DK173085B1 - Fremgangsmåde til bakteriel polypeptidudtrykkelse og plasmidisk udtrykkelsesmedium til fremstilling af et heterologt polype - Google Patents

Description

i DK 173085 B1

Med fremkomsten af rekombinant-DNA-teknologien er den styrede bakterielle produktion af en enorm række forskellige nyttige polypeptider blevet mulig. Der rådes allerede over bakterier, modificeret ved denne teknologi 5 til at muliggøre produktionen af sådanne polypeptidpro-dukter som somatostatin (K. Itakura et al., Science 198, 1056 (1977), A- og B-kædekomponenterne af humant insulin (D.V. Goeddel et al., Proc Nat‘l Acad Set, USA J6, 106 (1979) og humant væksthormon (D.V. Goeddel et al., lo Nature 281, 544 (1979)). For nylig er rekombinant-DNA-teknik blevet anvendt til at frembringe bakteriel produktion af thymosin <*1, et immunforstærkende stof produceret af thymus (US patentansøgning indleveret den 28. februar 1980 af Roberto Crea og Ronald Wetzel og 15 overdraget til ansøgeren i den foreliggende ansøgning).

Så magtfuld er denne teknologi, at praktisk taget ethvert nyttigt polypeptid kan produceres bakterielt, hvilket bringer den styrede fremstilling af hormoner, enzymer, antistoffer og vacciner over for en lang række forskelli-2o ge sygdomme inden for rækkevidde. Den anførte litteratur, som mere detaljeret beskriver de ovennævnte repræsentative eksempler, inkorporeres som henvisning i denne beskrivelse, ligesom andre publikationer, som der henvises til neden for, til belysning af opfindelsens baggrund.

25 Arbejdshesten for rekombinant-DNA-teknologien er plasmi-det, en ikke-kromosomal løkke af dobbeltstrenget DNA, der findes i bakterier, ofte i flere kopier pr. bakteriecelle. Inkluderet i den information, som er indkodet i plasmid-DNA'en, er den som kræves til at reproducere 3o plasmidet i datterceller (dvs. et ,,replicon,,) og almindeligvis en eller flere udvælgelsesegenskaber, såsom resistens over for antibiotica, hvilket gør det muligt at muligt at genkende kloner af værtscellen indeholdende det pågældende plasmid og fortrinsvis dyrket i selektive 35 medier. Nytten af bakterielle plasmider ligger i, at de kan spaltes specifikt af en eller anden restriktions- 2 DK 173085 B1 endonuklease eller ’’restriktionsenzym", som hvert genkender et forskelligt sted på plasmid-DNA'en. Derefter kan heterologe gener eller genfragmenter indsættes i plasmidet ved sammenføjning med enderne af spaltnings-5 stedet eller med rekonstruerede ender op til spaltningsstedet. I denne beskrivelse skal betegnelsen "heterolog" henføre til et gen, som ikke almindeligvis findes i, eller en polypeptidsekvens, som ikke almindeligvis produceres af, E. coli, medens betegnelsen "homolog" hen-lo fører til et gen eller polypeptid, som produceres i E. coli af vildtype. DNA-rekombination gennemføres uden for bakterien, men det resulterende "rekombinant" plasmid kan indføres i bakterien ved en proces, der kendes som transformation, og store mængder af rekombinant-15 plasmidet indeholdende det heterologe gen kan opnås ved dyrkning af transformanten. Endvidere kan, hvor genet er rigtigt indsat med hensyn til portioner af plasmidet, som styrer transkriptionen og translationen af det indkodede DNA-budskab, det resulterende udtrykkelsesmedium 2o anvendes til faktisk at producere den polypeptidsekvens, for hvilken det indsatte gen koder, en proces, der betegnes som udtrykkelse.

Udtrykkeisen starter i et område kendt som promotoren, der genkendes af og bindes af RNA-polymerase. I nogle 25 tilfælde, som i det neden for omtalte trp-operon, overlappes promotorområder af "operator"-områder til dannelse af en kombineret promotor-operator. Operatorer er DNA-sekvenser, som genkendes af såkaldte repressorproteiner, der tjener til at regulere hyppigheden af transkriptions-3o start ved en bestemt promotor. Polymerasen bevæger sig langs DNA’en, idet den transkriberer den i kodningsstrengen indeholdte information fra dens 5'- til 5'-ende til budbringer-RNA, som igen translateres til et polypeptid med den aminosyresekvens, for hvilken DNA'en koder. Hver 35 aminosyre er indkodet af en enestående nukleotidtriplet eller "codon" i, hvad der til det foreliggende formål kan betegnes som "strukturgenet", dvs. den del, som indkoder 3 DK 173085 B1 aminosyresekvensen af det udtrykte produkt. Efter binding til promotoren transkriberer RNA-polymerasen først nukleo-tider, der koder for et ribosombindingssted, derpå et translationsbegyndelses- eller ’’start «’-signal (almindelig-5 vis ATG, som i den resulterende budbringer-RNA giver AUG), derpå nukleotidcodonerne i strukturgenet selv. Såkaldte stopcodoner transkriberes ved enden af strukturgenet, hvorefter polymerasen kan danne en yderligere sekvens af budbringer-RNA, som på grund af tilstedeværelsen af stoplo signalet vil forblive utranslateret af ribosomerne. Ribo-somerne forbinder sig med det på budbringer-RNA’en tilvejebragte bindingssted, i bakterier almindeligvis idet mRNA'en dannes, og producerer selv det indkodede polypeptid begyndende ved translations-start-signalet og endende ved det 15 førnævnte stop-signal. Det ønskede produkt produceres, hvis de sekvenser, der indkoder ribosombindingsstedet, er anbragt rigtigt i forhold til AUG-startcodonen, og hvis alle resterende codoner følger startcodonen i fase.

Det resulterende produkt kan opnås ved lyse af værts-2o cellen og udvinding af produktet ved passende rensning fra andet bakterieprotein.

Polypeptider udtrykt ved anvendelse af rekombinant-DNA-teknologi kan være fuldstændig heterolog som i tilfælde af den direkte udtrykkelse af humant væksthormon, eller 25 kan alternativt bestå af et heterologt polypeptid og, sammenknyttet dermed, mindst en del af aminosyresekvensen af et homologt peptid, som i tilfælde af fremstillingen af mellemprodukter for somatostatin og komponenterne af humant insulin. I de sidstnævnte tilfælde, for eksem-5o pel, bestod det tilknyttede homologe polypeptid af en del af aminosyresekvensen for β-galactosidase. I disse tilfælde bioinaktiveres det påtænkte bioaktive produkt af det tilknyttede homologe polypeptid, indtil dette fraspaltes i et ekstracellulært miljø. Sammensmeltningsproteiner som 35 de lige nævnte kan udformes således, at de tillader højspecifik spaltning af forstadieproteinet fra det påtænkte 4 DK 173085 B1 produkt, som ved indvirkning af cyanbromid på methionin, eller alternativt ved enzymatisk spaltning, se f.eks.

G.B. fremlæggelsesskrift nr. 2.007 676 A.

Hvis rekombinant-DNA-teknologi skal svare fuldt ud til 5 forventningerne, må der udformes systemer, som optimerer udtrykkelse af genindsætninger, således at de påtænkte polypeptidprodukter kan fremskaffes i højt udbytte, (b-lactamase- og lactose-promotor-operator-systemer, som hidtil har været de mest almindeligt anvendte systemer, lo har, selv om de er nyttige, ikke fuldt ud udnyttet teknologiens kapacitet ud fra et udbyttesynspunkt. Der er behov for et bakterielt udtrykkelsesmedium, som er i stand til kontrolleret udtrykkelse af ønskede polypeptidprodukter i højere udbytte.

15 Tryptofan er en aminosyre, som produceres af bakterier til brug som en delkomponent af homologe polypeptider ved en biosyntetisk reaktionsfølge, som forløber: chorisminsyre —^anthranilsyre —>phosphoribosylantranil-syre —> CDRP [enol-l-(o-carboxyphenylamino)-l-desoxy-D-2o ribulose-5-phosphat]—? indol-3-glycerol-phosphat og til sidst til tryptofan selv. De enzymatiske reaktioner i denne reaktionsfølge katalyseres af produkterne af tryptofan- eller ’^rp'^operonet, et polycistronisk DNA-seg-ment, som transkriberes under direktion af trp-promotor-25 operator-systemet. Den resulterende polycistroniske budbringer-RNA koder for den såkaldte trp-ledersekvens og derpå i rækkefølge de polypeptider, der betegnes som trp E, trp D, trp C, trp B og trp A. Disse polypeptider katalyserer og styrer på forskellig måde individuelle 30 trin i reaktionsfølgen chorisminsyre til tryptofan.

I vildtype E. coli er tryptofan-operonet under mindst tre adskilte former for kontrol. I tilfælde af promotor-operator-repression virker tryptofan som en corepressor og forbinder sig med sin aporepressor til dannelse af et 5 DK 173085 B1 aktivt repressorkompleks, som igen forbinder sig med operatoren, hvorved reaktionsfølgen undertrykkes i sin helhed. For det andet forbinder tryptofan sig ved en til-bagekoblingsinhiberingsproces med et kompleks af trp E 5 og trp D polypeptiderne og forhindrer deres deltagelse i reaktionsfølgesyntesen. Endelig frembringes kontrol ved en proces, der betegnes som dæmpning, under kontrol af genets "dæmperområdeM, et område inde i trp-ledersekven-sen. Se alment G.F. Miozzari et al, J. Bacteriologi 133. lo 1457 (1978); The Operon 263-302, Cold Spring Harbor Laboratory (1978), Miller and Reznikoff, eds.; F. Lee et al,

Proc. Natl. Acad. Set. USA 2k* ^365 (1977) and K. Bertrand et al, J. Mol. Biol. 1Q2, 319 (1976). Graden af dæmpning viser sig at være styret af den intracellulære koncentra-15 tion af tryptofan, og i vildtype E. coli standser dæmperen udtrykkelse i tilnærmelsesvis ni ud af ti tilfælde, muligvis gennem dannelse af en sekundær struktur eller "afslutningsløkke" i budbringer-RNA’en, som får RNA-polymerasen til at løsne sig for tidligt fra den til-2o knyttede DNA.

