HU202277B - Process for producing dna sequences and plasmids comprising such sequences, as well as their use for synthesis of interferon - Google Patents

Description

A gének baktériumokban történő kifejeződésének előfeltétele egy úgynevezett promoter, azaz egy felismerő szekvencia jelenléte, amely a bekteriális polimerázzal kötődik. A promoter lehetővé teszi a mögötte lévő ezek- 5 venciák transzkripcióját is. Azoknak a géneknek, amelyeknek a termékei mindenkor szintetizálödnak, olyan promoterei vannak, amelyek mindig képesek RNS polimeráz molekulákkal kötődni. A baktériumok más génjei, 10 illetve operonjai szabályozottak, azaz promotereik meghatározott mechanizmusok révén hozzáférhetővé vagy hozzáférhetetlenné válnak.

A kívánt géntermékek szintetizálődásának egy másik feltétele az, hogy az* átirt RNS-ek hatékonyan transzlatálódjanak a bakteriális riboszömákon. Shine és Dalgarno [Natúré, 254, 34-38 (1975)] közölték, hogy baktériumokban a mRNS 5* végén lévő nukleotid szekvenciák felelősek a riboszómához történő kötődésért.

Jelen találmánynak az a célja, hogy egy ismert promoter segítségével, amely egy új riboszómakötő-linker szekvencián keresztül egy strukturális génhez kapcsolódik, baktérium-idegen proteinek - interferonok - géntechnológiai termelését javítsa.

Jelen találmány tárgya tehát az alábbi formulájú DNS szekvencia.

5’ AATTCACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3’ GTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG k-promoter —

GCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTA CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCCATTCCTCCAAATTCGA -promoter/operátor-M .<-RBS-w

HindlII amelyhez adott esetben a riboszómakótő szekvenciához egy linker szekvencia és egy 30 polipeptidet, előnyösen egy oC-interferont kódoló strukturgén szekvenciája kapcsolódik olyan formában, hogy ez baktériumok által kifejezhető, és a DNS-szekvenciák kombinációja oly módon történik, hogy a strukturgén 35 DNS-ezekvenciája a DNS linker szekvenciához 3’,5’-fo6zfodiészter-kótésBel kapcsolódik.

Ez a szekvencia egy irodalomból ismert promoter szekvenciából és egy irodalomból ismert riboszómakótő szekvenciából álló új ₄q kombinációt képvisel.

A jelen találmány tárgyét képezi előnyösen azonban* egy olyan DNS-szekvencia, amelyben a strukturgén az 1F7 klón (DSM 2362) PstI inszertjében lévő DNS-szekvenciával azonos, amely csak érett interferont kódol, és amely a következő képlettel ábrázolható:

5’ AATTCACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3 ’ GTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG

1« promote r ----GCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTAAGCT CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCCATTCCTCCAAATTCGA -promoter/operátor-h *-RBS-M

HindlII

1---az 1F7 (DSM 2362) klón PstI inszertjében lévő, érett oC-interferont kodoló DNS-szekvencia------>

TAAAGATGTGTGATCTGCCTCAAA 55

ATTTCTACACACTAGACGGAGTTT K----linker -—>

A találmány tárgyát képezik továbbá az

5’ TAAGGAGGTTTAAGCTTAAAGATGTGT

3’ ATTCCTCCAAATTCGAATTTCTACACACTAG

Sau3A képletű DNS-riboszómakötó-/linker szekvencia, az

5’ AGCTTAAAGATGTGT

3’ ATTTCTACACACTAG képletű DNS-linker szekvencia, valamint egy olyan DNS-szekvencia, amely az előbbi linker szekvenciából és az 1F7 klón (DSM 2362) Peti inszertjében lévó, érett oC-interferont ezen interferon amino-terminális ciszteinje nélkül kódoló DNS-szekvenciából áll, amely két részt a Sau3A végeken keresztül úgy ligálunk, hogy a teljes érett oC-interferon kódolva legyen, továbbá az előbb említett szekvenciákat tartalmazó plazmidok, például a pER103 plazmid, amely a

HU 202277 Β

5’ AATTCACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3’ GTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG k-p romote rGCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTA CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCCATTCCTCCAAATTCGA -promoter/operátor-->k-RBS-M

HindlII képletű DNS-szekvenciát tartalmazza, és olyan plazmidok, amelyekben ezután a pER103 piazmid egyetlen HindlII hasitási helyéhez oly módon kapcsolódik egy linker szekvencia és egy polipeptídet, előnyösen egy oC-interferont kódoló strukturgén szekvenciája, hogy ez baktériumokban kifejezhető legyen, például a pER33, pER21/l és parpER33 plazmidok, amelyek közül a parpER33 piazmid még egy par-lókuszt is tartalmaz. Ugyancsak a találmány tárgyát képezi az igy előállított termelő plazmidok alkalmazása valamilyen kivánt polipeptid, főleg érett cC-interferon, igy az 1F7 klón (DSM 2362) által kódolt érett oC-interferon baktériumokban való előállítására, valamint az cC-interferon előállítása és tisztítása.

A szakirodalomból 3 humán interferon-típus ismeretes: leukocita interferon (IFN—oC), fibroblaszt interferon (IFN-β) és immun interferon (IFN-x). A leginkább tanulmányozott a vírusokkal stimulált leukociták által termelt oC-interferon [Antimicrob. Agents Chemother., 20, 5-9 (1981)]. Az IFN-oC gének molekuláris klónozása során kiderült, hogy az IFN-oC-t egy multigén család kódolja, amely legalább 10 megkülönböztethető génből áll, igy a termék nem egységes protein, hanem IFN-oCl,2,3... [vagy LelFN A,B,C... ] altípusok [Natúré 287, 401 (1980) és 290, 20 (1981)] léteznek. Az IFN-cC gének közel hasonlók, és egymással kereszthibridizálnak. Az IFN-ű gén egyedüli génnek tűnik, IFN-β altípusok nem ismertek. Az IFN-cC és -β között nincs ke10 reszthibridizáció, szekvenciáik mintegy 45%-ban homológok [Natúré 285, 547 (1980)]. A leghosszabb azonos génszekvencia 13 bázis hosszúságú. Az IFN-oC és -& klónozására például Namalwa cDNS-ből származó szekvenciá15 kát használnak [Journal of Interferon Research, Vol. 2. (4), 575-585 (1982)].

A találmány által kitűzött célok elérése érdekében például a következőképpen járunk el.

Alkalmas bakteriális promoter szekvencia kiválasztása

Előnyösen olyan promotert alkalmazunk, 25 amely az operátor szekvenciával kombinációban indukálható, illetve represszálható. Egy ilyen promoternek az az előnye, hogy a kivánt baktériumidegen-fehérjének a szintézisét csak a bakteriális növekedési ciklus egy későbbi szakaszában indíthatjuk meg, például a triptofán operon esetében [Hallewell és Emtage: Gene, 9, 27-47 (1980)] azáltal, hogy a táptalajból a triptofánt elvonjuk és azáltal, ha a táptalajhoz - a triptofán operon indu35 kálására - indol-3-akrilsavat adunk és igy a baktériumok szaporodását nem befolyásoljuk. Az expressziós piazmid megszerkesztéséhez célszerűen a Serratia marcescens triptofán operonjának irodalomból ismert [Miozzari és

Yanofsky: Natúré, 276, 684-689 (1978)] nagyon erős és szabályozható alábbi formulájú promoter/operátor rendszerét alkalmazzuk:

5’ AATTCACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3’ GTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG

X-promoterGCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGG

CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCC

-promoter/ope rátör ->

Ezt a szekvenciát az irodalomból ismert módon állíthatjuk elő.

A riboszómakötő szekvencia RBS szerkesztése

Ez esetben az az 12mer

I-,

5’ TAAGGAGGTTTA

3’ ATTCCTCCAAATTCGA

6MER 10MER

5’TAAGGAGGTTTA formulájú, különlegesen hatékonynak leirt szekvenciát alkalmazzuk [Jay és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 5543-5548 (1981)]. 65 szerkezetű riboszómakötő szerkesztése előnyösen úgy történik, hogy az alábbi 3 szintetikus oligonukleotidot

HU 202277 Β

6mer

5' TCCTTA lOmer

5’ AGCTTAAACC és

12mer

5’ TAAGGAGGTTTA összeépítjük a szakirodalomból ismert módszerekkel· s célszerűen még ezelőtt a 6mer oligonukleotidot radioizotóppal jelöljük.

Ezt követően a promoter/operátor rákapcsolása a riboszömakötő szekvenciára ugyancsak a szakirodalomból ismert eljárásokkal történik.

A pER 103 expressziós plazmid szerkesztése

Egy plazmidból, például a pBR 101 plazmidból, amely a Serratia marcescens triptofán operonjának egy részét tartalmazza, kihasítjuk a 90 bp hosszú promoter/operátor szekvenciát az Eco Rí és Hae III restrikciós enzim segítségével. Ezt a fragmentumot ezután a szintetikus úton előállított RBS-el kapcsoljuk össze DNS-ligáz enzim alkalmazásával. Az igy előállított promoter/operátor-RBS-fragmentumot, amely a promoter/operátor szakasz előtt Eco Rí számára felismerhető véggel és az RBS szakasz után a HindllI számára felismerhető véggel rendelkezik, a pBR 322 plazmidba építjük be, a plazmid 29 bp hosezú Eco Rí - HindllI fragmentumának helyére. Az igy szerkesztett expressziós plazmid (pER 103) hatékonyságát a HindllI helyre beépített gének kifejeződésére nézve, az A altipusú leukocita interferon (IFN-oCA) példáján mutatjuk be.

