynecháním části genu kódující ampicilinovou citli vost. Piasmidické promotory a operátory jsou označeny ,,p“ a „o“. Písmena A, T, G a C označují nukleotidy obsahující base adenin, thymin, guanin a popřípadě cytosin. Význam dalších legend uvedených v obrázcích bude vysvětlen v následujícím textu.

Výhodná provedení způsobu podle vynálezu popsaná níže zahrnují použití řady běžně dostupných restrlkčních endonukleáz identifikovaných v dalším popisu; jejich odpovídající rozpoznávací sekvence a vzory štěpení (místa štěpení jsou označena šipkami) jsou znázorněny níže:

Označení endonukleázy

Nukleotidové sekvence a místo štěpení

Označení endonukleázy

Nukleotidové sekvence a místo štěpení

Xbal

EcoRI

BglII

PvulI

BamHI

I TCTAGA AGATCT ^{4 Ť}

GAATTC

CTTAAG

Ť

AGATCT

TCTAGA ť

GAGCTG

GTCGAC

1

GGATCC

Taql

HindlII

Hpal

Pstl cctagg

4,

TCGA

AGCT

X t

AAgctt

TTCGAA t

GTTAAC

CAATTG ' 4

CTGCAG

GACGTC

Když jsou body štěpení prostorově umístěny odděleně na příslušných řetězcích, jsou rozštěpené konce „lepivé“ (zachytne), tj. schopné · opětovné anelace (uzavření kruhu) nebo schopné připojení na jiné komplementární DNA zakončené lepivým koncem, podle Watsonova-Crickova principu párování basí (A s T a G s C] na principu drážky a čepu.

Některé restrikční enzymy, jako· shora uvedený Hpal a PvuII štěpí řetězec DNA za vzniku „otupených“ konců. Shora uvedené nukleotidové sekvence jsou znázorněny v souhlase s běžnými konvencemi: vrchní řetězec je řetězec kódující bílkoviny a při postupu z leva do prava po zmíněném řetězci jde o· pohyb z jeho 5‘-konce na 3‘-konec, tj. ve směru transkripce od „bližšího“ ke „vzdálenějšímu“ bodu.

Posléze v souhlase s konvencemi, symbol „A“ značí deleci (vynechání určité sekvence). Tak například označení plasmidu „A EcoRI-Xbal“ popisuje plasmid, ze kterého byla odstraněna nukleotidická sekvence mezi místy působení restrikčních enzymů EcoRI a Xbal digescí těmito enzymy. Pro lepší názornost jsou některé delece označena čísly.

Tak například, počínaje prvním párem basí („bp“) rozpoznávacího místa .enzymu EcoRI, který předchází genu pro tetracyklinovou resistenci v rodičovském plasmidu pBR 322, značí „AI“ vynechání párů bp 1 až 30 (tj. Δ EcoRI až HindlII) a z toho vyplývající eliminaci tetracyklinového promotorového — operátorového systému; „A 2“ značí deleci bp 1 až 375 (tj. A EcoRI až BamHI) a z toho vyplývající odstranění jak tetracyklinového promotoru — operátoru, tak strukturálního genu, který kóduje tetracyklinovou resistenci; .a „A 3“ značí vynechání sledu bp 3 ·611 až 4 359 (tj. A Pstl až EccRI) a v důsledku toho eliminaci ampicilinové resistence. Symbolu „A4“ se používá k označení odstranění sekvence bp ~ 900 až ~ 1 500 z trp operónového fragmentu 5 (viz obr. 1) a v důsledku toho· eliminaci strukturálního genu pro polypeptid trp D.

Hlavní trp sekvence je vytvářena páry basí [bp) 1 až 162, počínaje od výchozího bodu pro· trp mRNA. Čtrnáct aminokyselin uvedeného hlavního trp polypeptidu je zakódováno páry bp 27 až 71, následujících za ATG nukleotidy, které kódují startovní signál pro translaci.

Oblast trp útlumového článku zahrnuje postupně GC-bohaté a AT-bohaté nukleotidové sekvence, ležící mezi bp 114 až 156, a útlum je zřejmě způsobován mRNA nukleotidy zakódovanými ipáry ~ 134 až 141 hlavní sekvence. Aby došlo k expresi heterologického polypeptidu za řízení trp hlavním ribozómovým vazebným místem a současně aby se zamezilo· útlumu, musí být sledována následující kritéria:

1. páry basí 134 až 141 nebo ještě následující imusí být vynechány;

2. ATG kodón vloženého genu musí být umístěn ve správné relaci vzhledem k ribozómovému vazebnému místu, jak je popsánoi v literatuře (viz například kapitolu J. A. Steitze „Genetické signály a nuleotidické sekvence v informační RNA“ v monografii „Biological Regulation and Control“ (vydavatel R. Goodberger), Plenum Press, N. Y. /1976/];

3. mají-li být produkovány homologicko-heterologické fúzované bílkoviny, - musí zůstat dostupný startovní signál pro· translaci homologické polypeptidické sekvence, a kodóny pro homologicko-u část fúzované bílkoviny musí být včleněny ve fázi, aniž by zasahovaly do stop-signálů pro translaci.

Tak například vynecháním všecih párů basí uvnitř hlavní sekvence, vzdálenějších od bp 70, se odstraní oblast útlumu, ponechá se ATG kodón, který kóduje startovní signál pro translaci a eliminuje se mezi nimi ležící stop-signál pro translaci kódovaný sekvencí TCA (bp 69 až 71], eliminací nukleotidu A a následujících nukleotidů. Vynechání takové sekvence má za následek expresi fúzovaných bílkovin začínajících hlavním polypeptidem a končících proteinem zakódovaným příslušnou heterologickou vložkou, a včetně vzdálenější oblasti jednoho· z polypeptidů za vedoucím trp-operónem, určeného rozsahem vynechání sekvence ve směru k 3‘-konci. Tak například vynechání zasahující do· E genu vede k expresi -homologického prekursoru . · obsahujícího sekvenci L a vzdálenější oblast sekvence E (za konečným bodem vynechané sekvence), fúzovaných se sekvencí kódovanou následující vložkou, a tak dále.

Dva zvláště vhodné plasmidy, ze kterých byla -odstraněna oblast útlumu, jsou plasmidy pGM 1 až pGM 3; viz publikaci G. F. Mozzariho a spolupracovníků v časopise J. Bacteriology 133, 1 457 (1978). Tyto plasmidy imají popřípadě delece trp Δ LE 1 413 a trp ALE 1417 a vylučují (za kontroly trp-prornotoru-operátoru) polypeptidy obsahující přibližně prvních šest aminokyselin hlavní trp sekvence a vzdálenější -oblasti polypeptidu E.

V nejvýhodnějším případě, u plasmidů pGM 1, je vylučována pouze asi poslední třetina polypeptidů E, zatímco plasmid pGM 3 vylučuje téměř celou vzdálenější polovinu kodónů polypeptidů E. Bakterie E. coli K-12, kmen W 3110 tna 2 trp- 102 obsahující plasmid -pGM 1 jsou uloženy v americké sbírce typových kultur (Američan Type Culture Collection) pod -označením ATCC číslo 31 622. Plasmid pGM 1 se může z uvedeného kmene odstranit obvyklým způsobem a lze ho pak používat v níže popsaných postupech.

Alternativně lze delece některých sekvencí provádět způsoby podle vynálezu, které umožňují specifické štěpení dvojvláknové DNA -na kterémkoliv žádaném místě. Jeden příklad této štěpící pracovní techniky je zřejmý z příkladu 4 uvedeného níže. Tak například se -dvojvláknová DNA rozdělí na jednotlivá vlákna DNA v -okolí -oblasti zamýšleného místa štěpení, například reakcí s lambda-exonukleázou.

K takto předem vytvořené jednovláknové části DNA se pak hybridizuje syntetický -nebo jiný Jednovláknový DNA primér, pomocí Watsonova-Crickova principu párování basí, přičemž sekvence priméru musí být účelně taková, aby zaručovala, že jeho 5‘-konec bude li^i^ot^j^^^iminální s nukleotidem na prvním vláknu DNA právě před určeným bodem štěpení.

