JPH01247099A - ヒトの上皮細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法 - Google Patents
ヒトの上皮細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はヒト上皮細胞増殖因子（以下ｈＥＧＦと略記）
を遺伝子工学的手法を用いて生産する方法に係り、特に
ｈＥＧＦに対応する化学合成遺伝子及びそれを含むプラ
スミド、該プラスミドを保持する大腸菌及びこれらを用
いるｈＥＧＦの生産方法に関する。
を遺伝子工学的手法を用いて生産する方法に係り、特に
ｈＥＧＦに対応する化学合成遺伝子及びそれを含むプラ
スミド、該プラスミドを保持する大腸菌及びこれらを用
いるｈＥＧＦの生産方法に関する。
ｈＥＧＦはウロガストロンと同一物質と考えており、ヒ
トの十二指腸及び顎下腺などで合成され５３個のアミノ
酸からなるポリペプチドである。
トの十二指腸及び顎下腺などで合成され５３個のアミノ
酸からなるポリペプチドである。
このポリペプチドは胃酸の分泌を抑制し、上皮細胞の増
殖を促進する効果を有する。これから、胃潰瘍や傷の治
療薬としての利用が考えられている。
殖を促進する効果を有する。これから、胃潰瘍や傷の治
療薬としての利用が考えられている。
尿中に２５〜２５０ｎｇ／ｍρ含まれていることから、
従来尿より精製されていたが、生産量が少ないという欠
点があった。
従来尿より精製されていたが、生産量が少ないという欠
点があった。
最近、遺伝子工学的手法を用いて、ｈＥＧＦを大腸菌に
生産させることが試みられてきた。例えば、特開昭５７
−１２２０９６号、特開昭６０−２８９９４号、特開昭
６１−１５６９１号及び特開昭６１−８８８８１号等に
述べられている。この手法、すなわち化学合成したｈＥ
ＧＦ遺伝子を発現ベクターに組込み、当該ベクターを保
持する大腸菌を培養する方法によりｈＥＧＦを生産させ
るには、■化学合成したｈＥＧＦの塩基配列、■発現効
率の高い発令ベクター、■大腸菌の培養条件などを考慮
する必要がある。
生産させることが試みられてきた。例えば、特開昭５７
−１２２０９６号、特開昭６０−２８９９４号、特開昭
６１−１５６９１号及び特開昭６１−８８８８１号等に
述べられている。この手法、すなわち化学合成したｈＥ
ＧＦ遺伝子を発現ベクターに組込み、当該ベクターを保
持する大腸菌を培養する方法によりｈＥＧＦを生産させ
るには、■化学合成したｈＥＧＦの塩基配列、■発現効
率の高い発令ベクター、■大腸菌の培養条件などを考慮
する必要がある。
上記した公知技術はｇＥＧＦの塩基配列を翻訳効率の高
い配列にすること及び発現効率の高い発現ベクターの利
用について充分な配慮がなされておらず、容易にかつ大
量にｈＥＧＦを大腸菌に生産させることが難しいという
問題があった。
い配列にすること及び発現効率の高い発現ベクターの利
用について充分な配慮がなされておらず、容易にかつ大
量にｈＥＧＦを大腸菌に生産させることが難しいという
問題があった。
本発明の目的はポリペプチドへの翻訳効率ノ高いｈＥＧ
Ｆ遺伝子を化学働成し、続いて、化学合成したｈＥＧＦ
遺伝子を発現効率の高いトリプトファンプロモーターを
有する発現ベクターに連結し、当該発現ベクターを保持
する大腸菌を培養することにより、’ｈＥＧＦを効率よ
く大量に生産することを特徴とするｈＥＧＦの遺伝子工
学的生産方法を提供することにある。
Ｆ遺伝子を化学働成し、続いて、化学合成したｈＥＧＦ
遺伝子を発現効率の高いトリプトファンプロモーターを
有する発現ベクターに連結し、当該発現ベクターを保持
する大腸菌を培養することにより、’ｈＥＧＦを効率よ
く大量に生産することを特徴とするｈＥＧＦの遺伝子工
学的生産方法を提供することにある。
〔課題を解決するための手段〕
第１の発明の特徴は、トリプトファン調節遺伝子につな
がったトリプトファンオペロンのｔｒｐＥポリペプタイ
ドのＮ末側をコードした遺伝子とヒト上皮細胞増殖因子
側のアミノ酸をコードした遺伝子がリンカ−を介して結
合した次のＤＮＡ配列 ＡＴＧＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣＣＧＡＣＴＧＧＧＧ
ＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＡＧＡＡＡＴ
ＧＡＡＣＴＣＣＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＣ：ＣＣＧＣＴ
ＧＴＣＣＣＡＣＧＡＴＧＧＴＴＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＣ
ＧＡＣＧＧＣＧＴＴＴＴＧＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＧＡＧ
−ＧＣＧＣＴＧＧＡＣＡＡＡＴＡＴＧＣＧＴＧＴＡＡＣ
ＴＧＴＧＴＡＧＴＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣＧＧＣＧＡＡＣ
ＧＣＴＧＣＣＡＧＴＡＣＣＧＴＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧ
ＧＴＧＧＧＡＡＣＴＧＣＧＧ で表わされる遺伝子を用いることを特徴とするヒト上皮
細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法にある。
がったトリプトファンオペロンのｔｒｐＥポリペプタイ
ドのＮ末側をコードした遺伝子とヒト上皮細胞増殖因子
側のアミノ酸をコードした遺伝子がリンカ−を介して結
合した次のＤＮＡ配列 ＡＴＧＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣＣＧＡＣＴＧＧＧＧ
ＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＡＧＡＡＡＴ
ＧＡＡＣＴＣＣＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＣ：ＣＣＧＣＴ
ＧＴＣＣＣＡＣＧＡＴＧＧＴＴＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＣ
ＧＡＣＧＧＣＧＴＴＴＴＧＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＧＡＧ
−ＧＣＧＣＴＧＧＡＣＡＡＡＴＡＴＧＣＧＴＧＴＡＡＣ
ＴＧＴＧＴＡＧＴＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣＧＧＣＧＡＡＣ
ＧＣＴＧＣＣＡＧＴＡＣＣＧＴＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧ
ＧＴＧＧＧＡＡＣＴＧＣＧＧ で表わされる遺伝子を用いることを特徴とするヒト上皮
細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法にある。
第２の発明の特徴は、トリプトファン調節遺伝子につな
がったトリプトファンオペロンのｔｒｐＥポリペプタイ
ドのＮ末側をコードした遺伝子とヒト上皮細胞増殖因子
の５３個のアミノ酸をコードした遺伝子ガリンカーを介
