JPH04211375A - 合成遺伝子及びそれを用いたヒト血清アルブミンの製造法 - Google Patents
合成遺伝子及びそれを用いたヒト血清アルブミンの製造法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒト血清アルブミン（Ｈ
ＳＡ）をコードする遺伝子を含む合成ＤＮＡ、合成ＤＮ
Ａを有するプラスミド、該プラスミドにより形質転換さ
れた微生物及び該微生物を培養してヒト血清アルブミン
を製造する方法に関する。
ＳＡ）をコードする遺伝子を含む合成ＤＮＡ、合成ＤＮ
Ａを有するプラスミド、該プラスミドにより形質転換さ
れた微生物及び該微生物を培養してヒト血清アルブミン
を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】組換えＤＮＡ技術の進歩によって、大腸
菌等の微生物において高等真核生物由来の遺伝子を発現
させ、その目的遺伝子産物を微生物を培養することによ
って取得する技術が発展してきた。一般に高等真核生物
の遺伝子は、ｍＲＮＡを調製して、逆転写酵素によって
作製したｃＤＮＡからクローニングすることによって得
られている。ヒト血清アルブミンについても、例えば特
開昭５８−５６６８４等にｃＤＮＡの調製法が開示され
ている。
菌等の微生物において高等真核生物由来の遺伝子を発現
させ、その目的遺伝子産物を微生物を培養することによ
って取得する技術が発展してきた。一般に高等真核生物
の遺伝子は、ｍＲＮＡを調製して、逆転写酵素によって
作製したｃＤＮＡからクローニングすることによって得
られている。ヒト血清アルブミンについても、例えば特
開昭５８−５６６８４等にｃＤＮＡの調製法が開示され
ている。
【０００３】蛋白質をコードする遺伝子はその蛋白質の
アミノ酸配列を１アミノ酸につきＤＮＡの３塩基からな
る遺伝暗号（コドン）によってコードしているが、ある
アミノ酸に対応する遺伝暗号は必ずしも１つではない。 そして、大量に発現している遺伝子では生物種によって
使用されている遺伝暗号に偏りがみられることが知られ
ている。
アミノ酸配列を１アミノ酸につきＤＮＡの３塩基からな
る遺伝暗号（コドン）によってコードしているが、ある
アミノ酸に対応する遺伝暗号は必ずしも１つではない。 そして、大量に発現している遺伝子では生物種によって
使用されている遺伝暗号に偏りがみられることが知られ
ている。
【０００４】従って、前記の方法で調製されたｃＤＮＡ
からなる遺伝子は高等真核生物において多用される遺伝
暗号からなる遺伝子であり、必ずしも大腸菌等の原核生
物である微生物における発現に好適なものではない。
からなる遺伝子は高等真核生物において多用される遺伝
暗号からなる遺伝子であり、必ずしも大腸菌等の原核生
物である微生物における発現に好適なものではない。
【０００５】また、遺伝子を発現させるには適当な発現
制御系に接続する必要があり、より好適な発現制御系に
接続することによって同じ遺伝子の発現効率を飛躍的に
高めることが出来ることが知られている。遺伝子をより
好適な発現制御系に接続するためには、遺伝子中に存在
する制限酵素部位等が適切に配置されていることが操作
上望ましく、特にコードする蛋白質のＮ末端付近の領域
に単一の制限酵素部位が存在することが望ましい。しか
しながら、ｃＤＮＡにおいては遺伝子中に存在する制限
酵素部位は全くランダムと言ってよく、操作上好適な配
置をとっている場合は極めて希である。
制御系に接続する必要があり、より好適な発現制御系に
接続することによって同じ遺伝子の発現効率を飛躍的に
高めることが出来ることが知られている。遺伝子をより
好適な発現制御系に接続するためには、遺伝子中に存在
する制限酵素部位等が適切に配置されていることが操作
上望ましく、特にコードする蛋白質のＮ末端付近の領域
に単一の制限酵素部位が存在することが望ましい。しか
しながら、ｃＤＮＡにおいては遺伝子中に存在する制限
酵素部位は全くランダムと言ってよく、操作上好適な配
置をとっている場合は極めて希である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】上述の如く、高等真核
生物由来の蛋白質を原核生物である微生物を培養するこ
とによって工業的に有利に生産するためには、目的遺伝
子をより好適な発現制御系に接続することとともに、遺
伝子本体もまた宿主たる原核生物である微生物において
より効率よく発現するＤＮＡ配列を持ったものであるこ
とが望まれる。また、より好適な発現系に接続するにあ
たっての便宜上、適当な制限酵素部位が、適切に配置さ
れていることが望まれる。本発明の目的は、ｃＤＮＡを
用いて高等真核生物由来の蛋白質を原核生物である微生
物に生産せしめる方法の不完全さを是正し、より効率的
な遺伝子発現、蛋白質生産を行なうための技術を提供す
ることにある。
生物由来の蛋白質を原核生物である微生物を培養するこ
とによって工業的に有利に生産するためには、目的遺伝
子をより好適な発現制御系に接続することとともに、遺
伝子本体もまた宿主たる原核生物である微生物において
より効率よく発現するＤＮＡ配列を持ったものであるこ
とが望まれる。また、より好適な発現系に接続するにあ
たっての便宜上、適当な制限酵素部位が、適切に配置さ
れていることが望まれる。本発明の目的は、ｃＤＮＡを
用いて高等真核生物由来の蛋白質を原核生物である微生
物に生産せしめる方法の不完全さを是正し、より効率的
な遺伝子発現、蛋白質生産を行なうための技術を提供す
ることにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、高等真核
生物であるヒト由来の蛋白質であるヒト血清アルブミン
を大腸菌等の原核生物である微生物においてより効率的
に生産するために、ヒト血清アルブミンのアミノ酸配列
をコードするＤＮＡ配列を、 ■アミノ酸配列を変化させない。 ■操作上有用と思われる制限酵素部位を残し、不用な制
限酵素部位を除く。 ■目的蛋白質のＮ末端をコードする領域に単一の有用な
制限酵素部位を設ける。 ■安定な２次構造を取らないようにする。 ■大腸菌で多用されている遺伝暗号（コドン）を用いる
。 について考慮しながら設計し、化学合成したＤＮＡのオ
リゴマーから実際にヒト血清アルブミンを大腸菌等の原
核生物である微生物において著量生産させ得る合成ＤＮ
Ａを構築するとともに、この合成ＤＮＡを含有するプラ
スミドで形質転換された微生物を培地中で培養すること
により目的のヒト血清アルブミンを生産することができ
、本発明を完成するに至った。
生物であるヒト由来の蛋白質であるヒト血清アルブミン
を大腸菌等の原核生物である微生物においてより効率的
に生産するために、ヒト血清アルブミンのアミノ酸配列
をコードするＤＮＡ配列を、 ■アミノ酸配列を変化させない。 ■操作上有用と思われる制限酵素部位を残し、不用な制
限酵素部位を除く。 ■目的蛋白質のＮ末端をコードする領域に単一の有用な
制限酵素部位を設ける。 ■安定な２次構造を取らないようにする。 ■大腸菌で多用されている遺伝暗号（コドン）を用いる
。 について考慮しながら設計し、化学合成したＤＮＡのオ
リゴマーから実際にヒト血清アルブミンを大腸菌等の原
核生物である微生物において著量生産させ得る合成ＤＮ
Ａを構築するとともに、この合成ＤＮＡを含有するプラ
スミドで形質転換された微生物を培地中で培養すること
により目的のヒト血清アルブミンを生産することができ
、本発明を完成するに至った。
【０００８】さて、ｃＤＮＡを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等の微生物で
ヒト血清アルブミンを生成する方法は、特開昭５８−５
６６８４、特開昭５８−１５０５１７、特開昭６１−２
７５２２９、特開昭６２−２１５３９３などに開示され
ている。しかしこれらは遺伝暗号（コドン）の選択の余
地の無いｃＤＮＡの持つ性格の故に、その発現効率、従
って生産量には自ずと限界があるものである。大腸菌等
においてのヒト血清アルブミン生産量の飛躍的な増加は
、本発明によって初めて可能となった。また、特開昭６
２−２９９８５には特定のアミノ酸配列から類推される
ＤＮＡ配列一般が開示されているが、本発明のアミノ酸
配列は特開昭６２−２９９８５に開示されているアミノ
酸配列とは多くの相違点がある。
ｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等の微生物で
ヒト血清アルブミンを生成する方法は、特開昭５８−５
６６８４、特開昭５８−１５０５１７、特開昭６１−２
７５２２９、特開昭６２−２１５３９３などに開示され
ている。しかしこれらは遺伝暗号（コドン）の選択の余
地の無いｃＤＮＡの持つ性格の故に、その発現効率、従
って生産量には自ずと限界があるものである。大腸菌等
においてのヒト血清アルブミン生産量の飛躍的な増加は
、本発明によって初めて可能となった。また、特開昭６
２−２９９８５には特定のアミノ酸配列から類推される
ＤＮＡ配列一般が開示されているが、本発明のアミノ酸
配列は特開昭６２−２９９８５に開示されているアミノ
酸配列とは多くの相違点がある。
【０００９】本発明者らは原核生物に適したコドンに注
目して、ヒト血清アルブミンをコードするＤＮＡをデザ
インして化学合成した。
目して、ヒト血清アルブミンをコードするＤＮＡをデザ
インして化学合成した。
【００１０】なお、オリゴヌクレオチドの合成にはトリ
エステル法（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１０，６５５
３（１９８２））や、ホスホアミダイト法（Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ２２，１８５９（１９
８１））等の方法がすでに開発されており、いずれの方
法を用いてもよい。
エステル法（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１０，６５５
３（１９８２））や、ホスホアミダイト法（Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ２２，１８５９（１９
８１））等の方法がすでに開発されており、いずれの方
法を用いてもよい。
【００１１】また、近年、合成に必要なヌクレオチドや
試薬のキット更には自動合成機器も市販されいるので、
当然これらを用いてもよい。
試薬のキット更には自動合成機器も市販されいるので、
当然これらを用いてもよい。
【００１２】次にこの合成ＤＮＡを宿主に導入し、増殖
、発現させるために適当なプラスミドに組み込む。
、発現させるために適当なプラスミドに組み込む。
【００１３】本発明において用いられるプラスミドは特
に限定されないが大腸菌を宿主とする場合は通常よく利
用されるｐＳＣ１０１，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１９，ｐ
ＵＣ１８，ｐＨＳＧ２９８，ｐＨＳＧ２９９，ｐＨＳＧ
３９８，ｐＨＳＧ３９９等を用いればよい。
に限定されないが大腸菌を宿主とする場合は通常よく利
用されるｐＳＣ１０１，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１９，ｐ
ＵＣ１８，ｐＨＳＧ２９８，ｐＨＳＧ２９９，ｐＨＳＧ
３９８，ｐＨＳＧ３９９等を用いればよい。
【００１４】また枯草菌を宿主とする場合には、ｐＵＢ
１１０，ｐＣ１９４，ｐＥ１９４等を用いればよい。
１１０，ｐＣ１９４，ｐＥ１９４等を用いればよい。
【００１５】バチルス・ブレビスを宿主とする場合は、
ｐＨＹ５００，ｐＮＵ２００（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，３５８９（１９８９）
）等を用いればよい。もちろん、繰り返し述べるが、本
発明は上記プラスミドベクターに限定されるものではな
い。
ｐＨＹ５００，ｐＮＵ２００（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，３５８９（１９８９）
）等を用いればよい。もちろん、繰り返し述べるが、本