Az IFN-oCA kifejeződése a pER 103 plazmidban

Az interferon az emberi sejtekben - hasonlóan más ugyancsak a sejtmembránon keresztül szállított proteinekhez - preproteinként, azaz elószekvenciával rendelkező proteinként szintetizálódik. Ezt az elószekvenciát egy erre specializált enzim hasítja le, amikor a protein molekula a sejtből kilép, s így keletkezik a protein érett formája. Hogy a baktériumokkal érett interferont szintetizáltassuk, annak egyik lehetősége az, hogy DNS szinten eltávolítjuk az előszekvenciát, azaz olyan gént szerkesztünk, amely csak az érett protein szekvenciát kódolja.

Az IFN-oCA interferon termelő plazmid szerkesztése

A leukocita interferon például 23 aminosavból álló preszekvenciával rendelkezik, ezután egy risztéin következik, amely a preinterferon hasítása után az .érett' interferon polipeptid első aminosavát képezi. Azoknak a plazmidoknak a szerkesztésénél, amelyek baktériumokban az érett interferon szintetizálását kell lehetővé tegyék, az interferon gén egy olyan fragmentumának izolálása szükséges, amely pontosan a cisztein kodonjával kezdődik. Ez elé a risztéin kodon elé azután egy ATG metionin kodont kell tenni, hogy a protein szintézis iniciációja lehetővé váljék. Ezt a szerkezetet ezután, megfelelő módon, például a pER 103 expressziós plazmádba épitjük be úgy, hogy a ATG iniciációe kodon és az RBS közti távolság a transzláció szempontjából optimális legyen. Az interferon, amelyet egy ilyen plazmiddal baktériumban állítunk elő, az érett polipeptid aminosav szekvenciájával rendelkezik és még egy járulékos metioninnal az amino-terminális végén.

A találmány szerinti IFNoCA-t meghatározó pER 33 interferon termelő plazmidot például az alábbi alapelvek szerint szerkesztjük (előállítását a 4. ábrában sematikusan mutatjuk be):

a) Érett interferont meghatározó gén szerkesztése az aminoterminális cisztein kodonjának kihagyásával

Az interferon képződéshez szükséges információ kiindulási anyagául például az IFNoCA-t kódoló 1 F7 plazmid eDNS kiónját . , használjuk, amelyet 1982. május 17-én letétbe ; helyeztünk a .Deutsche Sammlung von Mik- .·. roorganismen' (Griesbach Strasse 8, D-3400 Göttingen, NSZK) törzsgyűjteményében, ahol , letéti szám: DSM 2362 (lásd még a P 32 20 116.8 számú német szövetségi köz- ;_; társasági szabadalmi bejelentést; 1982. május ; 28.). Ez tartalmazza az interferon gént a pBR ’ 322 plazmid Pst I helyére beépítve. Az IFNoCA ..... génben (ugyanúgy, mint a többi leukocita : interferon altípusok esetében), közvetlenül az amino-terminális ciszteint kódoló TGT után hasítási hely található a Sau 3A számára. Ennek a hasítási helynek a léte képezi az alapját annak a módszernek, amellyel az érett interferon gént szerkesztjük meg megfelelő restrikciós fragmentumokból, például az 1 F7 plazmid interferon specifikus 646 bp hosszú Ava II fragmentumából és 34 bp hosszú Sau 3A - Ava II fragmentumából.

b) Az oligonukleotid-komplex előállítása

Az igy szerkesztett gén 5’ végéhez ezután hozzá kell kapcsolni a hiányzó cisztein kodont és ez elé egy ATG metionin kodont; ezután szükség van még egy összekötő-darabra, amely lehetővé teszi, hogy ezt a szerkezetet beépítsük a pER 103 expressziós plazmid Hindii! helyére. Erre a célra a kővetkező 4 oligonukleotidot szintetizáljuk:

5’ TGTGATCTGCCTCA = 14mer,

5’ AGCTTAAAGATG = 12mer,

5’ CAGATCACA = 9mer és

5’ CATCTTTA = 8mer.

HU 202277 Β

AGCTTAAAGATGTGÁjATCTGCCTCA

Ha ezeket az oligonukleotidokat összekapcsoljuk, majd utólag Sau 3A-val hasítjuk, megkapjuk a kívánt fragmentumot, amely az interferon gén részt (Sau 3A vég) a pER 103-al (Hindin vég) összekötheti: 5

I

12mer ^14raer i

5’

3! ATTTCTACACACÍTAG^C 10 ' ¹ i

8mer 9raei |

Hin dili Sau 3A ,_, ₍_' 15

Met Cys

Az oligonukleotidokat a találmány szerint ügy szerkesztjük, hogy az ATG iniciációs kodont és a TGT cisztein kodont külön 20 fragmentumok tartalmazzák. Ez lehetővé teszi a 12mer (és 8mer) általános használatát géneknek a pER 103-ba történő inszertálásánál. Ezért a cisztein kodont tartalmazó oligonukleotidnak legalább 9 nukleotid hosszúságúnak 25 kell lennie. Például az alábbi nukleotidok használhatók e célra:

5'TGTGATCTG,

5’TGTGATCTGC, 30

5’TGTGATCTGCC,

5’TGTGATCTGCCT vagy

5’TGTGATCTGCCTC.

Például a 14raer-rel kapott, ligáz segítségével 35 összekapcsolt oligonukleotidot Sau 3A-val emésztjük, hogy az interferon génhez megfelelő Sau 3A vég keletkezzék.

Ezután az interferon génnek és az oligonukleotid komplexnek az összekapcsolása, 40 ennek bekötése egy plazmidba, majd ezzel egy bakteriális gazdasejt, például Escherichia coli HB 101 transzformálása a szakirodalomból ismert eljárásokkal történik.

Eukarióta géntermékek előállításánál a 45 kitermelés további növelése érdekében előnyös lehet, ha az illető termelő plazmid az expresszióhoz szükséges DNS szekvenciák többszörösét, például kétszeresét tartalmazza, például két teljes érett interferon oCA-t kó- 50 doló gént, a bakteriális regulátor-szekvenciákkal együtt. Tehát az érett interferon génjét, amely egy bakteriális promoterrel, egy prokarióta riboszomális kötőhellyel és egy ATG iniciációs kodonnal rendelkezik, a talál- 65 mány szerint előállított termelő plazmidból, például a pER 33-ból, izoláljuk, ezután e DNS darab két vége közül az egyiket módosítjuk, majd egy restrikciós enzim, például az Eco Rí segítségével a találmány szerint előállított, 60 linearizált teljesen azonos plazmidba beépítjük.

Előnyös továbbá, ha egy, a találmány szerint ilyen módon előállított, triptofán operont hordozó plazmid, mint például a pER 33 65 6 plazmid, egy par-lokusz-t tartalmaz, azaz egy olyan DNS szekvenciát, amely például egy antibiotikum - ilyen az ampicillin - által gyakorolt szelekciós kényszer elmaradásakor, a baktériumnövekedés folyamán a plazmidoknak a leánysejtekbe történő egyenletes átadásáért felelős [P. M Meacock, S. N. Cohen, Cell, 20, 529-542 (1980)1. Ezért először a pPM 31 plazmidból, amely az előbb megadott közleményben szerepel, izoláljuk a par-lokusz-t és bevisezük egy találmány szerint előállított interferon termelő plazmidba.

Jelen találmány segítségével egy olyan expressziós plazmidot sikerült megszerkeszteni, amely a Serratia marcescens triptofán operonjának promoter/ope rátör szakaszát tartalmazza, valamint egy szintetikus RBS-t. Ennek a szerkezetnek baktériumidegen proteinek géntechnológiai előállításánál megnyilvánuló hatékonyságát a leukocita interferon példáján mutatjuk be.

A következő példák a találmányt közelebbről világitják meg.

A. ÁLTALÁNOS MÓDSZEREK ISMERTETÉSE

1) Emésztések restrikciós enzimekkel

A restrikciós endonukleázokat, például a Bethesda Research Laboratories termékeit, az alábbi feltételek mellett alkalmazzuk:

Eco Rl-el, HindlII-al, Pst I-el és Ava II-vel az emésztéseket TA-pufferben [33 mM trisz-acetát (pH=7,9), 66 mM kálium-acetát, 10 mM magnézium-acetát, 100 pg/ml BSA] végezzük; Hae ΠΙ-al TM pufferben [70 mM trisz-sósav (pH=7,5), 7 mM magnézium-klorid] emésztünk; Sau 3A-val 10 mM trisz-sósav (pH=7,4), 10 mM magnézium-klorid és 75 mM nátrium-klorid tartalmú oldatban végezzük az emésztést.

2) Plazmid preparálás, gélelektroforézis

A plazmidokat Bimbóim és Doly [Nucleic Acids Rés., 7, 1513-1523 (1979)] előírása ezerint preparáljuk, L-Broth táptalajban egy éjszakán át tartó tenyésztési idő után, 1,5 ml vagy 100-300 ml tenyészetből. Az L-Broth táptalaj 25 Mg/ml tetraciklint, vagy 100 Mg/ml ampicillint tartalmaz. A plazmidok további tisztítása izopropanolos kicsapással (lásd alább) és nagyobb sarzsok esetén Sepharose 4B (Pharmacia) kromatografálással történik. Nagyobb mennyiségű plazmidot (1-6 liter tenyészetből) Clewell és Helinski [Biochemistry, 9, 4428-4440 (1970)] .cleared-lysate módszerével dolgozunk fel, s «zt követi egy etidium-bromid - cézium-klorid grádiens centrifugálás.