して結合した次のＤＮＡ配列 ＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＴＴＴＣＧＴＧＧＡＡＴＴＣＧ
ＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＡＧＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣ
ＣＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＣＣＣＧＣＴＧＴＣＣＣＡＣ
ＧＡＴＧＧＴＴＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＣＧＡＣＧＧＣＧ
ＴＴＴＧＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＧＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡ
ＣＡＡＡＴＡＴＧＣＧＴＧＴＡＡＣＴＧＴＧＴＡＧＴＡ
ＧＧＣＴＡＣＡＴＣＧＧＣＧＡＡＣＧＣＴＧＣＣＡＧＴ
ＡＣＣＧＴＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＣＴ
ＧＣＧＣ で表わされる遺伝子を用いることを特徴とするヒト上皮
細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法にある。
がったトリプトファンオペロンのｔｒｐＥポリペプタイ
ドのＮ末側をコードした遺伝子とヒト上皮細胞増殖因子
の５３個のアミノ酸をコードした遺伝子ガリンカーを介
して結合した次のＤＮＡ配列 ＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＴＴＴＣＧＴＧＧＡＡＴＴＣＧ
ＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＡＧＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣ
ＣＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＣＣＣＧＣＴＧＴＣＣＣＡＣ
ＧＡＴＧＧＴＴＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＣＧＡＣＧＧＣＧ
ＴＴＴＧＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＧＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡ
ＣＡＡＡＴＡＴＧＣＧＴＧＴＡＡＣＴＧＴＧＴＡＧＴＡ
ＧＧＣＴＡＣＡＴＣＧＧＣＧＡＡＣＧＣＴＧＣＣＡＧＴ
ＡＣＣＧＴＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＣＴ
ＧＣＧＣ で表わされる遺伝子を用いることを特徴とするヒト上皮
細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法にある。
第３の発明の特徴は、トリプトファン調節遺伝子とヒト
上皮細胞増殖因子の５３個のアミノ酸をコードした遺伝
子がリンカ−を介して結合した次のＤＮＡ配列 ＡＴＧＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣＣ：ＧＡＣＴＧＧＧ
ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＡＧＡＡＡ
ＴＧＡＡＣＴＣＣＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＣＣＣＧＣＴ
ＧＴＣＣＣＡＣＧＡＴＧＧＴＴＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＣ
ＧＡＣＧＧＣＧＴＴＴＴＧＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＧＡＧ
ＧＣＧＣＴＧＧＡＣＡＡＡＴＡＴＧＣＧＴＧＴＡＡＣＴ
ＧＴＧＴＡＧＴＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣＧＧＣＧＡＡＣＧ
ＣＴＧＣＣＡＧＴＡＣＣＧＴＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧ
ＴＧＧＧＡＡＣＴＧＣＧＣ で表わされる遺伝子とを有するプラスミドベクターを用
いることを特徴とするヒト上皮細胞増殖因子の遺伝子工
学的生産方法にある。
上皮細胞増殖因子の５３個のアミノ酸をコードした遺伝
子がリンカ−を介して結合した次のＤＮＡ配列 ＡＴＧＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣＣ：ＧＡＣＴＧＧＧ
ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＡＧＡＡＡ
ＴＧＡＡＣＴＣＣＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＣＣＣＧＣＴ
ＧＴＣＣＣＡＣＧＡＴＧＧＴＴＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＣ
ＧＡＣＧＧＣＧＴＴＴＴＧＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＧＡＧ
ＧＣＧＣＴＧＧＡＣＡＡＡＴＡＴＧＣＧＴＧＴＡＡＣＴ
ＧＴＧＴＡＧＴＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣＧＧＣＧＡＡＣＧ
ＣＴＧＣＣＡＧＴＡＣＣＧＴＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧ
ＴＧＧＧＡＡＣＴＧＣＧＣ で表わされる遺伝子とを有するプラスミドベクターを用
いることを特徴とするヒト上皮細胞増殖因子の遺伝子工
学的生産方法にある。
第４の発明の特徴は、トリプトファン調節遺伝子とヒト
上皮細胞増殖因子の５３個のアミノ酸をコードした遺伝
子ガリンカーを介して結合した次のＤＮＡ配列 ＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＴＴＴＣＧＴＧＧＡＡＴＴＣＧ
ＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＡＧＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣ
ＣＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＣＣＣＧＣＴＧＴＣＣＣＡＣ
ＧＡＴＧＧＴＴＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＣＧＡＣＧＧＣＧ
ＴＴＴＧＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＧＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡ
ＣＡＡＡＴＡＴＧＣＧＴＧＴＡＡＣＴＧＴＧＴＡＧＴＡ
ＧＧＣＴＡＣＡＴＣＧＧＣＧＡＡＣＧＣＴＧＣＣＡＧＴ
ＡＣＣＧＴＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＴＧ
ＣＧＣ で表わされる遺伝子とを有するプラスミドベクターを用
いることを特徴とするヒト上皮細胞増殖因子の遺伝子工
学的生産方法にある。
上皮細胞増殖因子の５３個のアミノ酸をコードした遺伝
子ガリンカーを介して結合した次のＤＮＡ配列 ＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＴＴＴＣＧＴＧＧＡＡＴＴＣＧ
ＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＡＧＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣ
ＣＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＣＣＣＧＣＴＧＴＣＣＣＡＣ
ＧＡＴＧＧＴＴＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＣＧＡＣＧＧＣＧ
ＴＴＴＧＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＧＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡ
ＣＡＡＡＴＡＴＧＣＧＴＧＴＡＡＣＴＧＴＧＴＡＧＴＡ
ＧＧＣＴＡＣＡＴＣＧＧＣＧＡＡＣＧＣＴＧＣＣＡＧＴ
ＡＣＣＧＴＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＴＧ
ＣＧＣ で表わされる遺伝子とを有するプラスミドベクターを用
いることを特徴とするヒト上皮細胞増殖因子の遺伝子工
学的生産方法にある。
第５の発明の特徴は、トリプトファン調節遺伝子ヒト上
皮細胞増殖因子の５３個のアミノ酸をコードした遺伝子
がリンカ−を介して結合した次のＤＮＡ配列 ＡＴＧＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣＣＧＡＣＴＧＧＧＧ
ＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＡＧＡＡＡＴ
ＧＡＡＣＴＣＣＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＣＣＣＧＣＴＧ
ＴＣＣＣＡＣＧＡＴＧＧＴＴＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＣＧ
ＡＣＧＧＣＧＴＴＴＴＧＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＧＡＧＧ
ＣＧＣＴＧＧＡＣＡＡＡＴＡＴＧＣＧＴＧＴＡＡＣＴＧ
ＴＧＴＡＧＴＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣＧＧＣＧＡＡＣＧＣ
ＴＧＣＣＡＧＴＡＣＣＧＴＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧＴ
ＧＧＧＡＡＣＴＧＣＧＣ で表わされる遺伝子とを有するプラスミドベクターを保
持する大腸菌を用いることを特徴とするヒト上皮細胞増
殖因子の遺伝子工学的生産方法にある。
皮細胞増殖因子の５３個のアミノ酸をコードした遺伝子
がリンカ−を介して結合した次のＤＮＡ配列 ＡＴＧＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣＣＧＡＣＴＧＧＧＧ
ＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＡＧＡＡＡＴ
ＧＡＡＣＴＣＣＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＣＣＣＧＣＴＧ
ＴＣＣＣＡＣＧＡＴＧＧＴＴＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＣＧ
ＡＣＧＧＣＧＴＴＴＴＧＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＧＡＧＧ
ＣＧＣＴＧＧＡＣＡＡＡＴＡＴＧＣＧＴＧＴＡＡＣＴＧ
ＴＧＴＡＧＴＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣＧＧＣＧＡＡＣＧＣ
ＴＧＣＣＡＧＴＡＣＣＧＴＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧＴ
ＧＧＧＡＡＣＴＧＣＧＣ で表わされる遺伝子とを有するプラスミドベクターを保
持する大腸菌を用いることを特徴とするヒト上皮細胞増
殖因子の遺伝子工学的生産方法にある。
第６の発明の特徴は、トリプトファン調節遺伝子とヒト
上皮細胞増殖因子の５３個のアミノ酸をコードした遺伝
子ガリンカーを介して結合した次のＤＮＡ配列 ＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＴＴＴＣＧＴＧＧＡＡＴＴＣＧ
ＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＡＧＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣ
ＣＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＣＣＣＧＣＴＧＴＣＣＣＡＣ
ＧＡＴＧＧＴＴＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＣＧＡＣＧＧＣＧ
ＴＴＴＧＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＧＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡ
ＣＡＡＡＴＡＴＧＣＧＴＧＴＡＡＣＴＧＴＧＴＡＧＴＡ
ＧＧＣＴＡＣＡＴＣＧＧＣＯＡＡＣＧＣＴＧＣＣＡＧＴ
ＡＣＣＧＴＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＴＧ
ＣＧＣ で表わされる遺伝子とを有するプラスミドベクターを保
持する大腸菌を用いることを特徴とするヒト上皮細胞増
殖因子の遺伝子工学的生産方法にある。
上皮細胞増殖因子の５３個のアミノ酸をコードした遺伝
子ガリンカーを介して結合した次のＤＮＡ配列 ＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＴＴＴＣＧＴＧＧＡＡＴＴＣＧ
ＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＡＧＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣ
ＣＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＣＣＣＧＣＴＧＴＣＣＣＡＣ
ＧＡＴＧＧＴＴＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＣＧＡＣＧＧＣＧ
ＴＴＴＧＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＧＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡ
ＣＡＡＡＴＡＴＧＣＧＴＧＴＡＡＣＴＧＴＧＴＡＧＴＡ
ＧＧＣＴＡＣＡＴＣＧＧＣＯＡＡＣＧＣＴＧＣＣＡＧＴ
ＡＣＣＧＴＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＴＧ
ＣＧＣ で表わされる遺伝子とを有するプラスミドベクターを保
持する大腸菌を用いることを特徴とするヒト上皮細胞増
殖因子の遺伝子工学的生産方法にある。
第７の発明の特徴は、第５の発明において、誘導物質と
してＩＡ（３−β−インドールアクリル酸）を添加して
培養された大腸菌を用いるヒト上皮細胞増殖因子の遺伝
子工学的生産方法にある。
してＩＡ（３−β−インドールアクリル酸）を添加して
培養された大腸菌を用いるヒト上皮細胞増殖因子の遺伝
子工学的生産方法にある。
第８の発明の特徴は、第６の発明において、誘導物質と
してＩＡ（８−β−インドールアクリルａ）を添加して
培養された大腸菌を用いるヒト上皮細胞増殖因子の遺伝
子工学的生産方法にある。
してＩＡ（８−β−インドールアクリルａ）を添加して
培養された大腸菌を用いるヒト上皮細胞増殖因子の遺伝
子工学的生産方法にある。
第９の発明の特徴は、第５の発明において、トリプトフ
ァンを含まない培地を用いて培養された大腸菌を用いる
ヒト上皮細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法にある。
ァンを含まない培地を用いて培養された大腸菌を用いる
ヒト上皮細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法にある。
第１０の発明の特徴は、第６の発明において、トリプト
ファンを含まない培地を用いて培養された大腸菌を用い
るヒト上皮細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法にある
。
ファンを含まない培地を用いて培養された大腸菌を用い
るヒト上皮細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法にある
。
５３個のアミノ酸よりなるｈＥＧＦの配列情報を担う構
造遺伝子ＤＮＡを得るためには、ｈＥＧＦのアミノ酸配
列から予測される何通りかの遺伝子の塩基配列のうち、
その中で使われている遺伝子コドンが使用する宿主大腸
菌中で出現頻度の高いものであるかどうか、またこれを
有機合成する際に、ミスの起り難い構造であるかどうか
、さらにはＤＮＡから転写されたｍ ＲＮ Ａが２次構
造を形成し易いためにリポソームによる翻訳の効率低下
が生じないかどうかを考慮の上、最も適切と思われる塩
基配列１つを選び、それを有機化学合成した。有機化学
合成したｈＥＧＦの塩基配列を第１図に示す、５３個の
アミノ酸に対応した塩基配列の前には翻訳開始コドンで
あるＡＴＧ （これはアミノ酸のメチオニン（Ｍｅｔ）
に対応する。）と塩基配列の後には翻訳停止コドンであ
るＴＡＡとＴＡＧを２連結した。ＡＴＧの前にはリンカ
−として２３個の塩基を連結し、末端を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ部位に設計した。また停止コドンの部分は制限酵素
ＢａｍＨＩ部位にした。
造遺伝子ＤＮＡを得るためには、ｈＥＧＦのアミノ酸配
列から予測される何通りかの遺伝子の塩基配列のうち、
その中で使われている遺伝子コドンが使用する宿主大腸
菌中で出現頻度の高いものであるかどうか、またこれを
有機合成する際に、ミスの起り難い構造であるかどうか
、さらにはＤＮＡから転写されたｍ ＲＮ Ａが２次構
造を形成し易いためにリポソームによる翻訳の効率低下
が生じないかどうかを考慮の上、最も適切と思われる塩
基配列１つを選び、それを有機化学合成した。有機化学
合成したｈＥＧＦの塩基配列を第１図に示す、５３個の
アミノ酸に対応した塩基配列の前には翻訳開始コドンで
あるＡＴＧ （これはアミノ酸のメチオニン（Ｍｅｔ）
に対応する。）と塩基配列の後には翻訳停止コドンであ
るＴＡＡとＴＡＧを２連結した。ＡＴＧの前にはリンカ
−として２３個の塩基を連結し、末端を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ部位に設計した。また停止コドンの部分は制限酵素
ＢａｍＨＩ部位にした。
トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータを有する発現ベク
ターＰＴＲＥ２は大腸菌のｔｒｐオペロンのプロモータ
、ｔｒｐＬ（リーダーペプタイド）及びｔｒｐＥ（アン
トラニル酸合成酵素）の先端部分の一部を含む波５００
ｂ ｐ （ｂａｓｅ ｐａｉｅｒｓ）のＤＮＡ断片を
ｐＢＲ３２２プラスミドのＥｃｏＲＩ部位に挿入したも
のである。ｔｒｐプロモータの向きはｐＢＲ３２２のＴ
ｃ（テトラサイクリン耐性遺伝子）の向きであり、また
ｔｒｐプロモータの上流側のＥｃｏＲＩ部位ＤＮＡポリ
メラーゼエで埋めて欠失させ、プロモータ下流側のＥｃ
ｏＲＩ部位のみに改良したものである。第２図に発現ベ
クターｐＴＲＥ２のｔｒｐプロモータ下流域の塩基配列
を示す。ｔｒｐＥポリペプタイド遺伝子中のＥｃｏＲＩ
部位に外来遺伝子を伝結することでｔｒＰＥポリペプタ
イドのＮ末端側８個のアミノ酸と融合した形で外来遺伝
子の発現が可能である。
ターＰＴＲＥ２は大腸菌のｔｒｐオペロンのプロモータ
、ｔｒｐＬ（リーダーペプタイド）及びｔｒｐＥ（アン
トラニル酸合成酵素）の先端部分の一部を含む波５００
ｂ ｐ （ｂａｓｅ ｐａｉｅｒｓ）のＤＮＡ断片を
ｐＢＲ３２２プラスミドのＥｃｏＲＩ部位に挿入したも
のである。ｔｒｐプロモータの向きはｐＢＲ３２２のＴ
ｃ（テトラサイクリン耐性遺伝子）の向きであり、また
ｔｒｐプロモータの上流側のＥｃｏＲＩ部位ＤＮＡポリ
メラーゼエで埋めて欠失させ、プロモータ下流側のＥｃ
ｏＲＩ部位のみに改良したものである。第２図に発現ベ
クターｐＴＲＥ２のｔｒｐプロモータ下流域の塩基配列
を示す。ｔｒｐＥポリペプタイド遺伝子中のＥｃｏＲＩ
部位に外来遺伝子を伝結することでｔｒＰＥポリペプタ
イドのＮ末端側８個のアミノ酸と融合した形で外来遺伝
子の発現が可能である。
ｔｒｐプロモータを有する発現ベクターｐＴＲＬ２はｐ
ＴＲＥ２のリーダーペプタイド遺伝子のＮ末側にある制
限酵素ＲａａＩ部以下を削除した後、当該Ｒ８ａＩ部位
をＥｃｏＲＩ部位に改良したものである。第３図に発現
ベクターｐＴＲＬ２のｔｒｐプロモータ下流域の塩基配
列を示す。ｔ ｒｐＬポリペプタイド遺伝子中のＥｃｏ
Ｒ１部位に外来遺伝子を連結することでｔｒｐＬポリペ
プタイドのＮ末端側６個のアミノ酸と融合した形で外来
遺伝子の発現が可能である。
ＴＲＥ２のリーダーペプタイド遺伝子のＮ末側にある制
限酵素ＲａａＩ部以下を削除した後、当該Ｒ８ａＩ部位
をＥｃｏＲＩ部位に改良したものである。第３図に発現
ベクターｐＴＲＬ２のｔｒｐプロモータ下流域の塩基配
列を示す。ｔ ｒｐＬポリペプタイド遺伝子中のＥｃｏ
Ｒ１部位に外来遺伝子を連結することでｔｒｐＬポリペ
プタイドのＮ末端側６個のアミノ酸と融合した形で外来
遺伝子の発現が可能である。
