JPS61275222A - 上皮成長因子の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は表皮成長因子（ＥＧＦ）の製造法に関する。

遺伝子の合成および微生物における発現は近年確立され
た技術である。しかし、インシュリン鎖のように小ポリ
ペプチドを大腸菌に直接発現させるのは非常に非効率的
であることが一般に分っている。主として、このことは
細胞内プロテアーゼによるタン自分解が迅速であるため
である。しかし、目的のアミノ酸末端配列と適合しうる
遺伝子内に有効な染色体部位および周囲の配列を構築す
る必要性からでもある。翻訳開始効率を支配するルール
は完全には理解されていない。更に、イニシエーターメ
チオニンコドンが必要であり、セしてＮ−末端メチオニ
ンは例えば特に高レベルの発現でヒト成長ホルモンの場
合のように、宿主タン白合成機構により有効に除去でき
ない。

成熟ポリペプチドの発現の別法として、制御可能なよう
に高レベルでそれ自身発現できる宿主タン白質の遺伝子
の一部に合成遺伝子゛を融合することができる（　１ｐ
−Ａ−０００１９３０号）。生成した融合タン白質はタ
ン自分解作用に対し十分安定である。当該ポリペプチド
は特異的化学的又は酵素的分解により放出させることが
できる。

ＥＧＦは羊の脱毛の原因となり得る（　ＧＢ−Ａ−２０
８２１８６号）。しかし、実質量の成長因子は６〜５ｑ
／羊の投与量でこの目的に合致する。

ＥＧＦ’は雄成熟マウス′１％、下線から抽出するこ、
とができる。このネズミＥＧＦ（ｍＥＧＦ）は公知の一
次構造の５３残基ポリペプチドである。しかし、この経
路により抽出できるｍＫＧＰ　ｔは不十分である。

ｍｘＧｙに対してリジン（Ｌ７Ｂ）結合を有する融合タ
ン白質は大腸菌に発現させかりＩＪｙ８特異注タン自分
屏により切断されて、ｍＥＧＦを放出できることを本発
明者は見出した。ｍＦｌｉＧＦはＬｙｇを欠くから、特
異的プロテアーゼに対し耐性がある。このアプローチは
一般的に適用可能性があり、内部ＴＪ７８残基を宮まな
１７％ｌ：（）７又は１８ＧＦ類似体について可能とさ
れていたより更に多量産生することができる。このアプ
ローチを具体化しなかったいくつかの融合タン白構築は 本発明によれば、融合タン白質をコードするＤＮＡであ
って、内部Ｌｙｓ残基を官まないＥＧＦ又はＥＧＦ類似
体にｂｙａ残基な介して結合したキャリアータン白質を
含み、その融合タン白質からＥＧＦ又はＥＧＦ類似体が
Ｌ７Ｂ特異性プロテアーゼにより切断することができる
、上！ｅＤＮＡ配列を供する。

更に本発明は、このＤＮＡ配列を導入しかつ形質転換宿
主において、融合タン白質を発現し５るベクターを供す
る。この種のベクターで形質転換した宿主は本発明の一
部をなす。

本発明はまた内部Ｌｙｓ残基な含まないＥＧＩＰ又はＥ
ＧＦ類似体の製造法におめて、この形質転換宿主を培養
して、融合タン白質を発現させ、ついでこの融合タン白
質をＬｙ８特異性プロテアーゼで処理して、ＥＧＦ又は
］！！ＧＰ　類似体を放出させることを特徴とする、上
記方法を供する。生成したＫＧＩＦ又はＥＧＦ類似体は
動物の脱毛に特に羊の別宅に使用することができる。

ＩＪｒａ　＆　ｆｆまないＥＧＦ又ｔ’ｊ、　Ｋ（）？
類似体にｂｙａ結合を有する融合タン白質を発現しうる
ＤＮＡ配列はベクター例えばシラスミドに供される。Ｌ
７１ｉ１残基および！１ｉＧＦ又はＥＧＦ類似体のコド
ンはキャリアータン白質のコドンと同じ読み枠にで供さ
れる。これらのコドンはプロモーターより前にある。宿
主はベクターで形質転換される。一般に、宿主は大腸菌
の如き細菌である。融合タン白質は宿主にて発現される
。

適当なりＮＡ配列はプロモーター、ＥＧＦ又はＥＸ）？
類似体の遺伝子にＬｙｓコドンを介して結合したキャリ
アータン白遺伝子および停止コドンから成ることを本発
明者は見出した。この種の配列は、ＥＧＦ又はＥＧＦ類
似体の遺伝子がｌｙ８コドンの直前にあり、続いて停止
コドンである合成遺伝子を構築することにより調製する
ことができる。この合成遺伝子は、キャリアータン白質
のプロモーターおよびキャリアータン白遺伝子から成る
ＤＮＡ配列と連結する。キャリアータン白遺伝子および
合成遺伝子の初め（：ｃｙｓコＶン末端）はこの目的の
ためにマツチしている粘着末端を供するのが望ましい。

