JPH01247098A - ヒトの上皮細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法 - Google Patents
ヒトの上皮細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
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- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明はヒト上皮細胞増殖因子（以下ｈＥＧＦと略記）
を遺伝子工学的手法を用いて生産する方法に係り、特に
ｈＥＧＦに対応する化学合成遺伝子、および、それを含
むプラスミド、該プラスミドを保持する大腸菌、および
、これらを用いるｈＥＧＦの生産方法に関する。
を遺伝子工学的手法を用いて生産する方法に係り、特に
ｈＥＧＦに対応する化学合成遺伝子、および、それを含
むプラスミド、該プラスミドを保持する大腸菌、および
、これらを用いるｈＥＧＦの生産方法に関する。
［従来の技術］
ｈＥＧＦはヒト・ウロガストロンと同一物質と考えられ
ており、ヒトの十二指腸及び顎下腺などで合成される５
３個のアミノ酸からなるポリペプチドである（Ｇｒｅｇ
ｏｒｙ、 Ｉｎｔ、Ｊ、 ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉ
ｎ Ｒｅｓ、 ９． ｐｐ、１０７−１１８ （１［７
７））、、本ペプチドは胃酸の分泌を抑制し、上皮細胞
の増殖を促進する効果を有するため胃潰瘍や手術後の傷
、或いは切り傷等の治療薬としての利用が考えられてい
る。ヒト尿中に２５〜２５０ｎｇ／ｍｌ含まれているこ
とから、従来、尿より精製されていたが、人尿の大量採
取が困難である等の理由により生産単価が高いという欠
点があった。
ており、ヒトの十二指腸及び顎下腺などで合成される５
３個のアミノ酸からなるポリペプチドである（Ｇｒｅｇ
ｏｒｙ、 Ｉｎｔ、Ｊ、 ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉ
ｎ Ｒｅｓ、 ９． ｐｐ、１０７−１１８ （１［７
７））、、本ペプチドは胃酸の分泌を抑制し、上皮細胞
の増殖を促進する効果を有するため胃潰瘍や手術後の傷
、或いは切り傷等の治療薬としての利用が考えられてい
る。ヒト尿中に２５〜２５０ｎｇ／ｍｌ含まれているこ
とから、従来、尿より精製されていたが、人尿の大量採
取が困難である等の理由により生産単価が高いという欠
点があった。
近年、遺伝子工学的手法を用いて、ｈＥＧＦを微生物体
に生産させることが試みられてきた。
に生産させることが試みられてきた。
例えば、特開昭５７−１２２０９６、特開昭６０−２８
９９４、特開昭６１−１５６９１及び特開昭６１−８８
８８１に述べられている。これらの手法、すなわち化学
合成したｈＥＧＦ遺伝子を発現ベクターに組込み、当該
ベクターを保持する大腸菌を培養することによりｈＥＧ
Ｆを生産させるためには、（１）化学合成したｈＥＧＦ
遺伝子の塩基配列、 （２）発現効率の高い発現ベクタ
ー、（３）大腸菌の培養条件などを考慮する必要がある
。
９９４、特開昭６１−１５６９１及び特開昭６１−８８
８８１に述べられている。これらの手法、すなわち化学
合成したｈＥＧＦ遺伝子を発現ベクターに組込み、当該
ベクターを保持する大腸菌を培養することによりｈＥＧ
Ｆを生産させるためには、（１）化学合成したｈＥＧＦ
遺伝子の塩基配列、 （２）発現効率の高い発現ベクタ
ー、（３）大腸菌の培養条件などを考慮する必要がある
。
［発明が解決しようとする課題］
上記した公知技術はｈＥＧＦ遺伝子の塩基配列を翻訳効
率の高い配列にすること、及び発現効率の高い発現ベク
ターの利用について充分な配慮がなされておらず、容易
にかつ大量にｈＥＧＦを大腸菌に生産させることが難し
いという問題があった。
率の高い配列にすること、及び発現効率の高い発現ベク
ターの利用について充分な配慮がなされておらず、容易
にかつ大量にｈＥＧＦを大腸菌に生産させることが難し
いという問題があった。
本発明の目的はポリペプチドへの翻訳効率の高いｈＥＧ
Ｆ遺伝子を化学合成し、続いて、化学合成したｈＥＧＦ
遺伝子を大腸菌体内で安定で発現効率の高い発現ベクタ
ーに連結し、大腸菌内に導入の後、当該発現ベクターを
保持する大腸菌を培養することにより、ｈＥＧＦを効率
良く生産することを特徴とするｈＥＧＦの遺伝子工学的
生産方法を提供することにある。
Ｆ遺伝子を化学合成し、続いて、化学合成したｈＥＧＦ
遺伝子を大腸菌体内で安定で発現効率の高い発現ベクタ
ーに連結し、大腸菌内に導入の後、当該発現ベクターを
保持する大腸菌を培養することにより、ｈＥＧＦを効率
良く生産することを特徴とするｈＥＧＦの遺伝子工学的
生産方法を提供することにある。
［課題を解決するための手段］
５３個のアミノ酸よりなるｈＥＧＦのアミノ酸配列情報
を担う構造遺伝子ＤＮＡを得るためには、ｈＥＧＦのア
ミノ酸配列から予測される何通りかの遺伝子の塩基配列
のうち、その中で使用されている遺伝子コドンが発現に
使用する大腸菌の中で出現頻度の高いものであるかどう
か、また有機化学的に合成した遺伝子断片より遺伝子全
体を組み上げる際に、正しくない連結を生じにくい構造
であるか、さらにはＤＮＡから転写されたｍＲＮＡがヘ
アピン構造等の２次構造を形成しやすいためにリボゾー
ム上での翻訳過程での効率低下が生じないか否かを考慮
の上、最も適切と思われる塩基配列１つを選び、有機化
学合成した。有機化学合成したｈＥＧＦの構造遺伝子の
塩基配列を第１図に示す。
を担う構造遺伝子ＤＮＡを得るためには、ｈＥＧＦのア
ミノ酸配列から予測される何通りかの遺伝子の塩基配列
のうち、その中で使用されている遺伝子コドンが発現に
使用する大腸菌の中で出現頻度の高いものであるかどう
か、また有機化学的に合成した遺伝子断片より遺伝子全
体を組み上げる際に、正しくない連結を生じにくい構造
であるか、さらにはＤＮＡから転写されたｍＲＮＡがヘ
アピン構造等の２次構造を形成しやすいためにリボゾー
ム上での翻訳過程での効率低下が生じないか否かを考慮
の上、最も適切と思われる塩基配列１つを選び、有機化
学合成した。有機化学合成したｈＥＧＦの構造遺伝子の
塩基配列を第１図に示す。
５３個のアミノ酸に対応する遺伝子コドンの直前には翻
訳開始コドンであるＡＴＧ（これはフォルミルメチオニ
ンに対応する）、さらに上流にはプラスミドｐＢＲ３２