A plazmidok, illetve restrikciós enzimes emésztéssel kapott termékeik elektroforézisét 40 mM trisz-acetátot (pH=7,8), 20 mM nátrium-acetátot és 2 mM EDTA-t tartalmazó oldattal készített 0,8-1,4%-os agaróz gélben,

HU 202277 Β vagy 6%-os poliakrilamid gélben végezzük. A restrikciós fragmentumok preparálása úgy történik, hogy a kivánt fragmentumot tartalmazó géldarabkát kivágjuk és a gélből a DNS-t dializáló hüvelyben elektroforézissel 5 eluáljuk.

3) Kináz-, foszfatáz- és ligáz reakciók

Az 5'-;foezforilálást (végek jelzése) 10 5 mM DTT-t és 0,2-0,5 mM ATP-t (10-20 μ0ϊϊ³²Ρ-ΑΤΡ) tartalmazó TM pufferben [70 mM trisz-sósav (pH=7,5), 7 mM magnézium-klorid J végezzük 5 egység T4 polinukleotid kinázzal (Bethesda Research Laboratories 15 cég gyártmánya) 60 percig, 37 °C-on. A reakcióelegyet ezután 70 °C-on 10 percig inkubáljuk, hogy az enzim inaktiválódjék.

A ligáz reakciókat 5 mM DTT-t és 0,25 mM ATP-t tartalmazó TM pufferben foly- 20 tatjuk le a .blunt-end összekapcsolásoknál 0,1 egység T4 DNS ligázzal (Bethesda Research Laboratories), a kohéziós végek öszszekapcsolásánál 0,005 egység ligázzal, egy éjszakán át 14 °C-on. Ezután az enzimet 25 70 °C-on 10 percig denaturáljuk.

Az egymásután következő kináz és ligáz reakciókat ugyanabban a reakciókeverékben folytatjuk le. Az első enzim hődenaturálása után a keverékhez újból hozzáadunk 5 mM 30 DTT-t és 0,25-0,5 mM ATP-t és ezután indítjuk a második reakciót.

A foszfatáz reakciókat a restrikciós emésztésekhez alkalmas pufferben (szokásosan TA pufferben) végezzük úgy, hogy 1 35 egység alkalikus foszfatázt (a Sigma cég állítja elő borjúbélből) adunk a restrikciós enzimes emésztéshez, majd 15 percig 37 °C-on inkubáljuk a reakciókeveréket. Ezt követi egy-két fenolos extrahálás, egy éteres ext- 40 rakció és egy alkoholos kicsapás. Még mielőtt a további manipulációkat elvégeznénk, gyakran előfordul, hogy a DNS fragmentumokat még elektroforézissel elválasztjuk és a gélből eluáljuk. 45

Hogy a nagy DNS fragmentumokat (500 bp hosszú, vagy ennél hosszabb) a kis fragmentumoktól (olyan linker fragmentumok ezek, amelyek nem kapcsolódtak, vagy kis restrikciós emésztési termékek) elválasszuk, 50 izopropanolos kicsapást végzünk: a reakcióelegybez 2 n ammónium-acetátot (vég-koncentráció) adunk, majd 0,6 térfogat izopropanollal 10-20 percig szobahőmérsékleten ki-, csapjuk. Az anyagot ezután Eppendorf cent- 55 rifugában 5 percig centrifugáljuk, a felülúszót elöntjük, a csapadékot hideg 70%-os etanollal mossuk, majd újra centrifugáljuk; az itt keletkező üledéket szárítjuk és így a további feldolgozásra készen áll. θθ

B. AZ OLIGONUKLEOTIDOK ELŐÁLLÍTÁSA

Jelmagyarázat:

DMTr = ρ,ρ’-dimetoxi-trifenilmetil ibu = izobutiril bz = benzoil (a bázis nitrogénjén) = polimer hordozó

B = timin vagy

NMzobutíril-guanin vagy N*-benzoil-citozin vagy N®-benzoil-adenin

THF = tetrahidrofurán

I. példa

A polimer hordozó működőképessé tétele

A polimer hordozót a szakirodalomból ismert eljárással alakítjuk működőképessé. Hordozó anyagunk a HPLC-Silicagel (Macherey-Nagel gyártmány, szemcsenagyság 20 pm, pórusnagyság 200 A°). A gélt Matteucci és Caruthers szerint kezeljük, azzal a különbséggel, hogy a borostyánkősav-anhidriddel való szukcinilezést vízmentes piridinben végezzük. [M. D. Matteucci, Μ. H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 21, 719 (1981); J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981) ée T. Tanaka, R. L. Letsinger, Nucleic Acids Research, ~ 10, 3249 (1982)]. A védett nukleozidok ennek megfelelően az I általános képlet szerint létesítenek kovalens kötést a szilikagéllel.

A fedettség 68-104 pmól nukleozid hordozó grammonként.

II. példa ’-dimetoxitritil-dezoxitimidin-3’-klórmetoxi-fószfit

A teljesen védett nukleozid-3’-klór-metoxi-foszfitokat a szakirodalomból ismert eljárással szintetizáljuk [M. D. Matteucci, Μ. H. Caruthers, J. Am. chem. Soc. 103, 3185 (1981) és T. Tanaka, R. L. Letsinger, Nucleic Acids Research, 10, 3249 (1982)].

544,6 mg (1,0 mmól) 5’-dimetoxi-tritil-timidint (DMTrdT) feloldunk 1,0 ml vízmentes THF-ben és ezt az oldatot -78 °C-on 15 percen belül, argon atmoszférában, cseppenként adagoljuk a 0,9 mmól metil-diklór-foszfitot tartalmazó 0,5 ml. vizmentee piridinből ée 2,0 ml vízmentes THF-ból álló oldathoz, keverés közben. További 10 perc eltelte után az oldatot szobahőmérsékletig melegítjük fel, majd lecentrifugáljuk. A felülúszót egy száraz, argonnal töltött 25 ml-es csiszolt-dugós lombikba pipettázzuk. Az oldószert szobahőmérsékleten, vákuum alatt elvonjuk, majd 0,5-0,5 ml toluolt és THF-et adunk az anyaghoz, majd újból bepároljuk és ekkor egy színtelen, habszerű szilárd anyag marad vissza. A terméket tisztaságára nézve nem

-611

HU 202277 Β analizáltuk, hanem 10 ml vízmentes piridinben feloldottuk. Az oldatot argon alatt, -20 °C-on tartjuk el felhasználásig, azonban legfeljebb egy hétig.

III. példa

5’-dimetoxi-tritil-ffi-izobutiril-dezoxiguanozin-3 ’-klór-pieLoxi-foszfit

Ezen nukleozid-foszforo-kloridit oldatát a II. példában leírtakkal analóg módon, 10,0 ml piridinben, 640,0 mg (1,0 mmól) 5*-dimetoxi-tritil-NMzobutil-dezoxiguanozinból állítjuk eló.

IV. példa ’-dimetoxi-tritil-fA-benzoil-dezoxicitidinS -klór-metoxi-foszfit

Ezen nukleozid-foszforo-kloridit oldatát a II. példában leírtakkal analóg módon, 25 10,0 ml piridinben, 633,7 mg (1,0 mmól) 5’-dimetoxi-tritil-N^-benzoil-dezoxiciticinből állítjuk eló.

V. példa

5’-dime toxi- tri til-ifi- benzoil-dezoxia denozin-3 '-klór-metoxi-foszfit

Ezen nukleozid-foszforo-kloridit oldatát a II. példában leírtakkal analóg módon, 10,0 ml piridinben, 657,7 mg (1,0 mmól) 5’-dimetoxi-tritil-N⁶-benzoil-dezoxiadenozinból állítjuk elő.

VI, példa

A d-TCCTTA szintetizálása

A DMTrdA^bI-vel fedett polimer hordozó 50 mg-jét (=5 Mmól) üvegszűróbe töltjük. Ezután az alábbi felsorolásnak megfelelő sorrendben különböző oldószereket és reagenseket öntünk hozzá, a hordozót ebben rövid ideig rázzuk, majd a kivánt reakció megtörténte után az oldatot újból eltávolítjuk úgy, hogy argon gáz segítségével (felülről) a zsugorított üvegszűrőn átnyomjuk.

a) a DMTr-csoport lehasítása 70 g cink-bromid, 500 ml nitrometán és 5 ml viz összetételű oldat 3 ml-ével. Reakció-idő: 10 perc.

b) Mosás négyszer, minden alkalommal 3 ml n-butanol-lutidin-THF (4:1:5) elegyével.

c) Mosás négyszer, minden alkalommal 4 ml vízmentes piridinnel.

d) A következő nukleotid-épitőkő rákon10 denzálása úgy történik, hogy körülbelül

100 μιηόΐ 5’-dimetoxi-tritil-dezoxitimidin-3’-klórmetoxi-foszfit (II. példa) piridines oldatának 1 ml-ét argon alatt az üvegszűróben lévő polimer hordozóhoz adjuk, s a hordozót az oldatban felrázzuk.

Reakció-idő: 10 perc.

e) Mosás háromszor, alkalmanként 3 ml vízmentes piridinnel.

f) A foszforsav-triészter oxidálását 100 mg jóddal végezzük, melyet előzőleg THF, lutidin és víz (2:2:1) elegyének 3 ml-ében oldottunk fel.

Reakció-idő: 7 perc.

g) Mosás háromszor, minden alkalommal ml THF-el.

h) A nem reagált 5'-hidroxil csoportok acetilezése a következő összetételű oldattal történik:

150 mg 4-dimetil-amino-piridin, 0,3 ml kollidin, 0,25 ml ecetsavanhidrid és 2,5 ml THF.

