PT93956A

PT93956A - Metodo de purificacao de proteinas utilizando fusoes ctap-iii

Info

Publication number: PT93956A
Application number: PT93956A
Authority: PT
Inventors: Paul H Johnson; Ping Sze; Richard C Winant
Original assignee: Stanford Res Inst Int
Priority date: 1989-05-04
Filing date: 1990-05-04
Publication date: 1991-02-08
Also published as: AU5567090A; EP0477200A4; CA2016018A1; US5179196A; WO1990013560A1; EP0477200A1

Description

TITULAR: SRI INTERNATIONAL

EPÍGRAFE: MÉTODO DE PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS UTILIZANDO FUSÕES CTAP-III

MEMÓRIA DESCRITIVA

Campo técnico da Invenção A presente invenção refere-se, na generalidade, aos campos da biotecnologia e purificação de proteínas. Mais particularmente, a invenção refere-se ao campo de expressão de proteinas, tecnologia de DNA recombinante, para criar as proteínas de fusão expressas de forma estável, e melhorar a produço de polipéptidos expressos de forma insuficiente em hospedeiros microbianos, e à purificação dos componentes individuais da proteina de fusão

Antecedentes da invenção

Muitas proteinas heterólogas não são capazes de serem expressas em Escherichia coli em quaisquer quantidades mensuráveis e, se detectáveis, não são capazes de serem expressas a niveis comercialmente recuperáveis devido à instabilidade da proteina estranha no hospedeiro. As pequenas proteinas (e.g., hormonas peptidicas de menos de 100 aminoácidos), parecem ser especialmente sensíveis à degradação ou proteólise do hospedeiro. 1

0 grau de instabilidade varia de hospedeiro para hospedeiro, e de proteina para proteina.

Assim, em muitas situações, por razões que não foram completamente esclarecidas, proteinas heterólogas, apesar do uso de promotores transcricionais activos e elevado número de cópias de plasmideos, são produzidas em apenas menores quantidades, se não completamente, num microorganismo hospedeiro. Mais ainda, aqui descrito com grande detalhe, os sistemas de expressão, que são bastante adequados para expressão, à escala laboratorial, de uma proteina desejada, não são adequados para fermentação de alta densidade.

Um dos modos através do qual se tem resolvido os problemas da instabilidade ou de degradação proteolitica serve-se do uso de uma sequência de DNA que codifica tuna proteina adicional que, por si própria, é estável numa célula hospedeira e que liga esta sequência à sequência de código da proteina desejada. Um pequeno número de proteinas procarióticas tem sido usada como auxiliar de fusão desta forma; E. coli lacZ, trpE, cloranfenicol acetil transferase (CTA), recA ecll lambda, por exemplo.

Enquanto a literatura estabelece que proteinas de fusão são úteis para expressão de proteinas heterólogas em bactérias, as tentativas para usar proteinas de mamiferos como auxiliares de fusão, para a expressão ou aumento da produção recuperável de proteinas heterólogas, não têm sido referidas. Mais particularmente, não foi referido o uso do péptido activador do tecido conjuntivo III humano (também referido como CTAP-III) como um componente na construção de proteinas de fusão para 2 estabilizar a expressão de uma proteina insuficientemente expressa ou instável. A luz do facto de que muitas proteinas importantes não podem ser expressas com sucesso na bactéria em qualquer produção comercialmente recuperável, há a necessidade de desenvolver sistemas adequados para a fermentação de alta densidade, para expressão bacteriana e recuperação de tais proteinas.

REVELAÇAO DA INVENÇÃO A invenção consiste num método para a produção de uma proteina heteróloga num microorganismo, compreendendo: (a) Expressão de uma proteina de fusão possuindo uma primeira sequência de aminoácidos, uma segunda sequência de aminoácidos, e um sitio selectivo que possa ser clivado para fornecer o primeiro e o segundo fragmentos do polipéptido, respectivamente, em que o referido primeiro fragmento é homólogo do CTAP-III, tendo os referidos primeiro e segundo fragmentos os primeiro e segundo valores de pi; (b) Clivagem da referida proteina de fusão para fornecer os primeiro e segundo fragmentos; e (c) Separação dos referidos primeiro e segundo fragmentos por cromatografia de troca iónica.

Nas modalidades escolhidas para este método, a primeira sequência de aminoácidos codifica CTAP-III(Leu2i), e a segunda sequência de aminoácidos corresponde à hirudina ou ao péptido laminin B^. Utiliza-se cromatografia de troca aniónica, após a clivagem da proteina de fusão por brometo de cianogénio, para separar os polipéptidos, o que demonstrou ser uma fase de purificação particularmente eficaz para a recuperação dos 3 polipéptidos em questão.

BREVE DESCRICAO DAS FIGURAS A Fig.l representa a sequência de nucleótido e principais caracteristicas estruturais do sistema de expressão bacteriana para a proteina CTAP-III. A Fig.2 é um diagrama que mostra a estratégia de ligação para a construção do gene sintético para a variante 1 de hirudina (HV-1). A Fig.3 é um diagrama que mostra a estratégia de ligação para a construção do gene sintético para o factor 4 das plaquetas (PF4). A Fig.4 é um diagrama que mostra a estratégia de ligação para a construção do gene sintético para a variante 1 do factor 4 das plaquetas (PF4varl). A Fig.5 é um diagrama que mostra a sequência de nucleótidos e aminoácidos da proteina de fusão pBR-CRM/CTAP (Leu2i)/HIR. A Fig.6 é um diagrama que sumariza a construção do vector de expressão do CTAP-III(LeU2i)/HIR. A Fig.7 é um diagrama que mostra o perfil de purificação de fase reversa HPLC da(s) proteina(s) CTAP- IIl/lamBi-40 antes (A) e após (B) clivagem por brometo de cianogénio. A Fig.8 é um diagrama que mostra a instabilidade de hirudina livre e a estabilidade do CTAP-III expressa em coli. A Fig.9 é um diagrama que demonstra a estabilidade da proteina de fusão CTAP-III/hirudina até 11 horas após a indução 4 da expressão em E^ coli. A Fig.10 é um diagrama de fluxo que ilustra o processo de purificação para a hirudina. A Fig.ll é um diagrama que ilustra a quantificação da expressão da hirudina pela separação da hirudina e do CTAP-III, usando a fase reversa HPLC após a clivagem por brometo de cianogénio. A Fig.12 é um diagrama que ilustra a purificação de hirudina por cromatografia de interacção hidrofóbica (HIC). A Fig.13 é um diagrama que ilustra o grau de pureza da hirudina após a etapa final de purificação, como calculada pela fase reversa HPLC analítica.

MODOS DE REALIZAR A INVENÇÃO A. DefiniçOes

Os termos "proteina heteróloga", "péptido heterólogo", "polipéptido heterólogo" são usados permutavelmente e referem-se a um péptido ou pelo menos, a uma sua porção, a qual não está normalmente contida no genoma da célula hospedeira. Exemplos de proteinas heterólogas incluem péptidos virais e eucarióticos codificados por cDNA, DNA genómico ou DNA sintético ou suas combinações. 0 termo aqui usado "expressão de proteina de forma estável" refere-se a uma propriedade do péptido activador do tecido conjuntivo-III, componente da proteina de fusão, que confere estabilidade invulgarmente alta in vivo a uma proteina estranha. Por exemplo, a hirudina possui uma semi-vida em coli de, aproximadamente, 10 minutos; contudo a fusão de hirudino 5 CTAP-III tem uma semi-vida superior a 10 horas. "Fermentação de alta densidade" refere-se a um nivel de densidade celular correspondendo aproximadamente a uma densidade óptica superior a 10 a 650 nm, e que resulta na produção de proteina em cerca de 50 a 1000 mg/1. "Alta expressão de proteina" ou "Expressão de proteina aumentada" refere-se a um nivel de expressão onde a proteina de fusão pode compreender 5% ou mais do total de proteina produzida por cada célula. A ordem de grandeza preferida para niveis de alta expressão de proteina é de 10 ou 30% ou mais do total de proteina celular. "Péptido activador do tecido conjuntivo-III" ou "CTAP-III" , como aqui usado, refere-se a um polipétido que ocorre naturalmente, isolado a partir de plaquetas humanas que é capaz de activar células do tecido conjuntivo. Um gene sintético que codifica CTAP-III humana ou análogo do CTAP-III, no qual a metionina na posição 21 é substituida por leucina, é descrito na Publicação Internacional No. W085/01067, publicado a 14 de Março de 1985, e aqui incorporado especificamente para referência. "Polipétido CTAP-III homólogo", como aqui usado, refere-se a uma composição e sequência de aminoácidos que é (a) substancialmente semelhante à sequência primária de CTAP-III humana, nativa, e (b) tem actividade biológica que é comum à CTAP-III nativa. Semelhança substancial da sequência de aminoácidos significa que as sequências são idênticas ou diferem por uma ou mais alterações de aminoácidos (delecçâo, adições, substituições) que não provocam dissemelhancas funcionais adversas entre a proteina alterada e o CTAP-III humana nativa. 6 "Ponto isoeléctrico diferencial" ou " pi diferencial", como aqui usado, considera uma diferença de nivel inicial minimo de aproximadamente 1,5 unidades de pH, entre os polipéptidos CTAP-III e o péptido em questão. Esta diferença permite a separação da molécula de CTAP-III do polipéptido heterólogo usando cromatografia de troca iónica em condicões de pH adequadas. Se a proteina heteróloga em questão tem pi semelhante ao do CTAP-III(Leu2i) ( que tem um pi de aproximadamente 7,8), podem ser usadas técnicas de mutagenese localmente dirigidas para introduzir sitios de clivagem específicos no polipéptido CTAP-III. A molécula CTAP-III alterada irá, após a clivagem, alterar o pl e densidade de carga dos fragmentos do péptido CTAP-III resultantes, para permitir a separação eficaz dos fragmentos CTAP-III da proteina heteróloga em questão, usando cromatografia de troca iónica.

B. Péptido activador do tecido conjuntivo humano III A CTAP-III, com a substituição da leucina, no aminoácido da posição 21, tem sido construída usando um total de 38 oligonucleótidos sintéticos como descrito em W085/01067, supra. Como foi mostrado na Fig. 1 , o gene é dividido em três fragmentos: fragmento I = EcoRI a BamHI; fragmento 11= BamHI a Xbal; e fragmento 111= Xbal a EcoRI. Os asteriscos na Fig. 1 indicam o limite dos 38 oligonucleótidos. Os oligonucleótidos foram sintetizados pelo método fosfotriéster (Ohtsuka et al (1982) Nuc Acids Res 1: 6553-6560), purificados, caracterizados, e ligados para produzir o gene completo, usando metodologia convencional. 7

Como foi descrito na secção de definição, o gene que codifica o CTAP-III, que é usado para construir o gene hibrido da invenção pode incluir modificações do CTAP-III humana, nativa. Uma tal modificação envolve substituição da metionina na posição 21 da sequência de aminoácidos CTAP-III (aqui e posteriormente referidas como CTAP-III(Leu2i))· A metionina pode ser substituída por um aminoâcido que não afecte adversamente a estabilidade da molécula. São preferidos os aminoácidos que possuem propriedades hidrofóbicas e cadeias laterais aciclicas semelhantes, como a leucina, isoleucina, e valina. A leucina é um substituto particularmente preferido. A substituição da metionina interna torna a proteina modificada insensível a agentes, tal como brometo de cianogénio, que fazem a clivagem das cadeias polipetidicas especificamente nos residuos de metionina.

Outras modificações podem ser feitas no CTAP-III para alcançar o efeito oposto, que é introduzir metioninas internas nas posições designadas para afectar o ponto isoeléctrico (pi)/ e a distribuição de cargas de certos fragmentos de CTAP-III que são formados após a clivagem por brometo de cianogénio. Para as proteínas com um pl semelhante ao do CTAP-III (Leu2i) / isto é, entre cerca de 6,5 e 8,5, o (CTAP-III (Leu2i) tem um pl de, aproximadamente, 7,8), então é usada CTAP-III (Met2i) na construção da fusão. A seguir à clivagem por brometo de cianogénio, são produzidos dois fragmentos derivados da CTAP, tendo pis de cerca de 4,2 e 9,3 . Neste caso pode ser usada cromatografia de troca iónica para completar a purificação da proteina em questão, através de manipulação adequada do pH da solução tampão e da eluição do gradiente salino. 8 3 A CTAP-III é produzida a niveis elevados em Ej_ coli, sob o controlo de uma região reguladora da colicina modificada e tem uma semi-vida tão longa que não pode ser medida com precisão; isto é, a proteina parece ser infinitamente estável nas células. Por essa razão, foi escolhida para ser usada como componente de fusão para testar se iria conferir esta estabilidade a outras proteínas. Na prática desta invenção, as proteínas de fusão assim construídas podem utilizar CTAP-III quer na terminação amina quer na terminação carboxi do péptido heterólogo. Mais vulgarmente, proteínas de fusão produzidas por via bacteriana são construídas de modo que a proteina heteróloga em questão compreenda a terminação carboxi. Tais construções permitem a libertação simultânea da proteina de fusão e da metionina do terminal amina, após a clivagem no sitio de clivagem. A clivagem de uma proteina ou polipétido é aqui definida como a hidrólise de uma ligação peptidica numa proteina ou polipéptido.

Em contraste com as proteinas bacterianas endógenas usadas como auxiliares de fusão, o CTAP-III possui propriedades farmacêuticas desejáveis . Os CTAPs estão a ser investigados como fármacos para a regeneração do tecido conjuntivo (e.g., cicatrização de feridas). (Ver Castor et al (1985) Biochemistry 24:1762-1767.) Assim, na prática da invenção, a expressão da proteina de fusão-CTAP permite a recuperação de duas proteinas desejáveis em produções comercialmente viáveis.

C - Vectores de fusão CTAP-III 0 vector plasmideo bacteriano, empregue para a expressão do gene híbrido da invenção, é uma modificação do vector pNP6 9

descrito em Waleh e Johnson (1985) Proc Natl Acad Sei USA R2:8389-8393 e WO 85/01067, supra, os quais foram aqui especificamente incorporados para referência. Este plasmideo é um derivado pBR322, em que um sub-fragmento do operão colicina EI foi clonado no sitio PstI do pBR322. O sub-fragmento da colicina El consiste numa sequência de controlo da expressão da colicina El, compreendendo um promotor, um sitio operador para a ligação repressora, um sitio de ligação ribossómica, um codão de iniciação da tradução, parte do gene estructural da colicina El, e uma terminação transcricional. A sequência de controlo da expressão contém uma região reguladora da iniciação transcricional induzivel, na qual o promotor pode ser regulado por um repressor sensivel à temperatura, lexA, um inactivador-repressor induzivel pela temperatura, recA, ou por indução quimica.