合成遺伝子のコドンがプロモーターとキャリアータン白
遺伝子に関して正しい読み枠にあるように連結をアレン
ジする。

別法として、ＤＮＡ配列によってコードされた融合タン
白質は２種以上のＥＧＦ又はＫＧ？類似体を含む。一つ
のランはＬｙｓ残基な介して次のものに結合し、融合タ
ン白質をＬ７ａ特異性プロテアーゼで処理すると、各Ｅ
ＩＧＩＦ又はＥＣ）Ｆ’類似体を放出する。

この態様のために、各ＥＧＦ又はＦｉ（）Ｆ類似体をコ
ードするＤＮＡ配列をＴＪｙｅコドンを介して縦列に結
合して＾る合成遺伝子を構築する。ＥＧＦ又はＥ（）Ｆ
類似体のＤＮＡ配列のリピートはしたがってｌ１１８コ
ドンを経て結合することができる。つ込でこのような合
成遺伝子は、キャリアータン白質のプＯ％−ターおよび
上記キャリアータン白遺伝子から成るＤＮＡ配列と連結
することができる。

融合タン白質を形成するＥＧＦ又はＥＧＦ類似体は内部
リジン残基な含まないことが重要である。

ｍｙはｍＥＧＦであるのが望ましい。爵？類似体は、毛
成長調節特に羊の別宅に有効なアミノ＃！（又はアミノ
酸置換物）の配列を言むＥＧＦポリペゾチドの合成およ
び天然誘導体である。したがって、ＥＧＦ類似体１ｊ　
ＥｆＧＸＰの断片、例えばｍＫＧＰ　１−４５、ｍ１ｍ
１Ｆ　１−４７、ｍｚｏｖｌ−４８又はｍｍＧｒ　１−
５１である。また、類似体はその毛成長関節特に羊の別
宅剤として作用する能力に影響しない天然由来の残基の
代りにアミノ酸残基な含んでもよい。

合成遺伝子は標準法により構築することができる。この
遺伝子のオリゴデオキシヌクレオチドは例えばスボロー
トとパンワース（１９８３）Ｋｌｅ載されたものに類似
する固定相マニュアル法により合成することができる。

組立てた遺伝子の５′−〇Ｈ末端を生ずるものを除いて
これらのオリゴデオキシヌクレオチｖは過剰の［：　ｒ
”ｐ　］−ＡＴＰとポリヌクレオチｒキナーゼで十分処
理される。連結実験はオリビデオキシヌクレオチドの各
種部分集合を使って行ない、生成した中間体は例えばポ
リアクリルアミｖｒル電気泳動により精製し、共に連結
して、ＥＧＦとＩ！ＧＦ類似体の遺伝子がＩ、７８コド
ンと停止コドンとの間でサンｒイツチされている合成遺
伝子を生成する。使用した方法はスミス等（１９８２）
およびエツジ等（１９８１）に記載の方法に類似してい
る。一般に、合成遺伝子は付着末端があり、適当なベク
ターに連結する役目をする。宿主をベクター九より形質
転換し、合成遺伝子含有コロニーを選択する。

この合成遺伝子はキャリアータン白質のプロモーターと
キャリアータン白遺伝子から成るＤＮＡ配列に連結させ
ることができる。配列は別々の断片又はベクターの一部
でよい。この配列はまた使用する発現によりオペレータ
ーおよび／又はアテニュエーターを導入することができ
る。本発明ではｔｒｐプロモーター言臀Ｔｒｐオペロン
の一部、アテニュエーターおよびＴｒｐ　Ｅ遺伝子の一
部を使用した。しかし、合成遺伝子は適当な原核プロモ
ーターの制御におくことができる。ｔａｃプロモーター
／オペレーターの如きプロモーター／オペレーターを使
用することができる。

キャリアータン白質は、融合タン白質を発現させる宿主
中の内生プロテアーゼによりタン自分解されにくい融合
タン白質を生成せねばならない。

望ましく　を工、殆んどの融合タン白質は封入体として
宿主に存在する。キャリアータン白質ヲマそれ自体完全
なタン白質であってもなくてもよい。上記した様に、本
発明ではＴｒｐオペロンの一部を使用した。結局、発現
した融合タン白質はＬｙｓ残基を介してｍＥＧＦに結合
したＴｒｌ）ＩＩＣタン白質の一部から成る。

融合タン白質を発現しうる宿、原核生物又は真核生物は
適当な方法で調製することができる。例えば、融合タン
白質の発現ベクターは、正しい読み枠で合成遺伝子をプ
ロモーターから成るＤＮＡ断片の一部であるキャリアー
タン白遺伝子と連結しそしてこの連結生成物を適当なベ
クターに入れて調製することができる。ついでこのベク
ターを使って宿主を形質転換させる。宿主は融合タン白
質の発現を確立するような条件下で培養する。融合タン
白質の生成レベルは温感性ランナウェイ−コピー数プラ
スミドを使って融合タン白質を発現するシラスミドのコ
ピー数が増えるにつれて増加させることができることを
見出した。

