FI86991C - Rekombinant-dna-sekvenser, deras framstaellning och dessa sekvenser innehaollande plasmider - Google Patents

Description

1 86991

Rekombinatti-DNA-sekvenssit, niiden valmistus ja näitä sekvenssejä sisältävät plasmidit - Rekombinant-DNA-sekvenser, deras framställning och dessa sekvenser innehällande plasmider

Bakteereissa tapahtuvan geenien ekspression edellytyksenä on, että läsnä on nk. promoottoria eli bakteeriperäisen RNA-poly-meraasin sitoutumisen tunnistamissekvenssiä. Promoottori mahdollistaa siten myötäpuolel 1 a sijaitsevien sekvenssien transkription. Geeneissä, joiden tuotteita aina syntetisoidaan, on promoottoreita, jotka aina voivat sitoa RNA-polyme-raasi-molekyy1 ejä. Bakteereiden muut geenit tai operonit ovat säätelyn alaisia, so. tiettyjen mekanismien avulla voidaan niiden promoottoriin päästä tai estää pääsy.

Haluttujen geenituotteiden synteesin toinen edellytys on RNA transkriptien tehokas translaatio, bakteereiden riboso-meihin. Shine ja Dalgarno (kts. Nature 254. 34-38 (1975) ovat siten osoittaneet, että bakteereissa nRNA:n 5’-päässä sijaitseva nukleotidisekvenssi vastaa tästä sitoutumisesta ribo-somiin.

Esillä olevan hakemuksen tavoitteena on siten parantaa bakteereille vieraiden proteiinien geeniteknologista tuottoa tunnetun promoottorin avulla, joka on sitoutunut rakennegeenin uuden ribosomi-sidonta-/kytkentäsekvenssin avulla. Esillä olevan keksinnön kohteena on siten rekombinantti-DNA-sekvenssi, jonka kaava on

5'AATTCACGCTGATCGCTAÄAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3' GTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG

K-Promoottori ----- 2 86991 GCGAACCAGTTÄÄCTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTA CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCCATTCCTCCAAATTCGA -Promoottori/operaattori -^-RBS-

Hin dl 11 johon lopuksi voidaan liittää ribosomi-sidossekvenssiin sekvenssi, jonka yleiskaava on <DNA-sekvenssi, joka koodaa puhtaan IFN-q> 5 ’ AGCTTAAAGATGTGTGATCTGCCTCAA-> 3 ' ATTTCTACACACTAGACGGAGTT -> < —-ky t k entä os a-> siten, että se bakteerien avulla voidaan ekspressoida ja että DNA-sekvenssien yhdistäminen tapahtuu siten, että rakennegee-nin DNA-sekvenssi kytketään DNA-kytkentäsekvenssiin 3',5'-fosfodiesterisidoksella.

Esillä olevan keksinnön kohteena ovat edelleen näitä sekvenssejä sisältävä ekspressioplasmididt, joissa edelliseen sekvenssiin liittyneenä on ainoa plasmidin Hin dl 11-katkaisukoh-ta, johon kyseinen haluttu geeni voidaan laittaa tuottoplasmi-din valmistusta varten, ja näin valmistettujen tuottoplasmidi-en käyttö eukaroyyttisten geenituotteiden valmistamiseen pro-karyooteista, erityisesti 1eukosyytti-interferonin valmistamiseen.

Keksinnön mukaisen tavoitteen saavuttamiseksi toimitaan esimerkiksi seuraavasti: 3 86991

Sopivan bakteeriperäisen promoottorisekvenssin valinta: Tähän käytetään parhaiten promoottoria, joka voidaan indusoida tai reprimoida yhdistelmänä operaattorisekvenssin kanssa. Tällaisen promoottorin etuna on, että halutun bakteerille vieraan proteiinin synteesi voidaan kytkeä päälle vasta bakteerin kasvusyklin myöhäisessä vaiheessa, esimerkiksi trypto-faanioperonin tapauksessa (kts. Hallewell ja Emtage, Gene 9_, 27-47 (1980) poistamalla kasvatusmediumista tryptofaani ja lisäämällä kasvatusmediumiin tryptofaanioperonin indusorina toimivaa indoli-(3)-akryy1ihappoa, jolloin ei vaikuteta bak-teereiden lisääntymiseen. Ekspressioplasmidin rakentamiseen käytetään tarkoituksenmukaisesti erittäin voimakasta ja säädeltävää kirjallisuudesta tunnettua (kts. Miozzari ja Yanofs-ky, Nature 276, 684-689 (1978)) Serratia marcescens-bakteerin tryptofaanioperonin promoottori/operaattori-systeemiä, jonka kaava on

5'AATTCACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAÄGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3' GTGCGACTAGCGATTTTGTAACÄCGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG

------------Promoottori- GCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGG CGCTTGGTCAATTGATCÄTGTGTTCAAGTGCCGTTGCC -Promoottori/operaattori-> Tämä saadaan kirjallisuudesta tunnetuilla menetelmillä. Ribosomi-sidontasekvenssin rakentaminen: Tähän käytetään erityisen tehokkaasti kuvattua sekvenssiä, jonka kaava on: 4 86991

5'TAAGGAGGTTTA

(kts. Jay et al . in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78_, 5543-5548 (1981).

Ribosomi-sidontasekvenssin, jonka kaava on 12 mer

5' TAAGGAGGTTTA 3' ATTCCTCCAAATTCGA

«_I * --1 6mer lOmer rakentaminen tapahtuu parhaiten yhdistämällä kirjallisuudesta tunnetuilla menetelmillä 3 synteettistä oiigonukleotidia, joiden kaavat ovat 6mer 5' TCCTTA, lOmer 5' AGCTTAAACC ja 12mer

5’ TAAGGAGGTTTA

jolloin on tarkoituksenmukaista ensin markkeerata radioaktii-visesti 6mer oligonukleotidi.

Tämän jälkeen suoritettava promoottori/operaattorin liittäminen ribosomi-sidontasekvenssiin tapahtuu kirjallisuudesta tunnetuilla menetelmillä.

Ekspressioplasmidin rakentaminen:

Plasmidista, esimerkiksi pBP 101 plasmidista, joka sisältää osan Serratia marccescens'in tryptofaanioperonista, katkais- 5 86991 taan Eco Rl ja Hae III restriktioentsyyminen avulla 90 bp pituinen promoottori/operaattori-sekvenssi. DNA-1igaasientsyy-min avulla tämä pala liitetään sen jälkeen synteettisesti valmistettuun RBS (ribosomin sidontasekvenssi)-sekvenssiin ja näin valmistettu promoottori/operaattori-RBS-pala, joka sisältää Eco Rl-pään ennen promoottori/operaattoria ja Hindlll-pään RBS:n jälkeen, laitetaan pBR 322 plasmidiin plasmidin oman 29 bp pituisen Eco RI-Hindlll-palan asemesta. Näin rakennetun ekspressioplasmidin (pER 103) toiminta HindiII-katkaisukohtaan muodostettujen geenien ekspression suhteen on osoitettu subtyyppi A (IFN-αΑ) leukosyytti-interferonia koskevassa esimerkissä .

IFN-αΑ interferonin ekspressio pER 103-plasroidissa:

Interferonia syntetisoidaan ihmissoluissa, kuten muitakin kuljetettavaksi tarkoitettuja proteiineja, esiproteiinina, so. Leader-sekvenssin sisältävänä proteiinina. Vasta proteiinimo-lekyylin poistuessa solusta lohkaisee tämän Leader-sekvenssin pois tähän erikoistunut entsyymi, jolloin muodostuu valmis proteiinimuoto. Eräs mahdollisuus syntetisoida bakteereiden valmista interferonia on, että poistetaan Leader-sekvenssi DNA-tasossa, so. rakennetaan geeni, joka koodaa vain valmiin proteiinin sekvenssejä.

Interferonin tuottoniasmidin rakentaminen IFN-aA-interferonia varten:

Leukosyytti-interferonissa on esimerkiksi 23 aminohapon esi-sekvenssi, jota seuraa kysteiini, joka esi-interferonin loh-kaisemisen jälkeen merkitsee "valmiin" interferonipolypeptidin ensimmäistä aminohappoa. Valmiin interferonin bakteereissa tapahtuvan synteesin mahdollistavien plasmidien rakentamiseksi on välttämätöntä eristää interferonigeenin se pala, joka täsmälleen alkaa tätä kysteiiniä tarkoittavalla kodonilla. Tämän kysteiinikodonin eteen on tällöin laitettava ATG-metioniiniko-doni, jotta proteiinisynteesin alkaminen olisi mahdollista.

6 86991 Tämä rakenne laitetaan tämän jälkeen sopivalla tavalla pER 103 ekspressioplasmidiin niin, että ATG-aloituskodonin ja RBS-sek-venssin välinen etäisyys on optimaalinen translaation kannalta. Interferonissa, joka valmistetaan bakteereissa tällaisen plasmidin avulla, on puhtaan polypeptidin aminohapposekvenssi sekä lisäksi metioniini tämän NH2~terminaalisessa päässä.

IFN-αΑ interferonia koodaava pER 33 interferonin tuottoplasmi-di rakennetaan keksinnön mukaisesti esimerkiksi näillä periaatteilla (sen valmistus on esitetty uudelleen kaavioilisesti kuviossa 4): a) Valmista interferonia koodaavan geenin, lukuunottamatta NHo-terminaalisen kysteiinin kodonia, rakentaminen:

Interferoni-informaation lähtömateriaalina on esimerkiksi interferonia IFN-αΑ koodaava cDNA-klooni 1 F7, joka 17.5.1982 on DENS-numerolla 2362 tallennettu "Deutsche Sammlung von Mikro-Organismen"-talletuslaitokseen (Griesebachstrasse 8, D 3400 Göttingen, Saksa-BRD) (kts. myös saksalainen patenttihakemus P 32 20 116.8, 28.5.82).