Andre forskere har anvendt trp-operonet til at opnå nogen grad af heterolog polypeptidudtrykkelse. Dette arbejde prøvede at løse problemerne med repression og dæmpning ved tilsætning af indolacrylsyre, en induktor og analog, 25 som kappes med tryptofan om trp-repressormolekyler, hvilket skulle give en tendens imod derepression ved konkurrerende inhibering. Samtidig formindsker induk-toren dæmpning ved inhibering af den enzymatiske omdannelse af indol til tryptofan og berøver således effektivt 3o cellen tryptofan. Som resultat gennemlæser flere polymeraser med held dæmperen. Imidlertid viser dette forsøg sig problematisk med hensyn til at fuldføre translation vedvarende og i højt udbytte, da tryptofanholdige proteinsekvenser afsluttes for tidligt ved syntesen på grund af 35 mangel på udnytteligt tryptofan. Faktisk afhænger en effektiv afhjælpning af dæmpning ved dette forsøg fuld- 6 DK 173085 B1 stændigt af alvorlig tryptofanudsultning.

Martial et al., Science 205:602-607 (1979) beskriver identifikation, sekvensanalyse og kloning af cDNA'et for 5 humant væksthormon. Som beskrevet på side 605, midterste kolonne, nederste afsnit, blev sekvenser af humant væksthormon efter isolering klonet i plasmidet ptrp ED5-1, som indeholder hele den regulerende trp-region, herunder trp-attenuatoren, hele trpE-genet, herunder trpE-ribosombin-10 dingsstedet, samt en del af trpD-genet. Til forskel fra de ekspressionsvektorer, der er beskrevet i kravene til den foreliggende ansøgning, har den af Martial et al. beskrevne vektor både trp-dæmpningsevne og indeholder trpE-ribosombindingsstedet.

15

Ekspression fra den af Martial et al. beskrevne vektor gav anledning til et fusionsprotein af trpD og humant væksthormon. Ekspression fra vektoren blev imidlertid udført ved "derepression" af systemet, dvs. ved tilsætning 20 af induceren 3β-indolylacrylsyre (IAA) (se side 605, sætningen fra den midterste til den højre kolonne, samt side 606, venstre kolonne). Martial et al. beskriver således ikke de sekventielle trin, der omfatter (1) repression af ekspression ved dyrkning af værtscellerne til et forudbe-25 stemt niveau i nærværelse af tryptofan, og derefter (2) derepression af systemet, ikke ved tilsætning af IAA, således som Martial et al. gør, men ved simpelt hen at berøve værtscellerne tilsat tryptofan. Martial et al. beskriver eller antyder heller ikke, at de sekventielle 30 trin med dyrkning af værtsceller i nærværelse af tryptofan og derefter fjernelse af det tilsatte tryptofan ville resultere i de overraskende høje niveauer af heterolog genekspression, som er beskrevet i nærværende beskrivelse. Martial et al. hverken beskriver eller antyder derfor 7 DK 173085 B1 noget med hensyn til den faktiske fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptidprodukt som beskrevet i den foreliggende ansøgning.

5 Hallewell et al., Gene 9:27-47 (1980), beskriver konstruktion af vektorer til analyse af genekspression under kontrol af trp-promotor/operator-systemet. Meget lig den vektor, der er beskrevet af Martial et al., har de af Hallewell et al. beskrevne vektorer specifikt (fra 5’ til 10 3’) hele tryptofan-promotor/operatoren, herunder trp-at- tenuatoren, hele trpE-genet, herunder trpE-ribosombin-dingsstedet, en del af trpD-genet og genet for tetra-cyclinresistens (tetr) . Se fx side 31, andet hele afsnit, hvor det er nævnt, at vektorerne indeholder det 5,4 kb 15 store Hindlll-DNA-restriktionsfragment fra E. coli indeholdende den regulerende trp-region, trpE-genet og en del af trpD-genet. Til forskel fra ekspressionsvektorerne ifølge den foreliggende opfindelse besidder vektorerne ifølge Hallewell et al. både trp-dæmpningsevne og trpE-20 ribosombindingsstedet.

Endelig beskriver Tacon et al., Molec. Gen. Genet.

177:427-438 (1980), konstruktionen af tre vektorer betegnet pWTlll, pWTl21 og pWT131. Ligesom de af Martial et 25 al. og Hallewell et al. beskrevne vektorer besidder de vektorer, der er beskrevet af Tacon et al., igen hver især hele trp-promotor/operatoren, herunder trp-attenua-toren (se side 427, højre kolonne, sidste afsnit). Vektorerne indeholder også ledersekvensen og de første syv 30 aminosyrer af trpE-genet, herunder trpE-ribosombindings-stedet og tetr-genet. Til forskel fra ekspressionsvektorerne ifølge den foreliggende opfindelse besidder de af Tacon et al. beskrevne vektorer både trp-dæmpningsevne og trpE-ribosombindingsstedet.

7a DK 173085 B1

Ekspression af tetr-genet under kontrol af trp-promotor/-operatoren blev udført ved at dyrke værtscellerne i "M9-salte, glucose, casaminosyrer-minimal agar suppleret med 5 tetracyclin-hydrochlorid" (dvs. medium uden tryptofan), og derefter "blev der tilsat 3p-indolylacrylsyre eller tryptofan" (se side 428, venstre kolonne, afsnit med overskriften "Medier og transformation"). Ekspression af tetr-genet blev således udført ved først at dyrke værts-10 cellerne i medium uden tryptofan og derefter tilsætte enten IAA eller tryptofan. Det kan let erkendes, at dette er nøjagtigt det modsatte af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, hvor værtsceller først dyrkes i represseret tilstand (dvs. i nærværelse af tryptofan) og 15 derefter skiftes til den derepresserede tilstand (dvs. ved at fjerne det tilsatte tryptofan). Derfor beskriver Tacon et al. intet med hensyn til fremgangsmåden til fremstilling af et polypeptid ifølge den foreliggende opfindelse. Tacon et al. beskriver eller antyder heller 20 ikke, at derepression ved simpelt hen at fjerne tilsat tryptofan (ikke ved at tilsætte induceren, IAA) ville være effektiv til at forårsage heterolog genekspression i de niveauer, der er beskrevet i nærværende beskrivelse.

25 Den foreliggende opfindelse angriber problemer forbundet med tryptofanrepression og dæmpning på en anden måde og angiver en særlig fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptidprodukt ved udtrykkelse i bakterier af et strukturgen, som koder herfor, hvilken fremgangsmåde er 30 ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del angivne.

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes hidtil ukendte plasmidiske udtrykkelsesmedier for produktion i 7b DK 173085 B1 bakterier af heterologe polypeptidprodukter, hvilke er ejendommelige ved det i krav 12's kendetegnende del angivne. I stedet anvendes trp-leder-ribosombindingsstedet effektivt til at frembringe udtrykkelse af den informa-5 tion, som er indkodet af et indsat gen.

Celler transformeres ved tilsætning af de trp-promotor-operator-holdige og dæmper-manglende plasmider ifølge opfindelsen og dyrkes i nærvær af tilsat tryptofan. Anven-10 delsen af tryptofanrige medier skaffer tilstrækkeligt tryptofan til i hovedsagen fuldstændigt at undertrykke trp-promotor-operatoren gennem trp/repressor-samvirken, således at cellevæksten kan foregå uhindret af for tidlig udtrykkelse af store mængder heterologt polypeptid indko-15 det med en indsætning, som ellers er under kontrol af trp-promotor-operator-systemet. Når rekombinantkulturen er blevet dyrket til et niveau, der er passende for industriel fremstilling af polypeptidet, fjernes, på den anden side, den ydre kilde for tryptofan, således at cellen 20 er overladt til kun at bygge på det tryptofan, den selv kan producere. Resultatet er mild tryptofanbegrænsning, og i overensstemmelse hermed derepresseres reaktionsfølgen, og der sker højeffektiv udtrykkelse af den heterologe indsætning, uhindret af dæmpning, fordi dæmperområ-25 det er blevet fjernet fra systemet. På denne måde berøves cellerne aldrig tryptofan i alvorlig grad, og alle proteiner, hvad enten de indeholder tryptofan eller ej, kan produceres i væsentlige udbytter.

30 Der tilvejebringes yderligere midler til spaltning af dobbeltstrenget DNA ved ethvert ønsket punkt, selv i fravær af et restriktionsenzymsted, en teknik, som bl.a. er nyttig til skabelse af trp-operoner med andre dæmperfjer- DK 173085 B1 7c neiser end de, der hidtil er opnået ved udvælgelse af mutanter .

Endelig tilvejebringes der en lang række nyttige mellem-5 produkter og slutprodukter, heruner specifikt spaltelige heterologt-homologt sammensatte proteiner, som er stabiliseret over for nedbrydning under udtrykkelsesbetingel-ser.

10 Udøvelsen af opfindelsen og de fordele, der opnås herved, belyses nærmere ved den følgende detaljerede beskrivelse med henvisning til tegningerne, på hvilke:

Figur 1 og 2 belyser et foretrukkent skema til dan-15 nelse af plasmider, som er i stand til at udtrykke heterologe gener som sammensætninger med en del af trp D polypeptidet, fra hvilken sammen- 8 DK 173085 B1 sætning de senere kan fraspaltes;

Figur 3 er resultatet af polyacrylamidgel-segrege-ring af celleprotein indeholdende homologt (trp D1) -heterologt (somatostatin eller thymosin cel) sammen-5 satte proteiner;

Figur 4, 5 og 6 belyser successive stadier i et foretrukkent skema til skabelse af et plasmid, som er i stand til direkte at udtrykke et heterologt gen (humant væksthormon) under kontrol af trp-lo promotor-operator-systemet;

Figur 7 viser resultatet af polyacrylamidgel-segre-gering af celleprotein indeholdende humant væksthormon direkte udtrykt under kontrol af trp-promotor-operator-systemet; 15 Figur 8, 9 (a-b) og 10 belyser successive stadier i et foretrukkent skema til skabelse af plasmider, som er i stand til at udtrykke heterologe gener (i det viste tilfælde for somatostatin) som sammensætninger med en del af trp E polypeptidet, fra 2o hvilken sammensætning de senere kan fraspaltes;

Figur 11 viser resultatet af polyacrylamidgel-segregering af celleprotein indeholdende homologt (trp E) - heterologt sammensatte proteiner til fremstilling af henholdsvis somatostatin, thymosin ocl, 25 humant proinsulin og A- og B-kæden af humant insulin.

Figur 12 og 13 belyser successive stadier i den måde, hvorpå det ifølge skemaet i figur 8-10 skabte plasmid manipuleres til dannelse af et system, hvori andre heterologe gener udskifteligt kan udtrykkes 3o som sammensætninger med trp E polypeptidsekvenser.

9 DK 173085 B1 I figurerne er kun kodningsstrengen af det dobbeltstrengede plasmid og lineære DNA’er afbildet i de fleste tilfælde af hensyn til illustrationens tydelighed. Gener, p der koder for antibiotisk resistens, er betegnet Ap (am-

R S

picillin) og Tc (tetracyclin). Symbolet Tc angiver et gen for tetracyclinresistens, som ikke er under kontrol af et promotor-operator-system, således at plasmider indeholdende genet ikke desto mindre vil være tetra- 3 cyclinfølsomme. Symbolet Ap angiver ampicillinfølsomhed opstået ved fjernelse af en del af det gen, der koder for ampicillinresistens. Plasmidiske promotorer og operatorer er betegnet "p" og "o". Bogstaverne A, T, G og C betegner de nukleotider, der indeholder baserne henholdsvis adenin, thymin, guanin og cytosin. Andre figursymboler fremgår af teksten.