上記した発現ベクターｐＴＲＥ２及びｐＴＲＬ２のＥｃ
ｏＲ１部位に第１図に示したｈＲＧＦ遺伝子のＥｃｏＲ
１部位を連結して、ｈＥＧＦ遺伝子を発現させるのであ
る。連結したベクターはｈＥＧＦポリペプタイドのＮ末
端側に、それぞれ１７個と１５個のアミノ酸が結合した
融合蛋白質としてｈＥＧＦを生産する。余分なアミノ酸
を含まない成熟ｈＥＧＦのみを得るためには、ＣＮＢ、
（ブロムシアン）処理でＭｅｔの位置で余分なアミノ酸
を切断除去する方法を用いることができる。しかし、ｈ
ＥＧＦの２１番目のアミノ酸がＭｅｔであるので、この
部分も切断される可能性があるけれども、このＭｅｔは
ＣＮＢｒ処理で切断され難いといわれている（Ｈ，Ｇｒ
ｅｇｏｒｙ ａｎｄ Ｂ、 Ｍ。
ｏＲ１部位に第１図に示したｈＲＧＦ遺伝子のＥｃｏＲ
１部位を連結して、ｈＥＧＦ遺伝子を発現させるのであ
る。連結したベクターはｈＥＧＦポリペプタイドのＮ末
端側に、それぞれ１７個と１５個のアミノ酸が結合した
融合蛋白質としてｈＥＧＦを生産する。余分なアミノ酸
を含まない成熟ｈＥＧＦのみを得るためには、ＣＮＢ、
（ブロムシアン）処理でＭｅｔの位置で余分なアミノ酸
を切断除去する方法を用いることができる。しかし、ｈ
ＥＧＦの２１番目のアミノ酸がＭｅｔであるので、この
部分も切断される可能性があるけれども、このＭｅｔは
ＣＮＢｒ処理で切断され難いといわれている（Ｈ，Ｇｒ
ｅｇｏｒｙ ａｎｄ Ｂ、 Ｍ。
Ｐｒｅｓｔｏｎ； Ｉｎｔ、 Ｊ、 Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ、。
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ、。
９、１０７−１１８（１９７７））ので、処理条件を選
択することにより成熟ｈＥＧＦを得ることが可能である
。
択することにより成熟ｈＥＧＦを得ることが可能である
。
以下、本発明の実施例について具体的に説明するが、本
発明はこれによりなんら限定されるものではない。
発明はこれによりなんら限定されるものではない。
実施例１゜
ｈＥＧＦの構造遺伝子及びリンカ−領域のＤＮＡ塩基配
列設計とその合成について述べる。第１図にｈＥＧＦの
アミノ酸配列と対応する遺伝子を示す。ｈＥＧＦのアミ
ノ酸配列はＧ ｒｅｇｏｒｙらにより決定されているの
で、その構造遺伝子は、アミノ酸、遺伝子コドンの対応
表から予測できる。
列設計とその合成について述べる。第１図にｈＥＧＦの
アミノ酸配列と対応する遺伝子を示す。ｈＥＧＦのアミ
ノ酸配列はＧ ｒｅｇｏｒｙらにより決定されているの
で、その構造遺伝子は、アミノ酸、遺伝子コドンの対応
表から予測できる。
しかし、遺伝子コドン側に一部重複があるため、この対
応は一義的でない。そこで、宿主別遺伝子コドン出現頻
度表（地材、細胞工学、Ｖｏｌ、２、Ｎｎ１３．ｐ７８
−８９ （１９８３））を参考に大腸菌体内で出現頻度
の高い遺伝子コドンを各アミノ酸毎に選択し、それらの
みからなる１５９塩基の構造遺伝子をまず設計した。さ
らに、翻訳開始コドンＡＴＧの上流に制限酵素ｘｂ、ｒ
とＢａｍＨＩの認識・切断部位を設け、全長１９１塩基
対の２本鎖ＤＮＡを設計した。ところが、公知のＤＮＡ
合成法であるリン酸トリエステル法による一連のＤＮＡ
鎖伸長反応操作では、第１図に示したような長鎖ＤＮＡ
を一気に合成することはできない、すなわち、１塩基分
の伸長反応の収率を９０％としても２０回くり返すと全
体での収率は１２％程度となり精製が困難になる。そこ
で実際には、第１図の長鎖２本ｌＩ４ＤＮＡを第４図に
示すように２８本の１本鎖オリゴヌクレオチドのブロッ
ク（Ａ−１〜Ａ−１４，Ｂ−１〜Ｂ−１４）に分割し、
それぞれを、リン酸トリエステル法によるＤＮＡ鎖伸長
反応で合成した。このブロック化に際しては、これらの
ブロックを１つにまとめてｈＥＧＦの遺伝子を作製する
ときに、ブロック間に不適切な相互作用が生じて、正し
くない構造の遺伝子が形成されることのないように、各
ブロックの塩基配列を最適化した。
応は一義的でない。そこで、宿主別遺伝子コドン出現頻
度表（地材、細胞工学、Ｖｏｌ、２、Ｎｎ１３．ｐ７８
−８９ （１９８３））を参考に大腸菌体内で出現頻度
の高い遺伝子コドンを各アミノ酸毎に選択し、それらの
みからなる１５９塩基の構造遺伝子をまず設計した。さ
らに、翻訳開始コドンＡＴＧの上流に制限酵素ｘｂ、ｒ
とＢａｍＨＩの認識・切断部位を設け、全長１９１塩基
対の２本鎖ＤＮＡを設計した。ところが、公知のＤＮＡ
合成法であるリン酸トリエステル法による一連のＤＮＡ
鎖伸長反応操作では、第１図に示したような長鎖ＤＮＡ
を一気に合成することはできない、すなわち、１塩基分
の伸長反応の収率を９０％としても２０回くり返すと全
体での収率は１２％程度となり精製が困難になる。そこ
で実際には、第１図の長鎖２本ｌＩ４ＤＮＡを第４図に
示すように２８本の１本鎖オリゴヌクレオチドのブロッ
ク（Ａ−１〜Ａ−１４，Ｂ−１〜Ｂ−１４）に分割し、
それぞれを、リン酸トリエステル法によるＤＮＡ鎖伸長
反応で合成した。このブロック化に際しては、これらの
ブロックを１つにまとめてｈＥＧＦの遺伝子を作製する
ときに、ブロック間に不適切な相互作用が生じて、正し
くない構造の遺伝子が形成されることのないように、各
ブロックの塩基配列を最適化した。
第５図には、ポリスチレン樹脂に結合したモノヌクレオ
チド（ａ）に憩のモノヌクレオチド（ｂ）を縮重合させ
、ジヌクレオチド（Ｑ）を合成するプロセスを示した。
チド（ａ）に憩のモノヌクレオチド（ｂ）を縮重合させ
、ジヌクレオチド（Ｑ）を合成するプロセスを示した。
ｎコのヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを合成
するためには、本工程を（ｎ−１）回くり返せば良い。
するためには、本工程を（ｎ−１）回くり返せば良い。
反応は常法に従った・
第６図には、Ｔ４リガーゼを使用した、ブロック化オリ
ゴヌクレオチドの連結手順を示す。２８ブロツクを一挙
に連結すると正しくない組合せが生ずる恐れがあったの
で、２段階の連結法を採用した。反応は常法に従った。
ゴヌクレオチドの連結手順を示す。２８ブロツクを一挙
に連結すると正しくない組合せが生ずる恐れがあったの
で、２段階の連結法を採用した。反応は常法に従った。
以上のようにして有機化学合成したｈＥＧＦ遺伝子をプ
ラスミドｐＢＲ３２２を制限酵素ＥＣＯＲ工とＢａｍＨ
Ｉにより切断することにより生じた開裂部分に挿入し、
ｈＥＧＦ遺伝子を含むプラスミドｐＢＲＥＧＦを得た（
第７図）。
ラスミドｐＢＲ３２２を制限酵素ＥＣＯＲ工とＢａｍＨ
Ｉにより切断することにより生じた開裂部分に挿入し、
ｈＥＧＦ遺伝子を含むプラスミドｐＢＲＥＧＦを得た（
第７図）。
実施例２゜
複合プラスミドｐＴＲＥＢＴ１の作製方法について述べ
る第８図）。約３μｇのｐＴＲＥ２と約５１ｊｇのｐ
Ｂ ＲＥ Ｇ Ｆを制限酵素ＥｃｏＲＩと５ａＲＩそれ
ぞれ５６Ｕと６０Ｕを用いて切断後、アガロース電気泳
動を行い、ｐＴＲＥ２からはｔｒｐプロモータを含む４
．２１ｋｂ（キロベースペアー）、ｐＢＲＥＧＦからは
ｈＥＧＦ遺伝子を含む０．４７ ｋ ｂのＤＮＡ断片を
それぞれ回収した。回収したＤＮＡの２断片をＴＥＮ緩
衝液（０，０２ＭＴｒｉｓ−ＨＣＱ、１ ｍ Ｍ Ｅ
Ｄ Ｔ Ａ 。