発明は上記プラスミドベクターに限定されるものではな
い。
【００１６】次に、このようにして得た組み換えＤＮＡ
で宿主を形質転換するのである。形質転換法として■細
胞を塩化カルシウム、塩化ルビジウム、または燐酸カル
シウムで処理する方法（塩化カルシウム、塩化ルビジウ
ム、または燐酸カルシウム法）、■電気パルスによる方
法（エレクトロポーレーション法）、■プロトプラスト
を利用する方法（プロトプラスト法）等の方法があるが
、いずれの方法を用いてもよい。またその他の方法を用
いてもよい。最後にこの形質転換体を培地中で培養して
菌体内に生産もしくは培地中に分泌させ、それを精製す
るのであるが、このプロセスは通常用いられる以下の方
法に従えばよい。
で宿主を形質転換するのである。形質転換法として■細
胞を塩化カルシウム、塩化ルビジウム、または燐酸カル
シウムで処理する方法（塩化カルシウム、塩化ルビジウ
ム、または燐酸カルシウム法）、■電気パルスによる方
法（エレクトロポーレーション法）、■プロトプラスト
を利用する方法（プロトプラスト法）等の方法があるが
、いずれの方法を用いてもよい。またその他の方法を用
いてもよい。最後にこの形質転換体を培地中で培養して
菌体内に生産もしくは培地中に分泌させ、それを精製す
るのであるが、このプロセスは通常用いられる以下の方
法に従えばよい。
【００１７】培地は適当な炭素源、窒素源、無機塩類、
使用菌株が特に要求する物質を含んだものを用いればよ
い。培養時間は使用菌株によって多少異なり特に限定さ
れないが、通常５時間から１００時間程度でよい。
使用菌株が特に要求する物質を含んだものを用いればよ
い。培養時間は使用菌株によって多少異なり特に限定さ
れないが、通常５時間から１００時間程度でよい。
【００１８】生成物の取り上げ方法は、菌体内に顆粒状
に生産させた場合は、集菌後菌体をリゾチーム、超音波
等で処理して破砕し、低速遠心によって顆粒を沈澱、採
取し、尿素や塩酸グアニジン等で処理して可溶化する。 それを希釈や透析等によって巻き戻しを行い、通常よく
用いられるＨＰＬＣ法等によって精製すればよい。培地
に分泌生産した場合は、菌体を除去後、培地から通常よ
く用いられるＨＰＬＣ法等によって精製すればよい。
に生産させた場合は、集菌後菌体をリゾチーム、超音波
等で処理して破砕し、低速遠心によって顆粒を沈澱、採
取し、尿素や塩酸グアニジン等で処理して可溶化する。 それを希釈や透析等によって巻き戻しを行い、通常よく
用いられるＨＰＬＣ法等によって精製すればよい。培地
に分泌生産した場合は、菌体を除去後、培地から通常よ
く用いられるＨＰＬＣ法等によって精製すればよい。
【００１９】以下、本発明を実施例に従って具体的に説
明する。
明する。
【００２０】
【実施例１】
［全合成ヒト血清アルブミン遺伝子の構築］遺伝子の設
計 現在の合成ＤＮＡ技術と、本発明者らの採用している精
製法では安定して得られるＤＮＡ鎖は最大７０塩基程度
である。ヒト血清アルブミンは５８５アミノ酸であるの
で１７５５塩基の遺伝子が少なくとも必要であり、少な
くとも２５本程度に分割して合成する必要がある。また
２本鎖としてプラスミドに組み込む必要があるので、そ
の２倍のＤＮＡを合成する必要がある。またプラスミド
に組み込んだ時点で塩基配列の確認が必要なので確実に
塩基配列が確認できる長さに分けてプラスミドに組み込
む方が操作上都合がよい。従って全体を一度に組み立て
るのではなく、８つ程度の部分に分けてフラグメントの
集合を行い、そこで塩基配列の確認を行ってから全体を
構築することにした。
計 現在の合成ＤＮＡ技術と、本発明者らの採用している精
製法では安定して得られるＤＮＡ鎖は最大７０塩基程度
である。ヒト血清アルブミンは５８５アミノ酸であるの
で１７５５塩基の遺伝子が少なくとも必要であり、少な
くとも２５本程度に分割して合成する必要がある。また
２本鎖としてプラスミドに組み込む必要があるので、そ
の２倍のＤＮＡを合成する必要がある。またプラスミド
に組み込んだ時点で塩基配列の確認が必要なので確実に
塩基配列が確認できる長さに分けてプラスミドに組み込
む方が操作上都合がよい。従って全体を一度に組み立て
るのではなく、８つ程度の部分に分けてフラグメントの
集合を行い、そこで塩基配列の確認を行ってから全体を
構築することにした。
【００２１】以上の前提条件をもとに、■ヒト血清アル
ブミンのアミノ酸配列を変化させない。 ■集合させる時に用いる制限酵素の認識部位を必要なだ
け持たせる。
ブミンのアミノ酸配列を変化させない。 ■集合させる時に用いる制限酵素の認識部位を必要なだ
け持たせる。
【００２２】（不必要な認識部位を除く。）■Ｎ末端の
なるべく近くに遺伝子内で単一の制限酵素部位を１つ持
たせる。（様々な発現システムへ容易に遺伝子を接続す
ることを可能にする。） ■安定な２次構造を取らないようにする。 ■大腸菌で汎用されている遺伝子暗号をなるべく用いる
。 の順番に条件を考慮しながら遺伝子の設計を行った。ヒ
ト血清アルブミンのアミノ酸配列は複数の文献によって
開示されているが、それらは互いに少しずつの相違があ
る（ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ ５８，１３４，（
１９７５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ ９，６１０３，（１９８１）、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，７１，
（１９８２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１，６７
４７，（１９８６））。
なるべく近くに遺伝子内で単一の制限酵素部位を１つ持
たせる。（様々な発現システムへ容易に遺伝子を接続す
ることを可能にする。） ■安定な２次構造を取らないようにする。 ■大腸菌で汎用されている遺伝子暗号をなるべく用いる
。 の順番に条件を考慮しながら遺伝子の設計を行った。ヒ
ト血清アルブミンのアミノ酸配列は複数の文献によって
開示されているが、それらは互いに少しずつの相違があ
る（ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ ５８，１３４，（
１９７５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ ９，６１０３，（１９８１）、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，７１，
（１９８２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１，６７
４７，（１９８６））。
【００２３】本発明者らは、一般にＤＮＡの配列を求め
る方がアミノ酸の配列を求めるよりも信頼性が高いと考
えられること、報告されている年次が新しいことの２つ
の理由により、アミノ酸配列そのものを決定した文献で
はなく、ｍＲＮＡより作製したｃＤＮＡの塩基配列を決
定することによってアミノ酸配列を報告している比較的
新しい文献、即ち、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９、６１０３（１９８１）及びＰ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７
９、７１、（１９８２）を主に参考にした。
る方がアミノ酸の配列を求めるよりも信頼性が高いと考
えられること、報告されている年次が新しいことの２つ
の理由により、アミノ酸配列そのものを決定した文献で
はなく、ｍＲＮＡより作製したｃＤＮＡの塩基配列を決
定することによってアミノ酸配列を報告している比較的
新しい文献、即ち、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９、６１０３（１９８１）及びＰ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７
９、７１、（１９８２）を主に参考にした。
【００２４】しかし、上述の２つの文献に示されたｃＤ
ＮＡから類推されるアミノ酸配列にも２ケ所の相違点が
ある。すなわち１つは胎児の肝臓から取ったｍＲＮＡか
ら類推したもの（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ ９、６１０３（１９８１））、もう
１つは成人の肝臓から取ったｍＲＮＡから類推したもの
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
，７９、７１、（１９８２））である。
ＮＡから類推されるアミノ酸配列にも２ケ所の相違点が
ある。すなわち１つは胎児の肝臓から取ったｍＲＮＡか
ら類推したもの（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ ９、６１０３（１９８１））、もう
１つは成人の肝臓から取ったｍＲＮＡから類推したもの
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
，７９、７１、（１９８２））である。
【００２５】本発明者らは実用性を考えて成人の配列を
採用した。コンピュータを用いてアミノ酸配列から取り
得る制限酵素部位を検索し、それをもとにして大腸菌で
汎用されているコドンを選びながら制限酵素部位の取捨
選択を行い、ＤＮＡ配列の最初の候補を作成した。
採用した。コンピュータを用いてアミノ酸配列から取り
得る制限酵素部位を検索し、それをもとにして大腸菌で
汎用されているコドンを選びながら制限酵素部位の取捨
選択を行い、ＤＮＡ配列の最初の候補を作成した。
【００２６】その候補配列をコンピュータの高次構造検
索プログラムに入力し、著しい二次構造を検索し、取り
除いた。最終的に決定した遺伝子の塩基配列を図１に示
した。
索プログラムに入力し、著しい二次構造を検索し、取り
除いた。最終的に決定した遺伝子の塩基配列を図１に示
した。
【００２７】この設計した遺伝子でのコドンの使用割合
を以下に示した。
を以下に示した。
【００２８】
【表１】
【００２９】下線を施した部分は、大腸菌で大量に発現
するとされている遺伝子に広く用いられているコドン（
メジャーコドン）と、一種類しかない、メチオニン、ト
リプトファン、それにコドンユーセージに片寄りが見ら
れないシステインのコードである（参考文献：細胞工学
，２，１５４１（１９８３））。上記のようにほとんど
メジャーコドンを用いて遺伝子を設計することができた
。アミノ酸配列のもとにした文献のヒト血清アルブミン
をコードするエクソン部分のＤＮＡ配列について同じこ
とを行なうと以下のようになり、大腸菌におけるメジャ
ーコドンの使用頻度はむしろ低いことが判明した。
するとされている遺伝子に広く用いられているコドン（
メジャーコドン）と、一種類しかない、メチオニン、ト
リプトファン、それにコドンユーセージに片寄りが見ら
れないシステインのコードである（参考文献：細胞工学
，２，１５４１（１９８３））。上記のようにほとんど
メジャーコドンを用いて遺伝子を設計することができた
。アミノ酸配列のもとにした文献のヒト血清アルブミン
をコードするエクソン部分のＤＮＡ配列について同じこ
とを行なうと以下のようになり、大腸菌におけるメジャ
ーコドンの使用頻度はむしろ低いことが判明した。
【００３０】
【表２】
【００３１】さて、図１に示した配列において、最初に
あるＡＡＧＣＴＴのＨｉｎｄＩＩＩ部位は遺伝子構築の
便宜上、付加したものである。またＮ末端近くにユニー
クな制限酵素部位を導入する目的で、認識部位と切断部
位とが離れているＦｏｋＩを図２のように導入して切り
離すようにした。
あるＡＡＧＣＴＴのＨｉｎｄＩＩＩ部位は遺伝子構築の
便宜上、付加したものである。またＮ末端近くにユニー
クな制限酵素部位を導入する目的で、認識部位と切断部
位とが離れているＦｏｋＩを図２のように導入して切り
離すようにした。
【００３２】ＦｏｋＩは認識部位の９塩基／１３塩基（
上側鎖／下側鎖）３’側を切断するので、認識部位を図