Se sisältää interferonigeenin insertoituna pBR322 plasmidin Pst I-katkaisukohtaan. IFN-αΑ interferonissa (kuten muissakin leukosyytti-interferoni-subtyypeissä) on Sau 3A-katkaisukohta heti NH2~terminaalista kysteiiniä koodaavan TGT:n jälkeen. Tämän katkaisukohdan olemassaolo muodostaa perustan käytetylle menetelmälle, jolla rakennetaan "valmis" interferonigeeni sopivista restriktiopalöistä, esimerkiksi plasmidin 1 F7 inter-feronispesifisestä 646 bp Ava II-palasta ja 34bp-Sau 3A-Ava II-palasta.

b) Oiigonukleotidi-kompleksin valmistaminen: Näin rakennetun geenin 5'-päähän on nyt liitettävä puuttuva kysteiinikodoni ja sen vuoksi ATG-metioniinikodoni; lisäksi tarvitaan liitospala, joka mahdollistaa tämän rakenteen liga- 7 86991 toinnin pER 103 ekspressioplasmidin Hindi 11-katkaisukohtaan. Tätä tarkoitusta varten syntetisoidaan 4 oiigonukleotidia: 14mer 5' TGTGATCTGCCTCA, 12mer 5’ AGCTTAAAGATG, 9mer 5' CAGATCACA ja 8mer 5' CATCTTTA. Ligatoinnin ja Sau 3A-1isäleikkauksen jälkeen nämä oiigonukleotidit muodostavat halutun paikan, joka voi sitoa interferonigeenipäät pER 103 plasmidin (Hindi 11-päät) kanssa: 12mer__l;4mer 5' AGCTTAAAGATGTGTCATCTGCCTCA 3 ’ atttctacacactÄg!ac HindiII 8mer 9mer ^ |_I SaU 3Ä

Met Cys

Keksinnön mukaisesti oiigonukleotidit rakennetaan siten, että aloituskodoni ATG ja kysteiinikodoni TGT ovat eri paloissa. Tämä mahdollistaa 12mer-osan (ja 8mer-osan) yleisen käytön insertoitaessa geenejä pER 103 plasmidiin. Kysteiinikodonin sisältävän oiigonukleotidin on sen vuoksi oltava vähintään 9 nukleotidin pituinen. Esimerkiksi voidaan käyttää seuraavia nukleotideja: 5'TGTGATCTG, 5' TGTGATCTGC, 5'TGTGATCTGCC, 5'TGTGATCTGCCT, tai 5'TGTGATCTGCCTC.

Interferonigeenin sopivien Sau 3A-päiden muodostamiseksi käsitellään siten esimerkiksi 14mer-osan kanssa saatu ligatoi-tu oligonukleotidi Sau 3A:lla.

s 86991

Seuraava interferonigeenin ja oiigonukleotidi-kömpieksin liittäminen, 1igantointiplasmidiin ja tämän trans formointi bakteeri-isännässä, esimerkiksi Escherichia coli HB 101 bakteerissa, tapahtuvat kirjallisuudessa tunnetuilla menetelmillä.

Saannon nostamiseksi vieläkin enemmän eukaryoottisten geeni-tuotteiden valmistuksessa voi lisäksi olla edullista, että tähän liittyvä tuottoplasmidi sisältää moninkertaisen, esimerkiksi kaksinkertaisen määrän ekspressioon tarvittavia DNA-sek-venssejä, esimerkiksi kaksi täydellistä geeniä valmiille aA-interferonille, mukaan lukien bakteeriperäiset säätelysekvens-sit. Tätä varten eristetään keksinnön mukaisesti valmistetusta tuottoplasmidista, esimerkiksi pER 33 plasmidista valmiin interferonin geeni, jossa on bakteeriperäinen promoottori, prokaryoottinen, ribosomaalinen sidontakohta ja ATG~aloitusko-doni ja toisen pään muuttamisen jälkeen tämä DNA-pala laitetaan restriktioentsyymi11ä, esimerkiksi EcoRi entsyymillä, keksinnön mukaisesti valmistettuun 1inearisoituun, täysin samanlaiseen plasmidiin.

Edelleen on edullista, että näin valmistettu, tryptofaaniope-ronin sisältävä plasmidi, kuten esimerkiksi pER 33 plasmidi sisältää par-kohdan, so. DNA-sekvenssin, joka ilman selek-tiopaineen, esimerkiksi antibiootin, kuten ampisilliinin läsnäoloa vastaa bakteereiden kasvun aikana plasmidin tasaisesta viemisestä tytärsoluihin (kts. P.M. Meacock, S.N. Cohen in Cell 20., 529-542 (1980). Tätä varten eristettiin ensin par-kohta pPM 31 plasmidista, joka on kuvattu mainitussa kirjallisuusviitteessä, ja laitettiin keksinnön mukaisesti valmistettuun interferonin tuottoplasmidiin.

Esillä olevan keksinnön avulla on siten onnistuttu rakentaa ekspressioplasmidi, joka sisältää Serratia marcescens-baktee-rin tryptofaani-operonin promoottori/operaattori-alueen sekä synteettisen RBS-sekvenssin. Tämän rakenteen teho bakteereille vieraiden proteiinien geeniteknisessä tuotossa on osoitettu 9 86991 leukosyytti-int.erferonia koskevassa esimerkissä.

Seuraajat esimerkit selventävät keksintöä lähemmin:

Yleisten menetelmien kuvaus: 1. Restriktioentsyymi käsittelyt

Restriktioendonukleaaseja, esimerkiksi Bethesda Research Laboratories-yhtiöstä, käytettiin seuraavissa olosuhteissa,

Eco Rl-, Hin d 111 — , Pst I- ja Ava II-käsittelyt suoritettiin TA-puskurissa (33 mM tris-asetaatti,pH 7,9, 66 mM K-asetaati, 10 mM Mg-asetaatti, 100 pg/ml BS ) ;

Hae 11I-käsitte lyt suoritettiin TM-puskurissa (70 mM tris-HCl, pH 7,5, 7 mM MgCl2);

Sau 3A-käsi11e 1yt suoritettiin 10 mM tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2, 75 mM NaCl-puskurissa.

2. Plasmidipreparaatti, qeelielektroforeesi

Plasmidit preparoitiin Birnboim'in ja Doly'n (kts. Nucleic Acids Res. 7_, 1513-1523 (1979)) mukaisesti 1,5 ml tai 100 -300 ml- viljelmissä (yön yli) LK-liemessä, joka sisälsi 25 ^jg/ml tetrasykliiniä tai 100 |jg/ml ampisi 11 iinia . Plasmidit puhdistettiin edelleen saostamalla isopropanolilla (kts.

··· jäljempänä) ja (suuremmat erät) kromatograafisesti Pharmacia- yhtiön Sepharose 4B:llä. Suuremmat plasmidimäärät (1-6 litran viljelmät) jatkokäsiteitiin Clewell'in ja Helainki'n "cleared lysate"-menetelmällä (kts. Biochemistry 4428-4440 (1970)), jolloin tämän jälkeen suoritettiin etidiumbromidi-CsCl-gra-dientti sentrifugointi.

Plasmidien tai niiden restriktiokäsit telytuotteide n elektroforeesi suoritettiin 0,8 - 1,4-prosenttisissa agaroosigeeleissä tai 6-prosen11isissa polyakryylia midigeeleissä seoksessa, jonka koostumus oli: 40 mM tris-asetaatti, pH 7,8, 20 mM Na-a steaatti , 2 mM EDTA. Restriktiopalat valmistettiin leik- 10 86991 kaarnalla pois halutun fragmentin sisältävä geelipala ja eluoimalla DNA geelistä elektroforeettisesti dialyysiputkessa.

3. Kinaasi- ja fosfataasireaktiot, liqaasireaktiot 51 - fosforylisointireaktiot (päiden leimaukset) suoritettiin TM-puskurissa (70 mM tris-HCl, pH 7,3, 7 mM MgC^) + mM DTT + 0,2-0,5 mM A TP (10-20 uCCi 32p-ATP) 5 yksiköllä T4-polynukleotidikinaasia, jota on saatavissa Bethesda Research Laboratories-yhtiöstä, 37°C:ssa 60 minuutin ajan. Tämän jälkeen inkuboitiin 10 minuuttia 70°C:ssa entsyymin inakti-vo imiseksi.

Ligaasireaktiot suoritettiin yön aikana 14°C:ssa TM-puskurissa, joka sisälsi 5 mm DTT ja 0,25 mM ATP, käyttämällä 0,1 yksiköä T4-DNA-ligaasia, jota on saatavissa Bethesda Research Laboratories-yhtiöstä, ("blunt-end"-ligatointi) tai 0,005 yksikköä ligaasia (kohesiivisten päiden ligatointi). Sen jälkeen entsyymi denaturoitiin pitämällä sitä 10 minuuttia 70 °C:ssa.

Peräkkäiset kinaasi- ja ligaasireaktiot suoritettiin samassa reaktioseoksessa. Ensimmäisen entsyymin lämpödenaturoinnin jälkeen lisättiin vielä 5 mM DTT ja 0,25-0,5 mM ATP ja suoritettiin toinen reaktio.

Fosataasireaktio suoritettiin restriktiokäsittelypuskurissa (tavallisesti TA-puskuri) lisäämällä 1 yksikkö alkalista fosfataasia (Sigma-yhtiön vasikan suolesta valmistama entsyymi) restriktiokäsittelyseokseen ja inkuboimalla 15 minuuttia 37°C:ssa. Tämän jälkeen uutettiin 1-2 kertaa fenolilla, kerran eetterillä ja saostettiin alkoholilla. Tämän jälkeen DNA-palat usein vielä erotettiin elektro foree11ise sti ja eluoitiin ennen muiden käsittelyjen suorittamista.