Modificações subsequentes neste plasmideo têm removido várias extensões do gene estrutural da colicina El, desde 54 nucleótidos de um total de 1566 (dando origem à fusão colicina-504) a 1554 nucleótidos (dando origem a um péptido colicina El com 4 aminoácidos). Outras modificações incluem (1) alterações na região promotora; (2) a introdução de sitios de restrição únicos; (3) remoção da sequência GAP (proteina repressora catabólica).

As alterações na sequência do promotor foram feitas para construir um promotor que se assemelhasse mais rigorosamente a uma sequência promotora correspondente (Hawley e McClure (1983) Nuc Acids Res 13.:2237-2255). Estas alterações na região -10 da região reguladora do pNP6 reforçaram o promotor colicina El. Sitios de restrição únicos Xhol e Hpal foram introduzidos 10 entre o operador lexA e o sitio da ligação ribossómica (S-D) para permitir que a região reguladora e a sequência de código, para o dominio amino terminal do gene inserido, sejam manipuladas mais facilmente. Vários sitios de restrição únicos (StuI, por exemplo), têm sido introduzidos a montante do promotor, permitindo assim que a "cassette" de expressão (as regiões de controlo genético e o gene sintético em questão) seja prontamente transferida. Por fim, a região de ligação CAP no pNP6 foi removida, permitindo assim, a indução das células que contêm este plasmideo de expressão, num meio de cultura contendo glucose. A sequência de nucleótidos e as caracteristicas estruturais principais deste sistema de expressão modificado para CTAP-III (pNP6-CRM/CTAP) são mostradas na Fig.l. As sequências de nucleótidos originais na região promotora são indicadas por parêntesis.

D- EXPRESSÃO DA PROTEÍNA HETEROLOGA

Quando a expressão directa (e.g., expressão de uma sequência de DNA que codifica uma proteina livre de proteinas endógenas ou fragmentos de proteinas) resulta na produção de uma proteina estável em bactérias, a proteina contém, tipicamente, uma metionina no terminal amino, que pode ou não ser removida eficazmente por enzimas hospedeiros. Em segundo lugar verificou— se que um número de proteinas estranhas não podem ser expressas em qualquer produção significativa em bactérias. Verificou-se ser útil o método de fusão na proteção de proteinas que, de outro modo, seriam consideradas proteinas estranhas ou produtos peptidicos de degradação intracelular. A presente invenção 11 fornece um vector de expressão que produz uma proteína excepcionalmente estável para uso nas fusões com qualquer número de proteínas heterólogas. Este vector também oferece o beneficio adicional de o CTAP-III, uma proteina de mamíferos de interesse e de utilidade, poder ser expresso e recuperado em associação com a proteina em questão. São discutidas a seguir modalidades especificas de um número de proteínas heterólogas para serem usadas na presente invenção. A Hirudina é uma pequena proteina isolada a partir das glândulas salivares da sanguessuga medicinal, Hirudo medicinalis. E o mais potente e mais especifico inibidor conhecido da trombina, a protease sérica que actua na regulação da hemostasia e que catalisa a fase final da coagulação sanguínea—conversão do fibrinogénio em fibrina coagulada. A hirudina mostrou ser um anticoagulante eficaz e agente anti-trombótico, em animais e seres humanos, e pode ser unicamente adaptada ao tratamento clinico de tromboses arteriais e venosas -particularmente como auxiliar na terapia fibrinolitica, coagulação intravascular disseminada, deficiência anti-trombina— III, e talvez algumas formas de cancro metastásico.

As estruturas primárias das três variantes da hirudina, designadas por HV-1, HV-2, e HV-3, foram determinadas, e o alinhamento da sequência de aminoácidos é descrito a seguir, juntamente com a sequência consensual. A linha superior é HV-1, a linha do meio é HV-2, a terceira linha é HV-3, e a última linha é a sequência concensual. 12

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As letras minúsculas indicam posições de variabilidade. Para a sequência consensual, as minúsculas indicam uma posição comum para duas das três variantes. Posições marcadas por um hifen (-) e sublinhadas (_) indicam variabilidade completa e deleçcão, respectivamente. Vários laboratórios construíram genes sintéticos para HV-1 e expressaram hirudina biológicamente activa. Fortkamp et al [(1986) NA 5511-517; em "Hemostasis and Animal Venoms" (Pirkle e Markland, eds.) pp. 295-306, Mareei Dekker, Basel, 1988] fizeram a fusão de um gene sintético de hirudina com um gene repressor Cl cortado do lambda bacteriófago para criar uma proteína hibrida com uma metionina adicional no ponto de fusão. Apesar de a proteina de fusão ser inactiva como inibidor da trombina, a clivagem por brometo de cianogénio na metionina isolada liberta hirudina activa. De igual modo, Bergmann et al [(1986) Bio Chem Hoppe Seyler 367:731-740] produziram HV-1 como uma fusão com beta-galactosidase. Dodt et al [(1986) FEBS Lett 202:273-277] subsequentemente aumentaram as produções de expressão usando uma fusão com a sequência de sinal da fosfatase alcalina que permite 13 li

que a hirudina seja excretada para o periplasma de coli e seja recuperada na sua forma nativa com elevada actividade biológica. Braun et al [(1988) Biochem 27:6517-65221 usaram um sistema secretor diferente, contendo o péptido de sinal da principal proteina da membrana exterior da E_;_ coli, OmpA,para secretar HV-1 correctamente processada e activa.

Harvey et al [(1986) Proc Natl Acad Sei USA 83:1081-1088] construíram um património de cDNA a partir de tecidos de sanguessuga e demonstraram múltiplas cópias. Análises de hibridação pela técnica de Northern sugeriram a existência de três espécies de mRNA distintas que codificam a hirudina, e análises de hibridaçâo pela técnica de Southern sugeriram a existência de vários genes. Um cDNA que codifica a variante HV-2 da hirudina foi expresso intracelularmente em coli, sob o controlo do promotor do lambda bacteriófago, mas com fraca produção (EP 158,564, publicado a 16 de Outubro de 1985). A HV-2 foi subsequentemente expressa em leveduras com uma produção significativamente aumentada , usando um sistema secretor que permite o processamento correcto da proteina madura (Loison et al (1988) Biotechnol 6:72-77; French 2,611,723, publicado a 9 de Setembro de 1988).

Enquanto que estes sistemas são aceitáveis para a produção de hirudina à escala laboratorial, como se evidencia a partir dos resultados fornecidos pela Tabela 1, nenhum deles é aceitável para a fermentação de alta densidade e produção de hirudina. 14 TABELA 1

EXPRESSÃO MICROBIANA DE RECOMBINANTES DA HIRUDINA vector/ 1 Produção Act.Es U/ir Organismo promotor Modo Variante (mg/1) E. coli ptg927 lam-PL I HV-2 <0.01 — E, coli pHIR21- tac > P HV-1 4 560IU E. coli pMFl, pRudi2 lacUV5/tac I HV-1 4.8 8,500 E. coli pHIR20 lam-PL I HV-1 0.16 500IU Levedura pTG1833 PGK s HV-2 1.6 13,000AT E. coli pNP64RI-CRM/ HIR4 I HV-1 10-15 11,300AT E. coli 1 pIN-III-ompA2 Ipp/lac P HV-1 13 I,intracelular; S, secreção extracelular; P, secreção periplásmica 2 AT-U, unidades antitrombina; IU, unidades internacionais 3

Produção após purificação . Braun et al (1988) Biochem 27:6517 4

Descrito no exemplo 4 A hirudina usada nos exemplos seguintes é produzida a partir de. um DNA sintético que codifica a variante HV-1. Contudo, como é aqui usado, "hirudina" pretende referir-se a qualquer uma das três variantes e suas variações óbvias. A construção do gene que codifica a hirudina é fornecida nos exemplos e a sequência de DNA é fornecida na Fig. 2.

Outras proteínas com interesse, para usar na presente invenção, incluem proteínas de ligação da heparina, como o factor 4 das plaquetas e uma variante da proteina do factor 4 das plaquetas descoberta recentemente (colectivamente referido como "PF4"). 0 PF4 é uma proteina secretada pelas plaquetas com várias funções biológicas, incluindo actividades de pró-coagulação, anti-heparina, imuno-regulação, e quimiotácticas. 0 PF4 foi isolado a partir do sangue de bovinos, ratos e humanos, e purificado para homogenização [Wu et al (1977) Prep Biochem 7:479; Doi et al (1987) Mol Cellular Biol 7?898; e Levine e Wohl (1986) J Biol Chem 251:324, respectivamente) e a sua sequência de aminoácidos e propriedades fisico-quimicas foram determinadas (ver Walz et al (1977) Throm Res 11:893)» Uma sequência de cDNA é divulgada por Poncz et al (1987) Blood 69ϊ219, que codifica uma sequência principal completa de 30 aminoácidos precedida por uma metionina e seguida por uma região que codifica uma proteina madura com 70 aminoácidos. A expressão bacteriana do PF4 é divulgada no Pedido de Patente Europeia No. 89.300128.9, depositado em 6 de Janeiro de 1989, cuja divulgação é aqui incorporada para referência. Como é ai explicado, um gene sintético para PF4 consiste em 243 pares de bases de DNA que são reunidas a partir de dois sub-fragmentos principais (designados por I e II), constituídos por oito e quatro oligonucleótidos, respectivamente. Os 12 oligonucleótidos foram sintetizados num Applied Biosystems DNA Synthesizer, utilizando a quimica da fosforamidite.

Os 12 oligonucleótidos sintéticos foram purificados, caracterizados, e ligados para produzir fragmentos I e II como 16

ilustrado na Fig 3. Os oligonucleótidos usados para construir este gene , introduzem sitios de restiçâo EcoRI nos limites deste gene, facilitando assim a subclonagem deste gene, como um simples fragmento EcoRI, num vector de expressão.

Recentemente foi descoberta uma variante do gene do PF4, designado por "PF4varl". O termo "PF4", como é aqui usado, pretende referir-se a qualquer uma destas duas proteínas. A clonagem e expressão do gene que codifica esta nova proteina é descrito em Green et al (1989) Mol Cell Biol 9(4):1445-1451 e em no pedido de Patente co-pendente Norte-Americano com o No. de série 07/302,425, depositado em 26 de Janeiro de 1989, ambos aqui incorporados especificamente para referência. A sequência de cDNA para PF4varl indica que, no que respeita à proteina madura, os resíduos de aminoâcidos que diferem do PF4 estão todos localizados na porção carboxi da molécula, especificamente nas

posições 58 (Pro--->Leu), 66 (Lys--->Glu), e 67 (Leu---> His). A natureza destas alterações pode ter um efeito significativo na estrutura e função do PF4varl. Em adição a estas alterações na proteina madura, o PF4varl inclui uma inserção de três argininas e várias outras variações de aminoâcidos na sequência principal.

Como foi explicado em cima para o PF4, pode ser construído um gene sintético que codifica o PF4varl, usando oligonucleótidos semelhantes aos usados para o PF4 mas contendo as alterações de bases apropriadas para as posiçoes 58, 66, e 67 dos aminoâcidos. A Fig 4 ilustra uma sequência de DNA sintético para a expressão do PF4varl. Os 12 oligonucleótidos usados para criar a sequência total de código, unidas por duas sequências de ligação EcoRI, são indicadas pelas setas em cima da sequêncis de 17 DNA.

Também foi expresso , como uma proteina de fusão-CTAP, um péptido laminin antimetastásico, usando o vector da presente invenção. Este péptido partilha uma correspondência substancial com a região que abrange os residuos dos aminoácidos de 897 a 936 na proteina laminin Βχ humana (Pikkaraimen et al (1987) J Biol Chem 262:10454-10462). A sequência do péptido é:

Pro^-Cys Pro Asp Gly Pro Asp Ser Gly Arg Gin Phe Ala Arg Ser Cys Tyr Gin Asp Pro Vai Thr Leu Gin Leu Ala X Vai Cys Asp Pro Gly Tyr Ile Gly Ser Arg Cys Asp Asp-Y, onde Proí é quer Pro quer des-NH2Pro, X é quer Cys, quer seleccionado a partir do grupo constituído pelos aminoácidos alifáticos neutros, e Y é quer -OH quer -NH2. Como são aqui usados, aminoácidos alifáticos neutros são definidos como alanina, valina, leucina, isoleucina, serina e treonina, especialmente a serina.

Um gene sintético que codifica este péptido de 40 aminoácidos, designado aqui por LamB^-40, está ilustrado no Exemplo 7. As especificações da sua construção são fornecidas com algum detalhe nos seguintes exemplos. E. Cultura de Células Hospedeiras

Estirpes hospedeiras usadas em clonagem e expressão procariótica são largamente disponíveis e incluem estirpes de E♦ coli como MC1060, DH1, RR1, C600hfl, HB101, JA221, MM294, e JM101. O mecanismo de regulação do vector de expressão do pNP6 e seus derivados baseia-se na inducibilidade do operão colicina EI da E^ coli por agentes quimicos ou fisicos que danificam o 18 DNA. Como é sabido pelos especialistas deste campo, outros sistemas de vectores para além do sistema colicina EI sao controlados do mesmo modo. A mitomicina C mostrou ser o agente de indução quimica mais eficaz. Contudo, o uso de mitomicina C para a produção de proteínas, tendo aplicações farmacêuticas, requer a remoção completa ou inactivação desta droga quimica durante o processo de produção e purificação, que é um processo trabalhoso e dispendioso. A luz ultravioleta (UV) é igualmente eficaz na indução do operão da colicina El. Contudo, um sistema de indução UV não pode ser facilmente adaptado a culturas em grande escala a nivel industrial. Por esse motivo, são necessários mecanismos alternativos aplicáveis à indução da expressão de genes heterólogos para a produção industrial das suas proteínas recombinantes codificadas. Um sistema desejável deve ser simples, barato e o seu uso não deve requerer métodos especiais no processo de purificação.