Přiměř se pak prodlouží směrem k 3‘-konci reakcí s DNA polymerázou, a tak se znovu sestaví ta část původní dvouvláknové DNA, která je před určeným místem štěpení a která byla v prvním stupni ztracena. Současně nebo poté se část prvního vlákna DNA za určeným místem štěpení -odstraní digescí vhodným enzymem. Postup je shrnut graficky v následujícím schématu, ve kterém „v“ označuje určené místo štěpení DNA:

a) ..	13 v·	14 určené místo štěpení -řetězce -'DNA „--v“
b) ..	v	vytvoření jednovJáknové -DNA v -okolí „v“
c) ..	v	hybridizace příměru
d) ...	v	prodloužení priméru
e) ...	v·	digesce jednovláknové -DNA za místem štěpení „v“.

Při výhodném způsobu provedení se stupně d) a - e) znázorněného postupu provádějí současně, za použití polymerázy, která současně digeruje vyčnívající jednovláknový konec DNA ve směru 3‘ - 5‘ a prodlužuje primér ve -směru 5‘ - 3‘ (v přítomnosti -dATP, dGTP, dTTP a - dCTP).

Vhodným -materiálem pro uvedený účel je Klenewova polymeráza 1, tj. fragment -získaný proteolytickým štěpením -DNA polymeráty I, který vykazuje - 5‘ - 3‘ polymerisační účinnost a 3‘ -> 5‘ exonukleolyticikou aktivitu rodičovského - enzymu, ale kterému chybí její 5* -> 3' excinukleolytická účinnost; viz -A. Kornberg v monografii „DNA Synthesis“, str. - ®8, W. H Freeman and Co., ’SFO (1974).

Za použití právě popsaného postupu -lze provádět delece útlumové oblasti z plasmidu obsahujícím trp-operón, po jeho předchozí linearizaci, například štěpením - v- místě -žádané restrikce, položeném -níže -od bodu, ve .(kterém wá být molekula - zakončena otupeným koncem - (viz shora -uvedené - „v“). Opětovné uvedení plasmidu do kruhového tvaru následující po -odstranění útlumové oblasti lze uskutečnit například navázáním „tupého“ konce molekuly nebo jinými zjpůsoby, které jsou odborníkům známé.

Ačkoliv- způsob podle vynálezu zahrnuje přímé vylučování liieterotogických -polypeptidů na -řízení tip-proiuotorem-operáterem, týká se přednostní způsob jeho provedení vylučování fúzovaných bílkovin obsahuj í cích jak homo-toglcké, tak heter-ologické sekvence, přičemž posléze uvedené polypeptidy se s výhodou - dají odštěpit od prvých v e x-trac e 1u . lárníc - h p rostl e dcích.

Zvláště výhodnými jsou takové fúze bílkovin, ve kterých se ho urologická část skládá -z jedné nebo více aminokyselin z trp hlavního polypeptidu -a asi z jedné třetiny nebo více trp E aminokyselinové ‘sekvence (ze vzdálenějšího konce). Takto získané fúzované bílkoviny se jeví podstatně stálejší vůči degradaci - za podmínek exprese.

^lB<alkterií E. coli K-12, kmene W 3110 tna 2“ trp“ A102 - (pGM’1), ATCC číslo- 31622. lze používat k rozšiřování kmenů plasmidu pGMl, kterých se podle vynálezu s výhodou používá к sestrojování trp promotorových-operátorových systémů zbavených útlumo vé oblasti. Tento .kmen je v- přítomnosti anthranilátu fenotypicky trp+ a lze ho pěstovat na minimální živné půdě, jako například na půdě -LB doplněné 50 -^g/ml anthranilátu.

Všechny bakteriální kmeny používané při expresi řízené - trp promotorem-operátorem podle -vynálezu jsou trp represory+ („trp R+“ J jako- v- případě - divokého typu ‘bakterií

E. coli, čímž je zajištěna represe až -do doby zamýšleného heterologického vylučování.

Při výhodném způsobu provedení se rekombinace DNA provádí v bakteriích E. coli K-12, kmenu 294 .(zakončení A, thi, hrs~, hsm._k ⁺), ATCC číslo 34446, což je bakteriální kmen, jehož membránové charakteristiky usnadňují transformace. Plasmidy produkující hutě nelogické polypeptidy, vypěstované v kultuře kmene 294, se běžným způsobem extrahují a - uchovávají v prostředí vhodného roztoku (napr. v roztoku 10 mmol tris [ - lrisýhydгoxymethyl·jaminomethan) a 1 mmol EDTD ( — kyselina ethylendiamintelraoclovš), -pH 8] při -teplotě v rozmezí asi od — 20- -C do 4 °C. Na druhé - straně, -pro expresi peptidů za -průmyslových podmínek, se podle vynálezu dává přednost -odolnějšímu kmenu, tj. kmenu E. coli K—12 RV

308 -sIii, .g,al 3’08-, označenému ATCC číslem 3)1808. Kmen RV 308 je nutričně divokým typem, roste dobře na minimální -půdě a syntetizuje všechny nezbytné makromolekuly z běžných směsí -amonných, fosforečnaíwvých a horečnatých -solí, -stop kovů a glukosy. Po transformaci kultury -RV 30^!3 -plasmidem - odvozeným z kmene 294 sc kultura pěstuje na agávových deskách v -prostředí selektivním pro znak nesený plasrnidem f jako je například resistence vůči antibiotikům) a kolonie -transformantů -se vyberou a kultivující -v -baňkách. Alikvotní díly -posléze -uvedené bankové kultury v 1.0% -roztoku - dimethylsulfoxidu - (DMSO) nebo -glycerolu - (ve sterilních lékovkách) se rychle zmrazí v lázni z ethanolu a suchého ledu a -uchovávají se při —80 °C. Za účelem produkce zakódovaného heterologického polypeptidu .-se vzorky takto uložené kultury pěstují v prostředí obsahujícími tryptofan, čímž se potlačí trp-promotor-operátor, pak se systém zbaví přídatného tryptofanu a tím dojde k vylučování peptidu.

Pro první stupeň kultivace se dá použít například LB živného prostředí (viz J. H. Miller v monografii „Experimente in Molecular Genetics“, str. 433, Cold Spring Barbor Laboratory 19'7’2), které obsahuje na každý litr roztoku 10 g tryptonu, 5 g kvasiničného extraktu a 10 g chloridu sodného. Inokulant se s výhodou kultivuje do optické hustoty (dále označované zkratkou „o. d“) o hodnotě 10 nebo více (při 550 um), výhodněji do; o. d. 20 a nejvýhodněji do o. -d. 30 nebo více, nicméně na o. d. menší než má stacionární fáze.

Za účelem dereprese a exprese polypeptidických produktů se inokulant poté kultivuje za podmínek, které zbavují buňky přidaného tryptofanu. Jedno z vhodných živných prostředí ipro- tento druh kultivace je půda M9 (viz J. H. Miller, shora uvedená monografie, str. 431), připravená následujícím způsobem (uvedeno množství substancí na jeden litr roztoku):

dihydrogeinfosforečnan draselný 3g liydrogenfosforečnan sodný 6g chlorid sodný 0,5g chlorid amonný 1g

Roztok se autoklávuje a pak se přidá:

ml 0,01 M roztoku bezvodého chloridu vápenatého ml 1 M roztoku bezvodého síranu horečnatého10 ml 20% roztoku glukosy ftg/ml vitaminu Bj ^g/rnl kaseinového aminokyselinového hydrolyzátu.

Posléze uvedený aminokyselinový dodatek živné půdy je hydrolyzát -kaseinu prostý tryptofanu.

Aby se dosáhlo vylučování heterologického polypeptidu, zředí se inokulant vypěstovaný na živné půdě bohaté na tryptofan například větším objemem prostředí neobsahujícím další tryptofan (například 2 až lOnásobné zředění) a pěstuje se až do - dosažení žádané hladiny (výhodně - krátce po. stacionární fázi růstu); žádaný produkt se získá běžným způsobem lýzou, centrifugací a dalším čištěním. Ve fázi kultivace, při které se buňky zbavují tryptofanu, se buňky pěstují s výhodou do stupně o. d. vyšší než 10, ještě výhodněji do o. d. vyšší než 20 a nejvýhodněji do - o. d. 30, nebo vyšší (měřeno při 550 mm) a pak se isoluje žádaný produkt.

