JP2637328B2 - 成熟ポリペプチド - Google Patents
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- JP2637328B2 JP2637328B2 JP4009692A JP969292A JP2637328B2 JP 2637328 B2 JP2637328 B2 JP 2637328B2 JP 4009692 A JP4009692 A JP 4009692A JP 969292 A JP969292 A JP 969292A JP 2637328 B2 JP2637328 B2 JP 2637328B2
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- fragment
- interferon
- dna
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＩＦＮ−α活性を有す
る成熟ポリペプチドに関するものである。
る成熟ポリペプチドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】バクテリア中での遺伝子発現の前提条件
として、バクテリアＲＮＡポリメラーゼの結合認識配
列、いわゆるプロモーターの存在がある。その結果、プ
ロモーターはその下流域に位置する配列の転写を可能に
する。その生産物がいつでも合成されるような遺伝子
は、ＲＮＡポリメラーゼ分子の結合が常に可能であるよ
うなプロモーターを有する。バクテリアのある遺伝子ま
たはオペロンは調節されており、それらのプロモーター
は特有の機構により結合できたり、できなかったりす
る。目的遺伝子産物の合成のための前提条件としてさら
に、バクテリアのリボゾームでのＲＮＡ転写物の効率の
よい翻訳がある。従って、バクテリアに於いて、ｍＲＮ
Ａの５´末端のヌクレオチド配列がリボゾームの結合を
担っているこがＳｈｉｎｅおよびＤａｌｇａｒｎｏによ
り明かにされている（Ｎａｔｕｒｅ２５４巻、３４−３
８頁：１９７５年参照）。
として、バクテリアＲＮＡポリメラーゼの結合認識配
列、いわゆるプロモーターの存在がある。その結果、プ
ロモーターはその下流域に位置する配列の転写を可能に
する。その生産物がいつでも合成されるような遺伝子
は、ＲＮＡポリメラーゼ分子の結合が常に可能であるよ
うなプロモーターを有する。バクテリアのある遺伝子ま
たはオペロンは調節されており、それらのプロモーター
は特有の機構により結合できたり、できなかったりす
る。目的遺伝子産物の合成のための前提条件としてさら
に、バクテリアのリボゾームでのＲＮＡ転写物の効率の
よい翻訳がある。従って、バクテリアに於いて、ｍＲＮ
Ａの５´末端のヌクレオチド配列がリボゾームの結合を
担っているこがＳｈｉｎｅおよびＤａｌｇａｒｎｏによ
り明かにされている（Ｎａｔｕｒｅ２５４巻、３４−３
８頁：１９７５年参照）。
【０００３】
【発明の開示】本発明の目的は、新規のリボゾーム結合
／リンカー配列を介して既知のプロモーターを構造遺伝
子に結合することにより、バクテリアにとり異種たん白
質の改良された遺伝的生産によって、産生されるＩＦＮ
−α活性を有する成熟ポリペプチドにある。本発明に係
るＤＮＡ配列は、リボゾーム結合配列の次に任意にリン
カー配列を含み、下記の式で表わされる。本配列は文献
上知られているプロモーター配列と、文献上知られてい
るリボゾーム結合配列との新規な組み合わせからなる：
／リンカー配列を介して既知のプロモーターを構造遺伝
子に結合することにより、バクテリアにとり異種たん白
質の改良された遺伝的生産によって、産生されるＩＦＮ
−α活性を有する成熟ポリペプチドにある。本発明に係
るＤＮＡ配列は、リボゾーム結合配列の次に任意にリン
カー配列を含み、下記の式で表わされる。本配列は文献
上知られているプロモーター配列と、文献上知られてい
るリボゾーム結合配列との新規な組み合わせからなる：
【化２】 Hind III
【０００４】本発明に係る望ましいＤＮＡ配列は、次の
式で表わされるＤＮＡ配列と、
式で表わされるＤＮＡ配列と、
【化３】 を含有する。
【０００５】本発明に従い、これらの配列を含み、その
配列の後ろにプラスミド中で一つのＨｉｎｄ III 間隔
を有する発現プラスミドであり、それに望む特別の遺伝
子を挿入して生産プラスミドを作成し、得られる生産プ
ラスミドを使用し、原核細胞中で真核細胞遺伝子の産物
が生産される、特に白血球インタフェロンが生産され
る。
配列の後ろにプラスミド中で一つのＨｉｎｄ III 間隔
を有する発現プラスミドであり、それに望む特別の遺伝
子を挿入して生産プラスミドを作成し、得られる生産プ
ラスミドを使用し、原核細胞中で真核細胞遺伝子の産物
が生産される、特に白血球インタフェロンが生産され
る。
【０００６】本発明に係る目的を達成するためには、以
下の手法が例として用いられる。適当なバクテリアプロモーター配列の選択 ：本目的のた
めには、オペレーター配列と組み合わせて誘発されたり
抑制されたりするようなプロモーターが好ましく使用さ
れる。この種のプロモーターはバクテリアにとって異種
の目的たん白質の合成がバクテリアの生育サイクル後期
にのみ開始されるという利点がある。たとえばトリプト
フアンオペロンの場合には（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌおよび
Ｅｍｔａｇｅ，Ｇｅｎｅ６巻、２７−４７頁：１９８０
年参照）、培養液からトリプトフアンを抽出除去し、ト
リプトフアンオペロンの誘発剤して、バクテリアの増殖
に影響することはないインドール−（３）−アクリル酸
を培養培地に加える。好ましくは、発現プラスミドを構
成するのに用いられるプロモーター／オペレーター系は
文献から知られている非常に強く、調節可能なものであ
り、下記の式で表わされる、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒ
ｃｅｓｃｅｎｓ（セラチア・マルセツセンス）のトリプ
トフアンオペロンの系（ＭｉｏｚｚａｒｉおよびＹａｎ
ｏｆｓｋｙ；Ｎａｔｕｒｅ２７６巻、６８４−６８９
頁：１９７８年）のものである。これは文献で知られて
いる方法により調製される。
下の手法が例として用いられる。適当なバクテリアプロモーター配列の選択 ：本目的のた
めには、オペレーター配列と組み合わせて誘発されたり
抑制されたりするようなプロモーターが好ましく使用さ
れる。この種のプロモーターはバクテリアにとって異種
の目的たん白質の合成がバクテリアの生育サイクル後期
にのみ開始されるという利点がある。たとえばトリプト
フアンオペロンの場合には（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌおよび
Ｅｍｔａｇｅ，Ｇｅｎｅ６巻、２７−４７頁：１９８０
年参照）、培養液からトリプトフアンを抽出除去し、ト
リプトフアンオペロンの誘発剤して、バクテリアの増殖
に影響することはないインドール−（３）−アクリル酸
を培養培地に加える。好ましくは、発現プラスミドを構
成するのに用いられるプロモーター／オペレーター系は
文献から知られている非常に強く、調節可能なものであ
り、下記の式で表わされる、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒ
ｃｅｓｃｅｎｓ（セラチア・マルセツセンス）のトリプ
トフアンオペロンの系（ＭｉｏｚｚａｒｉおよびＹａｎ
ｏｆｓｋｙ；Ｎａｔｕｒｅ２７６巻、６８４−６８９
頁：１９７８年）のものである。これは文献で知られて
いる方法により調製される。
【化４】
【０００７】リボゾーム結合配列の構成：本発明に係る
目的のために、特に有効であることが記載されている
式、 ５´ＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡ なる配列（ｖｏｎ Ｊａｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８巻、５５４３−５
５４８頁：１９８１年）が使用される。
目的のために、特に有効であることが記載されている
式、 ５´ＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡ なる配列（ｖｏｎ Ｊａｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８巻、５５４３−５
５４８頁：１９８１年）が使用される。
【化５】 で示されるリボゾーム結合配列の構成は、５´ＴＣＣＴ
ＴＡ（６員体）、５´ＡＧＣＴＴＡＡＡＣＣ（１０員
体）および５´ＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡ（１２員体）
の３つの合成オリゴヌクレオチドを文献から知られてい
る方法により組立てることによって、好ましく行なえ
る。この場合に、６員体オリゴヌクレオチドは前もって
適当に放射標識しておく。引き続くプロモーター／オペ
レーターとリボゾーム結合配列との結合は、文献から知
られている方法により行う。
ＴＡ（６員体）、５´ＡＧＣＴＴＡＡＡＣＣ（１０員
体）および５´ＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡ（１２員体）
の３つの合成オリゴヌクレオチドを文献から知られてい
る方法により組立てることによって、好ましく行なえ
る。この場合に、６員体オリゴヌクレオチドは前もって
適当に放射標識しておく。引き続くプロモーター／オペ
レーターとリボゾーム結合配列との結合は、文献から知
られている方法により行う。
【０００８】発現プラスミドの構成：９０ｂｐの長さの
プロモーター／オペレーター配列を、制限酸素ＥｃｏＲ
ＩおよびＨａｅ III を用いて、例えばプラスミドｐＢ
Ｐ１０１のようなＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅ
ｎｓのトリプトフアンオペロンを含むプラスミドより切
り出す。次にこの断片を酵素ＤＮＡリガーゼを用いて、
合成したＲＢＳと結合させ、このようにして得られ、プ
ロモーター／オペレーターの前部にＥｃｏ ＲＩ末端を
有し、ＲＢＳの後にＨｉｎｄ III末端を有するプロモー
ター／オペレーターＲＢＳ断片をプラスミドｐＢＲ３２
２の２９ｂｐ．の長さのＥｃｏ ＲＩ−Ｈｉｎｄ III断
片の代りに挿入する。このようにして得られる発現ベク
ター（ｐＥＲ１０３のＨｉｎｄ III間に挿入された遺伝
子の発現に関する有効性を、白血球インタフェロン、サ
ブタイプＡ（ＩＦＮ−αＡ）の例で示す。
プロモーター／オペレーター配列を、制限酸素ＥｃｏＲ
ＩおよびＨａｅ III を用いて、例えばプラスミドｐＢ
Ｐ１０１のようなＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅ
ｎｓのトリプトフアンオペロンを含むプラスミドより切
り出す。次にこの断片を酵素ＤＮＡリガーゼを用いて、
合成したＲＢＳと結合させ、このようにして得られ、プ
ロモーター／オペレーターの前部にＥｃｏ ＲＩ末端を
有し、ＲＢＳの後にＨｉｎｄ III末端を有するプロモー
ター／オペレーターＲＢＳ断片をプラスミドｐＢＲ３２
２の２９ｂｐ．の長さのＥｃｏ ＲＩ−Ｈｉｎｄ III断
片の代りに挿入する。このようにして得られる発現ベク
ター（ｐＥＲ１０３のＨｉｎｄ III間に挿入された遺伝
子の発現に関する有効性を、白血球インタフェロン、サ
ブタイプＡ（ＩＦＮ−αＡ）の例で示す。
【０００９】ｐＥＲ １０３中でのＩＦＮ−αＡの発
現：細胞外に搬出しようとする他のたん白質と同様に、
インタフェロンはヒト細胞内でプレたん白として、即
ち、リーダー配列をもったたん白質として合成される。
たん白質分子が細胞から出る時にのみ、このリーダー配
列はそこに存在する特有の酵素により切断され、その結
果として、成熟たん白質が生産される。バクテリア内で
成熟インタフェロンを合成する一つの可能性は、ＤＮＡ
の段階でリーダー配列を除くことであり、それは、成熟
たん白質の配列のみをコードする遺伝子を作製すること
による。
現：細胞外に搬出しようとする他のたん白質と同様に、
インタフェロンはヒト細胞内でプレたん白として、即
ち、リーダー配列をもったたん白質として合成される。
たん白質分子が細胞から出る時にのみ、このリーダー配
列はそこに存在する特有の酵素により切断され、その結
果として、成熟たん白質が生産される。バクテリア内で
成熟インタフェロンを合成する一つの可能性は、ＤＮＡ
の段階でリーダー配列を除くことであり、それは、成熟
たん白質の配列のみをコードする遺伝子を作製すること
による。
【００１０】ＩＦＮ−αＡのためのインタフェロン生産
プラスミドの作製：たとえば、白血球インタフェロンは
２３個のアミノ酸から成るプレ配列を有し、それにシス
テインが続き、プレインタフェロンの切断の後に、成熟
インタフェロンのポリペプチドの第一番目のアミノ酸と
なる。バクテリア中で成熟インタフェロンの合成を行な
うことのできるプラスミドを作製するためには、このシ
ステインの暗号から正確に開始するようなインタフェロ
ン遺伝子断片を単離する必要がある。
プラスミドの作製：たとえば、白血球インタフェロンは
２３個のアミノ酸から成るプレ配列を有し、それにシス
テインが続き、プレインタフェロンの切断の後に、成熟
インタフェロンのポリペプチドの第一番目のアミノ酸と
なる。バクテリア中で成熟インタフェロンの合成を行な
うことのできるプラスミドを作製するためには、このシ
ステインの暗号から正確に開始するようなインタフェロ
ン遺伝子断片を単離する必要がある。
【００１１】たん白質合成を開始するのに、このシステ
インのコドンの前にＡＴＧのメチオニンコドンをつけな
ければならない。このようにして作製されたものを適当
な方法で、例えば発現プラスミドｐＥＲ１０３に挿入
し、ＡＴＧ開始コドンとＲＢＳとの距離が翻訳に最適に
なるようにする。バクテリア中でこのようなプラスミド
により生産されたインタフェロンは、成熟ポリペプチド
のアミノ酸配列に、そのアミノ末端にさらにメチオニン
を有する。本発明によると、ＩＦＮ−αＡをコードする
インタフェロン生産プラスミドｐＥＲ３３は、例えば、
以下の基本に基づいて作製される（その作製方法を第４
図に示す）：
インのコドンの前にＡＴＧのメチオニンコドンをつけな
ければならない。このようにして作製されたものを適当
な方法で、例えば発現プラスミドｐＥＲ１０３に挿入
し、ＡＴＧ開始コドンとＲＢＳとの距離が翻訳に最適に
なるようにする。バクテリア中でこのようなプラスミド
により生産されたインタフェロンは、成熟ポリペプチド
のアミノ酸配列に、そのアミノ末端にさらにメチオニン
を有する。本発明によると、ＩＦＮ−αＡをコードする
インタフェロン生産プラスミドｐＥＲ３３は、例えば、
以下の基本に基づいて作製される（その作製方法を第４
図に示す）：
【００１２】ａ）アミノ末端システインのコドンを除い
て、成熟インタフェロンをコードする遺伝子の作製 インタフェロンの情報として用いる出発材料は、例え
ば、ＩＦＮ−αＡをコードするｃＤＮＡクローン１Ｆ７
であり、このクローンは１９８２年５月１７日付けで寄
託機関“Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｇｒｉｅｓｅｂａｃｈ
ｓｔｒａｓｓｅ ８，Ｄ−３４００ Ｇｏｔｔｉｎｇｅ
ｎ（ドイツ連邦共和国）にＤＳＭ番号２３６２として寄