Uma vez que o promotor da colicina El é regulado por controlo negativo (por exemplo, uma proteina repressora, codificada pelo gene lexA, ligado ao operador), pode ser utilizada a iniciação da transcrição através da alteração da temperatura, alternativamente, ou em adição , a indução pode ser realizada por activação induzida pela temperatura da proteina recA que resulta na inactivaçâo do repressor lexA. Deste modo para desenvolver um modo de indução barato, simples , é empregue uma estirpe hospedeira sensível à temperatura. Tais estirpes incluem DM511, DM936 e DM1187 (Mount et al, (1975) J Bacteriol 121:1203-1207). Estas estirpes possuem uma mutação quer nos 19 genes recA quer nos lexA que são desreprimidos para funções SOS e fazem a expressão do gene hibrido desejável no vector pNP6 a altos niveis quando a temperatura se altera de 30°C para cerca de 42° C. Como será apreciado pelos especialista neste campo, os plasmideos que transportam as mutações ts podem ser também utilizados para os objectivos da presente invenção. 0 presente modo de indução para a expressão do gene hibrido desejado, a niveis elevados, pode também ser aumentada pela adição de bases de ácidos nucleicos ou nucleósidos, preferivelmente bases purinicas ( por exemplo, adenina ou adenosina; contudo a base livre, timina, também funciona bem), ao meio de cultura, ao mesmo tempo da indução para amplificar os efeitos das mutações sensiveis à temperatura do recA e lexA e resulta na expressão ainda maior das funções reguladas por SOS. 0 melhoramento possui uma expressão pelo menos 10% superior para além da observada para induções sensiveis à temperatura. F. Purificação

Os microorganismos transformados crescem num meio de cultura tipicamente adequado, a uma densidade óptica (OD) de, pelo menos, cerca de 10 a 650 nm, e preferencialmente entre cerca de 20 e 40 ou superior a 650 nm. A composição do meio de cultura irá depender do microorganismo particular envolvido e irá conter, tipicamente, fontes assimiláveis de carbono e azoto, fontes de energia como a glucose, e magnésio, iões sódio e potássio e, opcionalmente, aminoácidos e bases púricas e pirimidinicas.

Depois das células terem sido recolhidas da cultura, podem ser concentradas, se necessário, a cerca de 0,1 a 1,0 g/ml, preferencialmente de 0,2 a 0,5 g/ml por filtração, centrifugação, 20 ou outros métodos convencionais. A seguir à concentração, a lise celular é completada pela destruição das membranas celulares. Podem ser usadas, nesta fase do processo, técnicas de destruição celular convencionais como homogenização, sonicação, ou compressão ciclica. Os métodos preferidos são sonicação ou homogenização com um Destruidor Celular Stansted (Stansted Cell Disrupter). 0 ponto final da fase de destruição pode ser monitorizada por densidade óptica , com a densidade óptica da suspensão a decrescer tipicamente a cerca de 65% a 85%. Em qualquer caso, a destruição deve quebrar substancialmente todas as células de modo que substancialmente não haja células intactas que subsistam na primeira fase de purificação. Antes da destruição, a força iónica e o pH da fase liquida do concentrado são ajustados, se necessário, para um nivel que facilite a remoção das proteínas da coli nas etapas subsequentes, enquanto retem a proteina de fusão como um complexo insolúvel nos restos celulares. 0 pH pode ser ajustado por adição de tampões adequados. Na maioria dos casos, o pH usado será na ordem de grandeza de cerca de 7,5 a cerca de 9,0. A solubilização de proteina de fusão é realizada num meio caotrópico usando um desnaturante forte como o sal de guanidina ou ureia, apesar de poderem ser utilizados detergentes como Triton, SDS e sais do ião tiocianato. Tipicamente, uma variação de concentração de 1 a 7 M para os sais de guanidina é manipulável, sendo preferida a 4-6 M, enquanto os detergentes são usados na ordem de 1-2% de solução. 0 pH da solução deve ser também compatível com as caracteristicas da proteina de fusão.

Uma vez que a proteina de fusão está solubilizada, deve 21 s

ser depois clivada selectivamente de acordo com a natureza do sitio de clivagem selectiva. Um dos métodos para fazer a clivagem selectiva utiliza o brometo de cianogénio. Esta técnica requer a ausência de uma metionina disponível que nao a do sitio de clivagem, ou a capacidade- para distinguir selectivamente entre uma metionina que vai ser clivada e uma metionina do interior da sequência do polipéptido. Alternativamente, pode ser utilizada uma protease que reconheça e faça a clivagem no sitio identificado por um tipo particular de aminoácido. Proteases comuns incluem tripsina, quimotripsina, pepsina, bromelaina, papaina ou semelhantes. A tripsina é especifica para aminoácidos básicos e faz a clivagem no lado carboxilico da ligaçao peptidica quer para a lisina quer para a arginina. Existem também enzimas que fazem clivagem nas sequências especificas dos aminoácidos. A enteroquinase bovina faz a clivagem no lado carboxilico da lisina ou arginina que é precedida pelos residuos ácidos do ácido aspártico, ácido glutâmico, ou carboximetil cisteina . Outras enzimas que reconhecem e fazem a clivagem de sequências especificas incluem: colagenase, factor X, e o enzima processador da trombina e de poliubiquitina.

Se a proteina solubilizada vai ser purificada por troca iónica, o agente solubilizante pode ser removido por diálise ou um processo equivalente como diafiltraçâo ou cromatografia liquida de fase reversa (LC).

As fases no processo de recuperação subsequentes à fase de clivagem, s3o principalmente destinadas a separar o polipéptido heterólogo em questão do CTAP-III e das proteínas endógenas de E^ coli, para fornecer a proteina heteróloga com um 22 elevado nível de pureza (preferivelmente a pelo menos cerca de 85% ef mais preferivelmente, a cerca de 95%) em produção de alta densidade de pelo menos cerca de 50 mg/1 e, mais preferivelmente, cerca de 50 a 500 mg/1. A seguir à etapa de clivagem, os componentes do polipéptido da proteína de fusão podem ser facilmente isolados numa forma substancialmente pura usando cromatografia de troca iónica. Pode ser usada cromatografia de troca, quer catiónica quer aniónica, dependendo das propriedades de carga diferencial dos dois componentes do polipéptido, ou se o CTAP-III fôr recuperado no todo ou em fragmentos.

Os produtos de reacçâo de clivagem são sujeitos a cromatografia de troca iónica para purificar a proteina heteróloga em questão. Utiliza-se cromatografia de troca aniónica quando a proteina heteróloga é ácida. Neste caso é preferível uma resina de troca aniónica forte possuindo os grupos catiónicos ligados a um suporte sólido. Os suportes polissacarideos são geralmente preferidos e incluem resinas de troca iónica usadas comummente, como por exemplo, contas de dextran, agarose ou celulose.

Os especialistas neste campo reconhecerão que a resina de troca aniónica forte se refere a resinas com grupos catiónicos que mantêm a sua carga positiva ao longo de uma variação de pH relativamente alargada. Os grupos catiónicos, ligados ao suporte, podem ser seleccionados a partir de grupos de amónia quaternária, como -CH2CH2N+(CH2CH3)2CH2CH(OH)CH3. Exemplos de resinas de troca aniónica adequadas, comercialmente disponíveis para serem utilizadas na prática desta invenção, incluem QAE-Sephadex A-25, 23 DE-52, QE-52 celulose, Cellex QAE, Safarose-Q e Mono Q de fluxo rápido. A resina de troca aniónica é geralmente utilizada na forma de uma coluna compacta. Esta coluna é geralmente calibrada usando técnicas convencionais e a solução dos produtos da reacção de clivagem é introduzida na coluna. 0 CTAP-III (Leu 2l) 3ue possui um pi alcalino (aproximadamente 7,8) não se liga eficazmente a valores de pH abaixo de, aproximadamente, 6,8, e a proteina em questão tendo um pi ácido, não se liga à coluna. A proteina em questão é eluida/separada, aumentando-se a força iónica da solução tampão, tipicamente de 0 a 0,75 M NaCl. A coluna pode ser regenerada através da lavagem com solução de NaOH e detergentes não iónicos para remover qualquer proteina residual contaminante ou agentes solubilizantes e a coluna pode ser calibrada.

Por exemplo, quando quer a hirudina quer o péptido laminin são fundidos com CTAP-III (Leu2i) pode ser utilizada uma coluna de troca aniónica (por exemplo, quer Sefarose-Q ou Mono-Q da Pharmacia), para separar as duas proteínas com base nas diferenças nos seus pontos isoeléctricos (hirudina=3,8, péptido laminin Bi=3,65, CTAP-III=7,8). Num tampão pH 5,5, a hirudina liga-se à coluna de troca aniónica enquanto o CTAP-III não o faz. DiluiçOes da hirudina podem ser realizadas com um gradiente linear (0 a 0,5 M) de NaCl. Fraçcões "pool" de hirudina tipicamente superiores a 90% pura, podem ser sujeitas facultativamente a posterior purificação usando cromatografia de interaçcão hidrofóbica (HIC), cromatografia de filtração gel, cromatografia liquida de fase reversa (RP-LC), ou suas 24 combinações. A fase de troca iónica pode também utilizar uma coluna de troca catiónica por onde os grupos aniónicos são ligados ao suporte sólido. Nesta concretização, podem ser usadas as resinas adequadas, comercialmente disponíveis , incluindo por exemplo, celulose carboximetil (CM) e Sefadex sulfopropil. Neste ambiente CTAP-III (Leu 2i) é ligado à coluna e a proteina em questão, neste exemplo, possuindo um pl mais ácido do que 0 CTAP-III, subirá na coluna e pode ser recuperado a partir dela. As condições de eluição para a recuperação do CTPA- -III são semelhantes às descritas para a troca aniónica.

Do mesmo modo, para a purificação de uma proteina desejada, por exemplo PF4, que tem um valor de pi semelhante ao do CTAP-III (aproximadamente 7,8), a sequê ncia natural, CTAP-III (Met 21) 6 usada na construção da fusão. A seguir à clivagem por brometo de cianogénio, o CTAP-III (Met 21) é clivado em dois péptidos com valores aproximadamente de pi 4,2 e 9,3, que podem ser prontamente separadas da proteina PF 4 por cromatografia de troca iónica, tal como descrita acima.

As amostras de proteinas podem ser reduzidas por incubação com um agente redutor tal como ditiotreitol (DTT), mercaptoetanol, glutationa, ou cisteina , para evitar a formação de pontes dissulfito intermoleculares ou intramoleculares, durante o processo de recuperação e antes de usar qualquer uma das fases de cromatografia subsequentes.

Cromatografia de interacção hidrofóbica utiliza suportes hidrofóbicos, tais como fenil-sefarose, fenil-T SK HPLC ou fenil superose. Este processo separa as proteinas baseando-se 25 ao contrário da nas propriedades hidrofóbicas da proteina, cromatografia de troca iónica que separa as proteinas baseando-se na propriedade de carga da proteina. A selecção dos tampões apropriados e as condições de eluiçâo são conhecidas dos especialistas neste campo. A cromatografia de filtração em gel pode ser realizada em duas etapas que remove ambos os componentes pirogénicos e os contaminantes da proteina possuindo pesos moleculares superiores ou inferiores ao da proteina heteróloga desejada, ( Por exemplo, a hirudina tem um peso molecular de cerca de 7.000 (pH baixo) e desloca-se a 28.000 (pH neutro) Kilodaltons). Os gels que são capazes de fraccionar a solução para permitir a separação da hirudina daqueles contaminantes estão comercialmente disponíveis. A coluna deverá ter o tamanho que permita a resolução adequada dos componentes desejados. Uma vez que, no processo da invenção, a proteina tem um nivel de pureza alto (virtualmente, sempre tão alto como 85% ou mais), após a fase de troca iónica, a desvantagem usual—e.g., a capacidade diminuída da filtração gel quando comparada com a troca iónica, não diz respeito a este caso.

Enquanto que a filtração gel é um método preferido, RP-LC tal como RP-HPLC é uma alternativa viável. RP-LC é capaz de remover moléculas da solução que tem pesos moleculares aproximados aos da proteina heteróloga recuperada e não podem ser, por isso, removidas completamente por filtração gel. Em adição, são também removidos eficazmente pelo RP-LC os contaminantes, como a endotoxina bacteriana. Contudo, uma vez que são usados na fase de eluição ácidos orgânicos como ácido acético 26

ou ácido trifluoracético e um solvente orgânico como propanol ou acetonitrilino , podem ser encontrados traços desses sistemas de eluiçao ligado à proteina purificada.

Assim que a proteina é recuperada da fase de cromatografia ê enrolada, o que, no caso da hirudina, acontece rapidamente a alta concentração, mas para outras proteinas pode requerer tratamento com um composto sulfridilico, sob condições de oxidação e concentração mais baixa da proteina. As condições de enrolamento podem incluir o uso de vim tampão "redox" contendo ambas as formas, reduzida e oxidada, dos compostos sulfidrilicos por exemplo, beta-mercaptoetanol, glutationa, cisteamina ou cisteina, como descrito na Patente Norte Americana No. 4.511.502.

Todas as preparações finais da proteina podem ser, por rotina, caracterizadas por HPLC analítica, espectroscopia U.V., composição de aminoácidos, análise de sequência de aminoácidos N-terminal e espectrometria de massa. A produção final do material purificado é, pelo menos, de 40 mg/1 e preferivelmente, 50 a 100 mg/1 de cultura.

G. TESTES PARA PROTEÍNAS HETEROLOGAS

Existe uma variedade de testes de actividade desenvolvidos para determinar a qualidade da preparação de hirudina e para utilizar na quantificação da hirudina em várias experiências bioquímicas e farmacológicas. Dois desses métodos foram aperfeiçoados e podem ser rotineira e reproduzivelmente usados . 0 primeiro, um teste de substrato cromogénico mede a inibição pela hirudina da capacidade da trombina para hidrolizar pequenos substratos peptidicos sintéticos. 0 segundo, um teste de 27 coagulação da fibrina mede a cinética da formação de coágulos, usando quer plasma humano quer o fibrogénio purificado como

I substrato da trombina.

No teste cromogénico, a actividade da antitrombina é obtida medindo a inibição da libertação de p-nitroanalina do substracto cromogénico H-D-fenilalanil-L-pipecolil-L-arginina-p-nitroanileto dihidrocloreto (S-2238, fornecida por Kabivitrum) pela trombina, em presença da hirudina. A concentração de trombina é de 2 nM (tipicamente 0,12 NIH unidades/ ml, e a hirudina pode ser testada reproduzivelmente a uma concentração aproximada na ordem dos 0,3 a 1 nM, usando substrato 296 uM em tampão Tris 50 mM, lOOmM NaCl, pH 7,8, e polietileno glicol-6000 0,1% (PEG). PEG é incluído para inibir a ligação da trombina à superfície plástica da microplaca ou cuvette; pela mesma razão, os vasos de reacção são pré-tratados com PEG-20.000 a 1% antes do teste. A hirudina inibe a conversão, mediada pela trombina, do fibrinogénio num coágulo de fibrina. Esta actividade anti— coagulatória pode ser testada pela monitorização da formaçao de coágulos quando o fibrinogénio humano purificado (10 mg/ml) é misturado com trombina (0,06 NIH unidades/ml) e variando concentrações de hirudina várias em Tris 50 mM , NaCl 100 mM, PEG 0,225% , pH 7,4. A concentaçâo de hirudina a 50% de inibição, é depois calculada a partir da curva de titulação.