ＥＧＦ又はＥＧＦ類似体は融合タン白質を宿主細胞から
抽出し、そしてそれをＬｙｓ特異性プロテアーゼで消化
して得る。したがって、Ｋ（）？父はＫ（）？類似体は
放出し、クロマトグラフィ等によって精製することがで
きる。適当なＬ７Ｓ特異性プロテアーゼはＬ７Ｂのカル
ボキシル基でタン白質を分解する二ンドゾロテイナーゼ
１７８０である（米国特許第４．４１４．３３２号ン。

本発明では次のようなエンドゾロテイナーゼＬｙｓ０を
得た。−晩斜面培養した＋７　ｒバクター・ｘ　ンｆイ
ーｅｌ’＊　ｘ　（ＡＴ（！Ｇ　２７７９６　）を、０
．２５％酵母エキス、０．１％グルコース、１．０％ト
リプトン−大豆、１．Ｑ　ｍＭ　Ｍｇ（Ｊ２水溶液を有
５０〇−・　振盪フラスコに接種し、２５℃１５６時間
攪拌しながら培養した。上溌液を遠沈により醗酵産物か
ら回収し、二ンドゾロテイナーゼＬ７Ｂとを上記のよう
に得た（米国特許第４．４１４．３３２号）。醗酵の最
終ｐＨは８−９であったが、調整しなかった。

生成したＥＧＦ又はＥＧＦ類似体は動物の除毛に、特に
羊の別宅に使用できる。ＥＧＦ又はＥＧＦ類似体は静脈
注入又は注射圧より、又は埋めこんだカプセルから徐放
させて、あるいは経口的に羊に投与することができる。

望ましくは、十分量のＥＧＦ又はＥＧＦ類似体を投与し
て、平均ステープル引き抜き力を６Ｎ／ＫｔｅＸ以下、
例えば２〜６　Ｎ　／　ｘｔｅｘに減する。この測定方
法はエイ・ジエイ・ゴートンの［オーストラリア−・ジ
ャーナル・オプ・エクスペリベンタル・アグリカルチュ
ラル・アニマルＩハズバンドリイＪ　２０．４０−４９
およびムーア等の「サーチ」１２，１２８−１２９に記
載されている。一般には、６−５ηのＥＧＦ又はＦ！Ｇ
ＮＰ類似体を各年に与える。

次の例により本発明を説明する。

例１ 第１図に示すＬ７θ−ｍＥＧＦ遺伝子を計画した。この
遺伝子はｍＢＧＩＦのアミノ酸配列および結合ペプチド
、ｌｅｕ　−１７８をコードする。この結合性タン白質
はＴｒｐｌｉｊ遺伝子［ｘｔｅ−３２３（７）：ｒドン
ヲ言ムＢｇＪ　ＩＩ部位にこの遺伝子を挿入させた。こ
れにより６７８アミノ酸残基の融合タン白質を発現させ
、それからリジン残基な欠（ｍＥＧＦはリジン特異性プ
ロテアーゼ、エンｒデロティナーゼＬｙｓ０により遊離
させることができた。ｐＡＴ　１５３のＢａｍＨニーＫ
ＯＯＲ工部位にクローニングを容易にするために、停止
コドンに続（］１２ｃｏＲ工制限部位は遺伝子の末端に
供した。

コドンは高発現タン白において大腸菌により好んで使用
される点で選択した（グランタム等、１９８１；グイと
ゴーティア−１９８２）。望ましくない相補性領域およ
びオリビデオキシヌクレオチド断片の正しい連結に妨げ
となるりキードを除去するために多くの改良を行なった
。オリゴヌクレオチドの合成について平均長さ２１残基
を選んだ。というのはこれらは効率的に合成・精製でき
、連結する前に効率的ハイデリドのために良好なオーバ
ーラツプを供するからである。

第１図に示す１ｂのオリゴデオキシヌクレオチドＥＧＦ
−３〜ＥＧＦ　−１８はダックワース等（１９８１）お
よびディト等（１９８２）に記載に基づく固相マニュア
ル法により合成したが、スプラウトとパンワース（１９
８３）の記載に類似する次の変法によった。６′−末端
デオキシヌクレオシドを６′−〇−サクシンアミド部分
を介して３−アミノゾロビル調整多孔がラスビーズ（２
４ＯＡ孔形）に結合させた。保護されたジヌクレオチド
トリエチルアンモニウム塩はチャットパドハイヤとリー
ス（１９７９）に従って製造した。Ｎ−メチルイミタ・
戸−ル触媒と共にメシチレンスルホニル−６−二トロー
１．２．４−）リアゾールを使って、各縮合工程につい
て保護されたモノ−およびジ−デオキシヌクレオチドホ
スフェートジエステルを活性化した。トリクロル酢酸（
１０チ）／１．１，１−トリクロルエタンを使って、各
サイクルのジメトキシトリチル保護基を除き、着色物質
（４０〜８０秒）の除去により要した最小時間を判断し
た。