る第８図）。約３μｇのｐＴＲＥ２と約５１ｊｇのｐ
Ｂ ＲＥ Ｇ Ｆを制限酵素ＥｃｏＲＩと５ａＲＩそれ
ぞれ５６Ｕと６０Ｕを用いて切断後、アガロース電気泳
動を行い、ｐＴＲＥ２からはｔｒｐプロモータを含む４
．２１ｋｂ（キロベースペアー）、ｐＢＲＥＧＦからは
ｈＥＧＦ遺伝子を含む０．４７ ｋ ｂのＤＮＡ断片を
それぞれ回収した。回収したＤＮＡの２断片をＴＥＮ緩
衝液（０，０２ＭＴｒｉｓ−ＨＣＱ、１ ｍ Ｍ Ｅ
Ｄ Ｔ Ａ 。
０．０２ＭＮａＣｕ、ｐ Ｈ８、０）に溶解後、回収し
たｔｒｐプロモータＤＮＡの１／６量に回収したｈＥＧ
ＦＤＮＡの１／３量を加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１５０
０Ｕ （全量２ｏμＱ）を用いて連結した。この連結し
たプラスミドで大腸菌Ｃ６００株を形質転換したところ
、２個の形質転換株が得られた。こうして得られた形質
転換株を培養して得た複合プラスミドｐＴＲＥＢＴ１を
用いて大腸乱ＨＢＩＯＩ株を形質転換し、複合プラスミ
ドｐＴＲＥＢＴ１を保持する大腸菌ＨＢＩＯ１、［ＰＴ
ＲＥＢＴ１］ （微工研菌寄第９９０８号）を得るこ
とができた。
たｔｒｐプロモータＤＮＡの１／６量に回収したｈＥＧ
ＦＤＮＡの１／３量を加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１５０
０Ｕ （全量２ｏμＱ）を用いて連結した。この連結し
たプラスミドで大腸菌Ｃ６００株を形質転換したところ
、２個の形質転換株が得られた。こうして得られた形質
転換株を培養して得た複合プラスミドｐＴＲＥＢＴ１を
用いて大腸乱ＨＢＩＯＩ株を形質転換し、複合プラスミ
ドｐＴＲＥＢＴ１を保持する大腸菌ＨＢＩＯ１、［ＰＴ
ＲＥＢＴ１］ （微工研菌寄第９９０８号）を得るこ
とができた。
実施例３゜
複合プラスミドＰＴＲＬＢＴＩの作製方法について述べ
る（第９図）。約２．５μｇのｐＢＲＥＧＦを制限酵素
ＥｃｏＲＩと５ａＩ２Ｉそれぞれ１６ Ｕを用いて切断
後、ポリアクリルアミド電気泳動を行い、ｈＥＧＦ遺伝
子を含む０．４７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。フェノ
ール処理によりＤＮＡを精製後、ＤＮＡリガーゼ緩衝液
（０，１ＭＴｒｉｓ−ＨＣＱ、、５ｍＭＭｇＣＩ２２、
ＰＨ７，６）２０μΩに溶解した。一方、約１μｇのｐ
ＴＲＬ２を制限酵素ＥｃｏＲＩと５ａＱＩそれぞれ８Ｕ
を用いて切断後、バクチリアルアルカリンホスファター
ゼ１．２Ｕを用いてホスファターゼ処理を行った。続い
てフェノール処理を３回行った後、ＤＮＡリガーゼ緩衝
液２０μΩに溶解した。ｈＥＧＦＤＮＡ液５μＱに上記
したｐＴＲＬ２液２μＱと宝酒造ＫＫ製ＤＮＡライゲー
ションキットのＡ液３０μＱとＢ液５μＱを加えて、全
量４２μＱとし、室温で３０分間ＤＮＡ連結反応を行っ
た。この連結したプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１株を形
質転換したところ、３，５千個以上の形質転換株が得ら
れた。こうして得られた形質転換株を培養して得たプラ
スミドを制限酵素で切断して、出現するＤＮＡ断片を検
定したところ、本プラスミドはｐＴＲＬＢＴｌに相異な
いことがわかった。このように複合プラミドｐＴＲＬＢ
Ｔ１を保持する大腸菌ＨＢＩＯＩ ［ｐＴＲＬＢＴｌコ
（微工研菌寄第９９０７号）を得ることができた。
る（第９図）。約２．５μｇのｐＢＲＥＧＦを制限酵素
ＥｃｏＲＩと５ａＩ２Ｉそれぞれ１６ Ｕを用いて切断
後、ポリアクリルアミド電気泳動を行い、ｈＥＧＦ遺伝
子を含む０．４７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。フェノ
ール処理によりＤＮＡを精製後、ＤＮＡリガーゼ緩衝液
（０，１ＭＴｒｉｓ−ＨＣＱ、、５ｍＭＭｇＣＩ２２、
ＰＨ７，６）２０μΩに溶解した。一方、約１μｇのｐ
ＴＲＬ２を制限酵素ＥｃｏＲＩと５ａＱＩそれぞれ８Ｕ
を用いて切断後、バクチリアルアルカリンホスファター
ゼ１．２Ｕを用いてホスファターゼ処理を行った。続い
てフェノール処理を３回行った後、ＤＮＡリガーゼ緩衝
液２０μΩに溶解した。ｈＥＧＦＤＮＡ液５μＱに上記
したｐＴＲＬ２液２μＱと宝酒造ＫＫ製ＤＮＡライゲー
ションキットのＡ液３０μＱとＢ液５μＱを加えて、全
量４２μＱとし、室温で３０分間ＤＮＡ連結反応を行っ
た。この連結したプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１株を形
質転換したところ、３，５千個以上の形質転換株が得ら
れた。こうして得られた形質転換株を培養して得たプラ
スミドを制限酵素で切断して、出現するＤＮＡ断片を検
定したところ、本プラスミドはｐＴＲＬＢＴｌに相異な
いことがわかった。このように複合プラミドｐＴＲＬＢ
Ｔ１を保持する大腸菌ＨＢＩＯＩ ［ｐＴＲＬＢＴｌコ
（微工研菌寄第９９０７号）を得ることができた。
実施例４゜
大腸菌によるｈＥＧＦの生産について述べる。
大腸菌ＨＢＩＯＩ ［ｐＴＲＥＢＴ１］と大腸菌ＨＢＩ
Ｏ１，［ｐＴＲＬＢＴ１］をそれぞれ次のように培養し
てｈＥＧＦを製造した。
Ｏ１，［ｐＴＲＬＢＴ１］をそれぞれ次のように培養し
てｈＥＧＦを製造した。
保存菌株の１白金耳を１０ ｍ ｍのＬ培地（ペプトン
Ｌｏｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ２５ｇ、グルコース
１ｇ、アンピシリン５０ ｍ ｇ、水１Ω、ｐＨ７，２
）に接種し、３７℃で一晩培養した。
Ｌｏｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ２５ｇ、グルコース
１ｇ、アンピシリン５０ ｍ ｇ、水１Ω、ｐＨ７，２
）に接種し、３７℃で一晩培養した。
前培養液の１ｍ１２を採取し、１５０００ｒｐｍで１分
間遠心分離し、菌体を回収した後、１ｍ１ｌｔのＭ９培
地（Ｎ Ｈ４ＣＱ １ ｇ −Ｎ ａ ２ＨＰ○４６
ｇ、ＫＨ２ＰＯ４３ｇ、ＮａＣＱ ０．５ｇ、ＣａＣ
Ｑ２・２Ｈ２００，０１５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００
，１ｇ、カザミノ酸 ２．５ｇ、グルコース ５ｇ、チ
アミン ０．１ｇ、アンピシリン ５０ ｍ ｇ、水
ＩＱ＋ ｐＨ７，４）で洗浄した。菌体を１ｍｎのＭ９
培地に懸濁全量を１０ｍ２のＭ９培地に接種し、３７℃
で７時間培養した。培養１時間目には遺伝子を発現させ
るために、ＩＡ （３−β−インドールアクリル酸）を
１５μｇ ／ ｍ Ｑになるように添加した。培養終了
後集菌し、菌体を５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＱ緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）２ｍＲで洗浄後、同緩衝液１ｍＱに菌体を懸
濁した。菌体懸濁液に１８μＱのフェニルメチルスルホ
ニルフルオライド（濃度１０ｍｇ／ｍＱ） 、１０ｔｔ
Ｑのリゾチーム（濃度１０ｍｇ／ｒｎＱ）及び２０μ０
の０ 、２５ ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａを添加し撹拌後、水