De foretrukne udførelsesformer for opfindelsen, som beskrevet nedenfor, involverede anvendelsen af et antal almindeligt tilgængelige restriktionsendonukleaser, identificeret i det følgende deres tilsvarende genkendelsessekvenser og (angivet ved pil) spaltningsmønstre.

i *

Xbal: TCTAGA Taql: TCGA

AGATCjT AGCjT

l I

EcoRI: GAATTC Hindlll: AAGCTT

CTTAAG TTCGAA

t t

BgIII: JgaTCT Hpal: GTTAAC

TCTAGA CAATTG

t *

PvuII GAGCTG Psti: CTGCAG

GTCGAC GACGTC

t t i

BamHI: GGATCC

CCTAG6 r 10 DK 173085 B1

Hvor spaltningspunkterne er forskudt for hinanden på de respektive strenge, vil de spaltede ender være "klistret", dvs. i stand til at sammensmeltes igen eller til at sammensmeltes med en anden komplementært "klistret"-endende 5 DNA ved Watson-Crick baseparring (A til T og G til C) på taphul- og -tapfacon. Nogle restriktionsenzymer, såsom Hpal og PvuII ovenfor, spalter, således at der efterlades "stumpe" ender. De ovenstående nukleotidsekvenser er tegnet i overensstemmelse med den konvention, som anven-lo des hele vejen: den øvre streng er proteinkodningsstrengen, og når man går fra venstre til højre på den streng, bevæger man sig fra 5'-enden til 3'-enden deraf, dvs. i transkriptionsretningen fra et "nær"- mod et "fjern"-punkt.

15 Endelig, hvad angår konventioner, betegner symbolet "δ" en fjernelse. Således beskriver f.eks. henvisning til et plasmid efterfulgt af f.eks. "aEcoRI-Xbal" det plasmid, hvorfra nukleotidsekvensen mellem EcoRI og Xbal restriktionsenzymstederne er blevet fjernet ved fordøjelse med 2o disse enzymer. Af nemhedsgrunde er visse fjernelser betegnet ved tal. Hvis man således begynder fra det første basepar ("bp") i EcoRI genkendelsesstedet, som kommer før genet for tetracyclinresistens i udgangsplasmidet pBR322, betegner "al" fjernelse af bp 1-30 (dvs. &EcoRI-Hind III) 25 og dermed følgende funktionsudygtighed af tetracyclin-promotor-operator-systemet; Mc2" betegner fjernelse af bp 1-375 (dvs. AEcoRI-BamHI) og dermed følgende fjernelse af både tetracyclin-promotor-operatoren og strukturgenet, som koder for tetracyclinresistens; og "δ3" betegner 3o fjernelse af bp 3611-4359 (dvs.aPstl-EcoRI) og fjernelse af ampicillinresistens. "a4" anvendes til at betegne fjernelse af bp ca. 900 - ca. 1500 fra trp-operon-fragmente t 5 (fig. 1), hvilket eliminerer strukturgenet for trp D polypeptidet.

35 trp-ledersekvensen udgøres af basepar ("bp") 1-162, begyndende fra startpunktet for trp-mRNA. Et formentligt trp- 11 DK 173085 B1 lederpolypeptid på 14 aminosyrer indkodes af bp 27-71 efterfulgt af ATG-nukleotiderne, der indkoder translations-startsignalet. trp-dæmperområdet består af successive GC-rige og AT-rige sekvenser beliggende mellem bp 5 114 og 156, og dæmpning frembringes øjensynligt på mRNA- nukleotider indkodet af bp ca. 134 - 141 i ledersekvensen. For at udtrykke et heterologt polypeptid under direktion af trp-lederribosora-bindingsstedet og samtidig undgå dæmpning må de følgende kriterier iagttages: lo 1. Basepar 134 - 141 eller derudover må fjernes; 2. ATG-codonen af det indsatte gen må anbringes i korrekt forhold til et ribosombindingssted, som det er kendt (f.eks. J.A. Steitz "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA" i 15 Biological Regulation and Control (ed. R. Gold berger) Plenum Press, N.Y. (1978)).

3. Hvor et homologt-heterologt sammensat protein skal fremstilles, skal translations-startsignalet for en homolog polypeptidsekvens forblive til rådig- 2o hed, og codonerne for den homologe del af det sammensatte protein må indsættes i fase uden mellemliggende translations-stopsignaler.

For eksempel vil fjernelse af alle basepar i ledersekvensen ud over bp 70 fjerne dæmperområdet, efterlade den 25 ATG-sekvens, som koder for translations-startsignalet og eliminere det mellemliggende translations-stop indkodet af TCA (bp 69 - 71) ved at fjerne A og følgende nukleotider. En sådan fjernelse ville resultere i ud-trykkelse af et sammensat protein begyndende med leder-30 polypeptidet, endende med det der er indkodet af enhver heterolog indsætning og inkluderende et fjernt område af et af efter-leder-trp-operon-polypeptiderne bestemt af fjernelsens udstrækning i 3'-retningen. En sådan fjernelse, der strækker sig ind i E genet, ville føre til 35 udtrykkelse af et homologt forstadium omfattende L- 12 DK 173085 B1 sekvensen og det fjerne område af E (uden for fjernelsens slutpunkt) knyttet til den sekvens, der indkodes af enhver følgende indsætning osv.

To særlig nyttige plasmider, hvorfra dæmperområdet er 5 blevet fjernet, er plasmiderne pGMl of pGM3, G.F. Mioz-zari et al, J. Bacteriologi 133. 1457 (1978). Disse bærer henholdsvis fjernelserne trp ^LE 1413 og trp ^\LE 1417 og udtrykker (under kontrol af trp-promotor-operatoren) et polypeptid, der omfatter tilnærmelsesvis de første lo seks aminosyrer af trp-leder-området og det fjerne område af E polypeptidet. I det mest foretrukne tilfælde, pGMl, udtrykkes kun omkring den sidste trediedel af E polypeptidet, medens pGM3 udtrykker næsten den fjerne halvdel af E-polypeptid-codonerne. E. coli K-12 stamme 15 W3H0 tna 2”trp”ål02 indeholdende pGMl er blevet deponeret i American Type Culture Collection (ATCC nr. 31622). pGMl kan konventionelt fjernes fra stammen til brug ved de neden for beskrevne procedurer.

Alternativt kan der frembringes fjernelser ved hjælp af 2o midler tilvejebragt af opfindelsen til specifik spaltning af dobbeltstrenget DNA ved ethvert ønsket sted. Et eksempel på denne spaltningsteknik fremgår af del IV i forsøgskapitlet nedenfor. Således omdannes dobbeltstrenget DNA til enkeltstrenget DNA i området, der omgiver det på-25 tænkte spaltningspunkt, f.eks. ved reaktion med\-exonu-klease. En syntetisk eller anden enkeltstrenget DNA-primer hybridiseres derpå til den tidligere dannede enkeltstrengede længde ved Watson-Crick baseparring, idet primersekvensen er således, at det sikres, at dens 5’-3o ende vil stemme overens med nukleotidet på den første streng lige før det påtænkte spaltningspunkt. Primeren udstrækkes derpå i 31-retningen ved reaktion med DNA-polymerase under genskabelse af den del af den oprindelige dobbeltstrengede DNA før den påtænkte spaltning, 35 som blev tabt i det første trin. Samtidigt eller deref- 13 DK 173085 B1 ter fordøjes den del af den første streng, som ligger ud over det påtænkte spaltningspunkt, bort. Sammenfattende kan teknikken belyses, som følger, hvor "v" markerer det påtænkte spaltningspunkt: 5 a) .......v_ påtænkt spalt- ....... ningspunkt "v" B) .......v gjort enkeltstren- ....... get omkring "v" c) .......v_ primer-hybridi- 10 ....... . sering d) .......y_ forlængelse fra • · · · · * . -.^λ/χλλλμ . - — . . primer e) .......v enkeltstrengs- ....... nedbrydning 15 I den mest foretrukne udførelsesform gennemføres trin (d) og (e) samtidigt under anvendelse af en polymerase, som samtidigt fordøjer den udragende enkeltstrengede ende i 3' —*5'-retningen og udstrækker primeren (i nærvær af dATP, dGTP, dTTP og dCTP) i 5'—^31-retningen. Det foretrukne 20 materiale til dette formål er Klenow polymerase I, dvs. det fragment, der opnås ved proteolytisk spaltning af DNA-polymerase I, som indeholder udgangsenzymets 5'—*3'-polymeriserende aktivitet og 3»5'-exonukleolytiske aktivitet, men mangler dens 5'—>3’-exonukleolytiske aktivitet.

25 (Se A. Kornberg, DNA Synthesis, 98, W.H. Freeman and Co., SFO (1974)).

Under anvendelse af den netop beskrevne procedure kan dæmperfjernelser foretages på enhver ønsket måde i et trp-operon-indeholdende plasmid, der først er linearise- 14 DK 173085 B1 ret, f.eks. ved spaltning ved et restriktionssted neden for det punkt, ved hvilket molekylet skal gøres stump-endet ("v" ovenfor). Ringslutning igen efter fjernelsen af dæmperområdet kan f.eks. frembringes ved stump-ende-5 ligering eller andre måder, som vil være nærliggende for fagfolk.

Selv om opfindelsen omfatter direkte udtrykkelse af heterologt polypeptid under direktion af trp-promotor-operatoren, involverer det foretrukne tilfælde udtrykkelse af 10 sammensatte proteiner indeholdende både homologe og heterologe sekvenser, hvoraf de sidstnævnte fortrinsvis er specifikt fraspaltelige fra de førstnævnte i ekstracellulære miljøer. Særligt foretrukne er sammensatte proteiner, hvori den homologe del omfatter en eller flere aminosyrer 15 fra trp-leder-polypeptidet og omkring en trediedel eller mere af trp E amlnosyresekvensen (fjerne ende). Således fremstillede sammensatte proteiner viser sig at være bemærkelsesværdigt stabiliserede over for nedbrydning under udtrykkelsesbetingelser.

20 Bakterien E. coli K-12 stamme W3110 tna 2~trp"al02 (pGMl), ATCC nr. 31622 kan anvendes til at opformere lagre af pGMl-plasmidet, der fortrinsvis anvendes til konstruktion af de dæmper-manglende trp-promotor-operator-systemer ifølge opfindelsen. Denne stamme er fænotypisk trp+ i 25 nærvær af anthranilat og kan dyrkes i minimale medier, såsom LB suppleret med 50 /ug/ml anthranilat.