この最終保護オリゴデオキシヌクレオチドを４−二トロ
ベンデルオキシムと１−１　＊　３−５−　テ）ラメチ
ルグアニジン１５０チジオキサンで処理し、２−クロル
フェニル保護基を分解しかつガラス支持体からオリビデ
オキシヌクレオチドを分解した。

アンモニアおよび酢酸の脱保護工程が既述したよ５に続
く（ダックワース等、１９８１　）。

オリゴデオキシヌクレオチドはノｆ−テシル８ＡＸカラ
ムで５５°Ｃ／６０％ホルムアミド中、１ｏ−７００ｍ
Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４の勾配でイオン５ｆ−換ｕｍｃにより
精製しそしてセファデックス０２５カラムで脱塩した。

各オリゴヌクレオチドは１５チポリアクリルアミドｒル
／８Ｍ尿素で電気泳動して分離した［：３２Ｆ）　−１
Ｊン酸塩ラベル物質のオートラジオグラフィにより明ら
かな様に純粋であった。

オリゴデオキシヌクレオチドＥＧＦ’　−３〜ＥσＦ−
１５およびＥＧＦ　−１８ｔ’ｊ−ポリヌクレオチドキ
ナーゼおよび過剰の〔γ−”Ｐ：ＩＡＴＰを使ってその
５′−ヒドロキシ基で予備的にリン酸化した。連結は６
組のオリビデオキシヌクレオチＶにっ＾て行なった。セ
ットＥは４０ｐモルＥＧＦ　−１７，１７，５１）モル
各各キナーゼ処理したＥＧＦ　−３、ＥＧＦ　−４、Ｅ
ＧＦ　−５およびｙｖａｙ　−１８、および２０．４　
ｐモルキナーゼ処理ＥＧＦ　−６を含有。セラ）Ｆは２
０．４　ｐモルキナーゼ処理ＥＧＦ　−７とＥＧＦ’　
−ｉ　１、および１７．５　Ｉ）モル各々キナーゼ処理
ｘＧＦ−８、ＥＧＦ　−９およびＥＧＦ　−ｉ　Ｑを含
有。セットＧは２０．４　ｐモルキナーゼ処理ＥＧＦ’
　−１２，１７，５ｐモル各々ＥＧＦ　−１３、ＥＧＦ
　−１４とＥＧＦ’　−１５および４０ｐモルｇａｙ　
−１６を含有。

オリゴデオキシヌクレオチドは各混合物について全１ｓ
−ｉｓμｍＨ２Ｏ中ボリプａｉレン管に加えた。この管
は１００°Ｏ／２分加熱し、初め防護ジャケットにて一
晩１００°Ｃで、２Ｊ−水浴にてゆっくり冷却した。こ
の管を０℃に冷却し、リガーゼバッファ＝（１５μＬ）
とウシ血清アルブミン（０６１％）を加え、続すて１μ
ｊ　Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼ（バイオラブ〕を加えた。

連結は３７℃７１時間であった。ＤＮＡ産物はエタノー
ルで沈澱させ、一定サイズのＤＮＡ断片を１２％アクリ
ルアミドｒル電気泳動により変性させて精製した。３つ
の分別連結産物を混合し、１００°ＣＶｃ７Ｊｏ熱しか
つゆっくり冷却してアニーリングした。０．１　％　Ｂ
ＳＡを宵するリガーゼバッファーを加え、１　ｔｄ−Ｔ
　４　ＤＮＡを加えた。３７°Ｃ／１時間後、ＤＮＡを
エタノールで沈澱させた。

この生成物を７℃で一晩１）ＡＴ　１５３　ｚｃｏｉニ
ーＢａｍＨＩ大断片大連片し、最終連結ミックスを使用
して、大腸菌に１２ＨＢ１０１に形質転換させた。

耐ンビシリフ耐性コａニーはナト２サイクリン感受性に
ついて選択し、そしてｐａｔ工＋Ｂ８ｔｌ！！ＩＩおよ
びＥｃｏＨ工＋Ｂ　ａｍＨ工を使って、選択コロニーを
制限酵素マツピングにより研究した。予期した断片、前
者で２７００と７９０　ｂｐ後者の消化物で３３００と
１６７　ｂｐは試験したコロニー１５の内１１で同定さ
れた。したがって、これらのコロニーは望ましいプラス
ミド、ｐＥＧＦ　６を含有した。

ＨｐａＩ［％　Ｔａｇ工およびＫ（！ＯＲエマツピング
を使って確認した。２つのコロニーからのＥＧＦ遺伝子
はマキサム・ギｌＬｔ　パート法（Ｍａｚａｍ　＆　Ｇ
１１ｂｅｒｔ　、　１９８Ｑ　）により完全に配列させ
た。一つの単離は正しい配列を有し、他方は単一の塩基
変化を有し、アミノ酸配列に影響しなかった。