託され、ブタペスト条約に基づく国際寄託受託証を受け
ている。又ドイツ特許出願Ｐ３２２０１１６．８（１９
８２年５月２８日）を参照できる。このクローンはｐＢ
Ｒ３２２のＰｓｔＩ間にインタフェロン遺伝子を挿入し
たものである。ＩＦＮ−αＡは（他の白血球インタフェ
ロンサブタイプと同様に）アミノ末端システインをコー
ドするＴＧＴのすぐ後に、Ｓａｕ３Ａのギャップを有す
る。このギャップが存在することが、適当な制限酵素断
片、例えばプラスミド１Ｆ７のインタフェロン特有の６
４６ｂｐのＡｖａＩＩ断片および３４ｂｐのＳａｕ３Ａ
−ＡｖａＩＩ断片、から成熟インタフェロン遺伝子を作
製する方法の基本を構成する。
て、成熟インタフェロンをコードする遺伝子の作製 インタフェロンの情報として用いる出発材料は、例え
ば、ＩＦＮ−αＡをコードするｃＤＮＡクローン１Ｆ７
であり、このクローンは１９８２年５月１７日付けで寄
託機関“Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｇｒｉｅｓｅｂａｃｈ
ｓｔｒａｓｓｅ ８，Ｄ−３４００ Ｇｏｔｔｉｎｇｅ
ｎ（ドイツ連邦共和国）にＤＳＭ番号２３６２として寄
託され、ブタペスト条約に基づく国際寄託受託証を受け
ている。又ドイツ特許出願Ｐ３２２０１１６．８（１９
８２年５月２８日）を参照できる。このクローンはｐＢ
Ｒ３２２のＰｓｔＩ間にインタフェロン遺伝子を挿入し
たものである。ＩＦＮ−αＡは（他の白血球インタフェ
ロンサブタイプと同様に）アミノ末端システインをコー
ドするＴＧＴのすぐ後に、Ｓａｕ３Ａのギャップを有す
る。このギャップが存在することが、適当な制限酵素断
片、例えばプラスミド１Ｆ７のインタフェロン特有の６
４６ｂｐのＡｖａＩＩ断片および３４ｂｐのＳａｕ３Ａ
−ＡｖａＩＩ断片、から成熟インタフェロン遺伝子を作
製する方法の基本を構成する。
【００１３】ｂ）オリゴヌクレオチド複合体の調製 次に、このようにして作製された遺伝子の欠けているシ
ステインコドンの５´末端で、この末端の前に、ＡＴＧ
メチオニンコドンをつけなければならない。また、発現
プラスミドｐＥＲ１０３のＨｉｎｄ IIIギャップに結合
することを可能にする結合断片が必要である。このため
に、４つのオリゴヌクレオチドを合成する；１４塩基体
の５´ＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡ、１２塩基体の５
´ＡＧＣＴＴＡＡＡＧＡＴＧ、９塩基体の５´ＣＡＧＡ
ＴＣＡＣＡ、および８塩基体の５´ＣＡＴＣＴＴＴＡで
ある。結合し、Ｓａｕ ３Ａで再切断すると、これらの
オリゴヌクレオチドはインタフェロン遺伝子のＳａｕ
３Ａ末端をｐＥＲ１０３Ｈｉｎｄ III末端に結合するこ
とができる望ましい断片となる。
ステインコドンの５´末端で、この末端の前に、ＡＴＧ
メチオニンコドンをつけなければならない。また、発現
プラスミドｐＥＲ１０３のＨｉｎｄ IIIギャップに結合
することを可能にする結合断片が必要である。このため
に、４つのオリゴヌクレオチドを合成する；１４塩基体
の５´ＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡ、１２塩基体の５
´ＡＧＣＴＴＡＡＡＧＡＴＧ、９塩基体の５´ＣＡＧＡ
ＴＣＡＣＡ、および８塩基体の５´ＣＡＴＣＴＴＴＡで
ある。結合し、Ｓａｕ ３Ａで再切断すると、これらの
オリゴヌクレオチドはインタフェロン遺伝子のＳａｕ
３Ａ末端をｐＥＲ１０３Ｈｉｎｄ III末端に結合するこ
とができる望ましい断片となる。
【化６】
【００１４】本発明においては、オリゴヌクレオチドの
合成に際し、開始コドンＡＴＧとシステインコドンＴＧ
Ｔは別の断片にくるように構築される。そのためには、
１２塩基体（および８塩基体）がｐＥＲ１０３に遺伝子
を挿入する際に、一般に使用できる。従って、システィ
ンコドンを有するオリゴヌクレオチドは少なくとも９塩
基の長さが必要である。例えば次のようなヌクレオチド
が使用できる。５´ＴＧＴＧＡＴＣＴＧ、５´ＴＧＴＧ
ＡＴＣＴＨＣ、５´ＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣ、５´ＴＧ
ＴＧＡＴＣＴＧＣＣＴ または５´ＴＧＴＧＡＴＣＴＧ
ＣＣＴＣ．
合成に際し、開始コドンＡＴＧとシステインコドンＴＧ
Ｔは別の断片にくるように構築される。そのためには、
１２塩基体（および８塩基体）がｐＥＲ１０３に遺伝子
を挿入する際に、一般に使用できる。従って、システィ
ンコドンを有するオリゴヌクレオチドは少なくとも９塩
基の長さが必要である。例えば次のようなヌクレオチド
が使用できる。５´ＴＧＴＧＡＴＣＴＧ、５´ＴＧＴＧ
ＡＴＣＴＨＣ、５´ＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣ、５´ＴＧ
ＴＧＡＴＣＴＧＣＣＴ または５´ＴＧＴＧＡＴＣＴＧ
ＣＣＴＣ．
【００１５】そこで、例えば、１４塩基体により得られ
る結合オリゴヌクレオチドをＳａｕ３Ａで消化して、イ
ンタフェロンに適合するＳａｕ ３Ａをつくる。引き続
くインタフェロン遺伝子とオリゴヌクレオチド複合体と
の結合、そのプラスミドへの挿入およびバクテリア宿
主、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１
０１、の形質転換は文献で知られている方法により行
う。
る結合オリゴヌクレオチドをＳａｕ３Ａで消化して、イ
ンタフェロンに適合するＳａｕ ３Ａをつくる。引き続
くインタフェロン遺伝子とオリゴヌクレオチド複合体と
の結合、そのプラスミドへの挿入およびバクテリア宿
主、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１
０１、の形質転換は文献で知られている方法により行
う。
【００１６】真核細胞遺伝子の生産物の生産収量をさら
に増加するためには、その生産プラスミドが発現に必要
なＤＮＡ配列を複数、例えば２倍、含んでいることが有
利である。例えば、バクテリアの調節配列を含む、成熟
インタフェロンαＡの全遺伝子の２倍である。この目的
のためには、バクテリアのプロモーター、原核細胞のリ
ボゾーム結合部位およびＡＴＧ開始コドンを伴なう成熟
インタフェロンの遺伝子を、本発明に係り作製された生
産プラスミド、例えばｐＥＲ３３から単離し、このＤＮ
Ａの一方の末端を変えてから、本発明に係り作製された
完全に同一のプラスミドを、たとえばＥｃｏ ＲＩなど
の制限酵素により線状にしたものの中に挿入する。
に増加するためには、その生産プラスミドが発現に必要
なＤＮＡ配列を複数、例えば２倍、含んでいることが有
利である。例えば、バクテリアの調節配列を含む、成熟
インタフェロンαＡの全遺伝子の２倍である。この目的
のためには、バクテリアのプロモーター、原核細胞のリ
ボゾーム結合部位およびＡＴＧ開始コドンを伴なう成熟
インタフェロンの遺伝子を、本発明に係り作製された生
産プラスミド、例えばｐＥＲ３３から単離し、このＤＮ
Ａの一方の末端を変えてから、本発明に係り作製された
完全に同一のプラスミドを、たとえばＥｃｏ ＲＩなど
の制限酵素により線状にしたものの中に挿入する。
【００１７】本発明に係り、このようにして作製された
プラスミドの中では、トリプトフアンオペロンを有する
もの、例えばプラスミドｐＥＲ３３がｐａｒ部位を含ん
でいると又有利である。即ち、アンピシリンのような抗
生物質など、選択指標の非存在下で、バクテリアの生育
中に、プラスミドを孫細胞に均一に輸送する役割のＤＮ
Ａ配列は有利である（Ｐ．Ｍ．Ｍｅａｃｏ ｃｋ．Ｓ．
Ｎ．Ｃｏｈｅｎ：Ｃｅｌｌ２０巻、５２９−５４２（１
９８０年）参照）。この目的のためには、先ずｐａｒ部
位を上記引用の文献記載のプラスミドｐＰＭ３１から単
離し、本発明に係り作製されたインタフェロン生産プラ
スミドに挿入する。
プラスミドの中では、トリプトフアンオペロンを有する
もの、例えばプラスミドｐＥＲ３３がｐａｒ部位を含ん
でいると又有利である。即ち、アンピシリンのような抗
生物質など、選択指標の非存在下で、バクテリアの生育
中に、プラスミドを孫細胞に均一に輸送する役割のＤＮ
Ａ配列は有利である（Ｐ．Ｍ．Ｍｅａｃｏ ｃｋ．Ｓ．
Ｎ．Ｃｏｈｅｎ：Ｃｅｌｌ２０巻、５２９−５４２（１
９８０年）参照）。この目的のためには、先ずｐａｒ部
位を上記引用の文献記載のプラスミドｐＰＭ３１から単
離し、本発明に係り作製されたインタフェロン生産プラ
スミドに挿入する。
【００１８】このようにして、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａ
ｒｃｅｓｃｅｎｓのトリプトファンプロモーター／オペ
レーター部分および合成ＲＢＳを含む発現プラスミドを
作製することが可能となった。たん白質の遺伝的生産の
ためのこのプラスミドの有効性は、白血球インタフェロ
ンの例によって証明されている。
ｒｃｅｓｃｅｎｓのトリプトファンプロモーター／オペ
レーター部分および合成ＲＢＳを含む発現プラスミドを
作製することが可能となった。たん白質の遺伝的生産の
ためのこのプラスミドの有効性は、白血球インタフェロ
ンの例によって証明されている。
【００１９】
【実施例】以下の例により本発明をさらに詳細に説明す
る。
る。
【００２０】Ａ．一般的方法の説明1. 制限酵素による消化 制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより購入の
制限エンドヌクレアーゼを、以下の条件で使用した：Ｅ
ｃｏ ＲＩ、Ｈｉｎｄ III Ｐｓｔ ＩおよびＡｖａ
II消化はＴＡ緩衝液（３３mMトリ酢酸、pH７．９、６６
mM酢酸カリ、１０mM酢酸マグネシウム、１００μｇ／ml
ＢＳＡ）中で行った。Ｈａｅ III消化はＴＭ緩衝液
（７０mMトリス−塩酸、pH７．５、７mM塩化マグネシウ
ム）中で行ない、Ｓａｕ ３Ａ消化は１０mMトリス−塩
酸、pH７．４、１０mM塩化マグネシウム、７５mM Ｎａ
Ｃｌ中で行なった。
ｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより購入の
制限エンドヌクレアーゼを、以下の条件で使用した：Ｅ
ｃｏ ＲＩ、Ｈｉｎｄ III Ｐｓｔ ＩおよびＡｖａ
II消化はＴＡ緩衝液（３３mMトリ酢酸、pH７．９、６６
mM酢酸カリ、１０mM酢酸マグネシウム、１００μｇ／ml
ＢＳＡ）中で行った。Ｈａｅ III消化はＴＭ緩衝液
（７０mMトリス−塩酸、pH７．５、７mM塩化マグネシウ
ム）中で行ない、Ｓａｕ ３Ａ消化は１０mMトリス−塩
酸、pH７．４、１０mM塩化マグネシウム、７５mM Ｎａ
Ｃｌ中で行なった。
【００２１】2. プラスミドの調製とゲル電気泳動 プラスミドの調製は、ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７巻、１５１
３−１５２３頁）１９７９年））の指示に従い、２５μ
ｇ／mlのテトラサイクリン又は１００μｇ／mlのアンピ
シリン含有のＬ−ブロス中の一晩培養物１．５mlまたは
１００−３００mlを用いて行なった。プラスミドの追加
の精製は、イソプロパノール沈でん（後述）および（大
量な場合には）フアルマシアのセフアロース４Ｂクロマ
トグラフィーにより実施した。さらに多量のプラスミド
はＣｌｅｗｅｌｌおよびＨｅｌｓｉｎｋｉ（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ９巻、４４２８−４４４０頁：１９７０
年）の“クリヤーライゼート”法により調製し、続いて
臭化エチジウムＣｓＣｌ密度勾配遠心分離を行なった。
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７巻、１５１
３−１５２３頁）１９７９年））の指示に従い、２５μ
ｇ／mlのテトラサイクリン又は１００μｇ／mlのアンピ
シリン含有のＬ−ブロス中の一晩培養物１．５mlまたは
１００−３００mlを用いて行なった。プラスミドの追加
の精製は、イソプロパノール沈でん（後述）および（大
量な場合には）フアルマシアのセフアロース４Ｂクロマ
トグラフィーにより実施した。さらに多量のプラスミド
はＣｌｅｗｅｌｌおよびＨｅｌｓｉｎｋｉ（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ９巻、４４２８−４４４０頁：１９７０
年）の“クリヤーライゼート”法により調製し、続いて
臭化エチジウムＣｓＣｌ密度勾配遠心分離を行なった。
【００２２】プラスミドおよびその制限酵素消化産物の
電気泳動は４０mMトリ酢酸pH７．８、２０mM酢酸ナトリ
ウム、２mMＥＤＴＡ中の０．８−１．４％アガロースゲ
ルまたは６％ポリアクリルアミドゲルで行なった。制限
酵素断片の調製は、目的断片を含むゲル区分を切り出
し、ゲルよりＤＮＡを電気泳動溶出により透析チューブ
へ溶出することにより行なった。
電気泳動は４０mMトリ酢酸pH７．８、２０mM酢酸ナトリ
ウム、２mMＥＤＴＡ中の０．８−１．４％アガロースゲ
ルまたは６％ポリアクリルアミドゲルで行なった。制限
酵素断片の調製は、目的断片を含むゲル区分を切り出
し、ゲルよりＤＮＡを電気泳動溶出により透析チューブ
へ溶出することにより行なった。
【００２３】3. キナーゼおよびフオスフアターゼの反
応およびリガーゼ反応 ５´−りん酸化反応（末端標識）は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ
ＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより入手
したＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ５単位を用い、ＴＭ
緩衝液（７０mMトリス−塩酸、pH７．５、７mM ＭｇＣ
ｌ2 ）＋５mMＤＴＴ＋０．２−０．５mM ＡＴＰ（１０
−２０μＣr 32Ｐ−ＡＴＰ）中、３７℃で６０分間行な
った。引き続いて、酵素不活化のために、７０℃で１０
分間インキュベートした。リガーゼ反応はＢｅｔｈｅｓ
ｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓか
ら入手できるＴ４ＤＮＡ０．１単位（平滑末端の結
合）、又は０．００５単位のリガーゼ（末端の結合）を
用い、ＴＭ緩衝液＋５mM ＤＴＴ＋０．２５mMＡＴＰ中
で１４℃において一晩で行なった。酵素はその後、７０
℃で１０分の加熱により失活させた。
応およびリガーゼ反応 ５´−りん酸化反応（末端標識）は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ
ＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより入手
したＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ５単位を用い、ＴＭ
緩衝液（７０mMトリス−塩酸、pH７．５、７mM ＭｇＣ
ｌ2 ）＋５mMＤＴＴ＋０．２−０．５mM ＡＴＰ（１０
−２０μＣr 32Ｐ−ＡＴＰ）中、３７℃で６０分間行な
った。引き続いて、酵素不活化のために、７０℃で１０
分間インキュベートした。リガーゼ反応はＢｅｔｈｅｓ
ｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓか
ら入手できるＴ４ＤＮＡ０．１単位（平滑末端の結
合）、又は０．００５単位のリガーゼ（末端の結合）を