Um dos testes para medir a actividade imunoestimulatória do PF4 pode ser realizado injectando ratinhos intravenosamente com um agente imunossupressor como a concanavalina A (Con A), juntamente com eritrocitos de carneiro 28 (SRBC) e medindo a redução da produção de anticorpos contra SRBC usando um teste de formação de rosetas. A supressão parece ser induzida pela proliferação de células T do fenótipo supressor provocado pela Con A . PF4 restaura a resposta imune através da inibição ou inversão da activação das células T supressoras.

Um dos testes usados para medir a actividade do péptido laminin Βχ mede a ligação das células tumorais que possuem o receptor laminin ao péptido imobilizado na superfície da cultura de tecidos (Graf et al (1987) Cell 48:989-996). Este teste é um método conveniente e sensivel para as medições de rotina da ligação do receptor celular laminin e, por isso, um bom indicador da actividade antagónica do laminin.

Os exemplos seguintes ilustram ainda as concretizações várias da invenção. Estes exemplos não pretendem limitar de qualquer modo, a invenção. Nestes exemplos todos os valores da temperatura, a menos que seja indicado o contrário, estão expressos em graus celsius.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Preparação de vectores de Expressão Derivados do pNP6 A construção de um vector pNP6, derivado do pBR322, compreendendo a sequência controlo da expressão da colicina El, é descrita em WO 85/01067, supra, bem como em Walesh e Johnson (1985), supra, e uma estirpe E^ coli MM294 transformada com este vector foi depositada na "American Type Culture Collection" sob o número ATCC 39418. Derivados deste vector como o pNP6&RI/Col(4)/ 29 » CTAP(Leu2lc)r aqui referidos como pNP6/CTAP-III-NM0D, úteis na prática da presente invenção são também descritos em WO85/01067 ou são aqui fornecidos. A- 0 plasmideo pNP6/SRI foi criado para remover o sitio EcoRI localizado perto do gene resistente à tetraciclina no interior da sequência pBR322 original, criando assim um sitio único EcoRI no interior do gene colicina. 0 vector pNP6 foi digerido com EcoRI em condições de reacçâo limitadas de forma a produzir moléculas lineares (clivadas em apenas um dos dois sitios). Purificam-se as moléculas lineares de pNP6 por electroforese gel de agarose, e subsquentemente reagiram com DNA polimerase I, e todos os quatro desoxiribonucleóctidos trifosfatos, de modo a preencher as extremidades das cadeias simples. As moléculas resultantes foram circularizadas numa reacção de ligação da extremidade cega, utilizando ligases T4 e depois usadas para transformar Ej_ coli 294.

Para a transformação em E^ coli 294, uma cultura crescida em "L-broth" durante a noite, foi diluida 1:100, em meio "L-broth" fresco, e incubada com agitação a 37° C até que a D.O 600 atingisse 0,6. Neste ponto, centrifugou-se 35 ml de cultura, a 6.000 rpm durante 10 minutos a 4°C, e resssuspendeu-se o pellet em 20 ml de CaCl2 0,05 M. AS células foram incubadas em gelo durante 15 minutos antes de serem recolhidas por centrifugação a 4.000 rpm, durante 10 minutos. Ressuspenderam-se as células em 4 ml de CaCl2 0,05 M e misturaram-se com 200 μΐ de uma solução de DNA preparada por adição de 50 μΐ da mistura de emparelhamento e 150 μΐ Tris-HCL 10 mM (pH 7,5) contendo MgCl2 10 mM e CaCl2 10 mM. Incubou-se a mistura a 0°C durante 25 minutos, seguida de uma 30

incubação a 50°C durante 10 segundos e à temperatura ambiente, durante 10 minutos. Neste ponto, adicionou-se 14 ml de "L-broth" e a cultura foi agitada a 37°C durante 30 minutos. Depois, adicionou-se à cultura 480 μΐ da solução de tetraciclina 1,25 mg/ml, e a incubação continuou durante mais 30 minutos. Foram plaqueadas aliquotas de 100 μΐ, em placas de agar preparadas de fresco contendo 25 ml de "L-broth", 1,5% de agar e 25 μg/ml de tetraciclina . Testaram-se depois os transformantes resistentes à tetraciclina (Tc ), para determinar a sua a sensibilidade à q ampicilina (Ap ), por plaqueamento em agar contendo 25 μg/ml de ampicilina.

As colónias transformantes Tcr Aps foram depois pesquizadas para a produção espontânea da colicina. Assinalaram— se as colónias simples nas placas de L-agar e incubaram-se a 37°C durante a noite. As colónias foram mortas por exposição ao vapor de clorofórmio, depois cobertas com 5 ml de L-broth contendo agar a 0,7 % e 0,1 ml de uma cultura crescida durante a noite de E. coli K-12. Depois de o agar ter solidificado, as placas foram incubadas durante a noite a 37°C. Marcaram-se as colónias com uma zona de inibição em seu redor, como produtoras de colicina.

Os transformantes produtores de colicina foram seleccionados e o DNA do plasmideo foi isolado a partir de clones individuais e digerido com EcoRI, para identificar aqueles que contêm um simples sitio EcoRI intacto no interior do gene da colicina. A localização do sitio EcoRI simples foi confirmada por mapeamento adicional da endonuclease de restrição. B. 0 Plasmideo pNP6ARI/Col(4)/CTAP(Leu2i) foi construído pela 31 digestão do pNP6£SRI com SstII (SacII) e enzimas de restrição EcoRI. 0 fragmento maior, contendo as sequências de replicação e de regulação do gene colicina, foi separado do fragmento menore contendo o gene da colicina, por electroforese gel e ligado a um DNA sintético (contendo a sequência de código do CTAP-III (Leu2i)) com um terminal coesivo SstII, no terminal de código araino-terminal, e um terminal coesivo EcoRI no terminal de código carboxi-terminal, como se mostra a seguir —ATG GAA ACC GC G ATG---------TAA TOA CTGCAG AATTC—

Met Glu Thr Ala Met CTAP-III(Leu2i> —TAC CTT TGG CGC TAC---------ATT ACT GACGTCTTAA G—

Usou-se o DNA do piasraideo recombinante resultante, para transformar células de coli 294; testaram-se para a expressão da proteína CTAP-III, colónias seleccionadas para a resistência à tetraciclina; isolou-se o DNA a partir de clones que demonstravam expressão positiva e verificou-se a estrutura correcta da construção, pela análise da sequência do DNA. Detalhes dos métodos são descritos nos exemplos subsequentes. C. Um vector de fusão da colicina, pNP6âRI/Col(150), pode ser preparado para a criação de um gene hibrido de tamanho médio, contendo os 150 aminoácidos da colicina que precede o gene em questão. A construção do pNP6£RI/Col(150)/PF4 é descrita com pormenor no Pedido de Patente Europeia No. 89300128.9, supra, e aqui incor‘porado para referência. Sumariamente, a construção deste plasmideo foi iniciada pela clonagem da sequência genética sintética que codifica PF4 (ilustrado na Fig.3), no sitio único EcoRI do pNP6£RI. Este plasmideo recombinante codifica uma 32 proteína colicina de 504 aminoácidos fundida através de um resíduo de metionina com a proteína PF4 de 70 aminoácidos.

Um derivado melhorado do pNPÉjâRI/Col (504) /PF4 foi construido por redução subsequente do tamanho do segmento de colicina. Assim, um gene hibrido de tamanho médio foi construido por supressão de, aproximadamente, 1.000 pb do DNA do pNP6£RI/Col(504)/PF4 em condições de digestão parcial do EcoRV. Existem três sitios de restrição EcoRV no pNP6£RI; dois no interior do gene estrutural colicina EI e o outro no interior do gene tetraciclina. Uma vez que os transformantes são seleccionados para Tcr, apenas resultarão os transformantes desejados tendo o fragmento EcoRV suprimido do gene colicina . 0 plasmideo resultante , pNP6j£RI/Col(150)/PF4, codifica apenas 150 aminoácidos da colicina que precede a sequência de código de iniciação do PF4 (no sitio EcoRI), e contém 1 único residuo de metionina ligando o segmento colicina e o PF4. A fusão deste segmento menor de colicina com a proteina do PF4 demonstrou aumentar a recuperação e a purificação do PF4. O tamanho do péptido de fusão da colicina pode ainda ser reduzido a vim segmento com 57 aminoácidos por supressão da região entre o SstII e o sitio de restrição simples do EcoRV no plasmideo pNP6£Rl/Col(150)/PF4. 0 DNA do pNP6âRI/Col(150)/PF4 purificado, foi clivado em moléculas lineares com enzimas de restrição SstII e depois tratado com polimerases DNA T4 e dCTP, condições nas quais a actividade da exonuclease 3' e 5' da polimerase, converte as terminações geradas pelo SstII do DNA do plasmideo em extremidades cegas. 0 DNA produzido nesta reacção foi clivado com enzimas de restrição EcoRV e o fragmento maior de 33 DNA resultante foi purificado, convertido em DNA circular, numa reacção de ligação de DNA e depois usado para transformar células. 0 plasmideo resultante, designado por pNP6£RI/Col(57)/PF4 , codifica os 57 aminoácidos da colicina que precede a sequência de código do PF4, e contém um único residuo de metionina ligando o segmento da colicina ao PF4.

Estes vectores de fusão da colicina modificados foram subsequentemente usados em experiências para expressar a hirudina e um péptido laminin B^ descritos aqui.

Exemplo 2

Construção do pBR-CRM/CTAP(Leu?η) A. Construção de uma Região (Promotora) Reguladora da Colicina Modificada (CRM)

Desenhou-se e construiu-se uma região reguladora modificada do promotor da colicina El. As alterações de nucleótidos introduzidas são sumarizadas na Fig 1. 0 oligómero sintético de 151 bases foi sintetizado num Applied Biosystems 380A de DNA synthesizer, em oito fragmentos, quatro segmentos complementares de outros quatro , concebidos de tal modo que partilham sequências complementares de 7 a 10 pares de base nas suas extremidades sobrepostas.

Purificaram-se os fragmentos sintetizados por electroforese gel. As terminações 5' dos polinucleótidos foram fosforiladas usando-se quinase polinucleotidica T4 e marcadas com 32 [gama- P]-ATP. As cadeias complementares foram emparelhadas e ligadas. 0 DNA com 151 pares de base foi purificado em gel e 34 ligado à EcoRI-HindIII clivada, purificou-se os fragmentos grandes do plasmideo bacteriano pBR322, substituindo assim a sequência promotora Tet excisada'. Designou-se a construção resultante por pBRG8. Uma vez que o promotor sintético substituiu a sequência Tet excisada, os transformantes resistentes à ampicilina foram pesquisados para determinar a resistência à tetraciclina após o tratamento com Mitomicina C (indução do promotor da colicina). 0 DNA plasmideo das colónias seleccionadas, foi purificado e analisado por meio da digestão de enzimas de restrição, bem como por hibridação de manchas para detectar a presença das sequências de DNA sintéticas. A sequência promotora sintética foi verificada pela sequenciaçâo do DNA de cadeias duplas seguintes *

5'-AATTCAGGCC TGACGTCGAC AGTCTTGACA GGGAAAATGC 3'-GTCCGG ACTGCAGCTG TCAGAACTGT CCCTTTTACG AGCGGCGTAT AATGTGTGCT GTATATAAAA CCAGTGGTTA TCGCCGCATA TTACACACGA CATATATTTT GGTCACCAAT * * *

TATGTACAGT ATTTATTTGT TAACTCGAGT GTTTTAAAAG ATACATGTCA TAAATAAACA ATTGAGCTCA CAAAATTTTC J * TCAAAGAGGA TTTTATAATG GAAACCGCGG A-5' AGTTTCTCCT AAAATATTAC CTTTGGCGCC TTCGA-31 B. Removeu-se a região reguladora da colicina, modificada(CRM) do plasmideo pBRG8, por digestão enzimática de restrição, e clonou-se no plasmideo pNP6£RI/Col(4)/CTAP (Leu2i), substituindo a região reguladora antiga da colicina El. Designou-se a nova construção por pNP6ARI-CRM/CTAP (Leu2i). 35

C. 0 plasmideo pNP6£RI-CRM/CTAP (Leu2i) foi digerido com enzimas de restrição Aatll e Seal, e o fragmento contendo as regiOes reguladoras da colicina do gene CTAP-III foi purificado. O plasmideo pBR322 foi digerido com enzimas de restrição Aatll e NruI e o fragmento maior contendo o gene da resistência à ampicilina e a origem da replicaçâo foi purificado. Ligaram-se os dois fragmentos (Seal e NruI produzem terminações blunt e assim podem ser ligados juntamente) para a produção do novo vector de expressão do plasmideo designado por pBR-CRM/CTAP (Leu2i)·

Exemplo 3

Construção do Gene da Hirudina 0 gene sintético para a hirudina (Fig.2) consiste em 228 pares de bases do DNA que são reunidos a partir de dois sub-fragmentos principais (designados por I e II), compostos por dois conjuntos de seis oligonucleótidos separados no sitio BamHI. Os 12 oligonucleótidos foram sintetizados num Applied Biosystems DNA Synthetizer, usando-se a quimica da fosforamidite.

Purificaram-se, caracterizaram-se e ligaram-se os 12 oligonucleótidos sintéticos, para produzirem os fragmentos I e II, conforme descrito a seguir e ilustrado na Fig.2.