例２ 完全なｍ１ｃＧＦ遺伝子と下流配列はＢａｎ　ＨニーＰ
ｓｔ　Ｘ消化物を使ってｐＥＧＦ　６から取った。Ｔｒ
ｐオペロンの一部の遺伝子を含むプラスミドｐＢＲｅｒ
ｐをｚｃｏＨ工とＢｇｌＩＩで消化し、そしてｔｒｐプ
ロモーター、アテ二二エーターおよびＴｒｐＥ遺伝子の
一部を含む断片を単離した。これらの２つの断片をｐＡ
Ｔ’１５３０ＫＯＯＲニーｐａｔＩ大断片に連結し、’
ｒｒｐプロモーター／オペレーター制御下（パートＴｒ
ｐ　Ｋ）−ｌｌ７８−　ｍｌ！１ＧＩＦ融合タン白質の
遺伝子を含むｐＷＲＩＪ５００を得た。ｐｗＲＬ　５０
０を構築するのに使った断片の長さは ２９０７　ｂｐＰｓｔ−ＥｃｏＲ工／　Ｉ）ＡＴｌ　５
３１２１０ｂｌ）ＫｃｏＲニーＢｇ’ｌＩＩ／　Ｉ）Ｂ
Ｒｔｒｐ９３０　ｂｐ　ｐｓｔ−ＢａｎＨ工／ｐＦＧＦ
６であった。

この断片を単一混合物で連結した。ｐＷＲＬ　５　Ｑ　
Ｑの構築を第２図に示す。シラスミドｐＢＲｔｒｐはプ
ロモーター、リーダーペプチドおよび１ｃｏＨ工とｐＢ
Ｒ３２２のＨｌｎ（ｌ　ｍ部位の間にあるＴｒｐＦｉの
構造遺伝子をコードする大腸菌のトリプト７アンオペｅ
ｆ７の２．０８　Ｋｂ　Ｈｐａルミニー１ｎｄ　ｍ断片
をもつｐＢＲ５２２の誘導体である。

シラスミドｐＷＲＬ　５００は大腸菌ＥＢＢ　１０１を
形質転換するのに用いた。アンピシリンとテトラサイク
リン耐性のコロニーを選択した。２０コロニーのシラス
ミドはＢＣＯＲ工制限マツぎングにより研究し、そして
予期された３６６０．１２２０および１６７ｂｐ断片は
ｐｓｔ工＋Ｂａｔ’ｓ、■消化を使りて更に特長づけた
。ｐＷＲＩ、　５００は予期した７９０と４２５７１）
ｐ断片を得た。

Ｑ３ （パートＴｒｐ　Ｋ）　−Ｌ７ａ　−ｍＥＧＦ融合タン
白質の発【 ｐＷＲＬ　５　Ｑ　Ｑ含有大腸菌を誘導して、クーマシ
イデルーで染色したポリアクリルアミドデル電気泳動グ
ラムをみて、全細胞タン白約１０チで評価して、高レベ
ルの融合タン白質Ｍ！”　４２．０８５を得た（トリプ
トファンを飢餓させそしてインｒ−ルアクリル酸の添加
によるン。融合タン白質の結　“合領域とＤＮＡ配列の
構造は次の通りである。

Ｂｇｌエエ／ＢａｍＨ工　　　　　　ＥＯＯＲＩ融合 例４ 採取した大腸菌（培養物の２４００　ＯＡ６００単位由
来）はりψチーム／　ＫＤＴＡおよび凍結／解凍を使っ
て粉砕し、ついでＤＮムアーゼ処理した。融として存在
し、固定化大腸菌細胞中融合タン白質に結合したウサギ
抗−ｍｌ！１ＧＩＦイムノグロデリンＧ分子を示し、か
つ４０．０００Ｘｇ、２０°Ｏ／１時間遠心分離後ペレ
ットフラクション中にあった。

このペレットを８Ｍ尿素、１　ｍＭ　ＩＤＴＡ　、　１
　ｍＭ　２−メルカプトエタノール、５０　ｍＭＮＨ４
ＨＯＯ３、ｐＨ８，３にて均質化し、その混合物を５０
　ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３に５倍稀釈した。オパール様の
混合物を上記のように遠心分離しそして融合タン白質を
含有する上澄液を二ンドゾロテイナーゼＬ７日０　（０
，７５σ、べ−リンガー製）で６７°Ｃ／２４時間消化
した。更に０．７５σのプロテアーゼを加え、消化を３
日間続けた。消化物を１　ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３，０，
２ｍＭ　ＫＤＴＡ　。

ｐｉ−１８，４°Ｏ／２時間透析し、ついで５　Ｑ　ｍ
Ｍ　ＨＣＪ、、０、Ｉ　Ｍ　ＮａＣｊで２時間行なった
。混合物を４０．０００Ｘｇ、４℃７１０分遠心分離し
、上澄液を［ＩＭ２膜でアミコン限外濾過セル中１５−
まで濃縮した。