Alle bakteriestammer, der anvendes til trp-promotor-operator-dirigeret udtrykkelse ifølge opfindelsen, er trp-repressor+ ("trp R+"), som det er tilfældet med vildtype 30 E. coli, for at sikre undertrykkelse, indtil det er hensigten at frembringe heterolog udtrykkelse.

DNA-rekombination gennemføres i den foretrukne udførelses- 15 DK 173085 B1 form i E. coli, K-12 strain 294 (end A, thi , hsr , hsm*), ATTC nr. 31446, en bakteriestamme, hvis membrankarakteristika letter transformationer. Heterologt-polypeptid-produce-rende plasmider dyrket i stamme 294 ekstraheres på konven-5 tionel måde og holdes i opløsning (f.eks. 10 mM tris, 1 mM EDTA, pH 8) ved fra omkring -20°C til omkring 4°C. Til ud-trykkelse under industrielle betingelser foretrækkes på den anden side en mere hårdfør stamme, nemlig E. coli K-12 *”f“ RV 308 strr, gal 308“ ATCC nr. 31608. RV 308 er næ-10 ringsmæssigt vildtype og vokser godt i minimale medier, idet den syntetiserer alle nødvendige makromolekyler ud fra konventionelle blandinger af ammonium-, phosphat- og magnesiumsalte, spormetaller og glucose. Efter transformation af RV 308 kulturen med det fra stamme 294 afledte 15 plasmid udplades kulturen på medier, der er selektive for en markeringsegenskab (såsom antibiotisk resistens), der bæres af plasmidet, og en transformantkoloni opsamles og dyrkes i kolbekultur. Aliquots af sidstnævnte i 10% dimethyl sulfoxid- eller glycerolopløsning (i sterile Wheaton-20 ampuller) skalfryses i et ethanol/tøris-bad og fryses ved -80°C. Til fremstilling af det indkodede heterologe poly-peptid opdyrkes kulturprøverne i medier indeholdende tryp-tofan for således at undertrykke trp-promotor-operatoren, og systemet berøves derpå ekstra tryptofan for at frem-25 bringe udtrykkelse.

Til det første vækststadium kan man f.eks. anvende LB-medium (J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, 433, Cold Spring Harbor Laboratory 1972), som pr. liter vandig opløsning indeholder 10 g Bacto trypton, 5 g Bacto 30 gærekstrakt og 10 g NaCl. Fortrinsvis dyrkes podematerialet til en optisk tæthed ("o.t.") på 10 eller mere (ved 550 nm), mere foretrukkent til o.t. 20 eller mere, og mest foretrukkent til o.t. 30 eller mere, men dog til mindre end stationær fase.

35 Til derepression og udtrykkelse dyrkes podematerialet der- 16 DK 173085 B1 næst under betingelser, som berøver cellen tilsat trypto-fan. Et eksempel på et passende medium til sådan vækst er M9 (J.H. Miller, ovenfor side 431) fremstillet som følger (pr. liter): 5 KH2P04 3 g

Na2HP04 6 g

NaCl 0,5 g NH4C1 1 g autoklaver og tilsæt derpå: 10 10 ml 0,01 M CaCl2 1 ml 1 M MgS04 10 ml 20% glucose

Vitamin Bl 1 jug/ml "Humko hycase amino" 15 eller "DIFCO cas. amino acids" 40 jug/ml.

Aminosyresupplementet er et tryptofanfrit syrehydrolysat af casein.

For at påbegynde udtrykkelse af det heterologe polypeptid kan podematerialet, dyrket i tryptofanrigt medium, f.eks.

20 fortyndes ud i et større volumen medium, der ikke indeholder noget tilsat tryptofan, (f.eks. 2-10 ganges fortynding), opdyrkes til ethvert ønsket niveau (fortrinsvis kort før stationær vækstfase), og det søgte produkt opnås på konventionel måde ved lyse, centrifugering og rensning. I 25 vækststadiet uden tryptofan dyrkes cellerne fortrinsvis til en optisk tæthed på over 10, mere foretrukkent over 20 og mest foretrukkent på eller over 30 (alt ved 550 nm) før udvinding af produktet.

Alle DNA-rekombinationsforsøg, som er beskrevet i det efter-30 følgende forsøgsafsnit, blev udført hos Genentech Inc. i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide- 17 DK 173085 B1 lines for Recombinant DNA research.

I. Udtrykkelse af D-polypeptid-sammensat protein.

En foretrukken metode til udtrykkelse af sammensatte proteiner omfattende ønskede polypeptider og, sammensat 5 dermed, en del af trp D polypeptidets aminosyresekvens, som kan fraskilles in vitro på grund af en methionin-aminosyre, som er specifikt modtagelig for cyanbromid-spaltning, er beskrevet med henvisning til figur 1-3.

A. Konstruktion af pBRHtrp.

10 Plasmid pGMl (1, fig. 1) bærer E. coli tryptofan-operonet indeholdende fjernelsen aLEl413 (G.F. Miozzari et al., (1978) J. Bacteriologi 1457-1466) og udtrykker derfor et sammensat protein omfattende de første seks aminosyrer af trp-lederen og tilnærmelsesvis den sidste trediedel af 15 trp E polypeptidet (i det følgende betegnet som LE' i sammenskrivninger) såvel som trp D polypeptidet i dets helhed, alle under kontrol af trp-promotor-operator-systemet.

Plasmidet, 20 jug, blev fordøjet med restriktionsenzymet PvuII, som spalter plasmidet på fem steder. Genfragmen-20 terne 2 blev dernæst kombineret med EcoRI-tilknytnings- sekvenser (bestående af et selvkomplementært oligonukleo-tid 3 med sekvensen: pCATGAATTCATG), der indfører et EcoRI-spaltningssted for senere kloning ind i et plasmid indeholdende et EcoRI-sted (20). De 20 pg DNA-fragmenter 2, 25 opnået ud fra pGMl blev behandlet med 10 enheder T^-DNA- ligase i nærvær af 200 pmol af det 5'-phosphorylerede syntetiske oligonukleotid pCATGAATTCATG (3) og i 20 μΐ T^-DNA-ligase-puffer (20 mM tris, pH 7,6, 0,5 mM ATP, 10 mM MgC^* 5 mM dithiothreitol) ved 4°C natten over. Opløsningen blev 30 derpå opvarmet til 70°C i 10 minutter for at standse ligeringen. Tilknytningssekvenserne blev spaltet ved EcoRI-fordøjelse, og fragmenterne, nu med EcoRI-ender, blev skilt fra under anvendelse af 5% polyacrylamidgel-elektro- 18 DK 173085 B1 forese (i det følgende betegnet "PAGE"), og de tre største fragmenter blev isoleret fra gelen ved først at farve med ethidiumbromid, lokalisere fragmenterne med ultraviolet lys og udskære de interessante portioner 5 fra gelen. Hvert gelfragment blev med 300 μΐ 1:10 TBE anbragt i en dialysepose og underkastet elektroforese ved 100 V i en time i 1:10 TBE-puffer (TBE-puffer indeholder: 10,8 g tris-base, 5,5 g borsyre, 0,09 g Na2EDTA i 1 liter H20). Den vandige opløsning blev opsamlet fra 10 dialyseposen, ekstraheret med phenol, ekstraheret med chloroform og gjort 0,2 M med natriumchlorid, og DNA'en blev udvundet i vand efter ethanolfældning. [Alle DNA-fragment-isoleringer, som beskrives i det følgende, gennemføres under anvendelse af PAGE efterfulgt af den 15 netop omtalte elektroelueringsmetode]. Det trp-promotor- operator-holdige gen med EcoRI-klistrende ender 5 blev identificeret ved den neden for beskrevne procedure, som indebærer indsætningen af fragmenter i et tetracyclinfølsomt plasmid 6, som efter indsætning af promotor-ope-20 rator bliver tetracyclinresistent.

B. Skabelse af plasmidet pBRHtrp, der udtrykker tetra-cyclinresistens under kontrol af trp-promotor-operatoren, og identifikation og opformering af det under A. ovenfor isolerede trp-promotor-operator-holdige DNA-fragment 5.

25 Plasmid pBRHl (6), (R.I. Rodriquez et al., Nucleic Acids Research 6^, 3267-3287 [1979]) udtrykker ampic il linresistens og indeholder genet for tetracyclinresistens, men udtrykker ikke denne resistens, da der ikke er nogen tilknyttet promotor. Plasmidet er som følge deraf tetra-30 cyclinfølsomt. Ved indførelse af et promotor-operator sys tem i EcoRI-stedet kan plasmidet gøres tetracyclinresistent.

pBRHl blev fordøjet med EcoRI, og enzymet fjernet ved phenolekstraktion efterfulgt af chloroformekstraktion, 19 DK 173085 B1 og det spaltede plasmid blev udvundet i vand efter ethanol-fældning. Det resulterende DNA-molekyle 7 blev i separate reaktionsblandinger kombineret med hvert af de tre DNA-fragmenter opnået under A. ovenfor og ligeret med T^-DNA-5 ligase som tidligere beskrevet. Den i reaktionsblandingen tilstedeværende DNA blev anvendt til at transformere kompetent E. coli K-12 strain 294, K. Backman et al., Proc Nat'l Acad Sci USA 73, 4174-4198 [1976] (ATCC nr. 31448) ved standardteknik (V. Hershfiels et al., Proc Nat'l Acad 10 Sci USA 71, 3455-3459 [1974]), og bakterien udpladet på LB-plader indeholdende 20 pg/ml ampicillin og 5 pg/ml te-tracyclin. Flere tetracyclinresistente kolonier blev udvalgt, plasmid-DNA'en isoleret, og tilstedeværelsen af det ønskede fragment bekræftet ved restriktionsenzym-analyse.

15 Det resulterende plasmid 8, betegnet pBRHtrp, udtrykker β-lactamase, der giver ampicillinresistens, og det indeholder et DNA-fragment, der inkluderer trp-promotor-operato-ren og koder for et første protein omfattende en sammensætning af de første seks aminosyrer af trp-lederen og 20 tilnærmelsesvis den sidste trediedel af trp E polypepti-det (dette polypeptid betegnes LE') og et andet protein svarende tilnærmelsesvis til den første halvdel af trp D polypeptidet (dette polypeptid betegnes D') og et tredie protein, som der kodes for af tetracyclinresistens-genet.

25 C. Kloningsgener for forskellige slutprodukt-polypep-tider og udtrykkelse af disse som sammensatte proteiner omfattende slutproduktet og specifikt fraspaltelige trp D polypeptid-forstadier (figur 2).