用い、ＴＭ緩衝液＋５mM ＤＴＴ＋０．２５mMＡＴＰ中
で１４℃において一晩で行なった。酵素はその後、７０
℃で１０分の加熱により失活させた。
【００２４】キナーゼおよびリガーゼの連続反応は同一
の反応液中で行なった。第一の酵素を熱失活させた後
に、５mM ＤＴＴおよび０．２５−０．５mM ＡＴＰを
再び添加し、第二の反応を行なった。フオスフアターゼ
反応は制限消化用緩衝液（ＴＡ緩衝液）中、１単位のア
ルカリフオスフアターゼ（仔牛の腸より調製したシグマ
製）を制限酵素消化物に添加し、３７℃における１５分
間のインキュベーションにより行なった。続いて、１〜
２回のフェノール抽出、エーテル抽出およびアルコール
沈でんを行なった。ＤＮＡ断片は多くの場合電気泳動で
分離し、ゲルより溶出してから次の操作に用いた。
の反応液中で行なった。第一の酵素を熱失活させた後
に、５mM ＤＴＴおよび０．２５−０．５mM ＡＴＰを
再び添加し、第二の反応を行なった。フオスフアターゼ
反応は制限消化用緩衝液（ＴＡ緩衝液）中、１単位のア
ルカリフオスフアターゼ（仔牛の腸より調製したシグマ
製）を制限酵素消化物に添加し、３７℃における１５分
間のインキュベーションにより行なった。続いて、１〜
２回のフェノール抽出、エーテル抽出およびアルコール
沈でんを行なった。ＤＮＡ断片は多くの場合電気泳動で
分離し、ゲルより溶出してから次の操作に用いた。
【００２５】ＤＮＡの大きい断片（５００ｂｐ以上）を
小さい断片（結合していないリンカ−断片または小さい
制限消化産物）から分離するには、イソプロパノール沈
澱を用いた。この反応は２Ｎの酢酸アンモニウム（終濃
度）で開始し、沈でんは０．６容量のイソプロパノール
を用いて室温において、１０〜２０分、行なった。エッ
ペンドルフ型遠心分離機で５分間遠心分離した後に、上
澄を除去し、沈でんを冷７０％エタノールで洗滌後に、
再び遠心分離した。得られるペレットを乾燥し、次の操
作に用いた。
小さい断片（結合していないリンカ−断片または小さい
制限消化産物）から分離するには、イソプロパノール沈
澱を用いた。この反応は２Ｎの酢酸アンモニウム（終濃
度）で開始し、沈でんは０．６容量のイソプロパノール
を用いて室温において、１０〜２０分、行なった。エッ
ペンドルフ型遠心分離機で５分間遠心分離した後に、上
澄を除去し、沈でんを冷７０％エタノールで洗滌後に、
再び遠心分離した。得られるペレットを乾燥し、次の操
作に用いた。
【００２６】Ｂ．オリゴヌクレオチドの作製 略称： ＤＭＴｒ＝Ｐ，Ｐ´−ジメトキシ−トリフェニルメチル ｉｂｕ ＝イソブチリル ｂｚ ＝ベンゾイル（塩基窒素上の）
【外１】
【００２７】例 Ｉ 高分子担体物質への官能基導入 高分子担体物質に、文献から知られている方法に従って
官能基を導入した。ＨＰＬＣシリカゲル（Ｍａｃｈｅｒ
ｅｙ ５ Ｎａｇｅｌ、粒子の大きさ２０mm、孔径２０
０Ａ）を担体として用いた。コハク酸化の工程を無水ピ
リジン中で無水コハク酸により行なう以外は、Ｍａｔｔ
ｅｕｃｃｉおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ記載の方法（Ｍ．
Ｄ．Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒ
ｓ，Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ２１巻、
７１９頁：１９８１年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．
１０３巻、３１８５頁：１９８１年およびＴ．Ｔａｎａ
ｋａ，Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，ｐｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ １０巻、３２４９頁：１
９８２年）に従って誘導体化を行なった。保護されたヌ
クレオシドを、次の式に従ってシリカゲルに共役結合し
た。
官能基を導入した。ＨＰＬＣシリカゲル（Ｍａｃｈｅｒ
ｅｙ ５ Ｎａｇｅｌ、粒子の大きさ２０mm、孔径２０
０Ａ）を担体として用いた。コハク酸化の工程を無水ピ
リジン中で無水コハク酸により行なう以外は、Ｍａｔｔ
ｅｕｃｃｉおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ記載の方法（Ｍ．
Ｄ．Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒ
ｓ，Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ２１巻、
７１９頁：１９８１年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．
１０３巻、３１８５頁：１９８１年およびＴ．Ｔａｎａ
ｋａ，Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，ｐｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ １０巻、３２４９頁：１
９８２年）に従って誘導体化を行なった。保護されたヌ
クレオシドを、次の式に従ってシリカゲルに共役結合し
た。
【化７】 １グラムの担体に対して６８〜１０４μmol のヌクレオ
シド濃度を用いた。
シド濃度を用いた。
【００２８】例 II ５´−ジメトキシトリチル−デオキシチミジン−３´−
クロロメトキシ亜りん酸 完全保護されたヌクレオシド−３´−クロロメトキシ亜
りん酸は文献に記載されている方法（Ｍ．Ｄ．Ｍａｔｔ
ｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３巻、３１８５頁：１９８１年
およびＴ．Ｔａｎａｋａ，Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅ
ｒ，Ｎｕｃｌｅｉｅ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
１０巻、３２４９頁：（１９８２年）により合成した。
５４４．６mg（１．０mmol）の５´−ジメトキシトリチ
ルチミジン（ＤＭＴｒｄＴ）を１．０mlの純粋ＴＨＦに
溶解し、この溶液を−７８℃で１５分間、アルゴン雰囲
気の下に、０．５mlの純粋ピリジンおよび２．０mlの純
粋テトラヒドロフラン中に溶解した０．９mmolのメチル
−ジクロロ亜りん酸の溶液に攪拌しながら滴下して加え
る。さらに１０分の攪拌の後に、この反応溶液を室温ま
で温め、次いで遠心分離する。
クロロメトキシ亜りん酸 完全保護されたヌクレオシド−３´−クロロメトキシ亜
りん酸は文献に記載されている方法（Ｍ．Ｄ．Ｍａｔｔ
ｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３巻、３１８５頁：１９８１年
およびＴ．Ｔａｎａｋａ，Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅ
ｒ，Ｎｕｃｌｅｉｅ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
１０巻、３２４９頁：（１９８２年）により合成した。
５４４．６mg（１．０mmol）の５´−ジメトキシトリチ
ルチミジン（ＤＭＴｒｄＴ）を１．０mlの純粋ＴＨＦに
溶解し、この溶液を−７８℃で１５分間、アルゴン雰囲
気の下に、０．５mlの純粋ピリジンおよび２．０mlの純
粋テトラヒドロフラン中に溶解した０．９mmolのメチル
−ジクロロ亜りん酸の溶液に攪拌しながら滴下して加え
る。さらに１０分の攪拌の後に、この反応溶液を室温ま
で温め、次いで遠心分離する。
【００２９】上澄液をアルゴン充填し、乾燥した２５ml
の先細共栓フラスコに、ピペットを用いて移す。この溶
液を室温で減圧の下に蒸発させ、トルエンおよびテトラ
ヒドロフラン各０．５mlを加え、蒸発を再び行ない、無
色の泡状固体を生成物として得る。この生成物の純度は
分析しなかったが、１０．０mlの純粋ピリジンに溶解
し、この溶液をアルゴン下に−２０℃で保存して使用し
たが、保存期間は一週間以内とした。
の先細共栓フラスコに、ピペットを用いて移す。この溶
液を室温で減圧の下に蒸発させ、トルエンおよびテトラ
ヒドロフラン各０．５mlを加え、蒸発を再び行ない、無
色の泡状固体を生成物として得る。この生成物の純度は
分析しなかったが、１０．０mlの純粋ピリジンに溶解
し、この溶液をアルゴン下に−２０℃で保存して使用し
たが、保存期間は一週間以内とした。
【００３０】例 III ５´−ジメトキシトリチル−Ｎ2 −イソブチル−デオキ
シグアノシン−３´−クロロメトキシ亜りん酸 例IIと同様に、６４０．０mg（１．０mmol）の５´−ジ
メトキシトリチル−Ｎ 2 −イソブチル−デオキシグアノ
シンから、１０．０mlのピリジン中で、このヌクレオシ
ドフオスフオロクロリダイトを調整した。
シグアノシン−３´−クロロメトキシ亜りん酸 例IIと同様に、６４０．０mg（１．０mmol）の５´−ジ
メトキシトリチル−Ｎ 2 −イソブチル−デオキシグアノ
シンから、１０．０mlのピリジン中で、このヌクレオシ
ドフオスフオロクロリダイトを調整した。
【００３１】例 IV ５´−ジメトキシトリチル−Ｎ6 −ベンゾイル−デオキ
シシチジン−３´−クロロメトキシ亜りん酸 例IIと同様に、６３３．７mg（１．０mmol）の５´−ジ
メトキシ−トリチル−Ｎ4 −ベンゾイル−デオキシシチ
ジンから、１０．０mlのピリジン中で、このヌクレオシ
ドフオスフオロクロリダイトを調整した。
シシチジン−３´−クロロメトキシ亜りん酸 例IIと同様に、６３３．７mg（１．０mmol）の５´−ジ
メトキシ−トリチル−Ｎ4 −ベンゾイル−デオキシシチ
ジンから、１０．０mlのピリジン中で、このヌクレオシ
ドフオスフオロクロリダイトを調整した。
【００３２】例 Ｖ ５´−ジメトキシトリチル−Ｎ6 −ベンゾイル−デオキ
シアデノシン−３´−クロロメトキシ亜りん酸 例IIと同様に、１０．０mlのピリジン中で６５７．７mg
（１．０mmol）の５´−ジメトキシトリチル−Ｎ6 −ベ
ンゾイル−デオキシアデノシンから、このヌクレオシド
フオスフオロクロリダイトを調整した。
シアデノシン−３´−クロロメトキシ亜りん酸 例IIと同様に、１０．０mlのピリジン中で６５７．７mg
（１．０mmol）の５´−ジメトキシトリチル−Ｎ6 −ベ
ンゾイル−デオキシアデノシンから、このヌクレオシド
フオスフオロクロリダイトを調整した。
【００３３】例 VI ｄ−ＴＣＣＴＴＡの合成 ＤＭＴｒｄＡbzをつけた高分子担体（例Ｉ）をガラスフ
リット中に注ぐ。下記のリストに従って種々の溶媒およ
び試薬溶液を添加し、目的の反応が終了した後に、フリ
ット上部からのアルゴンガス蒸気により押し通すことに
よって溶液を再び除去する。
リット中に注ぐ。下記のリストに従って種々の溶媒およ
び試薬溶液を添加し、目的の反応が終了した後に、フリ
ット上部からのアルゴンガス蒸気により押し通すことに
よって溶液を再び除去する。
【００３４】ａ）５００mlのニトロメタンと５mlの水に
７０ｇの臭化亜鉛を溶解した溶液３mlにより、ＤＭＴｒ
基を切断する。反応時間は１０分。 ｂ）ｎ−ブタノール−ルチジン−ＴＨＦの４：１：５混
合液３mlで４回洗滌。 ｃ）純粋ピリジン４mlで４回洗滌。 ｄ）次回のヌクレオチドモジュールの縮合：５´−ジメ
トキシトリチル−デオキシチミジン−３´−クロロメト
キシ亜りん酸（例Ｂ）（およそ１００μmol ）のピリジ
ン溶液１mlをアルゴン雰囲気の下にフリット中で、高分
子担体に添加し、振って溶液とする。反応時間１０分。 ｅ）絶対ピリジン３mlで３回洗滌。 ｆ）テトラヒドロフラン、ルチジンおよび水の２：２：
１混合液３mlに溶解した１００mgの沃素により三亜りん
酸を酸化する。反応時間、７分。 ｇ）テトラヒドロフラン４mlで３回洗滌。 ｈ）未反応の５´−ＯＨ基を１５０mgのジメチルアミノ
ピリジン、０．３mlのコリジン、０．２５ml無水酢酸お
よび２．５mlのテトラヒドロフランでアセチル化する。
反応時間、５分。 ｉ）ニトロメタン３mlで４回洗滌。 ａ）からｉ）までのサイクルを、あと４回くり返えし、
配列に必要なヌクレオチドモジュールをｄ）のステップ
に入れる。
７０ｇの臭化亜鉛を溶解した溶液３mlにより、ＤＭＴｒ
基を切断する。反応時間は１０分。 ｂ）ｎ−ブタノール−ルチジン−ＴＨＦの４：１：５混
合液３mlで４回洗滌。 ｃ）純粋ピリジン４mlで４回洗滌。 ｄ）次回のヌクレオチドモジュールの縮合：５´−ジメ
トキシトリチル−デオキシチミジン−３´−クロロメト
キシ亜りん酸（例Ｂ）（およそ１００μmol ）のピリジ
ン溶液１mlをアルゴン雰囲気の下にフリット中で、高分
子担体に添加し、振って溶液とする。反応時間１０分。 ｅ）絶対ピリジン３mlで３回洗滌。 ｆ）テトラヒドロフラン、ルチジンおよび水の２：２：
１混合液３mlに溶解した１００mgの沃素により三亜りん
酸を酸化する。反応時間、７分。 ｇ）テトラヒドロフラン４mlで３回洗滌。 ｈ）未反応の５´−ＯＨ基を１５０mgのジメチルアミノ
ピリジン、０．３mlのコリジン、０．２５ml無水酢酸お
よび２．５mlのテトラヒドロフランでアセチル化する。
反応時間、５分。 ｉ）ニトロメタン３mlで４回洗滌。 ａ）からｉ）までのサイクルを、あと４回くり返えし、
配列に必要なヌクレオチドモジュールをｄ）のステップ
に入れる。
【００３５】収量の測定：最後のヌクレオチドモジュー
ルを縮合した後に、担体物質をオイルポンプ減圧の下で
乾燥し、およそ１mgのサンプルを正確に秤量し、０．１
Ｍトルエンスルフォン酸アセトニトリル溶液１０mlと混
合する。ジメトキシトリチル陽イオンの開裂の結果とし
て、橙赤色溶液が得られる。この溶液の４９８nmにおけ
る吸収を測定する。下記の式に従って担体のジメトキシ
トリチル保護基による荷重を計算できる：
ルを縮合した後に、担体物質をオイルポンプ減圧の下で
乾燥し、およそ１mgのサンプルを正確に秤量し、０．１
Ｍトルエンスルフォン酸アセトニトリル溶液１０mlと混
合する。ジメトキシトリチル陽イオンの開裂の結果とし
て、橙赤色溶液が得られる。この溶液の４９８nmにおけ
る吸収を測定する。下記の式に従って担体のジメトキシ
トリチル保護基による荷重を計算できる：
【数１】 ４３μmol ／ｇが得られる。これは各縮合ステップ当り
平均収量８５％に相当する。
平均収量８５％に相当する。
【００３６】三りん酸基からのメチル基の開裂：担体物
質をチオフェノール、トリエチルアミンおよびジオキサ
ンの１：１：２混合溶液４ml中で４５分間振りまぜ、続
いてエタノール、さらにエーテルで洗う。 塩基保護基の開裂および高分子担体からのヘキサヌクレ
オチド鎖の同時開裂：担体を濃アンモニア水１０ml中で
５０℃に１４時間加熱し、水溶液を吸引濾過して得られ
る濾液をおよそ２mlまで蒸発させる。
質をチオフェノール、トリエチルアミンおよびジオキサ
ンの１：１：２混合溶液４ml中で４５分間振りまぜ、続
いてエタノール、さらにエーテルで洗う。 塩基保護基の開裂および高分子担体からのヘキサヌクレ
オチド鎖の同時開裂：担体を濃アンモニア水１０ml中で
５０℃に１４時間加熱し、水溶液を吸引濾過して得られ
る濾液をおよそ２mlまで蒸発させる。
【００３７】生産物の精製：このようにして得られた、
５´末端にジメトキシトリチル保護基をまだつけている
粗生産物を逆相ＨＰＬＣに付する：カラム：μボンダパ
ックＣ18（Ｗａｔｅｒｓ）；溶出液：２５％のアセトニ