２のようにアミノ酸配列の５’に隣接して置くことによ
り血清アルブミン遺伝子のＮ末端近くで切断できるよう
になる。ただしこのためには、遺伝子中のＦｏｋＩ認識
配列を全て除いておく必要がある。
上側鎖／下側鎖）３’側を切断するので、認識部位を図
２のようにアミノ酸配列の５’に隣接して置くことによ
り血清アルブミン遺伝子のＮ末端近くで切断できるよう
になる。ただしこのためには、遺伝子中のＦｏｋＩ認識
配列を全て除いておく必要がある。
【００３３】遺伝子全体の構築に用いる制限酵素はＨｉ
ｎｄＩＩＩ，ＫｐｎＩ，ＳａｌＩ，ＰｓｔＩ，ＸｂａＩ
，ＳｐｈＩ，ＢａｍＨＩとした。これらの酵素での切断
点地図を図３に示した。
ｎｄＩＩＩ，ＫｐｎＩ，ＳａｌＩ，ＰｓｔＩ，ＸｂａＩ
，ＳｐｈＩ，ＢａｍＨＩとした。これらの酵素での切断
点地図を図３に示した。
【００３４】ＤＮＡの化学合成
設計したＤＮＡ配列（図１）を図４のようにフラグメン
トに分割し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
社のＤＮＡ合成機を用いて各々のフラグメントの両鎖を
ホスホアミダイト法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ ２２，１８５９ （１９８１））によ
りそれぞれ合成した。
トに分割し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
社のＤＮＡ合成機を用いて各々のフラグメントの両鎖を
ホスホアミダイト法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ ２２，１８５９ （１９８１））によ
りそれぞれ合成した。
【００３５】遺伝子の構築
合成したＤＮＡの２６０ｎｍの吸光度を測定して濃度を
決定した後に、１回の操作で約１００ピコモルを用いた
。図３，４に示した制限酵素で８つのブロックにわけ、
各ブロックを構成する各断片の両鎖をアニールし、Ｔ４
リガーゼでライゲーションして各ブロックに相当する断
片を生成させ、それらをｐＵＣ１８もしくはｐＵＣ１９
にクローン化した。クローン化した各ブロックのＤＮＡ
配列をジデオキシ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２０
５（１９８１））によって少なくとも２回にわたって確
認した後、各ブロックの断片を調製した。次に各断片約
１μｇとｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９約１μｇを用いて
ライゲーションを行い、ブロック１，２，３とブロック
４，５と、ブロック６，７，８とをそれぞれ連結した中
間的ブロックをｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９にクローン
化した。最後に３つの中間的ブロック約１μｇとｐＵＣ
１９約１μｇを用いてライゲーションを行い、全ブロッ
クを連結した目的の遺伝子を含むプラスミドｐＨＳＡを
構築した（図３）。
決定した後に、１回の操作で約１００ピコモルを用いた
。図３，４に示した制限酵素で８つのブロックにわけ、
各ブロックを構成する各断片の両鎖をアニールし、Ｔ４
リガーゼでライゲーションして各ブロックに相当する断
片を生成させ、それらをｐＵＣ１８もしくはｐＵＣ１９
にクローン化した。クローン化した各ブロックのＤＮＡ
配列をジデオキシ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２０
５（１９８１））によって少なくとも２回にわたって確
認した後、各ブロックの断片を調製した。次に各断片約
１μｇとｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９約１μｇを用いて
ライゲーションを行い、ブロック１，２，３とブロック
４，５と、ブロック６，７，８とをそれぞれ連結した中
間的ブロックをｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９にクローン
化した。最後に３つの中間的ブロック約１μｇとｐＵＣ
１９約１μｇを用いてライゲーションを行い、全ブロッ
クを連結した目的の遺伝子を含むプラスミドｐＨＳＡを
構築した（図３）。
【００３６】
【実施例２】
［全合成ヒト血清アルブミン遺伝子の大腸菌での発現］
前出の方法と合成機を用いて図５に示すような合成ＤＮ
Ａを作成した。なお、同図中、ＳＤはリボソーム結合部
位を表す。次にこの合成ＤＮＡと先ほど作成したプラス
ミドｐＨＳＡ及びプラスミドｐＴ１３ｓ（Ｎｃｏ）（Ｊ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０４，３０（１９８８））とか
ら図６に示すように発現プラスミドｐＳＤＨＳＡ４を作
成した。なお、プラスミドｐＴ１３ｓ（Ｎｃｏ）は、工
業技術院微生物工業研究所に寄託されている保持菌株Ａ
Ｊ１２４４７（ＦＥＲＭ Ｐ−１０７５７）から調製
した。
前出の方法と合成機を用いて図５に示すような合成ＤＮ
Ａを作成した。なお、同図中、ＳＤはリボソーム結合部
位を表す。次にこの合成ＤＮＡと先ほど作成したプラス
ミドｐＨＳＡ及びプラスミドｐＴ１３ｓ（Ｎｃｏ）（Ｊ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０４，３０（１９８８））とか
ら図６に示すように発現プラスミドｐＳＤＨＳＡ４を作
成した。なお、プラスミドｐＴ１３ｓ（Ｎｃｏ）は、工
業技術院微生物工業研究所に寄託されている保持菌株Ａ
Ｊ１２４４７（ＦＥＲＭ Ｐ−１０７５７）から調製
した。
【００３７】この発現プラスミドｐＳＤＨＳＡ４の調製
の詳細は以下の通りである。即ち、ｐＨＳＡをＦｏｋＩ
とＢａｍＨＩで切断し、最も大きな断片（合成ヒト血清
アルブミン遺伝子の大部分を含む約１．８ｋｂ断片）を
調製する。一方、ｐＴ１３ｓ（Ｎｃｏ）をＣｌａＩとＢ
ａｍＨＩで切断し、大きい方の断片（ｔｒｐプロモータ
ー、ターミネーター、アンピシリン耐性遺伝子を含む約
２．６ｋｂ断片）を調製する。この両者と図５に示した
合成ＤＮＡとをＴ４リガーゼでライゲーションしてｐＳ
ＤＨＳＡ４を構築した。
の詳細は以下の通りである。即ち、ｐＨＳＡをＦｏｋＩ
とＢａｍＨＩで切断し、最も大きな断片（合成ヒト血清
アルブミン遺伝子の大部分を含む約１．８ｋｂ断片）を
調製する。一方、ｐＴ１３ｓ（Ｎｃｏ）をＣｌａＩとＢ
ａｍＨＩで切断し、大きい方の断片（ｔｒｐプロモータ
ー、ターミネーター、アンピシリン耐性遺伝子を含む約
２．６ｋｂ断片）を調製する。この両者と図５に示した
合成ＤＮＡとをＴ４リガーゼでライゲーションしてｐＳ
ＤＨＳＡ４を構築した。
【００３８】このようにして得られたプラスミドｐＳＤ
ＨＳＡ４は、ｔｒｐプロモーター−オペレーターの制御
下、Ｍｅｔ残基に成熟型ＨＳＡが直接連結した蛋白を発
現するように設計されており、転写ターミネーターとし
てｔｒｐＡターミネーターを備えている。
ＨＳＡ４は、ｔｒｐプロモーター−オペレーターの制御
下、Ｍｅｔ残基に成熟型ＨＳＡが直接連結した蛋白を発
現するように設計されており、転写ターミネーターとし
てｔｒｐＡターミネーターを備えている。
【００３９】次にこの発現プラスミドｐＳＤＨＳＡ４で
通常よく用いられる塩化ルビジウム法を用いて大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株を形質転換し、形質転換株ＨＢ１０１／ｐＳ
ＤＨＳＡ４を得た。この株をグルコース、酵母エキス、
ＫＨ２ＰＯ４，ＮＨ４Ｃｌ，ＭｇＳＯ４，ＣａＣｌ２，
ビタミンＢ１を含む培地で培養した。培養開始後４時間
でインドールアクリル酸による誘導をかけ、誘導後約１
５時間培養したところ、菌体内に顆粒が生成していた。
通常よく用いられる塩化ルビジウム法を用いて大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株を形質転換し、形質転換株ＨＢ１０１／ｐＳ
ＤＨＳＡ４を得た。この株をグルコース、酵母エキス、
ＫＨ２ＰＯ４，ＮＨ４Ｃｌ，ＭｇＳＯ４，ＣａＣｌ２，
ビタミンＢ１を含む培地で培養した。培養開始後４時間
でインドールアクリル酸による誘導をかけ、誘導後約１
５時間培養したところ、菌体内に顆粒が生成していた。
【００４０】集菌後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
３０ｍＭ ＮａＣｌ ０．５Ｍ ＥＤＴＡバッ
フアーに懸濁し、０．２５ｍｇ／ｍｌリゾチームで０℃
１時間処理後、超音波破砕した。顆粒を低速遠沈後、２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ３０ｍＭＮａＣｌ
０．５Ｍ ＥＤＴＡバッフアーにて洗浄、再び遠沈し
、１０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に懸濁し、顆粒画分とした
。
３０ｍＭ ＮａＣｌ ０．５Ｍ ＥＤＴＡバッ
フアーに懸濁し、０．２５ｍｇ／ｍｌリゾチームで０℃
１時間処理後、超音波破砕した。顆粒を低速遠沈後、２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ３０ｍＭＮａＣｌ
０．５Ｍ ＥＤＴＡバッフアーにて洗浄、再び遠沈し
、１０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に懸濁し、顆粒画分とした
。
【００４１】図７（Ａ）はＨＢ１０１，ＨＢ１０１／ｐ
ＳＤＨＳＡ４の全菌体蛋白及び顆粒画分をＳＤＳポリア
クリルアミド電気泳動した図である。図中の１，２，３
，Ｍの略号は以下の通りである。
ＳＤＨＳＡ４の全菌体蛋白及び顆粒画分をＳＤＳポリア
クリルアミド電気泳動した図である。図中の１，２，３
，Ｍの略号は以下の通りである。
【００４２】１．ＨＢ１０１全菌体蛋白２．ＨＢ１０１
／ｐＳＤＨＳＡＥ１２全菌体蛋白３．ＨＢ１０１／ｐＳ
ＤＨＳＡＥ１２顆粒画分Ｍ．分子量マーカー ＨＢ１０１／ｐＳＤＨＳＡ４の菌体蛋白には、宿主のＨ
Ｂ１０１には見られない分子量約６７Ｋのバンドが認め
られ、それは、顆粒画分に回収されている。ヒト血清ア
ルブミンの分子量は約６７Ｋであり、予定された分子量
の蛋白が顆粒として生成していることがわかった。
／ｐＳＤＨＳＡＥ１２全菌体蛋白３．ＨＢ１０１／ｐＳ
ＤＨＳＡＥ１２顆粒画分Ｍ．分子量マーカー ＨＢ１０１／ｐＳＤＨＳＡ４の菌体蛋白には、宿主のＨ
Ｂ１０１には見られない分子量約６７Ｋのバンドが認め
られ、それは、顆粒画分に回収されている。ヒト血清ア
ルブミンの分子量は約６７Ｋであり、予定された分子量
の蛋白が顆粒として生成していることがわかった。
【００４３】図７（Ａ）と同様の電気泳動後（蛋白量は
１／３０）、抗ＨＳＡ抗体でウェスタンブロッテイング
を行なうと図７（Ｂ）のようなパターンになり、顆粒状
生成した蛋白は抗ヒト血清アルブミン抗体と反応するこ
とが示された。
１／３０）、抗ＨＳＡ抗体でウェスタンブロッテイング
を行なうと図７（Ｂ）のようなパターンになり、顆粒状
生成した蛋白は抗ヒト血清アルブミン抗体と反応するこ
とが示された。
【００４４】顆粒を６Ｍ塩酸グアニジンで可溶化し、ジ
チオスレイトールを加えて（ｆｉｎａｌ ０．１Ｍ）
１００℃２分処理後、逆相ＨＰＬＣで顆粒蛋白を精製し
た。これをアミノ酸シークエンサーにかけ、Ｎ末端付近
のアミノ酸配列を調べたところ、図８のように、調べた
１６アミノ酸残基の全てが一致した。なお、同図中、Ｏ
ｂｓｅｒｖｅｄは実際に観察された配列を、Ｐｒｅｄｉ
ｃｔｅｄは予定した配列をそれぞれ示す。
チオスレイトールを加えて（ｆｉｎａｌ ０．１Ｍ）
１００℃２分処理後、逆相ＨＰＬＣで顆粒蛋白を精製し
た。これをアミノ酸シークエンサーにかけ、Ｎ末端付近
のアミノ酸配列を調べたところ、図８のように、調べた
１６アミノ酸残基の全てが一致した。なお、同図中、Ｏ
ｂｓｅｒｖｅｄは実際に観察された配列を、Ｐｒｅｄｉ
ｃｔｅｄは予定した配列をそれぞれ示す。
【００４５】以上のことから、大腸菌においてＮ末端に
Ｍｅｔ残基の付加した形でヒト血清アルブミンを顆粒状