中に３０分間保持した。続いて想濁液を３分間超音処理
したところ、液は透明になった。当該溶液に８Ｍ尿素液
を１．０５ｍＱ添加し、３７℃で６０分間振どう後、３
００００ｒｐｍで３０分間遠心分難し、沈でんを除去し
た。続いて５０ ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｎ緩衝液を透析外
液として。
間遠心分離し、菌体を回収した後、１ｍ１ｌｔのＭ９培
地（Ｎ Ｈ４ＣＱ １ ｇ −Ｎ ａ ２ＨＰ○４６
ｇ、ＫＨ２ＰＯ４３ｇ、ＮａＣＱ ０．５ｇ、ＣａＣ
Ｑ２・２Ｈ２００，０１５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００
，１ｇ、カザミノ酸 ２．５ｇ、グルコース ５ｇ、チ
アミン ０．１ｇ、アンピシリン ５０ ｍ ｇ、水
ＩＱ＋ ｐＨ７，４）で洗浄した。菌体を１ｍｎのＭ９
培地に懸濁全量を１０ｍ２のＭ９培地に接種し、３７℃
で７時間培養した。培養１時間目には遺伝子を発現させ
るために、ＩＡ （３−β−インドールアクリル酸）を
１５μｇ ／ ｍ Ｑになるように添加した。培養終了
後集菌し、菌体を５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＱ緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）２ｍＲで洗浄後、同緩衝液１ｍＱに菌体を懸
濁した。菌体懸濁液に１８μＱのフェニルメチルスルホ
ニルフルオライド（濃度１０ｍｇ／ｍＱ） 、１０ｔｔ
Ｑのリゾチーム（濃度１０ｍｇ／ｒｎＱ）及び２０μ０
の０ 、２５ ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａを添加し撹拌後、水
中に３０分間保持した。続いて想濁液を３分間超音処理
したところ、液は透明になった。当該溶液に８Ｍ尿素液
を１．０５ｍＱ添加し、３７℃で６０分間振どう後、３
００００ｒｐｍで３０分間遠心分難し、沈でんを除去し
た。続いて５０ ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｎ緩衝液を透析外
液として。
３回透析し、ラジオレセプタアッセイ（ＲＲＡ）ＲＲＡ
は次のように実施した。ｈＥＧＦ活性は同じ活性を示す
マウスＥＧＦ標準の重量で表わした。マウスミクロゾー
ム分画０．２ｍΩに標性マウスＥＧＦまたは検体０ 、
１ ｍ Ｑと工１３１標識マウスＥ Ｇ Ｆ ０ 、１
ｍ （１を加え撹拌後、室温で９０分間反応させた。
は次のように実施した。ｈＥＧＦ活性は同じ活性を示す
マウスＥＧＦ標準の重量で表わした。マウスミクロゾー
ム分画０．２ｍΩに標性マウスＥＧＦまたは検体０ 、
１ ｍ Ｑと工１３１標識マウスＥ Ｇ Ｆ ０ 、１
ｍ （１を加え撹拌後、室温で９０分間反応させた。
４℃、６００００Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引除
去した後、沈でんの放射能を測定した。このようにして
測定した培養液１ｍＱ当りのｈＥＧＦ活性を第１表に示
す。
去した後、沈でんの放射能を測定した。このようにして
測定した培養液１ｍＱ当りのｈＥＧＦ活性を第１表に示
す。
第１表 ｈＥＧＦの大腸菌による生産
実施例５゜
大腸菌ＨＢＩＯＩ ［ｐＴＲＥＢＴ１］を用いて流加培
養した結果について述べる。５Ｑの小型培養装置にＭ９
培養（この場合グルコース１ｇ／Ｑ、トリプトファン２
０ ｍ ｇ ／ Ｑを含む）を１．８Ω仕込んだ後、前
培養液２００ｍＭを接種して培養を開始した。グルコー
スが消費された１、５時間口より流加培地（グルコース
２００ｇ、カザミノ酸１００ｇ、アンピシリン０．１ｇ
、水ＩＱ、ｐＨ７，０）を酢酸濃度を指標として流加し
た。
養した結果について述べる。５Ｑの小型培養装置にＭ９
培養（この場合グルコース１ｇ／Ｑ、トリプトファン２
０ ｍ ｇ ／ Ｑを含む）を１．８Ω仕込んだ後、前
培養液２００ｍＭを接種して培養を開始した。グルコー
スが消費された１、５時間口より流加培地（グルコース
２００ｇ、カザミノ酸１００ｇ、アンピシリン０．１ｇ
、水ＩＱ、ｐＨ７，０）を酢酸濃度を指標として流加し
た。
つまり、培養液中の酢酸濃度が２ｇ／Ｑ以上になると流
加速度を減少させ、１ｇ／Ｑ以下になると□ 流加速度
を増加させた。この結果、培養８時間口には６０００ｎ
ｇ／ｍＱのｈＥＧＦを生産させることができた。
加速度を減少させ、１ｇ／Ｑ以下になると□ 流加速度
を増加させた。この結果、培養８時間口には６０００ｎ
ｇ／ｍＱのｈＥＧＦを生産させることができた。
本発明によればｈＥＧＦ遺伝子を保持する大腸菌ＨＢＩ
ＯＩ ［ｐＴＲＥＢＴ１］及び大腸菌ＨＢＩＯＩ ［ｐ
ＴＲＬＢＴ１］を得ることができるので、当該大腸菌を
培養することにより１０００ ｎ ｇ ／ ｍ Ｑ以上
のｈＥＧＦを大量生産できる効果ある。
ＯＩ ［ｐＴＲＥＢＴ１］及び大腸菌ＨＢＩＯＩ ［ｐ
ＴＲＬＢＴ１］を得ることができるので、当該大腸菌を
培養することにより１０００ ｎ ｇ ／ ｍ Ｑ以上
のｈＥＧＦを大量生産できる効果ある。
第１図は有機化学合成し先金塩基配列とｈＥＧＦのアミ
ノ酸との対応を示す図、第２図は発現ベクターｐＴＲＥ
２に含まれるｔｒｐプロモータ部分塩基配列を示す図、
第３図は発現ベクターｐＴＲＬ２に含まれるｔｒｐプロ
モータ部分の塩基配列を示す図、第４図は全塩基配列を
２８本の合成オリゴヌクレオチドブロックに分けて示す
図、第５図はオリゴヌクレオチド合成のフローを示す図
、第６図は合成オリゴヌクレオチドブロックの集合及び
連結のフローを示す図、第７図はプラスミドｐＢＲＥＧ
Ｆの作製方法を示す図、第８図は複合プラスミドｐＴＲ
ＥＢＴ１の作製方法を示す図、第９図は複合プラスミド
＠ＴＲＬＢＴＩの作製方法を示す図である。 符号の説明 Ａ・・・・・・アデニン、Ｃ・・・・・・シトシン、Ｇ
・・・・・・グアニン、Ｔ・・・・・・チミン、ＰＢ・
・・・・・ポリブノウボックス、ＳＤ・・・・・・シャ
インダルガルノウ配列、Ａｐ・・・・・・アンピシリン
耐性遺伝子、Ｔｃ・・・・・・テトラサイクリン耐性遺
伝子。 ’ｌ’）％Ｊ リ ト 良く
ト ト づ ＼ｆＣ／ ：
ノＪ−ぢし りｐンド１ト第７図
ノ酸との対応を示す図、第２図は発現ベクターｐＴＲＥ
２に含まれるｔｒｐプロモータ部分塩基配列を示す図、
第３図は発現ベクターｐＴＲＬ２に含まれるｔｒｐプロ
モータ部分の塩基配列を示す図、第４図は全塩基配列を
２８本の合成オリゴヌクレオチドブロックに分けて示す
図、第５図はオリゴヌクレオチド合成のフローを示す図
、第６図は合成オリゴヌクレオチドブロックの集合及び
連結のフローを示す図、第７図はプラスミドｐＢＲＥＧ
Ｆの作製方法を示す図、第８図は複合プラスミドｐＴＲ
ＥＢＴ１の作製方法を示す図、第９図は複合プラスミド
＠ＴＲＬＢＴＩの作製方法を示す図である。 符号の説明 Ａ・・・・・・アデニン、Ｃ・・・・・・シトシン、Ｇ
・・・・・・グアニン、Ｔ・・・・・・チミン、ＰＢ・
・・・・・ポリブノウボックス、ＳＤ・・・・・・シャ
インダルガルノウ配列、Ａｐ・・・・・・アンピシリン
耐性遺伝子、Ｔｃ・・・・・・テトラサイクリン耐性遺
伝子。 ’ｌ’）％Ｊ リ ト 良く
ト ト づ ＼ｆＣ／ ：