Suuret DNA-palat (500 bp ja suuremmat) erotettiin pienemmistä paloista (kyktkentäpalat, joita ei ole ligitoitu, tai restrik- n 86991 tiokäsittelyn pienet tuotteet) suorittamalla iospropanolisaos-tuksia: Reaktioseokseen lisättiin 2N NH^asetaattia (loppukon-sentraatio) ja saostettiin huoneen lämpötilassa 10 - 20 minuutin aikana käyttämällä 0,6 tilavuusosaa isopropanolia. Eppen-dorf-sentrifuugissa sentrifugoitiin 5 minuuttia, minkä jälkeen yläosa erotettiin, sakka pestiin kylmällä 70-prosenttisella etanolilla ja sentrifugoitiin vielä kerran; näin saatu kuivattu pelletti oli valmis jatkokäsittelyä varten.

g. Qligonukleotidien valmistus: gglitykset: DMTr = p,p'-dimetoksi-trifenyylimetyyli ibu = Isobutyryyli bz = Bentsoyyli (emästypessä) (p)^ = Kanta japolymeeri B = Tyrniini tai N^-isobutyryyliquaniini tai N4-bentsoyylisytosiini tai N^-bentsoyyliadeniini THR = Tetrahydrofuraani

Esimerkki I

Kantaiano1vmeerin funktjona1isointi

Kantajapolymeerin funktionalisointi suoritettiin kirjallisuudesta tunnettujen menetelmien mukaisesti. Kantajana toimi HPLC-si1ikageeli (Macherey 5 Nagel, raekoko 20 pm, huokoskoko 200 A). Se derivoitiin Matteucci'n ja Caruthers'in kuvaamalla tavalla paitsi, että sukkinylointivaihe suoritettiin meripih-kahappoanhydridi11ä vedettömässä pyridiinissä (kts. M.D. Matteucci, M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 21., 719 (1981)), J. Am. Chem. Soc. 103. 3185 (1981) ja myös M. Tanaka, R.L. Letsinger, Nucleic Acids Research 10., 3249 (1982)). Suojatut nukleosidit liitettiin siten kovalenttisesti silika-geelin kanssa seuraavan kaavion mukaisesti: 12 86991

B

DMTr-0 — el·0^ °C2H5 \_/ Ό-Si-(CH ) -N-CO-(CH ) -C0-0 t 2 3 , 2 2

oc2h5 H

Kuormitustiheys oli välillä 68 - 104 mikromoolia nukleosidia/g kantajaa .

Esimerkki II

51 -dimetoksitrityvli-desoksi tyrnidiini-3'-kloorimetoksifosfiit- t_i Täysin suojattu nukleosidi-3'-kloorimetoksifosfiitti syntetisoitiin kirjallisuudesta tunnettujen menetelmien mukaisesti (M.D. Matteucci, M.H. Caruthers, J. Am. Chem. 103, 3185 (1981) ja T. Tanaka, R.L. Letsinger, Nueclic Acids Research 10., 3249 (1982)).

544,6 mg (1,0 millimoolia) 5’-dimetoksitrityyli-tymidiiniä (DMTrdT) liuotettiin 1,0 mitään absoluuttista tetrahydrofuraania ja tämä liuos -78°C:ssa ja typen alla lisättiin tipottain 15 minuutin kuluessa sekoitettuun liuokseen, joka sisälsi 0,9 millimoolia metyy1i-dikloorifosfiittia, 0,5 ml absoluuttista pyri-diiniä ja 2,0 ml absoluuttista tetrahydrofuraania. Seuraavan 10 minuutin kuluttua reaktioliuos lämmitettiin huoneen lämpötilaan ja sentrifugoitiin. Yläosa siirrettiin pipetillä kuivaan, argonilla täytettyyn hiokesuiseen kolviin (25 ml). Liuotin poistettiin huoneen lämpötilassa tyhjiössä, minkä jälkeen lisättiin 0,5 ml sekä tolueenia että tetrahydrofuraania ja haihdutettiin uudelleen, jolloin tuote jäi jäljelle värit- i3 86991 tömänä, vaahtomaisena kiinteänä aineena. Tämän tuotteen puhtautta ei analysoitu vaan se liuotettiin 10,0 ml :aan absoluuttista pyridiiniä. Tätä liuosta säilytettiin typen alla -20°C:ssa käyttöönsä asti, enintään kuitenkin viikon verran.

Esimerkki III

2 5'-dimetoksitrityyli-N -butyryyli-desoksiquanosiini-31-kloorimetoksi-fosf iitti

Esimerkin II mukaisesti valmistettiin tämän nukleosidi-fosforo-kloridiitin liuos 10,0 ml:ssa pyridiiniä käyttämällä 640,0 mg (1,0 millimoolia) 5 ' - dimetoksit ri t y yl i-N -isobutyyli-desoksiguanosii nia.

Esimerkki I\l S'-dimetoksitrityyli-N^-bentsoyyli-desoksisytidiini-l1- kloorimetoksi-fosfiitti

Esimerkin II mukaisesti valmistettiin tämän nukleosidifosforo-kloridiitin liuos 10,0 ml:ssa pyridiiniä käyttämälä 633,7 mg (1,0 millimoolia) 5'-dimetoksi-trityyli-N -bentsoyyli-desoksisytidiiniä.

Esimerkki \l 3'-dimetoksitrityyli-N^-bentsoyyli-desoksiadenosiini-3 1 -kloorimetoksi-fosfiitti

Esimerkin II mukaisesti valmistettiin tämän nukleosidifosforo-kloridiitin liuos 10,0 ml:ssa pyridiiniä käyttämällä 657,7 mg (1,0 millimoolia) 5'-dimetoksitrityyli-N^-bentsoyyli-desoksiadenosii nia .

86991

Esimerkki VI d-TCCTTA:n synteesi 50 mg (= 5 mikromoolia) DMTrdA^z-kuormitettua kantajapolymeeriä (kts. esimerkki I) laitettiin lasisuodattimeen. Sen jälkeen lisättiin seuraavan luettelon mukaisesti eri liuottimet ja reagenssiliuokset, kantajaa ravisteltiin näissä hetken aikaa ja halutun reaktion jälken liuos poistettiin uudelleen siten, että se ajettiin suodattimen läpi ylhäältäpäin Argon-kaasuvirran avulla.

a) DMTr-ryhmät lohkaistiin 3 ml:lla liuosta, joka sisälsi 70 g sinkkibromidia, 500 ml nitrometaania ja 5 ml vettä. Reaktioaika: 10 minuuttia.

b) Pestiin 4 kertaa käyttämällä kulloinkin 3 ml n-butanolin, lutidiinin ja tetrahydrofuraanin (4:1:5) seosta.

c) Pestiin 4 kertaa käyttämällä kulloinkin 4 ml absoluuttista py ri di i ni ä .

d) Kohdensoitiin seuraava nukleotidipala : 1 ml 5'-dimetoksi-trityyli-desoksitymidiini-3'-kloorimetoksifosfiitin (esimerkki B) (noin 100 mikromoolia) pyridiini-liuosta lisättiin ;; typen alla suodattimessa olevaan kanta japolymeerii n ja tätä ravisteltiin liuoksessa.

Reaktioaika: 10 minuuttia.

e) Pestiin 3 kertaa käyttämällä kulloinkin 3 ml absoluuttista pyridiiniä.

f) Fosforihappo-triesteri hapetettiin 100 mg:lla jodia, joka oli liuotettu 3 ml:aan tetrahydrofuraanin, lutidiinin ja veden/ (2:2:1) seosta.

Reaktioaika: 7 minuuttia.

15 86991 g) Pestiin 3 kertaa käyttämällä kulloinkin 4 ml tetrahydro-f uraania.

h) Reagoimattomat 31-OH-ryhmät asetyloitiin liuoksella, joka sisälsi 150 mg 4-d.i me t y y 1 i a m i nop y ri d i i i ni ä , 0,3 ml kollidiinia, 0,25 ml asetanhydridiä ja 2,3 ml tetrahydro-furaania.

Reaktioaika: 3 minuuttia.

i) Pestiin 4 kertaa käyttämällä kulloinkin 3 ml ni t rometaa nia . tämä sarja a) - i) toistettiin vielä 4 kertaa, jolloin vaiheessa d) käytettiin sekvenssiin kulloinkin tarvittavaa nukleotidipalaa.

Saannon määrittäminen:

Viimeisen nukleotidipalan kondensoinnin jälkeen kantaja kuivattiin öljypumpun tyhjiössä, punnittiin tarkalleen noin 1 mg suuruinen määrä koeainetta (Probe) ja lisättiin 10,0 ml tolueenisulfonihapon 0,1 M liuosta aseton itrii1issä. Tällöin tapahtuvan di metok s itrityyli-kationin poislohkeamisen vaikutuksesta saadaan oranssinpunainen liuos, jonka absorptio aallonpituudella 498 nm mitattiin. Kantajan kuormitus di metoksitrityyli-suoja ryhmi11ä voidaan laskea kaavasta - 498 ;;· Kuormitus/jjMol/g/ = (Abs. ) . (La imennuske rroi n) . 14,3

Kantajan paino /mg/

Tulokseksi saadaan: 43 yj/Mol/g. Tämän perusteella kondensointi-v aiheen ke s k i mä ;i rä i non saanto on 85 % .

Met yyl iryhmien lohkaiseminen f os f ori ha ppotri eSiteri ryhmistä: ·./ Kantajaa ravisteltiin 45 minuuttia 4 mlrssa tiofenolin, trietyy1 iamiinin ja dioksaanin (1:1:2) liuosta, minkä jälkeen pestiin metanolilla ja sen jälkeen eetterillä.

16 86991

Emästen suojaryhmien ja samanaikainen heksanukleotidi-ketjujen lohkaiseminen kantajapolymeeristä : Kantajaa lämmitettiin 14 tuntia 50°C:ssa yhdessä 10 ml kanssa väkevää ammoniakkia, minkä jälkeen vesiliuos erotettiin imulla ja suodos haihdu-tettiin noin 2 ml:ksi.

