ES2788973T3 - Inmunoglobulina híbrida que contiene una unión distinta de peptidilo - Google Patents

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Abstract

Compuesto que tiene la estructura: **(Ver fórmula)** en la que A es una estructura biológicamente activa del compuesto; en la que Z es un componente de proteína del compuesto, componente de proteína que comprende uno o más polipéptidos, en el que al menos uno de los uno o más polipéptidos comprende aminoácidos consecutivos que (i) son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo; (ii) se unen a un receptor de Fc; y (iii) tienen en su extremo N-terminal una cisteína o una selenocisteína; en la que B es una estructura química que une A y Z; en la que la línea discontinua entre B y Z representa una unión peptidilo entre una cisteína o selenocisteína N-terminal de un polipéptido de Z y un residuo de aminoácido o un residuo de ácido orgánico de B; y en la que la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura: **(Ver fórmula)** en la que Xa es una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina; en la que Ra representa una estructura orgánica que se conecta a uno de A o B y Rb representa una estructura orgánica que se conecta al otro de A o B.

Description

DESCRIPCIÓN
Inmunoglobulina híbrida que contiene una unión distinta de peptidilo
Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente estadounidense provisional n.° 61/953.650, presentada el 14 de marzo de 2014.
A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a diversas publicaciones.
Antecedentes de la invención
Las proteínas prefieren formar estructura fibrosas o globulares compactas, minimizando su exposición a disolvente. Esta tendencia es inherente tanto en la estructura principal de polipéptidos con su propensión por una estructura secundaria unida por enlaces de hidrógeno como en interacciones de cadenas laterales que fomentan el plegamiento terciario. Por tanto, esfuerzos anteriores por introducir “flexibilidad” en anticuerpos usando péptidos han sido en gran medida inadecuados. Por ejemplo, resulta habitual emplear combinaciones de un aminoácido que favorece interacciones con disolvente (por ejemplo, serina) con uno que descompone la estructura helicoidal (por ejemplo, glicina). Aunque este enfoque resulta útil en la preparación de proteínas de fusión tales como fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla (scFv), las estructuras resultantes son realmente bastante compactas sin evidencias de capacidad de extensión (por ejemplo, véase Robert et al, (2009) Engineered antibody intervention strategies for Alzheimer's disease and related dementias by targeting amyloid and toxic oligomers. Protein Eng. Des. Sel. 22, 199-208). Además, es probable que tales secuencias creen problemas adicionales debido a su inmunogenicidad intrínseca y sensibilidad proteolítica.
Thomas J.D., et al., Bioconjugate Chem. 2012, 23, 2007-2013 describen constructos de anticuerpo-fármaco en los que un residuo de selenocisteína en el lado C-terminal de un dominio Fc de anticuerpo está conjugado a un grupo de unión bifuncional que contiene un asa que puede “someterse a química clic” (por ejemplo ciclobutano o ciclooctino) además de una molécula pequeña o un péptido de unión a célula tumoral.
Existe una necesidad de nuevos compuestos de proteína, que incorporen cadenas distintas de proteína, que sean tanto flexibles como extensibles, así como de procedimientos para producir tales compuestos.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un compuesto que tiene la estructura:
Figure imgf000002_0001
en la que A es una estructura biológicamente activa del compuesto;
en la que Z es un componente de proteína del compuesto, componente de proteína que comprende uno o más polipéptidos, en el que al menos uno de los uno o más polipéptidos comprende aminoácidos consecutivos que (i) son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo; (ii) se unen a un receptor de Fc; y (iii) tienen en su extremo N-terminal una cisteína o una selenocisteína;
en la que B es una estructura química que une A y Z;
en la que la línea discontinua entre B y Z representa una unión peptidilo entre una cisteína o selenocisteína N-terminal de un polipéptido de Z y un residuo de aminoácido o un residuo de ácido orgánico de B; y
en la que la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000002_0002
en la que Xa es una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina; y en la que Ra representa una estructura orgánica que se conecta a uno de A o B y Rb representa una estructura orgánica que se conecta al otro de A o B.
También se da a conocer en el presente documento un compuesto que tiene la estructura:
Figure imgf000003_0001
en la que Z es un componente de proteína del compuesto, componente de proteína que comprende uno o más polipéptidos, en el que al menos uno de los uno o más polipéptidos comprende aminoácidos consecutivos que (i) son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo; (ii) se unen a un receptor de Fc; y (iii) tienen en su extremo N-terminal una cisteína o una selenocisteína;
en la que B es una estructura química que une Ra y C;
en la que la línea discontinua entre B y Z representa una unión peptidilo;
Figure imgf000003_0002
en la que Ra es un enlace o una estructura orgánica que comprende o que consiste en una cadena de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10 o más restos, en el que cada resto se selecciona independientemente del grupo que consiste en [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, poli(alcohol vinílico), poli(vinil alquil éter), poli(ácido láctico), poli(ácido lácticoglicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo C1-C10, cicloalcano C3-C10, alqueno C2-C10, cicloalqueno C5-C10, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo C2-C5, acilamino C2-C5, aciloxilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoílo, un aminoácido, un grupo arilo, un grupo heteroarilo, un carbamato, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a un triazol, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a
una isoxazolidina, un dibenzocicloocteno, un dibenzoazacicloocteno
Figure imgf000003_0003
Figure imgf000004_0001
en los que Xi es CH o N, X2 es CH2 o un grupo carbonilo y R5 es un grupo arilo o alquilo;
en los que [PEG(y)]z es:
Figure imgf000004_0002
También se da a conocer en el presente documento un procedimiento para producir un compuesto que tiene la estructura:
Figure imgf000004_0003
en la que A es una estructura biológicamente activa del compuesto;
en la que Z es un componente de proteína del compuesto, componente de proteína que comprende uno o más polipéptidos, en el que al menos uno de los uno o más polipéptidos comprende aminoácidos consecutivos que (i) son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo; (ii) se unen a un receptor de Fc; y (iii) tienen en su extremo N-terminal una cisteína o una selenocisteína;
en la que B es una estructura química que une A y Z;
en la que la línea discontinua entre B y Z representa una unión peptidilo;
en la que la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo;
que comprende las siguientes etapas:
a) obtener un A' que comprende A o un derivado de A, y un primer grupo reactivo terminal;
b) obtener un B' que comprende B o un derivado de B, un segundo grupo reactivo terminal y un tercer grupo reactivo terminal, en el que el segundo grupo reactivo terminal puede reaccionar con el primer grupo reactivo terminal para formar una unión distinta de peptidilo;
c) obtener un Z' que comprende Z o un derivado de Z, y un cuarto grupo reactivo terminal, en el que el cuarto grupo reactivo terminal puede reaccionar con el tercer grupo reactivo terminal para formar una unión peptidilo; y
d) hacer reaccionar A', B' y Z' en cualquier orden para producir el compuesto.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la preparación de TNR1B modificado con alquino mediante escisión de una proteína de fusión de TNRIB-inteína con cistil-propargilamida. El subproducto de inteína se retira mediante cromatografía con quitina. TNR1B modificado con azida y TNR1B modificado con cicloalquino se preparan de manera similar usando cistil-3-azidopropilamida, y diversos derivados de ciclooctino (por ejemplo, DIBAC) de cisteína, respectivamente.
La figura 2 muestra la escisión de TNR1B mediante (1) cisteína, (2) cisteína mercaptoetano-sulfonato (MESNA), (3) cistil-propargilamida, (4) cistil-propargilamida MESNA y (5) MESNA. Todos los compuestos se usaron a una concentración de 50 mM.
La figura 3 muestra la preparación de Fc6 modificado con azida mediante ligación (peptidilo) del dímero de Fc6 y azida-DKTHT-tioéster (tabla 1).
La figura 4 muestra la preparación de Fc6 modificado con azida mediante ligación (peptidilo) del dímero de Fc6 y azida-PEGn-DKTHT-tioéster (tabla 1). Fc modificado con cicloalquino se prepara de manera similar usando DIBAC-PEG-12-tioéster.
La figura 5 muestra el análisis mediante SDS-PAGE (condiciones reductoras) de (1) Fc6 sin modificar, (2) el producto de reacción Az-DKTHT-Fc6 de la figura 3, y (3) el producto de reacción Az-PEG4-DKTHT-Fc6 de la figura 4.
La figura 6 muestra la síntesis de TNR1B-alquino-azida-Fc6 mediante ligación (distinta de peptidilo) de TNR1B modificado con alquino y Az-DKTHT-Fc6.
La figura 7 muestra la síntesis de TNR1B-alquino-azida-PEGn-Fc6 mediante ligación (distinta de peptidilo) de TNR1B modificado con alquino y azida-PEGn-DKTHT-Fc6. En este ejemplo, n = 4.
La figura 8 muestra el análisis mediante SDS-PAGE (condiciones reductoras) de (1) TNR1B modificado con alquino solo, (2) TNR1B modificado con alquino Az-DKTHT-Fc6 en ausencia de catalizador, (3) TNR1B modificado con alquino Az-DKTHT-Fc6 catalizador que conduce al producto de la figura 6 , y (4) TNR1B modificado con alquino dializado Az-DKTHT-Fc6 catalizador que conduce a la formación aumentada del producto de la figura 6 , (5) TNR1B modificado con alquino Az-PEG4-DKTHT-Fc6 en ausencia de catalizador, (6 ) TNR1B modificado con alquino Az-PEG4-DKTHT-Fc6 catalizador que conduce al producto de la figura 7, y (7) TNR1B modificado con alquino dializado Az-PEG4-DKTHT-Fc6 catalizador que conduce a la formación aumentada del producto de la figura 7. Las flechas corresponden a (a) Mr -75.000, (b) Mr -65.000, (c) Mr -43.000 y (d) Mr -28.000.
La figura 9 muestra el análisis mediante SDS-PAGE (condiciones reductoras) de (1) proteína de fusión de TNF1B-Fc (etanercept) sola, (2) TNR1B modificado con alquino Az-DKTHT-Fc6 catalizador que conduce al producto de la figura 6 , (3) proteína de fusión de TNF1B-Fc (etanercept), y (4) TNR1B modificado con alquino Az-PEG4-DKTHT-Fc6 que conduce al producto de la figura 7. Las flechas corresponden a (a) Mr -75.000, (b) Mr -65.000, (c) Mr -43.000, y (d) Mr -28.000.
La figura 10 muestra el análisis mediante SDS-PAGE (condiciones reductoras) de (1) Fc6 sin modificar catalizador, (2) TNR1B modificado con alquino Fc6 sin modificar catalizador (3) Az-DKTHT-Fc6 catalizador, (4) TNR1B modificado con alquino Az-DKTHT-Fc6 catalizador que conduce al producto de la figura 6 , y (5) TNR1B modificado con alquino solo. Las flechas corresponden a (a) Mr -75.000, (b) Mr -65.000, (c) Mr -43.000, (d) Mr -28.000, y (e) Mr -27.000.
La figura 11 muestra péptido tríptico identificado mediante CL/EM en el producto TNR1B-alquino-azida-DKTHT-Fc6 (Mr -75.000) de la figura 10. Las secuencias de péptido subrayadas son las identificadas mediante CL/EM que se derivan de las secuencias originales de TNR1B (superior) y Fc6 (inferior).
La figura 12 muestra el análisis mediante SPR de unión a TNF-^ mediante los productos de reacción TNR1B-alquinoazida-DKTHT-Fc6 (panel izquierdo) y TNR1 B-alquino-azida-PEG4-DKTHT-Fc6 (panel derecho) de la figura 9. Los datos de unión cinética se resumen en la tabla 2.
La figura 13 muestra la preparación de Fab' de adalimumab en un procedimiento en tres etapas: 1) escisión de IdeS para dar los fragmentos Fab'2 Fc', 2) cromatografía con proteína A para retirar el fragmento Fc', y 3) reducción leve del fragmento Fab'2 para dar el fragmento Fab' con 2-mercaptoetilamina (MEA).
La figura 14 muestra el análisis mediante SDS-PAGE de (1) adalimumab, (2) adalimumab después de la escisión de IdeS, (3) Fab'2 de adalimumab después de la purificación con proteína A, (4) Fab' de adalimumab después del tratamiento con MEA del Fab'2 purificado con proteína A, (5) Fab'2 de adalimumab después de la purificación con proteína A, y (6 ) Fab' de adalimumab después del tratamiento con MEA del Fab'2 purificado con proteína A. Las muestras en los carriles 1, 2, 5 y 6 fueron el análisis en condiciones reductoras; mientras que las muestras en los carriles 3 y 4 se analizaron en condiciones no reductoras. Las flechas corresponden a (a) cadena pesada, (b) fragmento Fc' de cadena pesada, (c) fragmento Fd' de cadena pesada (que contiene región variable), y (d) cadena ligera.
La figura 15 muestra la preparación de Fab' modificado con cicloalquino mediante la reacción de Fab' de adalimumab con DIBAC-PEGy-Lys (Mal). En este ejemplo, PEGy = PEG12.
La figura 16 muestra el análisis mediante SDS-PAGE (condiciones no reductoras) de la síntesis y purificación de Fab' de adalimumab modificado con cicloalquino. El panel superior muestra la reacción a (1-6) pH 7,4 y (7-12) pH 7,0. La ración de DIBAC-PEGy-Lys(Mal) con respecto a Fab' fue de (1) 0, (2) 10:1, (3) 5:1, (4) 2,5:1, (5) 1,2:1, (6 ) 0,6:1, (7) 0, (8) 10, (9) 5, (10) 2,5, (11) 1,2, y (12) 0,6:1. El panel inferior muestra (1) Fab' sin reaccionar, (2) a (12) fracciones de flujo a través de proteína L que sólo contienen el Fab' modificado con cicloalquino.
La figura 17 muestra el análisis mediante SDS-PAGE (condiciones reductoras) de (1) Fc6 , (2) Az-DKTHT-Fc6 , (3) Az-PEG-i2-DKTHT-Fc6 , (4) Az-PEG24-DKTHT-Fc6 , y (5) Az-PEG36-DKTHT-Fc6.
La figura 18 muestra la cromatografía de exclusión molecular de (a) Az-PEG36-DKTHT-Fc6 , (b) Az-PEG24-DKTHT-Fc6 , (c) Az-PEG-i2-DKTHT-Fc6 , (d) Az-DKTHT-Fc6 , y (e) Fc6.
La figura 19 muestra la síntesis de Fab'-PEGy-alquino-azida-PEGx-Fc6 mediante ligación (distinta de peptidilo) de Fab' de adalimumab modificado con cicloalquino y Fc6 modificado con azida.
La figura 20 muestra la serie de productos de Fab'-PEGy-alquino-azida-PEGx-Fc6.
La figura 21 muestra el análisis mediante SDS-PAGE de (1) anticuerpo completo de adalimumab, (2) Fab' de adalimumab, (3) Fab'-PEG12-alquino, (4) Fab'-PEG12-alquino Az-DKTHT-Fc6 , (5) Az-DKTHT-Fc6 , (6 ) Fab'-PEG12-alquino Az-PEG-i2-DKTHT-Fc6 , (7) Az-PEG-i2-DKTHT-Fc6 , (8) Fab'-PEG12-alquino Az-PEG24-DKTHT-Fc6 , (9) Az-PEG24-DKTHT-Fc6 solo, (10) Fab'-PEG12-alquino Az-PEG36-DKTHT-Fc6 , (11) Az-PEG36-DKTHT-Fc6 , y (12) Fc6. Se hicieron correr las muestras en condiciones reductoras (panel superior) y condiciones no reductoras (panel inferior). En el panel superior la flecha muestra (a) cadena pesada de Fab'-PEGy-alquino-azida-PEGx-Fc6. En los paneles inferiores las flechas muestran (a) moléculas de Fab'-PEGy-alquino-azida-PEGx-Fc6 de dos manos, y (b) moléculas de Fab'-PEGy-alquino-azida-PEGx-Fc6 de una mano.
La figura 22 muestra la cromatografía de exclusión molecular (SEC) de productos de reacción de dos manos: (a) Fab'-PEG-i2-alquino-azida-PEG36-DKTHT-Fc6 , (b) Fab'-PEG-i2-alquino-azida-PEG24-DKTHT-Fc6 , (c) Fab'-PEG12-alquinoazida-PEG-i2-DKTHT-Fc6 , (d) Fab'-PEG-i2-alquino-azida-DKTHT-Fc6 , y (e) adalimumab completo.
La figura 23 muestra la inhibición de la citotoxicidad de TNF-a sobre células WEHI mediante productos de reacción. El panel superior muestra (a) control de Fc6 , (b) Fab' modificado con cicloalquino, (c) Fab-PEG12-alquino-azida-DKTHT-Fc6 , y (d) Fab'-PEG-i2-alquino-azida-PEG-i2-DKTHT-Fc6. El panel inferior muestra (a) control de Fc6 , (b) Fab' modificado con cicloalquino, (c) Fab'-PEG-i2-alquino-azida-PEG24-DKTHT-Fc6 , y (d) Fab'-PEG-i2-alquino-azida-PEG36-DKTHT-Fc6.
La figura 24 muestra las proteínas de N3-Px-Fc purificadas mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras (izquierda) y no reductoras (derecha): control de Fc6 (carriles a), N3-P0-Fc (carriles b), N3-P12 -Fc (carriles c), N3-P24-Fc (carriles d) , N3-P36-Fc (carriles e), y N3-P48-Fc (carriles f).
La figura 25 muestra la estructura y síntesis del análogo de GLP-1 modificado con ciclooctino (GLP1-P7-DBCO).
La figura 26 muestra la reacción entre GLP1-P7-DBCO y las proteínas de N3-Px-Fc.
La figura 27 muestra la estructura de inmunoglobulinas híbridas de GLP1-triazol-Fc.
La figura 28 muestra las inmunoglobulinas híbridas de GLP1-triazol-Fc purificadas mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras (izquierda) y condiciones no reductoras (derecha): control de Fc6 (carriles a), GLP1-P4-DN-P0-Fc (carriles b), GLP1-P4-DN-P12-Fc (carriles c), GLP1-P4-DN-P24-Fc (carriles d), GLP1-P4-DN-P36-Fc (carriles e) , y GLP1-P4-DN-P48-Fc (carriles f).
La figura 29 compara directamente las inmunoglobulinas híbridas de GLP1-triazol-Fc y proteínas de N3-Px-Fc mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras: control de Fc6 (carril a), N3-P0-Fc (carril b), GLP1-P4-DN-P0-Fc (carril c), N3-P12 -Fc (carril d), GLP1-P4-DN-P12-Fc (carril e), N3-P24-Fc (carril f), GLP1-P4-DN-P24-Fc (carril g), N3-P36-Fc (carril h), GLP1-P4-DN-P36-Fc (carril i), N3-P48-Fc (carril j), GLP1-P4-DN-P48-Fc (carril k).
La figura 30 compara la inducción de la síntesis de cAMP en células que expresan receptor de GLP-1 mediante inmunoglobulinas híbridas de GLP1-triazol-Fc y GLP-1.
La figura 31 muestra la reacción entre DIBAC-PEG11-DIBAC y las proteínas de N3-Px-Fc.
La figura 32 muestra la estructura de las proteínas de ciclooctino-Px-Fc.
La figura 33 muestra el producto de reacción de DIBAC-P11-DN-P0-Fc mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras: control de Fc6 (carril b), producto de reacción sin purificar (carriles c-e), la proteína N3-P0-Fc purificada (carril f), y la proteína DIBa C-P11 -Dn -P0-Fc purificada (carril g).
La figura 34 muestra la reacción entre ADN modificado con azida y las proteínas de ciclooctino-Px-Fc.
La figura 35 muestra la estructura de inmunoglobulinas híbridas de ADN-triazol-Fc.
La figura 36 muestra los productos de reacción de inmunoglobulinas híbridas de ADN-triazol-Fc mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras: la concentración de oligonucleótido 5AzD-let7d (mg/ml) fue de la siguiente manera: marcadores (carril a), 0 (carril b), 2,5 (carril c), 1,25 (carril d), 0,063 (carril e), 0,031 (carril f), 0,016 (carril g), 0,08 (carril h).
La figura 37 muestra la estructura y síntesis de la variante de trastuzumab, cys1H-IgG1, y la cadena pesada de trastuzumab modificado con azida (N3-Px-Hc).
La figura 38 muestra la estructura y síntesis de la variante de trastuzumab, cys1L-IgG1, la cadena ligera de trastuzumab modificado con azida (N3-Px-Lc).
La figura 39 muestra la estructura y síntesis de DM-1 modificado con ciclooctino (DM1-P4-DBCO).
La figura 40 muestra la reacción entre DM-1 modificado con ciclooctino y las proteínas de N3-Px-Hc.
La figura 41 muestra la estructura de inmunoglobulinas híbridas de DM1-P4-triazol-Px-Hc.
La figura 42 muestra la reacción entre DM-1 modificado con ciclooctino y las proteínas de N3-Px-Lc.
La figura 43 muestra la estructura de inmunoglobulinas híbridas de DM1-P4-triazol-Px-Lc.
La figura 44 muestra la reacción entre tetrazina-DBCO y las proteínas de N3-Px-Fc.
La figura 45 muestra la estructura de proteínas de Fc modificadas con tetrazina (Tet-Px-Fc).
La figura 46 muestra las proteínas de Tet-Px-Fc purificadas mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras (izquierda) y no reductoras (derecha): control de Fc6 (carriles a), Tet-P0-Fc (carriles b), Tet-P12-Fc (carriles c), Tet-P24-Fc (carriles d), Tet-P36-Fc (carriles e), y Tet-P48-Fc (carriles f).
La figura 47 muestra la reacción entre TCO-PEG12-DBCO y las proteínas de N3-Px-Fc.
La figura 48 muestra la estructura de proteínas de Fc modificadas con transcicloocteno (Tco-Px-Fc).
La figura 49 muestra las proteínas de Tco-P12-Px-Fc mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras: la concentración de grupo de unión Tco-P12-DBCO (mg/ml) fue de la siguiente manera: 32 (carril a), 16 (carril b), 8 (carril c), 4 (carril d), 2 (carril e), 1 (carril f), 0,5 (carril g), 0,25 (carril h), 0,125 (carril i), y 0 (carril j).
La figura 50 muestra los productos de reacción entre NH2-PEG23-N3 y proteína DBCO-TT-P12-P36-Fc mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras: la concentración de grupo de unión NH2-PEG23-N3 (mg/ml) fue de la siguiente manera: 0,12 (carril a), 0,06 (carril b), 0,03 (carril c), 0,015 (carril d), 0,0075 (carril e), 0,0038 (carril f), 0,002 (carril g), 0,001 (carril h), 0 (carril i).
La figura 51 muestra la estructura y síntesis del análogo de GLP-1 modificado con transcicloocteno (GLP1-P6-Tco). La figura 52 muestra la reacción entre péptido GLP1-P6-Tco y las proteínas de Tet-Px-Fc.
La figura 53 muestra la estructura de las inmunoglobulinas híbridas de GLP1-dihidropiridizina-Fc.
La figura 54 muestra la estructura y síntesis del análogo de GLP-1 modificado con tetrazina (GLP1-P6-Tet).
La figura 55 muestra la reacción entre péptido GLP1-P6-Tet y las proteínas de Tco-Px-Fc.
La figura 56 muestra la estructura de las inmunoglobulinas híbridas de GLP1-P6-TT-Px-Fc.
La figura 57 muestra las inmunoglobulinas híbridas de GLP1-dihidropiridizina-Fc purificadas mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras (izquierda) y condiciones no reductoras (derecha): control de Fc6 (carriles a), GLP1-P6-TT-P0-Fc (carriles b), GLP1-P6-TTP12-Fc (carriles c), GLP1-P6-TT-P24-Fc (carriles d), GLP1-P6-TT-P36-Fc (carriles e), y GLP1-P6-TT-P48-Fc (carriles f).
La figura 58 compara directamente las proteínas de N3-Px-Fc (I), las proteínas de Tet-Px-Fc (II), y las inmunoglobulinas híbridas de GLP1-dihidropiridizina-Fc (III) mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras: control de Fc6 (carril a), N3-P0-Fc (carril b), Tet- P0-Fc (carril c), GLP1-P6-TT-P0-Fc (carril d), N3-P12 -Fc (carril e), Tet-P12-Fc (carril f), GLP1-P6-TT-P12-Fc (carril g), N3-P24-Fc (carril h), Tet-P24-Fc (carril i), GLP1-P6-TT-P24-Fc (carril j), N3-P36-Fc (carril k), Tet-P36-Fc (carril l), GLP1-P6-TT-P36-Fc (carril m), N3-P48-Fc (carril n), Tet-P48-Fc (carril o), GLP1-P6-TT-P48-Fc (carril p).
La figura 59 muestra un transcurso de tiempo para la reacción de GLP1-P7-DBCO con N3-P36-Fc y un transcurso de tiempo para la reacción de GLP1-P6-Tco con Tet-P36-Fc.
La figura 60 compara la inducción de la síntesis de cAMP en células que expresan receptor de GLP-1 mediante inmunoglobulinas híbridas de GLP1 -dihidropiridizina-Fc y GLP-1.
La figura 61 muestra la estructura y síntesis del Fab de adalimumab modificado con transcicloocteno (Fab-P3-Tco). La figura 62 muestra la reacción entre proteína Fab-P3-Tco y las proteínas de Tet-Px-Fc.
La figura 63 muestra la estructura de las inmunoglobulinas híbridas de Fab-dihidropiridizina-Fc.
La figura 64 muestra las inmunoglobulinas híbridas de Fab-dihidropiridizina-Fc mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras: marcadores (carriles a), adalimumab (carril b), Fab-P3-TT-P0-Fc (carril c), Fab-P3-TT-P12-Fc (carril d), Fab-P3-TT-P24-Fc (carriles e), Fab-P3-TT-P36-Fc (carriles f), Fab-P3-TT-P48-Fc (carril g), Fab-P3-Tco (carril h), Tet-P0-Fc (carril i), Tet- P12-Fc (carril j), Tet-P24-Fc (carril k), Tet-P36-Fc (carril l), Tet-P48-Fc (carril m).
La figura 65 muestra la estructura y síntesis de olanzapina modificada con azida y modificada con transcicloocteno (Ola-P12-Tco).
La figura 66 muestra la reacción entre Ola-P12-Tco y las proteínas de Tet-Px-Fc.
La figura 67 muestra la estructura de inmunoglobulinas híbridas de olanzapina-dihidropiridizina-Fc.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona un compuesto que tiene la estructura:
Figure imgf000008_0001
en la que A es una estructura biológicamente activa del compuesto;
en la que Z es un componente de proteína del compuesto, componente de proteína que comprende uno o más polipéptidos, en el que al menos uno de los uno o más polipéptidos comprende aminoácidos consecutivos que (i) son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo; (ii) se unen a un receptor de Fc; y (iii) tienen en su extremo N-terminal una cisteína o una selenocisteína;
en la que B es una estructura química que une A y Z;
en la que la línea discontinua entre B y Z representa una unión peptidilo entre una cisteína o selenocisteína N-terminal de un polipéptido de Z y un residuo de aminoácido o un residuo de ácido orgánico de B; y
en la que la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000008_0002
en la que Xa es una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina; y en la que Ra representa una estructura orgánica que se conecta a uno de A o B y Rb representa una estructura orgánica que se conecta al otro de A o B.
En algunas realizaciones, la cisteína o selenocisteína se produce de manera natural en el tramo de aminoácidos consecutivos. En algunas realizaciones, la cisteína o selenocisteína no se produce de manera natural en el tramo de aminoácidos consecutivos.
En algunas realizaciones, los aminoácidos consecutivos tienen en su extremo N-terminal una secuencia seleccionada del grupo que consiste en una cisteína, selenocisteína, CP, CPXCP (en la que X = P, R o S), CDKTHTCPPCP, CVECPPCP, CCVECPPCP y CDTPPPCPRCP.
En algunas realizaciones, el dominio Fc de un anticuerpo es un dominio Fc que se produce de manera natural de un anticuerpo.
En algunas realizaciones, el dominio Fc de un anticuerpo es un dominio Fc variante de un anticuerpo.
En algunas realizaciones, el dominio Fc variante de un anticuerpo es un dominio Fc mutado de un anticuerpo.
En algunas realizaciones, el dominio Fc mutado es un mutante de sustitución.
En algunas realizaciones, el mutante de sustitución tiene una sustitución de aminoácido en el extremo N-terminal, el extremo C-terminal o en una posición del dominio Fc distinta del extremo N-terminal o el extremo C-terminal.
En algunas realizaciones, el mutante de sustitución tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 10-15, 15-20, 10-20 ó 20­ 50 sustituciones de aminoácido en el tramo de aminoácidos consecutivos del mismo.
En algunas realizaciones, las sustituciones son sustituciones de aminoácido conservativas.
En algunas realizaciones, el dominio Fc mutado es un mutante de adición de aminoácido.
En algunas realizaciones, el mutante de adición de aminoácido tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 10-15, 15-20, 10-20 ó 20-50 aminoácidos añadidos en el tramo de aminoácidos consecutivos del mismo.
En algunas realizaciones, el dominio Fc mutado es un mutante de deleción de aminoácido.
En algunas realizaciones, el mutante de deleción de aminoácido tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 10-15, 15-20, 10-20 ó 20-50 aminoácidos delecionados en el tramo de aminoácidos consecutivos del mismo.
En algunas realizaciones, los aminoácidos consecutivos son idénticos a un tramo de al menos 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 ó 190 aminoácidos consecutivos presente en la cadena del dominio Fc del anticuerpo.
En algunas realizaciones, los aminoácidos consecutivos son idénticos al tramo de aminoácidos en la región de bisagra, la región CH2 o la región CH3 del dominio Fc o una porción de las mismas.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000009_0001
en la que
Figure imgf000009_0002
el que R5 es un grupo alquilo o arilo
en la que R1 es H o forma parte de una estructura adicional que es una estructura cíclica, en la que la estructura cíclica adicional comprende R1 o una porción de R1, y también puede comprender R2 o una porción de R2, y el carbono entre R2 y el doble enlace de alqueno;
con la condición de que
Figure imgf000009_0003
es
Figure imgf000010_0001
es un anillo de triazol que comprende
Figure imgf000010_0002
an o e soxazo na susttu o con -aqu o o ar o que compren e y
en la que R2 representa una estructura orgánica que se conecta a uno de A o B y R4 representa una estructura orgánica que se conecta al otro de A o B.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000010_0003
en la que R1 es H o forma parte de una estructura adicional que es una estructura cíclica, en la que la estructura cíclica adicional comprende R1 o una porción de R1, y también puede comprender R2 o una porción de R2, y el carbono entre R2 y el doble enlace de alqueno.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000011_0001
en la que Ri es H o forma parte de una estructura adicional que es una estructura cíclica, en la que la estructura cíclica adicional comprende R1 o una porción de R1, y también puede comprender R2 o una porción de R2, y el carbono entre R2 y el doble enlace de alqueno.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000011_0002
en la que R1 forma parte de una estructura adicional que es una estructura cíclica, en la que la estructura cíclica adicional comprende R1 o una porción de R1, y también puede comprender R2 o una porción de R2, y el carbono entre R2 y el doble enlace de alqueno.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000011_0003
en la que R1 forma parte de una estructura adicional que es una estructura cíclica, en la que la estructura cíclica adicional comprende R1 o una porción de R1, y también puede comprender R2 o una porción de R2, y el carbono entre R2 y el doble enlace de alqueno.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, R1 y R2 están unidos mediante al menos un enlace directo para formar una estructura cíclica que comprende
i) una porción de R1,
ii) una porción de R2,
iii) el carbono entre R2 y el doble enlace de alqueno, y
iv) el doble enlace de alqueno.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, Ri se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000012_0001
que está opcionalmente sustituido en cualquier posición.
Según una variante dada a conocer en el presente documento,
Figure imgf000012_0002
que está opcionalmente sustituido en cualquier posición.
Figure imgf000012_0003
Según una variante dada a conocer en el presente documento, R1 es que está opcionalmente sustituido en cualquier posición.
Según una variante dada a conocer en el presente documento,
Figure imgf000012_0004
que está opcionalmente sustituido en cualquier posición.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el carbono entre R2 y el doble enlace de alqueno está: (i) directamente unido a R2 con un enlace sencillo y sustituido con dos sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, bencilo opcionalmente sustituido, alquilo opcionalmente sustituido o alcoxilo opcionalmente sustituido; o
(ii) directamente unido a R2 mediante un doble enlace y un enlace sencillo.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el carbono entre R2 y el doble enlace de alqueno está sustituido con dos hidrógenos y directamente unido a R2 con un enlace sencillo.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el carbono entre R2 y el doble enlace de alqueno está directamente unido a R2 mediante un doble enlace y un enlace sencillo.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el carbono entre R2 y el doble enlace de alqueno está directamente unido a R2 mediante un doble enlace y un enlace sencillo para formar un anillo de fenilo que está opcionalmente sustituido en cualquier posición.
Según una variante dada a conocer en el presente documento,
Figure imgf000013_0001
unido a o B mediante J, y en el que J es un enlace o una estructura orgánica que comprende o que consiste en una cadena de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10 o más restos, en el que cada resto se selecciona independientemente del grupo que consiste en [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, poli(alcohol vinílico), poli(vinil alquil éter), poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo C1-C10, cicloalcano C3-C10, alqueno C2-C10, cicloalqueno C5-C10, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo C2-C5, acilamino C2-C5, aciloxilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoílo, un aminoácido, un grupo arilo, un grupo heteroarilo, un carbamato, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a un triazol, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a una isoxazolidina, un dibenzocicloocteno, un dibenzoazacicloocteno,
Figure imgf000013_0002
en los que X1 es CH o N, X2 es CH2 o un grupo carbonilo, y R5 es un grupo arilo o alquilo;
en el que [PEG(y)]z es:
Figure imgf000014_0001
Según una variante dada a conocer en el presente documento, R2 es t en el que R2 está unido a o B mediante J, en el que R2 está unido a R1 mediante el átomo de nitrógeno de R2, y en el que J es un enlace o una estructura orgánica que comprende o que consiste en una cadena de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10 o más restos, en el que cada resto se selecciona independientemente del grupo que consiste en [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, poli(alcohol vinílico), poli(vinil alquil éter), poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo C1-C10, cicloalcano C3-C10, alqueno C2-C10, cicloalqueno C5-C10, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo C2-C5, acilamino C2-C5, aciloxilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoílo, un aminoácido, un grupo arilo, un grupo heteroarilo, un carbamato, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a un triazol, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a
una isoxazolidina, un dibenzocicloocteno, un dibenzoazacicloocteno
Figure imgf000014_0002
Figure imgf000014_0003
en los que X1 es CH o N, X2 es CH2 o un grupo carbonilo, y R5 es un grupo arilo o alquilo;
en el que [PEG(y)]z es:
Figure imgf000015_0001
Según una variante dada a conocer en el presente documento, R2 es
Figure imgf000015_0002
que está opcionalmente sustituido en cualquier posición,
en el que R2 está unido a R1 mediante el átomo de nitrógeno o carbono de R2,
en el que R2 está unido a o B mediante J, y
en el que J es un enlace o una estructura orgánica que comprende o que consiste en una cadena de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más restos, en el que cada resto se selecciona independientemente del grupo que consiste en [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, poli(alcohol vinílico), poli(vinil alquil éter), poli(ácido láctico), poli(ácido lácticoglicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo C1-C10, cicloalcano C3-C10, alqueno C2-C10, cicloalqueno C5-C10, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo C2-C5, acilamino C2-C5, aciloxilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoílo, un aminoácido, un grupo arilo, un grupo heteroarilo, un carbamato, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a un triazol, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a
Figure imgf000016_0001
en los que Xi es CH o N, X2 es CH2 o un grupo carbonilo, y R5 es un grupo arilo o alquilo;
en el que [PEG(y)]z es:
Figure imgf000016_0002
Según una variante dada a conocer en el presente documento,
Figure imgf000016_0003
opcionalmente sustituido en cualquier posición.
Según una variante dada a conocer en el presente documento,
Figure imgf000016_0004
que está opcionalmente sustituido en cualquier posición.
Según una variante dada a conocer en el presente documento,
Figure imgf000016_0005
que está opcionalmente sustituido en cualquier posición.
Según una variante dada a conocer en el presente documento,
Figure imgf000017_0001
que está opcionalmente sustituido en cualquier posición.
Según una variante dada a conocer en el presente documento,
Figure imgf000017_0002
que está opcionalmente sustituido en cualquier posición.
Según una variante dada a conocer en el presente documento,
Figure imgf000017_0003
opcionalmente sustituido en cualquier posición.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, R1 y R2 tomados juntos son:
Figure imgf000018_0001
que están opcionalmente sustituidos en cualquier posición,
en los que J es un enlace o una estructura orgánica que comprende o que consiste en una cadena de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10 o más restos, en los que cada resto se selecciona independientemente del grupo que consiste en [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, poli(alcohol vinílico), poli(vinil alquil éter), poli(ácido láctico), poli(ácido lácticoglicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo Cr C10, cicloalcano C3-C10, alqueno C2-C10, cicloalqueno C5-C10, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo C2-C5, acilamino C2-C5, aciloxilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoílo, un aminoácido, un grupo arilo, un grupo heteroarilo, un carbamato, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a un triazol, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a
Figure imgf000018_0002
Figure imgf000019_0001
en los que Xi es CH o N, X2 es CH2 o un grupo carbonilo, y R5 es un grupo arilo o alquilo;
en los que [PEG(y)]z es:
Figure imgf000019_0002
Según una variante dada a conocer en el presente documento, R1 y R2 tomados juntos son
Figure imgf000019_0003
que está opcionalmente sustituido en cualquier posición.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, R1 y R2 tomados juntos son
Figure imgf000019_0004
que está opcionalmente sustituido en cualquier posición.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000020_0001
que está opcionalmente sustituida en cualquier posición,
en el que J es un enlace o una estructura orgánica que comprende o que consiste en una cadena de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10 o más restos, en el que cada resto se selecciona independientemente del grupo que consiste en [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, poli(alcohol vinílico), poli(vinil alquil éter), poli(ácido láctico), poli(ácido lácticoglicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo C1-C10, cicloalcano C3-C10, alqueno C2-C10, cicloalqueno C5-C10, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo C2-C5, acilamino C2-C5, aciloxilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoílo, un aminoácido, un grupo arilo, un grupo heteroarilo, un carbamato, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a un triazol, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a
una isoxazolidina, un dibenzocicloocteno, un dibenzoazacicloocteno,
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000021_0003
en los que X1 es CH o N, X2 es CH2 o un grupo carbonilo, y R5 es un grupo arilo o alquilo;
en el que [PEG(y)]z es:
Figure imgf000021_0002
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000022_0001
que está opcionalmente sustituida en cualquier posición.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000022_0002
que está opcionalmente sustituida en cualquier posición.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000023_0001
que está opcionalmente sustituida en cualquier posición,
en la que J es un enlace o una estructura orgánica que comprende o que consiste en una cadena de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10 o más restos, en la que cada resto se selecciona independientemente del grupo que consiste en [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, poli(alcohol vinílico), poli(vinil alquil éter), poli(ácido láctico), poli(ácido lácticoglicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo C1-C10, cicloalcano C3-C10, alqueno C2-C10, cicloalqueno C5-C10, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo C2-C5, acilamino C2-C5, aciloxilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoílo, un aminoácido, un grupo arilo, un grupo heteroarilo, un carbamato, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a un triazol, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a
una isoxazolidina, un dibenzocicloocteno, un dibenzoazacicloocteno;
Figure imgf000023_0002
Figure imgf000024_0001
en los que Xi es CH o N, X2 es CH2 o un grupo carbonilo, y R5 es un grupo arilo o alquilo;
en la que [PEG(y)]z es:
Figure imgf000024_0002
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000024_0003
que está opcionalmente sustituida en cualquier posición.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000025_0001
que está opcionalmente sustituida en cualquier posición.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000026_0001
que está opcionalmente sustituida en cualquier posición,
en la que J es un enlace o una estructura orgánica que comprende o que consiste en una cadena de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10 o más restos, en la que cada resto se selecciona independientemente del grupo que consiste en [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, poli(alcohol vinílico), poli(vinil alquil éter), poli(ácido láctico), poli(ácido lácticoglicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo C1-C10, cicloalcano C3-C10, alqueno C2-C10, cicloalqueno C5-C10, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo C2-C5, acilamino C2-C5, aciloxilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoílo, un aminoácido, un grupo arilo, un grupo heteroarilo, un carbamato, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a un triazol, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a
Figure imgf000027_0001
en los que Xi es CH o N, X2 es CH2 o un grupo carbonilo, y R5 es un grupo arilo o alquilo;
en la que [PEG(y)]z es:
Figure imgf000027_0002
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000027_0003
que está opcionalmente sustituida en cualquier posición.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000028_0001
que está opcionalmente sustituida en cualquier posición.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000029_0001
que está opcionalmente sustituida en cualquier posición,
en la que J es un enlace o una estructura orgánica que comprende o que consiste en una cadena de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10 o más restos, en la que cada resto se selecciona independientemente del grupo que consiste en [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, poli(alcohol vinílico), poli(vinil alquil éter), poli(ácido láctico), poli(ácido lácticoglicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo C1-C10, cicloalcano C3-C10, alqueno C2-C10, cicloalqueno C5-C10, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo C2-C5, acilamino C2-C5, aciloxilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoílo, un aminoácido, un grupo arilo, un grupo heteroarilo, un carbamato, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a un triazol, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a
Figure imgf000029_0002
Figure imgf000030_0002
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000030_0001
que está opcionalmente sustituida en cualquier posición.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000031_0001
que está opcionalmente sustituida en cualquier posición.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000031_0002
Según una variante dada a conocer en el presente documento, R1 es H.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, J es una estructura orgánica que comprende un grupo [PEG(y)]z.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, J es una estructura orgánica que comprende un grupo polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, poli(alcohol vinílico), poli(vinil alquil éter), poli(ácido láctico), poli(ácido lácticoglicólico) o polisacárido.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, J es una estructura orgánica que comprende un grupo alquilo C1-C4.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, J es una estructura orgánica que comprende una succinimida.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, J es una estructura orgánica que comprende amina. Según una variante dada a conocer en el presente documento, J es una estructura orgánica que comprende un succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo o adipoílo.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, J es una estructura orgánica que comprende un malonilo.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, J es una estructura orgánica que comprende un aminoácido.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, J es una estructura orgánica que comprende una cisteína.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, J es una estructura orgánica que comprende una lisina. Según una variante dada a conocer en el presente documento, J es una estructura orgánica que consiste en una cadena de 3 restos seleccionados del grupo que consiste en [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, poli(alcohol vinílico), poli(vinil alquil éter), poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo C1-C10, cicloalcano C3-C10, alqueno C2-C10, cicloalqueno C5-C10, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo C2-C5, acilamino C2-C5, aciloxilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoílo, un aminoácido, un grupo arilo, un grupo heteroarilo, un carbamato, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a un triazol, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a una isoxazolidina, un
dibenzocicloocteno, un dibenzoazacicloocteno;
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000032_0003
Según una variante dada a conocer en el presente documento, J es una estructura orgánica que consiste en una cadena de cuatro restos seleccionados del grupo que consiste en [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, poli(alcohol vinílico), poli(vinil alquil éter), poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo C1-C10, cicloalcano C3-C10, alqueno C2-C10, cicloalqueno C5-C10, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo C2-C5, acilamino C2-C5, aciloxilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoílo, un aminoácido, un grupo arilo, un grupo heteroarilo, un carbamato, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a un triazol, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a una isoxazolidina, un
dibenzocicloocteno un dibenzoazacicloocteno
Figure imgf000032_0002
Figure imgf000033_0001
Según una variante dada a conocer en el presente documento, J es una estructura orgánica que consiste en una cadena de cinco restos seleccionados del grupo que consiste en [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, poli(alcohol vinílico), poli(vinil alquil éter), poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo C1-C10, cicloalcano C3-C10, alqueno C2-C10, cicloalqueno C5-C10, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo C2-C5, acilamino C2-C5, aciloxilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoílo, un aminoácido, un grupo arilo, un grupo heteroarilo, un carbamato, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a un triazol, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a una isoxazolidina, un
Figure imgf000034_0001
Según una variante dada a conocer en el presente documento, J comprende un grupo [PEG(y)]z unido a una lisina. Según una variante dada a conocer en el presente documento, J comprende un grupo acilo C1-C4 unido a un grupo succinimida.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, J comprende una lisina unida a un acilo C1-C4. Según una variante dada a conocer en el presente documento, J comprende un grupo [PEG(y)]z, que está unido a un glutarilo.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, J es una estructura orgánica que consiste en una cadena de cinco restos seleccionados del grupo que consiste en [PEG(y)]z, acilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, un aminoácido, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a un triazol, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado una isoxazolidina, un dibenzocicloocteno, un dibenzoazacicloocteno,
Figure imgf000035_0002
conocer en el presente documento, J es un enlace.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, J es una cisteína.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, J tiene la estructura:
Figure imgf000035_0001
Según una variante dada a conocer en el presente documento, J tiene una estructura lineal.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, J tiene una estructura ramificada.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, R2 es
Figure imgf000036_0002
en los que n 1-3, m es 1-4, y es 1-100 y z es 1-10.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, R2 es
Figure imgf000036_0001
Según una variante dada a conocer en el presente documento, R2 es
Figure imgf000037_0001
Según una variante dada a conocer en el presente documento, Ri y R2 tomados juntos son:
Figure imgf000038_0001
Según una variante dada a conocer en el presente documento, Ri y R2 tomados juntos son:
Figure imgf000038_0002
Según una variante dada a conocer en el presente documento, R1 y R2 tomados juntos son:
Figure imgf000039_0001
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000039_0002
Figure imgf000040_0001
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000041_0001
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000041_0002
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000042_0001
en la que [PEG(x)]w es:
Figure imgf000043_0001
Según una variante dada a conocer en el presente documento, y es 1-20. En algunas realizaciones, y es 21-40. En algunas realizaciones, y es 41-60. En algunas realizaciones, y es 61-80. En algunas realizaciones, y es 30-50. En algunas realizaciones, y es 12, 24, 36 ó 48. En algunas realizaciones, z es 1. En algunas realizaciones, z es 0.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el carbonilo terminal del grupo [PEG(y)]z forma parte de un enlace amida.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la amina terminal del grupo [PEG(y)]z forma parte de un enlace amida.