ノＪ−ぢし りｐンド１ト第７図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、トリプトファン調節遺伝子につながったトリプトフ
ァンオペロンのｔｒｐＥポリペプタイドのＮ末側をコー
ドした遺伝子とヒト上皮細胞増殖因子個のアミノ酸をコ
ードした遺伝子がリンカーを介して結合した次のＤＮＡ
配列 【遺伝子配列があります。】 で表わされる遺伝子を用いることを特徴とするヒト上皮
細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法。 ２、トリプトファン調節遺伝子につながったトリプトフ
ァンオペロンのｔｒｐＥポリペプタイドのＮ末側をコー
ドした遺伝子とヒト上皮細胞増殖因子の５３個のアミノ
酸をコードした遺伝子ガリンカーを介して結合した次の
ＤＮＡ配列【遺伝子配列があります。】 で表わされる遺伝子を用いることを特徴とするヒト上皮
細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法。 ３、トリプトファン調節遺伝子とヒト上皮細胞増殖因子
の５３個のアミノ酸をコードした遺伝子がリンカーを介
して結合した次のＤＮＡ配列【遺伝子配列があります。 】 で表わされる遺伝子とを有するプラスミドベクターを用
いることを特徴とするヒト上皮細胞増殖因子の遺伝子工
学的生産方法。 ４、トリプトファン調節遺伝子とヒト上皮細胞増殖因子
の５３個のアミノ酸をコードした遺伝子ガリンカーを介
して結合した次のＤＮＡ配列【遺伝子配列があります。 】 で表わされる遺伝子とを有するプラスミドベクターを用
いることを特徴とするヒト上皮細胞増殖因子の遺伝子工
学的生産方法。 ５、トリプトファン調節遺伝子ヒト上皮細胞増殖因子の
５３個のアミノ酸をコードした遺伝子がリンカーを介し
て結合した次のＤＮＡ配列 【遺伝子配列があります。】 で表わされる遺伝子とを有するプラスミドベクターを保
持する大腸菌を用いることを特徴とするヒト上皮細胞増
殖因子の遺伝子工学的生産方法。 ６、トリプトファン調節遺伝子とヒト上皮細胞増殖因子
の５３個のアミノ酸をコードした遺伝子ガリンカーを介
して結合した次のＤＮＡ配列【遺伝子配列があります。 】 で表わされる遺伝子とを有するプラスミドベクターを保
持する大腸菌を用いることを特徴とするヒト上皮細胞増
殖因子の遺伝子工学的生産方法。 ７、誘導物質としてＩＡ（３−β−インドールアクリル
酸）を添加して培養された大腸菌を用いることを特徴と
する特許請求の範囲第５項記載のヒト上皮細胞増殖因子
の遺伝子工学的生産方法。 ８、誘導物質としてＩＡ（３−β−インドールアクリル
酸）を添加して培養された大腸菌を用いることを特徴と
する特許請求の範囲第６項記載のヒト上皮細胞増殖因子
の遺伝子工学的生産方法。 ９、トリプトファンを含まない培地を用いて培養された
大腸菌を用いることを特徴とする特許請求の範囲第５項
記載のヒト上皮細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法。 １０、トリプトファンを含まない培地を用いて培養され
た大腸菌を用いることを特徴とする特許請求の範囲第６
項記載のヒト上皮細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法
。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63074383A JPH01247099A (ja) | 1988-03-30 | 1988-03-30 | ヒトの上皮細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法 |
| EP19890105639 EP0335400B1 (en) | 1988-03-30 | 1989-03-30 | Processes for production of human epidermal growth factor by genetic engineering |
| DE1989615841 DE68915841T2 (de) | 1988-03-30 | 1989-03-30 | Verfahren zur Herstellung von Epidermal-Wachstumsfaktor durch genetische Transformation. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63074383A JPH01247099A (ja) | 1988-03-30 | 1988-03-30 | ヒトの上皮細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01247099A true JPH01247099A (ja) | 1989-10-02 |
Family
ID=13545588
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63074383A Pending JPH01247099A (ja) | 1988-03-30 | 1988-03-30 | ヒトの上皮細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01247099A (ja) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56145221A (en) * | 1980-03-24 | 1981-11-11 | Genentech Inc | Bacteria polypeptide development using tryptophan promotor operator |
| JPS59154989A (ja) * | 1983-02-23 | 1984-09-04 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | プラスミド |
| JPS61275222A (ja) * | 1985-03-25 | 1986-12-05 | ザ ウエルカム フアウンデ−シヨン リミテツド | 上皮成長因子の製造法 |
-
1988
- 1988-03-30 JP JP63074383A patent/JPH01247099A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56145221A (en) * | 1980-03-24 | 1981-11-11 | Genentech Inc | Bacteria polypeptide development using tryptophan promotor operator |
| JPS59154989A (ja) * | 1983-02-23 | 1984-09-04 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | プラスミド |
| JPS61275222A (ja) * | 1985-03-25 | 1986-12-05 | ザ ウエルカム フアウンデ−シヨン リミテツド | 上皮成長因子の製造法 |
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