Tuotteen puhdistaminen: Näin saatu raakatuote, jonka 5'-päässä oli vielä dimetoksitri-tyyli-suoja ryhmä, kromatografoitiin Reversod-Phase HPLC-merietelmäl lä . Pylväs: μ-Bondapak C^g, Waters; el uo i nt ia ine : 0,1 M trietyy1 iammoniumasetaa11puskuri, pH 7, jossa 25 % aset oni tri ili ä ; virtausnopeus 2 ml/min.; retentioa ikä : 14 minuuttia. Yhdistetyt el uo int i j akee t haihdutettiin noin 1 mlsksi, lisättiin 10 ml 80-prosenttista etikkahappoa ja annettiin seistä 30 minuuttia huoneen lämpötilassa.

Tämän jälkeen haihdutettiin tyhjiössä kuiviin 50°C:ssa, jäännös liuotettiin 25 mitään vettä ja irti lohjennut di me.to ksi t ri t a no li uutettiin 3 kertaa 15 mltlla eetteriä. Vesifaasi haihdutettiin uudelleen kuiviin, jäännös liuotettiin 2,5 mitään vettä, suolat poistettiin Biogel P 2-käsitte 1y11ä (pylväs: 60 x 1,7 cm) ja lyofilisoitiin.

Tuotteen analyysi:

Puh ta uskontrollina käytettiin analyyttistä HPLC-diagrammia (pylväs: 300 x 3,9 mm, μ-Bonda pa kk C^g, Waters; e 1 uoi nt ia ine : 0,1 M trietyyliammoniumasetaattpuskuri, pH 7, jossa 12 % asetonitriiliä; virtausnopeus: 1,5 ml/min.; retentioaika: 3,7 minuuttia).

Esimerkki VII

d-TAAGGAGGTTTA:n synteesi

Valmistetaan esimerkin VI mukaisella tavalla, lähtöaine: 17 86991 300 mg (30 jjMoI ) DMTrdAbz .~~0 .

Tuotteen HPLC-diagrammi:

Pylväs: 300 x 3,9 mm, μ-Bondapak C^g, Waters;

Eluointiaine: 0,1 M trietyyliammoniumasetaattipuskuri, pH 7, jossa 12 % asetonitrii1iä; virtausnopeus: 1.5 ml/min.; retentioaikä: 4,4 minuuttia.

Esimerkki Vili d-AGCTTAAACC:n synteesi

Valmistetaan esimerkin VI mukaisella tavalla, lähtöaine: 200 mg (16 jjMol ) OMirdCbz,^.0 Tuotteen HPLC-diagrammi:

Pylväs: 300 x 3,9 mm, μ-Bandapak C^, Waters;

Eluointiane: 0,1 M trietyyliammoniumasetaattipuskuri, pH 7, 12 % asetonitrii1iM; virtausnopeus: 1,5 ml/min.; retentioaikä : 3,4 minuuttia.

Esimerkki IX d-CATCTTTA:n synteesi

Valmistetaan esimerkin VI mukaisesti, lähtöaine: 150 mg (1,32 yuMol ) DMTrdAbz^®.

Tuotteen HPLC-diagrammi:

Pylväs: 300 x 7,8 mm, jj-Bondapak C^g, Waters;

Eluointi aine: 0,1 M trietyyli ammoniumasetaattipuskuri, pH 7, jossa 20 % asetonitriiliä; virtausnopeus: 1.5 ml/min.; retentioaikä : 7,7 minuuttia.

Esimerkki X

d-AGCTTAAAGATG:n synteesi

Valmistetaan esimerkin VI mukaisesti, lähtöaine: 200 mg (16,2 uMol) DDM1 rdGlbu —(p) .

10 86991

Tuotteen HPLC-diagrammi:

Pylväs: 300 x 7,8 mm, μ-Bondapak C^g, Waters;

Eluointiaine: 0,1 M trietyyliammoniumasetaattipuskuri, pH 7, jossa 26 % asetonitriiliä; virtausnopeus: 1.5 ml/min.; retentioaika: 5,2 minuuttia.

1.. s ime rkk i Xl d-TGTGATCTGCCTCA:n synteesi

Valmistetaan esimerkin VI mukaisesti, lähtöaine: 250 mg (22 jjMoI ) DMTrdAbz ^P) .

Tuotteen HPLC-diagrammi:

Pylväs: 300 x 7,8 mm; u-Bondapak C · Waters; 1 o

Eluointiaine: 0,1 M trietyyliammoniumasetaattipuskuri, pH 7, jossa 25 % asetonitriiliä ; virtausnopeus: 1.5 ml/min.; retentioaika: 6,1 minuuttia.

I s i me rl< k i X 1 1 d-CAGATACA:n synteesi

Valmistetaan esimerkin VI mukaisesti, lähtöaine: 150 mg (13,2 jpMol ) DMTrdAbz ,-y® .

Tuotteen HPLC-diagrammi:

Pylväs: 300 x 7,8 mm; |j-Bondapak C^gj Waters;

Eluointiaine: 0,1 M trietyyliammoniumasetaattipuskuri, pH 7, jossa 20 % asetonitriiliä; virtausnopeus: 0,2 ml/min.; retentioaika: 5,2 minuuttia.

Oliqodeoksinukleotidien analyysi

Synteettisesti valmistettujen oiigodeoksinukleotidien sekvenssianalyysi suoritettiin sen jälkeen, kun nämä oli liitetty interferonin pER 33 tuottoplasmidiin (kts. esimerkki 2: pER 33 interferoniplasmidin sekvenssianalyysi). Tällä airelyysillä vahvistetaan samanaikaisesti oikea emäsjärjestys 19 86991 oiigonukleotideissä (kts. kuvio 5).

Esimerkki 1 pER 103 ekspressioplasmidin rakentaminen pER 103 ekspressioplasmidin rakentaminen on esitetty kaaviol-lisesti kuviossa 1.

a ) Promoottori/operaattori-alueen eristäminen P romoo 1.1 o ri/op e ra a 11 o ri-a 1 ueen eristämisen lähtöaineena käytettiin pBR 101 plasmidia, joka sisältää noin 1000 bp Serrat ia marcescens-bakteerin tryptofaani-operonia.

Tämä säätelyalue sijaitsee 90 bp pitkässä Eco Rl - Hae III-palassa, jossa promoottori on suunnassa Eco Rl -^ Hae III .

Noin 23 /ug pBP 101 plasmidia käsiteltiin Eco Rl restriktio-entsyymillä, kaksi muodostunutta palaa erotettiin toisistaan geelielektroforeesil1 a (1,4 % agaroosi) ja 200 bp pituinen pala eluoitiin geelistä elektroforeettisesti. Tämä pala käsiteltiin sen jälkeen Hae III entsyymillä, molemmat käsittely tuotteet erotettiin 6-prosenttise 1la polyakryyli-amidigeelillä ja 90 bp pituinen pala (promoottori/operaattori) eristettiin jälleen geelistä.

b) Ribosomin sidontasekvenssin (RBS) rakentaminen RBS koottiin 3 synteettisestä oiigonukleotidistas 6mer 3'-TCCTTA, lOmer 5'-AGCTTAACC ja 12mer 5 '-TAAGGAGGTTTA.

500 pikomoolia 6mer-oligonukleotidia fosforyloitiin polynukleo-tidinaasi-entsyymin avulla ja näin leimattiin radioaktiivisesti (kts. A). Reaktioseosta kuumennettiin 10 minuuttia 70°C:ssa kinaasin inaktivoimiseksi, minkä jälkeen lisättiin yhtä suuret moolimäärät (fosforyloimattomia) lOmer- ja 12mer-oligo- 20 86991 nukleotideja, oiigonukleotidiseos kuumennettiin 95°C:een ja sen jälkeen jäähdytettiin hitaasti (noin 3 tunnin aikana) 30 - 35°C:een, jolloin oiigonukleotidit hybridoituivat keskenään: 12raer -1 5' dTAAGGAGGTTTA 3'

HO

3' dATTCCTCCAAATTCGA 5' l-1 i-1 6mer lOmer

Lisäämällä 0,25 mM ATP ja 5mM DTT liitettiin toisiinsa kovalent-tisesti 6mer- ja lOmer-oligonukleoti dit DNA-ligaasi-entsyymin avulla (kts. osa A). Fosfaattiryhmien puuttuminen 12mer-ja 10 mer-oligonuk1eotidien 5'-päistä esti multimeeristen 1igaatiotuotteiden muodostumisen. Reaktion jälkeen kuumennettiin 10 minuuttia 70°C:ssa ligaasin inaktivoimiseksi, minkä jälkeen lisättiin 0,5 mM ATP ja 5 mM DTT ja suoritettiin uusi kinaasi-reaktio (kts. osa A9 myös 12mer- ja lOmer-oligonukleotidien 5'-päissä. Tällä tavoin RBS oli saatu valmiiksi.

c) Promoottorin ja RBS-sekvenssin liittäminen

Standardiolosuhteissa (kts. osa A) ligitoitiin keskenään 12 pikomoolia 90 bp pituista Eco RI-Hae III promoottori/ operaattori-palaa ja 60 pikomoolia RBS-sekvenssiä. Koska vain 90 bp-palan Hae 111-katkais uila muodostettu tylppä pää ("blunt end") voidaan ligitoida RBS-sekvenssin tylpän pään kanssa, muodostui vain molekyylejä, joissa RBS sijaitsi oikeassa suunnassa eli promoottorista vastavirtaan. Reaktion jälkeen inaktivoitiin ligaasi pitämällä 10 minuuttia 70°C:ssa, säädettiin TA-puskurikonsentraatioon (kts. osa A) ja jälki-käsitelt ii n 200 yksiköllä Hin d111 ja 10 yksiköllä Eco Rl 21 86991 entsyymejä. Tällä tavoin voitiin edullisesti muuntaa ligaasi-reaktiossa muodostuneet multimeerit (koska halutun reaktion lisäksi sekä Eco Rl-päät että myös Hin dlll-päät voivat ligitoitua keskenään (jälleen monomeereiksi). Tämän jälkeen koeaine erotettiin 6-prosnttisella polyakryyliamidigeeli11ä ja noin 100 bp pitoinen promoottori/operaattori-RBS-pala (jossa on Eco Rl- ja Hin dlll-pää) leikattiin irti geelistä ja eluoitiin elektroforeettisesti sen erottamiseksi ligitoi-tumattoman RBS-sekvenssin ylimäärästä. Näin oli saatu valmiiksi ekspressioplasmidin ekspressiosta vastaava osa (kts. kuvio 3).