に生成することができたことが示唆された。
Ｍｅｔ残基の付加した形でヒト血清アルブミンを顆粒状
に生成することができたことが示唆された。
【００４６】形質転換株ＨＢ１０１／ｐＳＤＨＳＡ４（
ＡＪ１２４９８）は、工業技術院微生物工業研究所に寄
託されている（ＦＥＲＭ Ｐ−１１２０８）。
ＡＪ１２４９８）は、工業技術院微生物工業研究所に寄
託されている（ＦＥＲＭ Ｐ−１１２０８）。
【００４７】顆粒を６Ｍグアニジンで可溶化後、１Ｍジ
チオスレイトールを１／１０量加えて１００℃２分で還
元を行い、逆相ＨＰＬＣによって定量したところ本培養
によるヒト血清アルブミンの生成量は１５〜２０ｍｇ／
Ｌ／Ｏ．Ｄであった。特開昭６１−２７５２２９には、
大腸菌における最高生成量５〜１０ｍｇ／Ｌ／Ｏ．Ｄが
記載されている。本発明による生成量は、この最高生成
量を２倍以上上回るものである。
チオスレイトールを１／１０量加えて１００℃２分で還
元を行い、逆相ＨＰＬＣによって定量したところ本培養
によるヒト血清アルブミンの生成量は１５〜２０ｍｇ／
Ｌ／Ｏ．Ｄであった。特開昭６１−２７５２２９には、
大腸菌における最高生成量５〜１０ｍｇ／Ｌ／Ｏ．Ｄが
記載されている。本発明による生成量は、この最高生成
量を２倍以上上回るものである。
【００４８】
【実施例３】
［ヒト血清アルブミンの枯草菌における分泌生産］本発
明者らは、まず枯草菌のベクターとして多用されるｐＵ
Ｂ１１０（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３４，３１８（
１９７８））と大腸菌のベクターｐＢＲ３２７（Ｇｅｎ
ｅ ９，２８７（１９８０））とをＥｃｏＲＩ部位で
連結し、大腸菌と枯草菌の両方で複製可能なシャトルベ
クターｐＢＵ４３７１を構築した。ｐＢＵ４３７１は、
大腸菌ではアンピシリン耐性、枯草菌ではカナマイシン
耐性を賦与する（図９）。
明者らは、まず枯草菌のベクターとして多用されるｐＵ
Ｂ１１０（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３４，３１８（
１９７８））と大腸菌のベクターｐＢＲ３２７（Ｇｅｎ
ｅ ９，２８７（１９８０））とをＥｃｏＲＩ部位で
連結し、大腸菌と枯草菌の両方で複製可能なシャトルベ
クターｐＢＵ４３７１を構築した。ｐＢＵ４３７１は、
大腸菌ではアンピシリン耐性、枯草菌ではカナマイシン
耐性を賦与する（図９）。
【００４９】枯草菌のα−アミラーゼ遺伝子ａｍｙＥの
うち、α−アミラーゼの発現と分泌に必要な部分は、約
０．４ｋｂの領域に存在しており、大腸菌β−ｌａｃｔ
ａｍａｓｅを枯草菌で分泌するプラスミドｐＴＵＢ２５
６（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ
ｍｕｎ．１３４，６２４，（１９８６））では、この領
域が０．４ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ断片として得られる
。
うち、α−アミラーゼの発現と分泌に必要な部分は、約
０．４ｋｂの領域に存在しており、大腸菌β−ｌａｃｔ
ａｍａｓｅを枯草菌で分泌するプラスミドｐＴＵＢ２５
６（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ
ｍｕｎ．１３４，６２４，（１９８６））では、この領
域が０．４ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ断片として得られる
。
【００５０】図１０は、α−アミラーゼの分泌に必須で
あり分泌時には切り離されるシグナルペプチドの切断点
（Ａｌａ３３）付近のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を示
している。任意のタンパク質の遺伝子を介在配列なしに
シグナルペプチド切断点の直後に連結するためには、切
断点の直前と目的遺伝子のＮ末端の直後に、アミノ酸配
列を変えることなくユニークな制限酵素部位を配置し、
その間を切断点とＮ末端を丁度つなげるようなアミノ酸
配列をコードする合成ＤＮＡで連結するとよい。切断点
付近のアミノ酸配列から考えられるＤＮＡ配列をもとに
可能な制限酵素部位を検索したところ、ＨａｐＩＩ部位
の直後、Ａｌａ３０をコードする配列をＧＣＴからＧＣ
Ｃに置換することによって唯一のＮｏｔＩ部位が導入で
きることが判った。
あり分泌時には切り離されるシグナルペプチドの切断点
（Ａｌａ３３）付近のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を示
している。任意のタンパク質の遺伝子を介在配列なしに
シグナルペプチド切断点の直後に連結するためには、切
断点の直前と目的遺伝子のＮ末端の直後に、アミノ酸配
列を変えることなくユニークな制限酵素部位を配置し、
その間を切断点とＮ末端を丁度つなげるようなアミノ酸
配列をコードする合成ＤＮＡで連結するとよい。切断点
付近のアミノ酸配列から考えられるＤＮＡ配列をもとに
可能な制限酵素部位を検索したところ、ＨａｐＩＩ部位
の直後、Ａｌａ３０をコードする配列をＧＣＴからＧＣ
Ｃに置換することによって唯一のＮｏｔＩ部位が導入で
きることが判った。
【００５１】そこで、図１１のような合成ＤＮＡをＡｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＤＮＡ合成
機を用いて作製し、次に図１２のようにして汎用分泌ベ
クターｐＡＳＥＣｌを構築した。ｐＡＳＥＣｌは、これ
をＮｏｔＩとＳｍａＩで切断し、任意の目的遺伝子の３
’末端を平滑化してＮ末端付近の適当な制限酵素Ｅで切
断しておき、両者を５’末端がＮｏｔＩ ｃｏｈｅｓ
ｉｖｅで３’末端が制限酵素Ｅに合うような合成ＤＮＡ
で連結することによって、ａｍｙＥのシグナルペプチド
切断点と任意の目的蛋白とが直接連結した遺伝子を構築
することができるようになっている。
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＤＮＡ合成
機を用いて作製し、次に図１２のようにして汎用分泌ベ
クターｐＡＳＥＣｌを構築した。ｐＡＳＥＣｌは、これ
をＮｏｔＩとＳｍａＩで切断し、任意の目的遺伝子の３
’末端を平滑化してＮ末端付近の適当な制限酵素Ｅで切
断しておき、両者を５’末端がＮｏｔＩ ｃｏｈｅｓ
ｉｖｅで３’末端が制限酵素Ｅに合うような合成ＤＮＡ
で連結することによって、ａｍｙＥのシグナルペプチド
切断点と任意の目的蛋白とが直接連結した遺伝子を構築
することができるようになっている。
【００５２】ＨＳＡ分泌プラスミドの構築まず図１３に
示すような２本の合成ＤＮＡを作製した。 この２つの合成ＤＮＡと実施例１で構築した全合成ヒト
血清アルブミン遺伝子を含むプラスミドｐＨＳＡ（図３
参照）及びプラスミドｐＵＣ１９とから、プラスミドｐ
ＵＣ３３ＨＳＡを構築した（図１３）。
示すような２本の合成ＤＮＡを作製した。 この２つの合成ＤＮＡと実施例１で構築した全合成ヒト
血清アルブミン遺伝子を含むプラスミドｐＨＳＡ（図３
参照）及びプラスミドｐＵＣ１９とから、プラスミドｐ
ＵＣ３３ＨＳＡを構築した（図１３）。
【００５３】このプラスミドｐＵＣ３３ＨＳＡの構築の
詳細を以下に示す。
詳細を以下に示す。
【００５４】即ち、ｐＨＳＡをＦｏｋＩとＢａｍＨＩで
切断し、最も大きな断片（合成ヒト血清アルブミン遺伝
子の大部分を含む１．８ｋｂ断片）を調製する。一方、
ｐＵＣ１９をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断してお
く。これらと図１３中に示した２本の合成ＤＮＡとをＴ
４リガーゼで連結し、目的のプラスミドｐＵＣ３３ＨＳ
Ａを構築した。
切断し、最も大きな断片（合成ヒト血清アルブミン遺伝
子の大部分を含む１．８ｋｂ断片）を調製する。一方、
ｐＵＣ１９をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断してお
く。これらと図１３中に示した２本の合成ＤＮＡとをＴ
４リガーゼで連結し、目的のプラスミドｐＵＣ３３ＨＳ
Ａを構築した。
【００５５】さて次にプラスミドｐＵＣ３３ＨＳＡを制
限酵素ＢａｍＨＩで処理した後にクレノウ処理し、次い
でＮｏｔＩで処理することによって得られた１．８ｋｂ
の断片と、プラスミドｐＡＳＥＣｌをＮｏｔＩ，Ｓｍａ
Ｉで処理して得た７．５ｋｂの断片とをＴ４リガーゼを
用いて結合させた。このようにして得られたプラスミド
がヒト血清アルブミン分泌プラスミドｐＡＭＹ３３ＨＳ
Ａ４である（図１４）。
限酵素ＢａｍＨＩで処理した後にクレノウ処理し、次い
でＮｏｔＩで処理することによって得られた１．８ｋｂ
の断片と、プラスミドｐＡＳＥＣｌをＮｏｔＩ，Ｓｍａ
Ｉで処理して得た７．５ｋｂの断片とをＴ４リガーゼを
用いて結合させた。このようにして得られたプラスミド
がヒト血清アルブミン分泌プラスミドｐＡＭＹ３３ＨＳ
Ａ４である（図１４）。
【００５６】枯草菌によるヒト血清アルブミンの分泌当
業者ならば容易に入手し得る枯草菌１Ａ５１０株（Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６５，９３４（１９８３））を
上述のプラスミドｐＡＭＹ３３ＨＳＡ４でプロトプラス
ト法により形質転換し、形質転換株１Ａ５１０／ｐＡＭ
Ｙ３３ＨＳＡ４を得た。
業者ならば容易に入手し得る枯草菌１Ａ５１０株（Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６５，９３４（１９８３））を
上述のプラスミドｐＡＭＹ３３ＨＳＡ４でプロトプラス
ト法により形質転換し、形質転換株１Ａ５１０／ｐＡＭ
Ｙ３３ＨＳＡ４を得た。
【００５７】このようにして得た形質転換株１Ａ５１０
／ｐＡＭＹ３３ＨＳＡ４とコントロールとしてプラスミ
ドｐＢＵ４３７１を有する形質転換株１Ａ５１０／ｐＢ
Ｕ４３７１との両方をトリプトン、酵母エキス、ＮａＣ
ｌ、カゼインを含む培地で３７℃で振盪培養した。１４
，１６，１８時間で培養液をサンプリングし、培養上清
を１μｌずつ１回及び５回ナイロンメンブランにスポッ
トして抗ヒト血清アルブミン抗体を用いてドットイムノ
ブロッテイングを行なったところ、図１５に示すように
、ヒト血清アルブミンが培地に分泌生成していたことが
確認された。なお、同図中においてＳｔａｎｄａｒｄｓ
は、ＳＩＧＭＡのＥｓｓｅｎｔｉａｌｇｌｏｂｌｉｎ
ｆｒｅｅ ＨＵＭＡＮ Ａｌｂｕｍｉｎを用いた
。Ｂｒｏｔｈの位置には、培地をスポットした。図中の
１，２，４，５の位置には１Ａ５１０／ｐＡＭＹ３３Ｈ
ＳＡ４を、３，６の位置には１Ａ５１０／ｐＢＵ４３７
１をそれぞれスポットした。
／ｐＡＭＹ３３ＨＳＡ４とコントロールとしてプラスミ
ドｐＢＵ４３７１を有する形質転換株１Ａ５１０／ｐＢ
Ｕ４３７１との両方をトリプトン、酵母エキス、ＮａＣ
ｌ、カゼインを含む培地で３７℃で振盪培養した。１４
，１６，１８時間で培養液をサンプリングし、培養上清
を１μｌずつ１回及び５回ナイロンメンブランにスポッ
トして抗ヒト血清アルブミン抗体を用いてドットイムノ
ブロッテイングを行なったところ、図１５に示すように
、ヒト血清アルブミンが培地に分泌生成していたことが
確認された。なお、同図中においてＳｔａｎｄａｒｄｓ
は、ＳＩＧＭＡのＥｓｓｅｎｔｉａｌｇｌｏｂｌｉｎ
ｆｒｅｅ ＨＵＭＡＮ Ａｌｂｕｍｉｎを用いた
。Ｂｒｏｔｈの位置には、培地をスポットした。図中の
１，２，４，５の位置には１Ａ５１０／ｐＡＭＹ３３Ｈ
ＳＡ４を、３，６の位置には１Ａ５１０／ｐＢＵ４３７
１をそれぞれスポットした。
【００５８】形質転換株１Ａ５１０／ｐＡＭＹ３３ＨＳ
Ａ４（ＡＪ１２４９３）と１Ａ５１０／ｐＢＵ４３７１
（ＡＪ１２４９２）は、工業技術院微生物工業研究所に
寄託されている。その寄託番号は、１Ａ５１０／ｐＡＭ
Ｙ３３ＨＳＡ４がＦＥＲＭＰ−１１２０７で、１Ａ５１
０／ｐＢＵ４３７１がＦＥＲＭ Ｐ−１１２０６であ
る。
Ａ４（ＡＪ１２４９３）と１Ａ５１０／ｐＢＵ４３７１
（ＡＪ１２４９２）は、工業技術院微生物工業研究所に
寄託されている。その寄託番号は、１Ａ５１０／ｐＡＭ