Všechny rekombinace DNA popsané v následujících příkladech byly provedeny v souhlase se směrnicemi Národních zdravotnických ústavů pro výzkum rekombinovaných DNA.

Příklad 1

Exprese bílkoviny fúzované s trp D polypeptidem

Výhodný způsob vylučování fúzovaných bílkovin obsahujících žádané polypeptidy a na ně navázanou část - aminokyselinové sekvence trp D polypeptidu, kterou lze oddělit in vitro- prostřednictvím aminokyseliny methiominu, specificky citlivé na štěpení bromkyanem, jest popsán ve vztahu k obr. 1 až 3.

A. Konstrukce plasmidu pBRHtrp

Plasmid pGMl (1 na obr. 1) nese tryptofánový operón E. coli mající vynechanou oblast ALE1413 (viz G. F. Miozzari. a spolupracovníci, časopis J. Bacteriology /1978/ 1457 až 1436) a proto vylučuje fúzovanou bílkovinu obsahující prvních 6 aminokyselin hlavní trp sekvence -a přibližně poslední třetinu trp E polypeptidu (dále označovanou jako LE‘) a rovněž trp D polypeptid ve svém celku, vše pod kontrolou promotor ového-operátorového systému. Plasmid (20 ,ug) se digeruje restrikčním enzymem PvulI, který štěpí plasmid na pěti místech. Fragmenty 2 genu se poté kombinují s EcoRI články (obsahujícími vlastní komplementární -oligonukleotid 3 o sekvenci -pCATGAATTCATG), čímž se umožní . zapojit EcoRI místo štěpení posléze uvedeného fragmentu a vytvořit plasmid obsahující -oblast EcoR I (20). Na 20 ,ug DNA-fragmentů 2 získaných z pGMl shora uvedeným způsobem se nechá působit 10 jednotek Ti DNA-ligázy -v přítomnosti 200 pmol syntetického 5‘ffosforylovanébo oligonukleotidu pCATGAATTCATG (3) a 20 <u1 Ti DNA ligázového pufru (20 mmol tris o pH 7,6, 0,5 mmol ATP, 10 mmol bezvodého chloridu horečnatého a 5 mmol dithiothreitolu) při teplotě 4 “C přes - noc. Roztok se pak 10 minut zahřívá na 70 °C, aby se přerušilo spojování. Získané konjugáty se poté rozštěpí digescí s restrikčním enzymem EcoRI -a fragmenty, obsahující nyní EcoRI konce, se -isolují za použití elektroforézy na 5% polyakryloamidovém gelu (tento postup je v dalším popisu označován jako „PAGE-elektroforéza“). Tři největší fragmenty se z gelu isolují, po předchozím obarvení ethidiumbromidem a určení jejich polohy v ultrafialovém světle, vyříznutím příslušných částí gelové vrstvy obsahujících žádané produkty. Každý vyříznutý fragment gelové vrstvy se umístí spolu s 300 <d 0,1 X TBE pufru do· dialyzační komory a podrobí se elektroforéze při 100 V po dobu 1 hodiny v 0,1 X TBE pufru (TBE pufr -obsahuje 10,8 g tris-base, 5,5 g kyseliny borité, 0,09 gramu N62EDTA v 1 litru vody). Vodný roztok z dialyzační komory se spojí, extrahuje se fenolem a chloroformem, pak se upraví chloridem sodným na 0,2 M roztok a žádaný fragment DNA se získá po vysrážení etha238646 πιοΙθπι ve vodném roztoku. (Všechny isolace DNA fragmentů popsané dále byly prováděny pomocí PAGE elektroforézy a následující elektroelucí právě uvedeným způsobem). Získaný gen obsahující trp-promotor-operátor a EcoR I „lepivé“ konce (5) byl identifikován dále popsaným postupem, který spočívá v zavedení zmíněných fragmentů do plasmidů 6 citlivého na tetracyklin, který se po uvedeném včlenění promotoru-operátoru stane resistentním vůči tetracyklinu.

B. Sestrojení plasmidů pBRHtrp vylučujícího rezistenci vůči tetracyklinu za kontroly trp promotoru-operátoru a identifikace a rozmnožení DNA fragmentu obsahujícího trp-promotor-operátor, který byl isolován shora popsaným způsobem (A).

Plasmid pBRHl 6 (viz R. I. Rodriguez a spolupracovníci v časopise Nucleic Acids Researcb 6, 3267 až 3287 /1978/) vylučuje rezistenci vůči ampicilinu a obsahuje gen pro rezistenci vůči tetracyklinu, který však, poněvadž není připojen na promotor, nevylučuje posléze zmíněnou rezistenci. Plasmid je proto citlivý vůči tetracyklinu. Zavedením promotorového-operátorového systému přítomného v EcoRI oblasti se plasmid může stát rezistentním vůči tetracyklinu.

Plasmid pBRH'1 se digeruje restrikčním enzymem EcoRI, enzym se odstraní fenolovou extrakcí a následující extrakcí chloroformem a po vysrážení ethanolem se DNA získá ve vodném prostředí. Vzniklá molekula DNA 7 se pomocí Ti DNA ligázy váže shora popsaným způsobem, v oddělených reakčních směsích, s každým ze tří jednotlivých DNA fragmentu, získaných postupem uvedeným výše v části A. Rekombinovaná DNA přítomná v reakční směsi se použije к transformaci příslušných bakterií E. coli K-Í2, kmene 294, popsaných K. Backmanem a spolupracovníky v časopisu Proč. Nať 1. Ас-ad. Sci USA 73, 4174 až 4198 /1976/ a označených ATC-C číslem 31448, standardní pracovní technikou; bakterie se naočkují -na misky s agarem s minimální LB půdou obsahující 20 ^.g/ml ampicilinu a 5 ^g/ml tetracyklinu. Vyrostlé tetracyklin-rezistentní kolonie se vyberou, plasmidická DNA se vyizoluje a přítomnost žádaného fragmentu se potvrdí restrikční enzymatickou analysou. Získaný plasmid 8, označený pBRHtrp, vylučuje β-laktamázu, která mu uděluje rezistenci vůči ampicilinu, a obsahuje fragment DNA zahrnující trp-promotor-operátor a kódující první bílkovinu složenou z prvních šesti aminokyselin hlavní trp sekvence fúzovaných s přibližně poslední třetinou trp E polypeptidu (tato část polypeptidu je označena LE‘), a druhou bílkovinu odpovídající přibližně první polovině trp D polypeptidu (tato část polypeptidu je označena D‘), a třetí bílkovinu kódovanou pro tetr-acyklinovou rezistenci genu.

C. Začlenění genů pro různé konečné polypeptidické produkty a vylučování posléze uvedených produktů ve formě fúzovaných bílkovin složených z konečného polypeptidu a specificky odštěpitelného trp D polypeptidického prekurzoru (obr. 2).

Z plaismidu pBRHtrp se získá fragment DNA obsahující trp promotor-operátor a kodóny pro LE‘ a D‘ polypeptidy, který se vloží do plasmidů obsahujícího strukturální geny pro tvorbu různých žádaných polypeptidu, jak je dále ukázáno na příkladu somatostatinu (viz obr. 2).