Kuviossa 3 esitetty nukleotidise kvenssi voidaan tehdä kirjallisuudesta tunnetuilla polynukleotidisynteesimenetelmi11ä.

d) Promoottori/operaattori-RBS-palan insertointi pBR 322 plasm idi in

Noin 2 /jg pBR 322 plasmidia paloiteltiin Eco Rl ja Hin dill restriktioentsyymeillä, jolloin syntyi kaksi palaa: suuri 4332 bp-pala ja pieni 29 bp-pala. Suuri pala erotettiin pienestä palasta elektroforesointikäsittelemällä 0,8-prosent-tisella a ga roos i geel i 11 ä f iso pala leikattiin irti geelistä ja eluoitiin. Noin 0,4 pikomoolia tätä palaa ligitoitiin sen jälkeen noin 10 pikomoolin kanssa promoottori/operaattori-RBS-palaa (kts. osa A). pBR 322-pala ei voinut ligitoitua itsensä kanssa kahden yhteensopimattoman yliulottuvan pään vuoksi; koska promoottori/operaattori-RBS-pala voitiin ligitoida vain plasmidin suuntaan, promoottio tapahtui Hin d111-katkaisu-kohdassa pbR 322 plasmidin tetrasyk1iiniresistenssi - geeni n suuntaan.

e) Escherichia coli-bakteereiden transformointi pER 103 ekspressioplasmidilla

Escherichia coli HB 101 transformoitiin tämän viimeisen ligitoinnin reakt. ioseoksel la kirjallisuudesta tunnetulla 22 86991 tavalla (kts. Dworkin ja David, Dev. Biol . 7£, 435-440 (1980)) ja t ra ns forma nti t selektoitiin amp is i 11 i ini pi t ois i 11 a agarle-vyillä. Tätä varten kasvatettiin E. coli HB 101 soluja noin

Q

2 x 10 solua/ml tiheyteen asti. Solut pelletoitiin ja suspen-doitiin 100 mM CaClliuokseen (20 minuuttia 0°C:ssa). Tämän jälkeen soluja inkuboitiin ligaasireaktion reaktioseoksen kanssa 5 minuuttia 0 - 4°C:ssa ja 5 minuuttia 37°C:ssa.

Lisättiin 0,5 - 1 ml 1-lientä ja inkuboitiin vielä 15 -30 minuuttia 37°C:ssa. Valittiin 19 tra ns formanttia ja Hae 111-re striktiokäsitte 1yn avulla näistä tutkittiin mahdollinen promoo11ori/o pe ra attori-RBS-pala n mukanaolo. Puuttuvan 192 pb pituisen pBR 322/Hae II-palan oli korvannut 264 pb-pla (16 bp-pala plasmidin pBR 322 Hae 111-katkaisukohdasta "vasemmalle" Eco RI-katkaisukohdasta + 103 bp promoottori/operaattori - RBS-pa la + 145 bp-pala Hin dl II-katkaisukohdasta tästä "oikealle" seuraavaan Hae 111-katkaisukohtaan plasmidissa pBR 322 ). 19 valitusta tra ns formantista oli kahdeksalistoista odotettu restriktiokäsittelykuvio (kts. kuvio 2).

f ) pER 103 ekspressioplasmidin promoottori/operaattori-RBS- i alueen'. sekvenssianalyysi

Jotta voitaisiin vahvistaa epäilykset, että rakennettu eks-pressioplasmidi on oikea, sekvensoitiin yksi tällainen plasmidi (pER 103) promoottori/operaattori-RBS-alueella ja määritettiin sen asema pBR 322 plasmidissa. Sekvenssianalyysi suoritettiin Maxam'in ja Gilbert'in kirjallisuudesta tunnetulla menetelmällä (kts. Proc. Nat . Acad. Sei. 7j4, 560-564 (1977 ))

Eco RI-katkaisukohdasta lähtien Hin dl 11-katkaisukohtaan päin (ja tämän yli) ja myös Hin dl I I-katkaisukohdasta lähtien Eco RI-katkaisukoh taa n päin (ja tämän yli). Tällöin saatiin kuviossa 3 esitetty nukleotidi se kvenssi.

pER 103 on siten ekspressiopi asmidi, joka sisältää Serratia marcescens-bakteerin tryptofaanioperonin promoottori/operaattori-alueen yhdistelmänä synteettisen RBS-sekvenssin 23 86991 kanssa. Tämä uusi ekspressioplasmidi edistää niiden geenien transkriptiota, jotka on laitettu sen Hin dlII-katkaisukohtaan ja mahdollistaa näiden tra nskriptiotuotteiden tehokkaan translaation. Että näin on, on osoitettu esimerkissä 2.

Esimerkki 2

Interferonin tuottoplasmidin pER 33 rakentaminen a. Valmista interferonia koodaajan geenin, lukuunottamatta 2 NH -terminaalisen kysteiinin kodonia, rakentaminen

Noin 1 fjg 1 F7 kloonin Pst I-inserttiä käsiteltiin Sau 3A resktriktioentsyymil1ä ja 6-prosenttisella polyakryyliamidi-geelillä eristettiin 177 bp pituinen pala, joka NH^-termi-naalisen kysteiinikodonin jälkeisestä Sau 3A-katkaisukohdasta ulottuu seuraajaan Sau 3A-katka isukohtaan ja joka sisältää Ava II-katkaisukohdan. Tämä käsiteltiin 1 ml:lla alkalista fosfataasia (kts. osa A) ja saostettiin etanolilla fenoli-ja eetteriuuto 11a suoritetun fosfataasin poistamisen jälkeen. Pala katkaistiin tämän jälkeen Ava II entsyymillä, jolloin saatiin halutu 34 bp Sau 3A-Ava II-pala ja 143 bp-pala.

Tämän kanssa rinnan valmistettiin 1 F7 plasmidista interferoni-*. spesifinen 646 bp Ava II-pala, joka 177 bp Sau 3A-palan sisällä ulottuu Ava 11-k atka isukohdast a päättämiskodonin taakse asti. Sen jälkeen inkuboitiin noin 0,5 jug tätä 646 bp Ava II-palaa, 34 bp ja 143 bp Sau 3A-Ava II-palojen seosta ja DNA-1igaasientsyymiä (koheesivisten päiden ligitointi, kts. osa A). Tällöin muodostui Ava II-paloja, joiden sivuilla on kovalenttisesti sidottuina Ava II-Sau 3A-paloja. Heti kun Ava II-Sau 3A-pala on ligitoitunut Ava II-palan kanssa, näissä kohdissa ei enää voi tapahtua enempää ligitoitumista, koska Sau 3A-päät olivat de fosforyloituja. Ligaasireaktion jälkeen kuumennettiin 10 minuuttia 70°r:ssa entsyymin inakti-voimiseksi, minkä jälkeen lisättiin 5 mM DTT ja 0,25 mM - · ATP ja defosforyloidut Sau 3A-päät kinaasikäsiteltiin uudelleen 24 86991 (kts.. osa A). Reeaktioseos erotettiin 6-prosenttisell a poly-akryy1 ia midigeeli11ä ja eluouitiin molekyylit alueella 700 -800 bp (646 bp Ava Il-pala, jonka sivuilla kaksi Ava II-Sau 3A-palaa) ja alueella 1300 - 1300 bp (kaksi keskenään ligitoi-tunutta 646 bp Av Il-palaa, jonka sivuilla Ava II-Sau 3A-palat ) .

b. Oliqonukleotidi-kompleksin, jonka kaava on 12mer J 14mer I-r I—j--f

5' AGC TTAA AG ATGTG15GATC TGCC TC A

3 ' ATTTC TACAC ACTAGjAC

J_I I_*_J

*

Hin dill ! 8mer 9mer t

I_( I_I :<r-S*u 3A

Met Cys valmi st ami nen 4 synteettisesti valmistettua oiigonuk1eoti di a , nimittäin 14mer 5' TGTGATCTGCCTCA, 12mer 5' AGCTTAAAGATG, 9mer 5' CAGATCACA ja 8mer 5' CATCTTTA, saatettiin reagoimaan seuraavalla tavalla: 8mer-, 9mer- ja 14mer-oligonukleotidi a fos foryloitiin kutakin 250 pikomoolia (kts. osa A) ja reaktion jälkeen kinaasi inaktivoitiin kuumentamalla 95°C:een. Tämän jälkeen lisättiin 250 pikomoolia kinaasi-käsitte lemätöntä 12mer-oligo-nukleotidia ja oligonukleotidiseos jäähdytettiin hitaasti (noin 3 tunnin aikana) 35°C:een oiigonukleotidie n hybridoinnin mahdollistamiseksi. Lisättiin 5 mM OTT ja 0,25 mM ATP ja sen jälkeen oligonukleotidit ligitoitiin keskenään ("blunt-end"-ligidointi, kts. osa A). Fosfaattiryhmän puuttuminen 12mer-oligonukleotidin 5'-päästä esti dimeerien muodostumisen; 14mer-oligonukteotidin yliulottuva pää ei ole komplementäärinen itsensä kanssa eikä voi siten aiheuttaa dimeroitumista.