浴液を５０　ｍＭ　５１ＣＬ、　［１，Ｉ　Ｍ　ＮａＣ
１中バイオｒルＰ−１００カラム（２，５ｃｍＸ　８０
ｃＩＩＬ）でりＯ？トゲラフに供し、全カラム容量（サ
ページとコーエン、１９７２）後浴離して、ｍＥＧ？ピ
ークを集めた。この溶液をＮＨ３でｐＨ５−６に調整し
、殆んど濃縮乾燥した。それを２０　ｍＭ　ＮＨ４０Ａ
Ｑ　Ｋ爵解し、酢酸でｐｉ（５，＜Ｓに調整し、ｐＨ５
，６酢酸アンそニウムバッファーの勾配にてＤＩＩＣセ
ルロースでクロマトグラフに供した。この勾配を適用し
た後に溶離した第１−一りはｍＫＧＩＦであった。第２
ピークはｍＥＧＦに酷似しているタン白質の混合物を含
有し、多分分解産物であろう。コンｖトキシン（リムラ
ス試験）の試験では非常に少量（３，１ｎｇ／ｉｗｍＥ
ＧＦ　）を示した。

（ｌＤ２００Ｊの醗酵槽を使用 採取した大腸菌細胞をパックした細胞ペレット１ゆにて
処理し、使用するまで一２０℃に貯蔵した。解凍した細
胞を１．５１　ＮＨ０で懸濁させ、１〇−エタノール、
５０ｍ１Ｍ）リス環基、５ｗＩｔＯ，５ＭＥＤＴＡ％ｐ
）ｉｓ、１ｍ２−メルカプトエタノール、５ｄＮＰ４０
界面活性剤中５０１ｑフェニルメタン゛スルホニルフロ
ライドを添加して分解し、−８，５に調整し、１１ｉの
リゾチームを添加し、！１０°Ｃ／２時間培養シタ。Ｎ
ａＣｊ２　（５ｄ、ＩＭ）、！：ＤＮＡ７−ゼ（５０１
Ｆ）を卯え、培養を２時間続けた。

ＫＤＴＡ　（１０ｔｄ、０．５Ｍ％−８〕を加えた。混
合物を２７．０００Ｘｇで２０°Ｃ／４５分遠心分離し
た。ペレットを１．２５　Ｊ−の５　Ｑ　ｍＭ　ＮＨ４
ＥＣ！０３．１ｍＭｍ′ＤＴＡ、　１　ｍＭ２−メルカ
プトエタノール（−８，６）で均質化し、繰り返えし遠
心分離して集めた。尿素＜０．９９／９ペレツト）を加
え、混合物を３７℃に加温し、均質化した。澄明な粘性
浴液を２倍に稀釈し、遠心分離によりきれいにし、更Ｋ
　５０　ｍＭ　ＮＨ，ＨＣＯ２で５Ｊ−まで稀釈した。

２−ヒドロキシエチルジサルファイド（２，７５ｍ）と
エンドブロチイナーぜＬ７ＥＩＯ（１２σ）を加え、混
合物を３７℃／６日間培養した。これらの条件により殆
んど完全な分解を示した。

消化物をアセトニトリルで１５％にし、ｐ）１３．７５
に調整した。変性ポリペプチドは沈澱し、沈降・濾過に
より除いた。ｍ１ｌｆｉＧＦは、１５〜５０％アセトニ
トリル１０．１％トリフ、ロル酢酸の勾配で、プレグＲ
Ｐ　１　Ｂシリカデルで逆相クロマトグラフィにより上
澄液から回収した。粗ｍＥＧＦを稀釈し、中和し、そし
て上記のようにＤＥＡＤセルロースでクロマトグラフに
かけ、ｍ１ｉｌｉＧＦピークを酸性化しついでバイオデ
ルＰ−１０でクロマトグラフにかけた。最終生成物を中
和し、透析し、凍結乾燥した。収率は微生物ペレット中
融合タン白質含量を基準として理論量の約１５％であっ
た。約２００岬のｍＥＧＦを得た。

ＧｉＤ　　純度分析 精製ｇＧＦの逆相およびイオン交換ｉ！ＰＬＯは８５チ
以上の純度を示した。アミノ酸分析およびペゾチドマツ
ビングデータはｍＥＧＦの構造と一致した。

例５ 融合タン白質の発現レベルを上げるために、（パー）　
Ｔｒｐ　Ｅ）　−Ｌｙｓ　−ｍＫＧＩＦ遺伝子をｌ）ｗ
ＲＴＪ５　Ｑ　（１から温度感受性ランナウェイコピー
数ベクター、ｐＭＭｌ（ウオング等、１９８２）まで移
動させた。

これを第６図に示す。複製起源を有する、プラスミドｐ
ＭＭ］、のＢａｍＨ工とｐａｔ工消化により誘導され？
、−３．２ｋｌ）断片をＢａｍＨニーｐｓｔ工消化１）
ＷＲＩＩ　５００と連結した。大腸菌ＨＢ　１０１を連
結生成物と形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを６
０℃で生育するが４２°Ｃで生育しないものについて選
択した。正しく生成したｐＷＲＬ５０５　含Ｗコａ＝−
はＢａｍＨ工とＢｓｔ工を使って制限マツピングにより
同定した。