Ｙ３３ＨＳＡ４がＦＥＲＭＰ−１１２０７で、１Ａ５１
０／ｐＢＵ４３７１がＦＥＲＭ Ｐ−１１２０６であ
る。
【００５９】
【実施例４】
［全合成ヒト血清アルブミン遺伝子の構築］遺伝子の設
計 実施例１と同様の順番に条件を考慮しながら遺伝子の設
計を行った。ヒト血清アルブミンのアミノ酸配列は複数
の文献によって開示されているが、それらは互いに少し
ずつの相違がある（ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ ５
８，１３４，（１９７５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９，６１０３，（１９８
１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
，７９，７１，（１９８２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６１，６７４７，（１９８６））。
計 実施例１と同様の順番に条件を考慮しながら遺伝子の設
計を行った。ヒト血清アルブミンのアミノ酸配列は複数
の文献によって開示されているが、それらは互いに少し
ずつの相違がある（ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ ５
８，１３４，（１９７５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９，６１０３，（１９８
１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
，７９，７１，（１９８２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６１，６７４７，（１９８６））。
【００６０】本発明者らは、一般にＤＮＡの配列を求め
る方がアミノ酸の配列を求めるよりも信頼性が高いと考
えられること、ｍＲＮＡから逆転写によって作成される
ｃＤＮＡでは、逆転写の際に塩基の間違いが生じ易いこ
と、報告された年次が新しいことの３つの理由により、
ヒト染色体上のアルブミン遺伝子のＤＮＡ塩基配列とア
ミノ酸配列を決定した文献に報告されているアミノ酸配
列が最も信頼性が高いと判断し、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６１，６７４７，（１９８６）に報告されたアミ
ノ酸配列を採用した。
る方がアミノ酸の配列を求めるよりも信頼性が高いと考
えられること、ｍＲＮＡから逆転写によって作成される
ｃＤＮＡでは、逆転写の際に塩基の間違いが生じ易いこ
と、報告された年次が新しいことの３つの理由により、
ヒト染色体上のアルブミン遺伝子のＤＮＡ塩基配列とア
ミノ酸配列を決定した文献に報告されているアミノ酸配
列が最も信頼性が高いと判断し、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６１，６７４７，（１９８６）に報告されたアミ
ノ酸配列を採用した。
【００６１】コンピュータを用いてアミノ酸配列から取
り得る制限酵素部位を検索し、それをもとにして大腸菌
で汎用されているコドンを選びながら制限酵素部位の取
捨選択を行い、ＤＮＡ配列の最初の候補を作成した。
り得る制限酵素部位を検索し、それをもとにして大腸菌
で汎用されているコドンを選びながら制限酵素部位の取
捨選択を行い、ＤＮＡ配列の最初の候補を作成した。
【００６２】その候補配列をコンピュータの高次構造検
索プログラムに入力し、著しい二次構造を検索し、取り
除いた。最終的に決定した遺伝子の塩基配列を図１６に
示した。
索プログラムに入力し、著しい二次構造を検索し、取り
除いた。最終的に決定した遺伝子の塩基配列を図１６に
示した。
【００６３】この設計した遺伝子でのコドンの使用割合
を以下に示した。
を以下に示した。
【００６４】
【表３】
【００６５】下線を施した部分は、大腸菌で大量に発現
するとされている遺伝子に広く用いられているコドン（
メジャーコドン）と、一種類しかない、メチオニン、ト
リプトファン、それにコドンユーセージに片寄りが見ら
れないシステインのコードである（参考文献：細胞工学
，２，１５４１（１９８３））。上記のようにほとんど
メジャーコドンを用いて遺伝子を設計することができた
。アミノ酸配列のもとにした文献のヒト血清アルブミン
をコードするエクソン部分のＤＮＡ配列について同じこ
とを行なうと以下のようになり、大腸菌におけるメジャ
ーコドンの使用頻度はむしろ低いことが判明した。
するとされている遺伝子に広く用いられているコドン（
メジャーコドン）と、一種類しかない、メチオニン、ト
リプトファン、それにコドンユーセージに片寄りが見ら
れないシステインのコードである（参考文献：細胞工学
，２，１５４１（１９８３））。上記のようにほとんど
メジャーコドンを用いて遺伝子を設計することができた
。アミノ酸配列のもとにした文献のヒト血清アルブミン
をコードするエクソン部分のＤＮＡ配列について同じこ
とを行なうと以下のようになり、大腸菌におけるメジャ
ーコドンの使用頻度はむしろ低いことが判明した。
【００６６】
【表４】
【００６７】さて、図１６に示した配列において、最初
にあるＡＡＧＣＴＴのＨｉｎｄＩＩＩ部位は遺伝子構築
の便宜上、付加したものである。またＮ末端近くにユニ
ークな制限酵素部位を導入する目的で、認識部位と切断
部位とが離れているＦｏｋＩを図２のように導入して切
り離すようにした。
にあるＡＡＧＣＴＴのＨｉｎｄＩＩＩ部位は遺伝子構築
の便宜上、付加したものである。またＮ末端近くにユニ
ークな制限酵素部位を導入する目的で、認識部位と切断
部位とが離れているＦｏｋＩを図２のように導入して切
り離すようにした。
【００６８】ＦｏｋＩは認識部位の９塩基／１３塩基（
上側鎖／下側鎖）３’側を切断するので、認識部位を図
２のようにアミノ酸配列の５’に隣接して置くことによ
り血清アルブミン遺伝子のＮ末端近くで切断できるよう
になる。ただしこのためには、遺伝子中のＦｏｋＩ認識
配列を全て除いておく必要がある。
上側鎖／下側鎖）３’側を切断するので、認識部位を図
２のようにアミノ酸配列の５’に隣接して置くことによ
り血清アルブミン遺伝子のＮ末端近くで切断できるよう
になる。ただしこのためには、遺伝子中のＦｏｋＩ認識
配列を全て除いておく必要がある。
【００６９】遺伝子全体の構築に用いる制限酵素はＨｉ
ｎｄＩＩＩ，ＫｐｎＩ，ＳａｌＩ，ＰｓｔＩ，ＸｂａＩ
，ＳｐｈＩ，ＢａｍＨＩとした。これらの酵素での切断
点地図を図１７に示した。
ｎｄＩＩＩ，ＫｐｎＩ，ＳａｌＩ，ＰｓｔＩ，ＸｂａＩ
，ＳｐｈＩ，ＢａｍＨＩとした。これらの酵素での切断
点地図を図１７に示した。
【００７０】ＤＮＡの化学合成
設計したＤＮＡ配列（図１６）を図１８のようにフラグ
メントに分割し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ社のＤＮＡ合成機を用いて各々のフラグメントの両
鎖をホスホアミダイト法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２，１８５９ （１９８１））
によりそれぞれ合成した。
メントに分割し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ社のＤＮＡ合成機を用いて各々のフラグメントの両
鎖をホスホアミダイト法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２，１８５９ （１９８１））
によりそれぞれ合成した。
【００７１】遺伝子の構築
合成したＤＮＡの２６０ｎｍの吸光度を測定して濃度を
決定した後に、１回の操作で約１００ピコモルを用いた
。図１７，１８に示した制限酵素で８つのブロックにわ
け、各ブロックを構成する各断片の両鎖をアニールし、
Ｔ４リガーゼでライゲーションして各ブロックに相当す
る断片を生成させ、それらをｐＵＣ１８もしくはｐＵＣ
１９にクローン化した。クローン化した各ブロックのＤ
ＮＡ配列をジデオキシ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１
２０５（１９８１））によって少なくとも２回にわたっ
て確認した後、各ブロックの断片を調製した。次に各断
片約１μｇとｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９約１μｇを用
いてライゲーションを行い、ブロック１，２，３とブロ
ック４，５と、ブロック６，７，８とをそれぞれ連結し
た中間的ブロックをｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９にクロ
ーン化した。最後に３つの中間的ブロック約１μｇとｐ
ＵＣ１９約１μｇを用いてライゲーションを行い、全ブ
ロックを連結した目的の遺伝子を含むプラスミドｐＨＳ
ＡＥ２を構築した（図１７）。
決定した後に、１回の操作で約１００ピコモルを用いた
。図１７，１８に示した制限酵素で８つのブロックにわ
け、各ブロックを構成する各断片の両鎖をアニールし、
Ｔ４リガーゼでライゲーションして各ブロックに相当す
る断片を生成させ、それらをｐＵＣ１８もしくはｐＵＣ
１９にクローン化した。クローン化した各ブロックのＤ
ＮＡ配列をジデオキシ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１
２０５（１９８１））によって少なくとも２回にわたっ
て確認した後、各ブロックの断片を調製した。次に各断
片約１μｇとｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９約１μｇを用
いてライゲーションを行い、ブロック１，２，３とブロ
ック４，５と、ブロック６，７，８とをそれぞれ連結し
た中間的ブロックをｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９にクロ
ーン化した。最後に３つの中間的ブロック約１μｇとｐ
ＵＣ１９約１μｇを用いてライゲーションを行い、全ブ
ロックを連結した目的の遺伝子を含むプラスミドｐＨＳ
ＡＥ２を構築した（図１７）。
【００７２】
【実施例５】［全合成ヒト血清アルブミン遺伝子の大腸
菌での発現（１）］ 前出の方法と合成機を用いて図５に示すような合成ＤＮ
Ａを作成した。なお、同図中、ＳＤはリボソーム結合部
位を表す。次にこの合成ＤＮＡと先ほど作成したプラス
ミドｐＨＳＡＥ２及びプラスミドｐＴ１３ｓ（Ｎｃｏ）
（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０４，３０（１９８８））
とから図１９に示すように発現プラスミドｐＳＤＨＳＡ
Ｅ１２作成した。なお、プラスミドｐＴ１３ｓ（Ｎｃｏ
）は、工業技術院微生物工業研究所に寄託されている保
持菌株ＡＪ１２４４７（ＦＥＲＭＰ−１０７５７）から
調製した。
菌での発現（１）］ 前出の方法と合成機を用いて図５に示すような合成ＤＮ
Ａを作成した。なお、同図中、ＳＤはリボソーム結合部
位を表す。次にこの合成ＤＮＡと先ほど作成したプラス
ミドｐＨＳＡＥ２及びプラスミドｐＴ１３ｓ（Ｎｃｏ）
（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０４，３０（１９８８））
とから図１９に示すように発現プラスミドｐＳＤＨＳＡ
Ｅ１２作成した。なお、プラスミドｐＴ１３ｓ（Ｎｃｏ
）は、工業技術院微生物工業研究所に寄託されている保
持菌株ＡＪ１２４４７（ＦＥＲＭＰ−１０７５７）から
調製した。
【００７３】この発現プラスミドｐＳＤＨＳＡＥ１２の
調製の詳細は以下の通りである。即ち、ｐＨＳＡＥ２を
ＦｏｋＩとＢａｍＨＩで切断し、最も大きな断片（合成
ヒト血清アルブミン遺伝子の大部分を含む約１．８ｋｂ
断片）を調製する。一方、ｐＴ１３ｓ（Ｎｃｏ）をＣｌ
ａＩとＢａｍＨＩで切断し、大きい方の断片（ｔｒｐプ
ロモーター、ターミネーター、アンピシリン耐性遺伝子
を含む約２．６ｋｂ断片）を調製する。この両者と図５