Et DNA-fragment omfattende trp-promotor-operatoren og co-30 doner for LE'- og D'-polypeptiderne blev opnået ud fra plasmid pBRHtrp og indsat i plasmider indeholdende strukturgener for forskellige ønskede polypeptider, nedenfor eksemplificeret ved somatostatin (figur 2).

pBRHtrp blev fordøjet med EcoRI-restriktionsenzym, og det 20 DK 173085 B1 resulterende fragment 5 isoleret ved PAGE og elektroelue-ring. Et EcoRI-fordøjet plasmid pSom 11 (K. Itakura et al, Science 198, 1056 (1977); GB fremlæggelsesskrift nr.

2 007 676 A) blev kombineret med fragment 5. Blandingen 5 blev ligeret med T^-DNA-ligase som tidligere beskrevet, og den resulterende DKA transformeret ind i E. coll K-12 stamme 294 som tidligere beskrevet. Transformant-bakterier blev udvalgt på ampicillinholdige plader. De resulterende ampicillinresistente kolonier blev sigtet ved kolonihybri-10 disering (M. Gruenstein et al., Proc Nat'l Acad Sci USA 72, 3951-3965 [1975]), idet der som sonde anvendtes det trp-promotor-operator-indeholdende fragment 5 isoleret fra pBRHtrp, son var blevet radioaktivt mærket med P.

Flere kolonier, som viste sig at være positive ved koloni-15 hybridisering, blev udvalgt, plasmid-DNA blev isoleret, og orienteringen af de indsatte fragmenter bestemt ved restriktionsanalyse under anvendelse af restriktionsenzymer Bglll og BamHI i dobbelt nedbrydning. E. coli 294 indeholdende plasmidet, betegnet pS0M7 2, 11, som har trp- Λ 20 promotor-operator-fragmentet i den ønskede orientering, blev dyrket i LB-medium indeholdende 10 pg/ml ampicillin.

Cellerne blev dyrket til optisk tæthed 1 (ved 550 nm), opsamlet ved centrifugering og gensuspenderet i M9-medium i 10 ganges fortynding. Celler blev dyrket i 2-3 timer, 25 igen til optisk tæthed 1, derpå lyseret, og det totale celleprotein analyseret ved SDS (natriumdodecylsulfat)/ urinstof (15%)-polyacrylamidgel-elektroforese (J.V. Mai-zel Jr. et al., Meth Viral 5, 180-246 [1971]).

Figur 3 viser en proteingelanalyse, hvorved det totale 30 protein fra forskellige kulturer er separeret efter størrelse. Densiteten af de enkelte bånd afspejler den mængde, hvori de respektive proteiner er til stede. I figur 3 er bane 1 og 7 kontroller og omfatter en række forskellige proteiner af i forvejen bestemt størrelse, der tjener som 35 sammenligningspunkter. Bane 2 og 3 adskiller celleprotein fra kolonier af E. coli 294 transformeret med plasmid 21 DK 173085 B1 pSom7 Δ2 og dyrket 1 henholdsvis LB- (bane 2) og M9- (bane 3) medier. Bane 4 og 5 adskiller celleprotein opnået ud fra lignende celler transformeret ved plasmidet pTha7 &2r et thymosinudtrykkelsesplasmid opnået ved procedurer, som 5 i hovedsagen er identiske med de allerede beskrevne, begyndende med plasmidet pThal (se den til det offentlige overdragne US patentansøgning indleveret af Roberto Crea og Ronald B. Wetzel den 28. februar 1980 vedrørende fremstilling af thymosin al, og hvis indhold inddrages i den-10 ne beskrivelse som reference). Bane 4 adskiller celleprotein fra E. coli 294/pTha7 δ2 dyrket i LB-medium, medens bane 5 adskiller celleprotein fra den samme transformant dyrket i M9-medium. Bane 6, en anden kontrol, er proteinmønstret af E. coli 294/pBR322 dyrket i LB-medium.

15 Sammenligning med kontrollerne viser, at det øverste af de to mest fremtrædende bånd i hver af banerne 3 og 5 er proteiner af en størrelse, som forventes i tilfælde af udtrykkelse af et sammensat protein omfattende D'-poly-peptidet og henholdsvis somatostatin og thymosin (det 20 andet fremtrædende bånd repræsenterer LE'-polypeptidet resulterende fra fjernelse af dæmperen). Figur 3 bekræfter, at udtrykkelse undertrykkes i tryptofanrige medier, men at undertrykkelsen ophæves under tryptofanmangel-betingelser.

25 D. Cyanbromidspaltning og radioimmunoprøvning for hormonprodukt.

I både thymosin- og somatostatin-tilfældet blev det totale celleprotein cyanbromidspaltet, og spaltningsproduktet blev udvundet og efter tørring gensuspenderet i puf-30 fer og analyseret ved radioimmunoprøvning, hvilket bekræftede udtrykkeisen af et produkt, som var immunologisk identisk med henholdsvis somatostatin og thymosin. Cyan-bromidspaltningen gennemførtes som beskrevet i D.V. Goeddel et al., Proc Nat'l Acad Sci USA 7£, 106-110 [1979].

22 DK 173085 B1 II. Konstruktion af plasmider til direkte udtrykkelse af heterologe gener under kontrol af trp-promotor-operator-sys teinet.

Strategien for direkte udtrykkelse indebar skabelse af et 5 plasmid indeholdende et enestående restriktionssted fjernt fra alle kontrolelementer af trp-operonet, til hvilket heterologe gener kunne klones i stedet for trp-ledersekvensen og i rigtigt rumligt forhold til trp-lederpolypeptidets ribosombindingssted. Metoden til di-10 rekte udtrykkelse eksemplificeres nedenfor ved udtrykkelse af humant væksthormon.

Plasmidet pSom7 &2, 10 pg, blev spaltet med EcoRI, og DNA-fragmentet 5 indeholdende de genetiske tryptofanelementer blev isoleret ved PAGE og elektroeluering. Dette frag-15 ment, 2 pg, blev nedbrudt med restriktionsendonukleasen

Taq I, 2 enheder, 10 minutter ved 37°C, således at i gennemsnit kun et af de tilnærmelsesvis fem Tag I steder i hvert molekyle spaltes. Denne delvis nedbrudte blanding af fragmenter blev adskilt ved PAGE, og et fragment 12 20 (fig. 4) på tilnærmelsesvis 300 basepar, som indeholdt en EcoRI-ende og en Taq I ende, blev isoleret ved elektroeluering. Det tilsvarende Taq I sted er lokaliseret mellem transkriptionsstart- og translationsstart-stederne og er fem nukleotider oven for trp-lederpeptidets ATG-codon.

25 DNA-sekvensen omkring dette sted er vist i figur 4. Ved at gå frem som beskrevet kunne der isoleres et fragment indeholdende alle trp-operonets kontrolelementer, dvs. promotor-opera tor-system, transkriptions-startsignal og trp-1eder-ribosombindingssted.

30 Taq I resten ved 3'-enden af det resulterende fragment op til translations-startsignalet for trp-ledersekvensen blev dernæst omdannet til et Xbal-sted som vist i figur 5.

Dette blev gjort ved ligering af det oven for fremstillede fragment 12 til et plasmid indeholdende et enkelt EcoRI- 23 DK 173085 B1 sted og et enkelt Xbal-sted. Til dette formål kan man anvende i hovedsagen ethvert plasmid, som i rækkefølge indeholder et replicon, en selekterbar markeringsegenskab, såsom antibiotisk resistens, og EcoRI-, Xbal- og 5 BamHI-steder. Således kan f.eks. et Xbal-sted indføres mellem EcoRI- og BamHI-stederne i pBR322 (F. Bolivar et al., Gene 2, 95-119 [1977], f.eks. ved spaltning af plasmidets enkelte Hind III sted med Hind III efterfulgt af enkeltstrengsspecifik nukleasenedbrydning af de re-10 suiterende klistrede ender og stumpende-ligering af et selvsammensmeltende dobbeltstrenget syntetisk nukleotid indeholdende genkendelsesstedet, såsom CCTCTAGAGG. Alternativt kan der anvendes naturligt afledte DNA-fragmenter, som i det foreliggende tilfælde, der indeholder et enkelt 15 Xbal-sted mellem EcoRI- og BamHI-spaltningsrester. Således blev der opnået et EcoRI- og BamHI-nedbrydningsprodukt af det virale genom af hepatitis B ved konventionelle midler, og det blev klonet ind i EcoRI- og BamHI-stederne af plasmidet pGH6 (D.V. Goeddel et al., Nature 281, 544 [1979]) 20 til dannelse af plasmidet pHS32. Plasmid pHS32 blev spaltet med Xbal, phenolekstraheret, chloroformekstraheret og ethanolfældet. Det blev derpå behandlet med 1 μΐ E. coli polymerase I, Klenow-fragment (Boehringer-Mannhein) i 30 μΐ polymerasepuffer (50 mM kaliumphosphat pH 7,4, 7 mM 25 MgCl2, 1 mM (3-mercaptoethanol) indeholdende 0,1 mM dTTP og 0,1 mM dCTP i 30 minutter ved 0°C og derpå i 2 timer ved 37°C. Denne behandling får 2 af de 4 til Xbal-spalt-ningssbedets udragende 5'-ende komplementære nukleotider til at fyldes ind: 30 5’ CTAGA- 5' CTAGA- -p 3' T- 3« TCT-

To nukleotider, dC og dT, blev inkorporeret til dannelse af en ende med to S'-udragende nukleotider. Denne lineære rest af plasmid pHS32 (efter phenol- og chloroformekstrak- 24 DK 173085 B1 tion og udvinding i vand efter ethanolfældning) blev spaltet med EcoRI. Det store plasmidfragment 13 blev adskilt fra det mindre EcoRI-Xbal-fragment ved PAGE og isoleret efter elektroeluering. Dette DNA-fragment fra 5 pHS32 (0,2 /ug) blev under lignende betingelser som dem, der er beskrevet ovenfor, ligeret til EcoRI-Taq I fragmentet af tryptofan-operonet (ca. 0,01 μg) som vist i figur 5. Ved denne proces ligeres den udragende Taq I ende til den resterende udragende Xbal-ende, selv om den 10 ikke bliver fuldstændigt Watson-Crick baseparret: -T CTAGA- -TCTAGA- + -» -AGC TCT- -AGCTCT-

En portion af denne ligeringsreaktionsblanding blev transformeret ind i E. coli 294 celler som i del I. ovenfor, 15 varmebehandlet og udpladet på LB-plader indeholdende ampi-cillin. Der blev udvalgt 24 kolonier, som blev dyrket i 3 ml LB-medium og plasmid-isoleret. Seks af disse fandtes at have Xbal-stedet regenereret via E. coli katalyseret DNA-reparation og replikering: 20 -TCTAGA- -TCTAGA- -p -AGCTCT- -AGATCT-

Disse plasmider fandtes også at spaltes både med EcoRI og Hpal og at give de forventede restriktionsfragmenter. Et plasmid 14, betegnet pTrp 14, blev anvendt til udtrykkelse 25 af heterologe polypeptider som omtalt nedenfor.