Reakció-idő: 5 perc.

i) Mosás négyszer, mindig 3-3 ml nitrome35 tannal.

Az a)-i) ciklust még négyszer ismételjük és minden alkalommal a d) lépésnél a szekvenciához éppen szükséges nukleotid építőkövet használjuk.

A kitermelés meghatározása:

Az utolsó nukleotid építőkő kondenzéltatésa után a hordozót olajszivattyüval létesített vákuumban szárítjuk, körülbelül 1 mg mintát pontosan lemérünk belőle és hozzá45 adunk 10,0 ml-t 0,1 mólos toluol-szulfonsav acetonitriles oldatából. Ekkor leválik a dimetoxi-tritil-kation, s igy egy narancs-vörös oldatot kapunk, melynek az abszorpcióját 498 nm-en mérjük. Az alábbi képlet szerint számítjuk ki a hordozó dimetoxi-tritil-csoportokkal való fedettségét:

(Absz.⁴⁹⁸) ( higitási faktor)-14,3 Fedettség [pmól/g] = a hordozó súlya (mg)

-713

HU 202277 Β

Ha eredményként 43 pmól/g-ot kapunk, úgy az egyes kondenzációs lépéseknél átlag 85%-os kihozatalt értünk el.

A metil-gyök lehasítása a foszforsav-triészter csoportról:

A hordozót tiofenol, trietilamin és dixoán 1:1:2 arányú keverékének 4 ml-ével 45 percig rázzuk, ezután metanollal, majd éterrel mossuk.

A bázis.-védócsoport lehasítása és ezzel egyidejűleg a hexanukleotid lánc lehasítása a polimer hordozóról úgy történik, hogy a hordozót 14 órán át 10 ml tömény ammónium-hidroxid oldattal 50 °C-on melegítjük, ezután a vizes oldatot leszívjuk és a szürletet 2 ml-re betöményítjük.

A termék tisztítása:

Az igy kapott nyersterméket, amelynek 5’ végén még egy dimetoxi-tritil-védőcső port van, fordított fázisú (reversed-phase) HPLC-vel vizsgáljuk. Oszlop: μ-Bondapak Cia (Waters); oldószer: 0,1 M trietil-ammónium-acetát puffer (pH=7) 25% acetonitrillel; átfolyás sebessége: 2 ml/perc; retenciós idő: 14 perc. Az összegyűjtött frakciókat körülbelül 1 ml-re bepároljuk, hozzáadunk 10 ml 80%-os ecetsavat és 30 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután 50 °C-on vákuumban szárazra pároljuk, az üledéket 25 ml vízben feloldjuk és a lehasadt dimetoxi-tritanolt háromszor 15 ml éterrel extraháljuk. A vizes fázist újra szárazra pároljuk, az üledéket 2,5 ml vízben feloldjuk, Biogel P2 oszlopon (oszlop: 60x1,7) sótlanitjuk és liofilizáljuk.

A termék vizsgálata:

Tisztasági kontrollként az analitikai HPLC-diagramm szolgált (oszlop: 300x3,9 cm, μ-Bondapak Cu (Waters); eluáló oldat: 0,1 M trietil-ammónium-acetát puffer (pH=7) 12% acetonitrillel; átfolyás: 1,5 ml/perc; retenciós idő: 3,7 perc).

VII. példa

A d-TAAGGAGGTTTA szintetizálása

A nukleotidot a VI. példában leírtakhoz analóg módon állítjuk elő, a kiindulási anyag 300 mg (30 μιηόΐ, DMTrdA^bI ~(p) · A termék HPLC-diagramja:

Oszlop: 300x3,9 mm, μ-Bondapak Cis (Waters); Eluáló szer: 0,1 M trietil-ammónium-acetát puffer (pH=7) 12% acetonitril-. lel; átfolyás: 1,5 ml/perc; retenciós idő: 4,4 perc.

VIII. példa

A d-AGCTTAAACC szintetizálása

A nukleotidot a VI. példában leírtakhoz analóg módon állítjuk elő, a kiindulási anyag 200 mg (16 pmól) DMTrdC^te Jp)

A termék HPLC-diagramja:

Oszlop: 300x3,9 mm, μ-Bondapak Cis (Waters); Eluáló szer: 0,1 M trietil-ammónium-acetát puffer (pH=7) 12% acetonitrillel; átfolyás: 1,5 ml/perc; retenciós idő: 3,4 perc.

IX. példa

A d-CATCTTTA szintetizálása

A nukleotidot a VI. példában leírtakhoz analóg módon állítjuk elő, a kiindulási anyag 150 mg (1,32 umól) DMTrdA¹» ~(p)

A termék HPLC-diagramja:

Oszlop: 300x7,8 mm, μ-Bondapak Cu (Waters); Eluáló szer: 0,1 M trietil-ammónium-acetát puffer (pH=7) 20% acetonitrillel; átfolyás: 1,5 ml/perc; retenciós idő: 7,7 perc.

X. példa

A d-AGCTTAAAGATG szintetizálása

A nukleotidot a VI. példában leírtakhoz analóg módon állítjuk elő, a kiindulási anyag 200 mg (16,2 μιηόΐ) DMTrdG¹¹ ^<g A termék HPLC-diagramja: x

Oszlop: 300x7,8 mm, μ-Bondapak (Watere); Eluáló szer: 0,1 M trietil-ammónium-acetát puffer (pH=7) 26% acetonitrillel; átfolyás: 1,5 ml/perc; retenciós idő: 5,2 perc.

XI. példa

A d-TGTGATCTGCCTCA szintetizálása

A nukleotidot a VI. példában leírtakhoz analóg módon állítjuk elő, a kiindulási anyag 250 mg (22 umól) DMTrdA¹» ~<g)

A termék HPLC-diagramja:

Oszlop: 300x7,8 mm, μ-Bondapak Cu (Waters); Eluáló szer: 0,1 M trietil-ammónium-acetát puffer (pH=7) 25% acetonitrillel; átfolyás: 1,5 ml/perc; retenciós idő: 6,1 perc.

-815

HU 202277 Β

XII. példa

A d-CAGATCACA szintetizálása

A nukleotidot a VI. példában leírtakhoz analóg módon állítjuk elő, a kiindulási anyag 150 mg (13,2 pmól), DMTrdA^ta

A termék HPLC-diagramja:

Oszlop: 300x7,8 mm, μ-Bondapak Cu (Waters); Eluáló szer; 0,1 M trietil-ammónium-acetát puffer (pH=7) 20% acetonitrillel; átfolyás: 0,2 ml/perc; retenciós idő: 5,2 perc.

Az oligo-dezoxinukleotidok analízise

A szintetikus úton előállított oligo-dezoxinukleotidok szekvencia analízisét akkor végeztük el, amikor ezeket már a pER 33 interferon termelő plazmidba beépítettük (lásd a 2. példát: a pER 33 interferon plazmid szekvencia analízise). Ezzel a vizsgálattal egyidejűleg az oligo-dezoxinukleotidokban lévő bázisok sorrendjének helyessége is bizonyítást nyer (lásd az 5. ábrát).

1. példa

A pEfí 103 expressziós plazmid szerkesztése

A pER 103 expressziós plazmid szerkesztését az 1. ábrán sematikusan mutatjuk be.

a) A promoter/operátor fragmentum izolálása

A Serratia marcescens mintegy 1000 bp hosszú triptofán operonjának mintegy 1000 bázispárját tartalmazó pBR 101 plazmidot használjuk kiindulási anyagként a promoter/operátor szakasz izolálásához. Ez a regulator szakasz egy 90 bp hosszú Eco Rl - Hae III fragmentumon belül helyezkedik el, amelyben a promoter az Eco Rl-tól a Hae III felé irányított.

A pBR 101 a triptofán operon-fragmenst a Sáli hasitási helytől [lásd Natúré 276, 684 (1978) 1. ábra] a transzkripciós starthely utáni 128 nukleotidig (lásd a 2. ábrát ugyanott) tartalmazza. Ezt a fragmenst a pBR322-be a Sáli és EcoRl hasítási helyek közé toldják be, amikor a pBR322 652 bázispár hosszúságú EcoRI-Sall fragmense kicserélődik, és a pBRIOl-et kapják. Ennél a konstrukciónál az EcoRl és Sáli hasitási helyek megmaradnak. A fenti 90 bp hosszúságú, a -74. nukleotiddal kezdődő (EcoRl hasitási hely) és a 16. nukleotiddal végződő (Hae III hasitási hely) fragmens a triptofán operátort tartalmazó plazmid EcoRI-gyel majd HaelII-mal végzett hasításéval kapható.