En algunas realizaciones, R4 es
Figure imgf000043_0002
Según una variante dada a conocer en el presente documento, x es 1-20. En algunas realizaciones, x es 21-40. En algunas realizaciones, x es 41-60. En algunas realizaciones, x es 61-80. En algunas realizaciones, x es 30-50. En algunas realizaciones, x es 12, 24, 36 ó 48.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, w es 1. En algunas realizaciones, w es 0.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, R4 tiene la
Figure imgf000043_0003
Según una variante dada a conocer en el presente documento, R2 está unido a A mediante J, y R4 está unido a B. Según una variante dada a conocer en el presente documento, R2 está unido a B mediante J, y R4 está unido a. Según una variante dada a conocer en el presente documento, R4 está unido a B mediante el carbono de carbonilo terminal.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000044_0001
Según una variante dada a conocer en el presente documento R2 está unido a A mediante un enlace carbono-nitrógeno o un enlace carbono-azufre.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, R2 está unido a A mediante un enlace carbononitrógeno.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el enlace carbono-nitrógeno es un enlace amida. Según una variante dada a conocer en el presente documento, R2 está unido a A mediante un enlace biológicamente lábil.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, R2 está unido a A mediante un enlace amida entre el aminoácido C-terminal de A y un grupo amino en B.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el aminoácido terminal es cisteína.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, R2 está unido a A mediante un enlace carbono-azufre. Según una variante dada a conocer en el presente documento, R2 está unido a A mediante un enlace carbono-azufre formado entre R2 y un tiol libre.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, R2 está unido a A mediante un enlace succinimidaazufre.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, J comprende un residuo ramificado.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, J está unido a más de un A mediante el residuo ramificado.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, B comprende un residuo ramificado.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, B está unido a más de un A, cada uno mediante una unión distinta de peptidilo con el residuo ramificado.
Según la invención, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000044_0002
en la que Xa es una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina; y en la que Ra representa una estructura orgánica que se conecta a uno de A o B y Rb representa una estructura orgánica que se conecta al otro de A o B.
En algunas realizaciones, Xa tiene la estructura:
Figure imgf000045_0001
o un tautómero de la misma.
En algunas realizaciones, Xa tiene la estructura:
Figure imgf000045_0002
en la que Rc es H, alquilo o arilo;
o un tautómero de la misma.
En algunas realizaciones, Ra está conectado al ciclooctano y Rb está conectado a la dihidropiridazina.
En algunas realizaciones, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000045_0003
o un tautómero de la misma.
En algunas realizaciones, Xa tiene la estructura:
Figure imgf000046_0001
en la que Rc es H, alquilo o arilo;
o un tautómero de la misma.
En algunas realizaciones, Rc es metilo.
En algunas realizaciones, Ra y Rb son independientemente un enlace o una estructura orgánica que comprende o que consiste en una cadena de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10 o más restos, en el que cada resto se selecciona independientemente del grupo que consiste en [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, poli(alcohol vinílico), poli(vinil alquil éter), poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo C1-C10, cicloalcano C3-C10, alqueno C2-C10, cicloalqueno C5-C10, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo C2-C5, acilamino C2-C5, aciloxilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoílo, un aminoácido, un grupo arilo, un grupo heteroarilo, un carbamato, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a un triazol, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a una isoxazolidina, un dibenzocicloocteno, un
dibenzoazacicloocteno
Figure imgf000046_0002
Figure imgf000047_0001
en los que Xi es CH o N, X2 es CH2 o un grupo carbonilo, y R5 es un grupo arilo o alquilo;
en la que [PEG(y)]z es:
Figure imgf000047_0002
En algunas realizaciones, Ra y Rb son independientemente un enlace o una estructura orgánica que comprende o que consiste en una cadena de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10 o más restos, en el que cada resto se selecciona independientemente del grupo que consiste en [PEG(y)]z, acilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, un aminoácido, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a un triazol, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a
Figure imgf000047_0003
Figure imgf000048_0001
en los que Xi es CH o N, X2 es CH2 o un grupo carbonilo, y R5 es un grupo arilo o alquilo;
en el que [PEG(y)]z es:
Figure imgf000048_0002
En algunas realizaciones,
Figure imgf000048_0003
Rb está unido a A mediante un enlace carbono-nitrógeno o un enlace carbono-azufre. En algunas realizaciones,
Figure imgf000048_0004
está unido a A mediante un enlace carbono-nitrógeno.
En algunas realizaciones, el enlace carbono-nitrógeno es un enlace amida.
En algunas realizaciones,
Figure imgf000048_0006
está unido a A mediante un
Figure imgf000048_0005
enlace biológicamente lábil.
En algunas realizaciones,
Figure imgf000048_0007
Rb está unido a A mediante un enlace amida entre el aminoácido C-terminal de A y un grupo amino en B.
En algunas realizaciones, el aminoácido terminal es cisteína.
En algunas realizaciones, Ra o Rb está unido a A mediante un enlace carbono-azufre.
En algunas realizaciones, Ra o Rb está unido a A mediante un enlace carbono-azufre formado entre Ra o Rb y un tiol libre.
En algunas realizaciones, en las que Ra o Rb está unido a A mediante un enlace succinimida-azufre.
En algunas realizaciones, Ra o Rb comprende un residuo ramificado.
En algunas realizaciones, Ra o Rb está unido a más de un A mediante el residuo ramificado.
En algunas realizaciones, la actividad biológica de A se aumenta cuando forma parte de un compuesto o dímero de la invención en comparación con la actividad biológica de A cuando no está unido a ninguna otra estructura.
En algunas realizaciones, A comprende la estructura de un compuesto que es un fármaco aprobado para tratar a un sujeto que padece una enfermedad.
En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto mamífero.
En algunas realizaciones, el sujeto mamífero es un sujeto humano.
En algunas realizaciones, A comprende la estructura de un compuesto orgánico que tiene un peso molecular de menos de 1000 Dalton, un aptámero de ADN, un aptámero de ARN, un oligonucleótido o una proteína que es biológicamente activa.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido es un oligonucleótido antisentido.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido es una molécula de inducción de interferencia de ARN.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido codifica para una molécula de inducción de interferencia de ARN.
En algunas realizaciones, A comprende una amina primaria o una secundaria.
En algunas realizaciones, A está unido a B mediante la amina primaria o secundaria.
En algunas realizaciones, A comprende una amina primaria.
En algunas realizaciones, A es aripiprazol u oseltamivir.
En algunas realizaciones, A comprende una amina secundaria.
En algunas realizaciones, A es un fármaco respiratorio, un agente antihistamínico, un agente analgésico, un antidepresivo, un agente antianginoso, un agente antiarrítmico, un agente antihipertensor, un agente antidiabético, un antihistamínico, un agente antiinfeccioso, un antibiótico, un agente antiinflamatorio, un fármaco antiparkinsoniano, un antipsicótico, un agente antipirético, un agente antiulceroso, un fármaco contra trastorno por déficit de atención con hiperactividad (ADHD), un estimulante del sistema nervioso central, un descongestionante o un psicoestimulante.
En algunas realizaciones, A es alprenolol, acebutolol, amidefrina, amineptina, amosulalol, amoxapina, anfetaminilo, atenolol, atomoxetina, balofloxacino, bametán, befunolol, benazepril, benfluorex, benzoctamina, betahistina, betaxolol, bevantolol, bifemelano, bisoprolol, brinzolamida, bufeniodo, butetamina, camilofina, carazolol, carticaína, carvedilol, cefaelina, ciprofloxacino, clozapina, clobenzorex, clorprenalina, ciclopentamina, delapril, demexiptilina, denopamina, desipramina, desloratadina, diclofenaco, dimetofrina, dioxadrol, dobutamina, dopexamina, doripenem, dorzolamida, droprenilamina, duloxetina, eltoprazina, enalapril, enoxacino, epinefrina, ertapenem, esaprazol, esmolol, etoxadrol, fasudil, fendilina, fenetilina, fenfluramina, fenoldopam, fenoterol, fenproporex, flecamida, fluoxetina, formoterol, frovatriptan, gaboxadol, garenoxacino, gatifloxacino, grepafloxacino, hexoprenalina, imidapril, indalpina, indecainida, clorhidrato de indeloxazina, isoxsuprina, isproniclina, labetalol, landiolol, lapatinib, levofacetoperano, lisinopril, lomefloxacino, lotrafibán, maprotilina, mecamilamina, mefloquina, mepindolol, meropenem, metapramina, metaproterenol, metoxifenamina, metilfenidato dextrógiro, metilfenidato, metipranolol, metoprolol, mitoxantrona, mivazerol, moexipril, moprolol, moxifloxacino, nebivolol, nifenalol, nipradilol, norfloxacino, nortriptilina, nilidrina, olanzapina, oxamniquina, oxprenolol, oxifedrina, paroxetina, perhexilina, fenmetrazina, fenilefrina, fenilpropilmetilamina, foledrina, picilorex, pimetilina, pindolol, ácido pipemídico, piridocaína, practolol, pradofloxacino, pramipexol, pramiverina, prenalterol, prenilamina, prilocaína, procaterol, pronetalol, propafenona, propranolol, propilhexedrina, protoquilol, protriptilina, pseudoefedrina, reboxetina, rasagilina, (r)-rasagilina, repinotano, reproterol, rimiterol, ritodrina, safinamida, salbutamol/albuterol, salmeterol, sarizotano, sertralina, silodosina, sotalol, soterenol, esparfloxacino, espirapril, sulfinalol, sinefrina, tamsulosina, tebaniclina, tianeptina, tirofibán, tretoquinol, trimetazidina, troxipida, vareniclina, vildagliptina, viloxazina, viquidil o xamoterol.
En algunas realizaciones, A comprende una proteína que es biológicamente activa.
En algunas realizaciones, A comprende una proteína secretada.
En algunas realizaciones, A comprende un dominio extracelular de una proteína.
En algunas realizaciones, A es biológicamente activo de tal manera que tiene actividad de unión a diana.
En algunas realizaciones, el A es una proteína que se pliega de manera independiente o una porción de la misma.
En algunas realizaciones, A es una proteína glicosilada.
En algunas realizaciones, A comprende enlaces disulfuro dentro de la cadena.
En algunas realizaciones, A se une a una citocina.
En algunas realizaciones, la citocina es TNFa.
En algunas realizaciones, A comprende péptido natriurético auricular (ANP), calcitonina, hormona liberadora de corticotropina (CRH), endotelina, exenatida, péptido gástrico inhibidor (GIP), péptido similar a glucagón 1 (GLP-1), péptido similar a glucagón 2 (GLP-2), un análogo de GLP-1 o GLP-2, péptido intestinal vasoactivo de glucagón (GVIP), ghrelina, péptido YY o secretina o una porción de los mismos.
En algunas realizaciones, A comprende un tramo de aminoácidos consecutivos en la secuencia HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRG.
En algunas realizaciones, A comprende al menos un tramo de aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en la cadena pesada de un Fab o un Fab' de un anticuerpo.
En algunas realizaciones, A comprende al menos un al menos un tramo de aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en la cadena ligera de un Fab o un Fab' de un anticuerpo.
En algunas realizaciones, A comprende al menos un Fab o Fab' de un anticuerpo, o una porción del al menos un Fab o Fab'.
En algunas realizaciones, A comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9 ó 10 copias del Fab o Fab' o porción de los mismos.
En algunas realizaciones, A comprende Fab-1 o Fab'1 o una porción de los mismos del anticuerpo.
En algunas realizaciones, A comprende Fab-2 o Fab'2 o una porción de los mismos del anticuerpo.
En algunas realizaciones, A comprende dos manos de Fab o Fab' del anticuerpo.
En algunas realizaciones, el Fab o Fab' está presente en adalimumab
En algunas realizaciones, A comprende al menos un tramo de aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en un anticuerpo de cadena sencilla.
En algunas realizaciones, A comprende al menos un tramo de aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en un receptor de TNFa.
En algunas realizaciones, el receptor de TNFa es TNR1B.
En algunas realizaciones, un compuesto de la invención forma parte de un homodímero.
En algunas realizaciones, un compuesto de la invención forma parte de un heterodímero.
La presente invención proporciona homodímeros que comprenden compuestos de la invención.
La presente invención proporciona heterodímeros que comprenden compuestos de la invención.
En algunas realizaciones, cada compuesto del dímero puede unirse al otro mediante al menos un enlace disulfuro. En algunas realizaciones, cada compuesto del dímero puede unirse al otro mediante al menos un enlace disulfuro entre el Z de cada compuesto.
En algunas realizaciones, cada compuesto del dímero está unido al otro mediante al menos un enlace disulfuro. En algunas realizaciones, cada compuesto del dímero está unido al otro mediante al menos un enlace disulfuro entre el Z de cada compuesto.
En algunas realizaciones, cada compuesto del dímero está unido de manera no covalente al otro.
En el presente documento se da a conocer un compuesto que tiene la estructura:
Figure imgf000050_0001
en la que Z es un componente de proteína del compuesto, componente de proteína que comprende uno o más polipéptidos, en el que al menos uno de los uno o más polipéptidos comprende aminoácidos consecutivos que (i) son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo; (ii) se unen a un receptor de Fc; y (iii) tienen en su extremo N-terminal una cisteína o una selenocisteína;
en la que B es una estructura química que une Ra y C;
en la que la línea discontinua entre B y Z representa una unión peptidilo;
en la que L se selecciona del grupo que consiste en: -N3, un alquino,
Figure imgf000050_0002
alquilo o arilo, un grupo
Figure imgf000050_0003
una tetrazina y un trans-cicloocteno; y
en la que Ra es un enlace o una estructura orgánica que comprende o que consiste en una cadena de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10 o más restos, en la que cada resto se selecciona independientemente del grupo que consiste en [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, poli(alcohol vinílico), poli(vinil alquil éter), poli(ácido láctico), poli(ácido láctico glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo C1-C10, cicloalcano C3-C10, alqueno C2-C10, cicloalqueno C5-C10, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo C2-C5, acilamino C2-C5, aciloxilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoílo, un aminoácido, un grupo arilo, un grupo heteroarilo, un carbamato, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a un triazol, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a
una isoxazolidina, un dibenzocicloocteno, un dibenzoazacicloocteno
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000051_0002
en los que X1 es CH o N, X2 es CH2 o un grupo carbonilo, y R5 es un grupo arilo o alquilo;
en la que [PEG(y)]z es:
Figure imgf000051_0003
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la cisteína o selenocisteína se produce de manera natural en el tramo de aminoácidos consecutivos. En algunas realizaciones, la cisteína o selenocisteína no se produce de manera natural en el tramo de aminoácidos consecutivos.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, los aminoácidos consecutivos tienen en su extremo Nterminal una secuencia seleccionada del grupo que consiste en una cisteína, selenocisteína, CP, CPXCP (en la que X = P, R o S), CDKTHTCPPCP, CVECPPCP, CCVECPPCP y CDTPPPCPRCP.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el dominio Fc de un anticuerpo es un dominio Fc que se produce de manera natural de un anticuerpo.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el dominio Fc de un anticuerpo es un dominio Fc variante de un anticuerpo.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el dominio Fc variante de un anticuerpo es un dominio Fc mutado de un anticuerpo.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el dominio Fc mutado es un mutante de sustitución. Según una variante dada a conocer en el presente documento, el mutante de sustitución tiene una sustitución de aminoácido en el extremo N-terminal, el extremo C-terminal o en una posición del dominio Fc distinta del extremo N-terminal o el extremo C-terminal.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el mutante de sustitución tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 10-15, 15-20, 10-20 ó 20-50 sustituciones de aminoácido en el tramo de aminoácidos consecutivos del mismo. Según una variante dada a conocer en el presente documento, las sustituciones son sustituciones de aminoácido conservativas.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el dominio Fc mutado es un mutante de adición de aminoácido.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el mutante de adición de aminoácido tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 10-15, 15-20, 10-20 ó 20-50 aminoácidos añadidos en el tramo de aminoácidos consecutivos del mismo.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el dominio Fc mutado es un mutante de deleción de aminoácido.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el mutante de deleción de aminoácido tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 10-15, 15-20, 10-20 ó 20-50 aminoácidos delecionados en el tramo de aminoácidos consecutivos del mismo.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, los aminoácidos consecutivos son idénticos a un tramo de al menos 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 ó 190 aminoácidos consecutivos presente en la cadena del dominio Fc del anticuerpo.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, los aminoácidos consecutivos son idénticos al tramo de aminoácidos en la región de bisagra, la región CH2 o la región CH3 del dominio Fc o una porción de las mismas. Según una variante dada a conocer en el presente documento L es -N3.
Según una variante dada a conocer en el presente documento L es
Figure imgf000052_0001
Según una variante dada a conocer en el presente documento L es un alquino.
Según una variante dada a conocer en el presente documento el alquino es un grupo propargilo.
Según una variante dada a conocer en el presente documento el alquino es un grupo ciclooctino.
Según una variante dada a conocer en el presente documento el alquino tiene la estructura:
Figure imgf000052_0002
en la que X1 es CH o N, X2 es CH2 o un grupo carbonilo, y R5 es un grupo arilo o alquilo.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el alquino tiene la estructura:
Figure imgf000053_0001
conocer en el presente documento, L es una tetrazina.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la tetrazina tiene la estructura:
Figure imgf000053_0002
que Rc es H, alquilo o arilo.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la tetrazina tiene la estructura:
Figure imgf000053_0003
que Rc es H, alquilo o arilo.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la tetrazina tiene la estructura:
Figure imgf000053_0004
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la tetrazina tiene la estructura:
Figure imgf000053_0005
Según una variante dada a conocer en el presente documento, L es trans-cicloocteno.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el trans-cicloocteno tiene la estructura:
Figure imgf000053_0006
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el trans-cicloocteno tiene la estructura:
Figure imgf000054_0001
En algunas realizaciones, Ra o Rb es una estructura orgánica que comprende un grupo [PEG(y)]z.
En algunas realizaciones, Ra o Rb es una estructura orgánica que comprende un grupo polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, poli(alcohol vinílico), poli(vinil alquil éter), poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico) o polisacárido.
En algunas realizaciones, Ra o Rb es una estructura orgánica que comprende un grupo alquilo C1-C4.
En algunas realizaciones,
Figure imgf000054_0002
es una estructura orgánica que comprende una succinimida.
En algunas realizaciones,
Figure imgf000054_0003
es una estructura orgánica que comprende una amina.
En algunas realizaciones,
Figure imgf000054_0004
es una estructura orgánica que comprende un succinilo, malonilo, glutarilo, ft adipoílo.
En algunas realizaciones, Ra o Rb es una estructura orgánica que comprende un malonilo.
En algunas realizaciones,
Figure imgf000054_0005
es una estructura orgánica que comprende un aminoácido.
En algunas realizaciones,
Figure imgf000054_0006
es una estructura orgánica que comprende una cisteína.
En algunas realizaciones,
Figure imgf000054_0007
es una estructura orgánica que comprende una lisina.
En algunas realizaciones, Ra o Rb es una estructura orgánica que consiste en una cadena de 3 restos selecci del grupo que consiste en [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, poli(alcohol vinílico), poli(vinil alquil éter), poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo C1-C10, cicloalcano C3-C10, alqueno C2-C10, cicloalqueno C5-C10, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina,
acilo C2-C5, acilamino C2-C5, aciloxilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoílo, un aminoácido, un grupo
arilo, un grupo heteroarilo, un carbamato, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a un triazol, una estructura química
que contiene un cicloocteno condensado a una isoxazolidina, un dibenzocicloocteno, un dibenzoazacicloocteno,
Figure imgf000055_0001
En algunas realizaciones, Ra o Rb es una estructura orgánica que consiste en una cadena de cuatro restos seleccionados del grupo que consiste en [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, poli(alcohol vinílico), poli(vinil alquil éter), poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo C1-C10, cicloalcano C3-C10, alqueno C2-C10, cicloalqueno C5-C10, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo C2-C5, acilamino C2-C5, aciloxilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoílo, un aminoácido, un grupo arilo, un grupo heteroarilo, un carbamato, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a un triazol, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a una isoxazolidina, un dibenzocicloocteno, un
dibenzoazacicloocteno
Figure imgf000055_0002
Figure imgf000055_0003
En algunas realizaciones, Ra o Rb es una estructura orgánica que consiste en una cadena de cinco restos seleccionados del grupo que consiste en [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, poli(alcohol vinílico), poli(vinil alquil éter), poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo C1-C10, cicloalcano C3-C10, alqueno C2-C10, cicloalqueno C5-C10, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo C2-C5, acilamino C2-C5, aciloxilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoílo, un aminoácido, un grupo arilo, un grupo heteroarilo, un carbamato, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a un triazol, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a una isoxazolidina, un dibenzocicloocteno, un
dibenzoazacicloocteno
Figure imgf000056_0001
Figure imgf000056_0002
En algunas realizaciones, Ra o Rb comprende un grupo [PEG(y)]z unido a una lisina.
En algunas realizaciones, Ra o Rb comprende un grupo acilo C1-C4 unido a un grupo succinimida.
En algunas realizaciones, Ra o Rb comprende una lisina unida a un acilo C1-C4.
En algunas realizaciones, Ra o Rb comprende un grupo [PEG(y)]z, que está unido a un glutarilo.
En algunas realizaciones, Ra o Rb es una estructura orgánica que consiste en una cadena de tres, cuatro o cinco restos seleccionados del grupo que consiste en [PEG(y)]z, acilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, un aminoácido, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a un triazol, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a
Figure imgf000056_0003
un dibenzoazacicloocteno,
Figure imgf000057_0001
Según una variante dada a conocer en el presente documento, Ra o Rb es un enlace.
En algunas realizaciones, Ra o Rb es una cisteína.
En algunas realizaciones, Ra o Rb tiene una estructura lineal.
En algunas realizaciones, Ra o Rb tiene una estructura ramificada.
En algunas realizaciones, y es 1-20. En algunas realizaciones, y es 21-40. En algunas realizaciones, y es 41-60. En algunas realizaciones, y es 61-80. En algunas realizaciones, y es 30-50. En algunas realizaciones, y es 12, 24, 36 ó 48.
En algunas realizaciones, z es 1.
En algunas realizaciones, el carbonilo terminal del grupo [PEG(y)]z forma parte de un enlace amida.
En algunas realizaciones, la amina terminal del grupo [PEG(y)]z forma parte de un enlace amida.
En algunas realizaciones, Ra o Rb es
Figure imgf000058_0001
En algunas realizaciones, x es 1-20. En algunas realizaciones, x es 21-40. En algunas realizaciones, x es 41-60. En algunas realizaciones, x es 61-80. En algunas realizaciones, x es 30-50. En algunas realizaciones, x es 12, 24, 36 ó 48.
En algunas realizaciones, w es 1. En algunas realizaciones, w es 0.
En algunas realizaciones, Ra o Rb tiene la estructura:
Figure imgf000058_0002
En algunas realizaciones, Ra o Rb es:
Figure imgf000058_0003
en el que n es 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1-30, 1-40 ó 1-50, x es 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1-30, 1-40 ó 1-50 y z es 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1-30, 1-40 ó 1-50.
En algunas realizaciones, Ra o Rb es:
Figure imgf000059_0001
en el que n es 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1-30, 1-40 ó 1-50.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000060_0001
en la que n es 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1-30, 1-40 ó 1-50, x es 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1-30, 1-40 ó 1-50 y x es 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1-30, 1-40 ó 1-50.
En el presente documento también se da a conocer un procedimiento para producir un compuesto que tiene la estructura:
Figure imgf000061_0001
en la que A es una estructura biológicamente activa del compuesto;
en la que Z es un componente de proteína del compuesto, componente de proteína que comprende uno o más polipéptidos, en el que al menos uno de los uno o más polipéptidos comprende aminoácidos consecutivos que (i) son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo; (ii) se unen a un receptor de Fc; y (iii) tienen en su extremo N-terminal una cisteína o una selenocisteína;
en la que B es una estructura química que une A y Z;
en la que la línea discontinua entre B y Z representa una unión peptidilo;
en la que la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo;
que comprende las siguientes etapas:
a) obtener un A' que comprende A o un derivado de A, y un primer grupo reactivo terminal;
b) obtener un B' que comprende B o un derivado de B, un segundo grupo reactivo terminal y un tercer grupo reactivo terminal, en el que el segundo grupo reactivo terminal puede reaccionar con el primer grupo reactivo terminal para formar una unión distinta de peptidilo;
c) obtener un Z' que comprende Z o un derivado de Z, y un cuarto grupo reactivo terminal, en el que el cuarto grupo reactivo terminal puede reaccionar con el tercer grupo reactivo terminal para formar una unión peptidilo; y d) hacer reaccionar A', B' y Z' en cualquier orden para producir el compuesto.
En algunas realizaciones, la cisteína o selenocisteína se produce de manera natural en el tramo de aminoácidos consecutivos. En algunas realizaciones, la cisteína o selenocisteína no se produce de manera natural en el tramo de aminoácidos consecutivos.
En algunas realizaciones, los aminoácidos consecutivos tienen en su extremo N-terminal una secuencia seleccionada del grupo que consiste en una cisteína, selenocisteína, CP, CPXCP (en la que X = P, R o S), CDKTHTCPPCP, CVECPPCP, CCVECPPCP y CDTPPPCPRCP.
En algunas realizaciones, el dominio Fc de un anticuerpo es un dominio Fc que se produce de manera natural de un anticuerpo.
En algunas realizaciones, el dominio Fc de un anticuerpo es un dominio Fc variante de un anticuerpo.
En algunas realizaciones, el dominio Fc variante de un anticuerpo es un dominio Fc mutado de un anticuerpo.
En algunas realizaciones, el dominio Fc mutado es un mutante de sustitución.
En algunas realizaciones, el mutante de sustitución tiene una sustitución de aminoácido en el extremo N-terminal, el extremo C-terminal o en una posición del dominio Fc distinta del extremo N-terminal o el extremo C-terminal.
En algunas realizaciones, el mutante de sustitución tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 10-15, 15-20, 10-20 ó 20-50 sustituciones de aminoácido en el tramo de aminoácidos consecutivos del mismo.
En algunas realizaciones, las sustituciones son sustituciones de aminoácido conservativas.
En algunas realizaciones, el dominio Fc mutado es un mutante de adición de aminoácido.
En algunas realizaciones, el mutante de adición de aminoácido tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 10-15, 15-20, 10-20 ó 20-50 aminoácidos añadidos en el tramo de aminoácidos consecutivos del mismo.
En algunas realizaciones, el dominio Fc mutado es un mutante de deleción de aminoácido.
En algunas realizaciones, el mutante de deleción de aminoácido tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 10-15, 15-20, 10-20 ó 20-50 aminoácidos delecionados en el tramo de aminoácidos consecutivos del mismo. En algunas realizaciones, los aminoácidos consecutivos son idénticos a un tramo de al menos 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 ó 190 aminoácidos consecutivos presente en la cadena del dominio Fc del anticuerpo.
En algunas realizaciones, los aminoácidos consecutivos son idénticos al tramo de aminoácidos en la región de bisagra, la región CH2 o la región CH3 del dominio Fc o una porción de las mismas.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000062_0001
en el que R5 es un grupo alquilo o arilo
en la que R1 es H o forma parte de una estructura adicional que es una estructura cíclica, en la que la estructura cíclica adicional comprende R1 o una porción de R1, y también puede comprender R2 o una porción de R2, y el carbono entre R2 y el doble enlace de alqueno;
con la condición de que
Figure imgf000062_0002
es
Figure imgf000062_0003
es un anillo de triazol que comprende
Figure imgf000062_0004
anillo de isoxazolina sustituido con N-alquilo o arilo que comprende
en la que R2 representa una estructura orgánica que se conecta a uno de A o B y R4 representa una estructura orgánica que se conecta al otro de A o B;
que comprende las siguientes etapas:
a) obtener un A' que comprende A o un derivado de A, y un primer grupo reactivo terminal;
b) obtener un B' que comprende B o un derivado de B, un segundo grupo reactivo terminal y un tercer grupo reactivo terminal, en el que el segundo grupo reactivo terminal puede reaccionar con el primer grupo reactivo terminal para formar una unión distinta de peptidilo;
c) obtener un C' que comprende C o un derivado de C, y un cuarto grupo reactivo terminal, en el que el cuarto grupo reactivo terminal puede reaccionar con el tercer grupo reactivo terminal para formar una unión peptidilo; y d) hacer reaccionar A', B' y C' en cualquier orden para producir el compuesto.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la etapa d) se realiza haciendo reaccionar en primer A
B"
lugar A’ y B’ para producir en el que B” comprende B y el tercer grupo reactivo terminal, y la línea continua
Figure imgf000063_0001
entre B” y A representa una unión distinta de peptidilo; y después hacer reaccionar con C’ para producir el compuesto.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la etapa d) se realiza haciendo reaccionar en primer 0 i Í J
lugar C’ y B’ para producir
Figure imgf000063_0002
} en el que B” comprende B y el segundo grupo reactivo terminal, y la línea discontinua
Figure imgf000063_0003
entre B” y C representa una unión peptidilo; y después hacer reaccionar con A’ para producir el compuesto. Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal es una azida, un tiol, una nitrona o un alquino.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal es un alquino. Según una variante dada a conocer en el presente documento, el alquino es un cicloalquino.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el alquino es un anillo de ocho miembros.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el alquino es un azaciclooctino.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el cicloalquino es un biarilazaciclooctino.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el cicloalquino es un ciclooctino.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el alquino es un alquino terminal.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal es una azida, tiol o nitrona.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal es una azida.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal es un tiol.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal es una nitrona. Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal es una N-alquil nitrona.
S eg ún una v a ria n te da da a c o n o c e r en el p re se n te do cu m e n to , el p rim e r g ru p o rea c tivo te rm in a l es una N -a ril-n itro na . Según una variante dada a conocer en el presente documento, el segundo grupo reactivo terminal es una azida, un tiol, una nitrona o un alquino.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el segundo grupo reactivo terminal es un alquino. Según una variante dada a conocer en el presente documento, el alquino es un cicloalquino.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el alquino es un anillo de ocho miembros.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el alquino es un azaciclooctino.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el cicloalquino es un biarilazaciclooctino.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el cicloalquino es un ciclooctino.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el alquino es un alquino terminal.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el segundo grupo reactivo terminal es una azida, tiol o nitrona.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el segundo grupo reactivo terminal es una azida. Según una variante dada a conocer en el presente documento, el segundo grupo reactivo terminal es un tiol.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el segundo grupo reactivo terminal es una nitrona. Según una variante dada a conocer en el presente documento, el segundo grupo reactivo terminal es una N-alquilnitrona.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el segundo grupo reactivo terminal es una N-arilnitrona.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal es un alquino terminal y el segundo grupo reactivo terminal es una azida, tiol o nitrona.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el segundo grupo reactivo terminal es una azida. Según una variante dada a conocer en el presente documento, el segundo grupo reactivo terminal es un tiol.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el segundo grupo reactivo terminal es una nitrona. Según una variante dada a conocer en el presente documento, la nitrona es una N-alquil o N-aril-nitrona.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal es una azida, tiol o nitrona, y el segundo grupo reactivo terminal es un alquino terminal.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal es una azida. Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal es un tiol.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal es una nitrona. Según una variante dada a conocer en el presente documento, la nitrona es una N-alquil o N-aril-nitrona.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal es un cicloalquino y el segundo grupo reactivo terminal es una azida, tiol o nitrona.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal es una azida. Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal es un tiol.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal es una nitrona. Según una variante dada a conocer en el presente documento, la nitrona es una N-alquil o N-aril-nitrona.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal es una azida, tiol o nitrona, y el segundo grupo reactivo terminal es un cicloalquino.
S eg ún una v a ria n te d a d a a c o n o c e r en el
Figure imgf000065_0001
o cu m e n to , el p rim e r g ru p o rea c tivo te rm in a l es una azida. Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal es un tiol. Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal es una nitrona. Según una variante dada a conocer en el presente documento, la nitrona
Figure imgf000065_0002
es una N-alquil o N-aril-nitrona. Según una variante dada a conocer en el presente documento, el cicloalquino es
Figure imgf000065_0003
un anillo de ocho miembro Según una variante dada a conocer en el presente documento, el cicloalquino es
Figure imgf000065_0004
un azaciclooctino.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el cicloalquino es
Figure imgf000065_0005
un biarilazaciclooctino. Según una variante dada a conocer en el presente documento, el cicloalquino es un ciclooctino.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal es una azida y el segundo grupo reactivo terminal es un alquino terminal; o el primer grupo reactivo terminal es una azida y el segundo grupo reactivo terminal es un cicloalquino; o el primer grupo reactivo terminal es un tiol y el segundo grupo reactivo terminal es un cicloalquino; o el primer grupo reactivo terminal es una N-alquil-nitrona o N-aril-nitrona y el segundo grupo reactivo terminal es un ciclooctino.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el segundo grupo reactivo terminal es una azida y el primer grupo reactivo terminal es un alquino terminal; o el segundo grupo reactivo terminal es una azida y el primer grupo reactivo terminal es un cicloalquino; o el segundo grupo reactivo terminal es un tiol y el primer grupo reactivo terminal es un cicloalquino; o el segundo grupo reactivo terminal es una N-alquil-nitrona o N-aril-nitrona y el primer grupo reactivo terminal es un ciclooctino.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal y el segundo grupo reactivo terminal reaccionan para producir un triazol, tioleno, N-alquil-isoxazolina o N-aril-isoxazolina.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal y el segundo grupo reactivo terminal reaccionan para producir un triazol.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal y el segundo grupo reactivo terminal reaccionan para producir un tioleno.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal y el segundo grupo reactivo terminal reaccionan para producir una N-alquil-isoxazolina o N-aril-isoxazolina.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, la reacción del primer grupo reactivo con el segundo grupo reactivo da como resultado un rendimiento de al menos el 80%, 85% o 90% de la reacción en menos de 3, 6 ,
12, 18, 24, 30, 36, 42, 48 ó 72 horas.
Según la invención, la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
Figure imgf000065_0006
en la que Xa es una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina; y
en la que Ra representa una estructura orgánica que se conecta a uno de A o B y Rb representa una estructura orgánica que se conecta al otro de A o B.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal es un trans-cicloocteno o una tetrazina.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal es un transcicloocteno.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el alquino es una tetrazina.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el segundo grupo reactivo terminal es un transcicloocteno o una tetrazina.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el segundo grupo reactivo terminal es un transcicloocteno.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el segundo grupo reactivo terminal tiene la estructura:
Figure imgf000066_0001
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el segundo grupo reactivo terminal tiene la estructura:
Figure imgf000066_0002
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el segundo grupo reactivo terminal es una tetrazina. Según una variante dada a conocer en el presente documento, el segundo grupo reactivo terminal tiene la estructura:
Figure imgf000066_0003
en la que Rc es H, alquilo o arilo.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el segundo grupo reactivo terminal tiene la estructura:
Figure imgf000066_0004
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal es un trans-cicloocteno y el segundo grupo reactivo terminal es una tetrazina.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal es una tetrazina y el segundo grupo reactivo terminal es un trans-cicloocteno.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal y el segundo grupo reactivo terminal reaccionan para producir una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el primer grupo reactivo terminal y el segundo grupo reactivo terminal reaccionan para producir la estructura química:
Figure imgf000067_0001
o un tautómero de la misma.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el tercer grupo reactivo y el cuarto grupo reactivo terminal son cada uno independientemente un aminoácido o derivado de aminoácido.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el tercer grupo reactivo es una treonina o derivado de treonina.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el tercer grupo reactivo es un derivado tioéster de un aminoácido.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el cuarto grupo reactivo es cisteína, selenocisteína, homocisteína u homoselenocisteína, o un derivado de cisteína, selenocisteína, homocisteína u homoselenocisteína. Según una variante dada a conocer en el presente documento, el cuarto grupo reactivo es cisteína o un derivado de cisteína.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el cuarto grupo reactivo es cisteína.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, A' se prepara mediante las siguientes etapas: i) obtener un A” que comprende A o un derivado de A, y un tramo de aminoácidos consecutivos que comprende una inteína;
ii) obtener un residuo de cisteína, selenocisteína, homocisteína u homoselenocisteína sustituido, o un derivado sustituido de un residuo de cisteína, selenocisteína, homocisteína u homoselenocisteína, en el que el residuo de cisteína está sustituido en el extremo C-terminal con una estructura orgánica que contiene un alquino, una azida, un tiol o una nitrona; y
iii) hacer reaccionar A” con el residuo de cisteína sustituido para producir A'.
En algunas realizaciones, la estructura orgánica que contiene un alquino es N-propargil-amina.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, A' se prepara mediante las siguientes etapas: i) obtener un A” que comprende A o un derivado de A, y que comprende al menos un grupo tiol libre;
ii) obtener un compuesto que comprende un primer grupo reactivo terminal y una maleimida terminal; y
iii) hacer reaccionar A” con el compuesto de la etapa ii) para producir A'.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, A” se prepara mediante las siguientes etapas: a) obtener un A''', en el que A''' es un polipéptido que comprende A o un derivado de A, y que comprende al menos un enlace disulfuro; y
b) tratar A''' con mercaptoetilamina (MEA) para producir A”.
En algunas realizaciones, el A''' se prepara mediante las siguientes etapas:
a) obtener un anticuerpo monoclonal que comprende A o derivado de A, y que comprende al menos un enlace disulfuro; y
b) tratar el polipéptido de la etapa a) con IdeS para producir A'''.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el anticuerpo monoclonal se une a TNFa.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el anticuerpo monoclonal es adalimumab.
S eg ún una v a ria n te d a d a a c o n o c e r en el p re se n te d o cu m e n to , si R i es h id ró g e n o y el p rim e r g ru p o rea c tivo te rm in a l es a lqu ino , e n to n ce s en la e ta p a d) se hace re a c c io n a r B' en p re se n c ia de un c a ta liz a d o r de m etal.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, si Ri es hidrógeno y el segundo grupo reactivo terminal es alquino, entonces en la etapa d) se hace reaccionar B' en presencia de un catalizador de metal.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el catalizador de metal es Ag(I) o Cu(I).