Plasmidet pHGH 107 (18 i figur 6, D.V. Goeddel et al, Nature, 281, 544, 1979) indeholder et gen for humant væksthormon opbygget af 23 aminosyrecodoner produceret ud fra syntetiske DNA-fragmenter og 163 aminosyrecodoner opnået 30 fra komplementært DNA fremstillet ved omvendt transkrip-tion af budbringer-RNA for humant væksthormon. Dette gen 25 DK 173085 B1 21 indeholder, selv om det mangler codonerne for "præ"-sekvensen af humant væksthormon, en ATG-translations-start-codon. Genet blev isoleret fra 10 ug pHGH 107 efter behandling med EcoRI efterfulgt af E. coli poly-5 merase I Klenow-fragment og dTTP og dATP som beskrevet ovenfor. Efter phenol- og chloroformekstraktion og ethanol-fældning blev plasmidet behandlet med BamHI.

Se figur 6. Fragmentet 21 indeholdende genet for humant væksthormon ("HGH") blev isoleret ved PAGE efterfulgt af 10 elektroeluering. Det resulterende DNA-fragment indeholder også de første 350 nukleotider af tetracyclinresistens-strukturgenet, men mangler tetracyclin-promotor-operator-systemet, således at man, når det derefter klones ind i et udtrykkelsesplasmid, kan lokalisere plasmider indehol-15 dende indsætningen ved genoprettelsen af tetracyclinresi-stens. Fordi EcoRI-enden af fragmentet 21 er blevet fyldt ud ved Klenow-polymerase I proceduren, har fragmentet en stump og en klistrende ende, hvilket sikrer rigtig orientering, når det senere indsættes i et udtrykkelses-20 plasmid. Se figur 6.

Udtrykkelsesplasmidet pTrpl4 blev dernæst prepareret til at modtage det oven for fremstillede fragment indeholdende HGH-genet. Således blev pTrpl4 nedbrudt med Xbal, og de resulterende klistrende ender fyldt ud ved Klenow-polyme-25 rase I proceduren under anvendelse af dATP, dTTP, dGTP og dCTP. Efter phenol- og chloroformekstraktion og ethanol-fældning blev den resulterende DNA 16 behandlet med BamHI, og det resulterende store plasmidfragment 17 isoleret ved PAGE og elektroeluering. Det pTrpl4-afledte fragment 17 30 havde en stump og en klistrende ende, hvilket muliggjorde rekombination i rigtig orientering med det tidligere beskrevne fragment 21 indeholdende HGH-genet.

HGH-gen-fragmentet 21 og pTrpl4 Xba-BamHI-fragmentet 17 blev kombineret og ligeret sammen under lignende betingel-35 ser, som dem, der er beskrevet ovenfor. De udfyldte Xbal- 26 DK 173085 B1 og EcoRI-ender ligeredes sammen ved stumpende-ligering til gendannelse af både Xbal- og EcoRI-stedet:

Xbal fyldt ud EcoRI fyldt ud HGH-gen-start -TCTAG AATTCTATG- -ljcTA(^ATTCTATG- 5 -AGATC TTAAGATAC- -AGATCfTTA^GATAC-

Xbal EcoRI

Denne konstruktion genstaber også tetracyclinresistens-genet. Da plasmidet pHGH 107 udtrykker tetracyclinresi-stens fra en promotor liggende oven for HGH-genet (lac-10 promotoren), muliggør denne konstruktion 22, betegnet pHGH 207, udtrykkelse af genet for tetracyclinresistens under kontrol af tryptofan-promotor-operatoren. Således blev ligeringsblandingen transformeret ind i E. coli 294, og kolonier blev udvalgt på LB-plader indeholdende jug/ml 15 tetracyclin.

For at bekræfte den direkte udtrykkelse af humant væksthormon fra plasmid pHGH 207 blev det totale celleprotein fra E. coli 294/pHGH 207, som var blevet dyrket til optisk tæthed 1 i LB-medium indeholdende 10 (jg/ml ampicillin og 20 fortyndet 1:10 i M9-medium og dyrket igen til optisk tæthed 1, underkastet SDS-gelelektroforese som i I. ovenfor og sammenlignet med tilsvarende elektroforesedata opnået for humant væksthormon som tidligere udtrykt af andre (D.v. Goeddel et al, Nature 281, 544 (1979)). Figur 7 er 25 et fotografi af den resulterende farvede gel, hvori:

Bane 1 og 7 indeholder proteinmarkører af forskellige kendte størrelser; bane 2 er en kontrol, som adskiller det totale celleprotein af E. coli stamme 294 pBR322; bane 3 adskiller protein fra E. coli 294/pHGH 107 dyrket i 30 LB-medium; bane 4 adskiller protein fra E. coli 294/pHGH

107 dyrket i M9-medium; bane 5 adskiller protein fra E. coli 294/pHGH 207 dyrket i LB-medium; og bane 6 adskiller protein fra E. coli 294/pHGH 207 dyrket i M9-medium. Det tæt- 27 DK 173085 B1 te bånd i bane 6 er humant væksthormon, som vist ved sammenligning med lignende bånd i bane 2-4. Som forudsagt ifølge opfindelsen producerer organismen E. coli 294/pHGH 207, når den dyrkes i tryptofanrigt LB-medium, mindre hu-5 mant væksthormon på grund af tryptofan-repressor-operator-samvirken, og producerer, når den dyrkes i M9-medium, betydeligt mere HGH end E. coli 294/pHGH 107 på grund af indførelsen af det stærkere tryptofan-promotor-operator-system fremfor lac-promotor-operator-systemet i pHGH 107.

10 III. Skabelse af et alment udtrykkelsesplasmid til direkte udtrykkelse af heterologe gener under kontrol af tryptofan-promotor-operatoren.

Plasmidet pHGH 207, skabt i det forudgående afsnit, blev dernæst anvendt til at opnå et DNA-fragment indeholdende 15 kontrolelementerne af tryptofan-operonet (med dæmperen fjernet) og skabe en plasmid-"udtrykkelsesvektor", som er egnet til direkte udtrykkelse af forskellige strukturgen-indsætninger. Strategien for skabelse af det almene udtrykkelsesplasmid involverede fjernelse af tryp-20 tofan-kontrolområdet fra pHGH 207 ved EcoRI-nedbrydning og indsætning i det EcoRI-nedbrudte plasiaid pBRHl, anvendt i del I. ovenfor. pBRHl er, som tidligere anført, et ampicillinresistent plasmid indeholdende tetracyclin-resistensgenet, men er tetracyclinfølsomt på grund af 25 fraværet af et egnet promotor-operator-system. Det resulterende plasmid, pHKY 1, hvis konstruktion er nærmere beskrevet nedenfor og vist i figur 8, er både ampi-cillin- og tetracyclinresistent, indeholder tryptofan-promo tor-opera tor-sys ternet, mangler tryptofan-daanperen 30 og indeholder et enkelt Xbal-sted fjernt fra tryptofan-promotor-operatoren. Tryptofan-promotor-operatoren og det enkelte Xbal-sted grænser op til EcoRI-steder, således at det promotor-operator-Xbal-indeholdende fragment kan fjernes til indsætning i andre strukturgen-indeholdende 35 plasmider. Alternativt kan heterologe strukturgener ind- 28 DK 173085 B1 sættes, enten i Xbal-stedet eller (efter delvis EcoRI-nedbrydning) i EcoRI-stedet fjernt fra tryptofan-kontrol-orarådet, 1 hvert tilfælde således, at det kommer under kontrol af tryptofan-promotor-operator-systernet.

5 Plasmid pHGH 207 blev EcoRI-nedbrudt, og trp promotoren indeholdende EcoRI-fragment 23 udvundet ved PAGE efterfulgt af elektroeluering.

Plasmid pBRHl blev EcoRI-nedbrudt, og de spaltede ender behandlet med bakteriel alkalisk phosphatase ("BAP") 10 (1 pg, i 50 mM tris pH 8 og 10 mM MgCl2 i 30 minutter ved 65°C) for at fjerne phosphatgrupperne på de udragende EcoRI-ender. Overskud af bakteriel alkalisk phosphatase blev fjernet ved phenolekstraktion, chloroform-ekstraktion og ethanolfældning. Den resulterende line-15 ære DNA 7a vil, fordi den mangler phosphater på sine udragende ender, ved ligering kun acceptere indsætninger, hvis komplementære klistrende ender er phosphoryleret, men vil ikke selv recirkularisere, hvilket tillader en lettere sigtning for plasmider indeholdende indsætnin-20 gerne. EcoRI-fragmentet afledt fra pHGH 207 og den lineære DNA opnået ud fra pBRHl blev kombineret i nærvær af T^-ligase som tidligere beskrevet og ligeret. En portion af den resulterende blanding blev transformeret ind i E. coli stamme 294 som tidligere beskrevet, bakterien 25 blev udpladet på LB-medium indeholdende 5 |ug/ml tetra-cyclin, og 12 tetracyclinresistente kolonier blev udvalgt. Plasmid blev isoleret fra hver koloni og undersøgt for tilstedeværelse af en DNA-indsætning ved restrik-tionsendonuklease-analyse under anvendelse af EcoRI og 30 Xbal. Et plasmid indeholdende indsætningen blev betegnet pHKYl.

IV. Skabelse af et plasmid indeholdende tryptofan-operonet, som er i stand til at udtrykke et specifikt spalteligt og sammensat protein omfattende 6 aminosyrer 29 DK 173085 B1 af trp-lederpeptidet og den sidste trediedel af trp E polypeptidet (betegnet LE*) og et heterologt strukturgenprodukt.

Strategien for skabelsen af et plasmid, der udtrykker et 5 LE'-sammensat protein, indebar de følgende trin: a. Tilvejebringelse af et genfragment omfattende codoner for det fjerne område af LE *-polypeptidet med henholdsvis Bgl II og EcoRI-klistrende ender ved 51- og 3’-enden af kodningsstrengen; 10 b. Eliminering af codonerne fra det fjerne område af LE'-genfragmentet og codonerne for trp D genet fra plasmid Som7 42 og indsætning af det i trin 1 dannede fragment, rekonstituering af LE'-codon-sekvensen umiddelbart oven for sekvensen for det 15 heterologe gen for somatostatin.