２に連結するためのリンカ−として制限酵素ＥｃｏＲＩ
の認識部位を設けた。一方、塩基配列の直後には翻訳停
止コドンであるＴＡＡとＴＡＧを２つ連結し、さらにベ
クターに連結のため制限酵素Ｂａｍ １１１の認識部位
を設けた。
訳開始コドンであるＡＴＧ（これはフォルミルメチオニ
ンに対応する）、さらに上流にはプラスミドｐＢＲ３２
２に連結するためのリンカ−として制限酵素ＥｃｏＲＩ
の認識部位を設けた。一方、塩基配列の直後には翻訳停
止コドンであるＴＡＡとＴＡＧを２つ連結し、さらにベ
クターに連結のため制限酵素Ｂａｍ １１１の認識部位
を設けた。
発現ベクター：ｐＴＲＬ２（第１０図）は大腸菌のトリ
プトファンオペロンのトリプトファン・プロモータ／オ
ペレータ（以下ｔｒｐ Ｐｌｏと略記）、およびｔｒｐ
Ｌ （リーダーペプチド）の構造遺伝子の先端部分を含
む約３００ｂｐ （塩基対）のＤＮＡ断片をプラスミド
ベクター：ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に挿入したも
のである。ただしｔｒｐ Ｐｌｏの上流側のＥｃｏ Ｒ
Ｉ部位は平滑化連結して消失させた。
プトファンオペロンのトリプトファン・プロモータ／オ
ペレータ（以下ｔｒｐ Ｐｌｏと略記）、およびｔｒｐ
Ｌ （リーダーペプチド）の構造遺伝子の先端部分を含
む約３００ｂｐ （塩基対）のＤＮＡ断片をプラスミド
ベクター：ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に挿入したも
のである。ただしｔｒｐ Ｐｌｏの上流側のＥｃｏ Ｒ
Ｉ部位は平滑化連結して消失させた。
ｔｒｐ Ｐｌｏの向きはｐＢＲ３２２のＴｃ （テトラ
サイクリン耐性遺伝子）の向きと同一である。第２図に
発現ベクター： ｐＴＲＬ２のｔｒｐ Ｐ１０下流域の
塩基配列を示す、この発現ベクター：ｐＴＲＬ２のｔｒ
ｐＬポリペプチド遺伝子中のＥｃｏＲ１部位に遺伝子コ
ドンの読み取り枠を合わせて外来遺伝子を連結すること
でｔｒｐＬポリペプチドのＮ末端側６個のアミノ酸と融
合した形で外来遺伝子の発現が可能である。実際、本発
現ベクター：ｐＴＲＬ２のＥｃｏＲＩ部位に第１図に示
したｈＥＧＦ遺伝子を連結してｈＥＧＦ遺伝子を発現さ
せることができ、本発現ベクターのｔｒｐ Ｐｌｏｔｒ
ｐＬの翻訳調節領域の有効性が確認できた（第１０図）
。本ベクターはｔｒｐＬ遺伝子とｈＥＧＦ遺伝子との間
に９アミノ酸に相当するリンカ一部を有するため、ｈＥ
ＧＦポリペプチドのＮ末端側に、１５個のアミノ酸が結
合した融合蛋白質としてｈＥＧＦを生産する。
サイクリン耐性遺伝子）の向きと同一である。第２図に
発現ベクター： ｐＴＲＬ２のｔｒｐ Ｐ１０下流域の
塩基配列を示す、この発現ベクター：ｐＴＲＬ２のｔｒ
ｐＬポリペプチド遺伝子中のＥｃｏＲ１部位に遺伝子コ
ドンの読み取り枠を合わせて外来遺伝子を連結すること
でｔｒｐＬポリペプチドのＮ末端側６個のアミノ酸と融
合した形で外来遺伝子の発現が可能である。実際、本発
現ベクター：ｐＴＲＬ２のＥｃｏＲＩ部位に第１図に示
したｈＥＧＦ遺伝子を連結してｈＥＧＦ遺伝子を発現さ
せることができ、本発現ベクターのｔｒｐ Ｐｌｏｔｒ
ｐＬの翻訳調節領域の有効性が確認できた（第１０図）
。本ベクターはｔｒｐＬ遺伝子とｈＥＧＦ遺伝子との間
に９アミノ酸に相当するリンカ一部を有するため、ｈＥ
ＧＦポリペプチドのＮ末端側に、１５個のアミノ酸が結
合した融合蛋白質としてｈＥＧＦを生産する。
発現ベクター：ｐＴＲＥｌ（第１１図）は大腸菌のトリ
プトファンオペロンのｔｒｐ Ｐｌｏ 、ｔｒｐＬ（リ
ーダーペプチド）の構造遺伝子およびｔｒｐＥ構造遺伝
子の先端部分を含む約４５０ｂｐのＤＮＡ断片をプラス
ミドベクター：ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に挿入し
たものである。ただしｔｒｐ Ｐｌｏの上流側のＥｃｏ
ＲＩ部位は平滑化連結して消失させた。
プトファンオペロンのｔｒｐ Ｐｌｏ 、ｔｒｐＬ（リ
ーダーペプチド）の構造遺伝子およびｔｒｐＥ構造遺伝
子の先端部分を含む約４５０ｂｐのＤＮＡ断片をプラス
ミドベクター：ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に挿入し
たものである。ただしｔｒｐ Ｐｌｏの上流側のＥｃｏ
ＲＩ部位は平滑化連結して消失させた。
ｔｒｐ Ｐｌｏの向きはｐＢＲ３２２のＴｅの向きと同
一である。第３図に発現ベクター：ｐＴＲＥｌのｔｒｐ
Ｐ１０下流域の塩基配列を示す。この発現ベクター：ｐ
ＴＲＥｌのｔｒｐＥポリペプチド遺伝子中のＥｃｏＲＩ
部位に遺伝子コドンの読み取り枠を合わせて外来遺伝子
を連結することでｔｒｐＥポリペプチドのＮ末端側７個
のアミノ酸と融合した形で外来遺伝子の発現が可能であ
る。実際、本発現ベクター：ｐＴＲＥ１のＥｃｏＲＩ部
位に第１図に示したｈＥＧＦ遺伝子を連結してｈＥＧＦ
遺伝子を発現させることができ、本発現ベクターのｔｒ
ｐ Ｐｌｏ ｔｒｐＥの翻訳調節領域の有効性が確認で
きた（第１１図）。本ベクターはｔｒｐＥ遺伝子とｈＥ
ＧＦ遺伝子との間に９アミノ酸に相当するリンカ一部を
有するため、ｈＥＧＦポリペプチドのＮ末端側に、１６
個のアミノ酸が結合した融合蛋白質としてｈＥＧＦを生
産する。
一である。第３図に発現ベクター：ｐＴＲＥｌのｔｒｐ
Ｐ１０下流域の塩基配列を示す。この発現ベクター：ｐ
ＴＲＥｌのｔｒｐＥポリペプチド遺伝子中のＥｃｏＲＩ
部位に遺伝子コドンの読み取り枠を合わせて外来遺伝子
を連結することでｔｒｐＥポリペプチドのＮ末端側７個
のアミノ酸と融合した形で外来遺伝子の発現が可能であ
る。実際、本発現ベクター：ｐＴＲＥ１のＥｃｏＲＩ部
位に第１図に示したｈＥＧＦ遺伝子を連結してｈＥＧＦ
遺伝子を発現させることができ、本発現ベクターのｔｒ
ｐ Ｐｌｏ ｔｒｐＥの翻訳調節領域の有効性が確認で
きた（第１１図）。本ベクターはｔｒｐＥ遺伝子とｈＥ
ＧＦ遺伝子との間に９アミノ酸に相当するリンカ一部を
有するため、ｈＥＧＦポリペプチドのＮ末端側に、１６
個のアミノ酸が結合した融合蛋白質としてｈＥＧＦを生
産する。
このようにして得た融合型ｈＥＧＦより余分なアミノ酸
を含まない成熟型ｈＥＧＦを得るためには融合型ｈＥＧ
Ｆに対し、ＣＮＢｒ （ブロムシアン）処理を施し、ｈ
ＥＧＦの先頭のメチオニンの位置で余分なＮ末端部分を
除去しなければならない。しかし、この方法によればｈ
ＥＧＦの２１番目のアミノ酸残基であるメチオニンの位
置で切断される可能性もあり効率的な方法とは言えない