に示した合成ＤＮＡとをＴ４リガーゼでライゲーション
してｐＳＤＨＳＡＥ１２を構築した。
調製の詳細は以下の通りである。即ち、ｐＨＳＡＥ２を
ＦｏｋＩとＢａｍＨＩで切断し、最も大きな断片（合成
ヒト血清アルブミン遺伝子の大部分を含む約１．８ｋｂ
断片）を調製する。一方、ｐＴ１３ｓ（Ｎｃｏ）をＣｌ
ａＩとＢａｍＨＩで切断し、大きい方の断片（ｔｒｐプ
ロモーター、ターミネーター、アンピシリン耐性遺伝子
を含む約２．６ｋｂ断片）を調製する。この両者と図５
に示した合成ＤＮＡとをＴ４リガーゼでライゲーション
してｐＳＤＨＳＡＥ１２を構築した。
【００７４】このようにして得られたプラスミドｐＳＤ
ＨＳＡＥ１２は、ｔｒｐプロモーター−オペレーターの
制御下、Ｍｅｔ残基に成熟型ＨＳＡが直接連結した蛋白
を発現するように設計されており、転写ターミネーター
としてｔｒｐＡターミネーターを備えている。
ＨＳＡＥ１２は、ｔｒｐプロモーター−オペレーターの
制御下、Ｍｅｔ残基に成熟型ＨＳＡが直接連結した蛋白
を発現するように設計されており、転写ターミネーター
としてｔｒｐＡターミネーターを備えている。
【００７５】次にこの発現プラスミドｐＳＤＨＳＡＥ１
２で通常よく用いられる塩化ルビジウム法を用いて大腸
菌ＨＢ１０１株を形質転換し、形質転換株ＨＢ１０１／
ｐＳＤＨＳＡＥ１２を得た。この株をグルコース、酵母
エキス、ＫＨ２ＰＯ４，ＮＨ４Ｃｌ，ＭｇＳＯ４，Ｃａ
Ｃｌ２，ビタミンＢ１を含む培地で培養した。培養開始
後４時間でインドールアクリル酸による誘導をかけ、誘
導後約１５時間培養したところ、菌体内に顆粒が生成し
ていた。
２で通常よく用いられる塩化ルビジウム法を用いて大腸
菌ＨＢ１０１株を形質転換し、形質転換株ＨＢ１０１／
ｐＳＤＨＳＡＥ１２を得た。この株をグルコース、酵母
エキス、ＫＨ２ＰＯ４，ＮＨ４Ｃｌ，ＭｇＳＯ４，Ｃａ
Ｃｌ２，ビタミンＢ１を含む培地で培養した。培養開始
後４時間でインドールアクリル酸による誘導をかけ、誘
導後約１５時間培養したところ、菌体内に顆粒が生成し
ていた。
【００７６】集菌後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
３０ｍＭ ＮａＣｌ ０．５Ｍ ＥＤＴＡバッ
フアーに懸濁し、０．２５ｍｇ／ｍｌリゾチームで０℃
１時間処理後、超音波破砕した。顆粒を低速遠沈後、２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ３０ｍＭＮａＣｌ
０．５Ｍ ＥＤＴＡバッフアーにて洗浄、再び遠沈し
、１０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に懸濁し、顆粒画分とした
。
３０ｍＭ ＮａＣｌ ０．５Ｍ ＥＤＴＡバッ
フアーに懸濁し、０．２５ｍｇ／ｍｌリゾチームで０℃
１時間処理後、超音波破砕した。顆粒を低速遠沈後、２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ３０ｍＭＮａＣｌ
０．５Ｍ ＥＤＴＡバッフアーにて洗浄、再び遠沈し
、１０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に懸濁し、顆粒画分とした
。
【００７７】図７（Ａ）はＨＢ１０１，ＨＢ１０１／ｐ
ＳＤＨＳＡＥ１２の全菌体蛋白及び顆粒画分をＳＤＳポ
リアクリルアミド電気泳動した図である。図中の１，２
，３，Ｍの略号は以下の通りである。
ＳＤＨＳＡＥ１２の全菌体蛋白及び顆粒画分をＳＤＳポ
リアクリルアミド電気泳動した図である。図中の１，２
，３，Ｍの略号は以下の通りである。
【００７８】
１．ＨＢ１０１全菌体蛋白
２．ＨＢ１０１／ｐＳＤＨＳＡＥ１２全菌体蛋白３．Ｈ
Ｂ１０１／ｐＳＤＨＳＡＥ１２顆粒画分Ｍ．分子量マー
カー ＨＢ１０１／ｐＳＤＨＳＡＥ１２の菌体蛋白には、宿主
のＨＢ１０１には見られない分子量約６７Ｋのバンドが
認められ、それは、顆粒画分に回収されている。ヒト血
清アルブミンの分子量は約６７Ｋであり、予定された分
子量の蛋白が顆粒として生成していることがわかった。
Ｂ１０１／ｐＳＤＨＳＡＥ１２顆粒画分Ｍ．分子量マー
カー ＨＢ１０１／ｐＳＤＨＳＡＥ１２の菌体蛋白には、宿主
のＨＢ１０１には見られない分子量約６７Ｋのバンドが
認められ、それは、顆粒画分に回収されている。ヒト血
清アルブミンの分子量は約６７Ｋであり、予定された分
子量の蛋白が顆粒として生成していることがわかった。
【００７９】図７（Ａ）と同様の電気泳動後（蛋白量は
１／３０）、抗ＨＳＡ抗体でウェスタンブロッテイング
を行なうと図７（Ｂ）のようなパターンになり、顆粒状
生成した蛋白は抗ヒト血清アルブミン抗体と反応するこ
とが示された。
１／３０）、抗ＨＳＡ抗体でウェスタンブロッテイング
を行なうと図７（Ｂ）のようなパターンになり、顆粒状
生成した蛋白は抗ヒト血清アルブミン抗体と反応するこ
とが示された。
【００８０】顆粒を６Ｍ塩酸グアニジンで可溶化し、ジ
チオスレイトールを加えて（ｆｉｎａｌ ０．１Ｍ）
１００℃２分処理後、逆相ＨＰＬＣで顆粒蛋白を精製し
た。これをアミノ酸シークエンサーにかけ、Ｎ末端付近
のアミノ酸配列を調べたところ、図８のように、調べた
１６アミノ酸残基の全てが一致した。なお、同図中、Ｏ
ｂｓｅｒｖｅｄは実際に観察された配列を、Ｐｒｅｄｉ
ｃｔｅｄは予定した配列をそれぞれ示す。
チオスレイトールを加えて（ｆｉｎａｌ ０．１Ｍ）
１００℃２分処理後、逆相ＨＰＬＣで顆粒蛋白を精製し
た。これをアミノ酸シークエンサーにかけ、Ｎ末端付近
のアミノ酸配列を調べたところ、図８のように、調べた
１６アミノ酸残基の全てが一致した。なお、同図中、Ｏ
ｂｓｅｒｖｅｄは実際に観察された配列を、Ｐｒｅｄｉ
ｃｔｅｄは予定した配列をそれぞれ示す。
【００８１】以上のことから、大腸菌においてＮ末端に
Ｍｅｔ残基の付加した形でヒト血清アルブミンを顆粒状
に生成することができたことが示唆された。
Ｍｅｔ残基の付加した形でヒト血清アルブミンを顆粒状
に生成することができたことが示唆された。
【００８２】形質転換株ＨＢ１０１／ｐＳＤＨＳＡＥ１
２（ＡＪ１２５７６）は、工業技術院微生物工業研究所
に寄託されている（ＦＥＲＭ Ｐ−１１８０４）。
２（ＡＪ１２５７６）は、工業技術院微生物工業研究所
に寄託されている（ＦＥＲＭ Ｐ−１１８０４）。
【００８３】顆粒を６Ｍグアニジンで可溶化後、１Ｍジ
チオスレイトールを１／１０量加えて１００℃２分で還
元を行い、逆相ＨＰＬＣによって定量したところ本培養
によるヒト血清アルブミンの生成量は１５〜２０ｍｇ／
Ｌ／Ｏ．Ｄであった。特開昭６１−２７５２２９には、
大腸菌における最高生成量５〜１０ｍｇ／Ｌ／Ｏ．Ｄが
記載されている。本発明による生成量は、この最高生成
量を２倍以上上回るものである。
チオスレイトールを１／１０量加えて１００℃２分で還
元を行い、逆相ＨＰＬＣによって定量したところ本培養
によるヒト血清アルブミンの生成量は１５〜２０ｍｇ／
Ｌ／Ｏ．Ｄであった。特開昭６１−２７５２２９には、
大腸菌における最高生成量５〜１０ｍｇ／Ｌ／Ｏ．Ｄが
記載されている。本発明による生成量は、この最高生成
量を２倍以上上回るものである。
【００８４】
【実施例６】
［ヒト血清アルブミンの枯草菌における分泌生産］本発
明者らは、まず枯草菌のベクターとして多用されるｐＵ
Ｂ１１０（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３４，３１８（
１９７８））と大腸菌のベクターｐＢＲ３２７（Ｇｅｎ
ｅ ９，２８７（１９８０））とをＥｃｏＲＩ部位で
連結し、大腸菌と枯草菌の両方で複製可能なシャトルベ
クターｐＢＵ４３７１を構築した。ｐＢＵ４３７１は、
大腸菌ではアンピシリン耐性、枯草菌ではカナマイシン
耐性を賦与する（図９）。
明者らは、まず枯草菌のベクターとして多用されるｐＵ
Ｂ１１０（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３４，３１８（
１９７８））と大腸菌のベクターｐＢＲ３２７（Ｇｅｎ
ｅ ９，２８７（１９８０））とをＥｃｏＲＩ部位で
連結し、大腸菌と枯草菌の両方で複製可能なシャトルベ
クターｐＢＵ４３７１を構築した。ｐＢＵ４３７１は、
大腸菌ではアンピシリン耐性、枯草菌ではカナマイシン
耐性を賦与する（図９）。
【００８５】枯草菌のα−アミラーゼ遺伝子ａｍｙＥの
うち、α−アミラーゼの発現と分泌に必要な部分は、約
０．４ｋｂの領域に存在しており、大腸菌β−ｌａｃｔ
ａｍａｓｅを枯草菌で分泌するプラスミドｐＴＵＢ２５
６（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ
ｍｕｎ．１３４，６２４，（１９８６））では、この領
域が０．４ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ断片として得られる
。
うち、α−アミラーゼの発現と分泌に必要な部分は、約
０．４ｋｂの領域に存在しており、大腸菌β−ｌａｃｔ
ａｍａｓｅを枯草菌で分泌するプラスミドｐＴＵＢ２５
６（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ
ｍｕｎ．１３４，６２４，（１９８６））では、この領
域が０．４ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ断片として得られる
。
【００８６】図１０は、α−アミラーゼの分泌に必須で
あり分泌時には切り離されるシグナルペプチドの切断点
（Ａｌａ３３）付近のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を示
している。任意のタンパク質の遺伝子を介在配列なしに
シグナルペプチド切断点の直後に連結するためには、切
断点の直前と目的遺伝子のＮ末端の直後に、アミノ酸配
列を変えることなくユニークな制限酵素部位を配置し、
その間を切断点とＮ末端を丁度つなげるようなアミノ酸
配列をコードする合成ＤＮＡで連結するとよい。切断点
付近のアミノ酸配列から考えられるＤＮＡ配列をもとに
可能な制限酵素部位を検索したところ、ＨａｐＩＩ部位
の直後、Ａｌａ３０をコードする配列をＧＣＴからＧＣ
Ｃに置換することによって唯一のＮｏｔＩ部位が導入で
きることが判った。
あり分泌時には切り離されるシグナルペプチドの切断点
（Ａｌａ３３）付近のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を示
している。任意のタンパク質の遺伝子を介在配列なしに
シグナルペプチド切断点の直後に連結するためには、切
断点の直前と目的遺伝子のＮ末端の直後に、アミノ酸配
列を変えることなくユニークな制限酵素部位を配置し、
その間を切断点とＮ末端を丁度つなげるようなアミノ酸
配列をコードする合成ＤＮＡで連結するとよい。切断点
付近のアミノ酸配列から考えられるＤＮＡ配列をもとに
可能な制限酵素部位を検索したところ、ＨａｐＩＩ部位
の直後、Ａｌａ３０をコードする配列をＧＣＴからＧＣ
Ｃに置換することによって唯一のＮｏｔＩ部位が導入で
きることが判った。
【００８７】そこで、図１１のような合成ＤＮＡをＡｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＤＮＡ合成
機を用いて作製し、次に図１２のようにして汎用分泌ベ
クターｐＡＳＥＣｌを構築した。ｐＡＳＥＣｌは、これ
をＮｏｔＩとＳｍａＩで切断し、任意の目的遺伝子の３
’末端を平滑化してＮ末端付近の適当な制限酵素Ｅで切
断しておき、両者を５’末端がＮｏｔＩ ｃｏｈｅｓ
ｉｖｅで３’末端が制限酵素Ｅに合うような合成ＤＮＡ
で連結することによって、ａｍｙＥのシグナルペプチド
切断点と任意の目的蛋白とが直接連結した遺伝子を構築
することができるようになっている。
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＤＮＡ合成
機を用いて作製し、次に図１２のようにして汎用分泌ベ
クターｐＡＳＥＣｌを構築した。ｐＡＳＥＣｌは、これ
をＮｏｔＩとＳｍａＩで切断し、任意の目的遺伝子の３
’末端を平滑化してＮ末端付近の適当な制限酵素Ｅで切