25 86991

Osa (25 pikomoolia) ligitoidusta oiigonukleotidikompleksista käsiteltiin 80 yksiköllä Sau 3A entsyymiä interferonigeenin sopivan Sau 3A-pään muodostamiseksi. Tämän jälkeen koenäytettä kuumennettiin 10 minuuttia 75°C:ssa, uutettiin fenolilla ja saostettiin etanolilla. Näin saatiin valmiiksi kytkentäpala, joka keksinnön mukaisesti sitoo interferonigeenin Hindlll-katkaistun pER 103 plasmidin kanssa.

c. Interferonigeenin ia oiigonukleotidikompleksin liittäminen, ligatointi pER 103 plasmidissa

Eristetyt interferonipalat (kts. esimerkki 2a), joiden määrä oli noin 1 pikomooli molekyyliä, yhdistettiin Sau 3A-katkais-tun oligonukleotidikompleksin kanssa (noin 25 pikomoolia) ligatoimalla koheesivit Sau 3A-päät (kts. osa A). Fosfaatti-ryhmän puuttuminen oligonukleotidikompleksin (12mer) Hindlll-päästä esti jälleen multimeerien muodostumisen. Muodostui interferoni geeni-molekyylejä, joiden kummallakin puolen oli oiigonukleotidikompleksi, jossa oli vapaa Hindlll-pää. Ligaa-sin lämpödenaturoinnin ja 5 mM DTT ja 0,25 mM ATP-1isäyksen jälkeen nämä päät fosfory1oitiin (kts. osa A), minkä jälkeen saostettiin isopropanoli11 a (kts. osa A) myös 1igaanisreak-tiossa muodostuneiden oiigonukleotidikompleksi-dimeerien erottamiseksi. Tämän jälkeen ligatoitiin rakenne 0,05 pm kanssa Hindi11-katkaistua, fosfataasikäsiteltyä pER 103 plas-midia (koheesivisten päiden ligatointi, kts. osa A). Hindlll-katkaistun plasmidin fosfataasikäsittely (kts. osa A) vähensi tämän uudelleen rengastumista ligaasireaktiossa. Näin saatiin valmiiksi plasmidien seos, joka sisälsi 50 % asti interferonin tuottoplasmidia (nimittäin niitä plasmideja, joissa geenin alkuun oli saatu 34 pb Sau 3A-Ava II-pala 1igatoitaessa 646 pb Ava II-palan kanssa - kts. esimerkki 2a).

d. Echerichia coli HB 101 solujen transformointi ja transformaation analyysi interferonin tuoton suhteen

Esimerkin 2c mukaisesti valmistettua plasmidiseosta käytettiin 2ί 86991 esimerkin le mukaisesti Escherichia coli HB 101 solujen t rans f ormoi nti i n (kts. Dworkin ja Davi/id, Dew. Biol. 76 , 435-448 ( 1980)). Saaduista tra ns formanteista oli noin 20 %:lla inserttejä (loput olivat uudelleen rengastun eita pER 103-plasmideja), joista usean intraferoniekspressio tutkittiin.

Tätä varten kas vaiettiin 100 ml bakteeriviljelmää 0,6 -0,8 optiseen tiheyteen asti M9 minimia lustassa, johon oli lisätty kaikkia aminohappoja paitsi tryptofaania (20 ug/ml aminohappoa kohti) seka tiamiinia (1 jug/ml), glukoosia (0,2 %) ja t ryp tof aaniope roni n induktorina toimivaa indo li-( 3 )-ak ry yl i-happoa (IAA, 20 ug/ml; kts. Halleti/ell ja Emtage julkaisussa Gene 9, 27-27 (1980)). Bakteerit pelletoitiin sentrifugoima11a 10 minuuttia nopeudella 7000 U/min., pestiin kerran seoksessa: 50 mM TrisHCl, pH 8, 30 mM NaCl, ja sen jälkeen suspendoitiin 1,5 ml:aan samaa puskuria. Bakteereita inkuboitiin 30 minuuttia jäissä 1 mg/ml kanssa lysotsyymiä, minkä jälkeen pakastettiin ja sulatettiin viisi kertaa ja tämän jälkeen s oiujäännökset poistettiin sentrifugoima 11 a yksi tunti nopeudella 40 000 kierr./min. Yläosa steriilisuodatettiin ja siitä testattiin interferoniaktiivis uus plakkien pienentämiskokeessa, jossa käytettiin V3-soluja ja Vesicular St oma t i t is vi rus t a . Noin puolella kaikista klooneista (joissa on insertti) oli huomattava g interferoniekspressio: 2 x 10 yksikköä (kansainvälisiä referenssiyksikköjä ) viljelmän litraa kohti.

e. Interferonin tuottoplasmidin pER 33 sekvenssianalyysi

Valittiin yksi näistä interferonia tuottavista klooneista (pER 33) ja rakennetun plasmidin oikeellisuus vahvistettiin sekvensoimalla promoot tori/’operaa11ori-a lue interferonigeeniin asti. Sekvenssianalyysi suoritettiin jälleen Maxam'n ja Gilbert'in mukaisesti (kts. Proc. Nat. Acad. Sei. USA 74, 560-:564 (1977)). Analyysi aloitettiin 3'-päässä radioaktii-visesti leimatusta Eco RI-katkaisukohdasta interferonigeenin suuntaan. Tällöin saatiin odotettu sekvenssi, josta osa on esitetty kuviossa 5. iässä osassa ovat nähtävissä kaikki pER 33 kloonin rakentamiseen käytetyt o ligonukleotidipalat.

27 86991

Edellä mainitut ominaisuudet vahvistavat, että keksinnön mukaisesti valmistettu pER 103 ekspressioplasmidi sisältää Serratia marcescens bakteerin tryptofaanioperonin promoottori /operaa t t ori -sek venss i n yhdistelmänä synteettisen ribosomin sidontasekvenssin kanssa. Leukosyytti-interferonia koskevassa esimerkissä voitiin osoittaa, etä pER 103 ekspressioplasmidissa on sopivalla tavalla muodostetulla geenillä korkea ekspressio-arvo. pER 103 ekspressioplasmidi on 27.10.1983 tallennettu Budapestin sopimuksen mukaisesti numerolla DSM-NR. 2773 kokoelmaan: Deutschen Sammlung von Mik roo rga nismen Grisebach-strasse 8, D 3400 Gottingen.

Esimerkki 3 pER 21/1 interferoniplasmid.in rakentaminen pER 21/1 plasmidin rakenne on esitetty kaaviollisesti kuviossa 6.

a) IFNgA-qeenin valmistaminen pER 33 kloonista 2 /jg pER 33 kloonia katkaistiin EcoRI ja BamHI restriktioentsyy-meillä, jolloin muodostui kaksi palaa, joiden pituudet olivat noin 1300 bp ja noin 4000 bp. Nämä palat erotettiin elektro-foreet tisesti 1,2-prosentti sell a agaroosigeeli 11ä. Lyhyempi : jae eristettiin geelistä elekt roeluo ima 11a . Tämän DNA:n : päät muunnettiin tylpiksi päiksi lisäämällä dATP, dGTP, dCTP ja dTTP 1,25 nanomoolia kutakin ja 2 yksikköä DNA-poly-meraasi I:n Kle ηοω-pa laa. DNA puhdistettiin uuttamalla fenolilla ja saostamalla etanolipitoisesta liuoksesta ja sen jälkeen se otettiin 15 puitaan vettä.

5'-päihin fosforyloitiin noin 15 pikomoolia EcoRI-kytkentäosaa (Neu/ England Biolabs Inc.) 5 ulrssa reakt iol iuosta lisäämällä 32 γ- p-ATP ja T4-polynukleotidikinaasiä. Kinaasin lämpöinakti-'· voinnin jälkeen lisättiin DNA, 5 nanomoolia ATP ja 0,1 yksikköä T4-ligaasia ja inkuboitiin 16 tuntia 14°C:ssa. Reaktiotuote 28 86991 puhdistettiin pienimolekyylisistä aineista seostamalla isopro-panolilla. DNA katkaistiin tämän jälkeen 20 yksiköllä EcoRI-restriktioentsyymiä, puhdistettiin vielä kerran saostamalla isopropanoli11 a ja liuotettiin 10 pl:aan vettä.

b) pEr 33 plasmidin linearisointi

Noin 2 pg pEr 33 plasmidia käsiteltiin EcoRI restriktioentsyy-millä. Tämän jälkeen lisättiin alkaalista fosfataasia 5'-fosfaattiryhmien poistamiseksi. Noin 5300 pb pitkä, lineaarinen DNA puhdistettiin elektroforeesin avulla 1,2-prosenttises-sa agaroosigeelissä ja elektroeluoimalla muista, ei-katkais-tuista pER 33 plasmideista. DNA uutettiin fenolilla ja eetterillä, saostettiin etanolipitoisesta liuoksesta ja liuotettiin 10 μΐ:aan H2O.

c) Linearisoidun pER 33 plasmidin liittäminen IFNaA:n lisä-geenin kanssa 4 μΐ EcoRI-kytkentäosalla varustettua DNA-palaa, joka sisältää IFNaA geenin ja säätelyosia, ja 0,5 μΐ EcoRI-linearisoitua ja defosforyloitua pER 33 plasmidia ligatoitiin keskenään 20 pl:ssa reaktioliuosta 0,1 yksikön avulla T4-ligaasia. Inkuboitiin 16 tuntia 14°C:ssa, minkä jälkeen entsyymi tuhottiin kuumentamalla 68°C:ssa.

d) E.coli HB101 solujen transformointi ia transformaation analyysi interferonin tuoton suhteen E.coli HB101 transformoitiin esimerkin le mukaisesti esimerkistä 3c saadulla DNA:11a. Kahdesta näin valmistetusta kloonista tutkittiin esimerkin 2d mukaisesti interferonin ekspres-sio plakkien vähentämistestin avulla. Kun pER 33 kloonin IFN-tuotto on 200 x 10^ yksikköön asti viljelylitraa kohti, toisella uudella kloonilla, jonka merkintä oli pER 21/1, saatiin yllättäen yli 300 x 10^ yksikköä vi1jelylitraa kohti.