Según una variante dada a conocer en el presente documento, A' comprende uno o más residuos ramificados, en el que cada residuo ramificado comprende un primer grupo reactivo terminal adicional.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, B' comprende uno o más residuos ramificados, en el que cada residuo ramificado comprende un segundo grupo reactivo terminal adicional.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, B' comprende uno o más residuos ramificados, en el que cada residuo ramificado comprende un tercer grupo reactivo terminal adicional.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el residuo ramificado es un residuo de aminoácido.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el residuo de aminoácido es una lisina o un derivado de lisina, arginina o un derivado de arginina, ácido aspártico o un derivado de ácido aspártico, ácido glutámico o un derivado de ácido glutámico, asparaginas o un derivado de asparaginas, glutamina o derivado de glutamina, tirosina o derivado de tirosina, cisteína o derivado de cisteína u ornitina o derivado de ornitina.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el residuo de aminoácido está sustituido en la posición N con un residuo que contiene un grupo reactivo amino o carbonilo terminal.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el residuo ramificado es un residuo orgánico que contiene dos o más grupos amino terminales o dos o más grupos carbonilo terminales.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el residuo orgánico es ácido iminodipropiónico, ácido iminodiacético, ácido 4-amino-pimélico, ácido 4-amino-heptanodioico, ácido 3-aminohexanodioico, ácido 3-aminoadípico, ácido 2-aminooctanodioico o ácido 2 -amino-6-carbonil-heptanodioico.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el procedimiento se realiza en ausencia de un agente reductor distinto de tiol.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el procedimiento se realiza en ausencia de un agente reductor de tiol.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el procedimiento se realiza en presencia de un agente reductor de tiol.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el procedimiento se realiza con un rendimiento global del 80% o superior.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el procedimiento se realiza con un rendimiento global del 90% o superior.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, hacer reaccionar el primer grupo reactivo con el segundo grupo reactivo da como resultado un rendimiento de al menos el 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 85% o 90% de la reacción en menos de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10 ó 60 minutos.
En algunas realizaciones, B es un residuo de ácido orgánico.
En algunas realizaciones, B es un tramo de 1-50 residuos de aminoácido, y opcionalmente, un residuo de ácido orgánico.
En algunas realizaciones, B es un tramo de 1-10 aminoácidos consecutivos.
En algunas realizaciones, B comprende un tramo de aminoácidos consecutivos en la secuencia o una porción de los mismos, EPKSCDKTHTCPPCP, ERKCCVECPPCP, ELKTPLGDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3, ESKYGPPCPSCP.
En algunas realizaciones, B tiene una treonina en su extremo C-terminal.
En algunas realizaciones, Z comprende un C, en el que C es un primer polipéptido, primer polipéptido que comprende aminoácidos consecutivos que (i) son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo; (ii) se unen a un receptor de Fc; y (iii) tienen en su extremo N-terminal una secuencia seleccionada del grupo que consiste en una cisteína, selenocisteína, CP, CPXCP (en la que X = P, R o S), CDKTHTCPPCP, CVECPPCP, CCVECPPCP y CDTPPPCPRCP.
En algunas realizaciones, C comprende aminoácidos consecutivos que (i) son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo; (ii) se unen a un receptor de Fc; y (iii) tienen en su extremo N-terminal una secuencia que comprende una cisteína que se produce de manera natural seleccionada del grupo que consiste en CP, CPXCP (en la que X = P, R o S), CDKTHTCPPCP, CVECPPCP, CCVECPPCP y CDTPPPCPRCP.
En algunas realizaciones, C es un componente de polipéptido del compuesto, componente de polipéptido que comprende aminoácidos consecutivos que (i) son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo; (ii) se unen a un receptor de Fc; y (iii) tienen en su extremo N-terminal una secuencia que comprende una cisteína que no se produce de manera natural o selenocisteína.
En algunas realizaciones, C comprende aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en la cadena de un dominio Fc de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en IgG, IgM, IgA, IgD e IgE.
En algunas realizaciones, C comprende aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en la cadena de un dominio Fc6 de un anticuerpo.
En algunas realizaciones, C comprende además aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en una cadena de un anticuerpo distinta de una cadena de un dominio Fc del anticuerpo.
En algunas realizaciones, C comprende aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en una cadena pesada de un Fab o un Fab' de un anticuerpo.
En algunas realizaciones, C comprende aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en la cadena ligera de un Fab o un Fab' de un anticuerpo.
En algunas realizaciones, Z comprende además un segundo polipéptido, segundo polipéptido que comprende aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en una cadena de un anticuerpo distinta de una cadena de un dominio Fc del anticuerpo.
En algunas realizaciones, el segundo polipéptido comprende aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en una cadena pesada de un Fab o un Fab' de un anticuerpo.
En algunas realizaciones, el segundo polipéptido comprende aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en la cadena ligera de un Fab o un Fab' de un anticuerpo.
En algunas realizaciones, Z comprende un anticuerpo o una porción del mismo.
En algunas realizaciones, Z comprende al menos un Fab o Fab' de un anticuerpo, o una porción del al menos un Fab o Fab'.
En algunas realizaciones, Z comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 ó 10 copias del Fab o Fab' o porción de los mismos.
En algunas realizaciones, Z comprende Fab-1 o Fab'1 o una porción de los mismos de un anticuerpo.
En algunas realizaciones, Z comprende Fab-2 o Fab'2 o una porción de los mismos de un anticuerpo.
En algunas realizaciones, Z comprende dos manos de Fab o Fab' de un anticuerpo.
En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo de IgG, IgM, IgA, IgD o IgE.
En algunas realizaciones, el Fab o Fab' está presente en adalimumab.
En algunas realizaciones, Z comprende al menos un tramo de aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en un anticuerpo de cadena sencilla.
En algunas realizaciones, el extremo C-terminal de C comprende un tramo de aminoácidos consecutivos presente en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo que se ha modificado.
En algunas realizaciones, el extremo C-terminal de C es una cisteína, selenocisteína, homocisteína u homoselenocisteína, o un derivado de cisteína, selenocisteína, homocisteína u homoselenocisteína.
En algunas realizaciones, B está unido a Z mediante una unión peptidilo entre una cisteína o selenocisteína N-terminal de un polipéptido de Z y un residuo de aminoácido o un residuo de ácido orgánico de B.
En algunas realizaciones, Z comprende un segundo polipéptido, y B está unido a Z mediante una unión peptidilo entre la cisteína o selenocisteína N-terminal del segundo polipéptido de Z y un residuo de aminoácido o un residuo de ácido orgánico de B.
En algunas realizaciones, B está unido a C mediante una unión peptidilo entre la cisteína o selenocisteína N-terminal de C y un residuo de aminoácido o un residuo de ácido orgánico de B.
En algunas realizaciones, Z comprende un polipéptido, que es C.
En algunas realizaciones, Z comprende dos polipéptidos, que son C y un segundo polipéptido.
La presente invención proporciona homodímeros y heterodímeros que comprenden compuestos de la invención. En algunas realizaciones, cada compuesto del dímero puede unirse al otro mediante al menos un enlace disulfuro. En algunas realizaciones, cada compuesto del dímero puede unirse al otro mediante al menos un enlace disulfuro entre el C o el segundo polipéptido de cada compuesto.
En algunas realizaciones, cada compuesto del dímero está unido al otro mediante al menos un enlace disulfuro. En algunas realizaciones, cada compuesto del dímero está unido al otro mediante al menos un enlace disulfuro entre el C o el segundo polipéptido de cada compuesto.
En algunas realizaciones, cada compuesto del dímero está unido de manera no covalente al otro.
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el dímero es:
Figure imgf000071_0001
Figure imgf000072_0001
 Ċ
Figure imgf000074_0001
En algunas realizaciones, el dímero es:
Ċ
Figure imgf000075_0001
Según una variante dada a conocer en el presente documento, el dímero es:
Figure imgf000076_0001
En las figuras se muestran ejemplos no limitativos adicionales de dímeros de compuestos de la presente invención. En algunas realizaciones, el residuo ramificado es una lisina o un derivado de lisina, arginina o un derivado de arginina, ácido aspártico o un derivado de ácido aspártico, ácido glutámico o un derivado de ácido glutámico, asparaginas o un derivado de asparaginas, glutamina o derivado de glutamina, tirosina o derivado de tirosina, cisteína o derivado de cisteína u ornitina o derivado de ornitina.
En algunas realizaciones, el residuo ramificado es un aminoácido sustituido en la posición N con un residuo que contiene un grupo reactivo amino o carbonilo terminal. En algunas realizaciones, el residuo ramificado es un residuo orgánico que contiene dos o más grupos amino terminales o dos o más grupos carbonilo terminales.
En algunas realizaciones, el residuo ramificado es un residuo orgánico que contiene dos o más grupos amino terminales. En algunas realizaciones, el residuo ramificado es un residuo orgánico que contiene dos o más grupos carbonilo terminales. En algunas realizaciones, el residuo ramificado es un ácido diaminopropiónico. En algunas realizaciones, el residuo ramificado es un compuesto de carbonilo diaminopropiónico.
En algunas realizaciones, el residuo ramificado es 4-(carbonilmetoxi)fenilalanina, ácido 2-amino-6-(carbonilmetilamino)hexanoico, S-(carbonilpropil)cisteína, S-(carboniletil)cisteína, S-(carbonilmetil)cisteína, N-(carboniletil)glicina, N-(carbonilmetil)glicina, ácido iminodipropiónico, ácido iminodiacético, ácido 4-amino-pimélico, ácido 4-aminoheptanodioico, ácido 3-aminohexanodioico, ácido 3-aminoadípico, ácido 2-aminooctanodioico o ácido 2 -amino-6-carbonil-heptanodioico.
En algunas realizaciones, el residuo ramificado se prepara a partir de Fmoc-L-Asp-AMC, Fmoc-L-Asp-pNA, Fmoc-LGlu-AMC, Fmoc-L-Glu-pNA, Fmoc-L-Glu(Edans)-OH, Fmoc-L-Glu(PEG-biotinil)-OH, éster 6-terc-butílico del ácido (S)-Fmoc-2-amino-hexanodioico, éster 6-terc-butílico del ácido (S)-Fmoc-2-amino-adípico, (S)-Fmoc-Aad(OtBu)-OH, éster 6-terc-butílico del ácido (S)-Fmoc-2-amino-5-terc-butoxicarbonil-hexanodioico, éster 7-terc-butílico del ácido (S)-Fmoc-2-amino-heptanodioico, éster 7-terc-butílico del ácido (S)-Fmoc-2-amino-pimélico, éster 7-terc-butílico del ácido (S)-Fmoc-2-amino-6-terc-butoxicarbonil-heptanodioico, éster 8-terc-butílico del ácido (S)-Fmoc-2-amino-octanodioico, éster 8-terc-butílico del ácido (S)-Fmoc-2-amino-subérico, (S)-Fmoc-Asu(OtBu)-OH, éster 1 -terc-butílico del ácido (R)-Fmoc-3-amino-hexanodioico, éster 1 -terc-butílico del ácido (R)-Fmoc-3-amino-adípico, éster 1 -terc-butílico del ácido (R)-Fmoc-4-amino-heptanodioico, éster 1 -terc-butílico del ácido (R)-Fmoc-4-amino-pimélico, ácido Bociminodiacético, ácido Fmoc-iminodiacético, ácido Boc-iminodipropiónico, ácido Fmoc-iminodipropiónico, Fmoc-N-(tercbutoxicarbonilmetil)-glicina, Fmoc-N-(terc-butoxicarboniletil)-glicina, ácido (R)-Fmoc-2-amino-3-(tercbutoxicarbonilmetilsulfanil)-propiónico de Fmoc-L-Cys(terc-butoxicarbonilmetil)-OH, ácido (R)-Fmoc-2-amino-3-(3-terc-butoxicarbonilpropilsulfanil)-propiónico de Fmoc-L-Cys(terc-butoxicarbonilpropil)-OH, ácido (R)-Fmoc-2-amino-3-(2-terc-butoxicarboniletilsulfanil)-propiónico de Fmoc-L-Cys(terc-butoxicarboniletil)-OH, Fmoc-4-(tercbutoxicarbonilmetoxi)-L-fenilalanina o ácido (S)-Fmoc-2-amino-6-(Boc-terc-butoxicarbonilmetilamino)-hexanoico.
En algunas realizaciones, el residuo ramificado se prepara a partir de ácido N-a-Boc-DL-diaminopropiónico, ácido N-a-Boc-D-diaminopropiónico, ácido N-a-Boc-L-diaminopropiónico, ácido N-a-Fmoc-L-diaminopropiónico, ácido N-a-Boc-N-p-Alloc-D-diaminopropiónico, ácido N-a-Boc-N-p-Alloc-L-diaminopropiónico, ácido N-a-Fmoc-N-p-alloc-L-diaminopropiónico, ácido N-a-N-p-Bis-Boc-L-diaminopropiónico, ácido N-a-Fmoc-N-p-Boc-D-diaminopropiónico, ácido N-a-Fmoc-N-p-Boc-L-diaminopropiónico, ácido N-a-Z-N-p-Boc-L-diaminopropiónico, ácido N-a-Boc-N-p-Fmoc-D-diaminopropiónico, ácido N-a-Boc-N-p-Fmoc-L-diaminopropiónico, ácido N-a-N-p-Bis-Fmoc-L-diaminopropiónico, ácido N-a-Z-N-p-Fmoc-L-diaminopropiónico, ácido N-a-Boc-N-p-Z-L-diaminopropiónico, ácido N-a-Fmoc-N-p-Z-L-diaminopropiónico, ácido N-a-Fmoc-N-p-(Boc-aminooxiacetil)-L-diaminopropiónico, ácido N-a-Boc-N-gamma-Fmoc-D-diaminobutírico, ácido N-a-Boc-N-gamma-Fmoc-L-diaminobutírico, ácido N-a-Boc-N-gamma-Fmoc-L-diaminobutírico, ácido N-a-Fmoc-N-gamma-Boc-D-diaminobutírico, ácido N-a-Fmoc-N-gamma-Boc-L-diaminobutírico, ácido N-a-Fmoc-N-gamma-Alloc-L-diaminobutírico, ácido (S)-N-b-Fmoc-N-gamma-Boc-3,4-diaminobutírico, H-L-ornitina, N-a-Boc-N-delta-Alloc-L-ornitina, N-a-Fmoc-N-delta-Alloc-L-ornitina, N-a-Fmoc-N-delta-Boc-L-ornitina, ácido (S)-Boc-2-amino-5-azido-pentanoicoDCHA, ácido (S)-Fmoc-2-amino-5-azido-pentanoico, N-a-N-delta-bis-Boc-N-a-N-delta-bis(3-Boc-aminopropil)-L-ornitina, N-a-Boc-N-p-N-delta-N-delta-tris(3-Boc-aminopropil)-L-ornitina, Fmoc-L-Lys(Biotin)-OH, Fmoc-L-Lys(Dabcil)-OH, Fmoc-L-Lys(Boc)(Me)-OH, Fmoc-L-Lys(Boc)(iPr)-OH, ácido (2S,5R)-Fmoc-2-amino-4-(3-Boc-2,2-dimetil-oxazolidin-5-il)-butírico, ácido (S)-Fmoc-2-amino-6-(Boc-tercbutoxicarbonilmetil-amino)-hexanoico, ácido (S)-Fmoc-2-amino-7-(Boc-amino)-heptanoico, Fmoc-L-Arg(Me)(Pbf)-OH, Fmoc-L-Arg(Me)2(Pbf)-oH, Fmoc-L-Arg(Me)2-OH, ácido (S)-Fmoc-3-amino-5-[(N'-Pbf-pirrolidin-1-carboximidoil)-amino]-pentanoico, Fmoc-L-Homoarg(Et)2-OH, ácido Boc-3-amino-5-(Fmoc-amino)-benzoico, ácido 3,5-bis[2-(Bocamino)etoxi]-benzoico, Fmoc-4-[2-(Boc-amino)etoxi]-L-fenilalanina, hemisulfato de potasio y N,N-bis(N'-Fmoc-3-aminopropil)-glicina, hemisulfato de potasio y N,N-bis(N'-Fmoc-3-aminopropil)-glicina, Fmoc-N-(2-Boc-aminoetil)-glicina, Fmoc-N-(3-Boc-aminopropil)-glicina, Fmoc-N-(4-Boc-aminobutil)-glicina, ácido (R,S)-N-a-Fmoc-N-a'-Bocdiaminoacético, ácido N,N'-bis-Fmoc-diaminoacético, ácido (S)-N-4-Fmoc-N-8-Boc-diaminooctanoico, ácido (R,S)-N-Fmoc-N'-Boc-imidazolidin-2-carboxílico, Fmoc-p(NH-Boc)-L-Phe-OH, Boc-p(NH-Fmoc)-L-Phe-OH o Boc-p(NH-Z)-L-Phe-OH.
Se contempla que cada realización dada a conocer en el presente documento puede aplicarse a cada una de las otras realizaciones dadas a conocer. Por tanto, todas las combinaciones de los diversos elementos descritos en el presente documento están dentro del alcance de la invención.
Se entiende que, cuando se proporciona un intervalo de parámetros, todos los números enteros dentro de ese intervalo, y decimales de los mismos, también se proporcionan por la invención. Por ejemplo, “0,2-5 mg/kg/día” es una divulgación de 0,2 mg/kg/día, 0,3 mg/kg/día, 0,4 mg/kg/día, 0,5 mg/kg/día, 0,6 mg/kg/día, etc., hasta 5,0 mg/kg/día.
Términos
Tal como se usan en el presente documento, y a menos que se mencione lo contrario, cada uno de los siguientes términos tendrá la definición expuesta a continuación.
Unión peptidilo: la estructura
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Tramo de aminoácidos consecutivos: una pluralidad de aminoácidos dispuestos en una cadena, cada uno de los cuales está unido a un aminoácido precedente mediante un enlace peptídico, excepto porque el primer aminoácido en la cadena puede opcionalmente no estar unido a un aminoácido precedente. Los aminoácidos de la cadena pueden producirse de manera natural o no producirse de manera natural, o pueden comprender una mezcla de los mismos. Los aminoácidos, a menos que se indique lo contrario, pueden codificarse genéticamente, producirse de manera natural pero no codificarse genéticamente o no producirse de manera natural, y cualquier selección de los mismos.
Residuo de aminoácido N-terminal: el residuo terminal de un tramo de dos o más aminoácidos consecutivos que tiene un grupo funcional a-amino (NH2) libre, o un derivado de un grupo funcional a-amino (NH2).
Extremo N-terminal: el grupo a-amino (NH2) libre (o derivado del mismo) de un residuo de aminoácido N-terminal.
Residuo de aminoácido C-terminal: el residuo terminal de un tramo de dos o más aminoácidos consecutivos que tiene un grupo funcional a-carboxilo (COOH) libre, o un derivado de un grupo funcional a-carboxilo (COOH).
Extremo C-terminal: el grupo a-carboxilo (COOH) libre (o derivado del mismo) de un residuo de aminoácido C-terminal.
Una “estructura biológicamente activa”, tal como se usa en el presente documento, significa una estructura de una molécula o fragmento de la misma, que puede tratar una enfermedad o estado o localizar o dirigir un compuesto de la invención a un sitio de una enfermedad o estado en el organismo realizando una función o una acción, o estimulando o respondiendo a una función, una acción o una reacción, en un contexto biológico (por ejemplo en un organismo, una célula o un modelo in vitro de los mismos). Las estructuras biológicamente activas pueden comprender una estructura de al menos uno de polipéptidos, ácidos nucleicos, moléculas pequeñas tales como moléculas pequeñas orgánicas o inorgánicas.
Se entiende que un “enlace”, a menos que se especifique lo contrario, o sea contrario al contexto, incluye un enlace covalente, una interacción dipolo-dipolo tal como un enlace de hidrógeno, e interacciones intermoleculares tales como fuerzas de van der Waals.
Una “secuencia señal” es una cadena peptídica corta (de 3-60 aminoácidos de longitud) que dirige el transporte postraduccional de un polipéptido.
“Aminoácido” tal como se usa en el presente documento, en una realización, significa un isómero L o D de los aminoácidos codificados genéticamente, es decir isoleucina, alanina, leucina, asparagina, lisina, aspartato, metionina, cisteína, fenilalanina, glutamato, treonina, glutamina, triptófano, glicina, valina, prolina, arginina, serina, histidina, tirosina, selenocisteína, pirrolisina y también incluye homocisteína y homoselenocisteína.
Otros ejemplos de aminoácidos incluyen un isómero L o D de taurina, gaba, dopamina, lantionina, ácido 2-aminoisobutírico, deshidroalanina, ornitina y citrulina, así como homólogos no naturales y formas sintéticamente modificadas de los mismos incluyendo aminoácidos que tienen cadenas de alquileno acortadas o alargadas en hasta dos átomos de carbono, aminoácidos que comprenden grupos arilo opcionalmente sustituidos, y aminoácidos que comprenden grupos halogenados, incluyendo grupos alquilo y arilo halogenados, así como beta o gammaaminoácidos, y análogos cíclicos.
Debido a la presencia de grupos amino y carboxilo ionizables, los aminoácidos en estas realizaciones pueden estar en forma de sales ácidas o básicas, o pueden estar en formas neutras. También pueden modificarse residuos de aminoácido individuales mediante oxidación o reducción. Otras modificaciones contempladas incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, y metilación de los grupos alfaamino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina.
Pueden prepararse derivados covalentes uniendo grupos funcionales particulares a las cadenas laterales de aminoácido o a los extremos N o C-terminales.
Los compuestos que comprenden aminoácidos con sustituciones de grupo R están dentro del alcance de la invención. Se entiende que un experto habitual en la técnica puede seleccionar sustituyentes y patrones de sustitución en los compuestos de la presente invención para proporcionar compuestos que son químicamente estables a partir de materiales de partida fácilmente disponibles.
“Aminoácido natural” tal como se usa en el presente documento significa un isómero L o D de los aminoácidos genéticamente codificados, es decir isoleucina, alanina, leucina, asparagina, lisina, aspartato, metionina, cisteína, fenilalanina, glutamato, treonina, glutamina, triptófano, glicina, valina, prolina, arginina, serina, histidina, tirosina, selenocisteína, pirrolisina y homocisteína y homoselenocisteína.
“Aminoácido no natural” tal como se usa en el presente documento significa un isómero L o D químicamente modificado de isoleucina, alanina, leucina, asparagina, lisina, aspartato, metionina, cisteína, fenilalanina, glutamato, treonina, glutamina, triptófano, glicina, valina, prolina, arginina, serina, histidina, tirosina, selenocisteína, pirrolisina, homocisteína, homoselenocisteína, taurina, gaba, dopamina, lantionina, ácido 2-aminoisobutírico, deshidroalanina, ornitina o citrulina, incluyendo derivados de cisteína y selenocisteína que tienen cadenas laterales alifáticas C3-C10 entre el carbono alfa y el S o Se. En una realización, la cadena lateral alifática es un alquileno. En otra realización, la cadena lateral alifática es un alquenileno o alquinileno.
Además de los tramos de secuencias de aminoácidos consecutivos descritos en el presente documento, se contempla que pueden prepararse variantes de los mismos introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN codificante y/o mediante síntesis de las secuencias de aminoácidos consecutivos deseadas. Los expertos en la técnica apreciarán que cambios de aminoácidos pueden alterar procesos postraduccionales de los tramos de aminoácidos consecutivos descritos en el presente documento cuando la expresión es el método de síntesis elegido (en vez de la síntesis química, por ejemplo), tal como cambiar el número o la posición de sitios de glicosilación o alterar las características de anclaje a membrana.
Pueden realizarse variaciones en las secuencias descritas en el presente documento, por ejemplo, usando cualquiera de las técnicas y orientaciones para mutaciones conservativas y no conservativas expuestas, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, deleción o inserción de uno o más codones que codifican para la secuencia de aminoácidos consecutivos de interés que da como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia nativa. Opcionalmente, la variación es mediante sustitución de al menos un aminoácido con cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios. Puede encontrarse orientación en la determinación de qué residuo de aminoácido puede insertarse, sustituirse o delecionarse sin afectar de manera adversa a la actividad deseada, comparando la secuencia con la de moléculas de proteína conocidas homólogas y minimizando el número de cambios de secuencia de aminoácidos en regiones de alta homología. Pueden obtenerse sustituciones de aminoácido como resultado de sustituir un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tales como la sustitución de una leucina por una serina, es decir, sustituciones de aminoácido conservativas. Las inserciones o deleciones pueden estar opcionalmente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida puede determinarse realizando sistémicamente inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y sometiendo a prueba las variantes resultantes para determinar la actividad mostrada por la secuencia nativa madura o de longitud completa. Se entiende que cualquier variación terminal se realiza dentro del contexto de la invención dada a conocer en el presente documento.
Se preparan variantes de secuencia de aminoácidos de la pareja de unión teniendo en cuenta diversos objetivos, incluyendo aumentar la afinidad de la pareja de unión por su ligando, facilitar la estabilidad, purificación y preparación de la pareja de unión, modificar su semivida en plasma, mejorar la eficacia terapéutica y reducir la gravedad o aparición de efectos secundarios durante el uso terapéutico de la pareja de unión.
También se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de estas secuencias en el presente documento, incluyendo variantes de inserción, sustitución o deleción. Tales variantes pueden prepararse habitualmente mediante mutagénesis específica del sitio de nucleótidos en el ADN que codifica para el monómero de unión a diana, mediante lo cual se obtiene ADN que codifica para la variante, y después de eso expresando el ADN en cultivo de células recombinantes. También pueden prepararse de manera conveniente fragmentos que tienen hasta aproximadamente 100-150 residuos de aminoácido mediante síntesis in vitro. Tales variantes de secuencia de aminoácidos son variantes predeterminadas y no se encuentran en la naturaleza. Las variantes muestran la actividad biológica cualitativa (incluyendo unión a diana) de la forma no variante, aunque no necesariamente del mismo valor cuantitativo. Aunque el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado, la mutación en sí misma no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, con el fin de optimizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se lleva a cabo mutagénesis al azar o por saturación (en la que se insertan los 20 residuos posibles) en el codón objetivo y se examina la variante expresada para determinar la combinación óptima de actividades deseadas. Tal examen está dentro de la experiencia habitual en la técnica.
Las inserciones de aminoácido serán habitualmente del orden de aproximadamente desde 1 hasta 10 residuos de aminoácido; normalmente se introducen sustituciones para residuos individuales; y las deleciones oscilarán aproximadamente entre 1 y 30 residuos. Preferiblemente se realizan deleciones o inserciones en pares adyacentes, es decir una deleción de 2 residuos o inserción de 2 residuos. Resultará ampliamente evidente a partir de la siguiente discusión que se introducen o se combinan sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinación de las mismas para llegar a un producto final.
En un aspecto, la invención se refiere a un compuesto que comprende un tramo de aminoácidos consecutivos que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 80%, preferiblemente identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 81%, más preferiblemente identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 82%, aún más preferiblemente identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 83%, aún más preferiblemente identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 84%, aún más preferiblemente identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 85%, aún más preferiblemente identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 86%, aún más preferiblemente identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 87%, aún más preferiblemente identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 88%, aún más preferiblemente identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 89%, aún más preferiblemente identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 90%, aún más preferiblemente identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 91%, aún más preferiblemente identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 92%, aún más preferiblemente identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 93%, aún más preferiblemente identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 94%, aún más preferiblemente identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 95%, aún más preferiblemente identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 96%, aún más preferiblemente identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 97%, aún más preferiblemente identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 98% y aún más preferiblemente identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99% con respecto a una secuencia de aminoácidos dada a conocer en la memoria descriptiva, una figura, una SEQ ID NO. o una lista de secuencias de la presente solicitud.
Los valores de identidad de secuencia de aminoácidos en % pueden obtenerse fácilmente usando, por ejemplo, el programa informático WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)).
En el presente documento se proporcionan fragmentos de secuencias nativas. Tales fragmentos pueden estar truncados en el extremo N-terminal o el extremo C-terminal, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, en comparación con una proteína nativa de longitud completa. De nuevo, se entiende que cualquier variación terminal se realiza dentro del contexto de la invención dada a conocer en el presente documento.
Determinados fragmentos carecen de residuos de aminoácido que no son esenciales para una actividad biológica deseada de la secuencia de interés.
Puede usarse cualquiera de varias técnicas convencionales. Pueden sintetizarse químicamente fragmentos de péptidos deseados o fragmentos de tramos de aminoácidos consecutivos. Un enfoque alternativo implica generar fragmentos mediante digestión enzimática, por ejemplo tratando la proteína con una enzima que se sabe que escinde proteínas en sitios definidos mediante residuos de aminoácido particulares, o digiriendo el ADN con enzimas de restricción adecuadas y aislando el fragmento deseado. Aún otra técnica adecuada implica asilar y amplificar un fragmento de ADN que codifica para un fragmento de polipéptido/secuencia deseado, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Oligonucleótidos que definen los extremos terminales deseados del fragmento de ADN se emplean en los cebadores 5' y 3' en la PCR.
En realizaciones particulares, sustituciones conservativas de interés se muestran en la tabla 1 bajo el título de sustituciones preferidas. Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces se introducen cambios más sustanciales, denominados sustituciones a modo de ejemplo en la tabla 1 , o tal como se describe adicionalmente a continuación en referencia a las clases de aminoácidos, y se examinan los productos.
TABLA 1
Original A modo de ejemplo Preferida
Ala (A) val; leu; ile val
Arg (R) lys, gln; asn lys
Asn(N) gln; his, lys; arg gln
Asp(D) glu glu
Cys (C) ser ser
Gln (Q) asn asn
Glu (E) asp asp
Gly (G) pro; ala ala
His (H) asn; gln; lys; arg arg
He (1) leu; val; met; ala; phe; norleucina leu
Leu (L) norleucina, ile; val; met; ala, phe ile
Lys (K) arg; gln; asn arg
Met (M) leu; phe; ile leu
Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr leu
Pro (P) ala ala
Ser (S) thr thr
Thr (T) ser ser
Trp (W) tyr, phe tyr
Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe
Val (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu
Se logran modificaciones sustanciales en cuanto a la función o la identidad inmunológica de la secuencia seleccionando sustituciones que difieren significativamente en cuanto a su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la estructura principal de polipéptido en la zona de la sustitución, por ejemplo, como conformación en láminas o helicoidal, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio objetivo o (c) el volumen ocupado de la cadena lateral. Los residuos que se producen de manera natural se dividen en grupos basándose en propiedades de cadena lateral comunes:
(1 ) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
(2 ) hidrófilos neutros: cys, ser, thr;
(3) ácidos: asp, glu;
(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro;
(6 ) aromáticos: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservativas conllevarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Tales residuos sustituidos pueden introducirse también en los sitios de sustitución conservativa o, más preferiblemente, en los sitios restantes (no conservados).
Las variaciones pueden realizarse usando métodos conocidos en la técnica tales como mutagénesis mediada por oligonucleótido (dirigida al sitio), barrido de alanina y mutagénesis por PCR. Puede realizarse mutagénesis dirigida al sitio (Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)), mutagénesis en casete (Wells et al., Gene, 34:315 (1985)), mutagénesis por selección de restricción (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)) u otras técnicas conocidas en el ADN clonado para producir el ADN variante.
También puede emplearse análisis de aminoácidos por barrido para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de barrido preferidos se encuentran los aminoácidos neutros relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es normalmente un aminoácido de barrido preferido entre este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de cadena principal de la variante (Cunningham y Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)). También se prefiere normalmente alanina porque es el aminoácido más habitual. Además, se encuentra frecuentemente en posiciones tanto enterradas como expuestas (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)). Si la sustitución de alanina no produce cantidades adecuadas de variante, puede usarse un aminoácido isotérico.
Modificaciones covalentes: El tramo de aminoácidos consecutivos puede modificarse de manera covalente. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar residuos de aminoácido seleccionados como diana con un agente de derivatización orgánico que puede reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N o C-terminales que no participan en un enlace -x-x-. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para la reticulación con una superficie o matriz de soporte insoluble en agua para su uso en el método para purificar anticuerpos anti-secuencia de interés, y viceversa. Los agentes de reticulación habitualmente usados incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres disuccinimidílicos tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes tales como 3-((p-azidofenil)ditio)propioimidato de metilo.
Otras modificaciones incluyen desamidación de residuos de glutaminilo y asparaginilo para dar los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, metilación de los grupos alfa-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, págs.
79-86 (1983)), acetilación de la amina N-terminal, y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente comprende alterar el patrón de glicosilación nativo del tramo de aminoácidos consecutivos. Para los fines en el presente documento, se pretende que “alterar el patrón de glicosilación nativo” signifique delecionar uno o más restos de hidrato de carbono encontrados en secuencias de aminoácidos (o bien retirando el sitio de glicosilación subyacente o bien delecionando la glicosilación mediante medios químicos y/o enzimáticos), y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en la secuencia nativa. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas, que implican un cambio en la naturaleza y las proporciones de los diversos restos de hidratos de carbono presentes.
La adición de sitios de glicosilación a la secuencia de aminoácidos puede lograrse alterando la secuencia de aminoácidos. La alteración puede realizarse, por ejemplo, mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina en la secuencia nativa (para sitios de glicosilación unidos a O). La secuencia de aminoácidos puede alterarse opcionalmente mediante cambios a nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos en bases preseleccionadas de tal manera que se generan codones que se traducirán para dar los aminoácidos deseados.
Otro medio de aumentar el número de restos de hidratos de carbono en la secuencia de aminoácidos es mediante acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido. Tales métodos se describen en la técnica, por ejemplo, en el documento WO 87/05330 publicado el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., págs. 259-306 (1981).
La retirada de restos de hidratos de carbono presentes en la secuencia de aminoácidos puede lograrse de manera química o enzimática o mediante sustitución por mutación de codones que codifican para residuos de aminoácido que sirven como dianas para la glicosilación. En la técnica se conocen técnicas de desglicosilación químicas y se describen, por ejemplo, por Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y por Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). La escisión enzimática de restos de hidratos de carbono en polipéptidos puede lograrse mediante el uso de una variedad de endo y exo-glicosidasas tal como se describe por Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).
Otro tipo de modificación covalente comprende unir la secuencia de aminoácidos a uno de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera expuesta en las patentes estadounidenses n.os 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337.
El término “sustitución”, “sustituido” y “sustituyente” se refiere a un grupo funcional en el que uno o más enlaces a un átomo de hidrógeno contenidos en el mismo se sustituyen por un enlace a átomos distintos de hidrógeno, siempre que se mantengan las valencias normales y que la sustitución de cómo resultado un compuesto estable. Los grupos sustituidos también incluyen grupos en los que uno o más enlaces a un(os) átomo(s) de carbono o hidrógeno se sustituyen por uno o más enlaces, incluyendo dobles o triples enlaces, a un heteroátomo. Los ejemplos de grupos sustituyentes incluyen halógenos (es decir, F, Cl, Br e I); grupos alquilo, tales como metilo, etilo, n-propilo, isoproprilo, n-butilo, terc-butilo y trifluorometilo; grupos arilo, tales como fenilo; grupos heteroarilo, tales como triazol, dihidropiridazina y tetrazol; hidroxilo; grupos alcoxilo, tales como metoxilo, etoxilo, n-propoxilo e isopropoxilo; grupos ariloxilo, tales como fenoxilo; arilalquiloxilo, tal como benciloxilo (fenilmetoxilo) y p-trifluorometilbenciloxilo (4-trifluorometilfenilmetoxilo); grupos heteroariloxilo; grupos sulfonilo, tales como sulfonato, trifluorometanosulfonilo, metanosulfonilo y p-toluenosulfonilo; sulfonitro, nitrosilo; mercapto; grupos sulfanilo, tales como metilsulfanilo, etilsulfanilo y propilsulfanilo; ciano; grupos amino, tales como amino, metilamino, dimetilamino, etilamino y dietilamino; y carboxilo. Cuando se dan a conocer o se reivindican múltiples restos sustituyentes, el compuesto sustituido puede estar sustituido independientemente con uno o más de los restos sustituyentes dados a conocer o reivindicados, de manera individual o múltiple. Por independientemente sustituido, quiere decirse que los (dos o más) sustituyentes pueden ser iguales o diferentes. En los compuestos usados en el método de la presente invención, pueden sustituirse grupos alquilo, heteroalquilo, monociclo, biciclo, arilo, heteroarilo y heterociclo remplazando uno o más átomos de hidrógeno por grupos distintos de hidrógeno alternativos. Estos incluyen, pero no se limitan a, halo, hidroxilo, mercapto, amino, carboxilo, ciano y carbamoilo.
Se entiende que un experto habitual en la técnica puede seleccionar sustituyentes y patrones de sustitución en los compuestos usados en el método de la presente invención para proporcionar compuestos que son químicamente estables y que pueden sintetizarse fácilmente mediante técnicas conocidas en la técnica a partir de materiales de partida fácilmente disponibles. Si un sustituyente está a su vez sustituido con más de un grupo, se entiende que estos múltiples grupos pueden estar en el mismo carbono o en carbonos diferentes, siempre que se obtenga como resultado una estructura estable.
Al elegir los compuestos usados en el método de la presente invención, un experto habitual en la técnica reconocerá que los diversos sustituyentes, es decir R1, R2, etc., deben elegirse de acuerdo con principios bien conocidos de la conectividad de estructuras químicas.
Tal como se usa en el presente documento, “alquilo” incluye grupos de hidrocarburos alifáticos saturados de cadena tanto ramificada como lineal que tienen el número especificado de átomos de carbono y pueden no estar sustituidos o estar sustituidos. Por tanto, se define que C1-Cn tal como en “alquilo C1-Cn” incluye grupos que tienen 1, 2,...., n-1 o n carbonos en una disposición lineal o ramificada. Por ejemplo, se define que C1-C6, tal como en “alquilo C1-C6” incluye grupos que tienen 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 carbonos en una disposición lineal o ramificada, e incluye específicamente metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, pentilo y hexilo. A menos que se especifique lo contrario, contiene de uno a doce carbonos. Los grupos alquilo también pueden no estar sustituidos o estar sustituidos con uno o más sustituyentes, incluyendo, pero sin limitarse a, halógeno, alcoxilo, alquiltio, trifluorometilo, difluorometilo, metoxilo e hidroxilo. Una realización puede ser alquilo C1-C12, alquilo C2-C12, alquilo C3-C12, alquilo C4-C12 y así sucesivamente. Una realización puede ser alquilo C1-C8, alquilo C2-C8, alquilo C3-C8, alquilo C4-C8 y así sucesivamente. Se pretende que alquilo incluya restos que son monovalentes, divalentes, trivalentes, etc.
Tal como se usa en el presente documento, “alquilo C1-C4” incluye alquilo C1-C4 de cadena tanto ramificada como lineal.
Tal como se usa en el presente documento, el término “cicloalcano” se refiere a un sistema de anillos monocíclico o bicíclico, que puede estar insaturado o parcialmente insaturado, es decir presenta uno o más dobles enlaces. Los sistemas de anillos monocíclicos se muestran a modo de ejemplo mediante un grupo de hidrocarburo cíclico saturado que contiene desde 3 hasta 8 átomos de carbono. Los ejemplos de sistemas de anillos monocíclicos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo y ciclooctilo. Los sistemas de anillos condensados bicíclicos se muestran a modo de ejemplo mediante un anillo cicloalquilo condensado a otro anillo cicloalquilo. Los ejemplos de sistemas de anillos condensados bicíclicos incluyen, pero no se limitan a, decalina, 1,2,3,7,8,8a-hexahidro-naftaleno y similares. Por tanto, cicloalcano C3-C10 incluye anillos cíclicos de alcanos de tres a ocho átomos de carbono en total (por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo o ciclooctilo y así sucesivamente). Los grupos cicloalcano pueden no estar sustituidos o estar sustituidos con uno o más sustituyentes, incluyendo, pero sin limitarse a, halógeno, alcoxilo, alquiltio, trifluorometilo, difluorometilo, metoxilo e hidroxilo. Se pretende que cicloalcano incluya restos que son monovalentes, divalentes, trivalentes, etc.
Tal como se usa en el presente documento, el término “cicloalqueno” se refiere a un cicloalcano que presenta uno o más dobles enlaces. Por tanto, cicloalqueno C5-C10 incluye anillos cíclicos de alcanos de cinco a diez átomos de carbono totales (por ejemplo, ciclopentenilo, ciclohexenilo, cicloheptenilo, ciclohexadienilo, ciclooctenilo o ciclooctadienilo y así sucesivamente). Cicloalqueno se refiere a restos que son monovalentes, divalentes, trivalentes, etc. Se pretende que cicloalqueno incluya restos que son monovalentes, divalentes, trivalentes, etc.
Tal como se usa en el presente documento, “alqueno” incluye grupos de hidrocarburos alifáticos de cadena tanto ramificada como lineal que tienen uno o más dobles enlaces y el número especificado de átomos de carbono y pueden no estar sustituidos o estar sustituidos. Por tanto, se define que C2-Cn tal como en “alqueno C2-Cn” incluye grupos que tienen 2, 3,...., n-1 o n carbonos en una disposición lineal o ramificada. Por ejemplo, se define que C2-C10, tal como en “alqueno C2-C10” incluye grupos que tienen 2 , 3, 4, 5...10 carbonos en una disposición lineal o ramificada, e incluye específicamente vinilo, alilo, 1-buteno, 2-buteno, isobuteno, 1-penteno, 2-penteno, etc. Los grupos alqueno pueden no estar sustituidos o estar sustituidos con uno o más sustituyentes, incluyendo, pero sin limitarse a, halógeno, alcoxilo, alquiltio, trifluorometilo, difluorometilo, metoxilo e hidroxilo. Una realización puede ser alqueno C2-C3, alqueno C2-C4, alqueno C2-C5 y así sucesivamente. Se pretende que alqueno incluya restos que son monovalentes, divalentes, trivalentes, etc.