断しておき、両者を５’末端がＮｏｔＩ ｃｏｈｅｓ
ｉｖｅで３’末端が制限酵素Ｅに合うような合成ＤＮＡ
で連結することによって、ａｍｙＥのシグナルペプチド
切断点と任意の目的蛋白とが直接連結した遺伝子を構築
することができるようになっている。
【００８８】ＨＳＡ分泌プラスミドの構築まず図２０に
示すような２本の合成ＤＮＡを作製した。 この２つの合成ＤＮＡと実施例４で構築した全合成ヒト
血清アルブミン遺伝子を含むプラスミドｐＨＳＡＥ２（
図１７参照）及びプラスミドｐＵＣ１９とから、プラス
ミドｐＵＣ３３ＨＳＡＥを構築した（図２０）。
示すような２本の合成ＤＮＡを作製した。 この２つの合成ＤＮＡと実施例４で構築した全合成ヒト
血清アルブミン遺伝子を含むプラスミドｐＨＳＡＥ２（
図１７参照）及びプラスミドｐＵＣ１９とから、プラス
ミドｐＵＣ３３ＨＳＡＥを構築した（図２０）。
【００８９】このプラスミドｐＵＣ３３ＨＳＡＥの構築
の詳細を以下に示す。
の詳細を以下に示す。
【００９０】即ち、ｐＨＳＡＥ２をＦｏｋＩとＢａｍＨ
Ｉで切断し、最も大きな断片（合成ヒト血清アルブミン
遺伝子の大部分を含む１．８ｋｂ断片）を調製する。一
方、ｐＵＣ１９をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し
ておく。これらと図２０中に示した２本の合成ＤＮＡと
をＴ４リガーゼで連結し、目的のプラスミドｐＵＣ３３
ＨＳＡＥを構築した。
Ｉで切断し、最も大きな断片（合成ヒト血清アルブミン
遺伝子の大部分を含む１．８ｋｂ断片）を調製する。一
方、ｐＵＣ１９をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し
ておく。これらと図２０中に示した２本の合成ＤＮＡと
をＴ４リガーゼで連結し、目的のプラスミドｐＵＣ３３
ＨＳＡＥを構築した。
【００９１】さて次にプラスミドｐＵＣ３３ＨＳＡＥを
制限酵素ＢａｍＨＩで処理した後にクレノウ処理し、次
いでＮｏｔＩで処理することによって得られた１．８ｋ
ｂの断片と、プラスミドｐＡＳＥＣｌをＮｏｔＩ，Ｓｍ
ａＩで処理して得た７．５ｋｂの断片とをＴ４リガーゼ
を用いて結合させた。このようにして得られたプラスミ
ドがヒト血清アルブミン分泌プラスミドｐＡＭＹ３３Ｈ
ＳＡＥ２である（図２１）。
制限酵素ＢａｍＨＩで処理した後にクレノウ処理し、次
いでＮｏｔＩで処理することによって得られた１．８ｋ
ｂの断片と、プラスミドｐＡＳＥＣｌをＮｏｔＩ，Ｓｍ
ａＩで処理して得た７．５ｋｂの断片とをＴ４リガーゼ
を用いて結合させた。このようにして得られたプラスミ
ドがヒト血清アルブミン分泌プラスミドｐＡＭＹ３３Ｈ
ＳＡＥ２である（図２１）。
【００９２】枯草菌によるヒト血清アルブミンの分泌当
業者ならば容易に入手し得る枯草菌１Ａ５１０株（Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６５，９３４（１９８３））を
上述のプラスミドｐＡＭＹ３３ＨＳＡＥ２でプロトプラ
スト法により形質転換し、形質転換株１Ａ５１０／ｐＡ
ＭＹ３３ＨＳＡＥ２を得た。
業者ならば容易に入手し得る枯草菌１Ａ５１０株（Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６５，９３４（１９８３））を
上述のプラスミドｐＡＭＹ３３ＨＳＡＥ２でプロトプラ
スト法により形質転換し、形質転換株１Ａ５１０／ｐＡ
ＭＹ３３ＨＳＡＥ２を得た。
【００９３】このようにして得た形質転換株１Ａ５１０
／ｐＡＭＹ３３ＨＳＡＥ２とコントロールとしてプラス
ミドｐＢＵ４３７１を有する形質転換株１Ａ５１０／ｐ
ＢＵ４３７１との両方をトリプトン、酵母エキス、Ｎａ
Ｃｌ、カゼインを含む培地で３７℃で振盪培養した。１
４，１６，１８時間で培養液をサンプリングし、培養上
清を１μｌずつ１回及び５回ナイロンメンブランにスポ
ットして抗ヒト血清アルブミン抗体を用いてドットイム
ノブロッテイングを行なったところ、図１５に示すよう
に、ヒト血清アルブミンが培地に分泌生成していたこと
が確認された。なお、同図中においてＳｔａｎｄａｒｄ
ｓは、ＳＩＧＭＡのＥｓｓｅｎｔｉａｌｇｌｏｂｌｉｎ
ｆｒｅｅ ＨＵＭＡＮ Ａｌｂｕｍｉｎを用い
た。Ｂｒｏｔｈの位置には、培地をスポットした。図中
の１，２，４，５の位置には１Ａ５１０／ｐＡＭＹ３３
ＨＳＡＥ２を、３，６の位置には１Ａ５１０／ｐＢＵ４
３７１をそれぞれスポットした。
／ｐＡＭＹ３３ＨＳＡＥ２とコントロールとしてプラス
ミドｐＢＵ４３７１を有する形質転換株１Ａ５１０／ｐ
ＢＵ４３７１との両方をトリプトン、酵母エキス、Ｎａ
Ｃｌ、カゼインを含む培地で３７℃で振盪培養した。１
４，１６，１８時間で培養液をサンプリングし、培養上
清を１μｌずつ１回及び５回ナイロンメンブランにスポ
ットして抗ヒト血清アルブミン抗体を用いてドットイム
ノブロッテイングを行なったところ、図１５に示すよう
に、ヒト血清アルブミンが培地に分泌生成していたこと
が確認された。なお、同図中においてＳｔａｎｄａｒｄ
ｓは、ＳＩＧＭＡのＥｓｓｅｎｔｉａｌｇｌｏｂｌｉｎ
ｆｒｅｅ ＨＵＭＡＮ Ａｌｂｕｍｉｎを用い
た。Ｂｒｏｔｈの位置には、培地をスポットした。図中
の１，２，４，５の位置には１Ａ５１０／ｐＡＭＹ３３
ＨＳＡＥ２を、３，６の位置には１Ａ５１０／ｐＢＵ４
３７１をそれぞれスポットした。
【００９４】形質転換株１Ａ５１０／ｐＡＭＹ３３ＨＳ
ＡＥ２（ＡＪ１２５７８）と１Ａ５１０／ｐＢＵ４３７
１（ＡＪ１２４９２）は、工業技術院微生物工業研究所
に寄託されている。その寄託番号は、１Ａ５１０／ｐＡ
ＭＹ３３ＨＳＡＥ２がＦＥＲＭ Ｐ−１１８０６で、
１Ａ５１０／ｐＢＵ４３７１がＦＥＲＭ Ｐ−１１２
０６である。
ＡＥ２（ＡＪ１２５７８）と１Ａ５１０／ｐＢＵ４３７
１（ＡＪ１２４９２）は、工業技術院微生物工業研究所
に寄託されている。その寄託番号は、１Ａ５１０／ｐＡ
ＭＹ３３ＨＳＡＥ２がＦＥＲＭ Ｐ−１１８０６で、
１Ａ５１０／ｐＢＵ４３７１がＦＥＲＭ Ｐ−１１２
０６である。
【００９５】
【実施例７】［全合成ヒト血清アルブミン遺伝子の大腸
菌での発現（２）］ 大腸菌でのもう１つの発現プラスミドを図２２のように
して構築した。即ち、まず実施例５で構築したプラスミ
ドｐＳＤＨＡＳＥ１２のｔｒｐＡターミネーターを含む
０．３ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｃＩＩ断片をｐＨＳ
Ｇ２９９のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｃＩＩサイトに連結し、
ｐＫＴ９１を構築する。次にｐＳＤＨＡＳＥ１２のｔｒ
ｐプロモーターを含む８０ｂｐ ＥｃｏＲＩ−Ｃｌａ
Ｉ断片と、ヒト血清アルブミン遺伝子を含む１．８ｋｂ
ＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ断片とをｐＫＴ９１のＥｃｏ
ＲＩ−ＢａｍＨＩサイトに連結し、目的のプラスミドｐ
ＫＴ９１ＨＳＡＥ４を得た。
菌での発現（２）］ 大腸菌でのもう１つの発現プラスミドを図２２のように
して構築した。即ち、まず実施例５で構築したプラスミ
ドｐＳＤＨＡＳＥ１２のｔｒｐＡターミネーターを含む
０．３ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｃＩＩ断片をｐＨＳ
Ｇ２９９のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｃＩＩサイトに連結し、
ｐＫＴ９１を構築する。次にｐＳＤＨＡＳＥ１２のｔｒ
ｐプロモーターを含む８０ｂｐ ＥｃｏＲＩ−Ｃｌａ
Ｉ断片と、ヒト血清アルブミン遺伝子を含む１．８ｋｂ
ＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ断片とをｐＫＴ９１のＥｃｏ
ＲＩ−ＢａｍＨＩサイトに連結し、目的のプラスミドｐ
ＫＴ９１ＨＳＡＥ４を得た。
【００９６】次にこの発現プラスミドｐＫＴ９１ＨＳＡ
Ｅ４で通常よく用いられる塩化ルビジウム法を用いて大
腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、形質転換株ＨＢ１０１
／ｐＫＴ９１ＨＳＡＥ４を得た。この株を実施例５と同
様な培地で培養を行ったところ、やはり菌体内に顆粒が
生成した。
Ｅ４で通常よく用いられる塩化ルビジウム法を用いて大
腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、形質転換株ＨＢ１０１
／ｐＫＴ９１ＨＳＡＥ４を得た。この株を実施例５と同
様な培地で培養を行ったところ、やはり菌体内に顆粒が
生成した。
【００９７】実施例５と同様に顆粒を調製し、同様にヒ
ト血清アルブミンの定量を行ったところ、生成量は８０
〜９０ｍｇ／Ｌ／Ｏ．Ｄであり、実施例５の生成量をさ
らに４倍以上上回るものであった。
ト血清アルブミンの定量を行ったところ、生成量は８０
〜９０ｍｇ／Ｌ／Ｏ．Ｄであり、実施例５の生成量をさ
らに４倍以上上回るものであった。
【００９８】ＨＢ１０１／ｐＫＴ９１ＨＳＡＥ４（ＡＪ
１２５７７）は、工業技術院微生物工業研究所に寄託さ
れている（ＦＥＲＭ Ｐ−１１８０５）。
１２５７７）は、工業技術院微生物工業研究所に寄託さ
れている（ＦＥＲＭ Ｐ−１１８０５）。
【００９９】
【発明の効果】原核生物が好んで用いるコドンを多用す
るようにしてデザインした合成ＤＮＡを用いて目的とす
るヒト血清アルブミンを生産させる本発明は、ｃＤＮＡ
を用いてヒト血清アルブミンを微生物に生産させる従来
の方法の不完全さを是正し、より効率的な蛋白質生産を
行う上で極めて重要なものである。
るようにしてデザインした合成ＤＮＡを用いて目的とす
るヒト血清アルブミンを生産させる本発明は、ｃＤＮＡ
を用いてヒト血清アルブミンを微生物に生産させる従来
の方法の不完全さを是正し、より効率的な蛋白質生産を
行う上で極めて重要なものである。
【０１００】
【配列表】配列番号：１
配列の長さ：１７８１
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ存在位置
：２１．．２６ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列
：２１．．２６ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列
【０１０１】
【０１０２】
【０１０３】
【０１０４】
【０１０５】配列番号：２
配列の長さ：１７８１
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ存在位置
：２１．．２６ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列
：２１．．２６ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列
【０１０６】
【０１０７】
【０１０８】
【０１０９】
【図１】本発明者らが設計し、実際に全合成して構築し
た、ヒト血清アルブミンをコードするＤＮＡ配列を示す
図である。
た、ヒト血清アルブミンをコードするＤＮＡ配列を示す
図である。
【図２】ヒト血清アルブミンのＮ末端付近に単一の制限
酵素切断部位を導入するために配置したＦｏｋＩ認識部
位と切断部位を示す図である。
酵素切断部位を導入するために配置したＦｏｋＩ認識部
位と切断部位を示す図である。
【図３】遺伝子中の制限酵素部位の配置を示す図である
。なお、矢印はブロック１からブロック８各々の領域と
、３つの中間的ブロックの領域、及びｐＨＳＡが保持す
る領域を示す。
。なお、矢印はブロック１からブロック８各々の領域と
、３つの中間的ブロックの領域、及びｐＨＳＡが保持す
る領域を示す。
【図４】図４Ａはヒト血清アルブミン遺伝子構築のため
、ＤＮＡ合成機で合成したＤＮＡオリゴマーのブロック
１から３を示す図である。図４Ｂはヒト血清アルブミン
遺伝子構築のため、ＤＮＡ合成機で合成したＤＮＡオリ
ゴマーのブロック４，５を示す図である。図４Ｃはヒト