Purificação e Caracterização dos Oligonucleótidos 1. Purificação

Foram preparados geis de poliacrilamida (12%) com ureia 7 M, Tris-borato 90 mM, e tampão EDTA 2 mM. Foram formados reservatórios das amostras com um pente com dentes com pelo menos 36 2 cm de largura. Três horas depois o gel foi submetido a uma pré-electroforese durante 30 minutos. Misturaram-se volumes iguais de 1 a 5 A26O unidades das amostras dos oligonucleótidos não purificados , e 7 M de ureia com tampão Tris-HCl , 10 mM, pH 7,5. Adicionou-se a amostra de DMA ao gel, e adicionou-se a cada um dos reservatórios uma mistura corada (0,17% azul de bromofenol, 0,27% cianol xileno, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5), para monitorizar a taxa de migração dos oligonucleótidos. A electroforese foi realizada a 400 a 600 volts até o azul de bromofenol ter migrado 30 cm a partir do topo do gel. Removeram-se ambas as placas, envolveu-se o gel numa capa de plástico, e o DNA foi visualizado usando luz UV de ondas curtas. Retirou-se cuidadosamente a banda desejada usando uma lâmina. Colocou-se o pedaço de gel num tubo Eppendorf e esmagou-se com uma vareta de vidro. Depois adicionou-se 0,5 ml de TE (Tris-HCl 10 mM,EDTA 1 mM, pH 7,5) ao tubo, o qual ficou a rodar durante a noite para a extracçâo do DNA. Centrifugou-se o tubo a 15.000 rpm durante 10 min. e recuperou-se o sobrenadante. A amostra de DNA foi diluida 10 vezes com TE, ligada a uma coluna Sep-Pak C-18 e lavada com 20 ml de água para a dessalinização. A recuperação do DNA por eluiçâo de acetonitrilo é, geralmente entre 50 e 80%. Liofilizou-se o eluido e depois ressuspendeu-se em 0,5 ml de água. 2. Marcação das Terminações, Electroforese Gel e Autoradioqrafia

Liofilizaram-se 10 pmoles da amostra. Dissolveu-se a amostra seca em 1 μΐ de tampão quinase lOx concentrado (Tris-HCl 700 mM, pH 7,6, MgCÍ2 100 mM, KC1 1 mM, ditiotreitol 50mM), 5 μΐ 32 '3 * de H2O, 66 pmoles de ATP frio, 0,6 pmoles de (ATP-[ -P-gama], 1 μΐ de spermidina (lmM), 1 μΐ da solução quinase T4 contendo, pelo menos, 70 unidades de terminações coesivas (NEB) de actividade. A amostra foi incubada durante 30 min a 37°C. Após a adição de 5 μΐ da mistura corada, a amostra foi adicionada ao gel poliacrilamida (20%, 0,4 mm de espessura, 15 cm de comprimento), e electroforizada até o azul de bromofenol migrar até ao cimo do gel, e autoradiografada por exposição do gel à pelicula de raios X durante 10 a 30 minutos. 3. Emparelhamento e Ligação dos oligonucleótidos A Fig 2 mostra os 12 oligonucleótidos usados na construÇo do gene sintético. Os oligonucleótidos de 1 a 6, e de 7 a 12 compõem os fragmentos I e II, respectivamente. Estes dois fragmentos foram unidos in vitro, e subclonados em vectores M13 como é descrito a seguir.

Os dois conjuntos de 6 oligonucleótidos purificados foram emparelhado , ligados e subclonados em vectores M13 designados por M13-HIR (I) e M13-HIR(II). Para cada um dos fragmentos (I ou II), foram misturados os pares complementares da extremidade 5' dos diferentes oligonucleótidos fosforilados, aquecidos a 95°C durante 2 min, e depois emparelhados por arrefecimento gradual até 40°C. Os três oligonucleótidos de cadeia dupla ( com extremidades sobrepostas) de cada fragmento foram misturados e incubados juntos a 37°C, durante lh antes da ligação .

Misturas de reacção para a ligação consistem em Tris-HC1 50 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, ditiotreitol 20 mM, ATP 1 mM, 38 100 pmoles de DNA (concentração de extremidades 5'), 100 unidades de extremidades coesivas (NEB) de ligases T4, num volume total de 100 μΐ. Incubaram-se as misturas de reacção durante a noite a 16°C. 4. Sistemas de Transformação

Cultivou-se E_^ coli num meio 2x YT até a ODq60 se situar entre 0,6 e 0,7 . Recolheram-se as células por centrifugação, ressuspenderam-se em CaCl2 50 mM (metade do volume da cultura), e conservaram-se em gelo durante 20 minutos. Recolheram-se e ressuspenderam-se as células competentes em 1/10 de volumes de CaCl2 50 mM. 0 DNA das formas replicadas (RF) M13 comercialmente disponível, que tinha sido previamente digerido com endonucleases EcoRI e BamHI, foi ligado aos fragmentos I e II da hirudina, e misturado com as células JM101 competentes e conservado em gelo durante 40 minutos. A mistura foi submetida ao calor a 42°C, durante 2 minutos, e misturada com IPTG , Bluo-gal, agar fluido (46°C), e com as células JM101 crescidas de fresco. Plaqueou-se a mistura em placas de agar YT e incubou-se durante a noite a 37°C.

As células JM101 transformadas por M13 intacto sintetizaram beta-galactosidase e produziram placas azuis. As células transformadas por Ml3 contendo um fragmento de hirudina não sintetizaram beta-galactosidase e produziram placas brancas. 5· Preparação do DNA das Formas Replicadas M13 (RF) ou do DNA do PLasmldeo

Um litro de células, contendo o fragmento da hirudina, cresceu durante a noite na presença de 25 μg/ml de tetraciclina e adicionou-se 100 μg/ml de cloranfenicol ( para amplificação dos 39 plasmideos), a uma densidade celular apropriada, e deixou-se a crescer durante a noite. As células foram colhidas por centrifugação durante 20 min a 5000x g a 4°C, e depois suspendidas em 200 ml de TEN (10, 1, 150) e recentrifugadas. Ressuspenderam-se as células em 5 ml de glucose 50 mM, EDTA 10 mM e Tris 25 mM (pH 8,0), e transferiram-se para dois tubos de centrífuga de 30 ml com tampa de rosca.

Adicionaram-se ao tampão anterior 5 ml de lisozima a 4 mg/ml (2,5 ml a cada tubo) e agitaram-se suavemente os tubos, por inversão, e incubaram-se durante 10 min à temperatura ambiente ou 30 min no gelo. A seguir, adicionaram-se 20 ml (10 ml a cada tubo) de NaOH 0,2 N e SDS a 1%. A solução foi misturada suavemente por inversão (20 a 30 vezes) ou por meio de um vortex suave, e depois incubada durante 10 min à temperatura ambiente. Cerca de 15 ml (7,5 ml para cada tubo) de acetato de potássio 3M e ácido fórmico 4,4% (pH 4,8) foram depois adicionados e misturados suavemente para permitir que o DNA cromossomático viscoso e a proteina formassem um coágulo. A solução foi incubada durante 1 h no gelo e depois centrifugada durante 20 min a 10.000 x g. Adicionou-se um volume de isopropanol à solução sobrenadante que foi depois centrifugada durante 10 min a 10.000 x g. 0 sobrenadante foi decantado e os pellets foram lavados com 10 ml de etanol 70% a -20°C. Os pellets foram centrifugados durante 5 min a 10.000 x g, o etanol foi removido e os pellets secaram ao ar in vacuo. Subsequentemente, os pellets foram dissolvidos em 1,0 ml de TE e tratados com 20 pg/ml de RNase A livre de DNAse, durante 30 min a 37°C. A mistura de reacção foi depois extraida com 40 clorofórmio: alcóol isoamilico (24:1) e aplicada (com glicerol 5% e corante 0,02%) a uma coluna de agarose M BioGel A-50 com 2,5 x 25 cm. As fracçòes "pool" de DNA foram precipitadas com etanol, extraidas com fenol, reextraidas com etér, reprecipitadas com etanol, lavadas, secas e ressuspendidas em 1,0 ml de TE. 6. Purificação e Caracterização dos Fragmentos

Os fagos recombinantes foram pesquizados do seguinte modo para determinar a presença dos fragmentos X e II do gene da hirudina. A cultura dos fagos cresceu num meio YT contendo células hospedeiras JM101. O DNA das formas replicadas (RF) de cadeia dupla do M13-HIR(I) ou do M13-HIR(II) foi isolado como descrito acima. O DNA padrão de cadeia simples foi isolado a partir do sobrenadante lisado por precipitação em NaCl 2,5 M, PEG 20% (6.000), durante 30 min, em gelo extraido com fenol, e depois precipitado com etanol e acetato de sódio. A sequência de ambos os fragmentos foi confirmada pela sequenciação dideoxi M13. Os fragmentos foram removidos do DNA RF por digestão com endonucleases de restrição EcoRI e BamHI, e purificados por electroforese de

Colloids), num tampão Tris-acetato 50 mM, pH 8,2. 0 fragmento do gene da hirudina, visualizado através da luz ultravioleta de onda longa, após ter sido corado com brometo de etidio, foi excisado do gel com uma lâmina. 7. Ligação dos Fragmentos I e II dos Genes da Hirudina

PorçOes do gel, contendo os fragmentos do gene da hirudina, foram fundidos a 70°C, durante 5-15 min', e, depois, 41 equilibrados a 37°C. Após a adição de um volume igual de tampão, mantido no gelo, concentrado 2x contendo as ligases T4, a mistura de ligação foi incubada durante a noite a 20°C. A ligação foi terminada quelatando o MgCl2 com EDTA, em concentrações molares iguais e inactivando as ligases a 70°C durante 15 min. A mistura de reacçâo foi digerida com EcoRl para produzir o monómero do gene da hirudina. 8. Transformação do Gene da Hirudina Intacto A reacção de restrição EcoRl foi terminada como referido acima e ligada ao vector de clonagem M13 desfosforilado, previamente digerido com endonucleases EcoRl. A mistura de ligação na agarose de SeaPlaque ® foi refundida e diluida por vim factor de 10 a 50 em TCM, conservado no gelo (Tris 10 mM, pH 7,5, CaCl2 10 mM, MgCl2 10 mM), antes da transformação nas células JM101 9. Pesquisa e Sequenciação de Clones

Pesquisaram-se os fagos recombinantes rapidamente, quanto à presença da sequência da hirudina como se segue. 0 DNA RF foi reduzido com EcoRl endonucleases e o DNA de cadeias simples do fago, dos clones que produziam o padrão de restrição EcoRl de diagnóstico correcto foi isolado como foi descrito acima, e usado o padrão da sequenciação do M13 dideoxi. Esta construção M13 possui dois sitios EcoRl e foi designada por M13— HIR. 42 Μ

Exemplo 4

Construção de Vectores de Expressão da Hirudina

A. Vector pPN6ARI/Col(4)/HIR

Desenhou-se um linker-HL sintético para criar um sitio SstII e suprimir o sitio EcoRI que precede a sequência que codifica a hirudina no M13-HIR. Os dois oligonucleótidos de cadeia simples do linker foram sintetizados, purificados e fortalecidos para formar:

5' - CGACCGCGGTAATGGTTGT-3 TGGCGCCATTACCAACATA

Ambos, vector M13-HIR e linker-HL emparelhado, foram digeridos com Accl endonucleases e depois ligados. As células JM101 foram transformadas com o DNA ligado, os transformantes foram pesquisados por análise de restrição SstII e o DNA de cadeia simples do fago foi isolado e sequenciado.

Separou-se o fragmento HIR-HL do vector RF usando digestões SstII e EcoRI, e purificou-se por electroforese gel de agarose

Após a digestão SstII e EcoRI do vector plasmideo pNP6ARI/Col(4)/CTAP(Leu2i) e a electroforese gel para remover o gene CTAP, ligou-se o fragmento HIR-HL ao DNA do plasmideo digerido com SstII e EcoRI. A mistura de ligação foi usada para transformar células competentes de E.coli 294 RecA + e foi conservada no gelo durante 40 min. A mistura foi submetida ao calor durante 2 min a 42°C e misturada com "L-broth", incubada a 37°C durante 1 h antes do plaqueamento em placas de agar LB contendo 25 ml de "L-broth", 1,5% de agar, 25 μg/ml de tetraciclina. As placas foram incubadas durante a noite a 37°C. 43

Foram pesquisados transformantes Tcr com

Kpnl endonuclease (única para o gene hirudina) e a sequência do DNA plasmideo foi confirmada por técnicas de sequenciação dideoxi de cadeia dupla. 0 plasmideo expressa um pequeno polipéptido de fusão, contendo quatro residuos da proteina colicina (Col4) ligada à proteina da hirudina através de um residuo de metionina. A clivagem quimica da proteina de fusão da hirudina/col(4), pelo brometo de cianogénio, liberta a proteina da hirudina livre.

β. Vector pNP6ARI/col(504)/HIR

Ligou-se o gene da hirudina sintético do M13-HIR ao fragmento maior do gene da colicina (residuos 1-504), para investigar o potencial para a expressão aumentada e a estabilidade da hirudina. um linker ColHL sintéticos 5'-CGACGAATTCTGTTAACCATGGTTGT-3' ( TGCTTAAGACAATTGGTACCAACATA ) foi concebido para facilitar a clonagem e ajustar a estrutura de leitura do gene da hirudina no novo vector. Os dois oligonucleótidos de linkers de cadeia simples foram sintetizados, purificados , emparelhados e ligados a um fragmento digerido pelo

Accl, do M13-HIR RF contendo o gene da hirudina. O DNA ligado foi transformado em células JM101 e os transformantes foram pesquisados por digestão Hpal e EcoRI, e o DNA de cadeia simples dos fagos foi sequenciado. 0 fragmento HIR-ColHL foi separado do M13RF por digestão EcoRI, purificado por electroforese gel de agarose

SeaPlaque~> e depois clonado no sitio EcoRI simples do vector de expressão do plasmideo pNP6ARI. Os transformantes Tcr foram 44 pesquisados com endonucleases Hpal quanto à presença de enxerto, e com PstI para a orientação do enxerto. A sequência do DNA do plasmideo foi confirmada através de técnicas dideoxi de cadeia dupla. Este vector de expressão produz uma grande proteina de fusão da hirudina incluindo os residuos 1-504 do gene da colicina. C. Vector pNP6"RI-CRM/HIR Um linker sintético 5'-CGCTCGAGTGTTTTAAAAGTCAAAGAGGATTTTATAATGGTTGT-3' ( 3 ' -GAGCTCACAAAATTTTCAGTTTCTCCTAAAATATTACCAACATA-5 ' ) foi concebido para criar um sitio Xhol e eliminar o sitio 5'

EcoRI do M13-HIR. Os dois oligonucleótidos de cadeia simples do linker foram sintetizados, purificados, emparelhados e ligados a um fragmento Accl contendo hirudina do M13-HIR-RF. O DNA RF do M13 de ligação HIR das células JM101 transformadas, foi pesquizado com Xhol e o DNA de cadeia simples do fago foi sequenciado. 0 fragmento de ligação HIR foi removido do RF usando--se digestão Xhol e EcoRi, e separado por electroforese gel de agarose SeaPlaqu^. Depois, o fragmento foi clonado no vector pNP6ARI-CRM/CTAP(Leu2i) (descrito no exemplo 2B), que tinha sido previamente digerido com Xhol e EcoRi, para remover o gene CTAP. *r

Transformantes Tc foram pesquisados com Kpnl endonucleases— um sitio único que reside no interior do gene da hirudina. A sequência do DNA do plasmideo foi confirmada através de técnicas dideoxi de cadeias duplas. Esta construção foi designada por pNP6£Rl-CRM/HlR e contem a região reguladora da colicina melhorada (CRM). 45 D. Construção de Vectores Derivados para as Fusões Colicina--Hirudina A construção das fusões dos genes colicina-hirudina é semelhante à metodologia explicada no exemplo 1C para os vectores derivados compreendendo as sequências dos genes hibridos colicina-PF4. 0 vector pNP6ARI/Col(150)/HIR foi construido removendo o fragmento EcoRV de, aproximadamente, 1.000 pb, a partir do vector pNP6ARl/Col(504)/HIR , e o vector pNP6âRI/Col(57)/HIR foi construido removendo o fragmento Sstll-EcoRV de, aproximadamente, 279 pb a partir do pNP&aRI/Col(150)/HIR.