Plasmid pBRHtrp se digeruje restrikčním enzymem EcoRI a získaný fragment 5 se izoluje za použití PAGE elektroforézy a elektroeluce. Produkt 10, získaný EcoRI digesci plasmidů pSom 11 9 (viz K. Itakura a spolupracovníci v časopisu Science 198, 1056 /1977/); britský patent 2 097 676 A), se kombinuje s fragmentem 5. Na směs se působí Ϊ4 DNA ligázou, jak bylo popsáno výše, a získanou DNA se transformují shora uvedeným způsobem bakterie E. coli K-li2, kmene 294. Selekce transformovaných bakterií se provede na agarových deskách obsahujících ampicilin. Získané, vůči ampicilinu rezistentní kolonie se hybridizují sloupcovou pracovní technikou (viz M. Gruenstein a spolupracovníci v časopise Proč. Nať 1. Acad. Sci. USA 72, 3951 až 3965 /1975/), za použití vzorku fragmentu 5 obsahujícího trp-pro.motor-operátor, isolovaného z pBRHtrp, který byl radioaktivně značen fosforem P⁵². Provede se selekce kolonií, které jsou pozitivní při sloupcové hybridizaci, plasmidická DNA se izoluje a umístění vložených fragmentů se stanoví restrikční analysou za použití restrikční-ch enzymů BglII a BamHI při dvojité digesci. Bakterie E. coli 294 obsahující plasmid označený pSOM7 Δ2 11, který obsahuje trp-promotorový-operátoroivý fragment v žádané orientaci, se kultivují v živné půdě LB obsahující 10 ^g/ml ampicilinu. Buňky se pěstují do dosažení hustoty o. d. 1 (při 5-510 inm), pak se odcentrifugují a suspendují se znovu v desetinásobném zředění do živné půdy M9. Buňky se kultivují 2 až 3 hodiny, opět do· optické hustoty 1, pak se lizu jí a celková buněčná bílkovina se analysuje za použití elektroforézy na PAGE, obsahujícím 15 % SDS-močoviny (SDS = dodecylsulfát sodný) (viz J. V. Maizel a spolupracovníci v časopise Meth. Viral 5, 180 až 246 /1971/].

Na obr. 3 je znázorněna gelová analýza bílkovin, při které byla celková bílkovina získaná z různých kultur rozdělena na jednotlivé složky. Hustota jednotlivých pásů je měřítkem množství, ve kterém jsou jednotlivé bílkoviny přítomny. Na uvedeném obrázku představují -dráhy 1 a 7 kontrolní vzorky zahrnující různé bílkoviny s předem stanovenou polohou, které slouží jako body pro srovnávání. Dráhy 2 a 3 znázorňují dělení celulární bílkoviny získané z kolonií E. coli 294 transformovaných plasmidem pSom.7A2, kultivovaných jednak na živné půdě LB (dráha 2], jednak na půdě M9 (dráha 3). Dráhy 4 a · 5 znázorňují dělení celulární bílkoviny získané z .analogických •buněk E. coli 294 transformovaných plasmidem pTh!cei7 Δ2, tj. plasmidem vylučujícím thimosin; uvedený plasmid se získá v podstatě stejnými postupy jak již bylo· popsáno výše, počínaje plasmidem pThdl (viz publikovaná přihláška evropského patentu č. 0935'454). Dráha 4 znázorňuje dělení buněčné bílkoviny získané z bakterií E. coli 294/pTha? Δ2 kultivovaných na LB půdě, a dráha 5 znázorňuje dělení buněčné bílkoviny získané ze stejného transformanta kultivovaného na půdě M9. Dráha 6 je další kontrola a znázorňuje rozdělení rodičovské bílkoviny z bakterií E. coli 294/pBR322, pěstovaných na LB půdě.

Ze srovnání s kontrolami vyplývá, že nejhorejší ze dvou největších párů v každé z drah 3 a 5 patří předpokládaným polohám bílkovin vylučovaných ve formě fúzovaného proteinu skládajícího se z D‘-polypeptidu a sOímatostatinu, popřípadě thymosinu (další hlavní pásy představují LE‘ polypeptid vznikající vynecháním útlumové oblasti). Obr. 3 potvrzuje, že exprese je v živné půdě bohaté na tryptofan potlačena, ale naopak uvolněna za podmínek s nedostatkem tryptofanu v půdě.

D. Štěpení bílkovin bromkyanem a radioimunostanovení hormonálního produktu

V obou případech, jak u bílkoviny obsahující thymosiin, tak u bílkoviny obsahující somatostatin, byla celková buněčná bílkovina rozštěpena bromkyanem, rozštěpený produkt isolován a · po . vysušení suspendován v pufru a analysován radioimunometodou; bylo potvrzeno, že získané produkty jsou imunologicky . identické se · samostativem, popřípadě thymosmem. Štěpení bromkyanem je popsáno D. V. Goeddelem a spolupracovníky v časopise Proc.Naťl. Acad. Sci. USA 76, str. 106 až 110 /1979/).

Příklad 2

Konstrukce plasmidů pro přímé vylučování heter-oloigických genů za kontroly trp-promotoro^ť^J^io-^i^I^ť^irátorového systému

Pro strategii přímého vylučování je nezbytné sestavit plasmid .obsahující jediné restrikční místo' vzdálené od všech kontrolních prvků trp operónu, do· kterého mohou být začleněny heterologioké geny místo hlavní trp sekvence a ve vhodné prostorové relaci k ribozómovému vazebnému místu pro hlavní trp polypeptid. Přístup k dosažení · přímého vylučování heterologických peptidů jest v dalším popsán na příkladu vylučování lidského růstového hormonu.

Plasmid pSoim7 Δ2 (10 ^g) se rozštěpí restrikčním enzymem EcoRi a DNA fragment 5, obsahující tryptofanové genetické prvky, se isoluje pomocí PAGE elektroforézy a elektroeluce. Získaný fragment (2 ^g) se digeruje 10 minut při 37 C° dvěma jednotkani restrikční endonukleázy Taq I tak, aby se v každé molekule rozštěpilo v průměru pouze jedno z přibližně pěti Taq I restrikčních míst. Získaná směs částečně rozštěpených fragmentů se rozdělí PAGE elektroi?orézou a fragment 12 (viz obr. 4), který obsahuje přibližně 300 párů basí, jeden EcoR I konec a jeden Taq I konec, se isoluje elektroelucí. Příslušné Taq I restrikční konec, se isoluje elektroelucí. Příslušné Taq I restrikční místo jest umístěno mezi místy pro start transkripce a pro start translace a je o 5 nukleotidů vzdálené od ATG kodónu hlavního trp peptidu. DNA sekvence okolo tohoto místa je znázorněna na obr. 4. Uvedeným postupem lze isolovat fragment obsahující všechny kontrolní prvky trp operónu, tj. promotorový-operátorový systém, signál pro iniciaci transkripce a trn hlavní ribosomové vazebné místo.

Zbytek Taq I na konci 3‘ získaného fragmentu, sousedící se signálem pro start translace pro hlavní trp sekvenci, se poté převede do Xba I místa plasmidu pHSaz s vynechanou sekvencí EcoR I — Xba I, způsobem znázorněným na obr. 5. Tato operace se provede navázáním fragmentu 12, získaného shora uvedeným postupem, na plasmid obsahující jediné (to znamená jen jedno) EcoR I a jediné Xba I restrikční místo. Pro tento účel lze použít v podstatě jakéhokoliv plasmidu obsahujícího, v následujícím pořadí, replikón, selektivní znak, jako rezistenci vůči antibiotikům, a EcoRI, Xbal a BamHI restrikční místa. Tak například lze Xbal restrikční místo zavést mezi EcoRI a BamHI místa plasmidu pBR3'22 (viz F. Bolivar se spolupracovníky v časopisu Gene 2, 95 až 119 /1977//), například rozštěpením plasmidu v jeho jediném Hind Ш resti^ikč’ ním místě pomocí enzymu Hind Ш, následující · digescí vzniklých „lepivých“ konců specifickou jednovláknovou nukleázou a navázáním „tupých“ konců samoanelujícího dvouvláknového syntetického nukleotidu obsahujícího žádané rozpoznávací místo, jako sekvenci CCTCTAGAGG. Alternativně lze použít DNA fragmentů získaných z přirozených .plasmidů, jak je tomu v dále popsaném případě, které obsahují jediné Xbal restrikční místo mezi EcoRI a BamHI štěpnými zbytky. Tak například digescí virového genómu hepatitidy B enzymy EcoRI a BamHI se obvyklým způsobem získá produkt, který se začlení do EcoRI a BaimHI restrikčních míst plasmidu pGH6 (viz D. V. Goeddel a spolupracovníci v časopisu Nátuře 281, 544 /197'9/) za vzniku plasmidu pHS32. Získaný plasmid pHS3,2 se rozštěpí enzymem Xbal, směs se extrahuje fenolem, pak se extrahuje chloroformem a soli se vysráží ethanolem. Na rozštěpený plasmid se působí 1 ^1 E. coli polymerázy I, Klenowovým fragmentem v prostředí 30 μΐ polymerázového pufru (tj. 50 mmol fosforečnanu draselného o pH 7,4, 7 mmol chloridu horečnatého bezv. a 1 mmol /l-merkaptoethanolu) obsahujícího 0,1 mmol dTTP a 0,1 mmol dCTP, po dobu 30 minut při 0 °C a pak 2 hodin při 37°C. Při teto reakci se doplní dva ze 4 nukleotidů, komplementárních к 5‘ vyčnívajícímu ikono i Xbal štěpícímu místu:

5‘ CTAGA— 5‘ CTAGA—

3‘ T— 3‘ TCT—

Inkorporují se dva nukleotidy, d-C a dT, a vznikne konec se dvěma 5‘ vyčnívajícími nukleotidy. Tento lineární zbytek plasmidu pHS32 (isolovaný po extrakci fenolem, extrakci chloroformem a vysrážení ethanolem ve vodném prostředí) se štěpí restrikčním enzymem EcoRI. Velký plasmidický fragment 13 se oddělí od menšího EcoRI — — Xbal fragmentu PAGE elektroforézou a isoluje se elektroelucí. Tento DNA-fragment plasmidu pHS'32 (isolovaný po extrakci fenolem, extrakci chloroformem a vysrážení ethanolem ve vodném prostředí) se štěpí restrikčním enzymem EcoRI. Velký plasmidický fragment 13 se oddělí od menšího EcoRI — Xbal fragmentu PAGE elektroforézou a isoluje se elektroelucí. Tento DNA-fragment plasmidu pHS3'2 (0,2 ^g) se naváže, za podmínek podobných těm, které byly popsány výše, na shora uvedeným způsobem získaný EcoRI — Taql fragment tryptofánového. operónu 12 (- 0,01 ^g), jak je znázorněna na obr. 5. Při tomto postupu se Taql vyčnívající konec naváže na Xbal zbývající vyčnívající konec, i když jeho base nejsou kompletně spárovány podle Watsonova a Crickova principu:

—T CTAGA— —TCTAGA—

4—AGC TCT— —AGCTCT—

Částí takto získané reakční směsi ligantů se transformují buňky bakterií E. coli 294 stejným způsobem, jak bylo popsáno výše v příkladu 1, pak se na kulturu působí teplem a přeočkuje se na agarové desky s LB půdou obsahující ampicilin. Selekcí se získá 24 kolonií rezistentních vůči ampicilinu, které se kultivují ve 3 ml LB půdy a plasmid se isoluje. Šest z těchto plasmidů má Xbal místo, regenerované cestou bakteriemi E. coli katalysovaným přepárováním a replikací DNA:

-TCTAGA— -TCTAGA— —AGATCT— —AGCTCT—

Bylo rovněž nalezeno, že se tyto plasmidy štěpí jak restrikčním enzymem EcoRI, tak Hpal, a poskytují očekávané štěpné fragmenty. Jednoho z těchto plasmidů 14, označeného pTrp 14, lze použít pro vylučování heterologických polypeptidu, jak je popsáno dále.

Plasmid pITGH 107 (18 na obr. 0; viz publikaci D. V. Goeddela a spolupracovníků v časopisu Nátuře 281, 544 /1979/) obsahuje gen pro lidský růstový hormon, složený z 2 3 amino к ys e line vý c h к o dó nů p rod ukovaných ze synthetických DNA fragmentů, a ze 163 aminokyselinových kodónů získaných z komplementární DNA vytvořené cestou reverzní transkripce informační RNA pro lidský růstový hormon. Tento gen 21, i když mu schází kodóny předcházející sekvence („pre“sekvence) lidského růstového hormonu, obsahuje ATG kodón pro iniciaci translace. Gen se isoluje z 10 plasmidu pHDH 107 nejprve působením restrikčního enzymu EcoRI a poté připojením dTTP a dATP na získaný fragment působením Klenowovy E. coli polymerázy I, jak bylo již popsáno výše (viz obr. 6). Vzniklý plasmid se extrahuje fenolem, pak chloroformem a soli se vysráží ethanolem a poté se rozštěpí enzymem BamHI (viz obr. 6). Vzniklý fragment 21, obsahující gen pro lidský růstový hormon („HGH“) se isoluje PAGE elektroforézou a následující elektroelucí. Výsledný DNA-fragment obsahuje rovněž prvních 350 nukleotidů strukturálního genu pro rezistenci vůči tetracyklinu, ale chybí mu tetracyklin-ový promotorový-operátorový systém, takže, když se v následujícím postupu začlení do plasmidu, který je schopný exprese, lze plasmidy obsahující tuto vložku určit podle obnovení tetracyklinové rezistence. Protože EcoRI zakončení fragmentu 21 je doplněno postupem za použití Klenowovy polymerázy I, má zmíněný fragment jeden „tupý“ a jeden „lepivý“ konec, což mu zajišťuje správnou orientaci, když je později včleněn do plasmidu schopného exprese; viz obr. 6.

V dalším se upraví plasmid pTrp 14 schopný exprese tak, aby mohl přijmout shora uvedeným způsobem připravený fragment 21 obsahující HGH-gen. Plasmid pTrp 14 se za tím účelem digeruje enzymem Xbal .a získané „lepivé“ konce fragmentu doplní za použití postupu s Klenowovou polymerázou I a trifosfátů dATP, dTTP, dGTP a dCTP. Po. extrakci reakční směsi fenolem, extrakci chloroformem .a vysrážení ethanolem se na získanou DNA 16 působí enzymem BamHI a vzniklý velký fragment plasmidu 17 se isoluje PAGE elektroforézou a elektroelucí. Uvedený fragment 17 odvozený od pTrp 14 má jeden „tupý“ .a jeden „lepivý“ konec, které mu zajišťují správnou orientaci při rekombinaci s fragmentem 21 obsahujícím HGH gen a popsaným výše.

Fragment 21 obsahující HGH gen a fragment 17 pT^]pl4 A Xba-BamHI se zkombinují a navzájem naváží za podmínek podobných těm, které byly popsány výše. Doplněné Xbal a EcoRI konce se naváží spolu s tupými konci za obnovení obou Xbal a EcoRI štěpících míst:

—TCTAG —AGATC

AATTCTATG— +

TTAAGATAC—

T|CTAG|A4TTCTATG —

AGATcÍtTAaUtAC —

Xbal

EcoRI

Xbal doplněný konec

EcoRI doplněný konec iniciace

HGH gemu

Touto konstrukcí se rovněž obnoví rezistence genu vůči tetracyklinu. Jelikož plasmid pHGH 107 vylučuje tetracy klínovou rezistenci z promotoru ležícího dále od HGH genu (lac promotor), umožňuje výsledná konstrukce plasmidu 22, označená jako pHGH 207, vylučování genu pro tetracykliinov-ou rezistenci za kontroly tryptofánového pro-motoru-operátoru. Směsí llgandů, produktů rekombinace, se transformují bakterie E. coli 294 a provede se selekce rezistentních kolonií na agarových deskách s LB půdou obsahující 5 ^g/ml tetracyklinu.

Aby se potvrdilo přímé vylučování lidského· růstového· hormonu plasmidem pHGH 207, byla celková buněčná bílkovina, která byla získána z bakterií E. coli 294/pHGH 207, které byly kultivovány do optické hustoty 1 na LB půdě obsahující 10 ^g/ml ampicilinu, zředěny 1 : 10 do M9 půdy a kultivovány opět do· o. ·d. 1, podrobena SDS-gelové elektroforéze jako· ve shora uvedeném příkladu 1, a získaná data srovnána s analogickými výsledky elektroforézy lidského růstového hormonu, získaného· již dříve expresí postupem podle jiných autorů (D. V. Goeddel se spolupracovníky, časopis Nátuře 281, 544 /1979;/).

Na obr. 7 je uvedena fotografie získané, obarvené gelové vrstvy po PAGE elektroforéze: Dráhy 1 a 7 · obsahují standardy bílkovin o· různých známých polohách na eleiktrogramu. Dráha 2 je kontrola, a znázorňuje rozdělení celkové buněčné bílkoviny z bakterií E. coli, kmene 294 pBR322; dráha 3 znázorňuje rozdělení bílkovin z bakterií E. coli 294/pHGH 107, kultivovaných na LB půdě; dráha 4 ukazuje dělení bílkovin z bakterií E. coli 294/pHGH 107 kultivovaných na M9 půdě; dráha 5 znázorňuje dělení bílkovin z bakterií E. coli 294/pHGH 207 pěstovaných na LB půdě; a dráha 6 znázorňuje rozdělení bílkovin z bakterií E. coli 294/pHGH 207 kultivovaných na M9 půdě.