血清アルブミン遺伝子構築のため、ＤＮＡ合成機で合成
したＤＮＡオリゴマーのブロック６から８を示す図であ
る。
、ＤＮＡ合成機で合成したＤＮＡオリゴマーのブロック
１から３を示す図である。図４Ｂはヒト血清アルブミン
遺伝子構築のため、ＤＮＡ合成機で合成したＤＮＡオリ
ゴマーのブロック４，５を示す図である。図４Ｃはヒト
血清アルブミン遺伝子構築のため、ＤＮＡ合成機で合成
したＤＮＡオリゴマーのブロック６から８を示す図であ
る。
【図５】構築したヒト血清アルブミンを大腸菌の発現ベ
クターに接続するために作製した合成ＤＮＡを示す図で
ある。なお、ＳＤは、リボソーム結合部位を表す。
クターに接続するために作製した合成ＤＮＡを示す図で
ある。なお、ＳＤは、リボソーム結合部位を表す。
【図６】構築したヒト血清アルブミンを大腸菌で発現す
るプラスミドｐＳＤＨＳＡ４の構築手順を示す図である
。なお、プラスミドｐＴ１３Ｓ（Ｎｃｏ）は、大腸菌ｔ
ｒｐプロモーターを含む公知のプラスミドである。
るプラスミドｐＳＤＨＳＡ４の構築手順を示す図である
。なお、プラスミドｐＴ１３Ｓ（Ｎｃｏ）は、大腸菌ｔ
ｒｐプロモーターを含む公知のプラスミドである。
【図７】ポリアクリルアミド電気泳動図及びウェスタン
ブロッテイング図である。詳細に述べると（Ａ）はＳＤ
Ｓポリアクリルアミド電気泳動後、クーマシーブルーで
タンパク質を染色した図である。また（Ｂ）は（Ａ）の
１／３０量の蛋白を用いて同様の電気泳動後、ゲル内の
蛋白をナイロンメンブランにエレクトロトランスファー
し、抗ヒト血清アルブミン抗体を用いてウェスタンブロ
ッテイングした図である。図中の１，２，３，Ｍの略号
は以下の通りである。 １．ＨＢ１０１全菌体蛋白 ２．ＨＢ１０１／ｐＳＤＨＳＡＥ１２全菌体蛋白３．Ｈ
Ｂ１０１／ｐＳＤＨＳＡＥ１２顆粒画分Ｍ．分子量マー
カー
ブロッテイング図である。詳細に述べると（Ａ）はＳＤ
Ｓポリアクリルアミド電気泳動後、クーマシーブルーで
タンパク質を染色した図である。また（Ｂ）は（Ａ）の
１／３０量の蛋白を用いて同様の電気泳動後、ゲル内の
蛋白をナイロンメンブランにエレクトロトランスファー
し、抗ヒト血清アルブミン抗体を用いてウェスタンブロ
ッテイングした図である。図中の１，２，３，Ｍの略号
は以下の通りである。 １．ＨＢ１０１全菌体蛋白 ２．ＨＢ１０１／ｐＳＤＨＳＡＥ１２全菌体蛋白３．Ｈ
Ｂ１０１／ｐＳＤＨＳＡＥ１２顆粒画分Ｍ．分子量マー
カー
【図８】精製顆粒蛋白のアミノ酸配列を示す図である。
Ｏｂｓｅｒｖｅｄは実際に観察された配列、Ｐｒｅｄｉ
ｃｔｅｄは予定した配列を示す。
ｃｔｅｄは予定した配列を示す。
【図９】シャトルベクターｐＢＵ４３７１の構築を示す
図である。
図である。
【図１０】α−アミラーゼの分泌に必須であり分泌時に
は切り離される、ａｍｙＥのシグナルペプチドの切断点
（Ａｌａ３３）付近のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を示
す図である。なお、矢印は、Ａｌａ３３をコードする配
列をＧＣＴからＧＣＣに置換することによってＮｏｔＩ
部位が生ずること、及びシグナルペプチド切断点を表わ
す。
は切り離される、ａｍｙＥのシグナルペプチドの切断点
（Ａｌａ３３）付近のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を示
す図である。なお、矢印は、Ａｌａ３３をコードする配
列をＧＣＴからＧＣＣに置換することによってＮｏｔＩ
部位が生ずること、及びシグナルペプチド切断点を表わ
す。
【図１１】分泌ベクター構築のために作製した合成ＤＮ
Ａを示す図である。
Ａを示す図である。
【図１２】分泌ベクターｐＡＳＥＣｌの構築図である。
【図１３】ｐＡＳＥＣｌに接続するためのヒト血清アル
ブミン遺伝子の構築図である。
ブミン遺伝子の構築図である。
【図１４】ヒト血清アルブミンを枯草菌で分泌するため
のプラスミドｐＡＭＹ３３ＨＳＡ４の構築図である。
のプラスミドｐＡＭＹ３３ＨＳＡ４の構築図である。
【図１５】１Ａ５１０／ｐＡＭＹ３３ＨＳＡ４または１
Ａ５１０／ｐＡＭＹ３３ＨＳＡＥ２及び１Ａ５１０／ｐ
ＢＵ４３７１の培養１４，１６，１８時間目の培養上清
１μｌを１回及び５回ナイロンメンブランにスポットし
、抗ヒト血清アルブミン抗体でブロッテイングした図で
ある。Ｓｔａｎｄａｒｄｓは、ＳＩＧＭＡのＥｓｓｅｎ
ｔｉａｌ ｇｌｏｂｌｉｎｆｒｅｅ ＨＵＭＡＮ
Ａｌｂｕｍｉｎを用いた。Ｂｒｏｔｈの位置には、培
地をスポットした。図中の１，２，４，５の位置には１
Ａ５１０／ｐＡＭＹ３３ＨＳＡ４または１Ａ５１０／ｐ
ＡＭＹ３３ＨＳＡＥ２を、３，６の位置には１Ａ５１０
／ｐＢＵ４３７１をそれぞれスポットした。
Ａ５１０／ｐＡＭＹ３３ＨＳＡＥ２及び１Ａ５１０／ｐ
ＢＵ４３７１の培養１４，１６，１８時間目の培養上清
１μｌを１回及び５回ナイロンメンブランにスポットし
、抗ヒト血清アルブミン抗体でブロッテイングした図で
ある。Ｓｔａｎｄａｒｄｓは、ＳＩＧＭＡのＥｓｓｅｎ
ｔｉａｌ ｇｌｏｂｌｉｎｆｒｅｅ ＨＵＭＡＮ
Ａｌｂｕｍｉｎを用いた。Ｂｒｏｔｈの位置には、培
地をスポットした。図中の１，２，４，５の位置には１
Ａ５１０／ｐＡＭＹ３３ＨＳＡ４または１Ａ５１０／ｐ
ＡＭＹ３３ＨＳＡＥ２を、３，６の位置には１Ａ５１０
／ｐＢＵ４３７１をそれぞれスポットした。
【図１６】本発明者らが設計し、実際に全合成して構築
した、ヒト血清アルブミンをコードするＤＮＡ配列を示
す図である。
した、ヒト血清アルブミンをコードするＤＮＡ配列を示
す図である。
【図１７】遺伝子中の制限酵素部位の配置を示す図であ
る。なお、矢印はブロック１からブロック８各々の領域
と、３つの中間的ブロックの領域、及びｐＨＳＡＥ２が
保持する領域を示す。
る。なお、矢印はブロック１からブロック８各々の領域
と、３つの中間的ブロックの領域、及びｐＨＳＡＥ２が
保持する領域を示す。
【図１８】図１８Ａはヒト血清アルブミン遺伝子構築の
ため、ＤＮＡ合成機で合成したＤＮＡオリゴマーのブロ
ック１から３を示す図である。図１８Ｂはヒト血清アル
ブミン遺伝子構築のため、ＤＮＡ合成機で合成したＤＮ
Ａオリゴマーのブロック４，５を示す図である。図１８
Ｃはヒト血清アルブミン遺伝子構築のため、ＤＮＡ合成
機で合成したＤＮＡオリゴマーのブロック６から８を示
す図である。
ため、ＤＮＡ合成機で合成したＤＮＡオリゴマーのブロ
ック１から３を示す図である。図１８Ｂはヒト血清アル
ブミン遺伝子構築のため、ＤＮＡ合成機で合成したＤＮ
Ａオリゴマーのブロック４，５を示す図である。図１８
Ｃはヒト血清アルブミン遺伝子構築のため、ＤＮＡ合成
機で合成したＤＮＡオリゴマーのブロック６から８を示
す図である。
【図１９】構築したヒト血清アルブミンを大腸菌で発現
するプラスミドｐＳＤＨＳＡＥ１２の構築手順を示す図
である。なお、プラスミドｐＴ１３Ｓ（Ｎｃｏ）は、大
腸菌ｔｒｐプロモーターを含む公知のプラスミドである
。
するプラスミドｐＳＤＨＳＡＥ１２の構築手順を示す図
である。なお、プラスミドｐＴ１３Ｓ（Ｎｃｏ）は、大
腸菌ｔｒｐプロモーターを含む公知のプラスミドである
。
【図２０】ｐＡＳＥＣｌに接続するためのヒト血清アル
ブミン遺伝子の構築図である。
ブミン遺伝子の構築図である。
【図２１】ヒト血清アルブミンを枯草菌で分泌するため
のプラスミドｐＡＭＹ３３ＨＳＡＥ２の構築図である。
のプラスミドｐＡＭＹ３３ＨＳＡＥ２の構築図である。
【図２２】構築したヒト血清アルブミンを大腸菌で発現
するプラスミドｐＫＴ９１ＨＳＡＥ４の構築手順を示す
図である。
するプラスミドｐＫＴ９１ＨＳＡＥ４の構築手順を示す
図である。
Claims (9)
- 【請求項１】 大腸菌で多用されるコドンを頻用して
設計した、ヒト血清アルブミン蛋白をコードする遺伝子
を含む合成ＤＮＡ。 - 【請求項２】 合成ＤＮＡがヒト血清アルブミン蛋白
のＮ末端付近をコードする領域に単一の制限酵素切断部
位を保持することを特徴とする請求項１記載の合成ＤＮ
Ａ。 - 【請求項３】 合成ＤＮＡが下記に示す制限酵素地図
を有するものである請求項１記載の合成ＤＮＡ。 - 【請求項４】 合成ＤＮＡが配列表の配列番号１で示
される配列を有するものである請求項１記載の合成ＤＮ
Ａ。 - 【請求項５】 合成ＤＮＡが配列表の配列番号２で示
される配列を有するものである請求項１記載の合成ＤＮ
Ａ。 - 【請求項６】 請求項１ないし５記載の合成ＤＮＡを
含有するプラスミド。 - 【請求項７】 請求項６記載のプラスミドで形質転換
された微生物。 - 【請求項８】 微生物がエシェリシア・コリ（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）、バチルス・サチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
）またはバチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）であ
る請求項７記載の微生物。 - 【請求項９】 請求項７または８記載の微生物を培地
中で培養し、その微生物菌体または培地中からヒト血清
アルブミンを単離することを特徴とするヒト血清アルブ
ミンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1460091A JPH04211375A (ja) | 1990-02-05 | 1991-02-05 | 合成遺伝子及びそれを用いたヒト血清アルブミンの製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-25682 | 1990-02-05 | ||
| JP2568290 | 1990-02-05 | ||
| JP1460091A JPH04211375A (ja) | 1990-02-05 | 1991-02-05 | 合成遺伝子及びそれを用いたヒト血清アルブミンの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04211375A true JPH04211375A (ja) | 1992-08-03 |
Family
ID=26350568
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1460091A Pending JPH04211375A (ja) | 1990-02-05 | 1991-02-05 | 合成遺伝子及びそれを用いたヒト血清アルブミンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04211375A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001077314A1 (fr) * | 2000-04-11 | 2001-10-18 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Gene $g(a)2,3-sialyltransferase modifie, son procede de production et saccharide complexe contenant de l'acide sialique |
| US6926898B2 (en) | 2000-04-12 | 2005-08-09 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US7045318B2 (en) | 1995-12-30 | 2006-05-16 | Delta Biotechnology Limited | Recombinant fusion proteins to growth hormone and serum albumin |
| US8993517B2 (en) | 2001-12-21 | 2015-03-31 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
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