E. Construção do pBR-CRM/CTAP(Leu 21)/HIR O gene da hirudina foi inserido no vector de expressão para o péptido laminin Βχ (descrito no exemplo 7C), como ilustra a Fig 6. Um linker R sintético foi desenhado para facilitar a inserção do gene da hirudina na estrutura de leitura correcta com o gene CTAP. Os dois oligonucleótidos de cadeia simples do linker foram sintetizados, purificados, fortalcidos e ligados a uma hirudina contendo o fragmento da digestão Accl da M13-HIR RF. 0 DNA ligado foi usado para transformar as células JM101. Os transformantes de M13-HIR-R foram pesquisados por sequenciaçao dideoxi M13 de cadeia simples.

Separou-se o fragmento HIR-R do RF por digestão EcoRl e (g\ electroforese em gel de agarose SeaPlaque^. Inseriu-se o 46 fragmento HIR-R no sitio EcoRI simples do pBR-CRM/CTAP(Leu2i)/LamBi-40, entre o gene CTAP e o gene LamBi-40. A seguir à transformação das células, foram depois pesquisados V* transformantes resistentes à tetraciclina (Tc ) com Kpnl endonuclease, para detectar a presença do gene hirudina , e Hpal para a correcta orientação do enxerto. A sequência correcta do DNA do plasmideo foi confirmada por técnicas de sequenciação com dideoxi de cadeia dupla, e o DNA para a proteina de fusão é mostrado na Fig 5. 0 resultante vector de expressão do plasmideo para a hirudina, designado por pBR-CRM/CTAP(Leu2i)/HIR, produz uma proteina de fusão excepcionalmente estável, entre CTAP(Leu2i) e a hirudina, ligada por um segmento de 5 aminoácidos (Arg-Ile-Leu-Val-Asn) e uma Met simples, precedendo exactamente a sequência da proteina da hirudina.

Exemplo 5

Estabilidade no Estudo dos Impulsos e na Marcação de Encaixes

Tipicamente, 100 ml de culturas E.coli RecA+ contendo genes sintéticos da colecção de plasmideos derivados da colicina pNP6, codificando quer genes livres quer genes de fusão, cresceram num meio M9CA : (Na2HP04 42 mM, KH2PO4 22 mM, NaCl 8,6 mM, NH4CI 1,8 mM, MgSC>4 2 mM, 0,5% de glucose, CaCl2 0,1 mM,

Tiamina-HCl 1 mM, 0,2% ácido casamino) a 37°C até a ODggo =0,36- 0,4. Tipicamente, uma aliquota de 0,5 ml da cultura foi marcada 35 o (t=0) com 50 uCi de cisteina-[ S], durante 15 min a 37 C. A seguir a este intervalo de 15', os 100 ml da cultura foram 47 induzidos com 1 μς/πιΐ de Mitomicina C e, simultaneamente, 0,5 ml 35 de células marcadas -[ S] foram centrifugadas, ressuspendidas numa amostra tampao de gel proteico (SDS 1%, M beta- mercaptoetanol 0,14, glicerol 20%, Tris 40mM, pH 6,8, azul de bromofenol (BPB) 0,05%, aquecido a 95°C, durante 5 min. e conservado em gelo, como controlo de pré-indução. Depois da cultura ter sido induzida durante 105 min., uma aliquota de 5 ml 35 foi removida e marcada com 0,5 mci de cisteina -[ S] durante 15 min. a 37°C com agitação. Centrifugaram-se as células, lavou-se o pellet celular e depois res suspendeu-se em 5 ml de meio M9CA e incubaram-se a 37°C. Uma série de amostras de 5 ml de cultura foram colhidas a vários intervalos e fornecidas como descrito acima. As amostras seriadas no tempo foram imediatamente analizadas por electroforese em gel de poliacrilamida/SDS a 15%. 0 gel foi fixado em ácido acético a 10% durante 10 min., enxaguado, lavado em água durante 15 min., tratado com salicilato de Sódio 1M durante 60 min., seco no vácuo à temperatura de 60°C, durante 2 horas, e autoradiografado expondo o gel à pelicula de raios X durante 6 a 8 horas.

Como se mostra na Fig.8, a hirudina expressa no plasmideo pNP6ARl/HIR (ou pNP6-CRM/HIR), i.e., não como uma proteina de fusão, tem uma semi-vida de, aproximadamente, 10 min., enquanto o CTAP-III, expresso em condições semelhantes, é completamente estável pelo menos durante 10 horas.

Foram realizadas experiências de "pulse-chase" adicionais usando cada uma das construções do vector de fusão colicina-hirudina e demonstraram, por exemplo, que as proteínas de fusão colicina-hirudina, e.g., Col(57)/HIR e Col(150)/HIR 48 exibiam uma semi vida-semelhante (ou menor que) a observada para a expressão directa da hirudina. Em contraste, a Fig.9 mostra os resultados num gel de poliacrilamida (corado com prata) que demonstra a estabilidade da proteina de fusão CTAP-III/hirudina, 11 horas após a indução da expressão em Coli transformada com O vector pBR-CRM/CTAP(Leu2i)/HIR.

Exemplo 6

Purificação da Hirudina Recombinante (HV-1) A Fig.10 fornece um diagrama de fluxo que ilustra o processo de purificação descrito a seguir para a hirudina recombinante. A. Fermentação

Um ml da cultura congelada da estirpe 294 de Coli (pBR-CRM/CTAP(Leu2i)/HIR), armazenada a -80°C em glicerol a 15%, foi descongelado e usado para inocular 500 ml de "L-broth" (10 g de triptona, 5g de extracto de levedura, lOg de NaCl por litro) contendo tetraciclina, numa concentração final de 20 ug/ml. 0 pH do meio foi ajustado a 7,0 com NaOH IN. A cultura foi depois incubada durante a noite num incubador, com agitação, a 37°C. No dia seguinte, esta cultura foi usada para inocular quer 2 litros de "L-broth" preparado num frasco de 6 litros, quer 10 litros de meio de fermentação num recipiente de 16 litros. O tamanho do inóculo é de cerca de 2% do volume total do meio.

As células de E^ Coli, contendo o plasmideo de expressão para a hirudina (pBR-CRM/CTAP(Leu2i)/HIR , cresceram em meio minimo, quer a 37°C quer a 30°C (esta última temperatura 49 para as estirpes que transportam uma mutação sensivel á temperatura (ts) lexA ou RecA), até uma densidade celular correspondendo a uma densidade óptica a 650 nm de 4 (escala laboratorial) ou 30 ( escala de fermentação de alta densidade). [Meio minimo compreende (expresso em quantidades ou volumes por litro) 7,lg de (NH4)2S04, l,7g de K2HPO4, 1,5 g de citrato de sódio, 5g de ácido casamino suplementado com 100 ml de glucose 20%, 8,3 ml de MgS04 1 M, l,7ml de CaCl2 1M, 1,8 de FeCl3 0,1 M, 0,2 ml de elementos vestigiais, 10 ml de vitaminas]. As células foram depois induzidas por adição de mitomicina C a uma concentração final de 1 μg/ml, ou por aumento da temperatura a 42°C (durante 20 min.), seguida de ajustamento a 37°C, e permitiu-se o crescimento de células durante um periodo adicional de 4 horas. Mantiveram-se os niveis de oxigénio entre 40 e 60% do nivel de saturação, o pH do meio de cultura foi mantido a um pH 7-7,5 por adição de hidróxido de amónia, e a concentração de glucose foi mantida a, aproximadamente 2% por adição de uma solução nutritiva de glucose concentrada. Esta última compreende (por litro) 400 g de glucose, 0,4g de FeCl3.6H20, 2,6 g de MgS04.7H20, 20g de citrato de sódio, 20 ml de elementos vestigiais e 20 ml de vitaminas. Agitou-se a cultura por um motor giratório a 400-600 rpm. Adicionou-se um anti-espuma a quantidade necessária para evitar a formado significativa de espuma. Após um periodo de 4 horas de incubação, as células foram recolhidas e lavadas uma vez com tampão TEN (Tris-HCL 25mM, pH 8,0, EDTA 10 mM, NaCl 150 mM) . AS células foram recolhidas outra vez, por centrifugação a 4.000 rpm, durante 20 min. e os pellets foram armazenados a -20° C. 50 B. Expressão e Análise do gene A indução da expressão do gene de hirudina foi conseguida por adição de Mitomicina C, a uma concentração final de 1 mg/litro ou por uma alteração na temperatura de 30°C para 42°C, durante 15-30 min. seguida por um decréscimo para 37°C para as estirpes ts. Após um tempo de indução total de, aproximadamente, 4 horas [a densidade óptica final a 650 nm é de, aproximadamente, 10-12 (cultura à escala laboratorial) ou 40-50 (cultura de alta densidade)], a cultura foi arrefecida e as células foram recolhidas por centrifugação ou filtração. A expressão da sintese de proteínas de cada uma das proteínas recombinantes com interesse, após a indução, foi seguida de electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). As amostras foram geralmente retiradas da cultura antes, e 4 horas após a adição de Mitomicina C (horas 0 e 4, respectivamente). 0 volume das amostras foi ajustado para a densidade óptica da cultura, de modo a que, igual número de células foram retiradas num dado tempo de amostragem. Recolheram-se as células por centrifugação a 6.000 rpm, durante 5 min., e congelaram-se e descongelaram-se os pellets, pelo menos uma vez , antes da ressuspençâo em 250 μΐ do tampão amostra. O tampão amostra consiste em 1% de SDS, 20% de glicerol, Tris-HCL 40 mM, pH 6,8, 0,05% de BPB e 2- mercaptoetanol 0,14 M para o gel poliacrilamida padrão e 2,5% de SDS, DTT 10 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, e 0,01% de BPB para o sistema gel Phast (Pharmacia). As amostras analisadas pelo sistema Phast foram ainda diluídas 40x. As amostras foram fervidas durante 5 min. antes de serem carregadas num gradiente de gel da Pharmacia 8-25%, ou em 15% de gel de 51 poliacrilamida-SDS. 0 gel Phast correu e foi corado com prata, de acordo com os processos e programas fornecidos pelo fabricante. 0 gel de poliacrilamida-SDS foi electroforizado a 30 mAmp, durante 6 horas, e corado durante a noite numa mistura corada de azul de Coomassie (0.05% azul Coomassie, 25% de isopropanol e 10% de ácido acético), e descorada numa solução de 25% de isopropanol e 10% de ácido acético. Quando necessário, os geis foram quantificados por análise dos negativos fotográficos do gel, usando um densitómetro laser com um integrador electrónico. ! C. Lise celular

As células foram ressuspendidas num tampão consistindo em Tris 50 mM, NaCl 0,2 M, EDTA 5 mM, pH 8,5, (50-100 ml do tampão por litro da cultura original) e lisadas, usando um Destruidor Celular Stansted (Stansted Cell Disrupter), a uma temperatura de 5-10°C, uma pressão operacional de 11-12.000 psi, e uma taxa do fluxo de 150-200 ml por min. O material insolúvel (contendo mais de 85% do total de proteina de fusão CTAP-Ill/hirudina) foi recolhido por centrifugação ou filtração. A solução sobrenadante foi desprezada.

J D. Redução 0 material insolúvel, contendo a proteina da fusão CTAP-m/hirudina, foi solubilizado em hidrocloreto de guanidina (GnHCl) 6M, Tris base 50 mM, EDTA 1 mM, (50 ml por litro de cultura de células), e ajustado a um pH entre 8,5 e 9,0. Adicionou-se o agente redutor (ditiotreitol ou beta-mercaptoetanol) a uma concentração final de 0,1 M, e a solução foi incubada a 37°C, durante la 3 horas. A solução foi 52 acidificada para pH 3-4 e dializada contra 20-100 volumes de ácido acético 0,1 N, durante 6 a 12 horas, com duas alterações: qualquer precipitado resultante foi removido por centrifugação ou filtração e desprezado. O sobrenadante foi liofilizado. E. Clivagem por Brometo de Cianogénio A mistura da proteina natural foi dissolvida em ácido fórmico a 70% (aproximadamente 50 ml por litro de cultura de células), clarificada com gás Argon, e agitada lentamente à temperatura ambiente durante 2 0 min., ou até a maior parte do material estar dissolvido. Foi adicionado tiosulfato de sódio (aproximadamente 65 mg por litro de cultura), e agitado por um periodo adicional de 40 min. Finalmente, adicionou-se CNBr a uma concentração final entre 0,1 e 0,4 M, e incubou-se a mistura de reacçâo durante 6 a 20 horas. Alternativamente, a reacção CNBr pode ser realizada usando H3PO4 0, 2 N e GnHCl 6M, como solvente da reacção. 0 progresso da reacção foi seguido por análise HPLC analitica (descrito a seguir) de reacções de escala piloto. A reacção prosseguiu tipicamente até se atingir mais de 90 % do resultado final, altura em que a solução foi diluida 3- a 5-vezes com água desionizada/destilada, dializada e liofilizada.

Como se mostra na Fig. 11, a quantificação de expressão de hirudina, por clivagem e separação de hirudina do CTAP-III, foi determinada usando HPLC-RP. A produção de hirudina foi calculada a partir da análise da mistura de reacção CNBr, dializada após redução, por HPLC analítico, usando padrões de hirudina purificada cujas concentrações foram calibradas por análise da composição de aminoácidos e medição da actividade 53

V especifica. A análise HPLC de fase reversa foi tipicamente realizada com 10 μΐ da solução de hirudina e com 6 μΐ da hirudina padrão (aproximadamente 10 mg de cada). As amostras foram ajustadas para 15% de acetonitrilo, 0,065% de ácido trifluoroacético (V/V) (TFA) e injectadas em volumes de 0,1 ml (amostras não tratadas) ou 1,0 ml (amostras reduzidas) em colunas C-4 Vydac. A eluiçâo foi realizada usando 0,065% de TFA , com gradientes lineares ascendentes de 15 a 30% de acetonitrilo a uma taxa de 0,5% de acetonitrilo por minuto. A hirudina HV-1 oxidada e reduzida, elui-se em posições caracteristicas idênticas às da hirudina purificada HV-1, tendo valores de actividade especifica superiores a 10 unidades antitrombina por μg.