29 86991 e) pEr 21/1 kloonin restriktioentsyymianalyysi pER 21/1 plasmidia eristettiin suuri määrä ja analysoitiin käsittelemällä Hindlll restriktioentsyymi11ä. Koska pER 33 plasmidin EcoRI-kohtaan tuotu DNA tuotti kaksi identtistä EcoRI-päätä, tällä DNA:11a oli pER 21/1 kloonissa kaksi mahdollista orientoitumistapaa. pER 21/1 kloonin, jossa on yhdensuuntaiset interferonigeenit, käsittelyn Hindlll restriktio-entsyymillä tulee tuottaa paloja, joiden koot ovat noin 4100, 950 (2 palaa) ja 450 bp. Jos näiden kahden geenin orientoituminen olisi kuitenkin vastakkainen, odotettavissa olisi paloja, joiden koko olisi noin 4350, 950 (2 palaa) ja 200 bp. Kun noin 2 pg pER 21/1 kloonia käsiteltiin Hindlll restriktioent-syymillä ja sen jälkeen elektroforesoitiin 1,4-prosenttisel1 a agaroosigeeli11ä, saatiin paloja, joiden koko oli noin 4100, 950 ja 450 bp. Kummatkin IFN A geenit ovat sen vuoksi keskenään samansuuntaiset (kts. kuvio 6).

Esimerkki 4

Interferonin tuottoplasmidin parpET 33 rakentaminen parpER 33 plasmidin rakentaminen on esitetty kaavioi 1isesti kuviossa 7.

a) par-kohdan valmistaminen

Noin 200 pikomoolia EcoRI-kytkentäosaa (New England Biolabs Inc.) fosforyloitiin päistään 20 piissä reaktioliuosta käyttämällä 9 yksikköä T4-polynukleotidikinaasia ja 10 nanomoolia ATP. Tämän jälkeen entsyymi inaktivoitiin lämmöllä. 1 pg pPm 31 plasmidia katkaistiin Aval restriktioentsyymillä. Linearisoidun plasmidin päät muunnettiin tylpiksi päiksi lisäämällä dATP, dGTP, dTTP kutakin 5 nanomoolia ja 4 yksikköä polymeraasi I entsyymin Klenow-palaa. DNA puhdistettiin uuttamalla fenolilla ja saostamalla etanolipitoisesta liuoksesta 30 86991 ja otettiin 40 ul:aan vettä.

EcoRI-kytkentäosaa ja linearisoitua ja tylppäpäistä DNA 70 jjlrssa reakt iol i u os ta käsiteltiin 16 tuntia 14°C:ssa 6 nanomoolilla ATP ja 1 yksiköllä T4-ligaasia. Entsyymin lämpöinaktivoinnin jälkeen liuos säädettiin pH-arvoon 7,6 50 mM NaCl ja 50 mM tris-Cl puskurilla ja DNA käsiteltiin 300 yksiköllä EcoRl-entsyymiä. 2 tunnin inkuboinnin jälkeen restriktioentsyymi lampödenaturoitiin ja DNA erotettiin elektroforeettisesti 1,4-prosenttisell a agarosigeeli11ä. par-kohdan sisältävä DNA-pala, jonka pituus oli noin 400 bp , elekt roeluoit ii n geelistä, puhdistettiin uuttamalla fenolilla ja seostamalla et anolipitoisest a liuoksesta ja liuotettiin 50 ulraan vettä. Tämän DNA-palan päissä on nyt EcoRI-spesifiset ylitteet.

b) pER 33 plasmidin linearisointi

Noin 2 ^ig pER 33 plasmidia käsiteltiin EcoRI-restriktioentsyy-millä. Tämän jälkeen 5'-fosfaattiryhmät poistettiin lisäämällä alkalista fosfataasia. Noin 5300 bp pitkä, lineaarinen DNS puhdistettiin muusta, ei-katkaistusta pER 33 plasmidista elektroforesoima 11a 1,2-prosenttisella agaroosigeelillä ja elektroe 1uoima 11 a. DNA-liuos uutettiin fenolilla ja eetterillä, saostettiin eta no 1ipitoisesta liuoksesta ja liuotettiin : 50 jJl : aan vett ä .

c) Linearisoidun pER 33 plasmidin liittäminen par-kohdan sisältävään DNA:han 0,1 T4-ligaasiyksikön avulla ligitoitiin keskenään 1 ui li nea ri soitua pER 33 DNA ja 1 jjul par-kohdan sisältävää DNA 20 ul:ssa reaktioliuosta. Inkuboitiin.16 tuntia 14°C:ssa, minkä jälkeen entsyymi inaktivoitiin lämmön avulla.

31 86991 d) E.coli HB101 solujen transformointi ia transformoitujen bakteereiden plasmidien analyysi E.coli HB101 transformoitiin esimerkin le mukaisesti esimerkistä 4c saadulla DNA:1 la.·.Saatiin noin 50 pesäkettä. Kymmenestä tällaisesta pesäkkeestä eristettiin pieni määrä plasmi-di-DNA (Birnboim ja Doly, Nucleic Acid Reserach 7, 1513-1523 (1979)) ja katkaistiin PstI restriktioentsyymi11ä. Agaroosi-elektroforesoimal1 a suoritettu analyysi osoitti, että kaikki nämä plasmidit sisälsivät noin 400 bp pitkän par-kohdan. Valittiin yksi tällainen plasmidi ja annettiin sille merkintä parpER33.

e) parpER 33 plasmidin analyysi interferonin tuoton ia stabii1isuuden suhteen

Esimerkin 2d mukaisesti kasvatettiin bakteereita, jotka sisälsivät joko pER 33 tai parpER 33 plasmidin ja sen jälkeen tutkittiin interferonipitoisuus plakkien vähentämistestissä. Kummassakin kannassa interferoniekspressio oli suurin piirtein samalla tasolla.

Pitkäaikaisessa kokeessa, joka ulottui yli 120 bakteerisuku-polven, tutkittiin pER 33 ja parp 33 plasmidien stabiilisuus E.coli HB101 soluissa ilman ampisi11iini-antibiooti11 a aiheutettua selektiopainetta. Viljelmästä otettiin tasaisin välein näytteitä ja tutkittiin bakteereiden interferonipitoisuus. Osoittautui, että pER 33 pitoisissa bakteereissa interferonin tuotto lakkasi noin 60 sukupolven jälkeen. Bakteerit, jotka sisälsivät parpER 33 plasmidin, tuottivat kuitenkin aA interferonia pienentymättömän määrän vielä 120 sukupolven jälkeen.

Näin osoitettiin, etä par-kohdan laittaminen pER 33 plasmidiin ("parpET 33") lisää plasmidin stabii1isuutta E.coli HB101 soluissa.

32 86991 Käytetyt käsitteet ja lyhennykset ATP Adenosii nitri fosfaatti

Emäspari: 2 komplementääristä nukleotidia,

esimerkiksi A-T, G-C

blunt end: DNA-kaksoissäikeisen molekyylin täysin emäsparinen pää erotuksena yliulottuvista yksisäikeis istä pä ist ä bp : Emäspä ri BS : Häränseerumialbumiini cDNA: mRNA5:n kanssa komplementäärinen

DNA

Koodata: Sisältää informaatiota jostakin; DNA:ssa on nukleotidisekvenssissä proteiinn aminohapposekvenssiä koskeva informaatio

Kodoni: 3 nukleotidin ryhmä, joka koodaa määrättyä aminohappoa tai myös po 1 ypep t, idi synteesi n la k ka a mistä Defos fory1 o idä: Poistaa fosfaa11iryhmä DNA: Deoksiribonukleiinihappo DTT: Ditiotreitoii

Elektroforeesi: (DNA-) molekyylien erottaminen sähkökentässä

Ekspressio: Geenin informaation siirtäminen mRNa:han transkription avulla ja myöhemmin polypeptidiin translaation avulla

Ekspressioplasm idi: Plasmidi, joka mahdollistaa siihen insertoitujen geenien ekspression

Geeni: DNA-ala, jossa on informaatio tietystä transkriptistä (RNA-molekyyli), joka myöhemmin . .·. voidaan muuttaa proteiiniksi ” 86991

Geenituote: RNA (transkripti ), proteiini (translaatiotuote)

Hybridointi (nukleiinihappojen): Stabiilien kompleksien muodos taminen keskenään komplementääris-ten DNA-saikeiden välille

Hybridiplasmidi: Plasmidi, joka sisältää vieras peräisen DNA-palan IFN-αΑ: Leukosyytti-interferoni, subtyyppi

A

Aloituskodoni: ATG-kodoni, joka koodaa metioniinia ja joka voi antaa merkin translaation aloittamisesta

Insertti: Vieraan DNA:n pala, joka on hybridiplasmidissa

Kinaasi: Entsyymi, joka voi fosforyloida DNA- ja RNA-molekyyleissä 5' OH-ryhmän

Kinaasi-käsitellä: Varustaa 5'-fosfaattiryhmillä

Klooni: Bakteeripesäke, josta yksittäinen bakteeri on peräisin

Koheesiviset päät: DNA-mol ek y y 1 i n yliulottuvat yksittäissäikeiset päät, jotka voivat hybridoitua keskenään

Komplementäärinen: Toisiinsa sopiva (nukleotidit DNA:ssa: A on kompleme nt ääri nen ..." T:n kanssa, G on komplementääri nen ' C : n ka ns s a )

Ligaasi: Entsyymi, joka voi sitoa eri •DNA-molekyylit toisiinsa kovalent- tisesti

Ligatoida: Sitoa toisiinsa kova lenttisesti - (DNA-molekyylit) mRNA: Lähetti-RNA,onpolypeptidiä

koodaava RNA

34 86991 l·

Nukleotidi: DNA:n tai RNA:n rakenneosa (A = adenosiini, C= cytidiini, G= guanosiini, T= tymidiini, U=urasi ili )