A pBR 101 plazmidból körülbelül 25 ug-ot emésztünk Eco Rí restrikciós enzimmel, a keletkezett két fragmentumot gélelektroforé10 zissel (1,4% agaróz) választjuk el egymástól és a 200 bp hosszú fragmentumot a gélből elektroforézissel eluáljuk. Ezt a fragmentumot ezután Hae ΙΠ-al emésztjük, a két emésztési terméket 6%-os poliakrilamid gélben választjuk el és a 90 bp hosszú fragmentumot (promoter/operátor) is izoláljuk a gélből.

b) A riboszómakötő szekvencia (RBS) szerkesztése

Az RBS-t három szintetikus oligonukleotidból állítjuk össze: a 6mer 5’-TCCTTA-ból, a lOmer 5’-AGCTTAAACC-ból és a 12mer 5’-TAAGGAGGTTTA-ból. A 6mer-ből 500 pmól-t polinukleotid-kináz enzim segítségével foszforilélunk és egyben radioaktív izotóppal jelöljük (lásd az A fejezetet). A reakciókeveréket 10 percig 70 °C-on melegítjük, hogy a kinazt inaktiváljuk, s ezután a nem foszforilált 10mer-ből és 12mer-böl ekvimoláris mennyiségeket adunk hozzá. Az oligonukleotid keveréket ekkor 95 °C-ra hevítjük és ezután lassan (körülbelül 3 óra leforgása alatt) 30-35 °C-ra hűtjük, miközben az oligonukleotidok egymással hibridizálnak:

12mer

5’ dTAAGGAGGTTTA 3’

HO

3' dATTCCTCCAAATTCGA 5’ μ . —j ι ι .. j

6mer lOmer

0,25 mM ATP és 5 mM DTT hozzáadásával és a DNS-ligáz enzim segítségével a 6mer és 12mer között kovalens kötést létesítünk (lásd az A fejezetet). Az a körülmény, hogy a 12mer-ek és lOmer-ek 5' végei nem voltak foszforiláltak, megakadályozta, hogy multimer ligációs termékek keletkezzenek. A reakció lezajlása után a keveréket 10 percig 70 °C-on melegítjük, hogy a ligázt inaktiváljuk, majd 0,5 mM ATP-t és 5 mM DTT-t adunk hozzá, hogy egy további kináz reakció révén (lásd az A fejezetet) a 12mer-ek és lOmer-ek 5’ végei is foszforilálódjanak, s ezzel az RBS elkészüljön.

c) A promoter és az RBS összekapcsolása

A 90 bp hosszú Eco Rí - Hae III Promoter/operátor fragmentum 12 pmólnyi mennyiségét standard körülmények között (lásd az A fejezetet) 60 pmól RBS-el kapcsolunk öszsze. Minthogy a 90 bp hosszú fragmentumnak csak a Hae III hasítással előállított tompa végét (blunt-end) lehet az RBS tompa végével ligázzal összekapcsolni, csak olyan molekulák keletkeznek, amelyek az RBS-t a megfelelő irányban, a promotertöl lefelé irányítottan tartalmazzák. A reakció lezajlása után a ligézt 10 percig 70 °C-on inaktiváljuk, majd beállítjuk a TA-puffer koncentrációt (lásd az A fejezetet) és 200 egység Hind ΙΠ-mal és 10

-917

HU 202277 Β egység Eco Rl-el utóemésztést végzünk. Ezt azért előnyös elvégezni, hogy a ligáz reakciónál keletkezett multimereket (ugyanis a kivánt reakció mellett mind az Eco Rí végek, mind a HindlII végek egymással összekapcsolódhatnak) újból monomerekké alakítsuk. Ezután a mintaanyagot 6%-os poliakrilamid gélben elválasztjuk és körülbelül 100 bp hosszú promoter/operátor-RBS-fragmentumot (amely egy Eco Rí, és egy HindlII véggel rendelkezik) a gélből kivágjuk, majd elektroforézissel eluáljuk, hogy a nem kapcsolódott RBS feleslegtől elválasszuk. Ezzel az expressziós plazmid kifejeződésért felelős részét előállítottuk (lásd a 3. ábrát).

A 3. ábrában bemutatott nukleotid szekvencia a szakirodalomból ismert polinukleotid szintézisre vonatkozó módszerek alapján megszerkeszthető.

d) A promoter/operátor-RBS fragmentum beépítése a pBR 322 plazmidba

A pBR 322 plazmid 2 jug-ját Eco Rí és HindlII restrikciós enzimmel hasítjuk, miáltal két fragmentum keletkezik: egy 4332 bp hosszú nagy és egy 29 bp hosszú kis fragmentum. A nagy fragmentumot 0,8%-ob agaróz gél elektroforézissel választjuk el a kis fragmentumtól, a gélből kivágjuk és eluáljuk. E fragmentumnak mintegy 0,4 pmől-ját ligáz segítségével körülbelül 10 pmól promoter/operátor-RBS fragmentummal kapcsoljuk őszsze (lásd áz A fejezetet). A pBR 322 fragmentumok nem tudnak egymással kapcsolódni, mivel két túlnyúló végük nem illik össze; minthogy a promoter/operátor-RBS fragmentum a plazmidban csak egy irányban kapcsolható be, a HindlII hasitási hely irányéban - a pBR 322 tetraciklin-rezisztencia génje felé - fokozó hatás lép fel.

e) Escherichia coli transzformálása a pER 103 expressziós plazmiddal

Escherichia coli HB 101 sejteket (NRRL B-11371) transzformálunk ez utóbbi ligáz reakcióban előállitott szerkezettel a szakirodalomból ismert módon [Dworkin és Dawid, Dev. Bioi., 76, 435-448 (1980)] és transzformált sejteket ampicillin tartalmú agar lemezeken szelektáljuk. Az E. coli HB 101 sejteket 2x10® sejt/ml sűrűségig tenyésztjük, ülepítjük és 100 mmólos kalcium-klorid oldatban szuszpendáljuk (20 percig 0 °C-on). Ezután a sejteket a ligáz-reakció reakciókeverékével 5 percig 0-4 °C-on, majd 5 percig 37 °C-on inkubáljuk. A keverékhez ezután 0,5-1 ml L-Broth táptalajt adunk és további 15-30 percig inkubálunk 37 °C-on. Kiválasztottunk 19 transzformált sejtet és ezeket Hae III restrikciós enzimes emésztés segítségével megvizsgáltunk, hogy tartalmazzák-e a promoter/operátor-RBS fragmentumot. A 192 bp hosszú pBR 322/Hae III fragmentum hiányzott, melyet egy 264 bp hosszú fragmentum helyettesített (16 bp a Hae III hasitási helyről, amely a pBR 322-ben az Eco Rí hasitási helyétől .balra esik + 103 bp promoter/operátor-RBS fragmentum + 145 bp a HindlII hasitási helyről, amely a pBR 322-ben a következő HindlII hasitási helytől .jobbra esik). A 19 kiválasztott transzformált sejt közül 18 mutatta a várt emésztési képet (lásd a 2. ábrát).

f) A pER'103 expressziós plazmid promoter/operátor-RBS szakaszának szekvencia analízise

Hogy a megszerkesztett expressziós plazmid helyességét kétséget kizáróan megállapítsuk, elvégeztük egy ilyen plazmid (pER 103) promoter/operátor-RBS szakaszának szekvencia analízisét és meghatároztuk helyzetét a pBR 322-ben. A szekvencia analízist a szakirodalomból ismert módszerrel, Maxam és Gilbert szerint [Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 560-564 (1977)] végeztük el, mégpedig az Eco Rí hasitási helytől kiindulva a HindlII hasitási hely felé (és ezen túl), valamint a HindlII hasítási helytől kiindulva az Eco Rí hasitási hely felé (és ezen túl). Az eredmény a 3. ábrán bemutatott nukleotid szekvencia volt.

A pER 103 tehát egy olyan expressziós plazmid, amely a Serratia marcescens triptofán operonjának promoter/operátor szakaszát egy szintetikus RBS-el kombinációban tartalmazza. Ez az új expressziós plazmid elősegíti azoknak a géneknek a transzkripcióját, amelyek be vannak építve ennek HindlII hasitási helyére és lehetővé teszi ezen transzkripciós termékeknek a hatékony transzlációját. Hogy ez valóban igy van, ezt a 2. példában mutatjuk be.

2. példa

A pER 33 interferon termelő plazmid szerkesztése

a) Az érett interferont meghatározó gén szerkesztése, az aminoterminális ciszteinért felelős kodon kihagyásával

Az 1 F7 Pst I inszertumából 1 Mg-ot emésztünk Sau 3A restrikciós enzimmel és a 177 bp hosszú fragmentumot, amely az aminoterminális risztéin kodon utáni Sau 3A hasítási helytől a következő Sau 3A hasitási helyig terjed és egy Ava II hasítási helyet foglal magába, 6%-os poliakrilamid gélből izoláljuk. A fragmentumot 1 egység alkalikus foszfatázzal kezeljük (lásd az A fejezetet), majd a foszfatáz fenolos és éteres extrakcióval történő eltávolítása után etanollal kicsapjuk. Ezután a fragmentumot Ava II-vel haslt11

-1019

HU 202277 Β juk, miáltal megkapjuk a kivánt 34 bp hoszezú Sau 3A-Ava II fragmentumot és egy 143 bp hosszú fragmentumot.

Ezzel paralel a 646 bp hosszú interferon-specifikus Ava Π fragmentumot, amely a 177 bp hosszú Sau 3A fragmentumon belüli Ava II hasitási helytől a terminációs kodon mögöttig terjed, az 1 F7 plazmidból kipreparáljuk. Ebből a 646 bp hosszú Ava Π fragmentumból 0,5 Mg-ot a 34 bp hosszú és 143 bp hosszú Sau 3A - Ava II fragmentumok keverékével együtt DNS ligáz enzimmel inkubálunk (kohéziós végek összekapcsolása, lásd az A fejezetet). Ezáltal olyan Ava II fragmentumok jönnek létre, amelyeket - kovalens kötés által - Ava Π-Sau 3A fragmentumok határolnak. Ahogy egy Ava-II-Sau 3A fragmentum egy Ava II fragmentummal kapcsolódik, ezen a helyen további kapcsolódások nem képződhetnek, mivel a Sau 3A végek defoszforilálódtak. A ligáz reakció után a reakció keveréket 70 °C-on 10 percig melegítjük, hogy az enzim inaktiválödjék, ezután 5 mM DTT-t és 0,25 mM ATP-t adunk hozzá, s igy a defoezforilált Sau 3A végeken újból végbemegy a kinéz reakció (lásd az A fejezetet). A reakciókeveréket 6%-os poliakrilamid gélben választjuk el és a 700-800 bp hosszú molekulákat (egy 646 bp hosszú Ava fragmentum, amelyet két Ava Π-Sau 3A fragmentum határol), valamint az 1300-1500 bp hosszú molekulákat (két egymáshoz kapcsolt 646 bp hosezú Ava II fragmentum Ava Π-Sau 3A fragmentumokkal határolva) eluáljuk.

b) Az alábbi formulájú oligonukleotid-komplex előállítása

12mer | 14mer

I—— -:-1 I—rp5’ AGCTTAAAGATGTGTjGATCTGCCTCA

3’ ATTTCTACACACTAgJaC

Hin dili !