ｐＷＲＬ　５０５で形質転換した大腸菌はカブミノ酸を
含むグルコース最小培地にてＡ６００−１まで３０°Ｃ
で生育させた。温度を２時間３７℃まで上げ、シラスミ
ドのコピー数を数倍に上げ、ついでインドールアクリル
酸を添加し、Ｔｒｐプロモーターから発現を誘導させた
。更に３０９Ｃ／６時間後、（パートＴｒｐ　Ｋ　）−
Ｌ７ａ　−ｍＦｉＧＩＦの発現は全細胞タン白約２０％
のレベルに達した。例４　（ｉＨに記述した様に、ｍＥ
ＧＦを精製し、例４　（ｒｒｒ）に記載したように類似
の純度のものであった。

例６ ｔｒｐ、プロモーター由来のタン白質の高レベル発現は
トリプトファンの飢餓を必要とする。１ｎＥＧＦのよう
に、トリシトファン含有タン白の発現はこれらの条件丁
で最適であると予期されない。ｔａｃプロモーター（ド
・ボアー等、１９８３）はアミノ酸に富んだ培地にてイ
ンプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰ　ＴＧ　
）により誘導することができ、一層再現的に高発現効率
が予期できる。したがって、ｐｔａＣ１２中ｔａｃプロ
モーターはＬ７５１残基な介してＴｒｐＥタン白質に結
合しているｎ１ＥＧＦから成る融合タン白質を発現しう
るプラスミド、ｐＥＧＦｔａｃｔｒｐ　２を構築するの
に使用した。ｐＥＧＦｔａｃｔｒｐ２の構築は第４図に
示す。

例２のｐＷＲＩＩ　５００　ｔｘ−ＴＲｚｃｏＲｘ消ｆ
ｔＶＣ供１．Ｃ１ｔｒｐプロモーターと融合タン白遺伝
子を再方向づけをした。生成したシラスミドはｐＥＧ’
Ｉ’ｔｒｐ　１である。このプラスミドはＴｒｐＫコー
ド配列の塩基８０でＢａｔＸｌの認識部位を含有する。

ＴｒｐＫ遺伝子のｐｌ！；ＧＴ　ｔｒｐ　１からこのＢ
ｓｔ　Ｘ１認識部位のｔｒｐプロそ一ターは、下記した
ＴｒｐＫコード配列のｐｔａｃ１２から塩基８０のｔａ
ｃプロモーターから成る配列を置換した。シャインーダ
ルガルノ配列、染色体結合配列は標識８Ｄである。生成
プラスミド、ｐＥＴＧｔａｃｔｒｐ　１を部分的１ｃｏ
Ｈ工消化に供し、ｔａｃプロモーターと融合タン白質遺
伝子を再方向づけして、ｐｍＧＩＩ′ｔ　ａｃ　ｔｒｐ
　２を得た。

Ｄ 大腸菌に１２　、ＴＭ　１０５　（ヤニツシューペロン
、１９８５）をｐＥＧＦｔａｃｔｒｐ　２で形質転換サ
セタ。

この株を２Ｌ醗酵槽で富培地で３０℃下培養し、０、　
Ｄ、　６５０でＩ　ＰＴＧにより誘導させた。クーマシ
イデルー染色した８ＤＡ−ポリアクリルアミドデル電気
泳動図の密度計による分析では、全細胞タン白の３８％
が（パートＴＧｒｐＭ）　−Ｌ７ｓ　−ｍＥＧＦ融合タ
ン白質であることを示した。ｍＥＧＦを得、例４（１）
により精製し、例４（１１１）に記載したものと類似の
純度のものであった。

参考文献 アマン等（１９８６）「ジーン」２５，１６７−１７８
゜ ド・ざア一等（１９８３）ｒプロシーディング・オフ・
ナショナル・アカデミツク・サイエンス、米国Ｊ８０．
２１−２５゜ チャットパドヤヤとリース（１９７９）ｒテトラヒドロ
ン・レターＪ５０５９−５０６２゜ダックワース等（１
９８１）ｒヌクレイツク・アシツズ・リサーチ」９．１
６９１−１７０６゜エツジ、等（１９８１）ｒネイチャ
ー」２９２゜７５６−７６２゜ エフイモ７等（１９８２）ｒテトラヒドロン・レター」
２３，９６１−９７Ｓ４゜ ディト等（１９Ｂ２）ｒヌクレイツク・アジツズ・リサ
ーチ」１０．６２４５−６２５４゜グイとビーチア−（
１９８２）ｒヌクレイツク・アシツズ・リサーチ」１０
．７０５５−７０７４゜グランタム等（１９８１）ｒヌ
クレイツク・アシツズ・リサーチ」９、ｒ４３−ｒ７４
ｅマキサムとシルバード（１９８０）ｒメンッズ・オシ
・エンディモロシイＪ　６５，４９９−５６０サベージ
とコーエン（１９７２）ｒジャーナル・オシ・バイオロ
ジカル・ケミストリイＪ、２４７゜７６０９−７６１１
．’ スミス等（１９８２）ｒヌクレイツク・アシッズリサー
チ」１０．４４６７−４４８２゜スプロートとパンワー
ス（１９８３）ｒテトラヒドロン・レター」２４．５７
７１−５７７４゜ウオン等（１９８２）ｒノロシーテイ
ング・オシナショナル・アカデミツク・サイエンス、米
国。