1. Med henvisning til figur 9 (a) blev plasmid pSom7 Δ2 nedbrudt med Hind III efterfulgt af nedbrydning med^-exonuklease (en 5' til 3' exonuklease) under betingelser udvalgt således, at der nedbrydes ud over Bgl II restrik-20 tionsstedet i LE'-indkodningsområdet. 20 ^ug Hind III- nedbrudt pSom7 42 blev opløst i puffer [20 mM glycinpuf-fer, pH 9,6, 1 mM MgCl2, 1 mM β-mercaptoethanol]. Den resulterende blanding blev behandlet med 5 enheder A-exonuklease i 60 minutter ved stuetemperatur. Den opnåede 25 reaktionsblanding blev derpå phenolekstraheret, chloro-formekstraheret og ethanolfældet.

For til sidst at skabe en EcoRI-rest ved den fjerne ende 32 af LE'-genfragmentet blev en primer PCCTGTGCATGAT syntetiseret ved den forbedrede phosphotriestermetode (R.

30 Crea et al., Proc Nat'l Acad Sci USA T5 5765 [1978]) og hybridiseret til den enkeltstrengede ende af LE'-genfragmentet resulterende fra ?^-exonuklease-nedbrydningen. Hy- DK 173085 Bl 30 bridiseringen blev gennemført som beskrevet nedenfor.

20 pg af det λ-exonuklease-behandlede Hind III nedbrydningsprodukt af plasmid pSom7 Δ2 blev opløst i 20 μΐ vand og kombineret med 6 μΐ af en opløsning indeholdende 5 tilnærmelsesvis 80 pmol af det oven for beskrevne 5'-phosphorylerede oligonukleotid. Det syntetiske fragment blev hybridiseret til 3'-enden af LE'-kodningssekvensen, og den resterende enkeltstrengsdel af LE'-fragmentet blev udfyldt ved den oven for beskrevne Klenow-10 polymerase I procedure under anvendelse af dATP, dTTP, dGTP og dCTP.

Reaktionsblandingen blev opvarmet til 50°C og fik lov at afkøles langsomt til 10°C, hvorefter der tilsattes 4 pi

Klenow-enzym. Efter 15 minutters inkubation ved stue- 15 temperatur efterfulgt af 30 minutters inkubation ved 37°C blev reaktionen stoppet ved tilsætning af 5 μΐ 0,25 molær EDTA. Reaktionsblandingen blev phenolekstra- heret, chloroformekstraheret og ethanolfældet. DNA'en blev derpå spaltet med restriktionsenzymet Bgl II. Frag- 20 menterne blev adskilt ved PAGE. Et autoradiogram opnået 32 ud fra gelen afslørede et P-mærket fragment af den forventede længde på tilnærmelsesvis 470 basepar, som blev udvundet ved elektroeluering. Som skitseret har dette fragment LE' (d) en Bgl II ende og en stump ende, der 25 stemmer overens med begyndelsen af primeren.

Plasmidet pThal, beskrevet i del I (C.) ovenfor, bærer et strukturgen for thymosin al klonet ved sin 5'-kodnings streng-ende ind i et EcoRI-sted og ved sin 3'-ende ind i et BamHI-sted. Som vist i figur 9 indeholder thy-30 mosingenet ligeledes et Bgl II sted. Plasmidet pThal indeholder også et gen, som specificerer ampicillinresi-stens. For at skabe et plasmid, som er i stand til at acceptere det oven for fremstillede LE' (d)-fragment blev pThal EcoRI-nedbrudt efterfulgt af Klenov? polyme- 31 DK 173085 B1 rase I reaktion med dTTP og dATP for at gøre EcoRI-resterne stumpe. Bgl II nedbrydning af det resulterende produkt skabte et lineært DNA-fragment 33 indeholdende genet for ampicillinresistens og ved dets modsatte ender 5 en klistrende Bgl II rest og en stump ende. Det resul-terende produkt kunne recirkulariseres ved omsætning med LE' (d)-fragmentet indeholdende en Bgl II klistrende, ende og en stump ende i nærvær af T^-ligase til dannelse af plasmidet pTrp24 (fig. 9b). Herved genskabes et 10 EcoRI-sted ved den position, hvor stump-ende-ligeringen foregik.

Med henvisning til figur 10 giver successiv nedbrydning af pTrp24 med Bgl II og EcoRI efterfulgt af PAGE og elek-troeluering et fragment indeholdende codoner for LE'(d)-15 polypeptidet med en Bgl II klistrende ende og en EcoRI klistrende ende op til dets 3'-kodningsende. LE'(d)- fragmentet 38 kan klones ind i Bgl II stedet af plasmid pSom7 Λ 2 til dannelse af et LE'-polypeptid/somatostatin-sammensat protein udtrykt under kontrol af tryptofan-20 promotor-operatoren som vist i figur 10. Dette kræver (1) delvis EcoRI-nedbrydning af pSom7 Δ2 for at spalte EcoRI-stedet fjernt fra tryptofan-promotor-operatoren som vist i figur 10 og (2) rigtigt valg af primersekvensen (figur 9) for at opretholde den rette codonaflæsnings-25 ramme og genskabe et EcoRI-spaltningssted.

Således blev 16 /ug plasmid pSom7 4 2 fortyndet ud i 200 pi puffer indeholdende 20 mM Tris, pH 7,5, 5 mM MgC^/ 0,02 NP40-detergens, 100 mM NaCl og behandlet med 0,5 enheder EcoRI. Efter 15 minutter ved 37°C blev reaktions-30 blandingen phenolekstraheret, chloroformekstraheret og ethanolfældet og derpå nedbrudt med Bgl II. Det resulterende større fragment 36 blev isoleret ved PAGE-proce-duren efterfulgt af elektroeluering. Dette fragment indeholder codonerne "LE'(p)" for den nære ende af LE'-35 polypeptidet, dvs. codonerne oven for Bgl II stedet.

32 DK 173085 B1

Fragmentet 36 blev dernæst ligeret til fragmentet 38 i nærvær af T^-DNA-ligase til dannelse af plasmidet pSom7 Δ2ύ4, som efter transformation ind i E. coli stamme 294, som tidligere beskrevet, effektivt produ-5 cerede et sammensat protein bestående af det fuldt rekonstituerede LE'-polypeptid og somatostatin under kontrol af tryptofan-promotor-operatoren. Det sammensatte protein, hvorfra somatostatinet kan spaltes specifikt på grund af tilstedeværelsen af methionin ved 5'-enden 10 af somatostatinsekvensen, blev segregeret ved SDS- polyacrylamidgel-elektroforese som tidligere beskrevet.

Det sammensatte proteinprodukt er det mest distinkte bånd i bane 6 på figur 11, som omtalt mere detaljeret i del VI nedenfor.

15 V. Skabelse af et udtrykkelsessystem for trp-LE'- polypeptid-sammensætninger, hvori tetracyclinresistens anbringes under kontrol af tryptofan-promotor-operatoren.

Strategien for skabelse af et udtrykkelsesmedium, som er i stand til at modtage en lang række forskellige gener 20 for heterologt polypeptid til udtrykkelse som trp LE'-sammensatte proteiner under kontrol af tryptofan-opero-net, indebar konstruktion af et plasmid med de følgende egenskaber: 1. Tetracyclinresistens, som ville tabes i tilfælde 25 af, at det promotor-operator-system, som kontrol lerer generne, der specificerer en sådan resistens, blev bortskåret.

2. Fjernelse af promotor-operator-systemet, som kontrollerer tetracyclinresistens, og recirkulari- 30 sering ved ligering til et heterologt gen og et tryptofan-promotor-operator-system i rigtig aflæsningsfase med hensyn dertil, hvorved tetra-cyclinresistensen genskabes og således tillader 33 DK 173085 B1 identificering af plasmider indeholdende den heterologe genindsætning.

I korthed og i overensstemmelse med arten af de påtænkte indsætninger var formålet at skabe et lineært stykke 5 DNA, som har en Pst-rest ved 3'-enden og en Bgl II rest ved 5'-enden, grænsende op til et gen, som er i stand til at specificere tetracyclinresistens, når det bringes under kontrol af et promotor-operator-system.

Med henvisning til figur 12 blev plasmidet pBR322 ned-10 brudt med Hind III, og de udragende Hind III ender igen nedbrudt med Sl-nuklease. Sl-nuklease-nedbrydningen involverede behandling af 10 pg Hind III spaltet pBR322 i 30 pi Sl-puffer (0,3 M NaCl, 1 mM ZnC^, 25 mM natrium acetat, pH 4,5) med 300 enheder Sl-nuklease i 30 minutter 15 ved 15°C. Reaktionen blev stoppet ved tilsætning af 1 pi 30 X Sl-nuklease-stop-opløsning (0,8 M tris-base, 50 mM EDTA). Blandingen blev phenolekstraheret, chloro-formekstraheret og ethanolfældet og derpå EcoRI-nedbrudt som tidligere beskrevet, og det store fragment 46 blev 20 opnået ved PAGE-procedure efterfulgt af elektroeluering.

Det opnåede fragment har en første klistrende EcoRI-ende og en anden stump ende, hvis kodningsstreng begynder med nukleotidet thymidin. Som det vil blive vist i det følgende, kan den Sl-nedbrudte Hind III rest begyndende med 25 thymidin forbindes med en Klenow-polymerase I behandlet

Bgl II rest, således at Bgl II restriktionsstedet gendannes ved ligering.

Plasmid pSom7 Δ2, som fremstillet i del I ovenfor, blev nedbrudt med Bgl II, og de resulterende klistrende Bgl II 30 ender blev gjort dobbeltstrengede ved Klenow-polymerase I proceduren under anvendelse af alle fire deoxynukleotid-triphosphater. EcoRI-spaltning af det resulterende produkt efterfulgt af PAGE og elektroeluering af det lille fragment 42 gav et lineært stykke DNA indeholdende tryp- 34 DK 173085 B1 tofan-promotor-operatoren og codoner for den "nære" LE'-sekvens oven for Bgl II stedet ("LE1(p)"). Produktet havde en EcoRI-ende og en stump ende resulterende fra udfyldning i Bgl II stedet. Imidlertid gendannes 5 Bgl II stedet ved ligering af den stumpe ende af fragment 42 til den stumpe ende af fragment 46. Således blev de to fragmenter ligeret i nærvær af T4~DNA-ligase til dannelse af det recirkulariserede plasmid pHKY 10 (se figur 12), som blev opformeret ved transformation 10 ind i kompetente celler af E. coli stamme 294. Tetra-cyclinresistente celler bærende rekombinant-plasmidet pHKY 10 blev opdyrket, plasmid-DNA’en ekstraheret og på sin side nedbrudt med Bgl II og Pst efterfulgt af isolering ved PAGE-proceduren og elektroeluering af det 15 store fragment, et lineært stykke DNA med klistrende Pst-og Bgl II ender. Dette DNA-fragment 49 indeholder re-plikationsoriginet og viste sig derefter nyttigt som en første komponent i konstruktionen af plasmider, hvor begge generne, der koder for trp-LE'-polypeptid-sammen-20 satte proteiner og tet-resistens-genet kontrolleres af trp-promotor-operatoren.