8mer 9mer ι

MetCys <Sau 3A

Négy szintetikus úton előállított oligonukleotidot, azaz egy 14mer 5’ TGTGATCTGCCTCA-t, egy 12mer 5’ AGCTTAAAGATG-t, egy 9raer 5’ CAGATCACA-t és egy 8mer 5’ CATCTTTA-t a következőképpen reagáltatunk: a 8mer, 9mer és lOmer mindegyikéből 250 pmól-t foszforilálunk (lásd az A fejezetet), a reakció végbemenetele után a kinázt 95 °C-on inaktiváljuk, az oligonukleotid keverékhez 250 pmól nem foszforilált 12mer-t adunk, majd a keveréket lassan (3 órán át) 35 °C-ra hűtjük, hogy lehetővé tegyük az oligonukleotidok hibridizációját. Ezután a keverékhez 5 mM DTT-t és 0,25 mM ATP-t adunk és az oligonukleotidokat ligáz reakcióval egymáshoz kapcsoljuk {.blunt-end' ligáz reakció, lásd az A fejezetet). Tekintve, hogy a 12mer 5’ vége nem foszforilált, dimerek nem képződnek; a 14mer-ek túlnyúló végei egymással nem komplementerek, Így ez sem vezethet dimerizációhoz.

Az összekapcsolt oligonukleotid-komplex egy alikvot mennyiségét (25 pmól) 80 egység Sau 3A-val emésztjük, hogy az interferon génhez illeszkedő Sau 3A véget előállítsuk. Ennek érdekében a mintát 10 percig 75 °C-on melegítjük, fenollal extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. Ezzel a lépéssel azt a linker-fragmentumot, amely az interferon gént a HindlII-mal hasított pER 103-al a találmány szerint összeköti, elkészítettük.

c) Az interferon gén és az oligonumkleotid- komplex összekapcsolása, ligáz reakció a pER 103-ban

Az izolált interferon fragmentumokat (lásd a 2a. példát), amelyek körülbelül 1 pmól-nyi molekulát képviselnek, összekapcsoljuk a Sau 3A-val hasított oligonukleotidkomplex-el (kb. 25 pmól) a kohéziós Sau 3A végek ligáz enzimes reakciója révén (lásd az A fejezetet). Ez eeetben is gátolt a multimerek felépülése, mivel az oligonukleotid-komplex (12mer) HindlII végéről hiányzik a foszfát csoport. Olyan interferon gén molekulák keletkeznek, amelyeket mindkét végükön egy szabad HindlII végű oligonukleotid-komplex határol. A ligáz hődenaturálása után, a reakciókeverékhez 5 mM DTT-t és 0,25 mM ATP-t adunk, s igy ezek a végek ie foszforilálódnak (lásd az A fejezetet), majd izopropanollal kicsapást végzünk (lásd az A fejezetet), hogy a ligáz reakcióban ugyancsak keletkezett oligonukleotid-komplex dimereket leválasszuk. A szerkezetet ezután a 0,05 Mg HindIII-al hasított, foszfatázzal kezelt pER 103-al összekapcsoljuk (kohéziós végek ószszekapcsolása; lásd az A fejezetet). A HindIII-al hasított plazmid foszfatázzal történő kezelése (lásd az A fejezetet) csökkentette a plazmid újbóli gyűrűbe záródását a ligáz reakció folyamán, igy egy olyan plazmid keveréket állítunk elő, amely 50%-ban interferon termelő plazmidokat tartalmaz (ezek azok a plazmidok, amelyek a gén elején egy 34 bp hosszú Sau 3A-Ava II fragmentumot a 646 bp hosszú Ava II fragmentummal ósszekapcsoltan tartalmazzák - lásd a 2a. példát).

-1121

HU 202277 Β

d) Escherichia coli.HB 101 transzformálása és a transzformáció vizsgálata interferon termelés szempontjából

A 2c. példa szerint előállított plazmid keveréket az le. példában leírtakhoz analóg módon Escherichia coli HB 101 transzformálására használjuk [lásd Dworkin és Dawid, Dev. Bioi. 76, 435-448 (1980]. A kapott transzformáit sejtek mintegy 20%-a (a többi gyűrűbe záródott pER 103 plazmid volt) tartalmazott inszertumot, s ezek közül többet interferon expresszióra vizsgáltunk. 100 ml M9 minimál táptalajban tenyésztjük a baktériumokat, 0,6-0,8 optikai sűrűség eléréséig. A táptalajhoz előzőleg hozzáadjuk az összes aminosavat (aminosavkén* 20 pg/ml-t), kivéve a triptofánt, valamint tiamint (1 pg/ml-t), glükózt (0,2%-ot) és a triptofán operon induktorát, az indol-3-akrilsavat [1AA, 20 Mg/ml; lásd Hallewell és Emtage, Gene, 9, 27-47 (1980)]. A baktérium sejteket 10 percig 7000 ford./perc mellett centrifugálással ülepítjük, egyszer mossuk 50 mM trisz-sósav (pH=8) és 30 mM nátrium-klorid keverékével, majd ugyanezen puffer 1,5 ml-ében szuszpendáljuk. A szuszpenziót 1 mg/ml lizozimmel 30 percig jégben inkubáljuk, majd a baktériumokat ötször fagyasztjuk és felolvasztjuk és ezután a sejt.-törmelékeket egy órai 40.000 ford./perc melletti centrifugálással eltávolítjuk. A felülúszót sterilre szűrjük és interferon aktivitását plakk-redukciós módszerrel [Arch. Virol. 72, 169-178 (1982)] - V3 sejtekkel és vezikuláris-sztomstitisz-virussal - határozzuk meg. A kiónoknak (inszertummal rendelkezők) mintegy fele tekintélyes interferon expreszsziót mutatott: 1 liter tenyészet 2x10* egységet (nemzetközi referencia egység) tartalmazott. Az interferont ismert módszerekkel nyerjük ki, és tisztítjuk [Natúré 285, 446 (1980); J. Bioi. Chem., 256, 9750 (1981)].

e) A pER 33 interferon termelő plazmid szekvencia analízise

Egy ilyen interferon termelő kiónt (pER 33) kiválasztottunk és a promoter/operátor szakasztól kezdve az interferon génen belülre terjedő részig szekvencia analízist végeztünk, hogy megállapítsuk a megszerkesztett plazmid helyes voltát. A szekvencia analízis itt is Maxam és Gilbert módszerével [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1977)] történt és az Eco Rí hasítási hely radioizotóppal jelzett 3’ végétől kiindulva az interferon gén irányába haladt. A várt szekvenciát kaptuk, amelynek egy részletét az 5. ábrán mutatjuk be. Ebben a részben a pER 33 szerkesztéséhez felhasznált összes oligonukleotid fragmentum ezerepel.

Az előbbiekben említett tulajdonságok alátámasztják, hogy a találmány szerint előállított pER 103 expressziós plazmid a Serratia marcescens triptofán operonjának promoter/operátor szekvenciáját egy szintetikus riboszómakötő szekvenciával kombináltan tartalmazza. A leukocita interferon példájával bemutathattuk, hogy a pER 103 expressziós plazmidba megfelelő módon beépített gének magas értékű expressziót mutatnak. A pER 103 expreseziós plazmidot az Escherichia coli K 12 és HB 101 törzsben letétbe helyeztük a budapesti megállapodás alapján a Deutsche Sammlung von Mikroorganiemen (Griesbach Strasse 8, D-3400 Göttingen) törzsgyűjteményében 1983. október 27-én, DSM-2773 letéti szám alatt.

3. példa

A pER 21/1 interferon termelő plazmid szerkesztése

A pER 21/1 plazmid szerkesztésének sémáját a 6. ábrán mutatjuk be.

a) Az IFN-dCA gén preparálása a pER 33-ból jug pER 33-at Eco Rí és Bam Hl restrikciós enzimmel hasltunk, miáltal két fragmentum keletkezik, egy körülbelül 1300 bp hosszú és egy körülbelül 4000 bp hosszú. Ezeket a fragmentumokat 1,2 %-os agaróz gélben elektroforézissel választjuk el. A rövidebb fragmentumot a gélből elektro-elücióval izoláljuk. E DNS végeit egyenként 1,25 nmól dATP, dGTP, dCTP és dTTP, valamint 2 egység Klenow fragment (DNS polimeráz I) hozzáadásával tompa végekké (blunt-end) alakítjuk. A DNS-t fenolos extrahálással és etanolos oldatból történő kicsapéssal tisztítjuk, majd 15 yl vízben vesszük fel.

Körülbelül 15 pmól Eco Rl-linkert (New England Biolabs Inc.) 5 pl oldatban y-“P-ATP és T4 polinukleotid kinéz hozzáadásával 5’ végein foszforilálunk. A kinéz hődenaturálása után a DNS-hez 5 nmól ATP-t és 0,1 egység T4 ligázt adunk és 16 órán át 14 °C-on inkubáljuk. A reakcióterméket az alacsony molekulatőmegű anyagoktól izopropanolos kicsapással tisztítjuk meg.