、そこで本発明では融合型ｈＥＧＦを発現するプラスミ
ドベクターを改変し、成熟型−ｈＥＧＦを生産するベク
ターを作製した。すなわち、オリゴヌクレオチド断片を
有機化学的に合成し、上記発現ベクター： ｐＴＲＬ２
、およびｐＴＲＥｌでその有効性が確認されているｔｒ
ｐＰｌｏ、ｔｒｐＬの翻訳調節領域、あるいはｔｒｐＥ
の翻訳調節領域はそのまま残すがｔｒｐＬ遺伝子、およ
び、ｔｒｐＥ遺伝子すべてはｈＥＧＦ遺伝子で置換した
新たな発現ベクター： ｐＴＲＬＢＴ２およヒＰＴＲＥ
ＢＴ２を作製し、余分なアミノ酸を連結していない成熟
型ｈＥＧＦの発現を可能にした。
を含まない成熟型ｈＥＧＦを得るためには融合型ｈＥＧ
Ｆに対し、ＣＮＢｒ （ブロムシアン）処理を施し、ｈ
ＥＧＦの先頭のメチオニンの位置で余分なＮ末端部分を
除去しなければならない。しかし、この方法によればｈ
ＥＧＦの２１番目のアミノ酸残基であるメチオニンの位
置で切断される可能性もあり効率的な方法とは言えない
、そこで本発明では融合型ｈＥＧＦを発現するプラスミ
ドベクターを改変し、成熟型−ｈＥＧＦを生産するベク
ターを作製した。すなわち、オリゴヌクレオチド断片を
有機化学的に合成し、上記発現ベクター： ｐＴＲＬ２
、およびｐＴＲＥｌでその有効性が確認されているｔｒ
ｐＰｌｏ、ｔｒｐＬの翻訳調節領域、あるいはｔｒｐＥ
の翻訳調節領域はそのまま残すがｔｒｐＬ遺伝子、およ
び、ｔｒｐＥ遺伝子すべてはｈＥＧＦ遺伝子で置換した
新たな発現ベクター： ｐＴＲＬＢＴ２およヒＰＴＲＥ
ＢＴ２を作製し、余分なアミノ酸を連結していない成熟
型ｈＥＧＦの発現を可能にした。
［実施例］
以下、本発明の実施例を具体的に説明するが、本発明は
、これによりなんら限定されるものではない。
、これによりなんら限定されるものではない。
実施例１
ｈＥＧＦの構造遺伝子のＤＮＡ塩基配列設計とその合成
について述べる。第１図にｈＥＧＦのアミノ酸配列とそ
れに対応する遺伝子の塩基配列を示す。ｈＥＧＦのアミ
ノ酸配列はＧｒｅｇｏｒｙらにより決定されているので
、その構造遺伝子はアミノ酸−遺伝子コトンの対応表か
ら予測できる。しかし、遺伝子コドン表側に一部重複が
あるために、この対応は一義的でない。そこで、宿主別
遺伝子コドン出現頻度表（地材、細胞工学、Ｖｏｌ、
２． Ｎｏ、 １３． ｐｐ。
について述べる。第１図にｈＥＧＦのアミノ酸配列とそ
れに対応する遺伝子の塩基配列を示す。ｈＥＧＦのアミ
ノ酸配列はＧｒｅｇｏｒｙらにより決定されているので
、その構造遺伝子はアミノ酸−遺伝子コトンの対応表か
ら予測できる。しかし、遺伝子コドン表側に一部重複が
あるために、この対応は一義的でない。そこで、宿主別
遺伝子コドン出現頻度表（地材、細胞工学、Ｖｏｌ、
２． Ｎｏ、 １３． ｐｐ。
７８−８９ （１９８３））を参考に大腸菌体内で出現
頻度の高い遺伝子コドンを各アミノ酸毎に選択し、それ
らのみからなる１５９塩基の構造遺伝子と これをプラ
スミドにクローニングするためのリンカ−１翻訳停止コ
ドンを含む全長１９１塩基のＤＮＡ塩基配列をまず設計
した。ところが、公知のＤＮＡ合成法であるリン酸トリ
エステル法による一連のＤＮＡ鎖伸長反応操作（第５図
）では、第１図に示したような長鎖ＤＮＡを一気に合成
することは出来ない。すなわち、１塩基分の伸長反応の
収率を９０％としても２０回繰り返すと最終収率は１２
％程度となり、精製が困難となる。そこで実際には、第
１図の長鎖２本鎖ＤＮＡを第４図に示すように２８本の
１本鎖オリゴヌクレオチドのブロック（Ａ−１〜Ａ−１
４゜Ｂ−１〜Ｂ−１４）に分割し、それぞれをリン酸ト
リエステル法によるＤＮＡ鎖伸長反応で合成した。この
ブロック化に際しては、これらのブロックを１つにまと
めてｈＥＧＦの遺伝子を作製する時に、ブロック内、お
よびブロック間で不適切な相互作用が生じて、正しくな
い構造の遺伝子が形成されることの無いように、各ブロ
ックの塩基配列を最適化した。
頻度の高い遺伝子コドンを各アミノ酸毎に選択し、それ
らのみからなる１５９塩基の構造遺伝子と これをプラ
スミドにクローニングするためのリンカ−１翻訳停止コ
ドンを含む全長１９１塩基のＤＮＡ塩基配列をまず設計
した。ところが、公知のＤＮＡ合成法であるリン酸トリ
エステル法による一連のＤＮＡ鎖伸長反応操作（第５図
）では、第１図に示したような長鎖ＤＮＡを一気に合成
することは出来ない。すなわち、１塩基分の伸長反応の
収率を９０％としても２０回繰り返すと最終収率は１２
％程度となり、精製が困難となる。そこで実際には、第
１図の長鎖２本鎖ＤＮＡを第４図に示すように２８本の
１本鎖オリゴヌクレオチドのブロック（Ａ−１〜Ａ−１
４゜Ｂ−１〜Ｂ−１４）に分割し、それぞれをリン酸ト
リエステル法によるＤＮＡ鎖伸長反応で合成した。この
ブロック化に際しては、これらのブロックを１つにまと
めてｈＥＧＦの遺伝子を作製する時に、ブロック内、お
よびブロック間で不適切な相互作用が生じて、正しくな
い構造の遺伝子が形成されることの無いように、各ブロ
ックの塩基配列を最適化した。
第５図にはポリスチレン樹脂に結合したモノヌクレオチ
ド（ａ）に別のモノヌクレオチド（ｂ）を縮重合させ、
ジヌクレオチド（Ｃ）を合成するリン酸トリエステル法
のプロセスを示した。ｎ個のヌクレオチドからなるオリ
ゴヌクレオチドを合成するためには、本工程を（ｎ−１
）回繰り返せば良い。反応は常法に従った。
ド（ａ）に別のモノヌクレオチド（ｂ）を縮重合させ、
ジヌクレオチド（Ｃ）を合成するリン酸トリエステル法
のプロセスを示した。ｎ個のヌクレオチドからなるオリ
ゴヌクレオチドを合成するためには、本工程を（ｎ−１
）回繰り返せば良い。反応は常法に従った。
第６図には、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用したブロック化
オリゴヌクレオチドの連結手順を示す。
オリゴヌクレオチドの連結手順を示す。
２８ブロツクを一挙に連結すると正しくない組合せの生
ずるおそれがあったので、２段階の連結法を採用した。
ずるおそれがあったので、２段階の連結法を採用した。
反応は常法に従った。
以上のようにして有機化学合成したｈＥｃＦｍ伝子をプ
ラスミド：ｐＢＲ３２２を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｗ
ｌ Ｉで切断して生じた開裂部分に挿入し、ｈＥＧＦ遺
伝子を含むプラスミド：ｐＢＲＥＧＦ（４，１８キロ塩
基対（Ｋｂ）、第７図）を得、これで大腸菌を形質転換