Tal como se usa en el presente documento, un “acilo” se refiere a un grupo alquilo que tiene una cetona en la primera posición. Por ejemplo, una realización de “acilo” puede ser acetilo, propionilo, butirilo y valerilo. Como otro ejemplo, una realización de “acilo” puede ser:
Figure imgf000083_0001
en el que n es 1-10. En otra realización, n es 1-4.
Por tanto, un “acilo C2-C5” puede ser acetilo, propionilo, butirilo y/o valerilo. Se pretende que acilo incluya restos que son monovalentes, divalentes, trivalentes, etc.
Acilamino C2-C5 es un grupo acilo tal como se definió anteriormente sustituido adicionalmente con una amina. La amina puede estar unida a la porción de carbonilo del grupo acilo para formar una amida o la amina puede estar unida a una porción distinta de carbonilo del grupo acilo. Por ejemplo, el grupo amino puede estar en la posición alfa, la posición beta, la posición gamma, la posición delta, etc. Como ejemplos adicionales, acilamino incluye grupos tanto alfa-aminoacetilo como acetamido. Acilamino incluye beta-(aminopropionilo).
Aciloxilo C2-C5 es un grupo acilo tal como se definió anteriormente sustituido adicionalmente con un oxígeno. El oxígeno puede estar unido a la porción de carbonilo del grupo acilo para formar una amida o el oxígeno puede estar unido a una porción distinta de carbonilo del grupo acilo. Por ejemplo, el grupo de oxígeno puede estar en la posición alfa, la posición beta, la posición gamma, la posición delta, etc. Como ejemplos adicionales, aciloxilo incluye grupos tanto alfa-oxiacetilo como acetato. Aciloxilo incluye beta-(oxipropionilo).
Tal como se usa en el presente documento, “amino” incluye aminas primarias, secundarias, terciarias y cuaternarias. Por tanto, amino incluye un grupo -NH-, un grupo -NH2, un grupo -NR-, un grupo -NR2+-, un grupo -NRH+-, un grupo -NH2+-, un grupo -NH3+ y un grupo -NR3+, en el que R es alquilo o arilo. Se pretende que amino incluya restos que son monovalentes, divalentes, trivalentes, etc.
Tal como se usa en el presente documento, “azufre” incluye un grupo -S- y un grupo -SH. Se pretende que el término azufre incluya restos que son monovalentes, divalentes, trivalentes, etc.
Tal como se usa en el presente documento, “oxígeno” incluye un grupo -O -y un grupo -OH. El término azufre se refiere a restos que son monovalentes y divalentes.
Tal como se usa en el presente documento, “succinilo” se deriva de ácido succínico mediante retirada de uno o ambos grupos hidroxilo. Una realización puede ser -C(O)-CH2-CH2-C(O)-. Se pretende que succinilo incluya restos que son monovalentes, divalentes, trivalentes, etc.
Tal como se usa en el presente documento, un “malonilo” se deriva de ácido malónico mediante retirada de uno o ambos grupos hidroxilo. Una realización puede ser -C(O)-CH2-C(O)-. Se pretende que malonilo incluya restos que son monovalentes, divalentes, trivalentes, etc.
Tal como se usa en el presente documento, un “glutarilo” se deriva de ácido glutárico mediante retirada de uno o ambos grupos hidroxilo. Una realización puede ser -C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-. Se pretende que glutarilo incluya restos que son monovalentes, divalentes, trivalentes, etc.
Tal como se usa en el presente documento, un “adipoilo” se deriva de ácido adípico mediante retirada de uno o ambos grupos hidroxilo. Una realización puede ser -C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-(O)-. Se pretende que adipoilo incluya restos que son monovalentes, divalentes, trivalentes, etc.
Un “polialquilenglicol” se deriva de polialquilenglicol mediante retirada de ambos hidrógenos a partir de los grupos hidroxilo. Una realización puede derivarse de polietilenglicol, polipropilenglicol o polibutilenglicol.
Una realización de “polialquilenglicol” puede ser
Figure imgf000084_0001
o
en el que n es 1- 10.
Tal como se usa en el presente documento, se pretende que “arilo” signifique cualquier anillo de carbono monocíclico, bicíclico o policíclico estable de hasta 10 átomos en cada anillo, en el que al menos un anillo es aromático, y puede no estar sustituido o estar sustituido. Los ejemplos de tales elementos de arilo incluyen, pero no se limitan a: fenilo, ptoluenilo (4-metilfenilo), naftilo, tetrahidro-naftilo, indanilo, fenantrilo, antrilo o acenaftilo. En casos en los que el sustituyente de arilo es bicíclico y un anillo no es aromático, se entiende que la unión se realiza mediante el anillo aromático.
Tal como se usa en el presente documento, se pretende que “arilo” signifique cualquier anillo de carbono monocíclico, bicíclico o policíclico estable de hasta 10 átomos en cada anillo, en el que al menos un anillo es aromático, y puede no estar sustituido o estar sustituido. Los ejemplos de tales elementos de arilo incluyen, pero no se limitan a: fenilo, ptoluenilo (4-metilfenilo), naftilo, tetrahidro-naftilo, indanilo, fenantrilo, antrilo o acenaftilo. En casos en los que el sustituyente de arilo es bicíclico y un anillo no es aromático, se entiende que la unión se realiza mediante el anillo aromático.
El término “heteroarilo”, tal como se usa en el presente documento, representa un anillo monocíclico, bicíclico o policíclico estable de hasta 10 átomos en cada anillo, en el que al menos un anillo es aromático y contiene desde 1 hasta 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S. Los grupos heteroarilo aromáticos bicíclicos incluyen anillos de fenilo, piridina, pirimidina o piridizina que están (a) condensados a un anillo heterocíclico aromático (insaturado) de 6 miembros que tiene un átomo de nitrógeno; (b) condensados a un anillo heterocíclico aromático (insaturado) de 5 ó 6 miembros que tiene dos átomos de nitrógeno; (c) condensados a un anillo heterocíclico aromático (insaturado) de 5 miembros que tiene un átomo de nitrógeno junto con un átomo o bien de oxígeno o bien de azufre; o (d) condensados a un anillo heterocíclico aromático (insaturado) de 5 miembros que tiene un heteroátomo seleccionado de O, N o S. Los grupos heteroarilo dentro del alcance de esta definición incluyen, pero no se limitan a: benzoimidazolilo, benzofuranilo, benzofurazanilo, benzopirazolilo, benzotriazolilo, benzotiofenilo, benzoxazolilo, carbazolilo, carbolinilo, cinolinilo, dihidropiridizina, furanilo, indolinilo, indolilo, indolazinilo, indazolilo, isobenzofuranilo, isoindolilo, isoquinolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, naftopiridinilo, oxadiazolilo, oxazolilo, oxazolina, isoxazolina, oxetanilo, piranilo, pirazinilo, pirazolilo, piridazinilo, piridopiridinilo, piridazinilo, piridilo, pirimidilo, pirrolilo, quinazolinilo, quinolilo, quinoxalinilo, tetrazolilo, tetrazolopiridilo, tiadiazolilo, tiazolilo, tienilo, triazolilo, azetidinilo, aziridinilo, 1,4-dioxanilo, hexahidroazepinilo, dihidrobenzoimidazolilo, dihidrobenzofuranilo, dihidrobenzotiofenilo, dihidrobenzoxazolilo, dihidrofuranilo, dihidroimidazolilo, dihidroindolilo, dihidroisooxazolilo, dihidroisotiazolilo, dihidrooxadiazolilo, dihidrooxazolilo, dihidropirazinilo, dihidropirazolilo, dihidropiridinilo, dihidropirimidinilo, dihidropirrolilo, dihidroquinolinilo, dihidrotetrazolilo, dihidrotiadiazolilo, dihidrotiazolilo, dihidrotienilo, dihidrotriazolilo, dihidroazetidinilo, metilendioxibenzoilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotienilo, acridinilo, carbazolilo, cinolinilo, quinoxalinilo, pirrazolilo, indolilo, benzotriazolilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, furanilo, tienilo, benzotienilo, benzofuranilo, quinolinilo, isoquinolinilo, oxazolilo, isoxazolilo, indolilo, pirazinilo, piridazinilo, piridinilo, pirimidinilo, pirrolilo, tetra-hidroquinolina. En casos en los que el sustituyente de heteroarilo es bicíclico y un anillo no es aromático o no contiene ningún heteroátomo, se entiende que la unión se realiza mediante el anillo aromático o mediante el anillo que contiene heteroátomo, respectivamente. Si el heteroarilo contiene átomos de nitrógeno, se entiende que los N-óxidos correspondientes del mismo también quedan abarcados por esta definición.
Se pretende que el término “fenilo” signifique un anillo aromático de seis miembros que contiene seis carbonos, y cualquier derivado sustituido del mismo.
Se pretende que el término “bencilo” signifique un metileno unido directamente a un anillo de benceno. Un grupo bencilo es un grupo metilo en el que un hidrógeno está sustituido por un grupo fenilo, y cualquier derivado sustituido del mismo.
Se pretende que el término “triazol” signifique un heteroarilo que tiene un anillo de cinco miembros que contiene dos átomos de carbono y tres átomos de nitrógeno, y cualquier derivado sustituido del mismo.
La dihidropiradizina está opcionalmente sustituida e incluye 1,2-dihidropiridazinas,
r í^ N H
k -N H
1,4-dihidropiridazinas,
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1 ,6-dihidropiridazinas,
Figure imgf000085_0002
y 4,5-dihidropiridazinas;
r í^ NI H
^ N H
Una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina incluye, pero no se limita a, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a la 3a y 4a posición de una dihidropiridazina o una estructura química que contiene una cicloocta[d]piridazina saturada, cualquiera de las cuales está opcionalmente sustituida. Por ejemplo, la estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina incluye, pero no se limita a, una estructura química que contiene una 2,4a,5,6,7,8,9,10-octahidrocicloocta[d]piridazina,
Figure imgf000086_0001
una 4a,5,6,7,8,9,10,10a-octahidrocicloocta[d]piridazina,
Figure imgf000086_0002
una 2,3,5,6,7,8,9,10-octahidrocicloocta[d]piridazina,
Figure imgf000086_0003
o una 1,2,5,6,7,8,9,10-octahidrocicloocta[d]piridazina,
Figure imgf000086_0004
cada una de las cuales puede estar opcionalmente sustituida. Los tautómeros de
Figure imgf000086_0005
incluyen, pero no se limitan a:
Figure imgf000087_0001
En algunas realizaciones, la dihidropiridazina se oxida para dar una piridazina.
En algunas realizaciones, la dihidropiridazina se reduce para dar como resultado una estructura de anillo abierto que tiene un compuesto de 1,4-dicarbonilo.
Los compuestos usados en el método de la presente invención pueden prepararse mediante técnicas bien conocidas en la síntesis orgánica y con las que está familiarizado un experto habitual en la técnica. Sin embargo, estos pueden no ser los únicos medios mediante los cuales sintetizar u obtener los compuestos deseados.
Compuestos de la invención objeto pueden convertirse en profármacos para optimizar la absorción y biodisponibilidad. La formación de un profármaco incluye, pero no se limita a, reacción de un grupo hidroxilo libre con un ácido carboxílico para formar un éster, reacción de un grupo hidroxilo libre con un oxicloruro de fósforo seguido por hidrólisis para formar un fosfato, o reacción de un grupo hidroxilo libre con un aminoácido para formar un éster de aminoácido, cuyo procedimiento se ha descrito previamente por Chandran en el documento WO 2005/046575. Los sustituyentes se eligen y los análogos resultantes se evalúan según principios bien conocidos en la técnica de la química medicinal y farmacéutica, tales como cuantificación de relaciones de estructura-actividad, optimización de actividad biológica y propiedades de ADMET (absorción, distribución, metabolismo, excreción y toxicidad).
Los diversos grupos R unidos a los anillos aromáticos de los compuestos dados a conocer en el presente documento pueden añadirse a los anillos mediante procedimientos convencionales, por ejemplo los expuestos en Advanced Organic Chemistry: Part B: Reaction and Synthesis, Francis Carey y Richard Sundberg, (Springer) 5a ed. edición (2007), cuyo contenido se incorpora en el presente documento como referencia.
Los compuestos de presente invención pueden prepararse mediante técnicas descritas en Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry, A.I. Vogel, A.R. Tatchell, B.S. Furnis, A.J. Hannaford, P.W.G. Smith, (Prentice Hall) 5a edición (1996), March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Michael B. Smith, Jerry March, (Wiley-Interscience) 5a edición (2007), y referencias en los mismos. Sin embargo, pueden no ser los únicos medios mediante los cuales sintetizar u obtener los compuestos deseados.
Un experto habitual en la técnica entenderá fácilmente que se pretende que las definiciones de los sustituyentes y restos (por ejemplo los restos de J, Ra y Rb) proporcionadas en el presente documento respeten las reglas convencionales de la valencia química. Por ejemplo, cuando una estructura proporcionada en el presente documento requiere que un sustituyente o resto particular sea divalente (por ejemplo un resto en una cadena lineal de restos), un experto habitual en la técnica entenderá fácilmente que las definiciones de ese sustituyente o resto son divalentes con el fin de respetar las reglas convencionales de la valencia química.
Un experto habitual en la técnica entenderá fácilmente que algunos restos divalentes representados en la presente invención pueden unirse a otras estructuras químicas de más de una manera, por ejemplo, las estructuras representadas pueden unirse a otras estructuras químicas cuando se rotan o se invierten.
En algunas realizaciones de la presente invención, un compuesto comprende un polímero no proteico. En algunas realizaciones, el polímero no proteico puede ser es un polímero sintético hidrófilo, es decir, un polímero no encontrado de otro modo en la naturaleza. Sin embargo, polímeros que existen en la naturaleza y se producen mediante métodos recombinantes o in vitro son útiles, al igual que polímeros que se aíslan a partir de la naturaleza. Los polímeros de polivinilo hidrófilos se encuentran dentro del alcance de esta invención, por ejemplo poli(alcohol vinílico) y polivinilpirrolidona. Son particularmente útiles los poli(éteres de alquileno) tales como polietilenglicol, polipropilenglicol, ésteres de polioxietileno o metoxi-polietilenglicol; polioxialquilenos tales como polioxietileno, polioxipropileno y copolímeros de bloque de polioxietileno y polioxipropileno (Pluronics); polimetacrilatos; carbómeros; polisacáridos ramificados o no ramificados que comprenden los monómeros de sacáridos D-manosa, D y L-galactosa, fucosa, fructosa, D-xilosa, L-arabinosa, D-ácido glucurónico, ácido siálico, D-ácido galacturónico, D-ácido manurónico (por ejemplo poli(ácido manurónico) o ácido algínico), D-glucosamina, D-galactosamina, D-glucosa y ácido neuramínico incluyendo homopolisacáridos y heteropolisacáridos tales como lactosa, amilopectina, almidón, hidroxietilalmidón, amilosa, sulfato de dextrano, dextrano, dextrinas, glicógeno o la subunidad de polisacárido de mucopolisacáridos ácidos, por ejemplo ácido hialurónico; polímeros de alcoholes de azúcar tales como polisorbitol y polimanitol; y heparina o Heparon.
Sales
Las sales de los compuestos dados a conocer en el presente documento están dentro del alcance de la invención. Tal como se usa en el presente documento, una “sal” es sal de los presentes compuestos que se han modificado produciendo sales de ácidos o bases de los compuestos.
Dominios Fc
El término “dominio Fc”, tal como se usa en el presente documento, se refiere de manera general a un complejo de monómero o dímero, que comprende las secuencias de polipéptido C-terminales de una cadena pesada de inmunoglobulina. El dominio Fc puede comprender secuencias de Fc nativas o variantes. Aunque los límites del dominio Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, habitualmente se define que el dominio Fc de cadena pesada de IgG humana se extiende desde un residuo de aminoácido en la región de bisagra hasta el extremo carboxilo-terminal de la secuencia de Fc. La secuencia de Fc de una inmunoglobulina comprende generalmente dos regiones constantes, una región CH2 y una región CH3, y opcionalmente comprende una región CH4. Un dominio Fc humano puede obtenerse a partir de cualquier inmunoglobulina adecuada, tal como los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, IgA, IgE, IgD o IgM.
Se preparan dominios Fc adecuados mediante expresión de ADN recombinante de polipéptidos quiméricos pre-Fc que comprenden 1 ) un péptido señal, obtenido a partir de una proteína secretada o transmembrana, que se escinde delante de un polipéptido maduro que tiene un residuo de cisteína N-terminal, contiguo con 2) un polipéptido de dominio Fc que tiene un residuo de cisteína N-terminal.
Ejemplos adecuados de péptidos señal son sonic hedgehog (SHH) (n.° de registro de GenBank NM000193), IFNalfa-2 (IFN) (n.° de registro de GenBank NP000596) y colesterol éster transferasa (CETP) (n.° de registro de GenBank NM000078). Otros ejemplos adecuados incluyen Indian hedgehog (n.° de registro de GenBank NM002181), desert hedgehog (n.° de registro de GenBank NM021044), IFNalfa-1 (n.° de registro de GenBank NP076918), IFNalfa-4 (n.° de registro de GenBank NM021068), IFNalfa-5 (n.° de registro de GenBank NM002169), IFNalfa-6 (n.° de registro de GenBank NM021002), IFNalfa-7 (n.° de registro de GenBank NM021057), IFNalfa-8 (n.° de registro de GenBank NM002170), IFNalfa-10 (n.° de registro de GenBank NM002171), IFNalfa-13 (n.° de registro de GenBank NM006900), IFNalfa-14 (n.° de registro de GenBank NM002172), IFNalfa-16 (n.° de registro de GenBank NM002173), IFNalfa-17 (n.° de registro de GenBank NM021268) e IFNalfa-2l (n.° de registro de GenBank NM002175).
Ejemplos adecuados de dominios Fc y sus polipéptidos quiméricos pre-Fc se muestran en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 96. Los dominios Fc se obtienen expresando los polipéptidos quiméricos pre-Fc en células en condiciones que conducen a su secreción y escisión del péptido señal. Los polipéptidos pre-Fc pueden expresarse en células huésped o bien procariotas o bien eucariotas. Preferiblemente, se transfectan células huésped de mamífero con vectores de expresión que codifican para los polipéptidos pre-Fc.
Dominios Fc de IgG1 humana que tienen la secuencia N-terminal CDKTHTCPPCPAPE, CPPCPAPE y CPAPE se muestran en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 17, respectivamente, y las secuencias de ADN que codifican para los mismos se muestran en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID n O: 18, respectivamente. El dominio de IgG1 de SEQ ID NO: 1 se obtiene expresando los polipéptidos quiméricos pre-Fc mostrados en SEQ ID NO: 3 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 5 (péptido señal de IFN) y SEQ ID NO: 7 (péptido señal de CETP), usando las secuencias de ADN mostradas en SEQ ID n O: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8 , respectivamente. El dominio de IgG1 de SEQ ID NO: 9 se obtiene expresando los polipéptidos quiméricos pre-Fc mostrados en SEQ ID NO: 11 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 13 (péptido señal de IFN) y SEQ ID NO: 15 (péptido señal de CETP), usando las secuencias de ADN mostradas en Se Q iD NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID n O: 16, respectivamente. El dominio de IgG1 de SEQ ID NO: 17 se obtiene expresando los polipéptidos quiméricos pre-Fc mostrados en SEQ ID NO: 19 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 21 (péptido señal de If N) y SEQ ID NO: 23 (péptido señal de CETP), usando las secuencias de ADN mostradas en Se Q iD NO: 20 , SEQ ID NO: 22 y SEQ ID n O: 24, respectivamente.
Dominios Fc de IgG2 humana que tienen la secuencia N-terminal CCVECPPCPAPE, CVECPPCPAPE, CPPCPAPE, y CPAPE se muestran en SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 49, respectivamente, y las secuencias de ADN que codifican para los mismos se muestran en SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34, SEQ ID n O: 42 y SEQ ID NO: 50, respectivamente. El dominio de IgG2 de SEQ ID NO: 25 se obtiene expresando los polipéptidos quiméricos pre-Fc mostrados en SEQ ID NO: 27 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 29 (péptido señal de IFN) y Se Q ID NO: 31 (péptido señal de CETP), usando las secuencias de ADN mostradas en SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 32, respectivamente. El dominio de IgG2 de SEQ ID NO: 33 se obtiene expresando los polipéptidos quiméricos pre-Fc mostrados en SEQ ID NO: 35 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 37 (péptido señal de IFN) y Se Q ID NO: 39 (péptido señal de CETP) usando las secuencias de ADN mostradas en SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 40, respectivamente. El dominio de IgG2 de SEQ ID NO: 41 se obtiene a partir de los polipéptidos quiméricos pre-Fc mostrados en SEQ ID NO: 43 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 45 (péptido señal de IFN) y Se Q ID NO: 47 (péptido señal de CETP), usando las secuencias de ADN mostradas en SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 48, respectivamente. El dominio de IgG2 de SEQ ID NO: 49 se obtiene a partir de los polipéptidos quiméricos pre-Fc mostrados en SEQ ID NO: 51 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 53 (péptido señal de IFN) y Se Q ID NO: 55 (péptido señal de CETP), usando las secuencias de ADN mostradas en SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 56 , respectivamente.
Dominios Fc de IgG3 humana que tienen la secuencia N-terminal (CPRCPEPKSDTPPP)3-CPRCPAPE, CPRCPAPE y CPAPE se muestran en SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 73, respectivamente, y las secuencias de ADN que codifican para los mismos se muestran en SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66 , SEQ ID n O: 42 y SEQ ID NO: 74, respectivamente. El dominio de IgG3 de SEQ ID NO: 57 se obtiene expresando los polipéptidos quiméricos pre-Fc mostrados en SEQ ID NO: 59 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 61 (péptido señal de IFN) y Se Q ID NO: 63 (péptido señal de CETP), usando las secuencias de A d N mostradas en SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 64, respectivamente. El dominio de IgG3 de SEQ ID NO: 65 se obtiene expresando los polipéptidos quiméricos pre-Fc mostrados en SEQ ID NO: 67 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 69 (péptido señal de IFN) y s Eq ID NO: 71 (péptido señal de CETP), usando las secuencias de ADN mostradas en SEQ ID NO: 68 , SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 72, respectivamente. El dominio de IgG3 de SEQ ID NO: 73 se obtiene expresando los polipéptidos quiméricos pre-Fc mostrados en SEQ ID NO: 75 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 77 (péptido señal de IFN) y s Eq ID NO: 79 (péptido señal de CETP), usando las secuencias de ADN mostradas en SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78 y SEQ ID NO: 80, respectivamente.
Las secuencias de dominios Fc de IgG4 humana que tienen la secuencia N-terminal CPSCPAPE y CPAPE se muestran en SEQ ID NO: 81 y SEQ ID NO: 89, respectivamente, y las secuencias de ADN que codifican para los mismos se muestran en SEQ ID NO: 82 y SEQ ID NO: 90, respectivamente. El dominio de IgG4 de SEQ ID NO: 81 se obtiene expresando los polipéptidos quiméricos pre-Fc mostrados en SEQ ID NO: 83 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 85 (péptido señal de IFN) y SEQ ID NO: 87 (péptido señal de CETP), usando las secuencias de ADN mostradas en SEQ ID NO: 84, SEQ ID No : 86 y SEQ ID NO: 88, respectivamente. El dominio de IgG4 de SEQ ID NO: 89 se obtiene expresando los polipéptidos quiméricos pre-Fc mostrados en SEQ ID NO: 91 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 93 (péptido señal de IFN) y SEQ ID NO: 95 (péptido señal de CETP), usando las secuencias de ADN mostradas en SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94 y SEQ ID NO: 96 , respectivamente.
Se preparan variantes de anticuerpos adecuados que tienen en su extremo N-terminal de cadena pesada un residuo de cisteína mediante expresión de ADN recombinante de polipéptidos quiméricos pre-cadena pesada que comprenden 1 ) un péptido señal, obtenido a partir de una proteína secretada o transmembrana, que se escinde delante de un polipéptido maduro que tiene un residuo de cisteína N-terminal, contiguo con 2) un polipéptido de cadena pesada de anticuerpo que tiene un residuo de cisteína N-terminal.
Se preparan variantes de anticuerpos adecuados que tienen en su extremo N-terminal de cadena ligera un residuo de cisteína mediante expresión de ADN recombinante de polipéptidos quiméricos pre-cadena ligera que comprenden 1) un péptido señal, obtenido a partir de una proteína secretada o transmembrana, que se escinde delante de un polipéptido maduro que tiene un residuo de cisteína N-terminal, contiguo con 2) un polipéptido de cadena ligera de anticuerpo que tiene un residuo de cisteína N-terminal.
Se obtienen cadenas pesada y ligera de trastuzumab expresando los polipéptidos quiméricos pre-pesado y pre-ligero en células en condiciones que conducen a su secreción y escisión del péptido señal. Los polipéptidos pre-cadena pesada y pre-cadena ligera pueden expresarse en células huésped o bien procariotas o bien eucariotas. Preferiblemente, se transfectan células huésped de mamífero con vectores de expresión que codifican para los polipéptidos pre-cadena pesada y pre-cadena ligera.
En el presente documento se ilustran secuencias de proteína añadidas al extremo N-terminal de las variantes de cadena pesada, pre-cadena pesada, cadena ligera y pre-cadena ligera de anticuerpo anteriormente mencionadas para el anticuerpo recombinante trastuzumab, pero son aplicables de manera general a cualquier anticuerpo recombinante. Pueden construirse y expresarse secuencias de ADN que codifican para trastuzumab y sus variantes en células de mamífero cotransfectando vectores de ADN para sus cadenas pesada y ligera, y variantes derivadas de las mismas, tal como se describe en la patente estadounidense n.° 5.821.337 (“ Immunoglobulin Variants”). La secuencia de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada de trastuzumab silvestres se muestran en SEQ ID NO: 128 y SEQ ID NO: 129, respectivamente.
Ejemplos adecuados de cadenas ligeras de trastuzumab con residuos de cisteína N-terminales y sus polipéptidos quiméricos pre-Fc se muestran en SEQ ID NO: 130 a SEQ ID NO: 165. Ejemplos adecuados de cadenas pesadas de trastuzumab con residuos de cisteína N-terminales y sus polipéptidos quiméricos pre-Fc se muestran en SEQ ID NO: 166 a SEQ ID NO: 201.
Cadenas ligeras de trastuzumab que tienen la secuencia N-terminal C, CP, CPP, CPR, CPS, CDKT, CDKTHT, CVE, y CDTPPP se muestran en SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 158 y SEQ ID NO: 162, respectivamente. La cadena ligera de SEQ ID NO: 130 se obtiene expresando los polipéptidos quiméricos pre-ligeros mostrados en SEQ ID NO: 131 (péptido señal de SHH), SEQ ID n O: 132 (péptido señal de IFN) y SEQ ID NO: 133 (péptido señal de CETP). La cadena ligera de SEQ ID NO: 134 se obtiene expresando los polipéptidos quiméricos pre-cadena ligera mostrados en SEQ ID NO: 135 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 136 (péptido señal de IFN) y SEQ ID NO: 137 (péptido señal de CETP). La cadena ligera de SEQ ID NO: 138 se obtiene expresando los polipéptidos quiméricos pre-ligeros mostrados en SEQ ID NO: 139 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 140 (péptido señal de IFN) y SEQ ID NO: 141 (péptido señal de CETP). La cadena ligera de SEQ ID NO: 142 se obtiene expresando los polipéptidos quiméricos pre-ligeros mostrados en SEQ ID NO: 143 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 144 (péptido señal de IFN) y SEQ ID NO: 145 (péptido señal de CETP). La cadena ligera de SEQ ID NO: 146 se obtiene expresando los polipéptidos quiméricos pre-pesados ligeros mostrados en SEQ ID NO: 147 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 148 (péptido señal de IFN) y SEQ ID NO: 149 (péptido señal de CETP). La cadena ligera de SEQ ID NO: 150 se obtiene expresando los polipéptidos quiméricos pre-ligeros mostrados en SEQ ID NO: 151 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 152 (péptido señal de IFN) y SEQ ID NO: 153 (péptido señal de CETP). La cadena ligera de SEQ ID NO: 154 se obtiene expresando los polipéptidos quiméricos pre-ligeros mostrados en SEQ ID NO: 155 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 156 (péptido señal de IFN) y SEQ ID NO: 157 (péptido señal de CETP). La cadena ligera de SEQ ID NO: 158 se obtiene expresando los polipéptidos quiméricos pre-ligeros mostrados en SEQ ID NO: 159 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 160 (péptido señal de IFN) y SEQ ID No : 161 (péptido señal de CETP). La cadena ligera de SEQ ID NO: 162 se obtiene expresando los polipéptidos quiméricos pre-ligeros mostrados en SEQ ID NO: 163 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 164 (péptido señal de IFN) y Se Q ID NO: 165 (péptido señal de CETP).
Cadenas pesadas de trastuzumab que tienen la secuencia N-terminal C, CP, CPP, CPR, CPS, CDKT, CDKTHT, CVE, y CDTPPP se muestran en SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 194 y SEQ ID NO: 198, respectivamente. La cadena pesada de SEQ ID NO: 166 se obtiene expresando los polipéptidos quiméricos pre-cadena pesada mostrados en SEQ ID NO: 167 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 168 (péptido señal de IFN) y SEQ ID NO: 169 (péptido señal de CETP). La cadena pesada de SEQ ID NO: 170 se obtiene expresando los polipéptidos quiméricos pre-cadena pesada mostrados en SEQ ID NO: 171 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 172 (péptido señal de IFN) y SEQ ID NO: 173 (péptido señal de CETP). La cadena pesada de SEQ ID NO: 174 se obtiene a partir de los polipéptidos quiméricos pre-cadena pesada mostrados en SEQ ID NO: 175 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 176 (péptido señal de IFN) y SEQ ID NO: 177 (péptido señal de CETP). La cadena pesada de SEQ ID NO: 178 se obtiene a partir de los polipéptidos quiméricos pre-cadena pesada mostrados en Se Q ID NO: 179 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 180 (péptido señal de IFN) y SEQ ID NO: 181 (péptido señal de CETP). La cadena pesada de SeQ ID NO: 182 se obtiene expresando los polipéptidos quiméricos pre-cadena pesada mostrados en SEQ ID NO: 183 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 184 (péptido señal de IFN) y SEQ ID NO: 185 (péptido señal de CETP). La cadena pesada de SEQ ID No : 186 se obtiene expresando los polipéptidos quiméricos pre-cadena pesada mostrados en SEQ ID NO: 187 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 188 (péptido señal de IFN) y SEQ ID NO: 189 (péptido señal de CETP). La cadena pesada de SEQ iD NO: 190 se obtiene a partir de los polipéptidos quiméricos pre-cadena pesada mostrados en SEQ ID NO: 191 (péptido señal de SHH), SEQ iD NO: 192 (péptido señal de IFN) y SEQ ID NO: 193 (péptido señal de CETP). La cadena pesada de SEQ ID NO: 194 se obtiene a partir de los polipéptidos quiméricos pre-cadena pesada mostrados en SEQ ID NO: 195 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 196 (péptido señal de IFN) y SEQ ID NO: 197 (péptido señal de CETP). La cadena pesada de SEQ ID NO: 198 se obtiene a partir de los polipéptidos quiméricos pre-cadena pesada mostrados en SEQ ID NO: 199 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 200 (péptido señal de IFN) y SEQ ID NO: 201 (péptido señal de CETP).
Las células huésped adecuadas incluyen células embrionarias humanas 293 (ATCC CRL-1573) y células de ovario de hámster CHO-K1 (ATCC CCL-61) obtenidas a partir de la Colección americana de cultivos tipo (Rockville, Md.). Se hacen crecer células a 37°C, en una atmósfera de aire, el 95%; dióxido de carbono, el 5%. Se mantienen células 293 en medio esencial mínimo (Eagle) con L-glutamina 2 mM y BSS de Earle ajustado para contener bicarbonato de sodio 1,5 g/l, aminoácidos no esenciales 0,1 mM y piruvato de sodio 1,0 mM, el 90%; suero bovino fetal, el 10%. Se mantienen células CHO-K1 en medio F12K de Ham con L-glutamina 2 mM ajustado para contener bicarbonato de sodio 1,5 g/l, el 90%; suero bovino fetal, el 10%. Otras células huésped adecuadas incluyen células de riñón de mono CV1 (ATCC CCL-70), células de riñón de mono COS-7 (ATCC CRL-1651), células de riñón de mono VERO-76 (ATCC CRL-1587), células de cuello uterino humanas HELA (ATCC CCL-2), células de pulmón humanas W138 (ATc C CCL-75), células de riñón caninas MDCK (ATCC CCL-34), células de hígado de rata Br L3A (ATCC CRL-1442), células de riñón de hámster BHK (ATCC CCL-10), células de mama de ratón MMT060562 (ATc C CCL-51) y linfocitos T CD8+ humanos (descrito en el documento estadounidense con n.° de serie 08/258.152 incorporado en el presente documento en su totalidad como referencia).
Ejemplos de vectores de expresión adecuados son pCDNA3.1(+) mostrado en SEQ ID NO: 97 y pSA mostrado en SEQ ID NO: 98. El plásmido pSA contiene los siguientes elementos de secuencia de ADN: 1) pBluescriptIIKS(+) (nucleótidos 912-2941/1-619, n.° de registro de GenBank X52327), 2) un promotor de citomegalovirus humano, potenciador y donador de corte y empalme de primer exón (nucleótidos 63-912, n.° de registro de GenBank K03104), 3) un aceptor de corte y empalme de segundo exón de alfa1-globina humana (nucleótidos 6808-6919, n.° de registro de GenBank J00153), 4) un sitio de poliadenilación de antígeno T de SV40 (nucleótidos 2770-2533, Reddy et al. (1978) Science 200, 494-502), y 5) un origen de replicación de SV40 (nucleótidos 5725-5578, Reddy et al., ibid). Otros vectores de expresión adecuados incluyen los plásmidos pSVeCD4DHFR y pRKCD4 (patente estadounidense n.° 5.336.603), plásmido pIK.1.1 (patente estadounidense n.° 5.359.046), plásmido pVL-2 (patente estadounidense n.° 5.838.464), plásmido pRT43.2F3 (descrito en el documento estadounidense con n.° de serie 08/258.152 incorporado en el presente documento en su totalidad como referencia).
Pueden construirse vectores de expresión adecuados para polipéptidos pre-Fc de IgG humana mediante la ligación de un fragmento de vector HindIIIPspOM1 preparado a partir de SEQ ID NO: 98, con un fragmento de inserción HindlIl-Eagl preparado a partir de SEQ ID NOS: 4, 6 , 8 , 12, 14, 16, 20, 22, 24, 28, 30, 32, 36, 38, 40, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 68 , 70, 72, 76, 78, 80, 84, 86 , 88, 92, 94 y 96.
Los marcadores seleccionables adecuados incluyen el gen de neomicina fosfotransferasa (NEO) de transposón de Tn5 (Southern y Berg (1982) J. Mol. Appl. Gen. 1, 327-341), y el ADNc de dihidrofolato reductasa (DHFR) (Lucas et al. (1996) Nucl. Acids Res. 24, 1774-1779). Un ejemplo de un vector de expresión adecuado que incorpora un gen de NEO es plásmido pSA-NEO, que se construye ligando un primer fragmento de ADN, preparado digiriendo SEQ ID NO: 99 con EcoRI y BglII, con un segundo fragmento de ADN, preparado digiriendo SEQ ID NO: 98 con EcoRI y BglII. SEQ ID NO: 99 incorpora un gen de NEO (nucleótidos 1551 a 2345, n.° de registro de Genbank U00004) precedido por una secuencia para el inicio de la traducción (Kozak (1991) J. Biol. Chem, 266, 19867-19870). Otro ejemplo de un vector de expresión adecuado que incorpora un gen de NEO y un ADNc de DHFR es plásmido pSVe-NEO-DHFR, que se construye ligando un primer fragmento de ADN, preparado digiriendo SEQ ID NO: 99 con EcoRI y BglII, con un segundo fragmento de ADN, preparado digiriendo pSVeCD4DHFR con EcoRI y BglII. El plásmido pSVe-NEO-DHFR usa promotor temprano/potenciadores de SV40 para impulsar la expresión del gen de NEO y del ADNc de DHFR. Otros marcadores seleccionables adecuados incluyen el gen de XPGT (Mulligan y Berg (1980) Science 209, 1422­ 1427) y el gen de resistencia a la higromicina (Sugden et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5, 410-413).
En una realización, se transfectan células mediante el método de fosfato de calcio de Graham et al. (1977) J. Gen. Virol. 36, 59-74. Se disuelve una mezcla de ADN (10 ug) en 0,5 ml de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM y CaCl2227 mM. La mezcla de ADN contiene (en una razón de 10:1:1) el ADN de vector de expresión, el a Dn de marcador seleccionable y un ADN que codifica para el gen de ARN de VA (Thimmappaya et al. (1982) Cell 31, 543-551). A esta mezcla se le añaden, gota a gota, 0,5 ml de Hepes 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM y NaPO41,5 mM. Se deja que se forme el precipitado de ADN durante 10 minutos a 25°C, después se suspende y se añade a células que se hacen crecer hasta la confluencia en placas de cultivo tisular de plástico de 100 mm. Después de 4 horas a 37°C, se aspira el medio de cultivo y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 0,5 minutos. Después se lavan las células con medio libre de suero, se añade medio de cultivo recién preparado y se incuban las células durante 5 días.
En otra realización, se transfectan transitoriamente células mediante el método de sulfato de dextrano de Somparyrac et al. (1981) Proc. Nat. Acad. Sci. 12, 7575-7579. Se hacen crecer células hasta la máxima densidad en matraces de centrifugación, se concentran mediante centrifugación y se lavan con PBS. Se incuba el precipitado de ADN-dextrano sobre el sedimento celular. Después de 4 horas a 37°C, se aspira el DEAE-dextrano y se añade glicerol al 20% en PBS durante 1,5 minutos. Después se lavan las células con medio libre de suero, vuelven a introducirse en matraces de centrifugación que contienen medio de cultivo recién preparado con insulina bovina 5 microgramos/ml y transferrina bovina 0,1 microgramos/ml, y se incuban durante 4 días.
Tras la transfección mediante cualquier método, los medios condicionados se centrifugan y se filtran para retirar los residuos y las células huésped. Después se concentra la muestra que contiene el dominio Fc y se purifica mediante cualquier método seleccionado, tal como diálisis y/o cromatografía en columna (véase a continuación). Para identificar el dominio Fc en el sobrenadante de cultivo celular, se retira el medio de cultivo de 24 a 96 horas después de la transfección, se concentra y se analiza mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) en presencia o ausencia de un agente reductor tal como ditiotreitol.
Para la expresión sin amplificar, se transfectan plásmidos en células 293 humanas (Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 74 (1977)), usando un procedimiento de alta eficacia (Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech. 2:3 10 (1990)). Se cambian los medios por libres de suero y se recogen diariamente durante hasta cinco días. Para la expresión sin amplificar, se transfectan plásmidos en células 293 humanas (Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 74 (1977)), usando un procedimiento de alta eficacia (Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech. 2:3 10 (1990)). Se cambian los medios por libres de suero y se recogen diariamente durante hasta cinco días. Se purifican los dominios Fc a partir del sobrenadante de cultivo celular usando proteína A HP HiTrap (Pharmacia). Se someten los dominios Fc eluidos a intercambio de tampón en PBS usando un dispositivo Centricon-30 (Amicon), se concentran hasta 0,5 ml, se esterilizan por filtración usando un dispositivo Millex-GV (Millipore) a 4°C.
Tramos de aminoácidos consecutivos
Los ejemplos de tramos de aminoácidos consecutivos, tal como se denominan en el presente documento, incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos consecutivos que incluyen dominios de unión tales como proteínas secretadas o transmembrana, dominios y anticuerpos de unión intracelular (completos o porciones de los mismos) y versiones modificadas de los mismos. Los siguientes son algunos ejemplos no limitativos:
1) Inmunoglobulinas
El término “anticuerpo” se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos monovalentes, anticuerpos multivalentes y fragmentos de anticuerpo siempre que muestren la actividad biológica deseada (por ejemplo, Fab y/o anticuerpos de un solo brazo).
La “clase” de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que presenta su cadena pesada. Hay cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, 8, e, y y H, respectivamente.
Un “fragmento de anticuerpo” se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
Los términos “anticuerpo de longitud completa”, “anticuerpo intacto” y “anticuerpo completo” se usan en el presente documento de manera intercambiable para hacer referencia a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo nativo o que tienen cadenas pesadas que contienen una región Fc tal como se define en el presente documento.
Un anticuerpo “de bloqueo” o un anticuerpo “antagonista” es uno que inhibe significativamente (o bien parcialmente o bien completamente) una actividad biológica del antígeno al que se une.
Un “anticuerpo que se une al mismo epítopo” que un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en el 50% o más, y, a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competencia en el 50% o más. En el presente documento se proporciona un ensayo de competencia a modo de ejemplo.
El término “región variable” o “dominio variable” se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que participa en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo tienen generalmente estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones de marco conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR). (Véase, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007)). Un único dominio VH o Vl puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, anticuerpos que se unen a un antígeno particular pueden aislarse usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para examinar una biblioteca de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véase, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150: 880­ 887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
El término “región hipervariable” o “HVR”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en cuanto a la secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos (“bucles hipervariables”). Generalmente, los anticuerpos de cuatro cadenas nativos comprenden seis HVR; tres en VH (H1, H2, H3), y tres en VL (L1, L2, L3). Las HVR comprenden generalmente residuos de aminoácido de los bucles hipervariables y/o de las “regiones determinantes de complementariedad” (CDR), teniendo estas últimas la variabilidad de secuencia más alta y/o participando en el reconocimiento de antígeno. Los bucles hipervariables a modo de ejemplo se producen en los residuos de aminoácido 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), y 96-101 (H3). (Chotia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las CDR a modo de ejemplo (CDR-L1 , CDR-L2, CDR-L3, c Dr -H1, CDR-H2 , y CDR-H3) se producen en los residuos de aminoácido 24­ 34 de L1, 50-56 de L2, 89-97 de L3, 31-35B de H1, 50-65 de H2, y 95-102 de H3. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Con la excepción de CDR1 en VH, las CDR comprenden generalmente los residuos de aminoácido que forman los bucles hipervariables. Las CDR también comprenden “residuos determinantes de especificidad” o “SDR”, que son residuos que entran en contacto con antígeno. Los SDR están contenidos dentro de regiones de las CDR denominadas CDR abreviadas, o a-CDR. Las a-CDR a modo de ejemplo (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, y a-CDR-H3) se producen en los residuos de aminoácido 31-34 de L1, 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de H1, 50-58 de H2, y 95-102 de H3. (Véase Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)). A menos que se indique lo contrario, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, residuos de FR) se numeran en el presente documento según Kabat et al., citado anteriormente.