Végül a DNS-t 20 egység Eco Rí restrikciós enzimmel hasítjuk, még egyszer tisztítjuk izopropanolos kicsapással és 10 pl vízben feloldjuk.

b) A pER 33 plazmid linearizálása

Körülbelül 2 Mg pER 33-at Eco Rl-restrikciós enzimmel kezelünk. Ezután alkalikus foszfatázt adunk hozzá, hogy az 5*-foszfát csoportot eltávolitsuk. A körülbelül 5300 bp hosszú, lineáris DNS-t 1,2%-os agaróz gélben elektroforézissel, majd elektro-elúcióval a

-1223

HU 202277 Β maradék, nem hasított pER 33-tól megtisztítjuk. A DNS-t fenollal és éterrel extraháljuk, etanolos oldatból kicsapjuk és 10 pl vizben oldjuk.

c) A linearizált pER 33 összekapcsolása a hozzáadott IFN-oCA génnel

IFN-cCŐ gént és regulációs elemeket tartalmazó Eco Rl-linkerrel ellátott DNS-darab tartalmú 4 jul-nyi oldathoz hozzáadunk 0,5 pl Eco Rl-el linearizált és defoszforilált pER 33-at 20 μΐ-nyi reakció közegben és a molekulákat 0,1 egység T4 ligáz segítségével egymással összekapcsoljuk. A reakcióelegyet 16 órán át 14 °C-on inkubáljuk, majd az enzimet 68 °C-ra történő hevítéssel elbontjuk.

d) E. coli HB 101 transzformálása és a transzformáció vizsgálata interferon termelés szem pon tjá ból

E. coli HB 101 sejteket az le. példában leírtak szerint a 3c. példa DNS-ével transzformálunk. Két ilyen módon előállított klón interferon expresszióját a 2d. példához analóg módon plakk-redukciós módszerrel megvizsgáltunk. Míg a pER 33 klón 200x10® egység IFN-t termel tenyészet literenként, addig az új kiónok egyike - pER 21/1 a jele meglepő módon több mint 300x10® egységet termelt tenyészet literenként. Az interferont ismert módszerekkel nyerjük ki, és tisztítjuk [lásd 2.d) példánál].

e) A pER 21/1 restrikciós enzimes vizsgálata

A pER 21/1 plazmidot nagyobb mennyiségben izoláltuk és HindllI restrikciós enzimmel történő emésztés segítségével analizáltuk. Minthogy a pER 33-ban az Eco Rí helyre bevitt DNS-nek két azonos Eco Rí vége van, e DNS-nek két lehetséges iránya lehet a pER 21/1-ben. Parellel irányú interferon génnel rendelkező pER 21/1 HindllI restrikciós enzimes emésztésekor 4100, 950 (két fragmentum) és 450 bp körülbelüli nagyságú fragmentumoknak kell keletkezniük. Amennyiben a két gén ellentétes irányú, a várható fragmentumok hozzávetőleges nagysága 4350, 950 (két fragmentum) és 200 bp lesz. A pER 21/1 plazmid 2 pg-ját HindllI restrikciós enzimmel emésztve, majd ezt kővetően 1,4%-os agaróz gélben elektroforézissel elválasztva, olyan fragmentumok keletkeztek, melyek körülbelül 4100, 950 és 450 bp nagyságúak voltak. Ebből következett, hogy mindkét IFN-oCA gén iránya egymáshoz képest párhuzamos volt (lásd a 6. ébrét).

4. példa

A parpER 33 interferon termelő plazmid szerkesztése

A parpER 33 plazmid szerkesztésének sémáját a 7. ábrán mutatjuk be.

a) a par-lokusz előállítása

Körülbelül 200 pmól Eco Rí linkért (New England Biolabs Inc.) 20 μΐ reakció-közegben egység T4 polinukleotid kinázzal és nmól ATP-vel a végein foszforilálunk, majd ezután az enzimet hővel inaktiváljuk.

A pPM 31 plazmid 8 pg-ját Ava I restrikciós enzimmel hasítjuk. A linearizált plazmid végeit egyenként 5 nmól dATP, dGTP, dTTP, valamint 4 egység Klenow fragment (polimeráz I) hozzáadásával tompa végekké (blunt-end) alakítjuk. A DNS-t fenollal extraháljuk, etanolos oldatból kicsapjuk és 40 pl vizben felvesszük.

Az Eco Rí linkért a linearizált tompa végeket mutató DNS-el együtt 70 μΐ reakció térfogatban 6 nmól ATP-vel és 1 egység T4 ligázzal 16 órán át 14 °C-on kezeljük. Az enzim hődenaturálása után az oldatot 50 nmól nátrium-klorid és 50 nmól trisz-sósav hozzáadásával pH=7,6 értékre állítjuk be, majd a DNS-t 300 egység Eco Rl-el kezeljük. Két órai inkubálás után a restrikciós enzimet hővel denaturáljuk és a DNS-t 1,4%-os agaróz gélben elektroforézissel elválasztjuk. A pár-lokuszt tartalmazó mintegy 400 bp hosszúságú DNS darabot a gélből elektroforézissel eluáljuk, fenolos extrahálással és etanolos oldatból történő kicsapáseal tisztítjuk, majd 50 pl vizben feloldjuk. Ez a DNS darab Eco Rl-specifikus túlnyúló végeket hordoz.

b) A pER 33 plazmid linearizálása

A pER 33 plazmid 2 pg-ját Eco Rí restrikciós enzimmel kezeljük. Ezt követően alkalikus foszfatázt adunk hozzá az 5'-foszfát csoport eltávolítása céljából. A körülbelül 5300 bp hosszú, lineáris DNS-t 1,2%-os agaróz gél-elektroforézissel, majd elektro-elúcióval a maradék, nem hasított pER 33-tól megtisztítjuk. A DNS oldatot fenollal és éterrel extraháljuk, etanolos oldatból kicsapjuk, majd 50 pl vizben feloldjuk.

c) A linearizált pER 33 összekapcsolása a par-lokusz DNS-el pl linearizált pER 33 DNS-t 1 pl par-lokusz DNS-el 0,1 egyeég T4 ligáz segítségével 20 pl reakció-térfogatban egymáshoz kapcsolunk. A reakcióelegyet 16 órán át 14 °C-on inkubáljuk, majd az enzimet hővel inaktiváljuk.

-1325

HU 202277 Β

d) Az E. coli HB 101 transzformálása és a transzformált baktériumokból származó plaz-		cDNS:	mRNS-el komplementer DNS
midok vizsgálata		Kódolni:	információt hordozni valamire nézve; a
E. coli HB 101 sejteket az le. példában leírtakkal analóg módon transzformálunk a 4c. példában szereplő DNS-el. Körülbelül 50 telepet kaptunk. Tiz telepből kismennyiségű plazmid DNS-t izoláltunk [Bimbóim és Doly,	5		DNS nukleotid szekvenciájában hordozza egy protein aminosav szekvenciájára vonatkozó informáci-
Nucleic Acid, Research, 7, 1513-1523 (1979)],	10		ót
amelyet Pst I-restrikciós enzimmel hasítottunk. Az agaróz gél elektroforézis eredménye		Kodon:	három nukleotidból álló csoport, amely
azt mutatta, hogy mindezen plazmid tartalmazta a körülbelül 400 bp hosszú par-lo-			egy meghatározott aminoeavat, vagy
kuszt. Közülük egy plazmidot kiválasztottunk és parpER 33-al jelöltünk.	15		pedig a polipeptid szintézis megszakítását kódolja
e) A parpER 33 vizsgálata interferon terme-		Defoszforilálas:	foszfát csoportot eltávolítani
lés és stabilitás szempontjából	20	DNS:	dezoxiribonukleinsav
		DTT:	ditiotreitol
A 2d. példában leírtakkal analóg módon pER 33 és parpER 33 tartalmú baktérium sejteket tenyésztettünk, majd plakk-redukciós		Elektroforézis:	(DNS-) molekulák elválasztása elektromos térben
módszerrel interferon tartalomra vizsgáltunk.	25	Expresszió=
Mindkét törzs körülbelül ugyanazon nívójú interferon expressziót mutatott. Az interferont a 2d és 3d példáknál említett módon nyerjük- ki, és tisztítjuk.		=kifejeződés:	egy gén információjának átváltoztatása mRNS-é transzkripció által és ezt kö-
Egy hosszantartó vizsgálatban, amely 120 baktérium generáción keresztül húzódott,	30		vetően polipeptiddé transzláció révén
a pER 33 és parpER 33 plazmid stabilitását vizsgáltuk meg az ampicillin (antibiotikum) által gyakorolt szelekciós kényszer nélkül.		Expressziós plazmid:	plazmid, amely a beépített (inszer tált) gén kifejeződését
Egyenlő időközönként a tenyészetekből mintát vettünk és a baktériumokat interferon	35		(expresszióját) lehetővé teszi
tartalomra vizsgáltuk.- Kiderült, hogy a pER 33 tartalmú baktériumok körülbelül a 60. generáció után az interferon termelést abba-		Gén:	a DNS-en egy olyan szakasz, amely egy meghatározott RNS
hagyták. A parpER 33-at tartalmazó baktériumsejtek még a 120. generáció után is csökkenés nélkül termeltek oCA interferont. így bizonyítottuk, hogy a par-lokusz	40		molekula információját hordozza és ez a következőkben proteinné fordítható át
bevitele a pER 33-ba (.parpER 33) a plaz-		Géntermék:	RNS (transzkripciós
mid stabilitását az E. coli HB 101 törzsben megnöveli.	45	Hibridizálás	termék), protein (transzlációs termék)
HASZNÁLT FOGALMAK ÉS RÖVIDÍTÉSEK ATP; adenozintrifoszfát Bázispár: két komplementer	50	(n u kiéin savak é):	egymással komplementer DNS-szálak közti stabi) komplexek létrehozása
nukleotid, például A-T, G-C		Hibrid plazmid:	plazmid, amely idegen eredetú DNS
Blunt-end	55		szakaszt tartalmaz
(tompa vég): kétszálü DNS mole- kula vége, ahol pár		IFN-oCA:	a leukocita interferon A szubtipusa
nélküli bázis nincs, me g külön bőztetésül		Iniciációs kodon:	az ATG kodon, amely a metionint kódolja
az egyszálú, túllógó végektől	60		és a transzláció kezdetéhez adhat jelt
Bp: bázispár BSA: marha szérum albu- min		Inszertum:	idegen DNS darab, amely egy hibrid plazmidban van jelen