As amostras de hirudina foram reduzidas por incubação a 37°C em ditiotreitol 0,1 M, Tris base 0,2 M, pH9, durante 45 min. antes de acidificaçâo e diluição em acetonitrilo/TFA e injecçâo na coluna HPLC. A concentração da hirudina no padrão foi determinada pela análise quantitativa da composição de um hidrolizado ácido num analisador de aminoácidos Beckman 6300, (usando um padrão interno de concentração conhecida). Os cálculos da quantidade de hirudina numa amostra ( por exemplo, uma reaçcão de clivagem CNBr) são feitos por comparação da integração do pico da amostra e do padrão da hirudina para ambas as amostras, reduzidas e não reduzidas. Os picos de integração foram confirmados pelas experiências em duplicado. A partir desta análise, a produção de hirudina após a fase de clivagem CNBr era, consistentemente, de 50-70 mg por litro da cultura original, crescida em condições de baixa densidade ( densidade óptica final 54 da cultura, a 650 nm, era de 10-12). F. Cromatografia de Troca Aniónica (AEC) A proteína foi dissolvida em água a uma concentração de 5-25 mg/ml e o pH da solução foi ajustado a 5,5, por adição de hidrocloreto de histidina. A coluna de Q Sefarose (Pharmacia) foi calibrada com tampão histidina 50 mM, pH 5,5. Carregou-se a coluna com, aproximadamente, 5 mg de hirudina por ml de resina. O CTAP-III não se liga á coluna nestas condiçOes e elui-se no fluxo. A coluna foi lavada com tampão até não se detectar material com absorção de UV. A coluna foi depois eluida com um gradiente de NaCl, com 0 a 0,5 M de tampão histidina. A hirudina elui-se em NaCl, entre 0,12 e 0,15 M. 0 perfil de eluição foi caracterizado por um pico único principal que tinha propriedades cromatográficas e propriedades de inibição da trombina, idênticas à hirudina recombinante (HV-1) purificada. Combinaram-se fraçcões contendo hirudina, dializaram-se contra água, e liofilizaram-se. PreparaçOes de hirudina nesta fase tinham uma pureza tipicamente superior a 90%, tal como determinada por HPLC. G. Enrolamento de Proteínas A hirudina foi dissolvida em GnHCl 6M, numa concentração aproximada de 100 mg/ml. Adicionou-se beta-mercaptoetanol a uma concentração final de 0,1 M a 0,15 M, e a solução foi ajustada a um pH de 8,2 com Tris-base 50 mM, ou a um pH de 10 com bicarbonato de sódio 50 mM, EDTA 1 mM. Após aproximadamente 1 a 2 horas de incubação, à temperatura ambiente, a solução foi diluída 5 a 10 vezes com GnHCl 6M em tampão 50 mM, 55 EDTA lmM, e depois dializada durante um periodo de, aproximadamente, 6 a 18 horas contra 10 volumes de tampão (100 GnHCl) 50 mM. Durante este periodo ocorre o enrolamento que recupera a configuração nativa. Alternativamente, uma mistura 2:1 de glutationa oxidada e reduzida pode ser usada na reacção de enrolamento, em vez do mercaptoetanol. Finalmente a solução foi dializada contra a água. H. Cromatografia Final

Fases de cromatografia opcionais podem ser utilizadas neste ponto para conseguir maior pureza da proteína hirudina. Uma segunda cromatografia de troca aniónica, ou cromatografia de interacçâo hidrofóbica (HIC) ou fase de cromatografia inversa, por exemplo, fornecerá uma composição de hirudina com grau de pureza superior a 95% HIC foi usado para purificar uma amostra de hirudina recombinante expressa directamente como uma proteina não fundida no vector pNP6ARI-CRM/HIR. Neste exemplo, a hirudina foi preparada a partir de células lisadas, e purificada parcialmente por titulação do extracto puro com ácido clorídrico a um pH de 3,8 e desprezando o material insolúvel. O pH da solução sobrenadante foi ajustado a um pH neutro com hidróxido de sódio, diluido para dar uma forca iónica de, aproximadamente, 0,1 ou menos, e carregado numa coluna de troca iónica Zeta Prep QAE 60. A coluna foi lavado com NaCl 0,1 M, em tampão bis-Tris 20 mM pH 6,0, até não haver material absorvente UV no material eluido. A hirudina foi eluida da coluna usando tampão contendo NaCl 0,4 Μ. A hirudina resultante é, aproximadamente, 50% pura , como foi determinado por RP-HPLC analitica. 56 A proteina foi depois introduzida numa coluna HIC, numa escala semi-preparativa, contendo Superose fenil (Pharmacia) a uma concentração aproximada de 0,1 mg hirudina/ml e eluida num gradiente linear de sulfato de amónia de 1,7 a 1,2 M, em Tris-bis 20 mM pH 6,0, a uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min. A Fig.12 ilustra a pureza da hirudina recuperada por este processo. A influência da inclinação do gradiente salino na separação foi determinada alterando a variação de 4,25 para 17 mM de sulfato de amónia/min, em três corridas cromatográficas sucessivas. A resolução de base foi observada em todas as três experiências; a resolução (definida como a razão entre a distância entre os valore máximos dos picos e comprimento de base médio dos dois picos) foi de 2,25 a um gradiente de 4,25 mM de NaCl/min, 1,68 a 8,5 mM de NaCl/min, e 1,48 a 17mM de NaCl/min. (Uma resolução de 1,5, ou superior, é uma resolução da linha de base). A recuperação determinada para o gradiente de 8,5 mM de sulfato de amónia/min era de 65% a um carregamento de 0,133 mg de hirudina por ml de resina. Nestas condições, a hirudina elui-se em sulfato de amónia 1,49 M; elui-se numa concentração salina ligeiramente mais alta quando se usa o gradiente de base, e ligeiramente mais baixa em condições do gradiente de saturação. A pureza da hirudina eluida, como mostra a fig.13 era superior a 95%, como determinada por RP-HPLC analítica. A partir destes resultados verifica-se que o HIC é um processo extremamente útil para obter hirudina com uma pureza substancial.

Outro modo de purificação utiliza cromatografia de filtração em gel, após cromatografia de troca aniónica. A 57 Ή hirudina é purificada por cromatografia liquida proteica rápida (FPLc), usando Superose-12 (Pharmacia). 0 tampão de eluição é tipicamente fosfato de sódio 50 mM, NaCl 0,5 M, EDTA 0,1 mM, pH 7,0, a uma taxa de fluxo de 0,25-1,5 ml/min. A pureza de hirudina resultante é superior a 95%.

Exemplo 7

Construção de Vectores de Expressão Contendo o Gene para o Péptido Laminin Bi-40 A. Concepção e Sintese dos Fragmentos do Gene Laminin

Os seis fragmentos que formam o gene Laminin Βχ-40, referidos a seguir, foram sintetizados e purificados em gel como foi préviamente descrito. Os fragmentos 2, 3, 5 e 6 foram activados e os fragmentos 1 e 4 não, para evitar que as extremidades 3' se ligassem juntamente para formar dimeros. Os seis fragmentos foram ligados nas seguintes condiçOes: 33,3 pmoles dos oligómeros (1 e 4 não activados; 2, 3, 5 e 6 activados) foram adicionados a Tris HC1 30 mM (pH 7,8), MgCl2 10 mM, e DTT 6 mM, e aquecidos a 90°C. Depois de arrefecidos à temperatura ambiente, foram adicionados ATP 1 mM, e 200 unidades de extremidades coesivas (NEB) de ligase T4 ( uma unidade de terminação coesiva = 0,015 unidades Weiss), a um volume de 50 ul, e a reacção foi incubada, durante a noite, a 16°C. A reacçâo foi subsequentemente aquecida durante 15 min a 70°C para inactivar a ligase. A mistura de reacção foi digerida com enzimas de restrição EcorI, para separar quaisquer dimeros 5'-5'. A mistura de ligação cortada por EcorI, foi corrida num gel de agarose 58

SeaPlaquJ^a 2%, e o pedaço de 149 pb foi isolado para ligação ao vector. 0 fragmento EcorI tinha a seguinte sequência de DNAs

5'-AATTCGTATG CCGTGCCCGG ATGGTCCGGA CTCCGGCCGT 31-GCATAC GGCACGGGCC TACCAGGCCT GAGGCCGGCA *

CAGTTCGCTC GTTCTTGCTA CCAGGACCCG GTTACCCTGC GTCAAGCGAG CAAGAACGAT GGTCCTGGGC CAATGGGACG * *

AGCTGGCTTC TGTTTGCGAT CCAGGCTACA TCGGTTCTCG

TCGACCGAAG ACAAACGCTA GGTCCGATGT AGCCAAGAGC * TTGCGACGAC TAATGACTGC AGAAGCTTC-3' AACGCTGCTG ATTACTGACG TCTTCGAAGT TAA-5' B. Construção do pBR-CRM/Col(150)/LamBi~40 O processo da construção do gene de fusãO colicina(150)/Laminin Bi~40 foi realizado em duas fases. Um primeiro vector foi preparado inserindo o fragmento de 149 pb do gene Laminin (preparado como foi descrito acima) no pBR-CRM/CTAP(Leu2i) digerido pela EcorI. O fragmento SacII-EcoRI, contendo o gene que codifica o CTAP-III(Leu2i) foi removido deste vector por digestão dupla e subsequente purificação em gel de agarose do DNA do vector restante contendo o fragmento do gene laminin. O fragmento do gene colicina (150) foi preparado de forma similar por digestão SaclI-EcorI do pNP6£RI- CRM/Col(150)/PF4. O vector pBR-CRM/LamBi-40 e o fragmento do gene de colicina 150 foram depois ligados para produzir pBR-CRM/Col(150)/LamBi-40. Os clones foram pesquisados por análise de restrição do DNA do plasmideo purificado, preparado como foi descrito no Exexmplo 3, e demonstraram vários prováveis 59

candidatos, mas a análise gel da proteina das culturas induzidas desses clones mostraram pouca, ou nenhuma indução, de qualquer proteina do tamanho esperado (aproximadamente 21.000 daltons) da proteina de fusão Col(150)/LamBi-40. A sequênciação parcial desses clones demonstrou a presença da sequência do gene laminin na estrutura de leitura da tradução correcta com a terminação 5' da sequência do gene colicina. C. Construção do pBR-CRM/CTAP(Leu2i)/LamBi-40 A clonagem da fusão CTAP/LamBi-40 foi realizada como se segue. Uma porção da terminação - 3' do CTAP-III, no vector pBR-CRM/CTAP(Leu2i) foi removida por digestão dupla com Xbal e EcorI e o DNA do fragmento do vector foi purificado por electroforese gel SeaPLaque®. A este fragmento isolado adicionou-se um fragmento do linker Xbal-EcorI com 71 pb, contendo uma nova terminação 3' CTAP-III sem qualquer codâo de terminação da tradução. O linker sintético foi sintetizado, purificado, activado e ligado como foi préviamente descrito e se mostra a seguir.

51-CTAGACCCGG ACGCTCCACG TATCAAGAAG ATCGTTCAGA 31-TGOGCC TGCGAGGTOC ATAGTTCTTC TAGCAAGTCT AAAAACTGGCTGGTGACGAA TCTGCTGACA G-31 TTTTTGACCGACCACTGCTT AGACGCTTGT CTTAA-51

Os dois fragmentos foram depois ligados em condições descritas,préviamente usando 1,0 pmole do linker, e 0,1 pmole do vector, em 172 μΐ do volume da reacção. Transformaram-se 100 μ.1 de células deE.Coli 294 competentes congeladas com 1-10 ng da mistura de ligação para construir um vector de clonagem intermediário. Os clones resultantes foram pesquisados por 60 análise de enzimas de restrição como descrito previamente. 0 DNA de um clone representativo foi sequenciado para confirmar a correcta sequência do DNA. Desenvolveu-se este clone para produzir quantidades suficientes para a subsequente inserção do novo gene laminin.

Um novo gene laminin foi construído para (1) colocar o CTAP em fase com o laminin para a fusão do gene, (2) remover vim sitio HindiII (deixando um sitio HindIII no novo plasmideo para ser usado como um sitio de restrição único) , e (3) adicionar três novos sitios de restrição única (StuI, Smal e Sall) para futuras mutagéneses da cassette do gene laminin. Os oligonucleótidos e a estratégia de ligação são fornecidos a seguir:

5'-AATTCGTAT GCCGTGCCCG GATGGTCCGG ACTCCGGCCG 3' GOATA CGGCACGGGC CTACCAGGCC TGAGGCCGGC

GGTTACCCTG CCAATGGGAC

ATCGGTTCTC TAGCCAAGAG

TCAGTTCGCT CGTTCTTGCT ACCAGGACCC AGTCAAGCGA GCAAGAACGA TGGTCCTGGG *

CAGCTGGCTA GCGTTTGCGA CCCGGGCTAC GTCGACCGAT CGCAAACGCT GGGCCCGATG GTTGCGACGA CTAATGAGTC GACAGGCCTC-3' CAACGCTGCT GATTACTCAG CTGTCCGGAG TTAA-5'

Tal como na construção do gene colicina-laminin, o sitio EcoRI 5' estava activado , enquanto que o sitio EcoRI 3f tinha sofrido uma mutação ( GAATTC---> CAATTC) para deixar um único sitio EcoRI .

Este novo fragmento do gene foi inserido como se indica a seguir, na construção do vector intermediário no único sitio EcoRI, introduzindo assim a sequência de código do laminin, em 61

fase com a terminação da sequência de código do CTAP. 0 plasmideo intermediário foi digerido com EcoRI, tratado com fosfatase intestinal de vitela (CAP) para remover os grupos fosfato 5', para evitar as re-ligações do vector a si próprio, e foi purificado por electroforese em gel de agarose. 0 novo gene laminin foi construído, purificado e activado como foi previamente descrito. Estes dois pedaços foram depois ligados em conjunto e a mistura da ligação foi usada para transformar células coli 294 competentes . Seleccionaram-se seis clones e analisaram-se por indução com Mitomicina C, para determinar se foi produzida uma proteina de tamanho correcto (135 aminoácidos, aproximadamente 15.000 daltons). Dois dos seis clones induziram especificamente uma proteina destas dimensões.

Estes clones foram pesquisados para a orientação correcta da inserção do gene laminin por digestão dupla com EcoRI e Xhol. A orientação correcta produziu dois fragmentos de 308 pb e 3940 pb. A orientação incorrecta produziu dois fragmentos de 457 pb e 3791 pb. Dois dos seis clones possuíam a orientação correcta. A estrutura correcta do gene foi confirmada pela sequência do DNA de cadeia dupla.