することで大量のｈＥＧＦ遺伝子が安定的に得られるよ
うになった。
ラスミド：ｐＢＲ３２２を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｗ
ｌ Ｉで切断して生じた開裂部分に挿入し、ｈＥＧＦ遺
伝子を含むプラスミド：ｐＢＲＥＧＦ（４，１８キロ塩
基対（Ｋｂ）、第７図）を得、これで大腸菌を形質転換
することで大量のｈＥＧＦ遺伝子が安定的に得られるよ
うになった。
次に、ｔｒｐ ＰｌｏとｈＥＧＦ遺伝子のリンカ−領域
のＤＮＡ塩基配列設計とその合成について述べる。本発
明では大腸菌由来のｔｒｐ ＰｌｏとｔｒｐＬの翻訳調
節領域、あるいはｔｒｐ ＰｌｏとｔｒｐＥの翻訳１ｉ
筋領域を利用して成熟型ｈＥＧＦの発現を目指したので
リンカ−領域のＤＮＡ塩基配列は一義的に定まる。すな
わち、ｔｒｐ Ｐｌｏの直後にあるｔｒｐ Ｌの先頭コ
ドンＡＴＧ位置にｈＥＧＦ遺伝子の先頭コドンＡＴＧを
合せるようにするか、ｔｒｐ Ｅの先頭コドンＡＴＧ位
置にｈＥＧＦ遺伝子の先頭コドンＡＴＧを合せるように
すればよい、すでに合成し、プラスミド（ｐＢＲＥＧＦ
）にクローニングしであるｈＥＧＦ遺伝子と読み取り枠
が一致するようにｈＥＧＦ遺伝子のＡＴＧより１５塩基
目にある制限酵素：Ｈｉｎｆ Ｉ（第１図）の切断部位
を利用することとし、ｔｒｐ Ｐ１０上流のＨｐａ Ｉ
部位からｈＥＧＦ遺伝子内の）ｌｉｎｆ工部位までの５
０ｂｐＤＮＡ断片、および１８６ｂｐＤＮＡ断片（ＣＩ
〜Ｃ８）を合成した。第８図、第９図にそれらの塩基配
列を示す、有機化学合成はｈＥＧＦ遺伝子の場合と同様
にした。
のＤＮＡ塩基配列設計とその合成について述べる。本発
明では大腸菌由来のｔｒｐ ＰｌｏとｔｒｐＬの翻訳調
節領域、あるいはｔｒｐ ＰｌｏとｔｒｐＥの翻訳１ｉ
筋領域を利用して成熟型ｈＥＧＦの発現を目指したので
リンカ−領域のＤＮＡ塩基配列は一義的に定まる。すな
わち、ｔｒｐ Ｐｌｏの直後にあるｔｒｐ Ｌの先頭コ
ドンＡＴＧ位置にｈＥＧＦ遺伝子の先頭コドンＡＴＧを
合せるようにするか、ｔｒｐ Ｅの先頭コドンＡＴＧ位
置にｈＥＧＦ遺伝子の先頭コドンＡＴＧを合せるように
すればよい、すでに合成し、プラスミド（ｐＢＲＥＧＦ
）にクローニングしであるｈＥＧＦ遺伝子と読み取り枠
が一致するようにｈＥＧＦ遺伝子のＡＴＧより１５塩基
目にある制限酵素：Ｈｉｎｆ Ｉ（第１図）の切断部位
を利用することとし、ｔｒｐ Ｐ１０上流のＨｐａ Ｉ
部位からｈＥＧＦ遺伝子内の）ｌｉｎｆ工部位までの５
０ｂｐＤＮＡ断片、および１８６ｂｐＤＮＡ断片（ＣＩ
〜Ｃ８）を合成した。第８図、第９図にそれらの塩基配
列を示す、有機化学合成はｈＥＧＦ遺伝子の場合と同様
にした。
実施例２
成熟型ｈＥＧＦの発現用ベクターである複合プラスミド
ｐＴＲＬＢＴ２の親ベクターであり、融合型ｈＥＧＦの
発現ベクターであるプラスミドｐＴＲＬＢＴ１の作製法
について述べる（第１０図）、 ＰＴＲＬＢＴＩは前述
の発現ベクター：ｐＴＲＬ２のＥｃｏ ＲＩ −５ａｌ
Ｉ切断部位に上記ｐＢＲＥＧＦの［Ｅｃｏ ＲＩ −
５ａｌ ＩＦ断片（４８０ｂＰ）を連結したものであり
、１μｇ／ｍ１以上の融合型ｈＥＧＦの生産が可能であ
る。
ｐＴＲＬＢＴ２の親ベクターであり、融合型ｈＥＧＦの
発現ベクターであるプラスミドｐＴＲＬＢＴ１の作製法
について述べる（第１０図）、 ＰＴＲＬＢＴＩは前述
の発現ベクター：ｐＴＲＬ２のＥｃｏ ＲＩ −５ａｌ
Ｉ切断部位に上記ｐＢＲＥＧＦの［Ｅｃｏ ＲＩ −
５ａｌ ＩＦ断片（４８０ｂＰ）を連結したものであり
、１μｇ／ｍ１以上の融合型ｈＥＧＦの生産が可能であ
る。
次に複合プラスミドｐＴＲＬＢＴ２の作製法を第１２図
で説明する。 ＰＴＲＬＢＴＩ約３０μｇを制限酵素Ｈ
ｐａ Ｉとｓｐｈ Ｉで切断後、０．８％アガロースゲ
ル電気泳動を行いｐＴＲＬＢＴ２作製用ベクターとなる
４ＫｂのＤＮＡ断片とｈＥＧＦ遺伝子を含む５７０ｂｐ
の［Ｈｐａ Ｉ −Ｓｐｈ Ｉ ］断片とを回収した。
で説明する。 ＰＴＲＬＢＴＩ約３０μｇを制限酵素Ｈ
ｐａ Ｉとｓｐｈ Ｉで切断後、０．８％アガロースゲ
ル電気泳動を行いｐＴＲＬＢＴ２作製用ベクターとなる
４ＫｂのＤＮＡ断片とｈＥＧＦ遺伝子を含む５７０ｂｐ
の［Ｈｐａ Ｉ −Ｓｐｈ Ｉ ］断片とを回収した。
後者は更に制限酵素）１ｉｎｆ Ｉで切断した後、■ア
クリルアミドゲル電気泳動しｈＥＧＦ遺伝子の大部分を
含む３４０ｂＰの［Ｈｉｎｆ Ｉ −Ｓｐｈ Ｉ］断片
を得た。
クリルアミドゲル電気泳動しｈＥＧＦ遺伝子の大部分を
含む３４０ｂＰの［Ｈｉｎｆ Ｉ −Ｓｐｈ Ｉ］断片
を得た。
一方、実施例１で合成したｔｒｐ Ｐｌｏとｔｒｐ Ｌ
の翻訳調節およびｈＥＧＦのＮ末端側３アミノ酸分の遺
伝子コドンを含む５０ｂｐの［Ｈｐａ Ｉ−Ｈｉｎｆ
Ｉ ］断片（第８図）は、８Ｍ尿素を含む２０％のポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で精製した。ゲルより回収
の後ＤＮＡリガーゼ用緩衝液（１００ｍＭ トリス塩酸
（ｐＨ７，６）、 ５ｍＭ ＭｇＣ１，）に溶解し、−
旦７０℃に熱した後、室温まで徐冷しアニーリングした
。
の翻訳調節およびｈＥＧＦのＮ末端側３アミノ酸分の遺
伝子コドンを含む５０ｂｐの［Ｈｐａ Ｉ−Ｈｉｎｆ
Ｉ ］断片（第８図）は、８Ｍ尿素を含む２０％のポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で精製した。ゲルより回収
の後ＤＮＡリガーゼ用緩衝液（１００ｍＭ トリス塩酸
（ｐＨ７，６）、 ５ｍＭ ＭｇＣ１，）に溶解し、−
旦７０℃に熱した後、室温まで徐冷しアニーリングした
。
次いで、反応緩衝液（１００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７
，６）、５ｍＭ ＭｇＣ１□）に溶解した上記３４０ｂ
ｐ断片３００ｎｇと５０ｂｐ断片１１００ｎとを７４Ｄ
ＮＡリガーゼ７００ユニツトを用いて連結した。 ｓｐ
ｈ Ｉ部位で自己連結したＤＮＡ断片を取り除くためＤ
ＮＡ溶液に対しフェノール処理を行いＴ４リガーゼを失
活させた後に再度、制限酵素ｓｐｈ Ｉで切断の後、錦
アクリルアミドゲル電気泳動しｔｒｐＰｌｏとＡＴＧか
ら始まる完全なｈＥＧＦ遺伝子を含む３９０ｂｐの［Ｈ
ｐａ Ｉ −Ｓｐｈ Ｉ ］断片を得た。
，６）、５ｍＭ ＭｇＣ１□）に溶解した上記３４０ｂ
ｐ断片３００ｎｇと５０ｂｐ断片１１００ｎとを７４Ｄ
ＮＡリガーゼ７００ユニツトを用いて連結した。 ｓｐ
ｈ Ｉ部位で自己連結したＤＮＡ断片を取り除くためＤ