-1427 HU

Kináz:	enzim, amely a DNS és RNS molekulák 5' végein lévő hidroxil-csoportokat foszforilálja
Kinázzal kezelni:	5’-foszfát csopor- tokkal ellátni
Klón:	egyetlen baktériumból származó baktérium telep
Kohéziós végek:	egy DNS molekula túllógó egyfonalú végei, amelyek egymással hibridizálhatnak
Komplementer:	egymáshoz illő (nukleotidok a DNS-ben: A komplementer T-vel, G Komplementer C-vel)
Ligáz:	enzim, amely különböző DNS molekulákat kovalens kötéssel képes egymáshoz kapcsolni
Ligázzal kezelni:	(DNS molekulákat) kovalens kötéssel egymáshoz kapcsolni
mRNS:	messzendzser RNS, amely egy polipeptidet kódoló RNS
Nukleotid:	DNS vagy RNS építőköve (A=adenozin, C=citidin, G=guanozin, T=timidin, U= =uracil)
Nukleotid szekvencia:	egy DNS vagy RNS molekulában a nukleotidok egymást kővető sora
Oligonukleotid:	foszfodiészter kötéssel egymáshoz kapcsolt néhány (kevés) nukleotid (rövid, egyszálú DNS szakasz)
Operátor:	az operon szabályozó szakaszának egy része, ahova a represszor kötődik, miáltal a transzkripció gátolt lesz
Operon:	(bakteriális) gének csoportja, amelyeket egy operátor szakasz szabályoz
Foszfatáz:	enzim, amely a DNS molekulákról 5’- -foszfát csoportokat képes eltávolítani
Plazmid: 16	kromoszómán kívüli gyűrűs DNS molekula

Β 28

	Promoter:	DNS szekvencia, amely alkalmas az RNS polimeráz enzimmel való kapcso-
5	RBS:	lódásra lásd: riboszómakötő szekvencia
	Restrikciós endonukleáz
10	(restrikciós enzim):	enzim, amely egy meghatározott szimmetriájú DNS szekvenciánál a kétszálú DNS-t hasítani képes
15	Restrikciós fragmentumok:	DNS töredékek, amelyek restrikciós endonukleázzal történő emésztéskor kelet-
20	Riboszómakötő	keznek
	szekvencia:	a mRNS azon része, amely a riboszómához tud kötődni
25	RNS:	ribonukleinsav
	RNS-polimeráz:	enzim, amely egy DNS-el komplementer RNS fonalat képes szintetizálni
30	Szekvencia:	lásd: nukleotid szekvencia
	Terminációs kodon:	kodon, amely a transzláció befejezésére ad jelt
35	Transzformált sejt:	baktérium, amelyben transzformáció révén idegen DNS (egy plazmid) jutott be
	Transzformáció:	idegen (plazmid-)
40	Transzkripció:	DNS bejuttatása baktériumok ba DNS templáttal komplementer RNS szintézise
45	Transzláció:	a mRNS információjának átfordítása polipeptiddé
	Trisz:	trisz-hidroximetil-aminometán

AZ ÁBRÁK RÖVID ISMERTETÉSE

Az 1. ábrán a pER 103 expressziős plaz55 mid szerkesztésének sémáját mutatjuk be. A fragmentumok nagysága nem mérethű.

A 2. ábra a pBR 322 és a pER 103 plazmidok Hae Ill-al történő emésztése révén kapott képet ábrázolja. A pBR 322 plazmid

192 bp hosszú fragmentuma helyett a pER

103-ban egy körülbelül 270 bp hosszú fragmentum van.

-1529

HU 202277 Β

A 3. ábrán a pER 103 nukleotid szekvenciáját mutatjuk be az Eco Rí és a Hin dili hasitási hely között. A plazmid további része a pBR 322 nagy Hin dlII-Eco Rí fragmentumának felel meg.

A 4. ábrán a pER 33 interferon termelő plazmid szerkesztésének sémáját mutatjuk be. 4: Pst I hasitási hely, : Sau 3A hasitási hely,+ : Ava II hasitási hely. Az 1 F7 inezertűm restrikciós térképének kivételével a fragmentumok nem mérethűek.

Az 5. ábra egy szekvenáló gél egy olyan részletét mutatja be, amelyen a promoter-RBS-interferon-gén kapcsolat látható. A pER 33 szerkesztéséhez felhasznált minden oligonukleotid fragmentum megtalálható benne. A jobb megértés szempontjából ugyanezt a szekvenciát mégegyszer, mint kétfonalút adjuk meg; az egyes oligonukletid építőköveket beírtuk.

A 6. ábra sematikusan ábrázolja a pER 21/1 interferon termelő plazmid szerkesztését. A fragmentumokat, illetve plazmidokat nem mérethűen rajzoltuk meg.

A 7. ábrán a parpER 33 interferon termelő plazmid szerkesztését mutatjuk be sematikusan. A fragmentumok, illetve plazmidok ábrái nem mérethűek.

Claims (15)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás humán oC-interferon genetikai anyagát magában hordozó DNS szekvencia elöállitására, azzal jellemezve, hogy Serratia marcescens triptofán operonjának 90 bp hosszúságú promoter/operátor szekvenciáját egy

   5’ TAAGGAGGTTTA

   3’ ATTCCTCCAAATTCGA szerkezetű riboszömakötő szekvenciával kapcsoljuk össze, az igy létrejött DNS szekvenciához egy linker szekvenciát kapcsolunk, és ezt a DNS szekvenciát eC-interferont meghatározó etrukturális génnel kapcsoljuk össze.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy interferont meghatározó strukturális génként humán cC2c interferont kódoló gént alkalmazunk.
3. 3. Az 1. igénypont ezerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS szekvenciához az

   5’ AGCTTAAAGATG

   3’ ATTTCTAC képletű linker szekvenciát kapcsoljuk.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás a
5. 5’AATTCACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3 ’ GTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG t-— PromoterGCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTAAGCT CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCCATTCCTCCAAATTCGA -Promoter/operátor--RBS--------——- |

   HindlII ι-IFN-cC2C-Gén->

   TAAAGATGTGTGATCTGCCTCAAA ATTTCTACACACTAGACGGAGTTT t----linker----1 képletű DNS szekvencia elöállitására, azzal jellemezve, hogy a képlet szerinti DNS eleme45 két kapcsoljuk össze.

   5. Eljárás humán oC-interferon genetikai anyagát magában hordozó DNS szekvenciát tartalmazó termelő plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy egy plazmidba, előnyösen a

   5θ pER103 expressziós plazmidba az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti, egy vagy több DNS szekvenciát építünk be, és adott esetben a pPM31 plazmidból izolált par-lókuszt is beviszünk.

   55
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a plazmidba egy, 4. igénypont szerinti DNS szekvenciát építünk be.
7. 7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a plazmidba két, 4. igény60 pont szerinti DNS szekvenciát építünk be.
8. 8. Az 5. igénypont ezerinti eljárás a pER33 termelő plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a pER103 expressziós plazmidba a 4. igénypont szerinti DNS szekvenciát

   65 építjük be.

   -1631

   HU 202277 Β
9. 9. Az 5. igénypont szerinti eljárás parpER33 termelő plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a 8. igénypont ezerint előállított pER33 termelő plazmidba pPM31-ből izolált par-lókuszt építünk, be. 5
10. 10. Az 5. vagy 7. igénypont szerinti eljárás több, 4. igénypont szerinti DNS szekvenciát tartalmazó termelő plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a 8. igénypont szerint előállított pER33 termelő plazmidba 10 egy vagy több 4. igénypont szerinti DNS szekvenciát építünk be.
11. 11. Az 5. vagy 10. igénypont szerinti eljárás a pER21/l termelő plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a pER33 termelő 15 plazmidba egy, 4. igénypont szerinti DNS szekvenciát építünk be.
12. 12. Eljárás humán oC-interferon előállítására alkalmas E. coli transzformánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy az 5-10. 20 igénypontok bármelyike szerinti termelő plazmidot Eacherichia coli törzsbe transzformálunk.
13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a plazmidot Eacherichia 25 coli HB101 törzsbe transzformáljuk.
14. 14. Eljárás humán cC-interferon előállítására, azzal jellemezve, hogy a 12. vagy 13. igénypont szerint előállított transzformánst megfelelő tápkőzegben tenyésztjük, és a te- 30 nyészetből az interferon-fehérjéket kinyerjük.
15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás oC2C interferon előállítására, azzal jellemezve, hogy a 8., 9. vagy 11. igénypont szerinti 35 termelő plazmidot tartalmazó, a 13. igénypont ezerint előállított transzformánst megfelelő tápkőzegben tenyésztjük, és a tenyészetből az oC2C interferont kinyerjük.