“Marco” o “FR” se refiere a residuos de dominio variable distintos de residuos de la región hipervariable (HVR). El FR de un dominio variable consiste generalmente en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3, y FR4. Por consiguiente, las secuencias de HVR y FR aparecen generalmente en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
La frase “cadena pesada truncada en el extremo N-terminal”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que comprende partes, pero no la totalidad, de una cadena pesada de inmunoglobulina de longitud completa, en el que las partes que faltan son las que están normalmente ubicadas en la región N-terminal de la cadena pesada. Las partes que faltan pueden incluir el, pero no se limitan al, dominio variable, CH1, y parte o la totalidad de una secuencia de bisagra. Generalmente, si la secuencia de bisagra silvestre no está presente, el/los dominio(s) constante(s) restante(s) en la cadena pesada truncada en el extremo N-terminal comprenderá(n) un componente que puede unirse a otra secuencia de Fc (es decir, el “primer” polipéptido de Fc tal como se describe en el presente documento). Por ejemplo, dicho componente puede ser un residuo modificado o un residuo de cisteína añadido que puede formar una unión disulfuro.
“Receptor de Fc” o “FcR” describe un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. En algunas realizaciones, un FcR es un FcR humano nativo. En algunas realizaciones, un FcR es uno que se une a un anticuerpo de IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRIl y FcyRIM, incluyendo variantes alélicas y formas sometidas a corte y empalme alternativos de esos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un “receptor activante”) y FcyRIIB (un “receptor inhibidor”), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de los mismos. El receptor activante FcyRIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor (ITAM) en su dominio citoplasmático. El receptor inhibidor FcyRIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina de inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplasmático (véase, por ejemplo, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan, por ejemplo, en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med.
126:330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo los que se identificarán en el futuro, quedan abarcados por el término “FcR” en el presente documento.
El término “receptor de Fc” o “FcR” también incluye el receptor de nenonato, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) y regulación de homeostasis de inmunoglobulinas. Se conocen métodos de medición de la unión a FcRn (véase, por ejemplo, Ghetie y Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); documento WO 2004/92219 (Hinton et al.).
La unión a FcRn humano in vivo y la semivida en suero de polipéptidos de unión con alta afinidad a FcRn humano pueden someterse a ensayo, por ejemplo, en ratones transgénicos o líneas celulares humanas transfectadas que expresan FcRn humano, o en primates a los que se administran los polipéptidos con una región Fc variante. El documento WO 2000/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpo con unión mejorada o reducida a FcR. Véase también, por ejemplo, Shields et al. J. Biol. Chem. 9 (2): 6591-6604 (2001).
La “región de bisagra”, “secuencia de bisagra” y variaciones de las mismas, tal como se usan en el presente documento, incluyen el significado conocido en la técnica, que se ilustra, por ejemplo, en Janeway et al., Immuno Biology: the immune system in health and disease (Elsevier Science Ltd., NY) (4a ed., 1999); Bloom et al., Protein Science (1997), 6:407-415; Humphreys et al., J. Immunol. Methods (1997), 209:193-202.
A menos que se indique lo contrario, la expresión “anticuerpo multivalente” se usa a lo largo de la totalidad de esta memoria descriptiva para designar un anticuerpo que comprende tres o más sitios de unión a antígeno. El anticuerpo multivalente se diseña preferiblemente por ingeniería para tener los tres o más sitios de unión a antígeno y generalmente no es un anticuerpo de IgM o IgA de secuencia nativa.
Un fragmento “Fv” es un fragmento de anticuerpo que contiene un sitio de unión a, y reconocimiento de, antígeno completo. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y de cadena ligera en estrecha asociación, que puede ser de naturaleza covalente, por ejemplo en scFv. Es en esta configuración en la que las tres HVR de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. De manera colectiva, las seis HVR o un subconjunto de las mismas confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que sólo comprende tres HVR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse a antígeno, aunque habitualmente a una afinidad inferior al sitio de unión completo.
El fragmento “Fab” contiene un dominio variable y constante de la cadena ligera y un dominio variable y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 comprenden un par de fragmentos Fab que están generalmente unidos de manera covalente cerca de sus extremos carboxilo-terminal mediante cisteínas de bisagra entre los mismos. En la técnica también se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.
La frase “brazo de unión a antígeno”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una parte componente de un fragmento de anticuerpo que tiene la capacidad de unirse específicamente a una molécula diana de interés. De manera general y preferible, el brazo de unión a antígeno es un complejo de secuencias de polipéptidos de inmunoglobulina, por ejemplo, HVR y/o secuencias de dominio variable de una cadena ligera y pesada de inmunoglobulina.
Los fragmentos de anticuerpo “Fv de cadena sencilla” o “scFv” comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una única cadena de polipéptido. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un grupo de unión de polipéptido entre los dominios VH y VL, que permite que scFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de scFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994).
El término “diacuerpos” se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH y VL). Usando un grupo de unión que es demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se fuerza que los dominios se emparejen con los dominios complementarios de otra cadena y creen dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente, por ejemplo, en los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y en Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).
La expresión “anticuerpos lineales” se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 10571062 (1995). En resumen, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos de Fd en tándem (Vh-Chi-VhChi) que, junto con polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.
El término “anticuerpo monoclonal” tal como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones que se producen de manera natural o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando generalmente tales variantes presentes en cantidades minoritarias. A diferencia de preparaciones de anticuerpos policlonales, que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador “monoclonal” indica que el carácter del anticuerpo se obtiene a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que van a usarse pueden producirse mediante una variedad de técnicas, incluyendo el, pero sin limitarse al, método del hibridoma, métodos de ADN recombinante, métodos de presentación en fagos y métodos que usan animales transgénicos que contienen la totalidad o parte de los loci de inmunoglobulinas humanas, describiéndose tales métodos y otros métodos a modo de ejemplo para preparar anticuerpos monoclonales en el presente documento.
El término anticuerpo “quimérico” se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.
Un anticuerpo “humanizado” se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácido de HVR no humanas y residuos de aminoácido de FR humanas. En determinadas realizaciones, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que la totalidad o sustancialmente la totalidad de las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y la totalidad o sustancialmente la totalidad de las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una “forma humanizada” de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.
Un “anticuerpo humano” es uno que presenta una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o se deriva de una fuente no humana que usa repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican para anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.
Un “anticuerpo desnudo” se refiere a un anticuerpo que no está conjugado a un resto heterólogo (por ejemplo, un resto citotóxico) o radioetiqueta. El anticuerpo desnudo puede estar presente en una formulación farmacéutica.
Los “anticuerpos nativos” se refieren a moléculas de inmunoglobulina que se producen de manera natural con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos de IgG nativos son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 Dalton, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que están unidas por enlaces disulfuro. Desde el extremo N-terminal hasta el C-terminal, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también denominada dominio pesado variable o dominio variable de cadena pesada, seguida por tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). De manera similar, desde el extremo N-terminal hasta el C-terminal, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también denominada dominio ligero variable o dominio variable de cadena ligera, seguida por un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo puede asignarse a uno de dos tipos, denominados kappa ( k ) y lambda (X), basándose en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.
“Afinidad” se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, tal como se usa en el presente documento, “afinidad de unión” se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su pareja Y puede representarse generalmente mediante la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse mediante métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. A continuación se describen realizaciones ilustrativas y a modo de ejemplo específicas para medir la afinidad de unión.
Un anticuerpo “madurado en cuanto a afinidad” se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más HVR, en comparación con un anticuerpo original que no presenta tales alteraciones, dando tales alteraciones como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.
Un anticuerpo que tiene una “característica biológica” de un anticuerpo designado es uno que presenta una o más de las características biológicas de ese anticuerpo que lo distinguen de otros anticuerpos que se unen al mismo antígeno.
Un “sitio de unión a antígeno funcional” de un anticuerpo es uno que puede unirse a un antígeno diana. La afinidad de unión a antígeno del sitio de unión a antígeno no es necesariamente tan fuerte como la del anticuerpo original a partir del cual se deriva el sitio de unión a antígeno, pero la capacidad de unión a antígeno debe poder medirse usando uno cualquiera de una variedad de métodos conocidos para evaluar la unión de anticuerpo a un antígeno. Además, la afinidad de unión a antígeno de cada uno de los sitios de unión a antígeno de un anticuerpo multivalente en el presente documento no necesita ser cuantitativamente la misma. Para los anticuerpos multiméricos en el presente documento, el número de sitios de unión a antígeno funcionales puede evaluarse usando análisis por ultracentrifugación tal como se describe en el ejemplo 2 de la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 20050186208. Según este método de análisis, se combinan diferentes razones de antígeno diana con respecto a anticuerpo multimérico y se calcula el peso molecular promedio de los complejos suponiendo diferentes números de sitios de unión funcionales. Estos valores teóricos se comparan con los valores experimentales reales obtenidos con el fin de evaluar el número de sitios de unión funcionales.
Un “anticuerpo dependiente de especie” es uno que tiene una afinidad de unión más fuerte por un antígeno de una primera especie de mamífero que por un homólogo de ese antígeno de una segunda especie de mamífero. Normalmente, el anticuerpo dependiente de especie “se une específicamente” a un antígeno humano (es decir, tiene un valor de afinidad de unión (Kd) de no más de aproximadamente 1 x 10-7 M, preferiblemente no más de aproximadamente 1 x 10-8 M y lo más preferiblemente no más de aproximadamente 1 x 10-9 M) pero tiene una afinidad de unión por un homólogo del antígeno de una segunda especie de mamífero no humano que es al menos aproximadamente 50 veces, o al menos aproximadamente 500 veces, o al menos aproximadamente 1000 veces, más débil que su afinidad de unión por el antígeno humano. El anticuerpo dependiente de especie puede ser cualquiera de los diversos tipos de anticuerpos tal como se definió anteriormente. En algunas realizaciones, el anticuerpo dependiente de especie es un anticuerpo humanizado o humano.
Un anticuerpo “aislado” es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunas realizaciones, un anticuerpo se purifica hasta una pureza superior al 95% o al 99% tal como se determina, por ejemplo, mediante electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, HPLC de fase inversa o intercambio iónico). Para la revisión de métodos para la evaluación de la pureza de anticuerpo, véase, por ejemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
2) Proteínas extracelulares
Las proteínas extracelulares desempeñan papeles importantes, entre otras cosas, en la formación, diferenciación y mantenimiento de organismos multicelulares. Se expone una discusión de diversas proteínas intracelulares de interés en la patente estadounidense n.° 6.723.535, Ashkenazi et al., concedida el 20 de abril de 2004.
El destino de muchas células individuales, por ejemplo, proliferación, migración, diferenciación o interacción con otras células, está gobernado normalmente por la información recibida a partir de otras células y/o el entorno inmediato. Esta información se transmite con frecuencia por polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos y hormonas) que a su vez se reciben e interpretan por diversos receptores celulares o proteínas unidas a membrana. Estos polipéptidos secretados o moléculas de señalización pasan normalmente a través de la trayectoria secretora celular para alcanzar su sitio de acción en el entorno extracelular.
Las proteínas secretadas tienen diversas aplicaciones industriales, incluyendo como productos farmacéuticos, productos de diagnóstico, biosensores y biorreactores. La mayoría de los fármacos de proteínas disponibles en la actualidad, tales como agentes trombolíticos, interferones, interleucinas, eritropoyetinas, factores estimulantes de colonias y diversas otras citocinas, son proteínas secretoras. Sus receptores, que son proteínas de membrana, también tienen potencial como agentes terapéuticos o de diagnóstico. Están emprendiéndose esfuerzos tanto por la industria como por el sector académico para identificar nuevas proteínas secretadas nativas. Muchos esfuerzos se centran en la exploración de bibliotecas de ADN recombinante de mamíferos para identificar las secuencias codificantes de proteínas secretadas novedosas. Se describen ejemplos de métodos y técnicas de exploración en la bibliografía (véase, por ejemplo, Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:7108-7113 (1996); patente estadounidense n.° 5.536.637).
Las proteínas y receptores unidos a membrana pueden desempeñar papeles importantes, entre otras cosas, en la formación, diferenciación y mantenimiento de organismos multicelulares. El destino de muchas células individuales, por ejemplo, proliferación, migración, diferenciación o interacción con otras células, está regido normalmente por información recibida a partir de otras células y/o del entorno inmediato. Esta información se transmite con frecuencia por polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos y hormonas) que a su vez se reciben y se interpretan por diversos receptores celulares o proteínas unidas a membrana. Tales proteínas unidas a membrana y receptores celulares incluyen, pero no se limitan a, receptores de citocinas, cinasas receptoras, fosfatasas receptoras, receptores que participan en interacciones célula-célula, y moléculas de adhesión celular tales como selectinas e integrinas. Por ejemplo, la transducción de señales que regulan el crecimiento y la diferenciación celular se regula en parte mediante fosforilación de diversas proteínas celulares. Las proteína tirosina cinasas, enzimas que catalizan ese proceso, también pueden actuar como receptores de factores de crecimiento. Los ejemplos incluyen receptor de factor de crecimiento de fibroblastos y receptor de factor de crecimiento nervioso.
Las proteínas unidas a membrana y moléculas receptoras tienen diversas aplicaciones industriales, incluyendo como agentes farmacéuticos y de diagnóstico. Pueden emplearse inmunoadhesinas receptoras, por ejemplo, como agentes terapéuticos para bloquear interacciones receptor-ligando. Las proteínas unidas a membrana también pueden emplearse para explorar posibles inhibidores de molécula pequeña o péptido de la interacción receptor/ligando relevante.
3) Síntesis C-terminales basadas en inteína
Tal como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 6.849.428, concedida el 1 de febrero de 2005, las inteínas son la proteína equivalente de los intrones de ARN de autoempalme (véase Perler et al., Nucleic Acids Res. 22:1125-1127 (1994)), que catalizan su propia escisión a partir de una proteína precursora con la fusión concomitante de las secuencias de proteínas flanqueantes, conocidas como exteínas (revisado en Perler et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1:292-299 (1997); Perler, F. B. Cell 92(1):1-4 (1998); Xu et al., EMBO J. 15(19):5146-5153 (1996)).
Estudios sobre el mecanismo del corte y empalme de inteínas condujeron al desarrollo de un sistema de purificación de proteínas que usó la escisión inducida por tiol del enlace peptídico en el extremo N-terminal de la inteína Sce VMA (Chong et al., Gene 192(2):271-281 (1997)). La purificación con este sistema mediado por inteína genera una proteína expresada en bacterias con un tioéster C-terminal (Chong et al., (1997)). En una aplicación, en la que se describe aislar una proteína citotóxica, la proteína expresada en bacterias con el tioéster C-terminal se fusiona después a un péptido químicamente sintetizado con una cisteína N-terminal usando la química descrita para “ligación química nativa” (Evans et al., Protein Sci. 7:2256-2264 (1998); Muir et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6705-6710 (1998)).
Esta técnica, denominada “ligación de proteínas mediada por inteína” (IPL), representa un avance importante en técnicas de semisíntesis de proteínas. Sin embargo, dado que los péptidos químicamente sintetizados de más de aproximadamente 100 residuos son difíciles de obtener, la aplicación general de IPL se limitó por el requisito de un péptido químicamente sintetizado como pareja de ligación.
La tecnología de IPL se expandió significativamente cuando se generó una proteína expresada con un extremo N-terminal predeterminado, tal como cisteína, tal como se describe por ejemplo en la patente estadounidense n.° 6.849.428. Esto permite la fusión de una o más proteínas expresadas a partir de una célula huésped, tal como células bacterianas, de levadura o de mamífero. En un ejemplo no limitativo, se usa la inteína de un Methanobacterium thermoautotrophicum RIR1 modificado que se escinde o bien en el extremo C-terminal o bien en el extremo N-terminal, lo cual permite la liberación de una proteína expresada en bacterias durante una purificación en una columna, eliminando por tanto totalmente la necesidad de proteasas.
La tecnología de inteína es un ejemplo de una vía para obtener componentes. En una realización, las subunidades de los compuestos de la invención se obtienen mediante transfección de células adecuadas, que pueden expresar y secretar polipéptidos quiméricos maduros, en las que tales polipéptidos comprenden, por ejemplo, un dominio de adhesina contiguo con un dominio de inteína C-terminal aislable (véase la patente estadounidense n.° 6.849.428, Evans et al., concedida el 1 de febrero de 2005). Las células, tales como células de mamífero o células bacterianas, se transfectan usando técnicas de ADN recombinante conocidas. Entonces, puede aislarse el polipéptido quimérico secretado, por ejemplo usando una resina derivatizada con quitina en el caso de un dominio de unión a inteína-quitina (véase la patente estadounidense n.° 6.897.285, Xu et al., concedida el 24 de mayo de 2005), y después se trata en condiciones que permiten la escisión y liberación mediada por tiol de la subunidad terminada en tioéster ahora C-terminal. La subunidad de adhesión terminada en tioéster se convierte fácilmente en una subunidad terminada en cisteína C-terminal.
Por ejemplo, tras una reacción de autoescisión de inteína, se genera un producto intermedio de tioéster que permite la adición fácil de cisteína, selenocisteína, homocisteína u homoselenocisteína, o un derivado de cisteína, selenocisteína, homocisteína, homoselenocisteína, al extremo C-terminal mediante ligación química nativa. Métodos de adición de una cisteína, selenocisteína, homocisteína u homoselenocisteína, o un derivado de cisteína, selenocisteína, homocisteína, homoselenocisteína, al extremo C-terminal mediante ligación química nativa que son útiles en aspectos de la presente invención se describen en la solicitud de patente estadounidense n.° 2008/0254512, Capon, publicada el 16 de octubre de 2008, cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento como referencia.
Kits
En el presente documento también se dan a conocer kits que comprenden los compuestos dados a conocer en el presente documento y las composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos. Un kit puede incluir, además del compuesto o la composición farmacéutica, agentes de diagnóstico o terapéuticos. Un kit también puede incluir instrucciones de uso en un método de diagnóstico o terapéutico. En un aspecto de diagnóstico, el kit incluye el compuesto o una composición farmacéutica del mismo y un agente de diagnóstico. En un aspecto terapéutico, el kit incluye el anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo y uno o más agentes terapéuticos, tales como un agente antineoplásico adicional, agente antitumoral o agente quimioterápico.
Técnicas generales
La siguiente descripción se refiere principalmente a la producción de tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés cultivando células transformadas o transfectadas con un vector que contiene un ácido nucleico codificante. Evidentemente, se contempla que pueden emplearse métodos alternativos, que se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos, o porciones de la misma, puede producirse mediante síntesis de péptidos directa usando técnicas en fase sólida (véase, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, Calif. (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)). Puede realizarse la síntesis de proteínas in vitro usando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada puede lograrse, por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems (Foster City, Calif.) usando las instrucciones del fabricante. Pueden sintetizarse químicamente por separado diversas porciones de los tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés y combinarse usando métodos químicos o enzimáticos para producir los tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés de longitud completa.
1. Selección y transformación de células huésped
Se transfectan o se transforman células huésped con vectores de expresión o clonación descritos en el presente documento para la producción y se cultivan en medios de nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican para las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como medios, temperatura, pH y similares, pueden seleccionarse por el experto en la técnica sin excesiva experimentación. En general, pueden encontrarse principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos celulares en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook et al., citado anteriormente.
El experto habitual en la técnica conoce métodos de transfección de célula eucariotas y transformación de células procariotas, por ejemplo, CaCl2, CaPO4, mediados por liposoma y electroporación. Dependiendo de la célula huésped usada, se realiza la transformación usando técnicas convencionales apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio empleando cloruro de calcio, tal como se describe en Sambrook et al., citado anteriormente, o la electroporación se usan generalmente para procariotas. La infección con Agrobacterium tumefaciens se usa para la transformación de determinadas células vegetales, tal como se describe por Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y el documento WO 89/05859 publicado el 29 de junio de 1989. Para células de mamífero sin tales paredes celulares, puede emplearse el método de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Se han descrito aspectos generales de transfecciones en sistema huésped de célula de mamíferos en la patente estadounidense n.° 4.399.216. Normalmente se llevan a cabo transformaciones en levadura según el método de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946(1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo, también pueden usarse otros métodos para introducir ADN en células, tal como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para diversas técnicas para transformar células de mamífero, véase Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).
Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores en el presente documento incluyen células procariotas, de levadura o eucariotas superiores. Las procariotas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tal como E. coli. Hay diversas cepas de E. coli públicamente disponibles, tales como E. coli K12 cepa MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E. coli cepa W3110 (ATCC 27.325) y K5772 (ATCC 53.635). Otras células huésped procariotas adecuadas incluyen Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P dado a conocer en el documento DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitativos. La cepa W3110 es un huésped particularmente preferido o huésped original porque es una cepa huésped habitual para fermentaciones de productos de ADN recombinante. Preferiblemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para realizar una mutación genética en los genes que codifican para proteínas endógenas para el huésped, incluyendo ejemplos de tales huéspedes E. coli W3110 cepa 1A2, que tiene el genotipo completo tonA; E. coli W3110 cepa 9E4, que tiene el genotipo completo tonA ptr3; E. coli W3110 cepa 27C7 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonAptr3phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kanr; E. coli W3110 cepa 37D6, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr, E. coli W3110 cepa 40B4, que es la cepa 37D6 con una mutación de deleción de degP no resistente a kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene proteasa periplásmica mutante dada a conocer en la patente estadounidense n.° 4.946.783 concedida el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, son adecuados métodos in vitro de clonación, por ejemplo, PCR u otras reacciones de polimerasa de ácidos nucleicos.
Además de procariotas, microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores de codificación. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariota inferior habitualmente usado. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 290:140 (1981); documento EP 139.383 publicado el 2 de mayo de 1985); huéspedes de Kluyveromyces (patente estadounidense n.° 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tales como, por ejemplo, K. Lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (documento EP 402.226); Pichia pastoris (documento EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia (documento EP 244.234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979)); Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis (documento EP 394.538 publicado el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (documento WO 91/00357 publicado el 10 de enero de 1991), y huéspedes de Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 (1983); Tilburn et al., Gene, 26:205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 (1984)) y f\. niger (Kelly y Hynes, EMBO J., 4:475479 (1985)). Las levaduras metilotrópicas son adecuadas en el presente documento e incluyen, pero no se limitan a, levaduras que pueden crecer en metanol seleccionadas de los géneros que consisten en Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis y Rhodotorula. Puede encontrarse una lista de especies específicas que son a modo de ejemplo de esta clase de levaduras en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
Células huésped adecuadas para la expresión de tramos glicosilados de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés se derivan a partir de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células de insecto tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células vegetales. Los ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) y COS. Ejemplos más específicos incluyen línea CV1 de riñón de mono transformada mediante SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de ovario de hámster chino /-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de pulmón humanas (W138, At Cc CCL 75); células de hígado humanas (Hep G2, HB 8065); y tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). Se considera que la selección de la célula huésped apropiada está dentro de las habilidades en la técnica.
2. Selección y uso de un vector replicable
El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifica para el tramo de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés puede insertarse en un vector replicable para su clonación (amplificación del ADN) o para su expresión. Hay diversos vectores públicamente disponibles. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, cósmido, partícula viral o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede insertarse en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general, se inserta ADN en un(os) sitio(s) de endonucleasa de restricción apropiado(s) usando técnicas conocidas en la técnica. Los componentes de vector incluyen generalmente, pero no se limitan a, uno o más de una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de esos componentes emplea técnicas de ligación convencionales que se conocen por el experto en la técnica.
Los tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés pueden producirse de manera recombinante no sólo directamente, sino también como polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N-terminal de la proteína o el polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede formar parte del a Dn codificante que se inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, a partir del grupo de líderes de fosfatasa alcalina, penicilinasa, 1pp o enterotoxina II termoestable. Para la secreción de levaduras, la secuencia señal puede ser, por ejemplo, el líder de invertasa de levadura, líder de factor alfa (incluyendo líderes de factor alfa de Saccharomyces y Kluyveromyces, éste último descrito en la patente estadounidense n.° 5.010.182), o líder de fosfatasa ácida, el líder de glucoamilasa de C. albicans (documento EP 362.179 publicado el 4 de abril de 1990) o la señal descrita en el documento WO 90/13646 publicado el 15 de noviembre de 1990.
En la expresión en células de mamífero, pueden usarse secuencias señal de mamífero para dirigir la secreción de la proteína, tales como secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o de una relacionada, así como líderes secretores virales.
Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Tales secuencias se conocen bien para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen de plásmido del 2mu es adecuado para levaduras, y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero.
Los vectores de expresión y clonación contendrán normalmente un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican para proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles a partir de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica para D-alanina racemasa para Bacilli.
Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son los que permiten la identificación de células competentes para la captación del ácido nucleico codificante, tales como DHFR o timidina cinasa. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR silvestre es la línea celular CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada tal como se describe por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección adecuado para su uso en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levaduras YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC n.° 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)).
Los vectores de expresión y clonación contienen habitualmente un promotor unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico codificante para dirigir la síntesis de ARNm. Se conocen bien promotores reconocidos por una variedad de posibles células huésped. Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas incluyen los sistemas de promotor de beta-lactamasa y lactosa (Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)), fosfatasa alcalina, un sistema de promotor de triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); documento EP 36.776) y promotores híbridos tales como el promotor tac (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)). Los promotores para su uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) operativamente unida al ADN codificante.
Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su uso con huéspedes de levaduras incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)) u otras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa.
Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada mediante condiciones de crecimiento, son las regiones de promotor para alcohol deshidrogenasa 2 , isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradantes asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables del uso de maltosa y galactosa. Se describen adicionalmente vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión de levaduras en el documento EP 73.657.
La transcripción a partir de vectores en células huésped de mamífero se controla, por ejemplo, mediante promotores obtenidos a partir de los genomas de virus tales como virus del polioma, virus de la viruela aviar (documento UK 2.211.504 publicado el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus del simio 40 (SV40), a partir de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y a partir de promotores de choque térmico, siempre que tales promotores sean compatibles con los sistemas de célula huésped.
La transcripción de un ADN que codifica para los tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés mediante eucariotas superiores puede aumentarse insertando una secuencia de potenciador en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, habitualmente de aproximadamente desde 10 hasta 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Ahora se conocen muchas secuencias de potenciadores para genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína e insulina). Sin embargo, normalmente se usará un potenciador de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. El potenciador puede someterse a corte y empalme en el vector en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia codificante, pero preferiblemente está ubicado en un sitio 5' desde el promotor.
Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (células de levaduras, hongos, insectos, vegetales, animales, humanas o nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias están habitualmente disponibles desde las regiones no traducidas en 5' y, ocasionalmente en 3', de ADN o ADNc virales o de eucariotas. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida de los tramos que codifican para ARNm de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés.
Todavía otros métodos, vectores y células huésped adecuados para su adaptación a la síntesis de tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos en cultivo de células de vertebrados recombinantes se describen en Geting et al., Nature 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:4046 (1979); documentos EP 117.060; y EP 117.058.
3. Detección de la amplificación/expresión génica
La amplificación y/o expresión génica pueden medirse directamente en una muestra, por ejemplo, mediante transferencia de tipo Southern convencional, transferencia de tipo Northern para cuantificar la transcripción de ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), transferencia puntual (análisis de ADN) o hibridación in situ, usando una sonda marcada de manera apropiada, basándose en las secuencias proporcionadas en el presente documento. Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN, y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. A su vez, pueden marcarse los anticuerpos y puede llevarse a cabo el ensayo en el que el dúplex se une a una superficie, de modo que, tras la formación del dúplex en la superficie, puede detectarse la presencia de anticuerpo unido al dúplex.
Alternativamente, la expresión génica puede medirse mediante métodos inmunológicos, tales como tinción inmunohistoquímica de células o secciones tisulares y ensayo de cultivo tisular o líquidos corporales, para cuantificar directamente la expresión de producto génico. Los anticuerpos útiles para tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de líquidos de muestra pueden ser o bien monoclonales o bien policlonales, y pueden prepararse en cualquier mamífero. De manera conveniente, los anticuerpos pueden prepararse contra una secuencia nativa de tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés o contra un péptido sintético basándose en las secuencias de ADN proporcionadas en el presente documento o contra una secuencia exógena fusionada a ADN que codifica para un tramo de aminoácidos consecutivos o polipéptido de interés y que codifica para un epítopo de anticuerpo específico.
4. Purificación de polipéptido
Pueden recuperarse formas de los tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés a partir de medio de cultivo o a partir de lisados de células huésped. Si está unido a membrana, puede liberarse de la membrana usando una disolución de detergente adecuada (por ejemplo Triton-X 100) o mediante escisión enzimática. Las células empleadas en la expresión de los tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés pueden alterarse mediante diversos medios físicos o químicos, tales como ciclos de congelación-descongelación, sonicación, alteración mecánica o agentes de lisado celular.
Puede desearse purificar los tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés a partir de proteínas o polipéptidos de células recombinantes. Los siguientes procedimientos son a modo de ejemplo de procedimientos de purificación adecuados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación en etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A-Sepharose para retirar contaminantes tales como IgG; y columnas de quelación de metales para unirse a formas marcadas con etiqueta de epítopo. Pueden emplearse diversos métodos de purificación de proteínas y tales métodos se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, Nueva York (1982). La(s) etapa(s) de purificación seleccionada(s) dependerá(n), por ejemplo, de la naturaleza del procedimiento de producción usado y de los tramos particulares de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés producidos.
Ejemplo de expresión de tramo de aminoácidos consecutivos o componente de polipéptido de interés en E. coli
La secuencia de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos deseada de interés o polipéptido se amplifica inicialmente usando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores deben contener sitios de enzimas de restricción que corresponden a los sitios de enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado. Puede emplearse una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo de un vector adecuado es pBR322 (derivado de E. coli; véase Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)) que contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina. Se digiere el vector con enzima de restricción y se desfosforila. Después se ligan las secuencias amplificadas por PCR en el vector. El vector incluirá preferiblemente secuencias que codifican para un gen de resistencia a antibiótico, un promotor trp, un líder de polihis (incluyendo los seis primeros codones de STII, secuencia de polihis y sitio de escisión de enterocinasa), la secuencia de aminoácidos específica de interés / región codificante de polipéptido, terminador de transcripción lambda y un gen de argU.
Después se usa la mezcla de ligación para transformar una cepa de E. coli seleccionada usando los métodos descritos en Sambrook et al., citado anteriormente. Se identifican transformantes mediante su capacidad para crecer en placas de LB y después se seleccionan colonias resistentes a antibiótico. Puede aislarse a Dn de plásmido y confirmarse mediante análisis de restricción y secuenciación de ADN.
Pueden hacerse crecer clones seleccionados durante la noche en medio de cultivo líquido tal como caldo LB complementado con antibióticos. El cultivo durante la noche puede usarse posteriormente para inocular un cultivo a mayor escala. Después se hacen crecer las células hasta una densidad óptica deseada, durante lo cual se activa el promotor de expresión.
Después de cultivar las células durante varias horas más, pueden recogerse las células mediante centrifugación. El sedimento celular obtenido mediante la centrifugación puede solubilizarse usando diversos agentes conocidos en la técnica, y después puede purificarse la secuencia de aminoácidos solubilizada de interés o polipéptido usando una columna de quelación de metales en condiciones que permiten una estrecha unión de la proteína.
Los cebadores pueden contener sitios de enzimas de restricción que corresponden a los sitios de enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado, y otras secuencias útiles que proporcionan un inicio de la traducción eficiente y fiable, purificación rápida en una columna de quelación de metales, y retirada proteolítica con enterocinasa.
Las secuencias marcadas con etiqueta de poli-His, amplificadas por PCR, pueden ligarse en un vector de expresión usado para transformar un huésped de E. coli basándose, por ejemplo, en la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq). En primer lugar pueden hacerse crecer transformantes en LB que contiene carbenicilina a 50 mg/ml a 30°C con agitación hasta que se alcanza una DO600 de 3-5. Después se diluyen los cultivos 50-100 veces en medios CRAP (preparados mezclando 3,57 g de (N H ^S O 4, 0,71 g de citrato de sodio-2 H2O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de extracto de levadura Difco, 5,36 g de Sheffield hycase SF en 500 ml de agua, así como MPOS 110 mM, pH 7,3, glucosa al 0,55% (p/v) y MgSO47 mM) y se hacen crecer durante aproximadamente 20-30 horas a 30°C con agitación. Se retiran las muestras para verificar la expresión mediante análisis mediante SDS-PAGE, y se centrifuga el cultivo a granel para sedimentar las células. Se congelaron los sedimentos celulares hasta su purificación y replegamiento.
Se resuspendió la pasta de E. coli de fermentaciones de 0,5 a 1 l (6-10 g de sedimentos) en 10 volúmenes (p/v) en tampón de guanidina 7 M, Tris 20 mM, pH 8. Se añade sulfito de sodio sólido y tetrationato de sodio para producir concentraciones finales de 0,1 M y 0,02 M, respectivamente, y se agitó la disolución durante la noche a 4°C. Esta etapa da como resultado una proteína desnaturalizada con todos los residuos de cisteína bloqueados mediante sulfitolización. Se centrifugó la disolución a 40.000 rpm en una ultracentrifugadora Beckman durante 30 min. Se diluyó el sobrenadante con 3-5 volúmenes de tampón de columna de quelato de metal (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7,4) y se filtró a través de filtros de 0,22 micrómetros para aclararlo. Dependiendo se cargó el extracto aclarado en una columna de quelato de metal 5 mil Qiagen Ni-NTA equilibrada en el tampón de columna de quelato de metal. Se lavó la columna con tampón adicional que contenía imidazol 50 mM (Calbiochem, calidad Utrol), pH 7,4. Se eluyó la proteína con tampón que contenía imidazol 250 mM. Se combinaron las fracciones que contenían la proteína deseada y se almacenaron a 4°C. Se estimó la concentración de proteína mediante su absorbancia a 280 nm usando el coeficiente de extinción calculado basándose en su secuencia de aminoácidos.
Expresión de tramo de aminoácidos consecutivos o polipéptidos en células de mamífero
Este ejemplo general ilustra una preparación de una forma glicosilada de una secuencia de aminoácidos deseada de interés o componente de polipéptido mediante expresión recombinante en células de mamífero.
Puede emplearse el vector pRK5 (véase el documento EP 307.247, publicado el 15 de marzo de 1989) como vector de expresión. Opcionalmente, se liga el ADN codificante en pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción del ADN usando métodos de ligación tales como los descritos en Sambrook et al., citado anteriormente.
En una realización, las células huésped seleccionadas pueden ser células 293. Se hacen crecer células 293 humanas (ATCC CCL 1573) hasta la confluencia en placas de cultivo tisular en medio tal como DMEM complementado con suero de ternero fetal y, opcionalmente, componentes de nutrientes y/o antibióticos. Se mezclan aproximadamente 10 |ig del ADN de vector ligado con aproximadamente 1 |ig de ADN que codifica para el gen de ARN de VA [Thimmappaya et al., Cell 31:543 (1982)] y se disuelven en 500 |il de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl20,227 M. A esta mezcla se le añaden, gota a gota, 500 |il de HEPES de 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPO41,5 mM, y se deja que se forme un precipitado durante 10 minutos a 25°C. Se suspende el precipitado y se añade a las células 293 y se deja que sedimente durante aproximadamente cuatro horas a 37°C. Se elimina por aspiración el medio de cultivo y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. Después se lavan las células 293 con medio libre de suero, se añade medio recién preparado y se incuban las células durante aproximadamente 5 días.
Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, se retira el medio de cultivo y se sustituye por medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 35S-cisteína 200 pCi/ml y 35S-metionina 200 |iCi/ml. Después de una incubación de 12 horas, se recoge el medio condicionado, se concentra en un filtro de centrifugación y se carga sobre un gel con SDS al 15%. El gel procesado puede secarse y exponerse a película durante un periodo de tiempo seleccionado para revelar la presencia de secuencia de aminoácidos de interés o componente de polipéptido. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden someterse a incubación adicional (en medio libre de suero) y se somete el medio a prueba en bioensayos seleccionados.
En una técnica alternativa, la secuencia de aminoácidos de ácido nucleico de interés o componente de polipéptido puede introducirse en células 293 de manera transitoria usando el método de sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981). Se hacen crecer células 293 hasta su densidad máxima en un matraz de centrifugación y se añaden 700 |ig del vector ligado. En primer lugar se concentran las células a partir del matraz de centrifugación mediante centrifugación y se lavan con PBS. Se incuba el precipitado de ADN-dextrano sobre el sedimento celular durante cuatro horas. Se tratan las células con glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo tisular y vuelven a introducirse en el matraz de centrifugación que contiene medio de cultivo tisular, insulina bovina 5 |ig/ml y transferrina bovina 0,1 |ig/ml. Después de aproximadamente cuatro días, se centrifugan los medios condicionados y se filtran para retirar células y residuos. Después puede concentrarse la muestra que contiene la secuencia de aminoácidos expresada de interés o componente de polipéptido y purificarse mediante cualquier método seleccionado, tal como diálisis y/o cromatografía en columna.
En otra realización, la secuencia de aminoácidos de interés o componente de polipéptido puede expresarse en células CHO. La secuencia de aminoácidos de interés o componente de polipéptido puede transfectarse en células CHO usando reactivos conocidos tales como CaPO4 o DEAE-dextrano. Tal como se describió anteriormente, pueden incubarse los cultivos celulares, y sustituirse el medio por medio de cultivo (solo) o medio que contiene un radiomarcador tal como 35S-metionina. Después de determinar la presencia de secuencia de aminoácidos de interés o componente de polipéptido, puede sustituirse el medio de cultivo por medio libre de suero. Preferiblemente, se incuban los cultivos durante aproximadamente 6 días y después se recoge el medio condicionado. Después puede concentrarse el medio que contiene la secuencia de aminoácidos expresada de interés o componente de polipéptido y purificarse mediante cualquier método seleccionado.
También puede expresarse la secuencia de aminoácidos marcada con etiqueta de epítopo de interés o componente de polipéptido en células CHO huésped. La secuencia de aminoácidos de interés o componente de polipéptido puede subclonarse a partir de un vector pRK5. El inserto de subclón puede someterse a PCR para fusionarse en marco con una etiqueta de epítopo seleccionada tal como una etiqueta de poli-his en un vector de expresión de baculovirus. Después puede subclonarse el inserto de secuencia de aminoácidos marcada con etiqueta de poli-his de interés o componente de polipéptido en un vector impulsado por SV40 que contiene un marcador de selección tal como DHFR para la selección de clones estables. Finalmente, pueden transfectarse las células CHO (tal como se describió anteriormente) con el vector impulsado por SV40. Puede realizarse el marcaje, tal como se describió anteriormente, para verificar la expresión. Después puede concentrarse el medio de cultivo que contiene la secuencia de aminoácidos marcada con etiqueta de poli-His expresada de interés o componente de polipéptido y purificarse mediante cualquier método seleccionado, tal como mediante cromatografía de afinidad por quelato de Ni2+.
En una realización la secuencia de aminoácidos de interés o componente de polipéptido se expresan como un constructo de IgG (inmunoadhesina), en el que las secuencias codificantes para las formas solubles (por ejemplo dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan con una secuencia de región constante de IgG1 que contiene los dominios bisagra, CH2 y CH2 y/o es una forma marcada con etiqueta de poli-His.
Tras la amplificación por PCR, se subclonan los ADN respectivos en un vector de expresión de CHO usando técnicas convencionales tal como se describe en Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, unidad 3.16, John Wiley and Sons (1997). Se construyen vectores de expresión de CHO para tener sitios de restricción compatibles en 5' y 3' del ADN de interés para permitir el transporte por lanzadera conveniente de los ADNc. El vector usado en la expresión en células CHO es tal como se describe en Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24:9 (1774-1779 (1996), y usa el promotor temprano/potenciador de SV40 para impulsar la expresión del ADNc de interés y dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la selección para el mantenimiento estable del plásmido tras la transfección.
Expresión de tramo de aminoácidos consecutivos o polipéptidos en levaduras
El siguiente método describe la expresión recombinante de una secuencia de aminoácidos deseada de interés o componente de polipéptido en levaduras.
En primer lugar, se construyen vectores de expresión de levaduras para la producción intracelular o secreción de un tramo de aminoácidos consecutivos a partir del promotor de ADH2/GAPDH. Se inserta ADN que codifica para una secuencia de aminoácidos deseada de interés o componente de polipéptido, un péptido señal seleccionado y el promotor en sitios de enzimas de restricción adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular de la secuencia de aminoácidos de interés o componente de polipéptido. Para la secreción, puede clonarse ADN que codifica para el tramo de aminoácidos consecutivos en el plásmido seleccionado, junto con a Dn que codifica para el promotor de ADH2/GAPDH, la secuencia señal/líder secretora de factor alfa de levadura y secuencias de grupo de unión (si se necesita) para la expresión del tramo de aminoácidos consecutivos.
Después, pueden transformarse células de levadura, tales como cepa de levadura AB110, con los plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivarse en medios de fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de levadura transformados pueden analizarse mediante precipitación con ácido tricloroacético al 10% y separación mediante SDS-PAGE, seguido por tinción de los geles con tinte azul de Coomassie.
Posteriormente puede aislarse la secuencia de aminoácidos recombinante de interés o componente de polipéptido y purificarse retirando las células de levadura a partir del medio de fermentación mediante centrifugación y después concentración del medio usando filtros de cartucho seleccionados. El concentrado que contiene la secuencia de aminoácidos de interés o componente de polipéptido puede purificarse adicionalmente usando resinas de cromatografía en columna seleccionadas.