Hustý pás v dráze 6 je lidský růstový hormon, jak je zřejmé ze srovnání s podobnými pásy v drahách 2 až 4. Jak je podle vynálezu předpokládáno, produkují mikroorganismy E.coli 2i14/pHGH 207 při kultivaci na LB půdě bohaté na tryptofan méně lidského růstového hormonu z · důvodu interakcí tryptofanového represoru s trp operátorem, a při kultivaci na M9 půdě produkují podstatně více zmíněného· HGH než bakterie E. coli 294/pHGH 107 vzhledem k indukci silnějšího tryptofánového promotorového-operátorového systému vůči lac-promotorovému-operátorovému systému v pHGH 107.

Příklad 3

Sestavení plasmidu s obecnou expresí pro· přímé vylučování heterologických genů pod kontrolou tryptofánového· promotoru-operátoru

Plasmid pHGH 207 sestrojený v předcházejícím příkladu 2, se v dalším použije k získání fragmentu DNA obsahujícího kontrolní prvky tryptofánového operónu (s vynechanou útlumovou oblastí) a ik sestrojení plasmidického „vylučovacího vektoru“ vhodného pro· přímou expresi genových vložek o různé struktuře.

Strategie pro sestavení plasmidu s obecnou expresí zahrnuje odstranění tryptofanové kontrolní oblasti z plasmidu pHGH 207 digescí restrikčním enzymem EcoRI a vsunutí získaného· fragmentu do^ enzymem EcoRI digerovaného plasmidu pBRHl, používaného výše v příkladu 1. Plasmid pBRHl je, jak již bylo· výše uvedeno, plasmidem rezistentním vůči ampicilinu a obsahujícím gen pro tetracyklinovou rezistenci, ale je vůči tetracyklinu citlivý, neboť není přítomen vhodný promotorový-operátorový systém.

Výsledný plasmid pHKY 1, jehož zkonstruování je podrobněji popsáno níže a znázorněno na obr. 8, je rezistentní jak vůči ampicilinu, tak vůči tetracyklinu, obsahuje tryptofanový promotorový-operátorový systém, chybí mu tryptofánový útlumový článek a obsahuje jediné Xbal restrikční místo vzdálené od tryptofánového promotoru-operátoru. Tryptofánový promotor-operátor a jediné Xbal místo jsou vázány mezi dvěma EcoRI štěpícími místy, takže uvedený fragment obsahující trp promotor-operátor-Xbal místo lze odstranit a vsunout do plasmidů obsahujících jiné strukturální geny.

Alternativně lze do tohoto plasmidu vsunout další heterologické strukturální geny, buď do Xbal štěpícího místa, nebo· (po· par238646 ciální digesci enzymem EcoRI) do EcoRI restrikčního místa vzdálenějšího -od tryptofánové kontrolní oblasti, v každém případě tak, aby přišel pod kontrolu tryptofánového promotorového-operátorového systému.

Plasmid pHGH 207 se digeruje restrikčním enzymem EcoRI -a získaný trp promoitorový fragment 23 obsahující EcoRI štěpící místo se isoluje za použití PAGE elektroforézy a následující elektroelucí.

Plasmid pBRHl se digeruje restrikčním enzymem EcoRI a z konců rozštěpené -molekuly se působením bakteriální -alkalické fosfatázy („BAP“) (1 ug, v prostředí 50 mmol tris-pufru o pH 8 -a 10 mmol bezvodého chloridu horečnatého, po -dobu 30 minut při 65 stupních C] -odstraní fosfátové skupiny -na vyčnívajících- EcoRI koncích. Přebytek bakteriální alkalické fosfatázy se -odstraní extrakcí fenolem a extrakcí chloroformem a soli se vysráží ethanolem. Získá se lineární DNA 7a, které chybí fosfátové -skupiny na vyčnívajících koncích a která přijímá -a váže pouze vložky, jejichž komplementární „lepivé“ konce jsou fosforylovány, ale sama se neuzavírá do- kruhového tvaru a dovoluje proto- snadnější zkoušení plasmidů -obsahujících různé vložené části.

Fragment 23, získaný z plasmidu pHGH 207 a obsahující EcoRI, a lineární DNA získaná z plasmidu pBRHl 7a se zkombinují a vzájemně naváží v přítomnosti Ta ligázv, způsobem popsaným výše. Částí získané směsi se transformují bakterie E. -coli kmene 294, analogicky jak je popsáno- výše, -a mikroorganismy se kultivují na agarových deskách s LB půdou obsahující 5 jzg/ml tetracyklinu a touto selekcí se získá 12 kolonií rezistentních -na tetracyklin. Z každé kolonie se isoluje plasmid a hodnotí se na přítomnost vsunutého fragmentu DNA restrikční endonukleázovou analysou za použití štěpících enzymů EcoRI a Xbal. Jeden z takto získaných plasmidů -obsahující žádanou vložku byl označen jako plasmid pHKYl.

Příklad 4

Sestrojení plasmidu obsahujícího tryptofánový -operón, schopného exprese specificky štěpitelné fúzované bílkoviny obsahující 6 aminokyselin hlavního -trp-peptidu, poslední třetinu trp E polypeptidu (označenou LE‘) a heterologický strukturální gen

Strategie pro sestrojení plasmidu vylučujícího fúzovanou bílkovinu -s LE‘ polypeptidem zahrnuje následující stupně:

a) Zajištění genového fragmentu -obsahujícího kodóny pro vzdálenou -oblast LE‘ polypeptidu a -majícího Bgl II, popřípadě EcoRI záchytné konce na 5‘ a 3‘ koncích kódujícího vlákna;

e) Eliminace kodónů ze vzdálené oblasti LE‘ genového fragmentu a koidónu pro trp D gen z plasmidu SOM 7 Δ 2, vsunutí fragmentu získaného ve stupni a] -a obnovení LE‘ kodónové sekvence bezprostředně za sekvencí tin.

heterologického- genu pro somatostaje znázorněno na obr. 9a, plasmid

Δ 2 se digeruje enzymem Hind III _ lambda-exonukleázou

3‘ extonuklcaza) za podmínek zvolených

Jak pSom a pak se digeruje (5‘ ' tak, aby štěpení probíhalo za Bgl II restrikčním místem s LE‘ kódující oblastí; 20 μ-g plasmidu -pSom 7 Δ 2 digerovaného -enzymem Hind III se rozpustí v pufru (20 mmol glycinového pufru o pH 9,6, 1 mmol bezvodého chloridu horečnatého -a 1 -mmol -β-merkaptoethanolu) a na -směs se působí 60 minut při teplotě místnosti 5 jednotkami lambda-exonukleázy. Získaná reakční směs se extrahuje fenolem, pak -se extrahuje chloroformem a vysráží ethanolem.

Aby se posléze vytvořil EcoRI zbytek na vzdálenějším konci LE‘ genového fragmentu, syntetizuje se zlepšenou fosfortrlesterovou metodou (viz R. Crea se spolupracovníky, časopis Proč. Naťl. Acad. Sci USA 75, 5 765- /1979/) primér o složení ³²pCCTGTGCATGAT a hybridizujo se s jednovláknovým koncem LE‘ genového fragmentu, získaným digesci lambda-exonukleázou. Hybridizace se provádí níže popsaným způsobem.

fragmentu, získaného· působením lambda-exonukleázy na produkt digesce plasmidu pSom 7 Á 2 enzymem Hind III, se rozpustí ve 20 μΐ vody a k roztoku se přidá 60 μ1 roztoku obsahujícího a.si 80 pmol shora popsaného 5‘-fosforylovaného oílgonukleotidu. Synthetický fragment se hybridizuje na 3‘ konec LE‘ kódující sekvence a zbývající jednovláknová část LE‘ fragmentu se doplní výše popsaným postupem s Klenowovou polymerázou I, za použití trifosfátů dATP, dTTP, dGTP a dCTP.