トリル含有０．１Ｍのトリエチルアンモニウム酢酸緩衝
液、pH７；流量２ml／min ；溶出時間１４分。集めた溶
出画分を約１mlに濃縮し、８０％酢酸１０mlを加え、室
温で３０分放置する。それを減圧の下に、５０℃で濃縮
乾固し、残留物を２５mlの水に溶解し、分離したジメト
キシトリタノールを１５mlのエーテルで３回抽出する。
水性層を再び蒸発乾固し、残留物を２．５mlの水に溶解
し、Ｂｉｏｇｅｌ ｐ２（カラム：６０×１．７cm）で
脱イオン化し、凍結乾燥する。
５´末端にジメトキシトリチル保護基をまだつけている
粗生産物を逆相ＨＰＬＣに付する：カラム：μボンダパ
ックＣ18（Ｗａｔｅｒｓ）；溶出液：２５％のアセトニ
トリル含有０．１Ｍのトリエチルアンモニウム酢酸緩衝
液、pH７；流量２ml／min ；溶出時間１４分。集めた溶
出画分を約１mlに濃縮し、８０％酢酸１０mlを加え、室
温で３０分放置する。それを減圧の下に、５０℃で濃縮
乾固し、残留物を２５mlの水に溶解し、分離したジメト
キシトリタノールを１５mlのエーテルで３回抽出する。
水性層を再び蒸発乾固し、残留物を２．５mlの水に溶解
し、Ｂｉｏｇｅｌ ｐ２（カラム：６０×１．７cm）で
脱イオン化し、凍結乾燥する。
【００３８】生成物の分析：純度検定としては分析用Ｈ
ＰＬＣ図を用いた（カラム：３００×３．９mm、μボン
ダパックＣ18、Ｗａｔｅｒｓ；溶出液：１２％アセトニ
トリル中０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸緩衝液、
pH７；流速：１．５ml／min ；溶出時間：３．７分）。
ＰＬＣ図を用いた（カラム：３００×３．９mm、μボン
ダパックＣ18、Ｗａｔｅｒｓ；溶出液：１２％アセトニ
トリル中０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸緩衝液、
pH７；流速：１．５ml／min ；溶出時間：３．７分）。
【００３９】例 VII ｄ−ＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡの合成 例VIと同様の方法を用い、３００mg（３０μmol ）のＤ
ＭＴｒｄＡbz〜Ｐから合成した。 生成物のＨＰＬＣダイアグラム： カラム；３００×３．９mm、μボンダパックＣ18、（Ｗ
ａｔｅｒｓ）； 溶出液：１２％アセトニトリル中、０．１Ｍトリエチル
アンモニウム酢酸緩衝液、pH７ 流速：１．５ml／min 溶出時間：４．４分
ＭＴｒｄＡbz〜Ｐから合成した。 生成物のＨＰＬＣダイアグラム： カラム；３００×３．９mm、μボンダパックＣ18、（Ｗ
ａｔｅｒｓ）； 溶出液：１２％アセトニトリル中、０．１Ｍトリエチル
アンモニウム酢酸緩衝液、pH７ 流速：１．５ml／min 溶出時間：４．４分
【００４０】例 VIII ｄ−ＡＧＣＴＴＡＡＡＣＣの合成 例VIと同様にして、２００mg（１６μmol ）のＤＭＴｒ
ｄＣbz〜Ｐから合成した。 生成物のＨＰＬＣダイアグラム： カラム：３００×３．９mm、μボンダパックＣ18、（Ｗ
ａｔｅｒｓ） 溶出液：１２％アセトニトリル中、０．１Ｍトリエチル
アンモニウム酢酸緩衝液、pH７ 流速：１．５ml／min 溶出時間：３．４分
ｄＣbz〜Ｐから合成した。 生成物のＨＰＬＣダイアグラム： カラム：３００×３．９mm、μボンダパックＣ18、（Ｗ
ａｔｅｒｓ） 溶出液：１２％アセトニトリル中、０．１Ｍトリエチル
アンモニウム酢酸緩衝液、pH７ 流速：１．５ml／min 溶出時間：３．４分
【００４１】例 IX ｄ−ＣＡＴＣＴＴＴＡの合成 例VIと同様にして、１５０mg（１．３２μmol ）のＤＭ
ＴｒｄＡbz〜Ｐから合成した。 生成物のＨＰＬＣのダイアグラム： カラム：３００×７．８mm、μボンダパックＣ18、（Ｗ
ａｔｅｒｓ） 溶出液：２０％アセトニトリル中、０．１Ｍ酢酸トリエ
チルアンモニウム緩衝液、pH７ 流速：１．５ml／min 溶出時間：７．７分
ＴｒｄＡbz〜Ｐから合成した。 生成物のＨＰＬＣのダイアグラム： カラム：３００×７．８mm、μボンダパックＣ18、（Ｗ
ａｔｅｒｓ） 溶出液：２０％アセトニトリル中、０．１Ｍ酢酸トリエ
チルアンモニウム緩衝液、pH７ 流速：１．５ml／min 溶出時間：７．７分
【００４２】例 Ｘ ｄ−ＡＧＣＴＴＡＡＡＧＡＴＧの合成 例VIと同様にして、２００mg（１６．２μmol ）のＤＭ
ＴｒｄＧibu 〜Ｐから合成した。 生成物のＨＰＬＣダイアグラム： カラム：３００×７．８mm、μボンダパックＣ18、（Ｗ
ａｔｅｒｓ） 溶出液：２６％アセトニトリル中、０．１Ｍ酢酸トリエ
チルアンモニウム緩衝液、pH７ 流速：１．５ml／min 溶出時間：５．２分
ＴｒｄＧibu 〜Ｐから合成した。 生成物のＨＰＬＣダイアグラム： カラム：３００×７．８mm、μボンダパックＣ18、（Ｗ
ａｔｅｒｓ） 溶出液：２６％アセトニトリル中、０．１Ｍ酢酸トリエ
チルアンモニウム緩衝液、pH７ 流速：１．５ml／min 溶出時間：５．２分
【００４３】例 XI ｄ−ＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡの合成 例VIと同様にして、２５０mg（２２μmol ）のＤＭＴｒ
ｄＡbz〜Ｐから合成した。 生成物のＨＰＬＣダイアグラム： カラム：３００×７．８mm、μ−ボンダパック、Ｃ
18（Ｗａｔｅｒｓ） 溶出液：２５％アセトニトリル中、０．１Ｍ酢酸トリエ
チルアンモニウム緩衝液、pH７ 流速：１．５ml／min 溶出時間：６．１分
ｄＡbz〜Ｐから合成した。 生成物のＨＰＬＣダイアグラム： カラム：３００×７．８mm、μ−ボンダパック、Ｃ
18（Ｗａｔｅｒｓ） 溶出液：２５％アセトニトリル中、０．１Ｍ酢酸トリエ
チルアンモニウム緩衝液、pH７ 流速：１．５ml／min 溶出時間：６．１分
【００４４】例 XII ｄ−ＣＡＧＡＴＣＡＣＡの合成 例VIと同様にして、１５０mg（１３．２μmol ）のＤＭ
ＴｒｄＡbz〜Ｐから合成した。 生成物のＨＰＬＣダイアグラム： カラム：３００×７．８mm、μ−ボンダパック Ｃ
18（Ｗａｔｅｒｓ） 溶出液：２０％アセトニトリル中、０．１Ｍ酢酸トリエ
チルアンモニウム緩衝液、pH７ 流速：０．２ml／min 溶出時間：５．２分
ＴｒｄＡbz〜Ｐから合成した。 生成物のＨＰＬＣダイアグラム： カラム：３００×７．８mm、μ−ボンダパック Ｃ
18（Ｗａｔｅｒｓ） 溶出液：２０％アセトニトリル中、０．１Ｍ酢酸トリエ
チルアンモニウム緩衝液、pH７ 流速：０．２ml／min 溶出時間：５．２分
【００４５】オリゴデオキシヌクレオチドの分析 合成的に生成したオリゴデオキシヌクレオチドの配列分
析は、インタフエロン生産プラスミドｐＥＲ３３に組み
込んでから後で行った（例２：インタフエロンプラスミ
ドｐＥＲ３３の配列分析の項参照）。この分析によっ
て、オリゴデオキシヌクレオチドの塩基配列の正しさも
同時に証明される（第５図参照）。
析は、インタフエロン生産プラスミドｐＥＲ３３に組み
込んでから後で行った（例２：インタフエロンプラスミ
ドｐＥＲ３３の配列分析の項参照）。この分析によっ
て、オリゴデオキシヌクレオチドの塩基配列の正しさも
同時に証明される（第５図参照）。
【００４６】例 １ 発現プラスミドｐＥＲ１０３の作製 発現プラスミドｐＥＲ１０３の作製は第１図に図示す
る。 ａ）プロモータ／オペレータ断片の単離 Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのトリプトフ
ァンオペロンのおよそ１０００ｂｐを含むプラスミドｐ
ＢＲ１０１を出発原料として、プロモータ／オペレータ
部位を単離した。この調節部位は９０ｂｐの長さのＥｃ
ｏＲＩ−ＨａｅIII 内に位置し、その中でプロモータは
ＥｃｏＲＩ−Ｈａｅ IIIの方向に指向している。およそ
２５μｇのプラスミドｐＢＰ１０１を制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで消化し、得られる２つの断片をゲル電気泳動（１．
４％アガロース）を用いて分離し、２００ｂｐの長さの
断片をゲルから電気泳動的に溶出する。この断片をＨａ
ｅ IIIで消化し、２つの消化産物を６％のポリアクリル
アミドゲルで分離し、９０ｂｐの長さの断片（プロモー
タ／オペレータ）を再びゲルから単離する。
る。 ａ）プロモータ／オペレータ断片の単離 Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのトリプトフ
ァンオペロンのおよそ１０００ｂｐを含むプラスミドｐ
ＢＲ１０１を出発原料として、プロモータ／オペレータ
部位を単離した。この調節部位は９０ｂｐの長さのＥｃ
ｏＲＩ−ＨａｅIII 内に位置し、その中でプロモータは
ＥｃｏＲＩ−Ｈａｅ IIIの方向に指向している。およそ
２５μｇのプラスミドｐＢＰ１０１を制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで消化し、得られる２つの断片をゲル電気泳動（１．
４％アガロース）を用いて分離し、２００ｂｐの長さの
断片をゲルから電気泳動的に溶出する。この断片をＨａ
ｅ IIIで消化し、２つの消化産物を６％のポリアクリル
アミドゲルで分離し、９０ｂｐの長さの断片（プロモー
タ／オペレータ）を再びゲルから単離する。
【００４７】ｂ）リボソーム結合配列（ＲＢＳ）の作製 ＲＢＳは３つの合成オリゴヌクレオチドから成る：６量
体５´−ＴＣＣＴＴＡ、１０量体５´−ＡＧＣＴＴＡＡ
ＡＣＣおよび１２量体５´−ＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡ
である。５００ｐｍｏｌｅの６量体を酵素ポリヌクレオ
チドキナーゼによりりん酸化し、放射性標識付けを行な
う（ＰａｒｔＡ参照）。この反応溶液を７０℃で１０分
間加熱し、キナーゼを失活させ、等モル量の１０量体お
よび１２量体（りん酸化していない）を添加した後に、
オリゴヌクレオチド混合物を９５℃に過熱し、次いで徐
々に（約３時間以上）３０−３５℃まで冷却し、オリゴ
ヌクレオチドを互いにハイブリダイズする：
体５´−ＴＣＣＴＴＡ、１０量体５´−ＡＧＣＴＴＡＡ
ＡＣＣおよび１２量体５´−ＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡ
である。５００ｐｍｏｌｅの６量体を酵素ポリヌクレオ
チドキナーゼによりりん酸化し、放射性標識付けを行な
う（ＰａｒｔＡ参照）。この反応溶液を７０℃で１０分
間加熱し、キナーゼを失活させ、等モル量の１０量体お
よび１２量体（りん酸化していない）を添加した後に、
オリゴヌクレオチド混合物を９５℃に過熱し、次いで徐
々に（約３時間以上）３０−３５℃まで冷却し、オリゴ
ヌクレオチドを互いにハイブリダイズする：
【化８】
【００４８】０．２５mMのＡＴＰおび５mMのＤＴＴを添
加することにより、酵素ＤＮＡリガーゼによって６量体
と１０量体とを共役結合する（ＰａｒｔＡ参照）。１２
量体および１０量体の５´末端にりん酸基がないため
に、重合体の合成は阻止される。この反応後に、リガー
ゼを失活するために７０℃に１０分間加熱し、次に０．
５mMのＡＴＰおよび５mMのＤＴＴを添加後、１２量体お
よび１０量体の５´末端も引き続くキナーゼ反応（Ｐａ
ｒｔＡ参照）によりりん酸化し、その結果としてＲＢＳ
が生成された。
加することにより、酵素ＤＮＡリガーゼによって６量体
と１０量体とを共役結合する（ＰａｒｔＡ参照）。１２
量体および１０量体の５´末端にりん酸基がないため
に、重合体の合成は阻止される。この反応後に、リガー
ゼを失活するために７０℃に１０分間加熱し、次に０．
５mMのＡＴＰおよび５mMのＤＴＴを添加後、１２量体お
よび１０量体の５´末端も引き続くキナーゼ反応（Ｐａ
ｒｔＡ参照）によりりん酸化し、その結果としてＲＢＳ
が生成された。
【００４９】ｃ）プロモータとＲＢＳとの結合 ９０ｂｐの長さのＥｃｏＲＩ−Ｈａｅ IIIプロモータ／
オペレータ断片１５ｐｍｏｌｅを標準条件（ＰａｒｔＡ
参照）の下で、６０ｐｍｏｌｅのＲＢＳと結合させる。
Ｈａｅ III切断で生成した９０ｂｐ断片の平滑末端のみ
がＲＢＳの平滑末端とのみ結合できるので、ＲＢＳをプ
ロモータの下流域に正しい方向で持つ分子のみが得られ
る。この反応後に、リガーゼを７０℃において１０分間
で失活させた後に、ＴＡ緩衝液濃度（ＰａｒｔＡ参照）
に調整し、さらに２００単位のＨｉｎｄ IIIおよび１０
単位のＥｃｏＲＩで消化する。これはリガーゼ反応で得
られた多重体（目的の反応に加えてＥｃｏＲＩ末端およ
びＨｉｎｄ III末端はいずれも互いに結合するから）を
単量体に再び変換するのに有利である。
オペレータ断片１５ｐｍｏｌｅを標準条件（ＰａｒｔＡ
参照）の下で、６０ｐｍｏｌｅのＲＢＳと結合させる。
Ｈａｅ III切断で生成した９０ｂｐ断片の平滑末端のみ
がＲＢＳの平滑末端とのみ結合できるので、ＲＢＳをプ
ロモータの下流域に正しい方向で持つ分子のみが得られ
る。この反応後に、リガーゼを７０℃において１０分間
で失活させた後に、ＴＡ緩衝液濃度（ＰａｒｔＡ参照）
に調整し、さらに２００単位のＨｉｎｄ IIIおよび１０
単位のＥｃｏＲＩで消化する。これはリガーゼ反応で得
られた多重体（目的の反応に加えてＥｃｏＲＩ末端およ
びＨｉｎｄ III末端はいずれも互いに結合するから）を
単量体に再び変換するのに有利である。
【００５０】次に、サンプルを６％ポリアクリルアミド
ゲルで分離し、１００ｂｐの長さのプロモータ／オペレ
ータＲＢＳ断片（ＥｃｏＲＩ末端とＨｉｎｄ III末端を
有する）をゲルから切り取り、電気泳動的に溶出して、
未結合の過剰ＲＢＳを分離する。その結果、発現プラス
ミドの発現に関与する部分が作製された（第３図参
照）。第３図に示されているヌクレオチド配列は文献か
ら知られているポリヌクレオチド合成法により完成でき
る。
ゲルで分離し、１００ｂｐの長さのプロモータ／オペレ
ータＲＢＳ断片（ＥｃｏＲＩ末端とＨｉｎｄ III末端を
有する）をゲルから切り取り、電気泳動的に溶出して、
未結合の過剰ＲＢＳを分離する。その結果、発現プラス
ミドの発現に関与する部分が作製された（第３図参
照）。第３図に示されているヌクレオチド配列は文献か
ら知られているポリヌクレオチド合成法により完成でき
る。
【００５１】ｄ）プロモータ／オペレータＲＢＳ断片の
ｐＢＲ３２２への挿入 約２μｇのプラスミドｐＢＲ３２２を制限酵素ＥｃｏＲ
ＩおよびＨｉｎｄ IIIにより切断し、２つの断片を得
る：４３３２ｂｐの大断片と２９ｂｐの小断片である。
０．８％アガロースゲル電気泳動により、大断片を小断
片から分離し、ゲルから切り出し、溶出する。次にこの
断片約０．４ｐmoleを１０ｐmoleのプロモータ／オペレ
ータＲＢＳ断片（ＰａｒｔＡ参照）と結合させる。ｐＢ
Ｒ３２２断片の両端に、相互に合わない−重鎖が出てい
るため、この断片間で結合することは不可能である。プ
ロモータ／オペレータＲＢＳ断片はプラスミド中で一方
向にのみ結合されるため、ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄ III
部位からテトラサイクリン耐性遺伝子の方向に展開す
る。
ｐＢＲ３２２への挿入 約２μｇのプラスミドｐＢＲ３２２を制限酵素ＥｃｏＲ
ＩおよびＨｉｎｄ IIIにより切断し、２つの断片を得
る：４３３２ｂｐの大断片と２９ｂｐの小断片である。
０．８％アガロースゲル電気泳動により、大断片を小断
片から分離し、ゲルから切り出し、溶出する。次にこの