ＮＡ溶液に対しフェノール処理を行いＴ４リガーゼを失
活させた後に再度、制限酵素ｓｐｈ Ｉで切断の後、錦
アクリルアミドゲル電気泳動しｔｒｐＰｌｏとＡＴＧか
ら始まる完全なｈＥＧＦ遺伝子を含む３９０ｂｐの［Ｈ
ｐａ Ｉ −Ｓｐｈ Ｉ ］断片を得た。
次に、本断片にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを作用さ
せてＩ（ｐａ Ｉ側をリン酸化しベクターにクローニン
グし易くした後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ５００ユニットで
上記調製法にて調製済みのベクター（４Ｋｂ）４００ｎ
ｇと連結した。こうして得たＤＮＡ混合物で大腸菌ＨＢ
ＩＯＩを形質転換し、複合プラスミドｐＴＲＬＢＴ２を
保持する大腸菌ＨＢＩＯＩ［ｐＴＲＬＢＴ２］を得るこ
とが出来た。
せてＩ（ｐａ Ｉ側をリン酸化しベクターにクローニン
グし易くした後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ５００ユニットで
上記調製法にて調製済みのベクター（４Ｋｂ）４００ｎ
ｇと連結した。こうして得たＤＮＡ混合物で大腸菌ＨＢ
ＩＯＩを形質転換し、複合プラスミドｐＴＲＬＢＴ２を
保持する大腸菌ＨＢＩＯＩ［ｐＴＲＬＢＴ２］を得るこ
とが出来た。
実施例３
成熟型ｈＥＧＦの発現用ベクターである複合プラスミド
：ｐＴＲＥＢＴ２の作製法について述べる（第１３図）
。実施例２で述べた方法によりまずｈＥＧＦ遺伝子の大
部分を含む３４０ｂｐの［Ｈｉｎｆ Ｉ−Ｓｐｈ Ｉ
］断片を得た。
：ｐＴＲＥＢＴ２の作製法について述べる（第１３図）
。実施例２で述べた方法によりまずｈＥＧＦ遺伝子の大
部分を含む３４０ｂｐの［Ｈｉｎｆ Ｉ−Ｓｐｈ Ｉ
］断片を得た。
一方、実施例１ で合成したｔｒｐ Ｐｌｏ、ｔｒｐＬ
構造遺伝子とｔｒｐ Ｅの翻訳調節およびｈＥＧＦのＮ
末端側３アミノ酸分の遺伝子コドンを含む１８６ｂｐの
［Ｈｐａ Ｉ −Ｉ（ｉｎｆ Ｉコ断片（第９図）は、
８Ｍ尿素を含む２０％のポリアクリルアミドゲル電気泳
動で精製した。ゲルより回収の後ＤＮＡリガーゼ用緩衝
液（１００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７，６）、 ５ｍＭ
ＭｇＣ１，）に溶解し、−旦７０℃に熱した後、室温
まで徐冷しアニーリングした。 次いで、反応緩衝液（
１００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７，６）、５ｍＭ Ｍｇ
Ｃ１ｚ）に溶解した上記３４０ｂｐ断片３００ｎｇと１
８６ｂｐ断片３００ｎｇとをＴ、 ＤＮＡリガーゼ７０
０ユニツトを用いて連結した。Ｓｐｈ■部位で自己連結
したＤＮＡ断片を取り除くためＤＮＡ溶液に対しフェノ
ール処理を行いＴ４リガーゼを失活させた後に再度、制
限酵素ｓｐｈ Ｉで切断の後、５％アクリルアミドゲル
電気泳動しｔｒｐ ＰｌｏとＡＴＧから始まる完全なｈ
ＥＧＦ遺伝子を含む５２６ｂｐの［Ｈｐａ Ｉ −Ｓｐ
ｈ Ｉコ断片を得た。 次に、本断片にＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼを作用させてＨｐａ Ｉ側をリン酸化し
ベクターにクローニングし易くした後、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ５００ユニットで実施例２にて調製済みのベクター
（４Ｋｂ）４００ｎｇと連結した。こうして得たＤＮＡ
混合物で大腸菌）ＩＢＩＯＩを形質転換し、複合プラス
ミドρＴＲＥＢＴ２を保持する大腸菌ＨＢ１０１［ｐＴ
ＲＥＢＴ２コを得ることが出来た。
構造遺伝子とｔｒｐ Ｅの翻訳調節およびｈＥＧＦのＮ
末端側３アミノ酸分の遺伝子コドンを含む１８６ｂｐの
［Ｈｐａ Ｉ −Ｉ（ｉｎｆ Ｉコ断片（第９図）は、
８Ｍ尿素を含む２０％のポリアクリルアミドゲル電気泳
動で精製した。ゲルより回収の後ＤＮＡリガーゼ用緩衝
液（１００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７，６）、 ５ｍＭ
ＭｇＣ１，）に溶解し、−旦７０℃に熱した後、室温
まで徐冷しアニーリングした。 次いで、反応緩衝液（
１００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７，６）、５ｍＭ Ｍｇ
Ｃ１ｚ）に溶解した上記３４０ｂｐ断片３００ｎｇと１
８６ｂｐ断片３００ｎｇとをＴ、 ＤＮＡリガーゼ７０
０ユニツトを用いて連結した。Ｓｐｈ■部位で自己連結
したＤＮＡ断片を取り除くためＤＮＡ溶液に対しフェノ
ール処理を行いＴ４リガーゼを失活させた後に再度、制
限酵素ｓｐｈ Ｉで切断の後、５％アクリルアミドゲル
電気泳動しｔｒｐ ＰｌｏとＡＴＧから始まる完全なｈ
ＥＧＦ遺伝子を含む５２６ｂｐの［Ｈｐａ Ｉ −Ｓｐ
ｈ Ｉコ断片を得た。 次に、本断片にＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼを作用させてＨｐａ Ｉ側をリン酸化し
ベクターにクローニングし易くした後、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ５００ユニットで実施例２にて調製済みのベクター
（４Ｋｂ）４００ｎｇと連結した。こうして得たＤＮＡ
混合物で大腸菌）ＩＢＩＯＩを形質転換し、複合プラス
ミドρＴＲＥＢＴ２を保持する大腸菌ＨＢ１０１［ｐＴ
ＲＥＢＴ２コを得ることが出来た。
実施例４
大腸菌によるｈＥＧＦの生産について述べる。
大腸菌ＨＢＩＯ１［ｐＴＲＬＢＴ２］あるいはＨＢｌｏ
ｌ［ｐＴＲＥ［１Ｔ２１の保存菌株の１白金耳を３ｍｌ
のＭ９培地（ＮＨ２Ｃｌ Ｉｇ、 Ｎａ２ＨＰＯ４６ｇ
、 ＫＩＩ□ＰＯ４３ｇ。
ｌ［ｐＴＲＥ［１Ｔ２１の保存菌株の１白金耳を３ｍｌ
のＭ９培地（ＮＨ２Ｃｌ Ｉｇ、 Ｎａ２ＨＰＯ４６ｇ
、 ＫＩＩ□ＰＯ４３ｇ。
ＮａＣｌ ０．５ｇ、 ＣａＣｌ２・２Ｈ２００，０１
５ｇ、 ＭｇＳＯ４・７１１，００．１ｇ、カザミノ酸
２．５ｇグルコース５ｇｔチアミン０．１ｇ、プロリン
１ｇ、アンピシリン５０ｍｇ 、水Ｉ Ｑ 、 ｐ）１
７．４）に接種し、３７℃で１晩振盪培養した。次いで
１本培養液２ｍｌを上記組成の３Ｊ３ｍｌのＭ９培地に
接種し、３７℃で４時間振盪培養した。培養終了後集菌
し、菌体を５０１１ＩＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５