Reakční směs se zahřeje na 50 °C a pak se nechá zvolna vychladnout na 10 °C; poté se přidá Klenowova polymeráza. Po- 15 minutách inkubace při teplotě místnosti -a následujících 30 minutách inkubace při 37 ^0,C se reakce zastaví přidáním 5 μΐ 0,25 M EDTA. Reakční směs se vyextrahuje fenolem, pak se extrahuje chloroformem a vysráží se ethanolem. Získaná DNA 28 se poté štěpí restrikčním -enzymem Bgl II a fragmenty se rozdělí PAGE elektroforézou. Pomocí autoradiogramu gelové vrstvy se zjistí poloha 32P-znaičeného fragmentu o -očekávané délce řetězce přibližně 470 bp, -a tento fragment se isoluje elektroelucí. Jak již bylo nastíněno výše, tento fragment LE‘ (d) má Bgl II konec a druhý konec „tupý“, koincidující se začátkem priniéru.

Plasmid pTh α »1 popsaný výše v- příkladu 1, části C, nese strukturální gen pro thymosin alfa jedna, zakódovaný svým 5‘ koncem kódujícího vlákna do EcoRI místa a svým 3‘ koncem do BamHI místa. Jak je znázorněno na obr. 9b, obsahuje thymosinový gen rovněž Bgl II štěpící místo.

Plasmid pTh α ' 1 - obsahuje též gen specifikující rezistenci vůči ampicilínu. Za účelem sestrojení plasmidu schopného přijmout shora uvedeným způsobem připravený fragment LE‘ (d) 29, se pTh a 1 digeruje restrikčním enzymem EcoRI a pak se provede reakce -s trifosfáty dTTP a dATP v přítomnosti Klenowovy polymerázy, aby se „otupily“ EcoRI zbytky.

Digescí získaného produktu enzymem Bgl II se získá lineární DNA fragment 33 obsahující gen pro ampicilinovou rezistenci a na opačném konci „lepivý“ Bgl II zbytek a na bližším konci „tupé“ zakončení. Vzniklý produkt se dá znovu uzavřít do kruhu reakcí s LE‘ (d) fragmentem 29 obsahujícím Bgl II záchytný konec -a „tupý“ konec, v přítomnosti Ti DNA--igázy, a získá se plasmid pTrp 24 [34 viz - obr. 9b). Přitom se znovu vytvoří EcoRI štěpné místo v té poloze, kde dojde k vazbě s „tupým“ koncem.

Jak je znázorněno na obr. 10, postupná digesce plasmidu pTrp 24 restrikčními enzymy Bgl II a EcoRI a následující isolace produktu, za použití PAGE elektroforézy -a elektroeluce, poskytne fragment mající kodóny pro- LE‘ (d) polypeptid -s Bgl II „lepivým“ koncem a EcoRI „lepivým“ koncem sousedícím s jeho 3‘ kódujícím zakončením. Získaný LE‘ (d) fragment 38 se dá začlenit do Bgl II místa plasmidu pSom 7 Δ 2 za vytvoření fúzované bílkoviny složené z LE‘ polypeptidu a somatostatlnu, která je vylučována za kontroly tryptofanového promotoru-operátoru, jak je znázorněno na obr. 10.

Aby se shora popsané začlenění fragmentu 38 dalo provést, je třeba 1. částečně digerovat enzymem EcoRI plasmid pSom 7 Λ 2 za účelem jeho rozštěpení v EcoRI -místě vzdálenějším -od tryptofánového promotoru-operátoru, jak je znázorněno na -obr. 10, -a

2. vhodně zvolit sekvenci priméru (viz obrázek 9a), za účelem udržení správné translační -stavby kodónu, a znovu sestavit plasmid v EcoRI štěpném místě.

Tak například se 16 μξ plasmidu pSom 7 Δ 2 zředí do 200 μΐ pufru obsahujícího 20 mmol tris -o pH 7,5, 5 mmol bezvodého chloridu horečnatého, 0,02 mmol detergentu NP 40 -a -100- mmol chloridu sodného, a působí na něj 0,5 jednotkami -restrikčního enzymu EcoRI. Po 15 -minutách působení při 37 stupních C se reakční směs vyextrahuje fenolem, extrahuje chloroformem -a vysráží ethanolem a produkt se poté -digeruje enzymem Bgl II. Vzniklý větší fragment 36 se isoluje za použití PAGE elektroforézy a elektroeluce.

Tento fragment - obsahuje kodóny LE‘ (p) pro bližší konec LE‘ polypeptidu, tj. kodóny, které leží za Bgl II štěpícím místem. Fragment 36 se pak -naváže na fragment 38 v přítomnosti Ti DNA ligázy za vzniku plasmidu pSom 7 Δ '2 Δ 4, kterým se pak transformují bakterie E. coli kmene 294, způsobem popsaným výše a účinně -se tak produkuje, pod kontrolou tryptofánového prornotoru-operátoru, fúzovaná bílkovina skládající se z plně rekonstituovaného LE‘ polypeptidu -a ze somatostatínu.

Fúzovaná bílkovina, ze které může být somatostatin specificky -odštěpen vzhledem k přítomnosti -methioninu na 5‘ konci somatostatinové sekvence, se -oddělí shora popsaným způsobem, za použití elektroforézy na sodiumdodecylsulfát-polyakrylamidovém gelu. Na obr. 11 je fúzovaný protein jako nejzřetelnější pás v - dráze 6 (bližší podrobnosti k oibr. 11 jsou uvedeny v níže uvedeném příkladu 5).

Příklad 5

Sestrojení systému pro vylučování trp LE‘ polypeptidických fúzí, ve kterých je umístěna rezistence vůči tetracyklinu, za kontroly tr yp tof ánového p r- omoto-r u - op er áto r u

Strategie pro sestrojení vylučovacího prostředku schopného přijímat rozličné heteoologické polypeptidické geny pro expresi odpovídajících -bílkovin ve formě fúzí s trp LE‘ polypeptidem pod kontrolou tryptofánového operónu, zahrnuje zkonstruování plasmidu majícího následující charakteristiky:

1. Rezistenci vůči tetracyklinu, která se však může ztratit v případě, že se -odstraní promotorový-operátorový systém kontrolující geny specifikující takovou rezistenci;

2. Odstranění promotorového-operátorového systému, který kontroluje rezistenci vůči tetracyklinu, a opětovné uzavření získaného lineárního fragmentu do kruhového- tvaru navázáním zvoleného heterologického genu a tryptofánového promotorového-operátorového systému ve vhodné translační fázi vzhledem k němu, čímž se obnoví rezistence vůči tetracyklinu a v důsledku toho -se umožní identifikace plasmidu -obsahující vložený -ύ^ρο^κ^ gen.

Ve stručnosti lze shrnout, že v souhlase s povahou uvažovaných vložených sekvencí je účelem sestrojit lineární část DNA mající Pst zbytek na svém 3‘ konci -a Bgl II zbytek na svém 5‘ konci a vázající gen specificky schopný vytvářet rezistenci vůči tetracyklinu, když se uvede pod kontrolu promotorového-operátorového systému.

Tak například, jak je znázorněno na obrázku -12, se plasmid pBR3'22 -digeruje enzymem Hind III a vyčnívající Hind III konce se poté -digerují S1 nukleázou. Posléze uvedená -digesce spočívá v tom, že se na 10 μ§ plasmidu pBR3'22 rozštěpeného enzymem Hind III působí v prostředí 30 μ\ pufru S1 (0,3 mol chloridu sodného, 1 -mmol bezvodého chloridu zinečnatého, 25 mmol octanu sodného, pH 4,5) 300 jednotkami nukleázy S1 po dobu 3Ό minut při 15 °C.

Reakce se zastaví přidáním 1 μΐ 30 X S1 přerušovacího roztoku pro S1 nukleázu (0,8 mol tris-base a 5Ό mmol EDTA), směs se vyextrahuje fenolem, pak se extrahuje chloroformem a vysráží ethanolem. Získaný produkt 45 se digeruje výše popsaným způsobem štěpícím enzymem EcoRI a ze vzniklé směsi štěpů se velký fragment 46 isoluje PAGE elektroforézou a elektroelucí. Takto získaný fragment má jeden EcoRI „lepivý“ konec a druhý „tupý“ konec, jehož kódovací vlákno začíná nukleotidem thymidinem. Jak bude ukázáno v dalším popisu, může se S1 digerovaný Hind III zbytek začínající thymidinem připojit na Bgl II zbytek vzniklý působením Klenowovy polymerázy I a po navázání rekonstituovat Bgl II restrikční místo.