断片約０．４ｐmoleを１０ｐmoleのプロモータ／オペレ
ータＲＢＳ断片（ＰａｒｔＡ参照）と結合させる。ｐＢ
Ｒ３２２断片の両端に、相互に合わない−重鎖が出てい
るため、この断片間で結合することは不可能である。プ
ロモータ／オペレータＲＢＳ断片はプラスミド中で一方
向にのみ結合されるため、ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄ III
部位からテトラサイクリン耐性遺伝子の方向に展開す
る。
【００５２】ｅ）発現プラスミドｐＥＲ１０３による大
腸菌の形質転換 Ｅ．ｃｏＩｉ ＨＢ１０１を文献（Ｄｗｏｒｋｉｎおよ
びＤａｗｉｄ，Ｄｅｕ，Ｂｉｏｌ．７６巻、４３５−４
４８頁；１９８０年）から知られている方法に従い、最
後のリガーゼ反応液を用いて形質転換し、転換株はアン
ピリジン含有の寒天培地で選択する。この目的のために
は、Ｅ．ｃｏＩｉ ＨＢ１０１を、およそ２×１０8 ｃ
ｅｌｌｓ／mlの濃度まで培養する。細胞を集め、１００
mMの塩化カルウシム溶液中にけん濁する（０℃で２０分
間）。次に、菌体をリガーゼ反応液とともに０−４℃で
５分間、さらに３７℃で５分間、インキュベートする。
０．５−１mlのＬ培地を添加後、さらに３７℃で１５−
３０分間インキュベーションを行なう。
腸菌の形質転換 Ｅ．ｃｏＩｉ ＨＢ１０１を文献（Ｄｗｏｒｋｉｎおよ
びＤａｗｉｄ，Ｄｅｕ，Ｂｉｏｌ．７６巻、４３５−４
４８頁；１９８０年）から知られている方法に従い、最
後のリガーゼ反応液を用いて形質転換し、転換株はアン
ピリジン含有の寒天培地で選択する。この目的のために
は、Ｅ．ｃｏＩｉ ＨＢ１０１を、およそ２×１０8 ｃ
ｅｌｌｓ／mlの濃度まで培養する。細胞を集め、１００
mMの塩化カルウシム溶液中にけん濁する（０℃で２０分
間）。次に、菌体をリガーゼ反応液とともに０−４℃で
５分間、さらに３７℃で５分間、インキュベートする。
０．５−１mlのＬ培地を添加後、さらに３７℃で１５−
３０分間インキュベーションを行なう。
【００５３】１９の形質転換株を選択し、制限酵素Ｈａ
ｅ IIIを用いてプロモータ／オペレータＲＢＳ断片の有
無を確認した。１９２ｂｐの長さのｐＢＲ３２２／Ｈａ
ｅ III断片が欠失し、２６４ｂｐ断片と置き代っていた
（ｐＢＲ３２２中のＥｃｏＲＩ部位の左側のＨａｅ III
部位からの１６ｂｐ＋１０３ｂｐプロモータ／オペレー
タＲＢＳ断片＋ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄ III部位から右
側に次のＨａｅ部位までの１４５ｂｐ）。調べた１９の
形質転換株中、１８株が予想どおりの消化パターンを示
した（第２図参照）。
ｅ IIIを用いてプロモータ／オペレータＲＢＳ断片の有
無を確認した。１９２ｂｐの長さのｐＢＲ３２２／Ｈａ
ｅ III断片が欠失し、２６４ｂｐ断片と置き代っていた
（ｐＢＲ３２２中のＥｃｏＲＩ部位の左側のＨａｅ III
部位からの１６ｂｐ＋１０３ｂｐプロモータ／オペレー
タＲＢＳ断片＋ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄ III部位から右
側に次のＨａｅ部位までの１４５ｂｐ）。調べた１９の
形質転換株中、１８株が予想どおりの消化パターンを示
した（第２図参照）。
【００５４】ｆ）発現プラスミドｐＥＲ１０３のプロモ
ータ／オペレータＲＢＳ部分の配列分析 作製された発現プラスミドが疑いもなく正しいことを証
明するために、この中の一つのプラスミド（ｐＥＲ１０
３）を分析して、そのプロモータ／オペレータＲＢＳ部
分の配列およびｐＢＲ３２２中での位置を確立した。塩
基配列の分析はｍａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ７４巻、５６０−５
６４頁：１９７７年）による文献から知られている方法
で行ない、ＥｃｏＲＩ部位からＨｉｎｄ III部位の方向
（それ以上）で行ない、また、Ｈｉｎｄ III部位からＥ
ｃｏＲＩの方向（その先きまで）で行なった。第３図に
示す塩基配列が得られた。
ータ／オペレータＲＢＳ部分の配列分析 作製された発現プラスミドが疑いもなく正しいことを証
明するために、この中の一つのプラスミド（ｐＥＲ１０
３）を分析して、そのプロモータ／オペレータＲＢＳ部
分の配列およびｐＢＲ３２２中での位置を確立した。塩
基配列の分析はｍａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ７４巻、５６０−５
６４頁：１９７７年）による文献から知られている方法
で行ない、ＥｃｏＲＩ部位からＨｉｎｄ III部位の方向
（それ以上）で行ない、また、Ｈｉｎｄ III部位からＥ
ｃｏＲＩの方向（その先きまで）で行なった。第３図に
示す塩基配列が得られた。
【００５５】従って、ｐＥＲ１０３はＳｅｒｒａｔｉａ
ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのトリプトファンオペロンのプ
ロモータ／オペレータ部位と合成ＲＢＳを有する発現プ
ラスミドである。この新規な発現プラスミドは、そのＨ
ｉｎｄ III部位に挿入した遺伝子の転写を促進し、この
転写生成物の翻訳を効率よく可能にする。以下の例２に
それを示す。
ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのトリプトファンオペロンのプ
ロモータ／オペレータ部位と合成ＲＢＳを有する発現プ
ラスミドである。この新規な発現プラスミドは、そのＨ
ｉｎｄ III部位に挿入した遺伝子の転写を促進し、この
転写生成物の翻訳を効率よく可能にする。以下の例２に
それを示す。
【００５６】例 ２ インタフェロン生産プラスミドｐＥＲ３３の作製 ａ．アミノ末端システインのコドンを除いて、成熟イン
タフェロンをコードする遺伝子の作製 １Ｆ７のＰｓｔ１断片の約１μｇを制限酵素Ｓａｕ３Ａ
で消化し、アミノ末端システインの次のＳａｕ３Ａ部位
からＡｖａII部位を含んで次のＳａｕ３Ａまで伸びてい
る、１７７ｂｐの長さの断片を６％ポリアクリルアミド
ゲルから単離した。これを１単位のアルカリフォスフア
ターゼで処理し（Ｐａｒｔ Ａ参照）フェノールおよび
エーテル抽出によってフォスフアターゼを除去した後
に、エタノール沈でんを行なう。この断片を続いてＡｖ
ａIIで切断し、目的の３４ｂｐのＳａｕ ３Ａ−Ａｖａ
II断片および１４３ｂｐの断片を得た。
タフェロンをコードする遺伝子の作製 １Ｆ７のＰｓｔ１断片の約１μｇを制限酵素Ｓａｕ３Ａ
で消化し、アミノ末端システインの次のＳａｕ３Ａ部位
からＡｖａII部位を含んで次のＳａｕ３Ａまで伸びてい
る、１７７ｂｐの長さの断片を６％ポリアクリルアミド
ゲルから単離した。これを１単位のアルカリフォスフア
ターゼで処理し（Ｐａｒｔ Ａ参照）フェノールおよび
エーテル抽出によってフォスフアターゼを除去した後
に、エタノール沈でんを行なう。この断片を続いてＡｖ
ａIIで切断し、目的の３４ｂｐのＳａｕ ３Ａ−Ａｖａ
II断片および１４３ｂｐの断片を得た。
【００５７】これと平行して、１７７ｂｐのＳａｕ ３
Ａ断片中のＡｖａII部位から終了コドンの後までの、イ
ンタフェロン特有の６４６ｂｐ ＡｖａII断片を、プラ
スミド１Ｆ７から調整する。この６４６ｂｐのＡｖａII
断片約０．５μｇと、３４ｂｐおよび１４３ｂｐのＳａ
ｕ ３Ａ−ＡｖａII断片混合物とを酵素ＤＮＡ−リガー
ゼ（Ｐａｒｔ Ａ参照）で接着末端結合を行なう。その
結果として、共有結合され、ＡｖａII−Ｓａｕ ３Ａ断
片がくっついたＡｖａII断片が得られる。ＡｖａII−Ｓ
ａｕ ３Ａ断片がＡｖａII断片に結合すると、もはやそ
れ以上のリゲーションは起らない。それはＳａｕ ３Ａ
末端が脱りん酸されているからである。この結合反応の
後に、７０℃で１０分間加熱し酵素を失活させ、次に５
mMのＤＴＴおよび０．２５mMのＡＴＰを添加し、脱りん
酸しているＳａｕ ３Ａ末端をりん酸化する（Ｐａｒｔ
Ａ）。この反応溶液を６％ポリアクリルアミドゲルに
より分離し、７００〜８００ｂｐ区分（２つのＡｖａII
−Ｓａｕ ３Ａ断片のついた６４６ｂｐのＡｖａII断
片）と１３００〜１５００ｂｐ区分（この２つの２４６
ｂｐのＡｖａII断片が互いに結合し、ＡｖａII−Ｓａｕ
３Ａ断片がついたもの）の分子を溶出する。
Ａ断片中のＡｖａII部位から終了コドンの後までの、イ
ンタフェロン特有の６４６ｂｐ ＡｖａII断片を、プラ
スミド１Ｆ７から調整する。この６４６ｂｐのＡｖａII
断片約０．５μｇと、３４ｂｐおよび１４３ｂｐのＳａ
ｕ ３Ａ−ＡｖａII断片混合物とを酵素ＤＮＡ−リガー
ゼ（Ｐａｒｔ Ａ参照）で接着末端結合を行なう。その
結果として、共有結合され、ＡｖａII−Ｓａｕ ３Ａ断
片がくっついたＡｖａII断片が得られる。ＡｖａII−Ｓ
ａｕ ３Ａ断片がＡｖａII断片に結合すると、もはやそ
れ以上のリゲーションは起らない。それはＳａｕ ３Ａ
末端が脱りん酸されているからである。この結合反応の
後に、７０℃で１０分間加熱し酵素を失活させ、次に５
mMのＤＴＴおよび０．２５mMのＡＴＰを添加し、脱りん
酸しているＳａｕ ３Ａ末端をりん酸化する（Ｐａｒｔ
Ａ）。この反応溶液を６％ポリアクリルアミドゲルに
より分離し、７００〜８００ｂｐ区分（２つのＡｖａII
−Ｓａｕ ３Ａ断片のついた６４６ｂｐのＡｖａII断
片）と１３００〜１５００ｂｐ区分（この２つの２４６
ｂｐのＡｖａII断片が互いに結合し、ＡｖａII−Ｓａｕ
３Ａ断片がついたもの）の分子を溶出する。
【００５８】ｂ．下記式のオリゴヌクレオチド複合体の
調製
調製
【化９】
【００５９】４個の合成オリゴヌクレオチド、即ち、１
４塩基体５´ＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡ、１２塩基
体５´ＡＧＣＴＴＡＡＡＧＡＴＧ、９塩基体５´ＣＡＧ
ＡＴＣＡＣＡおよび８塩基体５´ＣＡＴＣＴＴＴＡ、を
以下のように反応させる。８塩基体、９塩基体および１
４塩基体の各２５０ｐmoleをりん酸化し（ＰａｒｔＡ参
照）、反応後に、９５℃に加熱してキナーゼを失活させ
た後に、非りん酸化１２塩基体２５０ｐmoleを添加し、
このオリゴヌクレオチド混合物を徐々に３５℃に冷却し
（およそ３時間余りかけて）、オリゴヌクレオチドのハ
イブリダイゼーションを行なう。次に、５mMのＤＴＴお
よび０．２５mMのＡＴＰを添加後、オリゴヌクレオチド
を相互に結合させる（平滑末端結合、Ｐａｒｔ Ａ参
照）。１２塩基体の５´末端にりん酸基がないために、
２量体の形成は阻止される。１４塩基体の突出末端は相
補性がないために、二量体形成は起さない。
４塩基体５´ＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡ、１２塩基
体５´ＡＧＣＴＴＡＡＡＧＡＴＧ、９塩基体５´ＣＡＧ
ＡＴＣＡＣＡおよび８塩基体５´ＣＡＴＣＴＴＴＡ、を
以下のように反応させる。８塩基体、９塩基体および１
４塩基体の各２５０ｐmoleをりん酸化し（ＰａｒｔＡ参
照）、反応後に、９５℃に加熱してキナーゼを失活させ
た後に、非りん酸化１２塩基体２５０ｐmoleを添加し、
このオリゴヌクレオチド混合物を徐々に３５℃に冷却し
（およそ３時間余りかけて）、オリゴヌクレオチドのハ
イブリダイゼーションを行なう。次に、５mMのＤＴＴお
よび０．２５mMのＡＴＰを添加後、オリゴヌクレオチド
を相互に結合させる（平滑末端結合、Ｐａｒｔ Ａ参
照）。１２塩基体の５´末端にりん酸基がないために、
２量体の形成は阻止される。１４塩基体の突出末端は相
補性がないために、二量体形成は起さない。
【００６０】この結合オリゴヌクレオチド複合体の一部
分（２５ｐmole）をＳａｕ ３Ａ８０単位で消化し、イ
ンタフエロン遺伝子に適合するＳａｕ ３Ａ末端を作製
する。サンプルを７５℃で１０分間加熱し、フェノール
で抽出してから、エタノール沈でんを行なう。このよう
にしてインタフェロン遺伝子を本発明に係るｐＥＲ１０
３のＨｉｎｄ III部位と結合するリンカ−断片が得られ
る。
分（２５ｐmole）をＳａｕ ３Ａ８０単位で消化し、イ
ンタフエロン遺伝子に適合するＳａｕ ３Ａ末端を作製
する。サンプルを７５℃で１０分間加熱し、フェノール
で抽出してから、エタノール沈でんを行なう。このよう
にしてインタフェロン遺伝子を本発明に係るｐＥＲ１０
３のＨｉｎｄ III部位と結合するリンカ−断片が得られ
る。
【００６１】ｃ．インタフェロン遺伝子とオリゴヌクレ
オチド複合体との結合およびｐＥＲ１０３への結合 およそ１ｐmoleの分子に相当する単したインタフェロン
断片をＳａｕ ３Ａの接着末端結合によって、Ｓａｕ
３Ａ切断オリゴヌクレオチド複合体（およそ２５ｐmol
e）と連結する。ここでも、オリゴヌクレオチド複合体
（１２塩基体）のＨｉｎｄ III末端にりん酸基がないた
めに、重合体の生成が阻止される。
オチド複合体との結合およびｐＥＲ１０３への結合 およそ１ｐmoleの分子に相当する単したインタフェロン
断片をＳａｕ ３Ａの接着末端結合によって、Ｓａｕ
３Ａ切断オリゴヌクレオチド複合体（およそ２５ｐmol
e）と連結する。ここでも、オリゴヌクレオチド複合体
（１２塩基体）のＨｉｎｄ III末端にりん酸基がないた
めに、重合体の生成が阻止される。
【００６２】遊離したＨｉｎｄ III末端を有するオリゴ
ヌクレオチド複合体を両端につけたインタフェロン分子
が得られる。リガーゼを熱変性させ、５mMのＤＴＴおよ
び０．２５mMのＡＴＰを添加した後に、これらの末端を
りん酸化し（Ｐａｒｔ Ａ参照）、続いてイソプロパノ
ール沈でんを行ない（Ｐａｒｔ Ａ参照）、リガーゼ反
応で生成したオリゴヌクレオチド複合体の二量体を分離
する。ここで生成物をフォスフアターゼ処理し、ｐＥＲ
１０３のＨｉｎｄ III切断物０．０５μｇと結合させる
（接着末端結合についてはＰａｒｔ Ａ参照）。プラス
ミドのＨｉｎｄIII切断物をフォスフアターゼ処理（Ｐ
ａｒｔ Ａ）することにより、リガーゼ反応中の閉環を
阻止できる。このようにしてインタフェロン生産プラス
ミド（遺伝子の開始点に６４６ｂｐのＡｖａII断片を結
合した３４ｂｐ Ｓａｕ ３Ａ−ＡｖａII断片を獲得し
たプラスミド）を５０％含むプラスミド混合物が得られ
る−例２ａ参照。
ヌクレオチド複合体を両端につけたインタフェロン分子
が得られる。リガーゼを熱変性させ、５mMのＤＴＴおよ
び０．２５mMのＡＴＰを添加した後に、これらの末端を
りん酸化し（Ｐａｒｔ Ａ参照）、続いてイソプロパノ
ール沈でんを行ない（Ｐａｒｔ Ａ参照）、リガーゼ反
応で生成したオリゴヌクレオチド複合体の二量体を分離
する。ここで生成物をフォスフアターゼ処理し、ｐＥＲ
１０３のＨｉｎｄ III切断物０．０５μｇと結合させる
（接着末端結合についてはＰａｒｔ Ａ参照）。プラス
ミドのＨｉｎｄIII切断物をフォスフアターゼ処理（Ｐ
ａｒｔ Ａ）することにより、リガーゼ反応中の閉環を
阻止できる。このようにしてインタフェロン生産プラス
ミド（遺伝子の開始点に６４６ｂｐのＡｖａII断片を結
合した３４ｂｐ Ｓａｕ ３Ａ−ＡｖａII断片を獲得し
たプラスミド）を５０％含むプラスミド混合物が得られ
る−例２ａ参照。
【００６３】ｄ．Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１の形質転換
およびインタフェロン生産に関する分析 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（Ｄｗ