）２＋＋＋１で洗浄後、同緩衝液１ｍｌに懸濁した。菌
体懸濁液にフェニルメチルスルフオニルフルオリド（ｌ
ｏｍｇ／ｍ１）１８ μｌ、 リゾチーム（１０ｍｇ
／ｍｌ） １０ ｔｔ ｌおよび２５０ｍＭ ＥＤＴＡ
２０μｍを添加し攪拌後、水中に３０分間保持した。
５ｇ、 ＭｇＳＯ４・７１１，００．１ｇ、カザミノ酸
２．５ｇグルコース５ｇｔチアミン０．１ｇ、プロリン
１ｇ、アンピシリン５０ｍｇ 、水Ｉ Ｑ 、 ｐ）１
７．４）に接種し、３７℃で１晩振盪培養した。次いで
１本培養液２ｍｌを上記組成の３Ｊ３ｍｌのＭ９培地に
接種し、３７℃で４時間振盪培養した。培養終了後集菌
し、菌体を５０１１ＩＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５
）２＋＋＋１で洗浄後、同緩衝液１ｍｌに懸濁した。菌
体懸濁液にフェニルメチルスルフオニルフルオリド（ｌ
ｏｍｇ／ｍ１）１８ μｌ、 リゾチーム（１０ｍｇ
／ｍｌ） １０ ｔｔ ｌおよび２５０ｍＭ ＥＤＴＡ
２０μｍを添加し攪拌後、水中に３０分間保持した。
次いで、懸濁液を３分間超音波処理し、菌体を破砕した
後、９６０ｍｇの尿素と５０ｍ阿トリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）約０．７耐を加え、全量で２＋ａｌとした。
後、９６０ｍｇの尿素と５０ｍ阿トリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）約０．７耐を加え、全量で２＋ａｌとした。
３７℃で１時間振盪の後、７００００Ｇで３０分間遠心
分離し、沈殿物を除去した。続いて変性蛋白質を含む上
滑を５０ＩｎＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）を透析
外液として、３回透析を繰返し尿素を取り除き、ラジオ
レセプターアッセイ（ＲＲＡ）用試料とした。
分離し、沈殿物を除去した。続いて変性蛋白質を含む上
滑を５０ＩｎＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）を透析
外液として、３回透析を繰返し尿素を取り除き、ラジオ
レセプターアッセイ（ＲＲＡ）用試料とした。
ＲＲＡは次のように実施した。マウス肝ミクロゾーム分
画０．２ｍｌに標準ＥＧＦまたは検体０．１ｍｌと１３
１１標識マウスＥＧＦ０．１ｍｌを加え攪拌後、室温で
９０分間反応させＥＧＦレセプターに対する標準ＥＧＦ
または検体と１３１工標識マウスＥＧＦとの競合的結合
反応を完了させた。次いで、４℃、６０００Ｇで５分間
遠心分離し、上清を吸引除去した後、沈殿中に含まれる
レセプターと結合した１３１工標識マウスＥＧＦの放射
活性を測定し、検体中のｈＥＧＦを定量した。マウスＥ
ＧＦとｈＥＧＦの比活性の違いを補正してＨＢｌｏｌ［
ＰＴＲＬＢＴ２］。
画０．２ｍｌに標準ＥＧＦまたは検体０．１ｍｌと１３
１１標識マウスＥＧＦ０．１ｍｌを加え攪拌後、室温で
９０分間反応させＥＧＦレセプターに対する標準ＥＧＦ
または検体と１３１工標識マウスＥＧＦとの競合的結合
反応を完了させた。次いで、４℃、６０００Ｇで５分間
遠心分離し、上清を吸引除去した後、沈殿中に含まれる
レセプターと結合した１３１工標識マウスＥＧＦの放射
活性を測定し、検体中のｈＥＧＦを定量した。マウスＥ
ＧＦとｈＥＧＦの比活性の違いを補正してＨＢｌｏｌ［
ＰＴＲＬＢＴ２］。
ＨＢＩＯＩ ［ｐＴＲＬＢ７２］の培養液Ｉｎ＋１当り
いずれも２４ｎｇのｈＥＧＦ活性を得た。
いずれも２４ｎｇのｈＥＧＦ活性を得た。
［発明の効果］
本発明によればｈＥＧＦ遺伝子を保持する大腸菌ＨＢＩ
ＯＩ ［ｐＴＲＬＢＴ２］およびＨＢｌｏｌ［ｐＴＲＥ
ＢＴ２］を得ることが出来るので、当該大腸菌を培養し
他ポリペプチドと融合していないｈＥＧＦを生産できる
。
ＯＩ ［ｐＴＲＬＢＴ２］およびＨＢｌｏｌ［ｐＴＲＥ
ＢＴ２］を得ることが出来るので、当該大腸菌を培養し
他ポリペプチドと融合していないｈＥＧＦを生産できる
。
第１図は有機化学合成したｈＥＧＦ遺伝子と前後のリン
カ一部分の全塩基配列とｈＥＧＦのアミノ酸配列との対
応を示す図、第２図は発現ベクターｐＴＲＬ２の内トリ
プトファンオペロンのプロモーター、オペレーター（ｔ
ｒｐ Ｐｌｏ）、およびｔｒｐＬリーダーペプチドの先
頭部分を含む領域の塩基配列を示す図、第３図は発現ベ
クターｐＴＲＥ１の内トリプトファンオペロンのプロモ
ーター、オペレーター（ｔｒｐＰｌｏ）、ｔｒｐＬ構造
遺伝子、およびｔｒｐＥ構造遺伝子の先頭部分を含む領
域の塩基配列を示す図、第４図は合成したｈＥＧＦ構造
遺伝子の全塩基配列を２８本のオリゴヌクレオチドブロ
ックに分けて示す図、第５図はオリゴヌクレオチドの合
成フローを示す図、第６図はオリゴヌクレオチドブロッ
クの連結手順を示す図、第７図は複合プラスミドｐＢＲ
ＥＧＦの作製手Ｊｆｆｉを示す図、第８図、第９図はｔ
ｒｐ ＰｌｏとｈＥＧＦ遺伝子を連結するためのＤＮＡ
断片の構造を示す図、第１０図は複合プラスミドｐＴＲ
ＬＢＴ１の作製手順を示す図、第１１図は複合プラスミ
ドｐＴＲＥＢＴ１の作製手順を示す図、第１２図は複合
プラスミドＰＴＲＬＢＴ２の作製手順を示す図、第１３
図は複合プラスミドｐＴＲＥＢＴ２の作製手順を示す図
である。 Ａ・・・・・・アデニン、Ｃ・・・・・・シトシン、Ｇ
・・・・・・グアニン、Ｔ・・・・・・チミン。 ｔｒｐ Ｐｌｏ・・・・・・ トリプトファンプロモー
タ・オペレータ、 ＰＢ ・・・・・・Ｐｒ１ｂｎｏ
ｖ ｂｏｘ。 ＳＯ・−・・Ｓｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏｗ配列、Ａ
ｐ ・・・・・・アンピシリン耐性遺伝子、Ｔｃ
・・・・・・テトラサイクリン耐性遺伝子代理人 弁
理士 小川勝男 ：４゛−＼［二 ゴ 、 （（３８−”１ 憤り 〜 ト ヘ＼ 第５目 第ｙ２ ”７
カ一部分の全塩基配列とｈＥＧＦのアミノ酸配列との対
応を示す図、第２図は発現ベクターｐＴＲＬ２の内トリ
プトファンオペロンのプロモーター、オペレーター（ｔ
ｒｐ Ｐｌｏ）、およびｔｒｐＬリーダーペプチドの先
頭部分を含む領域の塩基配列を示す図、第３図は発現ベ
クターｐＴＲＥ１の内トリプトファンオペロンのプロモ
ーター、オペレーター（ｔｒｐＰｌｏ）、ｔｒｐＬ構造
遺伝子、およびｔｒｐＥ構造遺伝子の先頭部分を含む領
域の塩基配列を示す図、第４図は合成したｈＥＧＦ構造