Plasmid pSom 7 Δ 2, připravený způsobem popsaným výše v příkladu 1, se digeruje enzymem Bgl II a získaný fragment s Bgl II záchytnými konci se převede postupem s Klenowovou polymerázou I, za použití všech čtyř desoxynukleotidtrifosfátů, na dvouvláknový.

Vzniklý produkt se rozštěpí enzymem EcoRI a následující isolací menšího, fragmentu 42 pomocí PAGE elektroforézy a elektroeluce se získá lineární část DNA obsahující tryptofánový promotor-operátor a kodóny nejbližší LE‘ sekvence za Bgl II štěpícím místem („LE‘ (p)“). Tento lineární fragment má jednak EcoRI konec a jednak „tupý“ konec vzniklý doplněním v Bgl II místě.

Bgl II místo se však rekonstituuje navázáním „tupého“ konce fragmentu 42 na „tupý“ konec fragmentu 46. Oba posléze zmíněné fragmenty se uvedeným způsobem naváží v přítomnosti T4 DNA ligázy za vzniku znovu do kruhu uzavřeného plasmidu pHKY 10 [viz obr. 12), kterým se transformují buňky bakterií E. coli kmene 294.

Vypěstované, vůči tetracyklinu rezistentní buňky nesoucí rek ombino váný plasmid pHKY 10 se vyisolují, plasmidická DNA se vyextrahuje a poté se postupně digeruje restikčními enzymy Bgl II a Pst, velký fragment získaný štěpením se isoluje PAGE elektroforézou a elektroelucí. Získá se lineární část DNA mající Pst a Bgl II záchytné konce.

Tento DNA fragment 49 obsahuje počáteční replikaci a je proto vhodný jako první komponenta pro konstrukci plasmidů, ve kterých oba geny, gen kódující bílkoviny fúzované s trp LE‘ polypeptidem a gen kódující rezistenci vůči tetracyklinu, jsou kontrolovány trp promotorem-operátorem.

Plasmid pSom 7 Δ 2 A 4, připravený způsobem popsaným v příkladu 4, lze zpracovat tak, aby poskytnul druhou komponentu potřebnou pro sestrojení systému schopného přijímat rozličné heterologické strukturální geny. Jak je uvedeno na obr. 13, podrobí se zmíněný plasmid částečné digesci restrikč33 ním enzymem EcoRI (viz příklad 4) a pak digesci enzymem Pst, a fragment 51 obsahující trp promotor-operátor se isoluje PAGE elektroforézou a následující elektroelucí.

Parciální digesce enzymem EcoRI se musí provádět proto, a'by se získal fragment rozštěpený v sousedství 5‘ konce somatostatinového genu, ale nerozštěpený v EcoRI místě přítomném mezi genem pro ampicilinovou rezistencí a trp promotorem-operátorem. Ampicilinová rezistence ztracená štěpením enzymem Pst I v ap^R genu se dá znovu obnovit po vazbě s fragmentem 51.

Jako první ukázka třetí komponenty potřebné pro konstrukci nového plasmidu je uveden strukturální gen pro thymosín alfa jedna. Připraví se tak, že se plasmid pTh a 1 podrobí digesci enzymem EcoRI a BarnHI a získaný fragment 52 se čistí PAGE elektroforézou a elektroelucí.

Uvedené tři genové fragmenty 49, 51 a 52 se navzájem naváží ve správné orientaci, jak je znázorněno na obr. 13, za vzniku plasmidu pTh a 7 Δ 1 A 4, který lze při kultivaci vybrat na základě jeho obnovené ampicilinové a tetracyklinové rezistence. Po transformaci bakterií E. coli kmene 294 a po kultivaci buněk za podmínek analogických těmkteré byly popsány v příkladu 1, se získá plasmid vylučující fúzovanou bílkovinu s trp-polypeptidem LE‘, ze kterého lze specificky odštěpit thymosin alfa jedna působením bromkyanu.

Když se podobným způsobem naváží jiné strukturální heterologické geny mající EcoRI a BarnHI zakončení s komponentami odvozenými z plasmidů pHKY 10 a pSom 7 Δ2 Δ4, získají se analogicky účinně fúzované bílkoviny s trp LE‘ polypeptidem, obsahující polypeptidy, pro které jsou příslušné heterologické geny kódovány.

Na obr. 11 jsou znázorněny výsledky dělení celkové buněčné bílkoviny získané z transformantů E. coli kmene 294, elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu, přičemž nejiintenzívnější pásy v každém z uvedených případů představují produkty fúzovaných bílkovin vzniklé pod kontrolou t r yp t o f á no vé h o promotorové ho - o p er á to r o v é ho systému.

Na dráze 1, Obr. 11 je pro kontrolu znázorněného rozdělení celkové buněčné bílkoviny získané z bakterií E. coli 294/pBR32:2. Dráha 2 znázorňuje rozdělení fúzovaného produktu obsahujícího somatostatin, získaného z plasmidu pSom 7 Δ 2 Δ 4 připraveného způsobem popsaným v příkladu 4. Dráha 3 znázorňuje rozdělení produktu vylučování z plasmidu pSom 7 Δ 1 A 4, obsahujícího somatostatin. Dráha 4 znázorňuje rozdělení produktu exprese z plasmidu pTh o? 7 Δ 1 A 4, a dráha 5 znázorňuje rozdělení produktu vylučovaného z plasmidu získaného spojením shora popsaných fragmentů odvozených z plasmidů pHKY 10 a pSom 7 A 2 Δ 4 se strukturálním genem kódujícím lidský iproinsulin, zakončeným EcoRI a BamH I konci a připraveným částečně jedním z autorů tohoto vynálezu.

Dráhy 6 a 7 znázorňují, jako nejintenzívnější pás, bílkovinu fúzovanou s trp LE‘ polypeptidem, ze které lze specificky odštěpit В a A řetězce lidského inzulínu. Strukturální geny pro inzulín В a A se získají digesci plasmidů pIBl, popřípadě pIAll, restrikčními enzymy EcoRI a BamH I; konstrukci uvedených plasmidů popsali D. V. Goeddel se spolupracovníky v časopisu Proč. Naťl. Acad. Sci. USA 76, 106 (1979). V dráze 8 je znázorněna poloha standardů.

Ačkoliv je způsob podle vynálezu popsán v jeho nejvýhodnějším provedení za použití bakterií E. coli, lze jako hostitelských buněk pro vylučování a jako zdrojů pro trp-operóny použít i jiných enterobakterií, ze kterých lze uvést například Salmonella typhimurium a Serratia marcesans. Způsob podle vynálezu není proto omezen na popsané výhodné provedení, ale jen na právní rozsah vyplývající z následujících bodů předmětu vynálezu.

Claims (3)

1. PŘEDMĚT VYNALEZU

   1. Způsob štěpení dvojvláknové DNA v kterémkoliv daném bodě, vyznačující se tím že

   a) dvojvláknová DNA se převede iv okolí obklopujícím daný bod na jednovláknovou DNA,

   b) na jednovláknový úsek vytvořený ve stupni a) se hybridizuje komplementární délka jednovláknového DNA priméru, přičemž 5‘ konec priméru leží na opačné straně nukleotidu připojeného к zamýšlenému štěpícímu místu,

   c) obnoví se ta část druhého vlákna eliminovaného ve stupni a), která leží v 3‘ směru od uvedeného priméru, reakcí s DNA polymerázou v přítomnosti trifosfátů desoxynukleotidů obsahujících adenin, thymin, guanin a cytosin a

   d) digeruje se zbývající jednovláknová délka DNA, která vyčnívá za zamýšleným štěpícím místem.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se stupně c) a d) provádějí současně reakcí s DNA polymerázou, která polymeruje ve směru 5‘ - 3‘, je exonukleolytická ve směru 3‘ - 5‘, ale není exonukleolytická ve směru 5‘ -> 3‘.
3. 3. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že se stupně c) a d) provádějí současně reakcí s Klenowovou polymerázou I.