ｏｒｋｉｎ ａｎｄＤａｗｉｄ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．７
６巻，４３５−４４８頁：１９８０年）の形質転換に、
例１ｅと同様にして、例２ｃにより作製されたプラスミ
ド混合物を用いた。得られた形質転換株の約２０％が挿
入部分を有し（残りは環状のｐＥＲ１０３プラスミドで
ある）、そのいくつかについてインタフェロン発現を分
析した。
およびインタフェロン生産に関する分析 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（Ｄｗ
ｏｒｋｉｎ ａｎｄＤａｗｉｄ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．７
６巻，４３５−４４８頁：１９８０年）の形質転換に、
例１ｅと同様にして、例２ｃにより作製されたプラスミ
ド混合物を用いた。得られた形質転換株の約２０％が挿
入部分を有し（残りは環状のｐＥＲ１０３プラスミドで
ある）、そのいくつかについてインタフェロン発現を分
析した。
【００６４】そのために、１００mlのバクテリア培養を
Ｍ９最少培地にトリプトファン以外の全てのアミノ酸
（各アミノ酸当り２０μｇ／ml）、チアミン（１μｇ／
ml）、グルコース（０．２％）およびトリプトファンオ
ペロンの誘発剤インドール−（３）−アクリル酸（ＩＡ
Ａ，２０μｇ／ml：Ｈａｌｌｅ ｗｅｌｌおよびＥｍｔ
ａｇｅ，Ｇｅｎｅ．９巻，２４−４７頁：１９８０年）
を添加し、ＯＤが０．６−０．８となるまで培養する。
バクテリアを７，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離し
て集菌し、トリス塩酸緩衝液、pH８、３０mM ＮａＣｌ
にて１回洗い、同緩衝液１．５ml中にけん濁する。氷の
中で１mg／mlのリゾチームと３０分間インキュベートし
た後に、菌体を５回凍結および融解し、菌体区分を４
０，０００ｒｐｍで１時間の遠心分離によって除去す
る。上澄液を濾過滅菌し、Ｖ３細胞とＶＳＶとを用いた
プラーク阻止試験により、インタフェロン活性をテスト
する。全てのクローン（挿入を有する）の約半分がかな
りのインタフェロン発現を示した：培養物１リットル当
り２×１０8 単位（国際対照単位）。
Ｍ９最少培地にトリプトファン以外の全てのアミノ酸
（各アミノ酸当り２０μｇ／ml）、チアミン（１μｇ／
ml）、グルコース（０．２％）およびトリプトファンオ
ペロンの誘発剤インドール−（３）−アクリル酸（ＩＡ
Ａ，２０μｇ／ml：Ｈａｌｌｅ ｗｅｌｌおよびＥｍｔ
ａｇｅ，Ｇｅｎｅ．９巻，２４−４７頁：１９８０年）
を添加し、ＯＤが０．６−０．８となるまで培養する。
バクテリアを７，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離し
て集菌し、トリス塩酸緩衝液、pH８、３０mM ＮａＣｌ
にて１回洗い、同緩衝液１．５ml中にけん濁する。氷の
中で１mg／mlのリゾチームと３０分間インキュベートし
た後に、菌体を５回凍結および融解し、菌体区分を４
０，０００ｒｐｍで１時間の遠心分離によって除去す
る。上澄液を濾過滅菌し、Ｖ３細胞とＶＳＶとを用いた
プラーク阻止試験により、インタフェロン活性をテスト
する。全てのクローン（挿入を有する）の約半分がかな
りのインタフェロン発現を示した：培養物１リットル当
り２×１０8 単位（国際対照単位）。
【００６５】ｅ．インタフェロン生産プラスミドｐＥＲ
３３の塩基配列分析 インタフェロン生産クローンの一つ（ｐＥＲ３３）を選
んで、作製されたプラスミドの正しさを確立するため
に、プロモータ／オペレータ部分から挿入遺伝子への配
列に関して分析した。この配列の分析は、またｍａｘａ
ｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ Ａｃ
ａｄ Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７４巻，５６０−５６４
頁：１９７７年）によって行ない、３´末端を放射標識
したＥｃｏＲＩ部位からインタフェロン遺伝子の方向に
実施した。予想どおりの配列が得られた。その切り出し
部分を第５図に示す。この部分にｐＥＲ３３を作製する
ために使用した全てのヌクレオチド断片が見られる。
３３の塩基配列分析 インタフェロン生産クローンの一つ（ｐＥＲ３３）を選
んで、作製されたプラスミドの正しさを確立するため
に、プロモータ／オペレータ部分から挿入遺伝子への配
列に関して分析した。この配列の分析は、またｍａｘａ
ｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ Ａｃ
ａｄ Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７４巻，５６０−５６４
頁：１９７７年）によって行ない、３´末端を放射標識
したＥｃｏＲＩ部位からインタフェロン遺伝子の方向に
実施した。予想どおりの配列が得られた。その切り出し
部分を第５図に示す。この部分にｐＥＲ３３を作製する
ために使用した全てのヌクレオチド断片が見られる。
【００６６】以上の性質より、本発明に係り作製された
発現プラスミドｐＥＲ１０３が、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍ
ａｒｃｅｓｃｅｎｓのトリプトファンオペロンの配列と
合成リボソーム結合配列とを有することが証明された。
白血球インタフェロンの例から、発現プラスミドｐＥＲ
１０３に適当な形でとり込まれた遺伝子が高度な発現率
を示すことが明かとなった。
発現プラスミドｐＥＲ１０３が、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍ
ａｒｃｅｓｃｅｎｓのトリプトファンオペロンの配列と
合成リボソーム結合配列とを有することが証明された。
白血球インタフェロンの例から、発現プラスミドｐＥＲ
１０３に適当な形でとり込まれた遺伝子が高度な発現率
を示すことが明かとなった。
【００６７】発現プラスミドｐＥＲ１０３はＥｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２，ＨＢ１０１に入れ
て、１９８３年１０月２７日にＤＳＭ Ｎｏ．２７７３
として“Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｇｒｉｅｓｅｂａｃｈ
ｓｔｒａｓｓｅ ８，Ｄ−３４００ Ｇｏｔｔｉｎｇｅ
ｎ（ドイツ連邦共和国）”に寄託され、ブタペスト条約
に基づく国際寄託受託証を受けている。
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２，ＨＢ１０１に入れ
て、１９８３年１０月２７日にＤＳＭ Ｎｏ．２７７３
として“Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｇｒｉｅｓｅｂａｃｈ
ｓｔｒａｓｓｅ ８，Ｄ−３４００ Ｇｏｔｔｉｎｇｅ
ｎ（ドイツ連邦共和国）”に寄託され、ブタペスト条約
に基づく国際寄託受託証を受けている。
【００６８】例 ３ インタフェロンプラスミドｐＥＲ２１／２の作製 プラスミドｐＥＲ２１／１の作製は第６図に図示してあ
る。 ａ）ｐＥＲ３３からのＩＦＮαＡ遺伝子の調製 ２μｇのｐＥＲ３３を用い、制限酵素ＥｃｏＲＩおよび
Ｂａｍ ＨＩにより切断し、およそ１３００ｂｐおよび
４０００ｂｐの長さの２つの断片を得る。これらの断片
を１．２％アガロースゲルで電気泳動的に分離する。短
い方の断片はゲルから電気溶出にて単離し、このＤＮＡ
の両端をｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ
の各１．２５nmolと２単位のＤＮＡポリメラーゼ１のク
レナウ断片とを添加することにより平滑末端とする。Ｄ
ＮＡはフェノール抽出およびエタノール溶液からの沈で
んによって精製し、１５μｌの水に溶解する。
る。 ａ）ｐＥＲ３３からのＩＦＮαＡ遺伝子の調製 ２μｇのｐＥＲ３３を用い、制限酵素ＥｃｏＲＩおよび
Ｂａｍ ＨＩにより切断し、およそ１３００ｂｐおよび
４０００ｂｐの長さの２つの断片を得る。これらの断片
を１．２％アガロースゲルで電気泳動的に分離する。短
い方の断片はゲルから電気溶出にて単離し、このＤＮＡ
の両端をｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ
の各１．２５nmolと２単位のＤＮＡポリメラーゼ１のク
レナウ断片とを添加することにより平滑末端とする。Ｄ
ＮＡはフェノール抽出およびエタノール溶液からの沈で
んによって精製し、１５μｌの水に溶解する。
【００６９】およそ１５ｐmol のＥｃｏＲＩリンカー
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎ
ｃ．）の５´末端を５μｌの反応液中でγ−32Ｐ−ＡＴ
ＰおよびＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼの添加によ
り、りん酸化する。キナーゼを熱失活させた後に、ＤＮ
Ａ、５nmolのＡＴＰおよび０．１単位のＴ４リガーゼを
加え、１４℃で１６時間インキュベードする。反応生成
物をインプロパノール沈でんにより低分子物質から精製
する。ＤＮＡを２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩにて切断
し、再びインプロパノール沈でんによって精製し、次い
で１０μｌの水に溶解する。
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎ
ｃ．）の５´末端を５μｌの反応液中でγ−32Ｐ−ＡＴ
ＰおよびＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼの添加によ
り、りん酸化する。キナーゼを熱失活させた後に、ＤＮ
Ａ、５nmolのＡＴＰおよび０．１単位のＴ４リガーゼを
加え、１４℃で１６時間インキュベードする。反応生成
物をインプロパノール沈でんにより低分子物質から精製
する。ＤＮＡを２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩにて切断
し、再びインプロパノール沈でんによって精製し、次い
で１０μｌの水に溶解する。
【００７０】ｂ）プラスミドｐＥＲ３３の線状化 約２μｇのプラスミドｐＥＲ３３を制限酵素ＥｃｏＲＩ
で処理する。続いて、アルカリフォスフアターゼを加
え、５´のりん酸を取り除く。約５３００ｂｐの長さの
線状ＤＮＡを１．２％アガロースゲル電気泳動により精
製し、残る未切断ｐＥＲ３３を電気溶出する。ＤＮＡは
フェノールおよびエーテルで抽出し、エタノール溶液か
ら沈でんさせ、１０μｌの水に溶解する。
で処理する。続いて、アルカリフォスフアターゼを加
え、５´のりん酸を取り除く。約５３００ｂｐの長さの
線状ＤＮＡを１．２％アガロースゲル電気泳動により精
製し、残る未切断ｐＥＲ３３を電気溶出する。ＤＮＡは
フェノールおよびエーテルで抽出し、エタノール溶液か
ら沈でんさせ、１０μｌの水に溶解する。
【００７１】ｃ）線状ｐＥＲ３３への追加ＩＦＮαＡ遺
伝子の結合 ＥｃｏＲＩリンカーを含有し、ＩＦＮαＡ遺伝子および
調製要素を含有するＤＮＡ部分４μｌを相互に、および
０．５μｌのＥｃｏＲＩで線状化し、脱りん酸したｐＥ
Ｒ３３と、０．１単位のＴ４リガーゼを用い２０μｌの
反応液中で結合させる。１４℃で１６時間の反応後に、
この酵素を６８℃に加熱して失活させる。
伝子の結合 ＥｃｏＲＩリンカーを含有し、ＩＦＮαＡ遺伝子および
調製要素を含有するＤＮＡ部分４μｌを相互に、および
０．５μｌのＥｃｏＲＩで線状化し、脱りん酸したｐＥ
Ｒ３３と、０．１単位のＴ４リガーゼを用い２０μｌの
反応液中で結合させる。１４℃で１６時間の反応後に、
この酵素を６８℃に加熱して失活させる。
【００７２】ｄ）Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１の形質転
換、並びにインタフェロン生産に関する分析 Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を例３ｃで得られたＤＮＡを
用い、例１ｅと同様の方法で、形質転換する。このよう
にして得られた２つのクローンを例２ｄと同様に、イン
タフェロン発現に係り、プラーク阻止試験で調べたクロ
ーンｐＥＲ３３が１リットルの培養液当り２００×１０
6 単位以下のインタフェロンを示したのに対し、ｐＥＲ
２１／１と命名した新しいクローンの一つによって３０
０×１０ 6 単位以上が得られた。
換、並びにインタフェロン生産に関する分析 Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を例３ｃで得られたＤＮＡを
用い、例１ｅと同様の方法で、形質転換する。このよう
にして得られた２つのクローンを例２ｄと同様に、イン
タフェロン発現に係り、プラーク阻止試験で調べたクロ
ーンｐＥＲ３３が１リットルの培養液当り２００×１０
6 単位以下のインタフェロンを示したのに対し、ｐＥＲ
２１／１と命名した新しいクローンの一つによって３０
０×１０ 6 単位以上が得られた。
【００７３】ｅ）ｐＥＲ２１／１の制限酵素分析 プラスミドｐＥＲ２１／１を比較的多量に単離し、Ｈｉ
ｎｄ IIIの制限酵素消化により分析した。ｐＥＲ３３の
ＥｃｏＲＩ部位に挿入をされたＤＮＡは２つの同じＥｃ
ｏＲＩ末端を有することから、ｐＥＲ２１／１中で２つ
の方向での挿入が考えられる。ｐＥＲ２１／１中でイン
タフェロン遺伝子が同一方向であるならば、Ｈｉｎｄ I
IIで制限消化すると約４１００，９５０（２つの断片）
および４５０ｂｐの大きさの断片が得られる筈である。
しかし、もし２個の遺伝子が逆方向にあるならば、約４
３５０，９５０（２つの断片）、および２００ｂｐの大
きさの断片が予想される。約２μｇのｐＥＲ２１／１を
制限酵素Ｈｉｎｄ IIIで消化し、続いて１．４％アガロ
ースゲル電気泳動を行なうと、約４１００，９５０およ
び４５０ｂｐの断片が得られた。従って、２つの１ＦＮ
αＡ遺伝子は互いに並行に結合していることが判った
（第６図参照）。
ｎｄ IIIの制限酵素消化により分析した。ｐＥＲ３３の
ＥｃｏＲＩ部位に挿入をされたＤＮＡは２つの同じＥｃ
ｏＲＩ末端を有することから、ｐＥＲ２１／１中で２つ
の方向での挿入が考えられる。ｐＥＲ２１／１中でイン
タフェロン遺伝子が同一方向であるならば、Ｈｉｎｄ I
IIで制限消化すると約４１００，９５０（２つの断片）
および４５０ｂｐの大きさの断片が得られる筈である。
しかし、もし２個の遺伝子が逆方向にあるならば、約４
３５０，９５０（２つの断片）、および２００ｂｐの大
きさの断片が予想される。約２μｇのｐＥＲ２１／１を
制限酵素Ｈｉｎｄ IIIで消化し、続いて１．４％アガロ
ースゲル電気泳動を行なうと、約４１００，９５０およ
び４５０ｂｐの断片が得られた。従って、２つの１ＦＮ
αＡ遺伝子は互いに並行に結合していることが判った
（第６図参照）。
【００７４】例 ４ インタフェロン生産プラスミドｐａｒｐＥＲ３３の作製 プラスミドｐａｒ ｐＥＲ３３の作製は第７図に図示す
る。 ａ）ｐａｒ−部位の調製 およそ２００ｐmol のＥｃｏＲＩリンカー（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）を９単位の