Plasmidet pSom7 Δ2λ4, fremstillet i del IV, kunne manipuleres til at give en anden komponent til et system, som er i stand til at modtage en lang række forskellige 25 heterologe strukturgener. Med henvisning til figur 13 blev plasmidet underkastet delvis EcoRI-nedbrydning {se del IV) efterfulgt af Pst-nedbrydning, og fragmentet 51 indeholdende trp-promotor-operatoren blev isoleret ved PAGE-proceduren efterfulgt af elektroeluering. Delvis 30 EcoRI-nedbrydning var nødvendig for at opnå et fragment, som blev spaltet op til 5'-enden af somatostatin-genet, men ikke spaltet ved EcoRI-stedet mellem ampicillin-resistens-genet og trp-promotor-operatoren. Ampicillin-resistensen, som var tabt ved Pst I klipningen i apR-35 genet, kunne genoprettes ved ligering med fragment 51.

35 DK 173085 B1 I en første påvisning blev den tredie komponent, et strukturgen for thymosin α-l, opnået ved EcoRI- og BamHI-nedbrydning af plasmid pThal. Fragmentet 52 blev renset ved PAGE og elektroeluering.

5 De tre genfragmenter, 49, 51 og 52 kunne nu ligeres sammen i rigtig orientering, som afbildet i figur 13, til dannelse af plasmidet pTha7ala4 , som kunne selekteres på grundlag af genoprettelsen af ampicillin- og tetracyclinresistensen. Plasmidet udtrykte, når det 10 blev transformeret ind i E. coli stamme 294 og opdyrket under betingelser som dem, der er beskrevet i del I, et trp-LE'-polypeptid-sammensat protein, hvorfra thymosin al kunne fraspaltes specifikt ved behandling med cyan-bromid. Når andre heterologe strukturgener indeholdende 15 EcoRI- og BamHI-ender på lignende måde blev ligeret med de fra pHKYlO og pSom7 Δ2Δ4 afledte komponenter, blev der ligeledes effektivt opnået trp-LE’-polypeptid-sammen-satte proteiner indeholdende polypeptiderne, for hvilke de pågældende heterologe gener koder. Figur 1 belyser 20 en adskillelse ved SDS-polyacrylgel-elektroforese af det totale celleprotein fra E. coli stamme 294 transformanter, hvor det mørkeste bånd i hvert tilfælde repræsenterer det sammensatte proteinprodukt fremstillet under kontrol af tryptofan-promotor-operator-systemet. I figur 11 er bane 25 1 en kontrol, som segregerer det totale celleprotein fra E. coli 294/pBR322. Bane 2 indeholder det somatostatin-sammensatte produkt fra plasmid pSom7 4244 fremstillet i del IV. Bane 3 er det somatostatin-indeholdende udtryk-kelsesprodukt af pSom7 41Δ4. Bane 4 indeholder udtryk-30 kelsesproduktet af pTha74l44 , medens bane 5 indeholder produktet udtrykt fra et plasmid opnået, når de oven for omtalte fragmenter afledt af pHKYlO og pSom74244 blev ligeret med et EcoRI/BamHI-afsluttet strukturgen, som koder for humant proinsulin og fremstillet af visse af op-35 finderne. Bane 6 og 7 indeholder som det mørkeste bånd henholdsvis et trp-LE’-polypeptid-sammensat protein, 36 DK 173085 B1 hvorfra der kan fraspaltes B- og A-kæden af humant insulin. Insulin-B-kæde- og A-kæde-strukturgenerne blev opnået ved EcoRI- og BamHI-nedbrydning af plasmiderne henholdsvis pIBl og pIAll, hvis konstruktion er angivet 5 i D.V. Goeddel et al., Proc Nat'l Acad Sci USA, 76, 106 [1979]. Bane 8 indeholder størrelsesmarkeringsmidler som før.

Selv om opfindelsen i dens mest foretrukne udførelsesform er beskrevet med henvisning til E. coli, kunne andre 10 enterobacteriaceae ligeledes tjene som værtsceller for udtrykkelse og som kilder til trp-operoner, og som eksempler på sådanne kan nævnte Salmonella typhimurium og Serratia marcescens. Således er opfindelsen ikke begrænset til de beskrevne foretrukne udførelsesformer, men 15 kun af omfanget af de efterfølgende patentkrav.

Claims (26)

37 DK 173085 B1

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptidprodukt ved 5 udtrykkelse i bakterier af et strukturgen, som koder derfor, kendetegnet ved, (a) at der tilvejebringes et bakteriepodningsmateriale transformeret med en replikerbar plasmidisk 10 udtrykkelsesvektor indeholdende en sekvens af dobbeltstrenget DNA, hvis kodningsstreng omfatter fase fra en første 5’-ende til en anden 3'-ende af elementerne: (i) et bakterielt trp-promotor-operator-system; 15 (ii) nukleotider, der koder for et ribosombindingssted til translation af element (iv); (iii) nukleotider, der koder for et 20 translationsstartsignal til translation af element (iv); og (iv) et strukturgen, der har indkodet aminosyresekvensen af et heterologt polypeptid; 25 hvilken sekvens hverken omfatter nogen trp-dæmpningsevne eller nukleotider, der koder for trp E ribosombindingsstedet; (b) at det transformerede podemateriale anbringes i et gærkar 30 og dyrkes til et forud fastsat niveau i et egnet næringsmedium indeholdende en tilstrækkelig mængde tilsat tryptofan til at undertrykke det nævnte promotor-operator-system; og 35 (c) at bakterien berøves denne tilsætning, således at systemet de-undertrykkes og der sker udtrykkelse af det produkt, for hvilket strukturgenet koder. 38 DK 173085 B1

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det polypeptid, der udtrykkes af strukturgenet, er fuldstændigt heterologt.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det udtrykte polypeptid er et sammensat protein omfattende et heterologt polypeptid og mindst én portion af aminosyresekvensen af et homologt polypeptid. 10

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den nævnte portion er en portion af aminosyresekvensen af et enzym, der er involveret i den biosyntetiske reaktionsfølge fra chorisminsyre til 15 tryptofan.

5 A-kæden af humant insulin og B-kæden af humant insulin.

5 A-kæden af humant insulin og B-kæden af humant insulin.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det heterologe polypeptid er et bioaktivt polypeptid, og at det tilknyttede homologe 20 polypeptid er et specifikt fraspalteligt bioinaktiverende polypeptid.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det homologe polypeptid er trp 25 E polypeptidet, og det nævnte ribosombindingssted er ribosombindingsstedet for trp-lederpolypeptidet.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det homologe polypeptid er trp 30 D polypeptidet.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det sammensatte protein består af et heterologt polypeptid og et homologt polypeptid, som i 35 sig selv udgør en sammensætning af omkring de første seks aminosyrer af trp-lederpolypeptidet og aminosyresekvensen indkodet af mindst omkring den fjerne tredjedel af trp E polypeptid-genet. 39 DK 173085 B1

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det heterologe polypeptid består af et udvindeligt polypeptid udvalgt blandt humant væksthormon, humant proinsulin, somatostatin, thymosin α 1,

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at tryptofan-berøvelsen frembringes ved ophør af tilsætningen af dette additiv og ved 10 fortynding af gæringsmediet, hvori podematerialet først er opdyrket.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at værtsbakterien er E. coli. 15

12. Plasmidisk udtrykkelsesvektor til udtrykkelse i bakterier af et heterologt polypeptidprodukt, kendetegnet ved, at det indeholder en sekvens af dobbeltstrenget DNA, hvis kodningsstreng i fase fra en første 20 5'-ende til en anden 3'-ende omfatter elementerne: (i) et bakterielt trp-promotor-operator-system; (ii) nukleotider, der koder for et ribosombindingssted 25 til translation af element (iv); (iii) nukleotider, der koder for et translationsstartsignal til translation af element (iv); og 30 (iv) et strukturgen, der har indkodet aminosyresekvensen af et heterologt polypeptid; hvilken sekvens hverken omfatter nogen trp-dæmpningsevne 35 eller nukleotider, der koder for trp E ribosombindingsstedet. 40 DK 173085 B1

13. Vektor ifølge krav 12, kendetegnet ved, at polypeptidet, der udtrykkes af strukturgenet, er fuldstændigt heterologt.

14. Vektor ifølge krav 12, kendetegnet ved, at det udtrykte polypeptid er et sammensat protein omfattende et heterologt polypeptid og mindst én portion af aminosyresekvensen af et homologt polypeptid. 10

15. Vektor ifølge krav 14, kendetegnet ved, at den nævnte portion er en portion af aminosyresekvensen af et enzym involveret i den biosyntetiske reaktionsfølge fra chorisminsyre til tryptofan. 15

16. Vektor ifølge krav 15, kendetegnet ved, at det heterologe polypeptid er et bioaktivt polypeptid, og det tilknyttede homologe polypeptid er et specifikt fraspalteligt bioinaktiverende 20 polypeptid.

17. Vektor ifølge krav 14, kendetegnet ved, at det homologe polypeptid er trp E polypeptidet, og ribosombindingsstedet er 25 ribosombindingsstedet for trp-lederpolypeptidet.

18. Vektor ifølge krav 14, kendetegnet ved, at det homologe polypeptid er trp D polypeptidet. 30

19. Vektor ifølge krav 17, kendetegnet ved, at det sammensatte protein består af et heterologt polypeptid og et homologt polypeptid, som i sig selv udgør en sammensætning af omkring de første seks 35 aminosyrer af trp-lederpolypeptidet og aminosyresekvensen indkodet af mindst omkring den fjerne tredjedel af trp E polypeptidgenet. 41 DK 173085 B1

20. Vektor ifølge krav 12, kendetegnet ved, at det heterologe polypeptid består af et udvindeligt polypeptid udvalgt blandt humant væksthormon, humant proinsulin, somatostatin, thymosin α 1/

21. Plasmidet pBRHtrp fremstillet ifølge eksempel I.B i beskrivelsen.

22. Plasmidet pSOM7A2 fremstillet ifølge eksempel I.C i beskrivelsen.

23. Plasmidet pHGH207 fremstillet ifølge eksempel II i beskrivelsen. 15

24. Plasmidet pHKYl fremstillet ifølge eksempel III i beskrivelsen.

25. Plasmidet pSOM7A2A4 fremstillet ifølge eksempel IV i 20 beskrivelsen.

26. Plasmidet pTHya7ålA4 fremstillet ifølge eksempel V i beskrivelsen.