７９．３５７０−３５７４゜ ヤニツシュ・ペロン等（１９８５）ｌジーン」６６．１
０３−１１９゜

【図面の簡単な説明】

第１図は例１のＬｙｓ　−ｍＥＧＦ遺伝子の配列を示す
。 第２図は例２の発現ベクターｐＷＲＬ　５００の構築を
示す。 第３図は列５の発現ベクターｐＷＲＬ　５０５の構築な
示す・ 第４図は例６の発現ベクターｐＥＧＦｔａｃｔｒｐ　２
のロ　構築を示す。

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）融合タン白質をコードするＤＮＡ配列であつて、
   内部Ｌｙｓ残基を含まないＥＧＦ又はＥＧＦ類似体にＬ
   ｙｓ残基を介して結合しているキャリアータン白質から
   成り、その融合タン白質からＥＧＦ又はＥＧＦ類似体を
   Ｌｙｓ特異性プロテアーゼにより切断可能であることを
   特徴とする、上記配列。
2. （２）ＥＧＦ又はＥＧＦ類似体はｍＥＧＦ、ｍＥＧＦ１
   −４５、ｍＥＧＦ１−４７、ｍＥＧＦ１−４８又はｍＥ
   ＧＦ１−５１である、特許請求の範囲第１項記載のＤＮ
   Ａ配列。
3. （３）ＥＧＦ又はＥＧＦ類似体は停止コドンに直接つい
   ている、特許請求の範囲第１項又は第２項記載のＤＮＡ
   配列。
4. （４）次のＤＮＡ配列： 【遺伝子配列があります】 を導入する、特許請求の範囲第３項記載のＤＮＡ配列。
5. （５）融合タン白質は２種以上のＥＧＦ又はＥＧＦ類似
   体を含む、特許請求の範囲第１項又は第２項記載のＤＮ
   Ａ配列。
6. （６）縦列に結合しているＥＧＦ又はＥＧＦ類似体のＤ
   ＮＡ配列のリピートから成る、特許請求の範囲第５項記
   載のＤＮＡ配列。
7. （７）キャリアータン白質はＴｒｐＥタン白質の一部で
   ある、特許請求の範囲第１項から第６項のいずれか１項
   に記載のＤＮＡ配列。
8. （８）特許請求の範囲第１項から第７項のいずれか１項
   に記載のＤＮＡ配列を導入しかつ形質転換した宿主にお
   いて、融合タン白質を発現しうるベクター。
9. （９）プラスミドである、特許請求の範囲第８項記載の
   ベクター。
10. （１０）融合タン白質の発現がｔｒｐプロモーター／ア
    テニュエーターの制御下にあるようにＴｒｐオペロンの
    一部を導入し、かつキャリアータン白質はＴｒｐＥ遺伝
    子の一部である、特許請求の範囲第８項又は第９項記載
    のＤＮＡ配列。
11. （１１）融合タン白質の発現はｔａｃプロモーター／オ
    ペレーターの制御下にある、特許請求の範囲第８項又は
    第９項記載のベクター。
12. （１２）特許請求の範囲第８項から第１１項のいずれか
    １項記載のベクターで形質転換した宿主。
13. （１３）宿主は大腸菌である、特許請求の範囲第１２項
    記載の形質転換宿主。
14. （１４）内部Ｌｙｓを含有しないＥＧＦ又はＥＧＦ類似
    体の製造法において、融合タン白質が発現するように、
    特許請求の範囲第１２項又は第１３項記載の形質転換宿
    主を培養し、ついで融合タン白質をＬｙｓ特異性プロテ
    アーゼで処理して、ＥＧＦ又はＥＧＦ類似体を放出させ
    ることを特徴とする、上記方法。
15. （１５）Ｌｙｓ特異性プロテアーゼはエンドプロテイナ
    ーゼＬｙｓＣである、特許請求の範囲第１４項記載の方
    法。
16. （１６）特許請求の範囲第１４項又は第１５項記載の方
    法により得たＥＧＦ又はＥＧＦ類似体を動物に投与する
    ことを特徴とする、動物の脱毛方法。
17. （１７）ＥＧＦ又はＥＧＦ類似体を毛を刈る羊に使用す
    る、特許請求の範囲第１６項記載の方法。
18. （１８）十分量のＥＧＦ又はＥＧＦ類似体を羊に投与し
    て、平均ステープル引き抜き力を２〜６Ｎ／ｋｔｅｘに
    滅ずる、特許請求の範囲第１７項記載の方法。