遺伝子の全塩基配列を２８本のオリゴヌクレオチドブロ
ックに分けて示す図、第５図はオリゴヌクレオチドの合
成フローを示す図、第６図はオリゴヌクレオチドブロッ
クの連結手順を示す図、第７図は複合プラスミドｐＢＲ
ＥＧＦの作製手Ｊｆｆｉを示す図、第８図、第９図はｔ
ｒｐ ＰｌｏとｈＥＧＦ遺伝子を連結するためのＤＮＡ
断片の構造を示す図、第１０図は複合プラスミドｐＴＲ
ＬＢＴ１の作製手順を示す図、第１１図は複合プラスミ
ドｐＴＲＥＢＴ１の作製手順を示す図、第１２図は複合
プラスミドＰＴＲＬＢＴ２の作製手順を示す図、第１３
図は複合プラスミドｐＴＲＥＢＴ２の作製手順を示す図
である。 Ａ・・・・・・アデニン、Ｃ・・・・・・シトシン、Ｇ
・・・・・・グアニン、Ｔ・・・・・・チミン。 ｔｒｐ Ｐｌｏ・・・・・・ トリプトファンプロモー
タ・オペレータ、 ＰＢ ・・・・・・Ｐｒ１ｂｎｏ
ｖ ｂｏｘ。 ＳＯ・−・・Ｓｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏｗ配列、Ａ
ｐ ・・・・・・アンピシリン耐性遺伝子、Ｔｃ
・・・・・・テトラサイクリン耐性遺伝子代理人 弁
理士 小川勝男 ：４゛−＼［二 ゴ 、 （（３８−”１ 憤り 〜 ト ヘ＼ 第５目 第ｙ２ ”７
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、大腸菌由来のトリプトファンオペロン中のトリプト
ファン調節遺伝子とその下流に連結したｔｒｐＬポリペ
プチド翻訳調節塩基配列とｔｒｐＬポリペプチドのＮ末
端のメチオニン以下にヒト上皮細胞増殖因子の５３個の
アミノ酸をコードした遺伝子を含む下記のＤＮＡ塩基配
列【遺伝子配列があります。】 で表現される遺伝子を用いることを特徴とするヒト上皮
細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法。 ２、大腸菌由来のトリプトファンオペロン中のトリプト
ファン調節遺伝子とその下流に連結したｔｒｐＥポリペ
プチド翻訳調節塩基配列とｔｒｐＥポリペプチドのＮ末
端のメチオニン以下にヒト上皮細胞増殖因子の５３個の
アミノ酸をコードした遺伝子を含む下記のＤＮＡ塩基配
列【遺伝子配列があります。】 で表現される遺伝子を用いることを特徴とするヒト上皮
細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法。 ３、大腸菌由来のトリプトファンオペロン中のトリプト
ファン調節遺伝子とその下流に連結したｔｒｐＬポリペ
プチド遺伝子、および、ｔｒｐＥポリペプチド翻訳調節
塩基配列とｔｒｐＥポリペプチドのＮ末端のメチオニン
以下にヒト上皮細胞増殖因子の５３個のアミノ酸をコー
ドした遺伝子を含む下記のＤＮＡ塩基配列 【遺伝子配列があります。】 で表現される遺伝子を用いることを特徴とするヒト上皮
細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法。 ４、トリプトファン調節遺伝子と大腸菌由来のトリプト
ファンオペロン中のトリプトファン調節遺伝子とその下
流に連結したｔｒｐＬポリペプチド翻訳調節塩基配列と
ｔｒｐＬポリペプチドのＮ末端のメチオニン以下にヒト
上皮細胞増殖因子の５３個のアミノ酸をコードした遺伝
子を含む下記のＤＮＡ塩基配列 【遺伝子配列があります。】 とを有するプラスミドベクターを用いることを特徴とす
るヒト上皮細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法。 ５、トリプトファン調節遺伝子と大腸菌由来のトリプト
ファンオペロン中のトリプトファン調節遺伝子とその下
流に連結したｔｒｐＥポリペプチド翻訳調節塩基配列と
ｔｒｐＥポリペプチドのＮ末端のメチオニン以下にヒト
上皮細胞増殖因子の５３個のアミノ酸をコードした遺伝
子を含む下記のＤＮＡ塩基配列 【遺伝子配列があります。】 とを有するプラスミドベク ターを用いることを特徴とするヒト上皮細胞増殖因子の
遺伝子工学的生産方法。 ６、トリプトファン調節遺伝子と大腸菌由来のトリプト
ファンオペロン中のトリプトファン調節遺伝子とその下
流に連結したｔｒｐＬポリペプチド遺伝子、および、ｔ
ｒｐＥポリペプチド翻訳調節塩基配列とｔｒｐＥポリペ
プチドのＮ末端のメチオニン以下にヒト上皮細胞増殖因
子の５３個のアミノ酸をコードした遺伝子を含む下記の
ＤＮＡ塩基配列 【遺伝子配列があります。】 とを有するプラスミドベクターを用いることを特徴とす
るヒト上皮細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法。 ７、トリプトファン調節遺伝子と大腸菌由来のトリプト
ファンオペロン中のトリプトファン調節遺伝子とその下
流に連結したｔｒｐＬポリペプチド翻訳調節塩基配列と
ｔｒｐＬポリペプチドのＮ末端のメチオニン以下にヒト
上皮細胞増殖因子の５３個のアミノ酸をコードした遺伝
子を含む下記のＤＮＡ塩基配列 【遺伝子配列があります。】 とを有するプラスミドベクターを保持する大腸菌を用い
ることを特徴とするヒト上皮細胞増殖因子の遺伝子工学
的生産方法。 ８、トリプトファン調節遺伝子と大腸菌由来のトリプト
ファンオペロン中のトリプトファン調節遺伝子とその下
流に連結したｔｒｐＥポリペプチド翻訳調節塩基配列と
ｔｒｐＥポリペプチドのＮ末端のメチオニン以下にヒト
上皮細胞増殖因子の５３個のアミノ酸をコードした遺伝
子を含む下記のＤＮＡ塩基配列 【遺伝子配列があります。】 とを有するプラスミドベクターを保持する大腸菌を用い
ることを特徴とするヒト上皮細胞増殖因子の遺伝子工学
的生産方法。 ９、トリプトファン調節遺伝子と大腸菌由来のトリプト
ファンオペロン中のトリプトファン調節遺伝子とその下
流に連結したｔｒｐＬポリペプチド遺伝子、および、ｔ
ｒｐＥポリペプチド翻訳調節塩基配列とｔｒｐＥポリペ
プチドのＮ末端のメチオニン以下にヒト上皮細胞増殖因
子の５３個のアミノ酸をコードした遺伝子を含む下記の
ＤＮＡ塩基配列 【遺伝子配列があります。】 とを有するプラスミドベクターを保持する大腸菌を用い
ることを特徴とするヒト上皮細胞増殖因子の遺伝子工学
的生産方法。 １０、誘導物質としてＩＡ（３−β−インドールアクリ
ル酸）を添加して培養された大腸菌を用いることを特徴
とする特許請求の範囲第７項記載のヒト上皮細胞増殖因
子の遺伝子工学的生産方法。 １１、誘導物質としてＩＡ（３−β−インドールアクリ
ル酸）を添加して培養された大腸菌を用いることを特徴