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび１０nmolのＡＴＰ
を含む２０μｌの反応液中で、その末端をりん酸化し、
この反応後に、酵素を熱失活させる。プラスミドｐＰＭ
３１の８μｇを制限酵素Ａｖａ １で切断する。線状に
したプラスミドの両端を、ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴ
Ｐ，ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを各５nmolとポリメラーゼ
１のクレナウ断片４単位とを加えて平滑末端に変換す
る。ＤＮＡをフェノール抽出およびエタノール溶液から
の沈でんにより精製し、４０μｌの水に溶解する。
る。 ａ）ｐａｒ−部位の調製 およそ２００ｐmol のＥｃｏＲＩリンカー（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）を９単位の
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび１０nmolのＡＴＰ
を含む２０μｌの反応液中で、その末端をりん酸化し、
この反応後に、酵素を熱失活させる。プラスミドｐＰＭ
３１の８μｇを制限酵素Ａｖａ １で切断する。線状に
したプラスミドの両端を、ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴ
Ｐ，ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを各５nmolとポリメラーゼ
１のクレナウ断片４単位とを加えて平滑末端に変換す
る。ＤＮＡをフェノール抽出およびエタノール溶液から
の沈でんにより精製し、４０μｌの水に溶解する。
【００７５】ＥｃｏＲＩリンカーを、線状化して平滑末
端にしたＤＮＡと共に、酵素を熱失活させた後に、６nm
olのＡＴＰを含む７０μｌの反応溶液中で１４℃におい
て１６時間処理し、この溶液を５０mM ＮａＣｌ、およ
び５０mMトリス−塩酸でpH７．６、に調製し、このＤＮ
Ａを３００単位のＥｃｏＲＩで処理する。２時間のイン
キュベーション後に、制限酵素を熱変性し、ＤＮＡを
１．４％のアガロースゲルの電気泳動で分離する。およ
そ４００ｂｐの長さの、ｐａｒ部位を含むＤＮＡ画分を
ゲルより電気溶出し、フェノール抽出およびエタノール
溶液からの沈でんにより精製し、５０μｌの水に溶解す
る。このＤＮＡ画分はその両端にＥｃｏＲＩ特有の突出
を有する。
端にしたＤＮＡと共に、酵素を熱失活させた後に、６nm
olのＡＴＰを含む７０μｌの反応溶液中で１４℃におい
て１６時間処理し、この溶液を５０mM ＮａＣｌ、およ
び５０mMトリス−塩酸でpH７．６、に調製し、このＤＮ
Ａを３００単位のＥｃｏＲＩで処理する。２時間のイン
キュベーション後に、制限酵素を熱変性し、ＤＮＡを
１．４％のアガロースゲルの電気泳動で分離する。およ
そ４００ｂｐの長さの、ｐａｒ部位を含むＤＮＡ画分を
ゲルより電気溶出し、フェノール抽出およびエタノール
溶液からの沈でんにより精製し、５０μｌの水に溶解す
る。このＤＮＡ画分はその両端にＥｃｏＲＩ特有の突出
を有する。
【００７６】ｂ）プラスミドｐＥＲ３３の線状化 約２μｇのｐＥＲ３３を制限酵素ＥｃｏＲＩで処理す
る。続いてアルカリフォスフアターゼを添加し、５´−
りん酸基を除去する。およそ５３００ｂｐの長さの線状
ＤＮＡを、１．２％アガロースゲル電気泳動および電気
溶出により、未切断のｐＥＲ３３と分離する。このＤＮ
Ａをフェノールおよびエーテルで抽出し、エタノール溶
液から沈でんさせ、５０μｌの水に溶解する。
る。続いてアルカリフォスフアターゼを添加し、５´−
りん酸基を除去する。およそ５３００ｂｐの長さの線状
ＤＮＡを、１．２％アガロースゲル電気泳動および電気
溶出により、未切断のｐＥＲ３３と分離する。このＤＮ
Ａをフェノールおよびエーテルで抽出し、エタノール溶
液から沈でんさせ、５０μｌの水に溶解する。
【００７７】ｃ）線状ｐＥＲ３３とｐａｒ部位ＤＮＡと
の結合 線状ｐＥＲ３３ １μｌとｐａｒ部位ＤＮＡ１μｌとを
２０μｌ反応液中で０．１単位のＴ４リガーゼにより結
合させる。１４℃で１６時間のインキュベーションの後
に、酵素を熱失活させる。
の結合 線状ｐＥＲ３３ １μｌとｐａｒ部位ＤＮＡ１μｌとを
２０μｌ反応液中で０．１単位のＴ４リガーゼにより結
合させる。１４℃で１６時間のインキュベーションの後
に、酵素を熱失活させる。
【００７８】ｄ）Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１の形質転換
および形質転換株のプラスミド分析 Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を例１ｅと同様にして、例４
ｃで得られるＤＮＡを用いて形質転換する。約５０のコ
ロニーが得られる。これらのコロニーのうちの１０個か
ら、少量のＤＮＡを単離し（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ
Ｄｏｌｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｌｒ７巻，１５１３−１５２３頁：１９７９年）、
制限酵素Ｐｓｔ １により切断する。アガロース電気泳
動による分析の結果、これらのプラスミドの全てが、お
よそ４００ｂｐの長さのｐａｒ部位を有することがわか
った。これらのプラスミドの一つを選んでｐａｒ ｐＥ
Ｒ３３と命名した。
および形質転換株のプラスミド分析 Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を例１ｅと同様にして、例４
ｃで得られるＤＮＡを用いて形質転換する。約５０のコ
ロニーが得られる。これらのコロニーのうちの１０個か
ら、少量のＤＮＡを単離し（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ
Ｄｏｌｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｌｒ７巻，１５１３−１５２３頁：１９７９年）、
制限酵素Ｐｓｔ １により切断する。アガロース電気泳
動による分析の結果、これらのプラスミドの全てが、お
よそ４００ｂｐの長さのｐａｒ部位を有することがわか
った。これらのプラスミドの一つを選んでｐａｒ ｐＥ
Ｒ３３と命名した。
【００７９】ｅ）ｐａｒ ｐＥＲ３３のインタフェロン
生産および安定性の分析 例２ｄと同様にして、ｐＥＲ３３またはｐａｒ ｐＥＲ
３３を含有するバクテリアを培養し、インタフェロン含
量をプラーク阻止試験によりテストした。両株ともほぼ
同等のインタフェロン発現を示した。
生産および安定性の分析 例２ｄと同様にして、ｐＥＲ３３またはｐａｒ ｐＥＲ
３３を含有するバクテリアを培養し、インタフェロン含
量をプラーク阻止試験によりテストした。両株ともほぼ
同等のインタフェロン発現を示した。
【００８０】１２０世代を越える長期のテストで、選択
標識のアンピシリンの非存在下、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１
０１中のプラスミドｐＥＲ３３およびｐａｒ ｐＥＲ３
３の安定性を調べた。培養液より一定時間毎にサンプル
を取り出し、インタフェロン含量を測定した。ｐＥＲ３
３を有するバクテリアでは約６０世代後にインタフェロ
ン生産は止まった。しかしながら、ｐａｒ ｐＥＲ３３
を含有するバクテリアでは、１２０世代後でもインタフ
ェロンαＡの生産は低下しなかった。従って、ｐＥＲ３
３にｐａｒ部位を導入することによりＥ．ｃｏｌｉ Ｈ
Ｂ１０１中のプラスミドの安定性が増加されることが明
かとなった。
標識のアンピシリンの非存在下、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１
０１中のプラスミドｐＥＲ３３およびｐａｒ ｐＥＲ３
３の安定性を調べた。培養液より一定時間毎にサンプル
を取り出し、インタフェロン含量を測定した。ｐＥＲ３
３を有するバクテリアでは約６０世代後にインタフェロ
ン生産は止まった。しかしながら、ｐａｒ ｐＥＲ３３
を含有するバクテリアでは、１２０世代後でもインタフ
ェロンαＡの生産は低下しなかった。従って、ｐＥＲ３
３にｐａｒ部位を導入することによりＥ．ｃｏｌｉ Ｈ
Ｂ１０１中のプラスミドの安定性が増加されることが明
かとなった。
【００８１】使用用語および略語の説明 ＡＴＰ ：アデノシン三りん酸 塩基対 ：Ａ−Ｔ，Ｇ−Ｃのような二つの相補的
ヌクレオチド 平滑末端 ：突出する一重鎖末端と区別して、完全
に塩基対を成すＤＮＡ二重鎖分子末端 ｂｐ ：塩基対 ＢＳＡ ：仔牛血清アルブミン ｃＤＮＡ ：ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ コード ：何かの情報を有する；ＤＮＡはそのヌ
クレオチド配列にたん白質のアミノ酸配列のための情報
を有する コドン ：３個のヌクレオチドのグループ。各コ
ードが特定のアミノ酸またはポリペプチド合成の中止を
示す。
ヌクレオチド 平滑末端 ：突出する一重鎖末端と区別して、完全
に塩基対を成すＤＮＡ二重鎖分子末端 ｂｐ ：塩基対 ＢＳＡ ：仔牛血清アルブミン ｃＤＮＡ ：ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ コード ：何かの情報を有する；ＤＮＡはそのヌ
クレオチド配列にたん白質のアミノ酸配列のための情報
を有する コドン ：３個のヌクレオチドのグループ。各コ
ードが特定のアミノ酸またはポリペプチド合成の中止を
示す。
【００８２】脱りん酸 ：りん酸基の除去 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ＤＴＴ ：デチオスレイトール 電気泳動 ：電場中での（ＤＮＡ）分子の分離 発現 ：遺伝子の情報を転写によりｍＲＮＡ
に、さらに翻訳によりポリペプチドの配列に変換するこ
と 発現プラスミド：その中に挿入された遺伝子の発現を可
能とするプラスミド 遺伝子 ：特定の転写物（ＲＮＡ分子）へ、さら
にたん白へ変換する情報を有するＤＮＡの部分 遺伝子産物 ：ＲＮＡ（転写物）、たん白（翻訳産
物） 核酸のハイブリダイゼーション：互いに相補的なＤＮＡ
鎖間で安定な複合対を形成すること
に、さらに翻訳によりポリペプチドの配列に変換するこ
と 発現プラスミド：その中に挿入された遺伝子の発現を可
能とするプラスミド 遺伝子 ：特定の転写物（ＲＮＡ分子）へ、さら
にたん白へ変換する情報を有するＤＮＡの部分 遺伝子産物 ：ＲＮＡ（転写物）、たん白（翻訳産
物） 核酸のハイブリダイゼーション：互いに相補的なＤＮＡ
鎖間で安定な複合対を形成すること
【００８３】混成プラスミド：異種ＤＮＡ断片を含むプ
ラスミド ＩＦＮ−αＡ ：白血球インタフェロン亜タイプＡ 開始コドン ：メチオニンをコードし、翻訳開始も指
令するＡＴＧコドン 挿入物 ：混成プラスミドに挿入された異種由来
ＤＮＡ部分 キナーゼ ：ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の５´−ＯＨ
基をりん酸化する酵素 キナーゼする ：５´−りん酸基を供給する クローン ：一個のバクテリアから発生したコロニ
ー 接着末端 ：互いにハイブリダイズできる、一重鎖
の突出したＤＮＡ分子末端 相補的 ：互いに適合している（ＤＮＡ中のヌク
レオチド：ＡはＴに相補的であり、ＧはＣに相補的）
ラスミド ＩＦＮ−αＡ ：白血球インタフェロン亜タイプＡ 開始コドン ：メチオニンをコードし、翻訳開始も指
令するＡＴＧコドン 挿入物 ：混成プラスミドに挿入された異種由来
ＤＮＡ部分 キナーゼ ：ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の５´−ＯＨ
基をりん酸化する酵素 キナーゼする ：５´−りん酸基を供給する クローン ：一個のバクテリアから発生したコロニ
ー 接着末端 ：互いにハイブリダイズできる、一重鎖
の突出したＤＮＡ分子末端 相補的 ：互いに適合している（ＤＮＡ中のヌク
レオチド：ＡはＴに相補的であり、ＧはＣに相補的）
【００８４】リガーゼ ：種々のＤＮＡ分子を共有
結合させる酵素 リガーゼする ：ＤＮＡ分子を互いに共有的に結合する
こと ｍＲＮＡ ：伝令ＲＮＡ、ポリペプチドをコードす
るＲＮＡ ヌクレオチド ：ＤＮＡまたはＲＮＡの構成単位（Ａ＝
アデノシン、Ｃ＝シチジン、Ｇ＝グアノシン、Ｔ＝チミ
ジン、Ｕ＝ウラシル） ヌクレオチド配列：ＤＮＡまたはＲＮＡ分子中のヌクレ
オチドの配列 オリゴヌクレオチド：フォスフオジエステル結合により
互いに結合しているいくつかのヌクレオチド（短い−重
鎖ＤＮＡ断片） オペレータ ：オペロンの制御部分の一部で、レプレ
ッサーが結合して転写が抑制される部分
結合させる酵素 リガーゼする ：ＤＮＡ分子を互いに共有的に結合する
こと ｍＲＮＡ ：伝令ＲＮＡ、ポリペプチドをコードす
るＲＮＡ ヌクレオチド ：ＤＮＡまたはＲＮＡの構成単位（Ａ＝
アデノシン、Ｃ＝シチジン、Ｇ＝グアノシン、Ｔ＝チミ
ジン、Ｕ＝ウラシル） ヌクレオチド配列：ＤＮＡまたはＲＮＡ分子中のヌクレ
オチドの配列 オリゴヌクレオチド：フォスフオジエステル結合により
互いに結合しているいくつかのヌクレオチド（短い−重
鎖ＤＮＡ断片） オペレータ ：オペロンの制御部分の一部で、レプレ
ッサーが結合して転写が抑制される部分
【００８５】オペロン ：オペレータを形成し、調
節を受ける遺伝子グループ フォスフアターゼ：ＤＮＡ分子から５´−りん酸基を除
去する酵素 プラスミド ：クロモゾーム外の環状ＤＮＡ分子 プロモータ ：酵素ＲＮＡホリメラーゼと結合できる
ＤＮＡ配列 ＲＢＳ ：リボゾーム結合配列の項参照 制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）：ＤＮＡ二重鎖の
特有の対称配列で切断できる酵素 制限断片 ：制限エンドヌクレアーゼによる消化の
結果得られるＤＮＡ区分 リボソーム結合配列：リボソームＲＮＡと結合できるｍ
ＲＮＡの部分
節を受ける遺伝子グループ フォスフアターゼ：ＤＮＡ分子から５´−りん酸基を除
去する酵素 プラスミド ：クロモゾーム外の環状ＤＮＡ分子 プロモータ ：酵素ＲＮＡホリメラーゼと結合できる
ＤＮＡ配列 ＲＢＳ ：リボゾーム結合配列の項参照 制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）：ＤＮＡ二重鎖の
特有の対称配列で切断できる酵素 制限断片 ：制限エンドヌクレアーゼによる消化の
結果得られるＤＮＡ区分 リボソーム結合配列：リボソームＲＮＡと結合できるｍ
ＲＮＡの部分
【００８６】ＲＮＡ ：リボ核酸 ＲＮＡポリメラーゼ：ＤＮＡに相補的ＲＮＡ鎖を合成す
る酵素 配列 ：ヌクレオチド配列の項参照 形質転換株 ：形質転換の結果、外来ＤＮＡ（プラス
ミド）を取り込んだバクテリア 形質転換 ：バクテリアで外来（プラスミド）ＤＮ
Ａをとりこむこと 転写 ：ＤＮＡマトリックスに相補的なＲＮＡ
の合成 翻訳 ：ｍＲＮＡの情報をポリペプチドに変換
すること Ｔｒｉｓ ：トリヒドロキシメチルアミノエタン
る酵素 配列 ：ヌクレオチド配列の項参照 形質転換株 ：形質転換の結果、外来ＤＮＡ（プラス
ミド）を取り込んだバクテリア 形質転換 ：バクテリアで外来（プラスミド）ＤＮ
Ａをとりこむこと 転写 ：ＤＮＡマトリックスに相補的なＲＮＡ