Exemplo 8

Expressão, Purificação e Testes para o Péptido Laminin Bi-40 A expressão da fusão do péptido CTAP/LamBi-40 em frascos com agitação, ou em culturas de fermentação, foi realizada como foi previamente descrito. A purificação do péptido laminin Βχ-40 é descrita a 62 seguir. As células foram colhidas como foi descrito para a hirudina , e lisadas por sonicação (2x) em um décimo do volume da cultura original de Tris-HCl 25 mM (ph 8,0), EDTA 1 mM, glucose (TEG) 50 mM. 0 péptido de fusão insolúvel foi recolhido por centrifugação, durante 20 min, a 15.000 rpm, num rotor SS-34 a 4°C. Os pellets foram ressuspendidos num décimo do volume da cultura original de Ureia 7 M, Tris-HCl 25 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM ( ou GnHCl 6 M, Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM), e sonicados seis vezes em gelo (# 8 setting, extremidades largas, sonicador Branson 350 watt), durante 2 min, com intervalo de 5 min. (Algumas preparações foram feitas usando PMSF 1 mM, para inibir as proteases durante as fases de lise celular e de solubilizaçâo). A suspensão foi centrifugada como foi descrito acima, durante 30 min a 15.000 rpm, num rotor SS-34. A solução sobrenadante ( aproximadamente 500 ml) foi dialisada durante 1-3 dias, versus 50 litros de ácido acético a 10 mM a 4°C, até se formar um precipitado pesado no saco da diálise ("cut-off" para um peso molecular de 3.500). A suspensão foi centrifugada (15 min, 15.000 rpm, rotor SS-34, 4°C). O pellet e o sobrenadante foram analisados para determinar a presença da banda de 15.000 daltons por electroforese em gel de poliacrilamida-SDS.

Normalmente , a grande maioria ( >90%) da proteina de fusão foi encontrada no pellet. Se tal não acontecesse, a suspensão total seria liofilizada para secar. A Fig 7A mostra o perfil de purificação HPLC da proteina de fusão CTAP-laminin, antes da clivagem por brometo de cianogénio. A clivagem por brometo de cianogénio da fusão do CTAP/ laminin foi realizada como foi descrito no exemplo 6E. Os 63 : ,: - · *rr produtos da reacçâo CNBr, dialisados e liofilizados, foram dissolvidos em, aproximadamente, 200 ml de GnHCl 6M, e titulados a um pH de 9-10 com Tris base 2 M. Foi adicionado DTT a 0,1 M e a mistura de reacçâo foi incubada a 37°C, durante 1 h, para reduzir toda a proteina. O pH da reacçâo foi ajustado a 2,5-3,5 por adição de aproximadamente 1/50 do volume de ácido fórmico 88%, para manter as cisteinas reduzidas. Este material foi feito em 15% de acetonitrilo para análise HPLC. Qualquer precipitado que se formou foi removido por centrifugação e filtração. 0 HPLC analítico foi realizado num sistema Wate'r's 680 (controlador 680, bombas 2-510, detector 490E) usando 15 a 40% do gradiente num solvente B, a 0,5%/min, 2 ml/min, onde o solvente A é de 0,065% (v/v) de TFA (ampolas Pierce Sequanol) em água (MilliQ ou Burdick e Jackson), e o solvente B é de 0,065% (v/v) de TFA em acetonitrilo (CH3CN, Burdick e Jackson, UV grade), usando uma coluna Vydac 214TP54 (C4, dimensões do poro 300 A°, 5μ de contas, 4,6 mm x 250 mm). O comprimento de onda da monitorização foi de 215 nm. Os resultados (Fig 7B ) mostram dois picos principais, o primeiro dos quais se demonstrou ser o péptido laminin B^-40 ( por análise da sequência e da composição dos aminoácidos), e o segundo foi identificado como sendo a proteina CTAP-III , mais os três aminoácidos de ligação (Arg-Ile-Arg), pelo seu tempo de retenção quando comparado com CTAP-III. A preparação do HPLC foi realizada num equipamento da Technology Separations 800 B com uma coluna de75mmx250mm A/E (expansão anular) com, aproximadamente, 1000 ml de Vydac 214TPB1520 (C4, dimensões do poro 300 A°, dimensões das contas 15-20μ). A separação foi conseguida carregando a amostra no 64

υ solvente Β 15%, correndo um pequeno gradiente B 15-20 % e eluindo o laminin Bi-40 e o CTAP-III (Arg-Ile-Arg) usando o gradiente B 20-40%, durante 80 min (320 ml/min) monitorizando a 215 nm. Tal como aconteceu com a separação HPLC analitica, os mesmos dois picos principais foram observados. Fracções apropriadas foram identificadas por RP-HPLC analitica, "pooled" e liofilizadas para secar. 0 péptido laminin Bi-40 foi enrolado como foi descrito para a hirudina , no exemplo 6G.

Exemplo 9

Testes de Aderência Celular 0 péptido laminin B^-40, juntamente com os péptidos YIGSR e CDPGYIGSR, descritos previamente, foi dissolvido em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e foram revestidos em placas de poliestireno com 96 poços, Falcon #3915 a 37°C, durante 60 min. As soluções peptidicas foram removidas e os poços lavados duas vezes com PBS. As ligações celulares não especificas foram evitadas adicionando 200 μΐ de albumina sérica bovina (BSA) 0,1 % (Sigma #4965) em PBS , aos poços , e incubando a 37°C, durante 60 min. Removeu-se o BSA lavando-os duas vezes com PBS. As células B16/F10 ( melanoma de murinos), na fase logarítmica da curva de crescimento, foram colhidas após 2 min de exposição à tripsina 0,05% / EDTA 0.1% em PBS, suspendidas num meio de cultura (DMEM+FBS 10%) centrifugadas, e ressuspendidas em meio de ligação ( DMEM + HEPES 20 mM +BSA 0,1%). Adicionaram-se a cada poço 100 4 μΐ de células ( 3-4x10 células), e incubaram-se durante 60 min a 65 37°C. As células não aderentes foram removidas por rotação rápida da placa, adição de PBS, aspiração total com excepção de 50 μΐ do conteúdo dos poços; o processo de lavagem foi repetido mais duas vezes. Após a lavagem final, toda a solução foi aspirada lentamente e as células foram fixadas por adição de 100 μΐ de metanol durante 15 min. 0 metanol foi removido e as células foram secas ao ar antes de serem coradas durante 5 min com 100 μΐ da solução de violeta cristal a 0,1%. 0 corante foi removido e os poços foram lavados com 200 μΐ de H2O e secos ao ar. As células foram solubilizadas adicionando 100 μΐ de ácido deoxicólico a 2% e aquecidos levemente num forno de micro-ondas. A densidade óptica das soluções foi lida num leitor de placas Molecular devices Corporation, a um comprimento de onda entre 590 nm e 405 nm. A extrapolação da densidade óptica, para o número de células ligadas, foi feita por comparação das leituras com uma curva padrão, obtida incubando vários números de células nos poços da placa de microtitulação, durante 5h ( para permitir aderência firme mas não divisão significativa) , e lavando e corando como foi descrito acima. A tabela 2 mostra que o péptido laminin recombinante (LamBi-40) liga as células metastásicas tumorais mais eficazmente neste teste que os pequenos péptidos sintéticos YIGSR ou CDPGYIGSR previamente indicados. Ο Ρχ é um produto da digestão da protease do laminin do rato, usado como o controlo positivo . 66 TABELA 2

NO. RELATIVO DE CÉLULAS LIGADAS μg/ml Péptido* Pl LamBi-40 Reduzido LamBi-40 Enrolado YIGSR CDPGYIRSR 0.00063 0 . I 0.002 1.95 0.0063 2.3 0.02 2,3 0,85 0 , 15 0.2 0.063 0.95 0.025 0.20 1.35 0.6 0.1 0.3 0.63 2.20 0.5 2.00 1.85 0.45 0.1 0.45 ♦Concentração do Péptido usado para revestir os poços da placa de Microtitulação.

Exemplo 10

Contrução do pBR-CRM/CTAP(Met9τ)/PF4 A clonagem de um gene hibrido que codifica uma fusão CTAP/PF4 foi realizada em três partes : A Leu2i, substituída do CTAP-III, foi novamente substituida pela metionina nativa para construir o vector designado por pNP6ARI/CTAP(Met2i). 0 fragmento Xhol-EcoRI de 303 pb, contendo o gene completo CTAP-III nativo, foi cortado deste vector e usado para substituir a mesma região CTAP no plasmideo pBR-CRM/CTAP(Leu2i) /LamB]_-40 (descrito previamente no exemplo 7C) para criar pBR-CRM/CTAP(Met21)/LamBi-40.

Por fim , o gene PF4 foi removido do plasmideo pNP6ARl/Col( 150)/PF4, como um fragmento EcoRI de 239 pb, (a sequência idêntica é fornecida na Fig 3) e ligado ao fragmento do vector descrito acima para construir um vector designado por pBR- 67

Claims

j'l

Λ CRM/CTAP(Met2i)/PF4. A extremidade 3' presente no gene laminin , em relação à fusão do gene CTAP PF4 não é expressa devido à presença de codões de terminação na extremidade 3'do gene PF4. Este vector foi usado para transformar E_;_ coli, os transformantes resistentes á ampicilina foram seleccionados e os clones isolados foram analisados por digestão de restrição para identificar a orientação correcta do gene. Clones positivos podem ser depois induzidos para a expressão da proteina de fusão CTAP-PF4. Modificações nos modos de realizar esta invenção, acima descritos, que são óbvios para os especialistas nos campos da biologia molecular, quimica das proteínas, biologia celular ou áreas relacionadas, pretendem estar dentro do âmbito das reivindicações anexas. REIVINDICAÇÕES 1- Um método para a produção de uma proteina heterõloga, num microorganismo, caracterizado pelo facto de compreender: (a) a expressão de uma proteina de fusão contendo uma primeira sequência de aminoácidos, uma segunda sequência de aminoácidos, e um sitio selectivo que possa ser clivado para fornecer fragmentos dos primeiro e segundo polipéptidos, respectivamente, em que o referido primeiro fragmento é homólogo do péptido do tecido conjuntivo III (CTAP-III), tendo os referidos primeiro e segundo fragmentos um primeiro e segundo 68 valores de pi; (b) a clivagem da referida proteina de fusão para fornecer o primeiro e segundo fragmentos; e (c) a separação dos referidos primeiro e segundo fragmentos por cromatografia de permuta iónica.
2- 0 método, conforme reivindicado na reivindicação lf caracterizado pelo facto de o referido segundo valor de pi ser inferior a cerca de 6,5 ou inferior a cerca de 8,5.
3- 0 método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido segundo valor de pi se encontrar entre cerca de 6,5 e cerca de 8,5, e compreendendo, ainda, a referida sequência de aminoácidos um segundo sitio de clivagem selectiva, dividindo o referido sitio de clivagem o referido primeiro fragmento num terceiro e quarto fragmentos, após a clivagem, tendo o referido terceiro fragmento vim pi de cerca de 4,2, e tendo o referido quarto fragmento um pi de cerca de 9,3.
4- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido microorganismo ser uma célula bacteriana.
5- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a sequência de aminoácidos CTAP-III corresponder ao CTAP(Leu2i).
6- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o aminoácido CTAP-III corresponder à sequência humana original.

7- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o sitio de clivagem selectiva, na 69 proteina de fusão, ser a metionina, e de se utilizar na reacção de clivagem brometo de cianogénio.

8- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a cromatografia de permuta iónica utilizar uma coluna de permuta aniónica.

9- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o pH do tampão de permuta aniónica se encontrar entre 5 e 7.

10- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o pH do tampão de permuta aniónica ser de 5,5.

11- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender, ainda, a recuperação dos segundos fragmentos a partir da etapa (c), como uma composição polipetidica purificada.

12- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a proteina recombinante heteróloga ser a hirudina.

13- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o polipéptido recombinante heterólogo ser um péptido laminin B^, possuindo a seguinte sequência: Proi-Cys-Pro-Asp-Gly-Pro-Asp-Ser-Gly-Arg-Gln-Phe-Ala-Arg-Ser-Cys-Tyr-Gln-Asp-Pro-Val-Thr- · Leu-Gln-Leu-Ala-X-Val-Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Cys-Asp-Asp-Y em que Pro^ é, quer Pro quer des-NH2 X é, quer Cys, quer seleccionada a partir do grupo constituído pelos aminoácidos alifáticos neutros, e γ é, quer -OH, quer — NH2? e os seus sais não tóxicos. 70

14- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 13, caracterizado pelo facto de o péptido laminin ter a seguinte sequência: Pro-Cys-Pro-Asp-Gly-Pro-Asp-Ser-Gly-Arg-Gln-Phe-Ala-Acg-Sec-Cys-Tyr-Oln-Asp-Pro-Val-Thr-Leu-Gln-Leu»Ala-Ser-Vai-Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile- Gly-Ser-Arg-Cys-Asp-Asp.

15- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender, ainda, uma fase de purificação adicional utilizando gel de filtração , cromatografia de interacçao hidrofóbica ou cromatografia liquida de fase reversa.

16- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 15, caracterizado pelo facto de a fase de purificação adicional ser levada a cabo por uma cromatografia de interacçao hidrofóbica a um pH da ordem de cerca de 5 a 7, utilizando um gradiente linear de cerca de 1,7 a 1,2 Mde sulfato de amónia.

17- Um método para a produção de hirudina recombinante num hospedeiro recombinante, caracterizado pelo facto de compreender: (a) a expressão de uma proteina de fusão contendo uma primeira sequência de aminoácidos para CTAP-III (Leu2i), uma segunda sequência de aminoácidos para a hirudina, e um sitio selectivo que possa ser clivado para fornecer CTAP-III (I»eu2i) e hirudina; (b) a clivagem da referida proteina de fusão para fornecer produtos de reacção compreendendo péptidos CTAP-III (Leu2i) dos referidos péptidos de hirudina, por cromatografia de permuta iónica, e (d) a recuperação dos referidos péptidos de hirudina. 71

18- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 18, caracterizado pelo facto de a referida cromatografia de permuta iónica ser realizada com um tampão com um pH de cerca de 5 a 6, sendo os péptidos de hirudina diluidos numa solução tampão tendo um pH de cerca de 5 a 6, e sendo o gradiente salino de 0 a cerca de 1,5 M de NaCl.

19- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 18, caracterizado pelo facto de compreender, ainda, uma fase de purificação adicional utilizando gel de filtração, cromatografia de interacção hidrofóbica, ou cromatografia de fase reversa.

20- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 20, caracterizado pelo facto de a fase de purificação adicional ser levada a cabo por cromatografia de interacção hidrofóbica, a um pH na ordem de cerca de 6 a 7, utilizando um gradiente linear de cerca de 2,2 a 1,2 M de sulfato de amónia. Lisboa, 4 de Maio de 1990
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