とする特許請求の範囲第８項記載のヒト上皮細胞増殖因
子の遺伝子工学的生産方法。 １２、誘導物質としてＩＡ（３−β−インドールアクリ
ル酸）を添加して培養された大腸菌を用いることを特徴
とする特許請求の範囲第９項記載のヒト上皮細胞増殖因
子の遺伝子工学的生産方法。 １３、トリプトファンを含まない培地を用いて培養され
た大腸菌を用いることを特徴とする特許請求の範囲第７
項記載のヒト上皮細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法
。 １４、トリプトファンを含まない培地を用いて培養され
た大腸菌を用いることを特徴とする特許請求の範囲第８
項記載のヒト上皮細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法
。 １５、トリプトファンを含まない培地を用いて培養され
た大腸菌を用いることを特徴とする特許請求の範囲第９
項記載のヒト上皮細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法
。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63074382A JPH01247098A (ja) | 1988-03-30 | 1988-03-30 | ヒトの上皮細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法 |
| DE1989615841 DE68915841T2 (de) | 1988-03-30 | 1989-03-30 | Verfahren zur Herstellung von Epidermal-Wachstumsfaktor durch genetische Transformation. |
| EP19890105639 EP0335400B1 (en) | 1988-03-30 | 1989-03-30 | Processes for production of human epidermal growth factor by genetic engineering |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63074382A JPH01247098A (ja) | 1988-03-30 | 1988-03-30 | ヒトの上皮細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01247098A true JPH01247098A (ja) | 1989-10-02 |
Family
ID=13545561
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63074382A Pending JPH01247098A (ja) | 1988-03-30 | 1988-03-30 | ヒトの上皮細胞増殖因子の遺伝子工学的生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01247098A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07509140A (ja) * | 1993-04-26 | 1995-10-12 | ダイウォン ファーマシューティカル カンパニー，リミテッド | ヒト上皮成長因子をコードする新規な遺伝子およびその製造方法 |
| CN116555310A (zh) * | 2023-03-28 | 2023-08-08 | 广州汉方合成生物研究中心(有限合伙) | 一种高通量筛选异源组成型启动子的方法及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56145221A (en) * | 1980-03-24 | 1981-11-11 | Genentech Inc | Bacteria polypeptide development using tryptophan promotor operator |
| JPS59154989A (ja) * | 1983-02-23 | 1984-09-04 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | プラスミド |
| JPS61275222A (ja) * | 1985-03-25 | 1986-12-05 | ザ ウエルカム フアウンデ−シヨン リミテツド | 上皮成長因子の製造法 |
-
1988
- 1988-03-30 JP JP63074382A patent/JPH01247098A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56145221A (en) * | 1980-03-24 | 1981-11-11 | Genentech Inc | Bacteria polypeptide development using tryptophan promotor operator |
| JPS59154989A (ja) * | 1983-02-23 | 1984-09-04 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | プラスミド |
| JPS61275222A (ja) * | 1985-03-25 | 1986-12-05 | ザ ウエルカム フアウンデ−シヨン リミテツド | 上皮成長因子の製造法 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07509140A (ja) * | 1993-04-26 | 1995-10-12 | ダイウォン ファーマシューティカル カンパニー，リミテッド | ヒト上皮成長因子をコードする新規な遺伝子およびその製造方法 |
| CN116555310A (zh) * | 2023-03-28 | 2023-08-08 | 广州汉方合成生物研究中心(有限合伙) | 一种高通量筛选异源组成型启动子的方法及其应用 |
| CN116555310B (zh) * | 2023-03-28 | 2024-03-29 | 广州市金因源生物技术有限公司 | 一种高通量筛选异源组成型启动子的方法及其应用 |
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