の合成 翻訳 ：ｍＲＮＡの情報をポリペプチドに変換
すること Ｔｒｉｓ ：トリヒドロキシメチルアミノエタン
【００８７】
【図１】発現プラスミドｐＥＲ１０３の作製を示す図
面。断片の大きさは実際の値を縮小したものでない。
面。断片の大きさは実際の値を縮小したものでない。
【図２】プラスミドｐＢＲ３２２およびｐＥＲ１０３の
Ｈａｅ III消化パターンを示す図面。ｐＢＲ３２２の１
９２ｂｐ断片がｐＥＲ１０３では約２７０ｂｐの断片で
置き代えられている。
Ｈａｅ III消化パターンを示す図面。ｐＢＲ３２２の１
９２ｂｐ断片がｐＥＲ１０３では約２７０ｂｐの断片で
置き代えられている。
【図３】ｐＥＲ１０３のＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ III部位
との間のヌクレオチド配列を示す図面。プラスミドの残
りの部分は、ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄ IIIとＥｃｏＲＩ
断片の大きい方の部分に対応する。
との間のヌクレオチド配列を示す図面。プラスミドの残
りの部分は、ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄ IIIとＥｃｏＲＩ
断片の大きい方の部分に対応する。
【図４】インタフェロン生産プラスミドｐＥＲ３３の作
製を示す図面。１Ｆ７挿入部分の制限図を除いて、断片
の大きさは実際の縮少で示されていない。
製を示す図面。１Ｆ７挿入部分の制限図を除いて、断片
の大きさは実際の縮少で示されていない。
【図５】プロモータＲＢＳ−インタフェロン遺伝子の結
合を表わすゲルの配列の図面。ｐＥＲ３３の作製に用い
られたオリゴヌクレオチド断片の全てが存在する。わか
り易いように、同じ配列を二重鎖として下部に示してあ
る。個々のオリゴヌクレオチド構成部分も示してある。
合を表わすゲルの配列の図面。ｐＥＲ３３の作製に用い
られたオリゴヌクレオチド断片の全てが存在する。わか
り易いように、同じ配列を二重鎖として下部に示してあ
る。個々のオリゴヌクレオチド構成部分も示してある。
【図６】インタフェロン生産プラスミドｐＥＲ２１／１
の作製を示す図面。プラスミド断片は実際の大きさの縮
少ではない。
の作製を示す図面。プラスミド断片は実際の大きさの縮
少ではない。
【図７】インタフェロン生産プラスミドｐａｒ ｐＥＲ
３３の作製を示す図面。断片およびプラスミドは実際の
大きさを縮少したものではない。
３３の作製を示す図面。断片およびプラスミドは実際の
大きさを縮少したものではない。
図４において、 ↓ Ｐｓｔ Ｉ部位
【外２】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ギユンター アドルフ オーストリア国ウイーン，ヨハナガツセ 20−７ (72)発明者 ノルベルト ハウエル ドイツ連邦共和国ビベラツハ １，ハン デルストラーセ 12 (72)発明者 ペーター マインドル オーストリア国ウイーン，ホツケガツセ 63−１ (72)発明者 ペーター スウエツトリイ オーストリア国ウイーン，ヒエトジンガ ー ハウプストラーセ 40 ビー − ９ (72)発明者 ルドルフ ハウプトマン オーストリア国ウイーン，ビクトルガツ セ 25−８ (56)参考文献 特開 昭57−79897（ＪＰ，Ａ)
Claims (1)
- 【請求項１】 クローン１Ｆ７（ＤＳＭ Ｎｏ．２３６
２）のＰｓｔＩ挿入物中に含有されており、成熟インタ
フェロンのみをコードする以下の式を有するＤＮＡ配列
を構造遺伝子として含有するプラスミドを含有する細菌
を成育させることにより得ることができるＩＦＮ−α２
ｃ活性を有する培養物。 【化１】
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE32479220 | 1982-12-24 | ||
| DE19823247922 DE3247922A1 (de) | 1982-12-24 | 1982-12-24 | Dna-sequenzen, deren herstellung, diese sequenzen enthaltende plasmide und deren verwendung zur synthese eukaryotischer genprodukte in prokaryoten |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58243626A Division JPH088868B2 (ja) | 1982-12-24 | 1983-12-23 | Ｄｎａ配列、その調製法、該配列を含むプラスミドおよび原核細胞における真核細胞遺伝子生産物の合成のためのそれらの利用 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05214000A JPH05214000A (ja) | 1993-08-24 |
| JP2637328B2 true JP2637328B2 (ja) | 1997-08-06 |
Family
ID=6181687
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58243626A Expired - Lifetime JPH088868B2 (ja) | 1982-12-24 | 1983-12-23 | Ｄｎａ配列、その調製法、該配列を含むプラスミドおよび原核細胞における真核細胞遺伝子生産物の合成のためのそれらの利用 |
| JP4009692A Expired - Lifetime JP2637328B2 (ja) | 1982-12-24 | 1992-01-23 | 成熟ポリペプチド |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58243626A Expired - Lifetime JPH088868B2 (ja) | 1982-12-24 | 1983-12-23 | Ｄｎａ配列、その調製法、該配列を含むプラスミドおよび原核細胞における真核細胞遺伝子生産物の合成のためのそれらの利用 |
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| JP (2) | JPH088868B2 (ja) |
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| DK (1) | DK576983A (ja) |
| ES (4) | ES8501798A1 (ja) |
| FI (1) | FI86991C (ja) |
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| NZ (1) | NZ206700A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| ATE67786T1 (de) * | 1984-08-01 | 1991-10-15 | Boehringer Ingelheim Int | Neue genetische sequenzen, die durch sie codierten interferon-peptide vom typ i und diese sie produzierende organismen. |
| US6291662B1 (en) | 1984-12-05 | 2001-09-18 | Amgen Inc. | Recombinant methods for production of serine protease inhibitors and DNA sequences |
| HU204563B (en) * | 1984-12-06 | 1992-01-28 | Synergen Biolog Inc | Process for producing recombinant serine-protease inhibitors and dns sequencyes for them |
| FI90990C (fi) * | 1984-12-18 | 1994-04-25 | Boehringer Ingelheim Int | Rekombinantti-DNA-molekyyli, transformoitu isäntäorganismi ja menetelmä interferonin valmistamiseksi |
| DK151585D0 (da) * | 1985-04-03 | 1985-04-03 | Nordisk Gentofte | Dna-sekvens |
| DK156072C (da) * | 1985-04-03 | 1989-11-06 | Nordisk Gentofte | Syntetisk dna-sekvens indeholdende et ribosombindingssted |
| DE3514113A1 (de) * | 1985-04-19 | 1986-10-23 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Veraenderung der dna-sequenz zwischen shine-dalgarno-sequenz und startcodon des trp-operons zur steigerung der proteinexpression |
| US4874703A (en) * | 1985-08-26 | 1989-10-17 | Eli Lilly And Company | Expression vectors for use in E. coli |
| DE3607835A1 (de) * | 1986-03-10 | 1987-09-24 | Boehringer Ingelheim Int | Hybridinterferone, deren verwendung als arzneimittel und als zwischenprodukte zur herstellung von antikoerpern und deren verwendung sowie verfahren zu ihrer herstellung |
| DE3642096A1 (de) * | 1986-12-10 | 1988-06-16 | Boehringer Ingelheim Int | Pferde-(gamma)-interferon |
| GB8813032D0 (en) * | 1988-06-02 | 1988-07-06 | Boehringer Ingelheim Int | Antiviral pharmaceutical composition |
| WO1990005186A1 (en) * | 1988-11-04 | 1990-05-17 | The Upjohn Company | Somatotropin expression using a serratia promoter |
| EP0626448A3 (de) * | 1993-05-26 | 1998-01-14 | BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH | Verfahren zur Herstellung und Reinigung von alpha-Interferon |
| US5531880A (en) * | 1994-09-13 | 1996-07-02 | Microelectronics And Computer Technology Corporation | Method for producing thin, uniform powder phosphor for display screens |
| FR2724665B1 (fr) * | 1994-09-16 | 1996-12-20 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procede de production de proteines recombinantes, plasmides et cellules modifiees |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA811368B (en) * | 1980-03-24 | 1982-04-28 | Genentech Inc | Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator |
| EP0042246B1 (en) * | 1980-06-12 | 1987-03-18 | The Cancer Institute Of Japanese Foundation For Cancer Research | Plasmid |
| ZA814375B (en) * | 1980-07-01 | 1982-07-28 | Hoffmann La Roche | Interferons and process for their preparation |
| IE52755B1 (en) * | 1980-08-26 | 1988-02-17 | Univ California | Bovine pre-growth and growth hormone |
| EP0062971B1 (en) * | 1981-03-27 | 1990-03-07 | Imperial Chemical Industries Plc | Genetically modified microorganisms |
| DE3220116A1 (de) * | 1982-05-28 | 1983-12-01 | Dr. Karl Thomae Gmbh, 7950 Biberach | Mikrobiologisch hergestellte (alpha)- und ss-interferone, dna-sequenzen, die fuer diese interferone codieren, mikroorganismen, die diese genetische information enthalten, und verfahren zu ihrer herstellung |
| DE3247923A1 (de) * | 1982-12-24 | 1984-06-28 | Dr. Karl Thomae Gmbh, 7950 Biberach | Neue oligonucleotide und verfahren zu ihrer herstellung |
-
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- 1982-12-24 DE DE19823247922 patent/DE3247922A1/de not_active Withdrawn
-
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- 1983-12-14 DK DK576983A patent/DK576983A/da not_active Application Discontinuation
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