Expresión de tramos de tramo de aminoácidos consecutivos o polipéptidos en células de insecto infectadas por baculovirus
El siguiente método describe la expresión recombinante de tramos de aminoácidos consecutivos en células de insecto infectadas por baculovirus.
El ácido nucleico deseado que codifica para el tramo de aminoácidos consecutivos se fusiona en el sentido de 5' de una etiqueta de epítopo contenida en un vector de expresión de baculovirus. Tales etiquetas de epítopo incluyen etiquetas de poli-his y etiquetas de inmunoglobulina (tales como regiones Fc de IgG). Puede emplearse una variedad de plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de plásmidos comercialmente disponibles tales como pVL1393 (Novagen). En resumen, la secuencia de aminoácidos de interés o componente de polipéptido o la porción deseada de la secuencia de aminoácidos de interés o componente de polipéptido (tal como la secuencia que codifica para el dominio extracelular de una proteína transmembrana) se amplifica mediante PCR con cebadores complementarios a las regiones en 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar sitios de enzimas de restricción flanqueantes (seleccionados). Después se dirigiere el producto con esas enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en el vector de expresión.
El baculovirus recombinante se genera cotransfectando el plásmido anterior y ADN de virus BaculoGold™ (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda (“Sf9”) (ATCC CRL 1711) usando Lipofectin (comercialmente disponible de GIBCO-BRL). Después de 4-5 días de incubación a 28°C, se recogen los virus liberados y se usan para amplificaciones adicionales. La infección viral y expresión de proteína se realizan tal como se describe por O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).
Después, puede purificarse la secuencia de aminoácidos marcada con etiqueta de poli-his expresada de interés o componente de polipéptido, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad por quelato de Ni2+ de la siguiente manera. Se preparan extractos a partir de células Sf9 infectadas por virus recombinante tal como se describe por Rupert et al., Nature, 362:175-179 (1993). En resumen, se lavan células Sf9, se resuspenden en tampón de sonicación (25 ml de Hepes, pH 7,9; MgCh 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; glicerol al 10%; NP40 al 0,1%; KCl 0,4 M), y se sonican dos veces durante 20 segundos sobre hielo. Se aclaran los sonicados mediante centrifugación, y se diluye el sobrenadante 50 veces en tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtra a través de un filtro de 0,45 |im. Se prepara una columna de agarosa de Ni2+-NTA (comercialmente disponible de Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se equilibra con 25 ml de tampón de carga. Se carga el extracto celular filtrado sobre la columna a 0,5 ml por minuto. Se lava la columna hasta A280 de nivel inicial con tampón de carga, momento en el cual se inicia la recogida de fracciones. A continuación, se lava la columna con un tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 6,0), que eluye proteína unida de manera no específica. Después de alcanzar de nuevo el nivel inicial de A280, se desarrolla la columna con un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el tampón de lavado secundario. Se recogen fracciones de un ml y se analizan mediante SDS-PAGE y tinción de plata o inmunotransferencia de tipo Western con Ni2+-NTA conjugado con fosfatasa alcalina (Qiagen). Se combinan fracciones que contienen la secuencia marcada con etiqueta de His™ eluida y se dializan frente a tampón de carga.
Alternativamente, puede realizarse la purificación de la secuencia de aminoácidos marcada con etiqueta de IgG (o marcada con etiqueta de Fc) usando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo, por ejemplo, cromatografía en columna de proteína A o proteína G.
Pueden purificarse constructos de proteínas que contienen Fc a partir de medios condicionados de la siguiente manera. Se bombean los medios condicionados sobre una columna de proteína A de 5 ml (Pharmacia) que se equilibra en tampón de fosfato de Na 20 mM, pH 6,8. Después de la carga, se lava la columna de manera extensa con tampón de equilibrado antes de la elución con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. Se neutraliza inmediatamente la proteína eluida recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275 ml de tampón Tris 1 M, pH 9. Posteriormente se desala la proteína altamente purificada en tampón de almacenamiento tal como se describió anteriormente para las proteínas marcadas con etiqueta de poli-His. Se verifica la homogeneidad de las proteínas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (PEG) y secuenciación de aminoácidos N-terminales mediante degradación de Edman.
Ejemplos de composiciones farmacéuticas
A continuación se exponen ejemplos no limitativos de tales composiciones y dosificaciones:
Las composiciones que comprenden un compuesto que comprende un tramo de aminoácidos consecutivos que comprende aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia de etanercept (por ejemplo Enbrel) pueden comprender manitol, sacarosa y trometamina. En una realización, la composición está en forma de un liofilizado. En una realización, la composición se reconstituye, por ejemplo, con agua para inyección bacteriostática estéril (BWFI), USP (que contiene alcohol bencílico al 0,9%). En una realización el compuesto se administra a un sujeto para reducir signos y síntomas, inducir una respuesta clínica principal, inhibir la progresión de daño estructural, y mejorar la función física en sujetos con artritis reumatoide de moderada a gravemente activa. El compuesto puede iniciarse en combinación con metotrexato (MTX) o usarse solo. En una realización el compuesto se administra a un sujeto para reducir signos y síntomas de artritis reumatoide juvenil de curso poliarticular de moderada a gravemente activa en sujetos que han tenido una respuesta inadecuada a uno o más DMARD. En una realización el compuesto se administra a un sujeto para reducir signos y síntomas, inhibir la progresión de daño estructural de artritis activa y mejorar la función física en sujetos con artritis psoriásica. En una realización el compuesto se administra a un sujeto para reducir signos y síntomas en sujetos con espondilitis anquilosante activa. En una realización el compuesto se administra a un sujeto para el tratamiento de psoriasis en placas crónica de moderada a grave. En una realización en la que el sujeto tiene artritis reumatoide, artritis psoriásica o espondilitis anquilosante, el compuesto se administra a 25-75 mg por semana administrados como una o más inyecciones subcutáneas (s.c.). En una realización adicional el compuesto se administra a 50 mg por semana en una única inyección s.c. En una realización en la que el sujeto tiene psoriasis en placas el compuesto se administra a 25-75 mg dos veces por semana o con 4 días de separación durante 3 meses seguido por una reducción hasta una dosis de mantenimiento de 25-75 mg por semana. En una realización adicional el compuesto se administra a una dosis de 50 mg dos veces por semana o con 4 días de separación durante 3 meses seguido por una reducción hasta una dosis de mantenimiento de 50 mg por semana. En una realización la dosis es entre 2x y 100x menos que las dosis expuestas en el presente documento. En una realización en la que el sujeto tiene JRA de curso poliarticular activa, el compuesto puede administrarse a una dosis de 0,2-1,2 mg/kg por semana (hasta un máximo de 75 mg por semana). En una realización adicional el compuesto se administra a una dosis de 0,8 mg/kg por semana (hasta un máximo de 50 mg por semana). En algunas realizaciones la dosis es entre 2x y 100x menos que las dosis expuestas anteriormente en el presente documento.
Las composiciones que comprenden un compuesto que comprende un tramo de aminoácidos consecutivos que comprende aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia de infliximab (por ejemplo Remicade) pueden comprender sacarosa, polisorbato 80, fosfato de sodio monobásico, monohidratado, y fosfato de sodio dibásico, dihidratado. En una realización no hay conservantes presentes. En una realización, la composición está en forma de un liofilizado. En una realización, la composición se reconstituye, por ejemplo, con agua para inyección (BWFI), USP. En una realización el pH de la composición es de 7,2 o es de aproximadamente 7,2. En una realización el compuesto se administra se administra a un sujeto con artritis reumatoide en una dosis de 2-4 mg/kg administrada como una infusión intravenosa seguida por dosis similares adicionales a las 2 y 6 semanas después de la primera infusión, luego cada 8 semanas después de eso. En una realización adicional el compuesto se administra en una dosis de 3 mg/kg administrada como infusión intravenosa seguida por dosis similares adicionales a 2 y 6 semanas después de la primera infusión, luego cada 8 semanas después de eso. En una realización la dosis se ajusta hasta 10 mg/kg o tratando con una frecuencia de hasta cada 4 semanas. En una realización el compuesto se administra en combinación con metotrexato. En una realización el compuesto se administra se administra a un sujeto con enfermedad de Crohn o enfermedad de Crohn fistulizante a una dosis de 2-7 mg/kg administrada como régimen de inducción a las 0, 2 y 6 semanas seguido por un régimen de mantenimiento de 4-6 mg/kg cada 8 semanas después de eso para el tratamiento de enfermedad de Crohn o enfermedad fistulizante de moderada a gravemente activa. En una realización adicional el compuesto se administra a una dosis de 5 mg/kg administrada como régimen de inducción a las 0, 2 y 6 semanas seguido por un régimen de mantenimiento de 5 mg/kg cada 8 semanas después de eso para el tratamiento de enfermedad de Crohn o enfermedad fistulizante de moderada a gravemente activa. En una realización la dosis se ajusta hasta 10 mg/kg. En una realización el compuesto se administra a un sujeto con espondilitis anquilosante a una dosis de 2-7 mg/kg administrada como infusión intravenosa seguida por dosis similares adicionales a las 2 y 6 semanas después de la primera infusión, luego cada 6 semanas después de eso. En una realización adicional el compuesto se administra a una dosis de 5 mg/kg administrada como infusión intravenosa seguida por dosis similares adicionales a las 2 y 6 semanas después de la primera infusión, luego cada 6 semanas después de eso. En una realización el compuesto se administra a un sujeto con artritis psoriásica a una dosis de 2-7 mg/kg administrada como infusión intravenosa seguida por dosis similares adicionales a las 2 y 6 semanas después de la primera infusión, luego cada 8 semanas después de eso. En una realización adicional el compuesto se administra a una dosis de 5 mg/kg administrada como infusión intravenosa seguida por dosis similares adicionales a las 2 y 6 semanas después de la primera infusión, luego cada 8 semanas después de eso. En una realización el compuesto se administra con metotrexato. En una realización el compuesto se administra a un sujeto con colitis ulcerosa a una dosis de 2-7 mg/kg administrada como régimen de inducción a las 0, 2 y 6 semanas seguido por un régimen de mantenimiento de 2-7 mg/kg cada 8 semanas después de eso para el tratamiento de colitis ulcerosa de moderada a gravemente activa. En una realización adicional el compuesto se administra a un sujeto con colitis ulcerosa a una dosis de 5 mg/kg administrada como régimen de inducción a las 0, 2 y 6 semanas seguido por un régimen de mantenimiento de 5 mg/kg cada 8 semanas después de eso. En algunas realizaciones la dosis es entre 2x y 100x menor que las dosis expuestas anteriormente en el presente documento para tratar las enfermedades individuales.
En cada una de las realizaciones de las composiciones descritas en el presente documento, las composiciones, cuando están en forma de un liofilizado, pueden reconstituirse, por ejemplo, con disoluciones acuosas estériles, agua estéril, agua para inyecciones estéril (USP), agua para inyecciones bacteriostática estéril (USP) y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la técnica.
Se entiende que en la administración de cualquiera de los presentes compuestos, el compuesto puede administrarse de manera aislada, en un portador, como parte de una composición farmacéutica o en cualquier vehículo apropiado.
Dosificación
Se entiende que cuando se menciona un intervalo de dosificación en el presente documento, por ejemplo de 1­ 10 mg/kg por semana, la invención dada a conocer en el presente documento también contempla cada dosis de número entero, y decimales de los mismos, entre los límites superior e inferior. Por tanto, en el caso del ejemplo facilitado, la invención contempla 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1,2,2, 2,3, 2,4, etc., mg/kg hasta 10 mg/kg.
En realizaciones, los compuestos de la presente invención pueden administrarse como una única dosis o pueden administrarse como múltiples dosis.
En general, la dosificación diaria para tratar un trastorno o estado según los métodos descritos anteriormente oscilará generalmente entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 10,0 mg/kg de peso corporal del sujeto que va a tratarse.
Un médico experto habitual puede realizar variaciones basándose en los intervalos de dosificación anteriormente mencionados teniendo en cuenta consideraciones conocidas tales como el peso, edad y estado de la persona que está tratándose, la gravedad de la aflicción, y la vía de administración particular elegida.
También se espera que los compuestos dados a conocer produzcan una unión colaborativa con consecuencias relacionadas sobre las dosificaciones eficaces requeridas.
Productos farmacéuticos
Se entiende que el término “portador farmacéuticamente aceptable” incluye excipientes, portadores o diluyentes. El portador, diluyente o excipiente particular usado dependerá de los medios y del propósito para el que esté aplicándose el principio activo.
Para la administración parenteral, pueden emplearse disoluciones que contienen un compuesto de esta invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en disolución acuosa estéril. Tales disoluciones acuosas deben tamponarse de manera adecuada si es necesario y en primer lugar debe hacerse que el diluyente líquido se vuelva isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas disoluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. Los medios acuosos estériles empleados están todos ellos fácilmente disponibles mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica.
Las composiciones de esta invención pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como disoluciones líquidas (por ejemplo, disoluciones inyectables y que pueden administrarse por infusión), dispersiones o suspensiones. La forma preferida depende del modo de administración previsto y de la aplicación terapéutica. Algunas composiciones están en forma de disoluciones inyectables o que pueden administrarse por infusión. Un modo de administración es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En una realización, el compuesto se administra mediante inyección o infusión intravenosa. En otra realización, el compuesto se administra mediante inyección intramuscular o subcutánea.
Las composiciones dadas a conocer en el presente documento, para su uso en terapia, pueden administrarse de diversas maneras, incluyendo en forma soluble mediante inyección en bolo, infusión continua, liberación sostenida a partir de implantes, ingestión oral, inyección local (por ejemplo intracardiaca, intramuscular), inyección sistémica u otras técnicas adecuadas bien conocidas en las técnicas farmacéuticas. Otros métodos de administración farmacéutica incluyen, pero no se limitan a, métodos de administración oral, subcutánea, transdérmica, intravenosa, intramuscular y parenteral. Normalmente, una composición soluble comprenderá un compuesto purificado junto con portadores, excipientes o diluyentes fisiológicamente aceptables. Tales portadores serán no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas. La preparación de tales composiciones puede conllevar combinar un compuesto con tampones, antioxidantes, hidratos de carbono incluyendo glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, glutatión y otros estabilizadores y excipientes. Solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina sérica conespecífica son diluyentes apropiados a modo de ejemplo. El producto puede formularse como liofilizado usando disoluciones de excipientes apropiadas (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes.
Otros derivados comprenden los compuestos/composiciones de esta invención unidos de manera covalente a un polímero no proteico. La unión al polímero se lleva a cabo generalmente de modo que no interfiere con la actividad biológica preferida del compuesto, por ejemplo la actividad de unión del compuesto a una diana. El polímero no proteico es habitualmente un polímero sintético hidrófilo, es decir, un polímero no encontrado de otro modo en la naturaleza. Sin embargo, polímeros que existen en la naturaleza y se producen mediante métodos recombinantes o in vitro son útiles, al igual que polímeros que se aíslan a partir de la naturaleza. Los polímeros de polivinilo hidrófilos se encuentran dentro del alcance de esta invención, por ejemplo poli(alcohol vinílico) y polivinilpirrolidona. Son particularmente útiles los poli(éteres de alquileno) tales como polietilenglicol, polipropilenglicol, ésteres de polioxietileno o metoxi-polietilenglicol; polioxialquilenos tales como polioxietileno, polioxipropileno y copolímeros de bloque de polioxietileno y polioxipropileno (Pluronics); polimetacrilatos; carbómeros; polisacáridos ramificados o no ramificados que comprenden los monómeros de sacárido D-manosa, D y L-galactosa, fucosa, fructosa, D-xilosa, L-arabinosa, D-ácido glucurónico, ácido siálico, D-ácido galacturónico, D-ácido manurónico (por ejemplo poli(ácido manurónico), o ácido algínico), D-glucosamina, D-galactosamina, D-glucosa y ácido neuramínico incluyendo homopolisacáridos y heteropolisacáridos tales como lactosa, amilopectina, almidón, hidroxietilalmidón, amilosa, sulfato de dextrano, dextrano, dextrinas, glicógeno, o la subunidad de polisacárido de mucopolisacáridos ácidos, por ejemplo ácido hialurónico; polímeros de alcoholes de azúcar tales como polisorbitol y polimanitol; así como heparina o Heparon.
Las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en el presente documento pueden incluir una “cantidad terapéuticamente eficaz” o una “cantidad profilácticamente eficaz” de un compuesto de la invención. Una “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto puede variar según factores tales como el estado patológico, edad, sexo y peso del individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del compuesto queda compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una “cantidad profilácticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Normalmente, dado que una dosis profiláctica se usa en sujetos antes, o en un estadio temprano, de una enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
Las variantes dadas a conocer en el presente documento incluyen todas las combinaciones de los diversos elementos dados a conocer en el presente documento.
Esta invención se entenderá mejor mediante referencia a los siguientes detalles experimentales, pero los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que los experimentos específicos detallados sólo son ilustrativos de la invención tal como se describe más completamente en las reivindicaciones que siguen más adelante.
Detalles experimentales
Los ejemplos 1 a 3, 5 a 6 , 8 y 10 son ejemplos comparativos.
EJEMPLO 1: TNR1B-alquino-azida-Fc6
Se preparó TNR1B-alquino-azida-Fc6 mediante la reacción de TNR1B modificado con alquino (receptor de TNF 1B) con Fc6 modificado con azida de la siguiente manera. Se prepara TNR1B-azida-alquino-Fc6 usando los mismos principios mediante la reacción de TNR1B modificado con azida con Fc6 modificado con alquino.
Se preparó TNFR1B modificado con alquino (TNR1B-Alk) mediante escisión de TNR1B-inteína (proteína de fusión de TNRlB-Mth) con cistil-propargilamida, HSc H2CH[NH2]CONHCH2CeCH3 (figura 1 ) y se preparó TNR1 B modificado con azida (TNR1B-Az) mediante escisión de TNR1B-inteína con cistil-3-azidopropilamida, HSCH2CH[NH2]CONH(CH2)3NH2.
TNR1B-inteína y Fc6 se describen en el documento estadounidense con n.° de serie 11/982085, publicado el 16 de octubre de 2008, la totalidad del cual se incorpora en el presente documento como referencia.
Se produjo proteína de fusión de TNR1B-inteína usando vector pCDNA3-TNR1B-Mth, cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO: 100. El polipéptido quimérico pre-TNR1B-inteína que se expresa inicialmente, que contiene el dominio extracelular de TNR1B unido en su extremo C-terminal mediante un enlace peptídico al extremo N-terminal de una intenína de autoempalme Mth RIR1 en el sitio de autoescisión, se muestra en SEQ ID NO: 101. La escisión de las secuencias señal de TNR homólogo mediante la señal peptidasa celular proporciona la proteína de fusión de TNR1B-inteína madura que se secreta al líquido de cultivo celular, cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO: 102.
Se expresó la proteína Fc6 usando vector pCDNA3-SHH-IgG1-Fc11, cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO: 103. El polipéptido pre-Fc6 que se expresa inicialmente se muestra en SEQ ID NO: 104. La escisión de las secuencias señal de sonic hedgehog (SHH) heterólogo mediante la señal peptidasa celular proporciona la proteína Fc6 madura que se secreta al líquido de cultivo celular, cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO: 105.
Se llevó a cabo la producción de proteína mediante expresión transitoria en células CHO-DG44, adaptadas a cultivo en suspensión libre de suero. Se realizaron transfecciones transitorias con polietilenimina como agente de transfección, complejada con ADN, en condiciones de alta densidad tal como se describe por Rajendra et al., J. Biotechnol. 153, 22-26 (2011). Se mantuvieron cultivos de tren de semillas en 50 tubos de biorreactor TubeSpin® obtenidos de TPP (Trasadingen, CH) y se ampliaron a escala en cuanto al volumen para generar una biomasa suficiente para su transfección. Se llevaron a cabo transfecciones en cultivos de 0,5-1,0 l. Se mantuvieron cultivos a esta escala en botellas de Schott de 2 l o 5 l con un tapón ventilado. Se agitaron las botellas a 180 rpm en un agitador incubador de Kühner con humidificación y control de CO2 al 5%. Se recogió el líquido de cultivo celular después de 10 días, se centrifugó y se esterilizó por filtración, antes de la purificación.
Se prepararon cistil-propargilamida y cistil-3-azidopropilamida de la siguiente manera. Boc-Cys(Trt)-OH, (C6H5)3CSCH2CH[NHCO2C(CH3)3]CO2H; propargilamina, HCECCH2NH; 3-azidopropilamina, NH2CH2CH2CH2N3; EDC, clorhidrato de A/-(3-dimetilaminopropil)-W’-etilcarbodiimida; y HOBt, 1-hidroxibenzotriazol, y se obtuvieron a partir de AnaSpec (Freemont, CA) o CPC Scientific (San Jose, CA). Todos los demás productos químicos se obtuvieron a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Para la síntesis de cistil-propargilamida, se preparó una disolución de Boc-Cys(Trt)-OH (100 mM) y propargilamina (100 mM) en CH2Ch a 100 mM en cada uno de EDC, HOBt y trietilamina. Para la síntesis de cistil-3-azidopropilamida, se sustituyó propargilamina por 3-azidopropilamina (100 mM). Se sometieron ambas reacciones a tratamiento final mediante el siguiente procedimiento. Después de agitar durante la noche a temperatura ambiente, se detuvo la reacción con un exceso de NaHCO3 saturado en agua, se extrajo con CH2Cl2, se secó sobre MgSO4, se filtró, se evaporó y se purificó mediante cromatografía en columna. Para retirar los grupos protectores Boc/Trt, se disolvió el producto intermedio a una concentración de 0,05 M en TFA/triisopropilsilano/H2O (90:5:5) y se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después se secó la reacción mediante evaporación y se extrajo con CH2O 2. Después se extrajo la fase orgánica con agua, proporcionando el producto de cistil-propargilamida final como un aceite amarillento y el producto de cistil-3-azidopropilamida final como un sólido amarillento.
Para preparar el TNR1B modificado con alquino (figura 1) o el TNR1B modificado con azida, se aplicó la proteína TNRIB-inteína en el líquido de cultivo celular a una columna empaquetada con perlas de quitina obtenida de New England BioLabs (Beverley, MA) que se equilibró previamente con tampón A (Tris-HCl 20 mM, NaCl 500 mM, pH 7,5). Se lavó la proteína no unida de la columna con tampón A. Se inició la escisión equilibrando rápidamente la resina de quitina en tampón B (Tris-HCl 20 mM, NaCl 500 mM, pH 8,0) que contenía o bien cistil-propargilamida 50 mM (para TNR1B modificado con alquino) o bien cistil-3-azidopropilamida 50 mM (para TNR1B modificado con azida) y se llevó a cabo la incubación durante de 24 a 96 horas a temperatura ambiente. Se eluyeron las proteínas TNR1B modificado con alquino (SEQ ID NO: 106) o TNR1B modificado con azida (SEQ ID NO: 107) escindidas de la columna con tampón A, se concentraron usando una unidad de filtro de centrífuga Amicon Ultracel-3 de Millipore (Billerica, MA), se dializaron frente a solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin sales de Ca o Mg (PBS) obtenida de la UCSF Cell Culture Facility (San Francisco, CA) y se almacenaron a 4°C antes de su uso.
La figura 2 muestra el análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) del TNR1B modificado con alquino, en comparación con TNR1B modificado con cisteína (SEQ ID NO: 108) preparado usando cisteína 50 mM en lugar de cistil-propargilamida. Se llevó a cabo SDS-PAGE usando geles NuPAGE® Novex Bis-Tris Midi (al 10%) obtenidos de Invitrogen (Carlsbad, CA). Se visualizaron las proteínas usando Silver Stain Plus o Bio-Safe Coomassie Stain obtenidos de Bio-Rad (Hercules, CA). El TNR1B modificado con alquino (carril 3) y el TNR1B modificado con cisteína (carril 1) tenían el mismo Mr -43.000. Además, el TNR1B modificado con alquino tenía una actividad biológica comparable al TNR1B modificado con cisteína tal como se mide usando un ensayo ELISA Human sTNFRII/TNFRSF1B Quantikine obtenido de R&D Systems (Minneapolis, MN). Preparaciones del t Nr 1B modificado con cisteína (carril 2), TNR1B modificado con alquino (carril 4) o TNR1B modificado con tioéster (SEQ ID NO: 109) (carril 5) realizadas en presencia de MESNA 50 mM tenían Mr similares, pero tenían menos del 5% de la actividad biológica observada para preparaciones realizadas en ausencia de MESNA. Por tanto, se empleó TNR1B modificado con alquino preparado en ausencia de MESNA en estudios adicionales.
Se preparó Fc6 modificado con azida (Az-Fc6 ) mediante la reacción de proteína Fc6 con diversos tioésteres de péptidos que contenían azida (figura 3) y tioésteres de PEG que contenían azida (figura 4). Se preparó Fc6 modificado con alquino (Alk-Fc6 ) mediante la reacción de tioésteres que contenían alquino con proteína Fc6.
Se expresó proteína Fc6 recombinante en células de ovario de hámster chino (CHO) tal como se describe para TNR1B-inteína (véase anteriormente) y se purificó mediante cromatografía de afinidad por proteína A. Se aplicó el sobrenadante de cultivo a una columna empaquetada con rProtein A Fast Flow de Pharmacia (Uppsala, Suecia) previamente equilibrada con PBS. Se lavó la columna extensamente con PBS y después se eluyó la proteína Fc6 con tampón de glicina 0,1 M pH 2,7. Se recogieron las fracciones en tubos que contenían 0,05 vol/vol de Tris-HCl 1,0 M pH 9,0 (dando un pH final de 7,5), se combinaron, se dializaron frente a PBS y se almacenaron a 4°C antes de su uso.
La tabla 1 muestra tioésteres de péptidos/PEG que contienen azida y que contienen alquino representativos. Se sintetizaron los tioésteres mediante una estrategia en fase sólida de Fmoc/t-Butilo en una resina de cloruro de 2-clorotritilo previamente cargada con Fmoc-Thr(tBu)-OH. Se obtuvieron derivados de aminoácido de CPC Scientific (Sunnyvale, CA), se obtuvieron derivados de Fmoc-PEGn-OH de Quanta BioDesign (Powell, OH), y se obtuvieron hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilaminio (HBTU), diclorometano (DCM), ácido tricloroacético (TFA), N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC), 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), N,N'-diisopropiletilamina (DIEA) y triisopropilsilano (TIS) de Sigma (St. Louis, MO). Se empleó la activación de HBTU convencional para la elongación de péptidos. Los péptidos que contenían PEG requirieron la inserción de Fmoc-PEGn-OH. Como etapa final en la elongación de péptidos, se convirtió el grupo protector a-Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo) terminal en Boc (terc-butoxicarbonilo). Se lavó la resina peptídica con DCM y se escindió con TFA al 1%/DCM para producir el péptido totalmente protegido con un ácido carboxílico libre en el extremo C-terminal. Se formó el tioéster de los péptidos tratando el péptido protegido en bruto con DIC/HOBt/DIEA y bencil-mercaptano o tiofenol en DCM durante la noche. Después de la concentración, se precipitó el tioéster de péptido protegido en bruto mediante múltiples trituraciones con éter frío seguido por centrifugación. Se llevó a cabo la desprotección mediante tratamiento del producto protegido en bruto con 95:2,5:2,5 de TFA/TIS/H2O durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de la precipitación con éter helado se purificó el tioéster de péptido desprotegido mediante RP-HPLC preparativa en un sistema de H2O-acetonitrilo (TFA al 0,1%) para proporcionar el producto final con una pureza del 91-95% y el EM deseado.
Se prepararon Fc6 modificado con azida y Fc6 modificado con alquino mediante ligación química nativa de la siguiente manera. Se obtuvo ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) de Acros (Morris Plains, NJ), se obtuvo tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) de Pierce (Rockford, IL) y se obtuvo ácido 4-mercaptofenilacético (MPAA) de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Se llevaron a cabo reacciones mediante ligación de los diversos tioésteres mostrados en la tabla 1 con la proteína Fc6 de la siguiente manera. Las reacciones (100 ul) contenían tampón MES 50 mM, pH 6,5, TCEP 0,8 mM, MPAA 10 mM, 4 mg/ml del tioéster de péptido y 0,5 mg/ml de la proteína Fc6. Tras la incubación durante la noche a temperatura ambiente, se ajustaron las reacciones a pH 7,0 con 0,05 vol/vol de Tris-HCl 1,0 M pH 9,0, se purificaron usando perlas magnéticas de proteína A de New England BioLabs, se dializaron en fosfato 0,1 M pH 8,0, y se concentraron.
La figura 5 muestra el análisis mediante SDS-PAGE que demuestra que la proteína Fc6 (carril 1) reaccionó de manera cuantitativa con azida-DKTHT-tioéster para producir la proteína Az-DKTHT-Fc6 (carril 2) y azida-PEG4-DKTHT-tioéster para producir la proteína Az-PEG4-DKTHT-Fc6 (carril 3). La secuencia de la proteína Az-DKTHT-Fc6 se muestra en SEQ ID NO: 110 y la secuencia de la Az-PEG4-DKTHT-Fc6 se muestra en SEQ ID NO: 111. El oligómero PEG4 proporcionó un aumento de tamaño incremental comparable a la secuencia de 5 aminoácidos DKTHTD. Esto muestra que una única unidad de monómero de oxietileno realiza una contribución a la longitud de contorno similar a un único residuo de aminoácido, de manera compatible con el hecho de que tienen conformaciones totalmente extendidas comparables de ~3,5 a 4Á (Flory (1969) Statistical Mechanics of Chain Molecules (Interscience Publishers, Nueva York).
Se preparó TNR1B-alquino-azida-Fc6 mediante la reacción del TNR1B modificado con alquino con la proteína Az-DKTh T-Fc6 (figura 6) y la proteína Az-PEG4-DKTHT-Fc6 (figura 7). Se obtuvieron fosfato de sodio dibásico (anhidro) y fosfato de sodio monobásico (monohidratado) de Acros, TCEP era de Pierce, CuSO4 (pentahidratado) era de Sigma-Aldrich, y Tris[1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina (TBTA) de AnaSpec (Freemont, CA). Las reacciones (60 ul) contenían fosfato de sodio 0,1 M, pH 8,0, CuSO41,0 mM, TBTA 2,0 mM, el TNR1B modificado con alquino (30 ug) y la proteína Fc6 sin modificar, la proteína Az-DKTHT-Fc6 o la proteína Az-PEG4-DKTHT-Fc6 (10 ug). Se iniciaron las reacciones mediante la adición de TCEP 2,0 mM y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente. Se purificaron los productos de reacción usando perlas magnéticas de proteína A para retirar cualquier TNR1B modificado con alquino sin reaccionar.
La figura 8 muestra el análisis mediante SDS-PAGE de los productos de TNR1B-alquino-azida-Fc6 en condiciones reductoras. En ausencia de CuSO4, TBTA y TCEP, tanto Az-DKTHT-Fc6 (carril 2) como Az-PEG4-DKTHT-Fc6 (carril 5) dieron una única banda de Mr ~ 28-30.000 Dalton (flecha d) correspondiente a las proteínas de Fc6 modificado con azida de entrada, sin ningún signo de formación de producto. Además, no hubo ninguna evidencia de ninguna transferencia del TNR1B modificado con alquino de entrada (mostrado en el carril 1) tras la purificación con proteína A. Sin embargo, en presencia de CuSO4, TBTa y TCEP, la reacción entre TNR1B modificado con alquino y Az-DKTHT-Fc6 (carril 3) y la reacción entre TNR1B modificado con alquino y Az-PEG4-DKTHT-Fc6 (carril 6) produjeron ambas dos nuevos productos de Mr ~75.000 Dalton (flecha a) y ~65.000 Dalton (flecha b). Las reacciones llevadas a cabo usando una preparación de TNR1B modificado con alquino tras el intercambio de tampón en fosfato 0,1 M pH 8,0 para retirar sal dieron productos de reacción esencialmente similares tanto con Az-DKTHT-Fc6 (carril 4) como con Az-PEG4-DKTHT-Fc6 (carril 6), aunque hubo un aumento significativo en el rendimiento del producto de Mr ~75.000 Dalton con respecto al producto de Mr ~65.000 Dalton.
La figura 9 muestra el análisis mediante SDS-PAGE que compara los productos de reacción de TNR1B-alquino-azida-Fc6 (panel izquierdo) y los productos de reacción de TNR1B-alquino-azida-PEG4-Fc6 (panel derecho) con proteína de fusión TNR1B-Fc (etanercept). El producto TNR1B-alquino-azida-Fc6 de Mr ~75.000 Dalton (carril 2), que tenía la secuencia predicha mostrada en SEQ ID NO: 112, y el producto TNR1B-alquino-azida-PEG4-Fc6 de Mr ~75.000 Dalton (carril 4), que tenía la secuencia predicha mostrada en SEQ ID NO: 113, son esencialmente indistinguibles en cuanto al tamaño con respecto a etanercept (carriles 1, 3), cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO: 114.
La figura 10 muestra el análisis mediante SDS-PAGE que proporciona evidencias adicionales que confirman el requisito de los grupos alquino y azida para la reactividad. Las mezclas de reacción que contenían TNR1B modificado con alquino con proteína de Fc6 sin modificar no dieron ningún producto de reacción (carril 2) en comparación con Fc6 solo (carril 1), mientras que TNR1B modificado con alquino con Az-DKTHT-Fc6 dio los productos esperados (carril 4) en comparación con Az-DKTHT-Fc6 solo (carril 3). De nuevo, ninguna transferencia del TNR1B modificado con alquino de entrada (mostrado en el carril 5) resultó evidente tras la purificación con proteína A.
Los productos de TNR1B-alquino-azida-Fc6 de la figura 10 se caracterizaron adicionalmente mediante secuenciación de su péptido tríptico mediante CL-EM. Tras la SDS-PAGE, se tiñó el gel con Coomassie y se escindieron cuatro regiones de gel, correspondientes al producto de Mr ~75.000 (flecha a), al producto de Mr ~65.000 (flecha b), la región sin teñir en la que migraba TNR1B modificado con alquino (flecha c), y la proteína Az-DKTHT-Fc6 sin reaccionar de Mr ~28.000 (flecha d). Se cortaron las cuatro secciones de gel para dar pequeños fragmentos (~0,5-1,0 mm3) y se procesaron de la siguiente manera. Se obtuvieron bicarbonato de amonio, acetonitrilo, ditiotreitol y yodoacetamida de Sigma-Aldrich, se obtuvo ácido fórmico de Pierce, y se obtuvo tripsina porcina (calidad para secuenciación) de Promega (Madison, WI). Para retirar el tinte de Coomassie, se extrajo cada sección de gel con 200 ul de NH4HCO325 mM en acetonitrilo al 50% mediante agitación en vórtex, se centrifugó para retirar el sobrenadante y se deshidrató añadiendo acetonitrilo durante unos pocos minutos hasta que los fragmentos de gel se contrajeron y se volvieron blancos. Se descartó el acetonitrilo y se secaron las secciones de gel en un dispositivo Speed Vac (Savant Instruments, Farmingdale, NY). Después se llevaron a cabo la reducción y alquilación rehidratando las secciones de gel en 40 ul de ditiotreitol 10 mM en NH4HCO325 mM, se agitaron en vórtex y se incubaron a 56°C durante 45 minutos. Después se descartó el sobrenadante, se añadieron 40 ul de yodoacetamida 55 mM en NH4HCO325 mM, se agitaron las secciones de gel en vórtex y se incubaron en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se descartó el sobrenadante, se deshidrataron de nuevo las secciones de gel en acetonitrilo y se secaron en un dispositivo Speed Vac. Después se llevó a cabo la digestión con tripsina rehidratando las secciones de gel en 25 ul de tripsina (12,5 ug/ml) en NH4HCO325 mM sobre hielo durante 60 minutos. Después se retiró la disolución de tripsina en exceso, se cubrieron las secciones de gel con NH4HCO325 mM y se incubaron a 37°C durante la noche. Se retiró el sobrenadante y después se extrajo el gel dos veces con 30 ul de acetonitrilo al 50%/ácido fórmico al 0,1% en agua. Se combinaron los extractos orgánicos con el sobrenadante acuoso, se redujeron hasta un volumen de 10 ul en un dispositivo Speed Vac, después se analizaron mediante CL-EM usando un espectrómetro de masas Q-Star Elite (AB SCIEX, Foster City, CA).
La figura 11 resume la caracterización de la estructura del producto de reacción de TNR1B-alquino-azida-Fc6 mediante espectrometría de masas. El producto de Mr -75.000, tal como se esperaba para el producto de TNR1B-alquinoazida-Fc6 de longitud completa, contenía péptidos de las proteínas originales tanto TNR1B modificado con alquino como Fc6 modificado con azida. Además, la cobertura de péptido de la secuencia de TNR1B modificado con alquino (panel superior) se extendió desde la región N-terminal (EYYDQTAQMCCSK) hasta la región C-terminal (SMAPGAVHLPQPVST). De manera similar, la cobertura de péptido de la secuencia de proteína de Fc6 modificado con azida (panel inferior) se extendió desde la región N-terminal (DTLMISR) hasta la región C-terminal (TTPPPVLDSDGSFFLYSK). En cambio, Mr -65.000 carecía del péptido EYYDQTAQMCCSK, lo que sugiere que era una versión delecionada en el extremo N-terminal del producto TNR1B-alquino-azida-Fc6 de longitud completa esperado. No se detectaron secuencias derivadas de la proteína TNR1B en la región sin teñir de Mr -43.000 en la que migraría normalmente el TNR1B modificado con alquino (flecha c), mientras que sólo se detectaron secuencias derivadas de la proteína Fc6 en la proteína Az-DKTHT-Fc6 sin reaccionar de Mr -28.000 (flecha d).
Se caracterizaron adicionalmente los productos TNR1B-alquino-azida-Fc6 y TNR1 B-alquino-azida-PEG4-Fc6 de la figura 10 para determinar su actividad biológica midiendo su capacidad para unirse a TNF-a usando resonancia de plasmón superficial (SPR). Se obtuvo proteína TNF-a humana recombinante (libre de portador) de R&D Systems y se reconstituyó en PBS. Se llevaron a cabo estudios de SPR usando un instrumento Biacore T100 de Biacore AB (Uppsala, Suecia). Se inmovilizaron los ligandos unidos a superficie, TNR1B-alquino-azida-Fc6 y TNR1B-alquinoazida-PEG4-Fc6 , sobre un chip sensor CM5, serie S, usando un kit de acoplamiento de amina (BR-1000-50) obtenido de GE Healthcare (Piscataway, NJ) según las instrucciones del fabricante. Se llevó a cabo la unión de TNF-a a 25°C en tampón Hepes 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, y Tween-20 al 0,005%. Se evaluó la unión por duplicado a concentraciones de TNF-a de 0,156 nM, 0,312 nM, 0,625 nM, 1,25 nM, 2,5 nM, 5,0 nM, 10,0 nM, 20,0 nM y 40 nM. Se evaluaron los datos usando el software de evaluación Biacore T100, versión 2.0.3.
La figura 12 muestra las curvas de unión cinética para TNR1B-alquino-azida-Fc6 (panel izquierdo) y TNR1B-alquinoazida-PEG4-Fc6 (panel derecho). Ambos productos mostraron unión a TNF-a saturable, y se obtuvo un ajuste excelente empleando un modelo biexponencial (Chi2 -0,05). La tabla 2 resume los datos de unión cinética. Aproximadamente el 40% de los sitios de unión para cada producto tenían una afinidad superior, con una constante de disociación 1,6 veces mayor para TNR1 B-alquino-azida-PEG4-Fc6 (Kd = 1,86x10'1° M) que para TNR1B-alquinoazida-Fc6 (Kd = 2,99x10'1° M). El 60% restante de los sitios de unión tenían afinidad inferior, siendo las constantes de disociación aproximadamente iguales para TNR1 B-alquino-azida-PEG4-Fc6 (Kd = 5,12x10'9 M) y TNR1B-alquinoazida-Fc6 (Kd = 5,17x10'9 M). La asociación del grupo de unión PEG4 con unión de alta afinidad aumentada, pero igual unión de baja afinidad, proporciona evidencias convincentes de un grado superior de unión colaborativa (con dos manos) de TNF-a mediante TNR1 B-alquino-azida-PEG4-Fc6 en comparación con TNR1B-alquino-azida-Fc6.
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EJEMPLO 2: Fab'-alquino-azida-Fc6
Se preparó Fab'-alquino-azida-Fc6 mediante la reacción de Fab' modificado con cicloalquino con Fc6 modificado con azida de la siguiente manera.
Se obtuvo adalimumab (Humira) como formulación líquida (50 mg/ml) de Abbott (Abbott Park, IL). Se preparó el fragmento Fab' usando proteasa IdeS para generar en primer lugar fragmento Fab'2 seguido por reducción selectiva de los disulfuros entre cadenas con 2-mercaptoetilamina (figura 13). Se sometió el anticuerpo (10 mg) a intercambio en tampón de escisión (fosfato de sodio 50 mM, NaCl 150 mM, pH 6 ,6 ) usando una unidad de diálisis Slide-A-Lyzer Mini, MWCO de 10 K de Pierce (Rockford, IL), después se incubó con IdeS recombinante marcado con etiqueta de his inmovilizado sobre perlas de agarosa (columna FragIT MidiSpin) de Genovis (Lund, Suecia) durante 1 hora a temperatura ambiente con mezclado constante. Se retiraron las perlas de la disolución de digestión mediante centrifugación, se lavaron dos veces con tampón de escisión y después se combinaron las disoluciones de digestión y de lavado y se aplicaron a una columna de proteína A HiTrap HP de GE Life Sciences (Piscataway, NJ) para retirar el fragmento Fc' y anticuerpo sin digerir. Se redujeron fracciones de flujo a través que contenían el fragmento Fab'2 para dar el fragmento Fab' añadiendo alícuotas de 1 ml a un vial que contenía 6 mg de 2-mercaptoetilamina (MEA) de Pierce. Se llevaron a cabo reducciones con EDTA 10 mM para minimizar la reoxidación de los disulfuros entre cadenas. Tras la incubación a 37°C durante 110 min, se retiró el MEA en exceso mediante intercambio de tampón en PBS que contenía EDTA 10 mM usando una columna de desalación PD-10 de GE Life Sciences (Piscataway, NJ). Se concentró el eluato que contenía el fragmento Fab' usando una unidad de filtro de centrífuga Amicon Ultracel-3 de Millipore (Billerica, MA).
La figura 14 muestra el análisis mediante SDS-PAGE de adalimumab tras la escisión con IdeS (panel A), seguido por cromatografía de proteína A y reducción leve con MEA (panel B). En presencia de un fuerte agente reductor (ditiotreitol) en el gel de poliacrilamida, el anticuerpo completo (carril 1) migró como una cadena pesada de Mr -55.000 (flecha a) y una cadena ligera de Mr -25.000 (flecha d). IdeS escindió la cadena pesada (carril 2) para dar un fragmento C-terminal de Mr -29.000 (flecha b) y un fragmento N-terminal de Mr -26.000 (flecha c). La cadena ligera y el fragmento de cadena pesada N-terminal comprenden el dominio Fab'2, mientras que el fragmento de cadena pesada C-terminal comprende el dominio Fc'. La columna de proteína A retiró eficazmente el dominio Fc' a partir del dominio Fab' (compárense el carril 2 con los carriles 5 y 6 ). En condiciones no reductoras, el dominio Fab'2 migró como una única especie de Mr -110.000 (carril 3), mientras que el dominio Fab' produjo una leve reducción con MEA que migró como una única especie de Mr -55.000 (carril 4). En condiciones reductoras, el dominio Fab'2 (carril 5) y el dominio Fab' (carril 6 ) proporcionaron ambos la misma cadena ligera (flecha d) y fragmento de cadena pesada N-terminal (flecha c), tal como se esperaba. Por tanto, el dominio Fab' obtenido mediante este procedimiento estaba esencialmente libre de los dominios Fab'2 y Fc'.
Se preparó Fab' modificado con cicloalquino a partir del dominio Fab' de adalimumab usando un grupo de unión bifuncional, DIBAC-PEG-i2-Lys(Mal), que contiene un grupo maleimida que puede reaccionar con los grupos tiol libres en el fragmento Fab' (figura 15). Se preparó DIBAC-PEG-i2-Lys(Mal) usando una estrategia de síntesis en fase sólida de Fmoc. Se obtuvieron resina Lys(Mtt)-Wang y 3-maleimidopropanoato de succinimido (Mpa-OSu) de CPC Scientific (Sunnyvale, CA), se obtuvo Fmoc-A/-amido-dPEG12-ácido de Quanta BioDesign (Powell, OH), y se sintetizó ácido 5-(11,12-dideshidrodibenzo[6,f]azocin-5(6H)-il)-5-oxopentanoico, un aza-dibenzociclooctino funcionalizado con ácido (DIBAC-ácido), tal como se describe por Debets, M. F. et al., Chem. Commun. 46, 97-99 (2010). Se hicieron reaccionar Fmoc-W-amido-dPEG12-ácido y DIBAC-ácido de manera secuencial con resina Lys(Mtt)-Wang para obtener resina DIBAC-PEG-i2-Lys(Mtt)-Wang, después se trataron con TFA/DCM/TIS (1:96:3) para retirar el grupo Mtt. Se hizo reaccionar la resina desprotegida con Mpa-OSu en el grupo amino libre en la cadena lateral de lisina para obtener resina DIBAC-PEG-i2-Lys(Mpa)-Wang. Tras la escisión con TFA/agua (95:5), se purificó el producto bruto mediante RP-HPLC preparativa para producir el producto DIBAC-PEG-i2-Lys(Mal) (DPk M) con una pureza del 93% y los espectros de EM deseados.
La figura 16 muestra la modificación química de fragmento Fab' de adalimumab con el grupo de unión DIBAC-PEG12-Lys(Mal) y la purificación del Fab' modificado con cicloalquino resultante. Para la purificación, se llevaron a cabo reacciones (0,535 ml) en fosfato de sodio 0,1 M a pH 7,0 y pH 7,4, que contenían cada una 5 mg de fragmento Fab' y 10 mg de DIBAC-PEG-i2-Lys(Mal). Después de una incubación de 30 horas a temperatura ambiente, se combinaron las dos reacciones y se sometieron a intercambio de tampón en acetato de sodio 20 mM, NaCl 20 mM, pH 5,5 usando una columna PD-10. Se aplicó el eluato (3,5 ml) a una columna de intercambio catiónico HiTrap SP HP de GE Life Sciences que retenía la totalidad de Fab' sin modificar y Fab'2 residual. Se combinaron las fracciones de flujo a través (5,5 ml) que contenían el Fab' modificado con cicloalquino purificado (figura 16b), se ajustaron a pH 7,0 con 10x PBS (0,55 ml), y se concentraron mediante cromatografía de afinidad en una columna de proteína L (Capto L) de GE Life Sciences. Se eluyó el Fab' modificado con cicloalquino a partir de la columna de proteína L con glicinaHCl 0,1 M pH 2,7 (2,4 ml), se neutralizó con 1/20 volumen de Tris HCl 1,0 M pH 9,0, se sometió a intercambio de tampón en PBS usando una columna PD-10 (3,5 ml) y se concentró usando una unidad de filtro de centrífuga Amicon Ultracel-3 hasta un volumen final de 70 ul a una concentración de 9,5 mg/ml.
Se usaron diversas proteínas de Fc6 modificado con azida con grupos de unión de PEG de diferentes longitudes en la preparación del Fab' de adalimumab-cicloalquino-azida-Fc6. Se prepararon Az-DKTHT-Fc6 (figura 3) y derivados de Az-DKTHT-PEGx-Fc6 con x = 12, 24 y 36 (figura 4) en reacciones (2 ml) que contenían MES 50 mM pH 6,5, TCEP 0,8 mM, MPAA 10 mM, 5 mg/ml de cada uno de los cuatro Az-DKTHT-PEGx-tioésteres, y 2,36 mg/ml de proteína Fc6. Después de 20 horas a temperatura ambiente, se neutralizaron las reacciones con 100 ul de Tris HCl pH 9,0, se aclararon mediante centrifugación a 12.000xg, y se aplicaron a una columna de proteína A HiTrap HP de 1 ml. Se lavaron las columnas con 12 vol de PBS, después se eluyeron las proteínas de Fc6 modificado con azida con glicinaHCl 0,1 M pH 2,7 (2,0 ml), se neutralizaron con 1/20 volumen de Tris HCl 1,0 M pH 9,0, se dializaron frente a tres cambios de PBS durante 12 horas cada uno usando una unidad de diálisis Slide-A-Lyzer Mini, MWCO de 10 K, y se concentraron usando unidades de filtro de centrífuga Amicon Ultracel-3.
La figura 17 muestra el análisis mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras de las proteínas Fc6 (carril 1), Az-DKTHT-Fc6 (carril 2), Az-DKTHT-PEG-i2-Fc6 (carril 3), Az-DKTHT-PEG24-Fc6 (carril 4), y Az-DKTHT-PEGs6-Fc6 (carril 5) mediante SDS-PAGE. La proteína Fc6 reaccionó de manera cuantitativa (> 90%) con los cuatro tioésteres, proporcionando una escalera de productos de tamaño creciente.
La figura 18 muestra el análisis mediante cromatografía de exclusión molecular (SEC) para confirmar que los cuatro productos de proteína de Fc6 modificado con azida tenían la misma estructura dimérica que la molécula de Fc6 original. Se llevó a cabo SEC usando un sistema Prominence HPLC (Shimadzu Corp, Kioto, Japón). Se obtuvieron columnas TSKgel Super SW3000 (columna de 4,6 mm x 30 cm, precolumna de 4,6 mm x 5 cm) de TOSOH Bioscience (Tokio, Japón). La fase móvil, velocidad de flujo, temperatura de columna y longitud de onda de detección usadas fueron fosfato de sodio 50 mM, NaCl 300 mM, pH 7,4, 0,35 ml/min, 30°C y 280 nm, respectivamente. Los cuatro productos de proteína de Fc6 modificado con azida presentaron un tiempo de retención que disminuyó a medida que aumentó el tamaño de grupo de unión de PEG, confirmando su estructura de dímero. Los cuatro productos también dieron esencialmente un único pico, demostrando una estructura de dos manos en la que ambos extremos N-terminales del dímero de Fc6 original se modificaron mediante el grupo de unión de PEG que se confirmó mediante análisis mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras (véase a continuación).
Se hizo reaccionar el Fab' modificado con ciclooctino con las cuatro moléculas de Fc6 modificado con azida (figura 19), proporcionando una familia de estructuras de Fab'-PEGy-cicloalquino-azida-PEGx-Fc6 con brazos de longitud creciente (figura 20). Las longitudes globales de los brazos resultantes eran de Fab'-PEG-i2-Fc6 (para x = 0, y = 12), Fab'-PEG24-Fc6 (para x = 12, y = 12), Fab'-PEG36-Fc6 (para x = 24, y = 12), y Fab'-PEG48-Fc6 (para x = 36, y = 12). Se llevaron a cabo las reacciones (8 ul) en fosfato de sodio 0,1 M pH 7,0 durante la noche a temperatura ambiente con cada una de las cuatro proteínas de Fc6 modificado con azida (2,5 mg/ml) en presencia o ausencia del Fab' modificado con cicloalquino (5 mg/ml).
La figura 21 muestra el análisis mediante SDS-PAGE de la reacción de Fab'-cicloalquino-azida-Fc6 en condiciones reductoras y no reductoras. En ausencia del Fab' modificado con cicloalquino (carriles 5, 7, 9 y 11), las cuatro proteínas de Fc6 modificado con azida dieron una única banda en geles tanto reductores como no reductores, confirmando su estructura de dos manos dimérica. En presencia del Fab' modificado con cicloalquino (carriles 4, 6 , 8 y 10), las cuatro proteínas de Fc6 modificado con azida se consumieron en gran medida en la reacción resultante. En condiciones reductoras, las cuatro reacciones dieron un producto con Mr ~de 57.000 a 62.000 (flecha a). El tamaño del producto Fab'-PEG-i2-Fc6 (carril 4) era aproximadamente 1-2 kD mayor que la cadena pesada de adalimumab silvestre (carril 1), mientras que los tamaños de los productos de Fab'-PEG24-Fc6 (carril 6 ), Fab'-PEG36-Fc6 (carril 8) y Fab'-PEG48-Fc6 (carril 10) aumentaron adicionalmente con la longitud global del grupo de unión de PEG. En condiciones no reductoras, se observaron dos productos, un primer producto de Mr ~ de 155.000 a 160.000 (flecha a), y un segundo de Mr ~ de 110.000 a 115.000 (flecha b). El producto de Fab'-PEG-i2-Fc6 más grande (carril 4) era aproximadamente 5 kD mayor que el anticuerpo completo de adalimumab (carril 1), de manera compatible con el producto de dos manos esperado, mientras que los productos de Fab'-PEG24-Fc6 (carril 6 ), Fab'-PEG36-Fc6 (carril 8) y Fab'-PEG48-Fc6 (carril 10 ) más grandes aumentaron todavía más de tamaño a medida que aumentaba la longitud global del grupo de unión de PEG.
La figura 22 muestra el análisis mediante SEC para confirmar la estructura de dos manos (es decir, dos manos de Fab' unidas a un dominio Fc6 ) del producto de reacción más grande con Mr ~ de 155.000 a 160.000 de las reacciones de Fab'-PEG-i2-Fc6 , Fab'-PEG24-Fc6 , Fab'-PEG36-Fc6 y Fab'-PEG48-Fc6. Los cuatro productos de reacción presentaron un tiempo de retención más corto que el anticuerpo completo de adalimumab que disminuyó adicionalmente a medida que aumentó el tamaño del grupo de unión de PEG, confirmando la estructura de dos manos observada mediante análisis mediante SDS-PAGE.
La actividad biológica de los productos de Fab'-cicloalquino-azida-Fc6 evaluada mediante su capacidad para neutralizar la citotoxicidad mediada por TNF-a en células WEHI murinas tratadas con actinomicina D. La línea celular WEHI-13VAR de ratón (ATCC CRL-2148) se obtuvo a partir de la colección americana de cultivos tipo (Rockville, MD) y se hizo crecer en medios 1640 RPMI de Gibco (RPMI-1640) complementados con suero bovino fetal (FBS) al 10% y penicilina y estreptomicina (10 U/ml), obtenidos de Life Technologies (Grand Island, NY). Se llevaron a cabo ensayos de citotoxicidad de TNF-a de la siguiente manera. Se sembraron células WEHI-13VAR en placas de cultivo celular blancas Nunc de 96 pocillos obtenidas de Thermo Fisher (Waltham, MA) a 2x104 células por pocillo durante la noche y después se trataron con actinomicina D (0,5 |ig/ml) obtenida de Sigma (St Louis, MO) y TNF-a (0,2 ng/ml) en ausencia o presencia de TNFR-IgG u otros inhibidores. Después de 24 h de incubación a 37°C/CO2 al 5%, se determinó la viabilidad celular con sistemas de ensayo de viabilidad celular luminiscentes CellTiter-Glo (Promega, Madison, WI) que miden la cantidad de ATP presente en células metabólicamente activas y la luminiscencia medida usando un luminómetro POLARstar (BMG LABTECH Inc., Cary, NC). Se diluyó cada inhibidor mediante diez diluciones en serie de 3 veces comenzando a 10 |ig/ml y se midieron por duplicado o triplicado. Se calcularon datos de citotoxicidad usando las siguientes ecuaciones: (1 - lectura de luciferasa de muestra / lectura de luciferasa de células tratadas con actinomicina D sola) x 100%, y se presentaron como la media ± desviación estándar. Se usó Enbrel como control positivo de citotoxicidad y Fc6 como control negativo.
La figura 23 muestra la neutralización de la citotoxicidad mediada por TNF-a mediante mezclas de reacción de Fab'-PEGi2-Fc6 , Fab'-PEG24-Fc6 , Fab'-PEG36-Fc6 y Fab'-PEG48-Fc6 en comparación con el Fab' modificado con cicloalquino (basándose en cantidades iguales de Fab' modificado con cicloalquino de entrada). Ambas mezclas de reacción de Fab'-PEGi2-Fc6 y Fab'-PEG24-Fc6 presentaron actividad de neutralización de TNF-a comparable en comparación con la del Fab' modificado con cicloalquino de entrada (panel superior), mientras que las mezclas de reacción de Fab'-PEG36-Fc6 y Fab'-PEG48-Fc6 presentaron un aumento de 1,5 veces y 2,0 veces, respectivamente, en su actividad de neutralización de TNF-a en comparación con el Fab' modificado con cicloalquino de entrada (panel inferior). Dado que la cantidad de producto de dos manos representó únicamente el 10-20% del Fab' modificado con cicloalquino total en cada reacción tal como se estima mediante SDS-PAGE (figura 22), se estima que los productos de dos manos de las reacciones de Fab'-PEG36-Fc6 y Fab'-PEG48-Fc6 son al menos 7,5 veces y 10 veces mayores que el Fab' modificado con cicloalquino de entrada, respectivamente.
EJEMPLO 3: Fab-alquino-azida-Fc6
Se prepara Fab-alquino-azida-Fc6 haciendo reaccionar Fc6 modificado con azida con una proteína de Fab modificado con alquino o modificado con cicloalquino que se produce mediante escisión de una proteína de fusión de Fab-inteína de la siguiente manera. De manera similar, se prepara Fab-azida-alquino-Fc6 haciendo reaccionar Fc6 modificado con alquino o modificado con cicloalquino con una proteína de Fab modificado con azida que se produce mediante escisión de una proteína de fusión de Fab-inteína.
Se produce proteína de fusión de Fab de adalimumab-inteína cotransfectando vector de expresión pFUSE2ss-DE27-VK-CLIg-hk (SEQ ID NO: 115) con pPUSEss-DE27-Vy1-CHIg-hG1-Mth-1 (SEQ ID NO: 116) o pFUSEss-DE27-Vy1 -CHIg-hG1-Mth-2 (SEQ ID NO: 117).
El vector pFUSE2ss-DE27-VK-CLIg-hk dirige la expresión de la cadena ligera pre-kappa de adalimumab mostrada en SEQ ID NO: 118. La escisión de la secuencia señal de IL-2 heteróloga mediante la señal peptidasa celular proporciona la cadena ligera kappa madura de adalimumab mostrada en SEQ ID NO: 119.
El vector pFUSEss-DE27-Vy1-CHIg-hG1-Mth-1 dirige la expresión de un primer tipo de polipéptido quimérico de pre­ cadena pesada-inteína mostrado en SEQ ID NO: 120, en el que los dominios VH y CH1 de cadena pesada de adalimumab están unidos en su extremo C-terminal al extremo N-terminal de una inteína de autoempalme RIR1 en el sitio de autoescisión. La escisión de la secuencia señal de IL-2 heteróloga mediante la señal peptidasa celular proporciona la proteína de fusión de cadena pesada-inteína madura mostrada en SEQ ID NO: 121. En conjunto, las proteínas de s Eq ID NO: 119 y SEQ ID NO: 121 comprenden la proteína de fusión de Fab-1 de adalimumab-inteína que se secreta en el líquido de cultivo celular.
El vector pFUSEss-DE27-Vh1-CHIg-hG1-Mth-2 dirige la expresión de un segundo tipo de polipéptido quimérico de pre-cadena pesada-inteína mostrado en SEQ ID NO: 122, en el que los dominios VH y CH1 de cadena pesada de adalimumab están unidos en su extremo C-terminal al extremo N-terminal de una inteína de autoempalme RIR1 en el sitio de autoescisión. La escisión de la secuencia señal de IL-2 heteróloga mediante la señal peptidasa celular proporciona la proteína de fusión de cadena pesada-inteína madura mostrada en SEQ ID NO: 123. En conjunto, las proteínas de s Eq ID NO: 119 y SEQ ID NO: 123 comprenden la proteína de fusión de Fab-2 de adalimumab-inteína que se secreta en el líquido de cultivo celular.
Se lleva a cabo la producción de proteína mediante expresión transitoria en células CHO-DG44 esencialmente tal como se describe en el ejemplo 1, mediante la cotransfección de SEQ ID NO: 115 con SEQ ID NO: 116 para producir la proteína de fusión de Fab-1 de adalimumab-inteína, y mediante cotransfección de SEQ ID NO: 115 con SEQ ID NO: 117 para producir la proteína de fusión Fab-2 de adalimumab-inteína.
Se producen proteínas de Fab modificado con alquino de adalimumab mediante escisión de proteínas de fusión de Fab de adalimumab-inteína con cistil-propargilamida 50 mM esencialmente tal como se describe en el ejemplo 1. Se escinde la proteína de fusión de Fab-1 de adalimumab-inteína con cistil-propargilamida para producir proteína de Fab-1modificado con alquino de adalimumab que es una proteína de heterodímero de SEQ ID NO: 119 y SEQ ID NO: 124. Se escinde la proteína de fusión de Fab-2 de adalimumab-inteína con cistil-propargilamida para producir proteína de Fab-2 modificado con alquino de adalimumab que es una proteína de heterodímero de SEQ ID NO: 119 y SEQ ID NO: 125.
Se producen proteínas de Fab modificado con azida de adalimumab mediante escisión de proteínas de fusión de Fab de adalimumab-inteína con cistil-3-azidopropilamida 50 mM esencialmente tal como se describe en el ejemplo 1. Se escinde la proteína de fusión de Fab-1 de adalimumab-inteína con cistil-3-azidopropilamida para producir proteína de Fab-1 modificado con azida de adalimumab que es una proteína de heterodímero de SEQ ID NO: 119 y SEQ ID NO: 126. Se escinde la proteína de fusión de Fab-2 de adalimumab-inteína con cistil-3-azidopropilamida para producir proteína de Fab-2 modificado con azida de adalimumab que es una proteína de heterodímero de SEQ ID NO: 119 y SEQ ID NO: 127.
Se preparan Fab-1 de adalimumab-alquino-azida-Fc6 y Fab-2 de adalimumab-alquino-azida-Fc6 mediante la reacción de proteína de Fab-1 modificado con alquino de adalimumab o proteína de Fab-2 modificado con alquino de adalimumab con proteína Az-DKTHT-Fc6 (figura 6 ) o proteínas Az-PEGx-DKTHT-Fc6 (figura 7).
Se prepara tris(3-hidroxipropiltriazolilmetil)amina (THTPA) tal como se describe por Hong et al., Angew. Chem. Int. Ed.
48, 1-7 (2009). Se llevan a cabo las reacciones en fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,0, con el grupo de unión-Fc a una concentración de 5 mg/ml o mayor, y una razón molar de > 2:1 de Fab-A:grupo de unión-Fc. A la reacción se le añade una concentración final de CuSO4 0,0001 M, THTPA 0,0005 M. Se inicia la reacción añadiendo hasta una concentración final de aminoguanidina 0,005 M y ascorbato de sodio 0,005 M. Tras la incubación a temperatura ambiente durante 12-18 horas en un tubo cerrado, se aplica la mezcla de reacción a una columna cromatográfica empaquetada con proteína A (GE Lifesciences, NJ) para retirar el reactivo en exceso y Fab-A sin reaccionar, se lava con p Bs , se eluye con glicina-HCl 0,1 M, pH 2,7, y se neutraliza inmediatamente añadiendo Tris-HCl 1,0 M, pH 9,0. Se dializan los productos de Fab-1 de adalimumab-alquino-azida-Fc6 y Fab-2 de adalimumab-alquino-azida-Fc6 eluidos frente a PBS.
Se preparan Fab-1 de adalimumab-azida-alquino-Fc6 y Fab-2 de adalimumab-azida-alquino-Fc6 mediante la reacción de proteína de Fab-1 modificado con azida de adalimumab o proteína de Fab-2 modificado con azida de adalimumab con proteína de Fc6 modificado con cicloalquino.
Se preparan proteínas de Fc6 modificado con cicloalquino esencialmente tal como se describe en el ejemplo 1 usando DIBAC-PEG-12-tioéster (tabla 1) y otros DIBAC-PEGx-tioésteres y DIBAC-PEGx-DKTHT-tioésteres preparados de manera similar.
Ejemplo 4: Proteínas de Fc modificado con azida N-terminales
Se preparó una serie de proteínas de Fc modificado con azida (N3-Px-Fc), que tenían, cada una, un grupo funcional azida en su extremo N-terminal, y opcionalmente un grupo de unión de PEG, haciendo reaccionar la proteína Fc6 con cinco tioésteres que tenían la secuencia azidoacetil-Px-DKTHT-tiofenol (x = 0, 12, 24, 36, 48). Se llevaron a cabo las reacciones en ausencia de TCEP para minimizar cualquier reducción del grupo azida para dar una amina primaria. En la tabla 1 se muestran los tioésteres de azidoacetil-Px-DKTHT-tiofenol con x = 12, 24, 36. Se preparó azidoacetil-DKTHT-tiofenol tal como se describe en el ejemplo 1 (calculado para C32H45O10N11S [M+H]+ 776,8, hallado 776,3). Se preparó azidoacetil-PEG48-DKTHT-tiofenol mediante fase sólida mediante la condensación secuencial de Fmoc-PEG12-OH y Fmoc-PEG36-OH obtenidos de Quanta BioDesign (calculado para C134H247N13O60S [M+H]+ 3032,5, hallado 3032,8). Las fórmulas estructurales son las siguientes:
Cada reacción (2 ml) contenía MES 50 mM pH 6,5, ácido mercaptofenilacético 10 mM, 2,2 mg de Fc6 y uno de los cinco tioésteres de la siguiente manera: azidoacetil-DKTHT-tiofenol (5 mg), azidoacetil-PEG12-DKTHT-tiofenol (5 mg), azidoacetil-PEG24-DKTHT-tiofenol (10 mg), azidoacetil-PEG36-DKTHT-tiofenol (10 mg) o azidoacetil-PEG48-DKTHT-tiofenol (20 mg). Se llevaron a cabo las reacciones durante 20 horas a temperatura ambiente, se neutralizaron con 0,1 ml de Tris HCl pH 9,0, se centrifugaron a 12.000 x g, y se aplicaron a una columna de proteína A HiTrap HP. Se lavaron las columnas con 12 vol de PBS, y después se eluyeron las proteínas de N3-Px-Fc con glicina HCl 0,1 M pH 2,7 y se neutralizaron con 1/20 volúmenes de Tris HCl 1,0 M pH 9,0. Se combinaron las fracciones de pico mediante A280, se desalaron en columnas PD-10 y se concentraron usando unidades de filtro de centrífuga Amicon Ultracel-3.
La figura 24 muestra las proteínas purificadas de N3-Px-Fc mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras (izquierda) y no reductoras (derecha): control de Fc6 (carriles a), N3-P0-Fc (carriles b), N3-P12 -Fc (carriles c), N3-P24-Fc (carriles d), N3-P36-Fc (carriles e), y N3-P48-Fc (carriles f). El tamaño de las proteínas de N3-Px-Fc aumentó con la longitud del grupo de unión de PEG. Además, el tamaño de las proteínas de N3-Px-FC preparadas sin TCEP (figura 24) no pudieron distinguirse mediante SDS-PAGE con respecto al tamaño de las proteínas de N3-Px-FC preparadas con TCEP (figura 17).
Ejemplo 5: inmunoglobulinas híbridas de GLP1-triazol-Fc
Se preparó una serie de inmunoglobulinas híbridas de GLP1-triazol-Fc (GLP1-P4-DN-Px-Fc) haciendo reaccionar un análogo de GLP-1 (péptido similar al glucagón 1), modificado adicionalmente para tener un grupo funcional ciclooctino, con cada una de las cinco proteínas de N3-Px-Fc del ejemplo 4. La secuencia del análogo de GLP-1, HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRG-PEG3-C-NH2 (HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRG es SEQ ID NO: 202), corresponde a los residuos 7-37 del péptido de GLP-1 nativo, en el que se sustituye glicina por alanina en la posición 8 y se sustituye ácido glutámico por lisina en la posición 22. Además, el análogo de GLP-1 tiene un grupo de grupo de unión de PEG3 y residuo de cisteína en su extremo C-terminal usado para unir el grupo funcional ciclooctino. Este análogo de GLP-1, gly8-glu22-GLP-1 (7 -37 )-PEG3-cys-NH2, se preparó mediante SPPS (calculado para C165H253N43O53S [M+H]+ 3720,3, hallado 3721,3).
Se añadió un grupo funcional ciclooctino a gly8-glu22-GLP-1 (7-37 )-PEG3-cys-NH2 usando un grupo de unión heterobifuncional, DBCO-PEG4-maleimida, que contenía un grupo maleimida que podía reaccionar con el grupo tiol libre en el residuo de cisteína C-terminal (figura 25). Se obtuvo DBCO-PEG4-maleimida (C50H54N4O9, peso molecular de 854,92), de Click Chemistry Tools (Scottsdale, AZ). Antes de su uso, se disolvió el grupo de unión a una concentración de 25 mg/ml en dimetilsulfóxido (DMSO) obtenido de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Las reacciones (0,4 ml) contenían MES 50 mM pH 6,5, EDTA 5 mM, 0,45 mg de péptido gly8-glu22 -GLP-1 (7-37 )-PEG3-cys-NH2 y 0,9 mg/ml del grupo de unión DBCO-PEG4-maleimida. Se llevaron a cabo las reacciones durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se retiró el grupo de unión sin reaccionar en exceso usando una columna de desalación HiTrap de 5 ml obtenida de GE Life Sciences. La figura 25 muestra la estructura del producto de reacción de análogo de GLP-1 modificado con ciclooctino resultante (GLP1-P7-DBCO).
Se hizo reaccionar GLP1-P7-DBCO de manera individual con cada una de las cinco proteínas de N3-Px-Fc (figura 26), para generar una serie de inmunoglobulinas híbridas de GLP1-P7-triazol-Px-Fc (figura 27). Cada reacción (1,5 ml) contenía fosfato de sodio 0,1 M pH 7,0, 0,375 mg del péptido GLP1-P7-DBCO y 0,5 mg de una de las cinco proteínas de N3-Px-Fc. Se llevaron a cabo las reacciones durante 3,5 horas a temperatura ambiente, se purificaron las reacciones mediante cromatografía de proteína A HiTrap HP, se desalaron y se concentraron tal como se describe en el ejemplo 4.
La figura 28 muestra las inmunoglobulinas híbridas de GLP1-triazol-Fc purificadas mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras (izquierda) y condiciones no reductoras (derecha): control de Fc6 (carriles a), GLP1-P4-DN-P0-Fc (carriles b), GLP1-P4-DN-P12-Fc (carriles c), GLP1-P4-DN-P24-Fc (carriles d), GLP1-P4-DN-P36-Fc (carriles e), y GLP1-P4-DN-P48-Fc (carriles f). El tamaño de las inmunoglobulinas híbridas de GLP1-triazol-Fc aumentó con la longitud del grupo de unión de PEG de manera comparable a las proteínas de N3-Px-Fc.
La figura 29 compara directamente las inmunoglobulinas híbridas de GLP1-triazol-Fc y las proteínas de N3-Px-Fc mediante SDS-pAg E en condiciones reductoras: control de Fc6 (carril a), N3-P0-Fc (carril b), GLP1-P4-DN-P0-Fc (carril c), N3-P12 -Fc (carril d), GLP1-P4-DN-P12-Fc (carril e), N3-P24-Fc (carril f), GLP1-P4-DN-P24-Fc (carril g), N3-P36-Fc (carril h), GLP1-P4-Dn P36-Fc (carril i), N3-P48-Fc (carril j), GLP1-P4-d N-P48-Fc (carril k). La conversión de cada proteína de N3-Px-Fc en la inmunoglobulina híbrida de GLP1-P4-DN-Px-Fc correspondiente fue de aproximadamente el 95%.
Ejemplo 6 : Actividad biológica de inmunoglobulinas híbridas de GLP1-triazol-Fc
Se evaluó la actividad biológica de las inmunoglobulinas híbridas de GLP1-P7-triazol-Px-Fc en un ensayo basado en células que midió la inducción de la síntesis de cAMP en células que expresaban el receptor de GLP-1 humano (GLP-1R). Para el aislamiento de células que expresaban GLP-1R, se obtuvieron medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) de Invitrogen (Grand Island, NY), suero bovino fetal (FBS), penicilina, estreptomicina y sulfato de geneticina (G418) de Corning (Manassas, VA), se obtuvo el kit de transfección de CalPhos de Clontech (Mountain Vista, CA), se obtuvo plásmido de expresión de receptor de GLP-1 humano de GeneCopoeia (Rockville, MD), y se obtuvo anticuerpo monoclonal anti-GLP-1R humano-ficoeritrina de R&D Systems (Mineápolis, MN). Para ensayos de cAMP, se obtuvo 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) de Sigma-Aldrich (n.° 15879), se obtuvo el kit de cAMP dinámico 2 de Cisbio Bioassays (Bedford, MA) y se obtuvo el péptido GLP-1(7-37) de AnaSpec (n.° 20761).
Se prepararon células que expresaban GLP-1R mediante transfección de un vector de expresión de GLP-1R (EX-A0510-M02) en células de riñón embrionario 293T humanas usando un kit de transfección de mamífero CalPho. Se hicieron crecer células transfectadas en DMEM complementado con FBS al 10% y penicilina y estreptomicina (10 Ul/ml) y se llevó a cabo la selección de transfectantes estables en los mismos medios que contenían G4182 mg/ml. Se evaluó la expresión de GLP-1R mediante análisis de citometría de flujo usando un anticuerpo monoclonal anti-GLP-1R humano-ficoeritrina.
Para ensayos de cAMP, se sembraron células 293T-GLP-1R durante la noche en placas de microtitulación blancas tratadas con cultivo tisular de 384 pocillos (Corning n.° 3704) a una densidad de 5.000, 8.000 ó 10.000 células/pocillo en 20 ul de medio/pocillo. Al día siguiente, se añadieron diluciones en serie de agonista (péptido GLP-1 o las inmunoglobulinas híbridas de GLP1-triazol-Fc) en 20 ul de PBS que contenían IBMX 0,5 mM a las células, y después se incubaron las células a 37°C durante 1, 4 ó 24 horas. Tras la estimulación, se determinaron los niveles de cAMP mediante fluorescencia de resolución en el tiempo homogénea (HTRF) en un lector de microplacas ClarioStar (BMG Labtech) usando un kit de cAMP dinámico 2 de Cisbio según las instrucciones del fabricante. Tras la adición de reactivos de detección de HTRF, AcM anti-cAMP marcado con criptato (20 ul) y el cAMP marcado con colorante d2 (20 ul), se incubaron las placas durante 1 hora a temperatura ambiente y se calculó la razón de fluorescencia (665 nm/620 nm) y se usó para determinar la concentración de cAMP en los lisados celulares mediante ajuste de cuatro parámetros a una curva patrón de cAMP.
La figura 30 muestra los resultados de péptido GLP-1(7-37) y las proteínas de GLP1-P7-DN-Px-Fc (x = 0, 12, 24, 36, 48). Las cinco inmunoglobulinas híbridas de GLP1-triazol-Fc indujeron niveles de cAMP comparables al péptido GLP-1(7-37). La estimulación mediante GLP-1(7-37) fue similar ya se expusieran las células a agonista durante 1, 4 ó 24 horas, con una CE50 de ~ 2 nM a las 24 horas, mientras que la estimulación mediante las inmunoglobulinas híbridas de GLP1-triazol-Fc aumentó drásticamente a medida que se expusieron las células a agonista durante tiempos más prolongados, con una CE50 de ~0,4 nM a las 24 horas.
Ejemplo 7: Proteínas de ciclooctino-Fc N-terminales
Se prepara una serie de proteínas de Fc modificado con ciclooctino (DIBAC-P11-DN-Px-Fc), que tienen cada una un grupo funcional ciclooctino en su extremo N-terminal, haciendo reaccionar un grupo de unión ciclooctino homobifuncional con las proteínas de N3-Px-Fc modificado con azida del ejemplo 4. El grupo de unión, DIBAC-PEG11-DIBAC, mostrado en la figura 31, se obtuvo de CPC Scientific (calculado para C74H102N6O17 [M+H]+ 1346,6, hallado 1346,4). La porción PEG11 de este grupo de unión se derivó de diamido-dPEGn-diamina (Quanta Biodesigns n.° 10361) que tiene la estructura: [-NH-CH2-(CH2-CH2-O)3-(CH2)3-CO-NH-(CH2-CH2-O)5-(CH2)2-CO-NH-CH2-(CH2-CH2-O)3-(CH2)3-NH-].
Se hace reaccionar DIBAC-PEG11-DIBAC de manera individual con cada una de las cinco proteínas de N3-Px-Fc (figura 31), para generar una serie de proteínas de DIBAC-P11-DN-Px-Fc (figura 32). Se muestran resultados representativos para la reacción de DIBAC-PEG11-DIBAC con la proteína N3-P0-Fc para generar DIBAC-P11-DN-P0-Fc. Se inició la reacción (1 ml) añadiendo 84 mg de la proteína de N3-Px-Fc a 11,25 mg del grupo de unión de DIBAC-PEG11-DIBAC en fosfato de sodio 0,02 M pH 7,0 en agua-etanol (0,64:0,36 vol/vol). Se llevó a cabo la reacción durante 12 horas a temperatura ambiente, y después se extrajo el grupo de unión de DIBAC-PEG11-DIBAC añadiendo 1 ml de PBS, mezclando bien y centrifugando a 12.000 x g lo cual separó el grupo de unión como una fase aceitosa más densa. El producto DIBAC-P11-DN-P0-Fc deseado contenido dentro de la fase acuosa superior se purificó mediante cromatografía de proteína A HiTrap HP, se desaló y se concentró tal como se describe en el ejemplo 4.
La figura 33 muestra el producto de reacción DIBAC-P11-DN-P0-Fc mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras: control de Fc6 (carril b), producto de reacción sin purificar (carriles c-e), la proteína N3-P0-Fc purificada (carril f), y la proteína DIBACP11-DN-P0-Fc purificada (carril g). Aproximadamente, el 70% de la proteína N3-P0-Fc (I) se convirtió en un producto que tenía el tamaño esperado de la proteína DIBAC-P11-DN-P0-Fc (II).
Ejemplo 8 : inmunoglobulinas híbridas de ADN-triazol-Fc
Se prepara una serie de inmunoglobulinas híbridas de ADN-triazol-Fc (ADN-P11-DN-Px-Fc) haciendo reaccionar un ADN o ARN modificado con azida, con cada una de las cinco proteínas de DIBAC-P11-DN-Px-Fc del ejemplo 7. La figura 34 muestra la estructura del ADN modificado con azida, 5AzD-let7d, que tiene la secuencia 5'-AGAGGTAGTAGGTTGCATAGTT-3' (SEQ ID NO: 203) de la cadena codificante de ADN para el ARNmi de hsa-let-7d-5p humano maduro (www.mirbase.org, n.° de registro MIMAT0000065). Se obtuvo el oligonucleótido 5AzD-let7d (5AzD-let7d) de Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Antes de su uso, se disolvió 5AzD-let7d (peso molecular de 7187,8) en Tris HCl 10 mM, EDTA 1 mM.
Se hizo reaccionar 5AzD-let7d de manera individual con cada una de las proteínas de DIBAC-P11-DN-Px-Fc (figura 34) para generar una serie de inmunoglobulinas híbridas de ADN-triazol-Fc (figura 35). Se muestran resultados representativos para la reacción de 5AzD-let7d con la proteína DIBAC-P11-DN-P0-Fc. Las reacciones (20 ul) contenían fosfato de sodio 0,1 M pH 7,0, 50 ug de 5AzD-let7d o una serie de diluciones de dos veces del mismo, y 5,7 ug de la proteína de ADN-P11-DN-Px-Fc. Se llevaron a cabo las reacciones a temperatura ambiente durante 2 horas.
La figura 36 muestra los productos de reacción mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras: la concentración de oligonucleótido 5AzD-let7d (mg/ml) fue de la siguiente manera: marcadores (carril a), 0 (carril b), 2,5 (carril c), 1,25 (carril d), 0,063 (carril e), 0,031 (carril f), 0,016 (carril g), 0,08 (carril h). Aproximadamente el 90% de la proteína DIBAC-P11-DN-P0-Fc (II) se convirtió en un producto que tenía el tamaño esperado de la inmunoglobulina híbrida ADN-ND-P11-DN-PEGü-Fc (III).
Ejemplo 9: Proteínas de azida-AcM N-terminales
Se prepara una serie de proteínas de trastuzumab modificado con azida (N3-Px-Hc), que tienen cada una un grupo funcional azida en el extremo N-terminal de su cadena pesada, y opcionalmente un grupo de unión de PEG, haciendo reaccionar una variante de proteína de trastuzumab, cys1HIgG1, con tioésteres que tienen la secuencia azidoacetil-Px-DKTHT-tiofenol (figura 37).
Cys1H-IgG1 consiste en la cadena ligera de trastuzumab silvestre mostrada en SEQ ID NO: 128, y una cadena pesada de trastuzumab variante, que tiene en su extremo N-terminal de cadena pesada un residuo de cisteína. La cadena pesada de cys1H-IgG1 se expresa inicialmente como las pre-cadenas pesadas de trastuzumab variantes mostradas en SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168 y SEQ ID NO: 169, que tienen un péptido señal de SHH, péptido señal de IFN y péptido señal de CETP, respectivamente. La escisión de las secuencias señal heterólogas mediante la señal peptidasa celular proporciona la proteína de cadena pesada madura que tiene una cisteína N-terminal, cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO: 166.
Se prepara una segunda serie de proteínas de trastuzumab modificado con azida (N3-Px-Lc), que tienen cada una un grupo funcional azida en el extremo N-terminal de su cadena ligera, y opcionalmente un grupo de unión de PEG, haciendo reaccionar una variante de proteína de trastuzumab, cys1L-IgG1, con tioésteres que tienen la secuencia azidoacetil-Px-DKTHT-tiofenol (figura 38).
Cys1L-IgG1 consiste en la cadena pesada de trastuzumab silvestre mostrada en SEQ ID NO: 129, y una cadena ligera de trastuzumab variante, que tiene en su extremo N-terminal de cadena pesada un residuo de cisteína. La cadena ligera de cys1L-IgG1 se expresa inicialmente como las pre-cadenas ligeras de trastuzumab variantes mostradas en SEQ ID NO: 131, SEQ ID No : 132 y SEQ ID NO: 133 que tienen un péptido señal de SHH, péptido señal de IFN y péptido señal de CETP, respectivamente.
La escisión de las secuencias señal heterólogas mediante la señal peptidasa celular proporciona la proteína de cadena ligera madura que tiene una cisteína N-terminal, cuya secuencia se muestra en SEQ iD NO: 130.
Se cotransfectan vectores de expresión de cadena ligera y pesada apropiados para producir las proteínas cys1H-IgG1 y cysL-IgG. Se lleva a cabo la producción de proteínas mediante expresión transitoria en células CHO-DG44, adaptadas para el cultivo el suspensión libre de suero seguido por purificación con proteína A, tal como se describe en el ejemplo 1.
Ejemplo 10: Inmunoglobulinas híbridas de mertansina-triazol-trastuzumab
Se prepara una serie de inmunoglobulinas híbridas de mertansina-triazol-trastuzumab haciendo reaccionar el maitansinoide DM1 (mertansina), modificado adicionalmente para tener un grupo funcional ciclooctino, con cada una de las proteínas de N3-Px-Hc y N3-Px-Lc del ejemplo 9.
Se prepara DM1 (forma de tiol libre; P.M. 737,5 g/mol) tal como se describió anteriormente en las patentes estadounidenses n.os 5.208.020 y 6.333.410 B1. Se añade un grupo funcional ciclooctino a DM1 usando el grupo de unión heterobifuncional DBCO-PEG4-maleimida que contiene un grupo maleimida que puede reaccionar con el grupo tiol libre de DM1 (figura 39). Se hace reaccionar DM1 con DBCO-PEG4-maleimida en DMSO usando los procedimientos del ejemplo 5. Se purifica el producto de DM1 modificado con cicloctino (DM1-P4-DBCO) mediante HPLC y se disuelve en DMSO antes de su uso.
Se hace reaccionar DM1-P4-DBCO de manera individual con cada una de las cinco proteínas de N3-Px-Hc (figura 40), para generar una serie de inmunoglobulinas híbridas de mertansina-triazol-trastuzumab modificadas con DM1 en el extremo N-terminal de la cadena pesada de trastuzumab (DM1-P4-triazol-Px-Hc) (figura 41).
Se hace reaccionar DM1-P4-DBCO de manera individual con cada una de las cinco proteínas de N3-Px-Lc (figura 42), para generar una serie de inmunoglobulinas híbridas de mertansina-triazol-trastuzumab modificadas con DM1 en el extremo N-terminal de la cadena ligera de trastuzumab (DM1-P4-triazol-Px-Lc) (figura 43).
Se evalúa la eficacia de las inmunoglobulinas híbridas de mertansina-triazol-trastuzumab como conjugados de anticuerpo-fármaco novedosos y se compara con ado-trastuzumab emtansina, obtenido de Genentech (South San Francisco, CA), usando ensayos de proliferación celular in vitro ensayos de inhibición del crecimiento tumoral in vivo tal como se describe en la patente estadounidense n.° 7.521.541B2.
Ejemplo 11: Proteínas de tetrazina-Fc N-terminales
Se preparó una serie de proteínas de Fc modificadas con tetrazina (Tet-Px-Fc), que tenían cada una un grupo tetrazina en su extremo N-terminal y opcionalmente un grupo de unión de PEGx, haciendo reaccionar un grupo de unión heterobifuncional con las proteínas de N3-Px-Fc modificado con azida del ejemplo 4. La figura 44 muestra el grupo de unión heterobifuncional tetrazina-DBCO, que tiene un grupo ciclooctino en un extremo que puede reaccionar con el grupo azida de las proteínas de N3-Px-FC, y un grupo tetrazina en el otro extremo. El grupo de unión tetrazina-DBCO se obtuvo de Click Chemistry Tools (artículo n.° 1022; C32H29N7O6S, protonado; peso molecular de 639,68, protonado). Antes de su uso, se disolvió tetrazina-DBCO a una concentración de 25 mg/ml en agua.
Se hizo reaccionar tetrazina-DBCO de manera individual con cada proteína de N3-Px-Fc (figura 44) para generar la serie correspondiente de proteínas de Tet-Px-Fc (figura 45). Las reacciones (0,72 ml) contenían fosfato de sodio 0,1 M pH 7,0, 0,1875 mg del grupo de unión tetrazina-DBCO y 0,6 mg de la proteína de N3-Px-Fc. Se llevaron a cabo las reacciones durante 3,5 horas a temperatura ambiente. Se retiró el grupo de unión sin reaccionar en exceso mediante cromatografía de proteína A HiTrap HP.
La figura 46 muestra las proteínas de Tet-Px-Fc purificadas mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras (izquierda) y no reductoras (derecha): control de Fc6 (carriles a), Tet-P0-Fc (carriles b), Tet-P12-Fc (carriles c), Tet-P24-Fc (carriles d), Tet-P36-Fc (carriles e), y Tet-P48-Fc (carriles f). El tamaño en SDS-PAGE de las proteínas de Tet-Px-Fc aumentó a medida que aumentó la longitud del grupo de unión de PEG, en condiciones tanto reductoras como no reductoras. Además, cada una de las proteínas de Tet-Px-Fc fue mayor que la proteína de N3-Px-Fc correspondiente mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras (figura 50).
Ejemplo 12: Proteínas de trancicloocteno-Fc N-terminales
Se prepara una serie de proteínas de Fc modificadas con transcicloocteno (Tco-Px-Fc), que tienen cada una un grupo transcicloocteno en su extremo N-terminal y opcionalmente un grupo de unión de PEGx, haciendo reaccionar un grupo de unión heterobifuncional con las proteínas de N3-Px-Fc modificado con azida del ejemplo 4. La figura 47 muestra el grupo de unión heterobifuncional TCO-PEG12-DBCO, que tiene un grupo ciclooctino en un extremo que puede reaccionar con el grupo azida de las proteínas de N3-PX-FC, y un grupo transcicloocteno en el otro extremo. El grupo de unión TCO-PEG12-DBCO se obtuvo de Click Chemistry Tools (artículo n.° 1005; C54H81N3O16; peso molecular de 1028,23). Antes de su uso, se disolvió TCO-PEG12-DBCO a una concentración de 100 mg/ml en DMSO.
Se hace reaccionar TCO-PEG12-DBCO de manera individual con cada proteína de N3-Px-Fc (figura 47) para generar la serie correspondiente de proteínas de Tco-P12-Px-Fc (figura 48). Se muestran resultados representativos para la reacción de TCO-PEG12-DBCO con la proteína N3-P36-Fc. Las reacciones (6 ul) contenían fosfato de sodio 0,1 M pH 7,0, 0,2 mg del grupo de unión TCO-PEG12-DBCO o una serie de diluciones de dos veces del mismo en DMSO, y 5 ug de la proteína N3-P36-Fc. Se llevaron a cabo las reacciones durante 3,5 horas a temperatura ambiente.
La figura 49 muestra las proteínas de Tco-P12-Px-Fc mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras: la concentración de grupo de unión Tco-P12-DBCO (mg/ml) fue de la siguiente manera: 32 (carril a), 16 (carril b), 8 (carril c), 4 (carril d), 2 (carril e), 1 (carril f), 0,5 (carril g), 0,25 (carril h), 0,125 (carril i), y 0 (carril j). La conversión de la proteína N3-P36-Fc (I) en la proteína Tco-P12-P36-Fc (II) fue esencialmente completa a una concentración de grupo de unión Tco-P12-DBCO de 1 mg/ml (carril f). En estudios adicionales, la proteína Tco-P12-P36-Fc así obtenida se purificó mediante cromatografía de proteína A HiTrap HP, se desaló y se concentró tal como se describe en el ejemplo 4.
Para someter a prueba la reactividad de la proteína Tco-P12-P36-Fc con un grupo funcional tetrazina, en primer lugar se hizo reaccionar proteína Tco-P12-P36-Fc purificada con el grupo de unión tetrazina-DBCO heterobifuncional para preparar proteína DBCO-TT-P12-P36-Fc, que se purificó mediante proteína A y después se sometió a prueba para determinar su capacidad para reaccionar con un grupo de unión azido-PEG-amina, NH2-PEG23-N3, obtenido de Quanta Biodesigns (artículo n.° 10525, C48H98N4O23, peso molecular de 1099,30). Las reacciones de prueba (6 ul) contenían fosfato de sodio 0,1 M pH 7,0, 0,2 mg del grupo de unión NH2-PEG23-N3 o una serie de diluciones de dos veces del mismo, y 5 ug de la proteína DBCO-TT-P12-P36-Fc. Se llevaron a cabo las reacciones durante 1 hora a temperatura ambiente.
La figura 50 muestra los productos de reacción mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras: la concentración de grupo de unión NH2-PEG23-N3 (mg/ml) fue de la siguiente manera: 0,12 (carril a), 0,06 (carril b), 0,03 (carril c), 0,015 (carril d), 0,0075 (carril e), 0,0038 (carril f), 0,002 (carril g), 0,001 (carril h), 0 (carril i). La proteína DBc O-TT-p 12-P36-Fc (III), pero no la proteína Tco-P12-P36-Fc (no mostrado), se convirtió en la proteína NH2-P23-ND-TT-P12-P36-Fc (IV) esperada, confirmando la reactividad de la proteína Tco-P12-P36-Fc con un grupo funcional tetrazina.
Ejemplo 13: Inmunoglobulinas híbridas de GLP1-dihidropiridizina-Fc
Se preparó una serie de inmunoglobulinas híbridas de GLP1-dihidropiridizina-Fc (GLP1-P3-TT-Px-Fc) haciendo reaccionar un análogo de GLP-1 modificado con transcicloocteno con las proteínas de Tet-Px-Fc del ejemplo 11. También se prepararon inmunoglobulinas híbridas de GLP1-dihidropiridizina-Fc haciendo reaccionar un análogo de GLP-1 modificado con tetrazina con las proteínas de Tco-Px-Fc del ejemplo 12.
Para preparar el análogo de GLP-1 modificado con transcicloocteno, se hizo reaccionar el péptido gly8-glu22-GLP-1 (7 -37 )-PEG3-cys-NH2 con un grupo de unión heterobifuncional, TCO-PEG3-maleimida, que contenía un grupo maleimida que podía reaccionar con el grupo tiol libre en el residuo de cisteína C-terminal (figura 51). Se obtuvo TCO-PEG3-maleimida (C26H41N3O8, peso molecular de 523,62) de Click Chemistry Tools (artículo n.° 1002). Antes de su uso, se disolvió el grupo de unión a una concentración de 25 mg/ml en DMSo . Las reacciones (0,42 ml) contenían MES 50 mM pH 6,5, Ed TA 5 mM, 0,45 mg de péptido gly8-glu22-GLP-1 (7-37 )-PEG3-cys-NH2 y 0,375 mg del grupo de unión TCO-PEG3-maleimida. Se llevaron a cabo las reacciones a temperatura ambiente durante 60 minutos. Se retiró el grupo de unión sin reaccionar en exceso mediante intercambio de tampón en fosfato de sodio 0,02 M pH 7,0 usando una columna de desalación HiTrap de 5 ml. La figura 51 muestra la estructura del análogo de GLP-1 modificado con transcicloocteno (GLP1-P6-Tco).
Se hizo reaccionar el péptido GLP1-P6-Tco de manera individual con cada una de las proteínas de Tet-Px-Fc (figura 52), para generar la serie de GLP1-P3-TT-Px-Fc de inmunoglobulinas híbridas (figura 53). Las reacciones (0,99 ml) contenían fosfato de sodio 0,1 M pH 7,0, 0,145 mg de péptido GLP1-P6-Tco y 0,33 mg de cada proteína de Tet-Px-Fc. Se llevaron a cabo las reacciones a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después se purificaron las inmunoglobulinas híbridas de GLP1-P6-TT-Px-Fc mediante cromatografía sobre proteína A HiTrap HP.
Para preparar el análogo de GLP-1 modificado con tetrazina, se hace reaccionar el péptido gly8-glu22-GLP-1(7-37)-PEG3-cys-NH2 con un grupo de unión heterobifuncional, tetrazina-PEG4-maleimida, que contiene un grupo maleimida que puede reaccionar con el grupo tiol libre en el residuo de cisteína C-terminal (figura 54). Se obtuvo tetrazina-PEG4-maleimida (C29H39N7O, peso molecular de 613,66) de Click Chemistry Tools (artículo n.° A139). Antes de su uso, se disuelve el grupo de unión a una concentración de 25 mg/ml en DMSO. Las reacciones (0,42 ml) contenían MES 50 mM pH 6,5, e Dt A 5 mM, 0,45 mg de péptido gly8-glu22-GLP-1 (7-37 )-PEG3-cys-NH2 y 0,375 mg del grupo de unión tetrazina-PEG4-Maleimida. Se llevan a cabo las reacciones a temperatura ambiente durante 60 minutos. Se retira el grupo de unión sin reaccionar en exceso mediante intercambio de tampón en fosfato de sodio 0,02 M pH 7,0 usando una columna de desalación HiTrap de 5 ml. La figura 54 muestra la estructura del análogo de GLP-1 modificado con tetrazina (GLP1-P7-Tet).
Se hace reaccionar el péptido GLP1-P7-Tet de manera individual con cada una de las proteínas de Tco-Px-Fc (figura 55), para generar la serie de GLP1-P7-TetTco-Px-Fc de inmunoglobulinas híbridas (figura 56). Las reacciones (0,99 ml) contienen fosfato de sodio 0,1 M pH 7,0, 0,145 mg de péptido GLP1-P7-Tet y 0,33 mg de cada proteína de Tco-Px-Fc. Se llevan a cabo las reacciones a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después se purifican las inmunoglobulinas híbridas de GLP1-P7-Tet/Tco-Px-Fc mediante cromatografía sobre proteína A HiTrap Hp .
La figura 57 muestra las inmunoglobulinas híbridas de GLP1-dihidropiridizina-Fc purificadas mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras (izquierda) y condiciones no reductoras (derecha): control de Fc6 (carriles a), GLP1-P6-TT-P0-Fc (carriles b), GLP1-P6-TTP12-Fc (carriles c), GLP1-P6-TT-P24-Fc (carriles d), GLP1-P6-TT-P36-Fc (carriles e), y GLP1-P6-TT-P48-Fc (carriles f). El tamaño de inmunoglobulinas híbridas de GLP1-dihidropiridizina-Fc aumentó con la longitud del grupo de unión de PEG de manera comparable a las proteínas de Tet-Px-Fc.
La figura 58 compara directamente las proteínas de N3-Px-Fc (I), las proteínas de Tet-Px-Fc (II) y las inmunoglobulinas híbridas de GLP1-dihidropiridizina-Fc (III) mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras: control de Fc6 (carril a), N3-P0-Fc (carril b), Tet-P0-Fc (carril c), GLP1-P6-TT-P0-Fc (carril d), N3-P12 -Fc (carril e), Tet-P12-Fc (carril f), GLP1-P6-TT-P12-Fc (carril g), N3-P24-Fc (carril h), Tet-P24-Fc (carril i), GLP1-P6-TT-P24-Fc (carril j), N3-P36-Fc (carril k), Tet-P36-Fc (carril l), GLP1- P6-TT-P36-Fc (carril m), N3-P48-Fc (carril n), Tet-P48-Fc (carril o), GLP1-P6-TT-P48-Fc (carril p). La conversión de cada proteína de Tet-Px-Fc en la inmunoglobulina híbrida de GLP1-P6-TT-Px-Fc correspondiente fue de aproximadamente el 92%.
La figura 59 muestra un transcurso de tiempo para la reacción de GLP1-P7-DBCO con N3-P36-Fc y un transcurso de tiempo para la reacción de GLP1-P6-Tco con Tet-P36-Fc. Se llevaron a cabo las reacciones tal como se describió anteriormente durante los diversos tiempos indicados, excepto porque cada reacción se terminó mediante la adición de un exceso de competidor. Para la reacción de GLP1-P7-DBCO con N3-P36-Fc, se añadió azida de sodio hasta una concentración final del 0,1%; para la reacción de GLP1-P6-Tco con Tet-P36-Fc, se añadió TCO-PEG3-maleimida hasta una concentración final de 3,5 mg/ml. Se analizó cada reacción mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras: (panel superior) N3-P36-Fc solo (carril a), N3-P36-Fc GLP1-P7-DBCO para los siguientes tiempos 0, 1, 2, 4, 6 , 24, 48, 72 horas; (panel inferior) Tet-P36-Fc solo (carril a), Tet-P36-Fc TCO-PEG3-maleimida solo (carril b), Tet-P36-Fc GLP1-P6-Tco para los siguientes tiempos -4, -2, -1, 0, 1,2, 4 minutos. La reacción de GLP1-P6-Tco con Tet-P36-Fc (I) que conduce a la formación de GLP1-P7-DN-P36-Fc (II) es mucho más rápida, llegando a completarse dentro del plazo de 1 minuto, mientras que la reacción de GLP1-P7-DBCO con N3-P36-Fc (I) que conduce a la formación de GLP1-P7-DN-P36-Fc (II) sólo se completa al 50% después de 6 horas.
Se evaluó la actividad biológica de inmunoglobulinas híbridas de GLP1-P6-dihidropiridizina-Px-Fc en un ensayo basado en células tal como se describe en el ejemplo 6. La figura 60 muestra los resultados para el péptido GLP-1(7-37) y las proteínas de GLP1-P6-TT-Px-Fc (x = 0, 12, 24, 36, 48). Las cinco inmunoglobulinas híbridas de GLP1-dihidropiridizina-Fc indujeron niveles de cAMP comparables al péptido GLP-1(7-37). La estimulación mediante GLP-1(7-37) fue similar ya se expusieran las células a agonista durante 1, 4 ó 24 horas, con una CE50 de ~2 nM a las 24 horas, mientras que la estimulación mediante las inmunoglobulinas híbridas de GLP1-dihidropiridizina-Fc aumentó drásticamente a medida que se expusieron las células a agonista durante tiempos más prolongados, con una CE50 de ~0,2 nM a las 24 horas.
Ejemplo 14: Inmunoglobulinas híbridas de Fab de adalimumab-dihidropiridizina-Fc
Se preparó una serie de inmunoglobulinas híbridas de Fab-dihidropiridizina-Fc (Fab-P3-TT-Px-Fc) haciendo reaccionar un fragmento Fab modificado con transciclocteno con las proteínas de Tet-Px-Fc del ejemplo 11. También se preparan inmunoglobulinas híbridas de Fab-dihidropiridizina-Fc haciendo reaccionar un fragmento Fab modificado con tetrazina con las proteínas de Tco-Px-Fc del ejemplo 12.
Para preparar el Fab modificado con transcicloocteno, se hizo reaccionar Fab tratado con TCEP con un grupo de unión heterobifuncional, TCO-PEG3-maleimida, que contenía un grupo maleimida que podía reaccionar con un grupo tiol libre en el Fab tratado con TCEP (figura 61). Se generó el fragmento Fab mediante digestión con papaína de 10 mg de adalimumab (Humira™) obtenido de Abbott usando un kit de preparación de Fab Pierce™ (n.° de cat. 44985) según las instrucciones del fabricante. Tras la digestión, se purificó el fragmento Fab mediante cromatografía sobre proteína A HiTrap HP para retirar el fragmento Fc y anticuerpo sin digerir. Se sometieron las fracciones de flujo a través, que contenían el fragmento Fab, a intercambio de tampón en PBS, y se concentraron hasta 5 mg/ml.
Para la reducción parcial del fragmento Fab con TCEP, las reacciones (0,26 ml) contenían fosfato de sodio 0,1 M pH 7,0, 0,5 mg de Fab, y 0,08 mg/ml TCEP. Tras la incubación a temperatura ambiente durante 60 minutos, se llevó la reacción hasta 0,72 ml con la adición de 0,24 ml de fosfato de sodio 0,3 M pH 7,0 y 0,22 ml de agua. Después se añadió el grupo de unión TCO-PEG3-maleimida a la reacción (0,12 ml a una concentración de 50 ug/ml en DMSO) y se incubó la reacción durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se sometió el Fab modificado con transcicloocteno a intercambio de tampón en una columna PD-10 en fosfato de sodio 0,02 M pH 7,0 para retirar el grupo de unión en exceso y se concentró el producto final hasta 2,7 mg/ml. En estas condiciones, se modificó más del 90% de la cadena pesada de Fab y menos del 10% de la cadena ligera de Fab mediante el grupo de unión TCO-PEG3-maleimida. La figura 61 muestra la estructura de la proteína de Fab modificado con transcicloocteno (Fab-P3-Tco).
Se hizo reaccionar la proteína Fab-P3-Tco de manera individual con cada una de las proteínas de Tet-Px-Fc (figura 62), para generar la serie de Fab-P3-TT-Px-Fc de inmunoglobulinas híbridas (figura 63). La reacciones (6 ul) contenían fosfato de sodio 0,1 M pH 7,0, 3,6 ug de la proteína Fab-P3-Tco y 1 ug de cada proteína de Tet-Px-Fc. Se llevaron a cabo las reacciones a temperatura ambiente durante 60 minutos.
La figura 64 muestra las inmunoglobulinas híbridas de Fab-dihidropiridizina-Fc mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras: marcadores (carriles a), adalimumab (carril b), Fab-P3-TT-P0-Fc (carril c), Fab-P3-TT-P12-Fc (carril d), Fab-P3-TT-P24-Fc (carriles e), Fab-P3-TT-P36-Fc (carriles f), Fab-P3-TT-P48-Fc (carril g), Fab-P3-Tco (carril h), Tet-P0-Fc (carril i), Tet-P12-Fc (carril j), Tet-P24-Fc (carril k), Tet-P36-Fc (carril l)m Tet-P48-Fc (carril m). Mediante comparación con adalimumab (carril b), las inmunoglobulinas híbridas de Fab-dihidropiridizina-Fc tenían el tamaño esperado, mostrando un aumento con la longitud del grupo de unión de PEG comparable a las proteínas de Tet-Px-Fc. La conversión de cada proteína de Tet-Px-Fc en la inmunoglobulina híbrida de Fab-P3-TT-Px-Fc correspondiente fue de aproximadamente el 75%.
Ejemplo 15: Inmunoglobulinas híbridas de olanzapina-dihidropiridizina-Fc
En este ejemplo, se preparan inmunoglobulinas híbridas con un derivado de azida de un compuesto de amina primaria, amina secundaria o alcohol. El compuesto derivatizado con azida puede prepararse tal como se describe en Pothukanuri, S. y Winssinger, N., Org Lett. 2007; 9(11): 2223-5. En primer lugar se hace reaccionar el compuesto de amina primaria amina, amina secundaria o alcohol con cloroformiato de cloroalquilo para obtener el carbamato de cloroalquilo, seguido por un desplazamiento con azida del cloruro, proporcionando el carbamato de azidoalquilo. Todos los productos químicos se obtienen de Sigma-Aldrich.
En primer lugar se hace reaccionar olanzapina (Sigma, n.° de cat. 01141) con cloroformiato de clorometilo tal como se describe en la solicitud de patente estadounidense 13/801.344, publicada el 10 de octubre de 2013, publicación n.° US20130267505 A1. Se calienta una disolución de olanzapina (60 mmol) y trietilamina (120 mmol) en diclorometano anhidro (250 ml) hasta 35°C hasta que se forma una disolución transparente, después se enfría hasta 5°C. Después se añade cloroformiato de clorometilo (90 mmol) a lo largo de 20 minutos. Otros cloroformiatos de cloroalquilo adecuados incluyen cloroformiato de 2-cloroetilo, cloroformiato de 3-cloropropilo y cloroformiato de 4-clorobutilo. Se agita la reacción a temperatura ambiente durante 30 min y se deja calentar hasta temperatura ambiente. Después de 15 min a temperatura ambiente se diluye la mezcla de reacción con diclorometano (100 ml), después se lava con NaHCO3 acuoso saturado (75 ml) y agua (350 ml). Se seca la fase orgánica sobre MgSO4 y se filtra. Después se concentra la fase orgánica a vacío a 45°C hasta un volumen de 150 ml. Se diluye la mezcla con 30 ml de acetato de etilo y se evapora adicionalmente (20-30 ml) a vacío. Se enfría la mezcla hasta temperatura ambiente y se filtra el precipitado sólido resultante y se lava con acetato de etilo. Después de secar a vacío a 35°C durante 90 min, se obtiene 2-metil-4-(4-metilpiperazin-1-il)-5H-benzo[b]tieno[2,3-e]-[1,4]diazepin-5-carboxilato de clorometilo. Después se trata este compuesto (1,5 eq) con NaN3 (1,5 eq) en CH3CN:H2O (1:1, 0,3 M) a temperatura ambiente durante de 8 a 36 horas. Se diluye la mezcla de reacción con acetato de etilo y se lava la fase orgánica con agua, salmuera, después se seca sobre Na2SO4 y se concentra a vacío. La purificación mediante HPLC proporciona el derivado de azidaolanzapina, 2-metil-4-(4-metilpiperazin-1-il)-5H-benzo[b]tieno[2,3-e]-[1,4]diazepin-5-carboxilato de azidometilo (figura 65).
Después se usa el derivado de azida-olanzapina para preparar una serie de inmunoglobulinas híbridas de olanzapinadihidropiridizina-Fc (Ola-P12-TT-Px-Fc) de la siguiente manera. En una primera etapa, se modifica el derivado de azida-olanzapina con un grupo funcional transcicloocteno usando un grupo de unión heterobifuncional. En una segunda etapa, se hace reaccionar la olanzapina modificada con transciclocteno con las proteínas de Tet-Px-Fc del ejemplo 11.
Para preparar la olanzapina modificada con transcicloocteno, se hace reaccionar el derivado de azida-olanzapina con el grupo de unión heterobifuncional TCO-PEG12-DBCO que contiene un grupo ciclooctino que puede reaccionar con el grupo azida (figura 65). Las reacciones (1 ml) contienen 0,5 mg del derivado de azida-olanzapina y 5 mg del grupo de unión TCO-PEG12-DBCO en DMSO. Se llevan a cabo las reacciones a temperatura ambiente durante de 3 a 20 horas. Se purifica la olanzapina modificada con transciclocteno (Ola-P12-Tco) mediante HPLC para retirar el grupo de unión TCO-PEG12-DBCO sin reaccionar en exceso. Antes de su uso, se disuelve Ola-P12-Tco a una concentración de 1 mg/ml en DMSO.
Se hace reaccionar Ola-P12-Tco de manera individual con cada una de las proteínas de Tet-Px-Fc (figura 66 ), para generar la serie de Ola-P12-TT-Px-Fc de inmunoglobulinas híbridas (figura 67). Las reacciones (1 ml) contienen 0,1 mg de péptido GLP1-P7-Tet y 0,33 mg de cada proteína de Tco-Px-Fc en DMSO. Se llevan a cabo las reacciones a temperatura ambiente durante 60 minutos. Después se purifican las inmunoglobulinas híbridas de Ola-P12-TT-Px-Fc mediante cromatografía sobre proteína A HiTrap HP.
Discusión
En el presente documento se da a conocer la semisíntesis química de anticuerpos con bisagras no proteicas que incorporan grandes dominios de unión tales como el propio Fab o dominios extracelulares de receptor. La presente divulgación se refiere a la identificación de reacciones de ligación que son compatibles con la estructura y función

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Compuesto que tiene la estructura:
    Figure imgf000372_0001
    en la que A es una estructura biológicamente activa del compuesto;
    en la que Z es un componente de proteína del compuesto, componente de proteína que comprende uno o más polipéptidos, en el que al menos uno de los uno o más polipéptidos comprende aminoácidos consecutivos que (i) son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo; (ii) se unen a un receptor de Fc; y (iii) tienen en su extremo N-terminal una cisteína o una selenocisteína;
    en la que B es una estructura química que une A y Z;
    en la que la línea discontinua entre B y Z representa una unión peptidilo entre una cisteína o selenocisteína N-terminal de un polipéptido de Z y un residuo de aminoácido o un residuo de ácido orgánico de B; y en la que la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
    Figure imgf000372_0002
    en la que Xa es una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina; en la que Ra representa una estructura orgánica que se conecta a uno de A o B y Rb representa una estructura orgánica que se conecta al otro de A o B.
    Compuesto según la reivindicación 1, en el que Ra está conectado al ciclooctano y Rb está conectado a la dihidropiridazina.
    Compuesto según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que Xa tiene la estructura:
    Figure imgf000372_0003
    en la que Rc es H, alquilo o arilo;
    o un tautómero del mismo.
    Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la línea continua entre A y B representa una unión distinta de peptidilo que comprende la estructura:
    Figure imgf000373_0001
    o un tautómero del mismo.
    5. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que Ra y Rb son independientemente una estructura orgánica que comprende o que consiste en una cadena de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10 o más restos, en el que cada resto se selecciona independientemente del grupo que consiste en [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, poli(alcohol vinílico), poli(vinil alquil éter), poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo C1-C10, cicloalcano C3-C10, alqueno C2-C10, cicloalqueno C5-C10, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo C2-C5, acilamino C2-C5, aciloxilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoílo, un aminoácido, un grupo arilo, un grupo heteroarilo, un carbamato, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a un triazol, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a una isoxazolidina, un
    dibenzocicloocteno un dibenzoazacicloocteno
    Figure imgf000373_0002
    Figure imgf000374_0001
    en los que Xi es CH o N, X2 es CH2 o un grupo carbonilo, y R5 es un grupo arilo o alquilo;
    en el que [PEG(y)]z es:
    Figure imgf000374_0002
    Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que Ra o Rb
    i) está unido a A mediante un enlace carbono-nitrógeno o un enlace carbono-azufre;
    ii) está unido a A mediante un enlace carbono-nitrógeno;
    iii) está unido a A mediante un enlace carbono-nitrógeno, en el que el enlace carbono-nitrógeno es un enlace amida;
    iv) está unido a A mediante un enlace biológicamente lábil;
    v) está unido a A mediante un enlace amida entre el aminoácido C-terminal de A y un grupo amino en B; vi) está unido a A mediante un enlace amida entre el aminoácido C-terminal de A y un grupo amino en B, en el que el aminoácido terminal es cisteína;
    vii) está unido a A mediante un enlace carbono-azufre;
    viii) está unido a A mediante un enlace carbono-azufre formado entre Ra o Rb y un tiol libre;
    ix) comprende un residuo ramificado; o
    x) está unido a más de un A mediante un residuo ramificado.
    Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que A
    i) comprende la estructura de un compuesto que es un fármaco aprobado para tratar a un sujeto que padece una enfermedad;
    ii) comprende la estructura de un compuesto orgánico que tiene un peso molecular de menos de 1000 Dalton, un aptámero de ADN, un aptámero de ARN, un oligonucleótido o una proteína que es biológicamente activa; iii) comprende una amina primaria o una secundaria;
    iv) está unido a B mediante la amina primaria o secundaria;
    v) es aripiprazol u oseltamivir;
    vi) comprende una amina secundaria;
    vii) es un fármaco respiratorio, un agente antihistamínico, un agente analgésico, un antidepresivo, un agente antianginoso, un agente antiarrítmico, un agente antihipertensor, un agente antidiabético, un antihistamínico, un agente antiinfeccioso, un antibiótico, un agente antiinflamatorio, un fármaco antiparkinsoniano, un antipsicótico, un agente antipirético, un agente antiulceroso, un fármaco contra trastorno por déficit de atención con hiperactividad (ADHD), un estimulante del sistema nervioso central, un descongestionante o un psicoestimulante;
    viii) es alprenolol, acebutolol, amidefrina, amineptina, amosulalol, amoxapina, anfetaminilo, atenolol, atomoxetina, balofloxacino, bametán, befunolol, benazepril, benfluorex, benzoctamina, betahistina, betaxolol, bevantolol, bifemelano, bisoprolol, brinzolamida, bufeniodo, butetamina, camilofina, carazolol, carticaína, carvedilol, cefaelina, ciprofloxacino, clozapina, clobenzorex, clorprenalina, ciclopentamina, delapril, demexiptilina, denopamina, desipramina, desloratadina, diclofenaco, dimetofrina, dioxadrol, dobutamina, dopexamina, doripenem, dorzolamida, droprenilamina, duloxetina, eltoprazina, enalapril, enoxacino, epinefrina, ertapenem, esaprazol, esmolol, etoxadrol, fasudil, fendilina, fenetilina, fenfluramina, fenoldopam, fenoterol, fenproporex, flecamida, fluoxetina, formoterol, frovatriptan, gaboxadol, garenoxacino, gatifloxacino, grepafloxacino, hexoprenalina, imidapril, indalpina, indecainida, clorhidrato de indeloxazina, isoxsuprina, isproniclina, labetalol, landiolol, lapatinib, levofacetoperano, lisinopril, lomefloxacino, lotrafibán, maprotilina, mecamilamina, mefloquina, mepindolol, meropenem, metapramina, metaproterenol, metoxifenamina, metilfenidato dextrógiro, metilfenidato, metipranolol, metoprolol, mitoxantrona, mivazerol, moexipril, moprolol, moxifloxacino, nebivolol, nifenalol, nipradilol, norfloxacino, nortriptilina, nilidrina, olanzapina, oxamniquina, oxprenolol, oxifedrina, paroxetina, perhexilina, fenmetrazina, fenilefrina, fenilpropilmetilamina, foledrina, picilorex, pimetilina, pindolol, ácido pipemídico, piridocaína, practolol, pradofloxacino, pramipexol, pramiverina, prenalterol, prenilamina, prilocaína, procaterol, pronetalol, propafenona, propranolol, propilhexedrina, protoquilol, protriptilina, pseudoefedrina, reboxetina, rasagilina, (r)-rasagilina, repinotano, reproterol, rimiterol, ritodrina, safinamida, salbutamol/albuterol, salmeterol, sarizotano, sertralina, silodosina, sotalol, soterenol, esparfloxacino, espirapril, sulfinalol, sinefrina, tamsulosina, tebaniclina, tianeptina, tirofibán, tretoquinol, trimetazidina, troxipida, vareniclina, vildagliptina, viloxazina, viquidil o xamoterol;
    ix) comprende una proteína que es biológicamente activa;
    x) comprende una proteína secretada;
    xi) comprende un dominio extracelular de una proteína;
    xii) es biológicamente activo de tal manera que tiene actividad de unión a diana;
    xiii) es una proteína que se pliega de manera independiente o una porción de la misma;
    xiv) es una proteína glicosilada;
    xv) comprende enlaces disulfuro dentro de la cadena;
    xvi) se une a una citocina;
    xvii) se une a una citocina, en el que la citocina es TNFa;
    xviii) comprende péptido natriurético auricular (ANP), calcitonina, hormona liberadora de corticotropina (CRH), endotelina, exenatida, péptido gástrico inhibidor (GIP), péptido similar a glucagón 1 (GLP-1), péptido similar a glucagón 2 (GLP-2), un análogo de GLP-1 o GLP-2, péptido intestinal vasoactivo de glucagón (GVIP), ghrelina, péptido YY o secretina o una porción de los mismos;
    ixx) comprende un tramo de aminoácidos consecutivos en la secuencia HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRG;
    xx) comprende al menos un tramo de aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en la cadena pesada de un Fab o un Fab' de un anticuerpo;
    xxi) comprende al menos un al menos un tramo de aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en la cadena ligera de un Fab o un Fab' de un anticuerpo; xxii) comprende al menos un Fab o Fab' de un anticuerpo, o una porción de al menos un Fab o Fab'; xxiii) comprende Fab-1 o Fab'1 o una porción de los mismos de un anticuerpo;
    xxiv) comprende Fab-2 o Fab'2 o una porción de los mismos de un anticuerpo;
    xxv) comprende dos manos de Fab o Fab' de un anticuerpo;
    xxvi) comprende al menos un tramo de aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en un anticuerpo de cadena sencilla; o
    xxvii) comprende al menos un tramo de aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en un receptor de TNFa.
    8. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que Ra o Rb
    i) es una estructura orgánica que comprende un grupo [PEG(y)]z;
    ii) es una estructura orgánica que comprende un grupo polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, poli(alcohol vinílico), poli(vinil alquil éter), poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico) o polisacárido;
    iii) es una estructura orgánica que comprende un grupo alquilo C1-C4;
    iv) es una estructura orgánica que comprende una succinimida;
    v) es una estructura orgánica que comprende una amina;
    vi) es una estructura orgánica que comprende un succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo o adipoílo;
    vii) es una estructura orgánica que comprende un malonilo;
    viii) es una estructura orgánica que comprende un aminoácido;
    ix) es una estructura orgánica que comprende una cisteína;
    x) es una estructura orgánica que comprende una lisina;
    xi) es una estructura orgánica que consiste en una cadena de 3 restos seleccionados del grupo que consiste en [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, poli(alcohol vinílico), poli(vinil alquil éter), poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo C1-C10, cicloalcano C3-C10, alqueno C2-C10, cicloalqueno C5-C10, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo C2-C5, acilamino C2-C5, aciloxilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoílo, un aminoácido, un grupo arilo, un grupo heteroarilo, un carbamato, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno
    Figure imgf000377_0001
    xii) es una estructura orgánica que consiste en una cadena de cuatro restos seleccionados del grupo que consiste en [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, poli(alcohol vinílico), poli(vinil alquil éter), poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo C1-C10, cicloalcano C3-C10, alqueno C2-C10, cicloalqueno C5-C10, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo C2-C5, acilamino C2-C5, aciloxilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoílo, un aminoácido, un grupo arilo, un grupo heteroarilo, un carbamato, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a un triazol, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a una isoxazolidina,
    Figure imgf000377_0002
    Figure imgf000378_0001
    xiii) es una estructura orgánica que consiste en una cadena de cinco restos seleccionados del grupo que consiste en [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, poli(alcohol vinílico), poli(vinil alquil éter), poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo C1-C10, cicloalcano C3-C10, alqueno C2-C10, cicloalqueno C5-C10, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo C2-C5, acilamino C2-C5, aciloxilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoílo, un aminoácido, un grupo arilo, un grupo heteroarilo, un carbamato, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a un triazol, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a una isoxazolidina,
    un dibenzocicloocteno, un dibenzoazacicloocteno
    Figure imgf000378_0002
    Figure imgf000378_0003
    xiv) comprende un grupo [PEG(y)]z unido a una lisina;
    xv) comprende un grupo acilo C1-C4 unido a un grupo succinimida;
    xvi) comprende una lisina unida a un acilo C1-C4;
    xvii) comprende un grupo [PEG(y)]z, que está unido a un glutarilo;
    xviii) es una estructura orgánica que consiste en una cadena de tres, cuatro o cinco restos seleccionados del grupo que consiste en [PEG(y)]z, acilo C2-C5, succinilo, malonilo, glutarilo, un aminoácido, una estructura química que contiene un ciclooctano condensado a una dihidropiridazina, una estructura química que contiene un cicloocteno condensado a un triazol, una estructura química que contiene un cicloocteno
    condensado a una isoxazolidina, un dibenzocicloocteno, un dibenzoazacicloocteno
    Figure imgf000379_0001
    Figure imgf000379_0002
    en los que X1 es CH o N, X2 es CH2 o un grupo carbonilo, y R5 es un grupo arilo o alquilo;
    en los que [PEG(y)]z es:
    Figure imgf000379_0003
    en el que y = 1-100 y z = 1- 10 ;
    ixx) es un enlace;
    xx) es una cisteína;
    xxi) tiene una estructura lineal; o
    xxii) tiene una estructura ramificada;
    xxiii) tiene la estructura:
    Figure imgf000380_0001
    xxiv) es:
    Figure imgf000380_0002
    en el que n es 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1-30, 1-40 ó 1-50; xxv) es:
    Figure imgf000380_0003
    en el que n es 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1-30, 1-40 ó 1-50, x es 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1-30, 1-40 ó 1-50 y z es 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1-30, 1-40 ó 1-50;
    xxvi) es:
    Figure imgf000381_0001
    en el que x es 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1-30, 1-40 ó 1-50 y z es 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1-30, 1-40 ó 1-50; o
    xxvii) es:
    Figure imgf000381_0002
    en el que n es 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1-30, 1-40 ó 1-50.
    Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que Z comprende un C, en el que C es un primer polipéptido, primer polipéptido que comprende aminoácidos consecutivos que (i) son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo; (ii) se unen a un receptor de Fc; y (iii) tienen en su extremo N-terminal una secuencia seleccionada del grupo que consiste en una cisteína, selenocisteína, CP, CPXCP (en la que X = P, R o S), CDKTHTCPPCp, CVECPPCP, CCVECPPCP y CDTPPPCPRCP.
    Compuesto según la reivindicación 9, en el que C
    i) comprende aminoácidos consecutivos que (i) son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo; (ii) se unen a un receptor de Fc; y (iii) tienen en su extremo N-terminal una secuencia que comprende una cisteína que se produce de manera natural seleccionada del grupo que consiste en CP, CPx Cp (en la que X = P, R o S), CDKTHTCPPCP, CVECPPCP, CCVECPPCP y CDTPPPCPRCP;
    ii) es un componente de polipéptido del compuesto, componente de polipéptido que comprende aminoácidos consecutivos que (i) son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo; (ii) se unen a un receptor de Fc; y (iii) tienen en su extremo N-terminal una secuencia que comprende una cisteína que no se produce de manera natural o selenocisteína;
    iii) comprende aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en la cadena de un dominio Fc de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en IgG, IgM, IgA, IgD e IgE;
    iv) comprende aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en la cadena de un dominio Fc6 de un anticuerpo;
    v) comprende aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en una cadena de un anticuerpo distinta de una cadena de un dominio Fc del anticuerpo;
    vi) aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en una cadena pesada de un Fab o un Fab' de un anticuerpo; o
    vii) comprende aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en la cadena ligera de un Fab o un Fab' de un anticuerpo.
    11. Compuesto según la reivindicación 9 ó 10, en el que Z comprende además un segundo polipéptido, segundo polipéptido que comprende aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en una cadena de un anticuerpo distinta de una cadena de un dominio Fc del anticuerpo.
    12. Compuesto según la reivindicación 11, en el que el segundo polipéptido comprende
    i) aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en una cadena pesada de un Fab o un Fab' de un anticuerpo; o
    ii) aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en la cadena ligera de un Fab o un Fab' de un anticuerpo.
    13. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que Z
    i) comprende un anticuerpo o una porción del mismo;
    ii) comprende al menos un Fab o Fab' de un anticuerpo, o una porción del al menos un Fab o Fab';
    iii) comprende Fab-1 o Fab'1 o una porción de los mismos de un anticuerpo;
    iv) comprende Fab-2 o Fab'2 o una porción de los mismos de un anticuerpo;
    v) comprende dos manos de Fab o Fab' de un anticuerpo;
    vi) comprende al menos un tramo de aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presente en un anticuerpo de cadena sencilla; o
    vii) comprende un segundo polipéptido, y B está unido a Z mediante una unión peptidilo entre la cisteína o selenocisteína N-terminal del segundo polipéptido de Z y un residuo de aminoácido o un residuo de ácido orgánico de B.
    14. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, en el que el extremo C-terminal de C
    i) comprende un tramo de aminoácidos consecutivos presente en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo que se ha modificado; o
    ii) es una cisteína, selenocisteína, homocisteína u homoselenocisteína, o un derivado de cisteína, selenocisteína, homocisteína u homoselenocisteína.
    15. Homodímero o heterodímero que comprende el compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1­ 14.
    16. Homodímero o heterodímero según la reivindicación 15, en el que cada compuesto del homodímero o heterodímero
    i) puede unirse al otro mediante al menos un enlace disulfuro;
    ii) puede unirse al otro mediante al menos un enlace disulfuro entre el C o el segundo polipéptido de cada compuesto;
    iii) está unido al otro mediante al menos un enlace disulfuro;
    iv) está unido al otro mediante al menos un enlace disulfuro entre el C o el segundo polipéptido de cada compuesto.
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