Nukleotidi se kvenssi: Nukleotidien järjestys DNA- tai RNA-mole kyy1issä 0 ligonukleotidi: Pienet toisiinsa fos fodiesteri- sidoksilla liittyneet nukleotidit (lyhyet yksittäissäikeiset DNA-palat)

Operaattori: Operonin säätelyalueen osa, johon repressori sitoutuu, jolloin transkriptio estyy

Operoni: (Bakteeri-) geenien ryhmä, jota voidaan säädellä operaattori-alueelta

Fosfataasi: Entsyymi, joka voi poistaa 5 1 - fosfaattiryhmän DNA-molekyy- lei st ä

Plasmidi: Ekstrakoromosomaalinen, renkaan muotoinen DNA-molekyyli

Promoottori: DNA-sekvenssi, joka kykenee sitomaan RNA-poiymeraasi-entsyymin RBS: Kts. ribosomin sidontasekvenssi

Restriktioendonukleaasi (restriktioensyymi): Entsyymi, joka voi määrätyssä symmetrisessä DNA-sekvenssissä katkaista DNA-kaksoissaikeen

Restriktiopala: DNA-pala, joka muodostuu kasitte- :·. lemällä re st ri kt i oendonuk leaas il la

Ribosomin sidonta- sekvenssi: mRNA:n osa, joka voi sitoutua ribosomiin RNA: Ribonukleiinihappo 35 86991 RNA-polymeraasi: Entsyymi, joka voi syntetisoida DNA:n kanssa komplementaarisen RNA-s aikeen

Sekvenssi: Kts. nukleotidisekvenssi Päättymiskodoni: Kodoni, joka antaa signaalin päättymisestä

Tra ns formantti: Bakteeri, joka on saanut trans formoimalla vieraan DNA:n (plas-midi )

Transformaatio: Vieraan (plasmidi)- DNA:n vienti bakteereihin

Transkriptio: DNA-matriis in kanssa komplemen- täärisen RNA:n synteesi

Translaatio: mRNA:n informaation muuttaminen polypeptidiksi

Tris: Trishydroksimetyyliaminoetaani

Kuvien lyhyet selitykset Kuvio 1 esittä kaavi oliisesti pER 103 ekspressioplasmidin rakentamista. Alojen suuruuksia ei ole esitetty oikeassa mittakaavassa.

Kuv io 2 esittää pBR 322 ja pER 103 plasmidien Hae 111-käsittelykuviota. pBR 322 plasmidin 192 bp-pala on korvattu noin 270 bp pälalla pER 103 plasmidissa.

Kuvio 3 - esittää pER 103 plasmidin nukleotidisekvenssiä Eco Rl- ja . Hin dl I I-katka isukoht ien välillä. Plasmidin loppuosa vastaa pBR 322 plasmidin suurta Hin dlll-Eco RI-palaa.

Kuvio 4 esittää kaaviol1isesti interferonin tuottaplasmidin pER 33 rakentamista. ^7 : Pst. I-katkaisuk ohta, 9 · Sau 3A- ka t. ka isukoht a , ^ : Ava I I-k a t ka i s uk oh ta . 1 F7-insertin 56 86991 restriktiokarttaa lukuunottamatta paloja ei ole esitetty oikeassa mittakaavassa.

Kuvio 5 esittää sekvenssigeelin palaa, jossa on nähtävissä promoottori-RBS-interferonigeeni n liittyminen. Kaikki pER 33 plasmidin rakentamisessa käytetyt oligonukleotidipalat ovat läsnä. Ymmärtämisen helpottamiseksi sama sekvenssi on alempana annettu vielä kaks isäik ei sessä muodossa; yksittäiset oligonuk-leotidin rakenneosat on merkitty.

Kuvio 6 esittää kaavioliisesti interferonin tuottoplasmidin pER 21/1 rakentamista. Paloja tai plamsideja ei ole esitetty mittakaavan mukaisesti.

K uv io 7 esittää ka a v i oi 1 i se s t i interferonin t uo tt oplasmidi n parpER 53 rakentamista. Paloja jo plasmideja ei ole esitetty mittakaavan mukaisesti.

Claims (23)

1. 37 86 991
2. 1. Rekombinantti-DNA-sekvenssi, jonka kaava on 5’AATTCACGCTGATCGCTAÄAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3' GTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGÄAACGGÄAG K-Promoottori- GCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTA CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCCATTCCTCCAAATTCGA -Promoottori/operaattori--RBS- Hin dill johon lopuksi voidaan liittää ribosomi-sidossekvenssiin sekvenssi, jonka yleiskaava on <DNA-sekvenssi, joka koodaa puhtaan IFN-a> 5' AGCTTAAÄGATGTGTGATCTGCCTCAA->
3. 3. ATTTCTACACACTAGÄCGGAGTT-> <-ky t k entä osa——— > siten, että se bakteerien avulla voidaan ekspressoida ja että DNA-sekvenssien yhdistäminen tapahtuu siten, että rakennegee-nin DNA-sekvenssi kytketään DNA-kytkentäsekvenssiin 3',5'-fosfodiesterisidoksella.
4. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että sen kaava on 5'AATTCÄCGCTGATCGCTAAAACÄTTGTGCAÄAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3’ GTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG K - --Promoottori- GCGAÄCCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTA CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCCATTCCTCCAAATTCGA -Promoottori/oper aattori-^—RBS-)| Hin dl11 38 86991 < - Kloonin 1F7, (DSM-Nr. 2362) PstI insertin sisältämä kypsää IFN-α koodaava DNA-sekvenssi-> TAAAGATGTGTGATCTGCCTCAAA ATTTCTACACACTÄGACGGAGTTT <-kytkentäosa->
5. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnet-t u siitä, että sillä on kaava I < - Kloonin 1F7 (DSM-Nr. 2362) PstI insertin sisältämä kypsää IFN-α koodaava DNA-sekvenssi-> 5' AGCTTAAAGATGTGTGATCTGCCTCAA->
6. 3. ATTTCTACACACTAGACGGAGTT-> < — ky t k entä os a->
7. 4. Bakteerissa replikoitava plasmidi, joka sisältää yhtä tai useampaa DNA-sekvenssiä, jonka kaava on 5'AATTCACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3' GTGCGACTAGCGATTTTGTAACÄCGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG K-Promoottori- GCGAACCAGTTAACTAGTACACAÄGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTA CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCCATTCCTCCAAATTCGA -Promoottori/ operaattori-^-RBS-^1 Hin dl 11 johon lopuksi voidaan liittää ribosomi-sidossekvenssiin sekvenssi, jonka yleiskaava on <DNA-sekvenssi, joka koodaa puhtaan IFN-a> 5' AGCTTAAAGATGTGTGATCTGCCTCAA->
8. 3. ATTTCTACACACTAGACGGAGTT-> <—-ky t k entä osa - — > 39 86991 siten, että se bakteerien avulla voidaan ekspressoida ja että DNA-sekvenssien yhdistäminen tapahtuu siten, että rakennegee-nin DNA-sekvenssi kytketään DNA-kytkentäsekvenssiin 3',5'-fosfodiesterisidoksel1 a, edullisesti plasmidista pPM31 saadun par-1okuksen.
9. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen plasmidi pER103 (DSM-Nr 2773), tunnettu siitä, että plasmidi pBR322 29 bp pitkän EcoRI/HindI11-fragmentin asemasta sisältää DNA-sekvens-sin, jonka kaava on 5'AATTCACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3' GTGCGACTÄGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG j(-Promoottori- GCGAACCAGTTÄACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTA CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCCATTCCTCCÄAATTCGA -Promoottori/operaattori--RBS-^ Hin dl 11 ja jolla on kuvan 1 mukainen rakenne.
10. 6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen tuotantoplasmidi pER33, tunnettu siitä, että plasmidi pBR322 29 bp pitkän EcoRI/HindIII-fragmentin asemasta sisältää DNA-sekvenssin, jonka kaava on 5'AATTCACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3' GTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG fc------—-------Promoottori--— 1 GCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTA CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCÄAGTGCCGTTGCCATTCCTCCAAATTCGA -Promoottori/operaattori--RBS-^1 Hin dlII 40 8 6 9 91 ja <- Kloonin 1F7 (DSM-Nr. 2362) PstI insertin sisältämä kypsää IFN-ot koodaava DNA-sekvenssi->
11. 5. AGCTTÄÄAGATGTGTGATCTGCCTCAA ——->
12. 3. ATTTCTACACACTAGACGGAGTT—-> < kytkentä os a-> ja jolla on kuvan 4 mukainen rakenne.
13. 7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen tuotantoplasmidi pER21/l, tunnettu siitä, että se sisältää plasmidin pER33 EcoRI-katkaisukohtaan EcoRI/BamHI-kytkentäosan avulla käsittelemällä plasmidia pER33 EcoRIrlla ja BamHI:lla saatua noin 1.300 pb pitkää DNA-fragmenttia liitettyä fragmenttia, ja jolla on kuvan 6 mukainen rakenne.
14. 8. Patenttivaatimuksen 4 mukainen tuotantoplasmidi parpER33, tunnettu siitä, että se sisältää plasmidin pER33 EcoRI-katkaisukohdassa olevaa plasmidista pPM31 eristettyn 400 bp pitkän par-1okuksen, jolla on kuvan 7 mukainen rakenne.
15. 9. Menetelmä valmistaa patenttivaatimuksen 1 mukaista DNA-sekvenssiä, tunnettu siitä, että 90 bp pitkää Serra-tia marcescens tryptofaanioperoinin promoottori/operaattori-sekvenssi liitetään ribosomisidossekvenssiin, jonka kaava on 5' TAAGGAGGTTA 3' ATTCCTCCAAATTCGA ja mahdollisesti sitten näin saatuun DNA-sekvenssiin, jonka kaava on 5’AATTCACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3' GTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG t~-------------------- promoottori - 86991 GCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTA CGCTTGGTCAATTGATCÄTGTGTTCAAGTGCCGTTGCCÄTTCCTCCAAATTCGA - promoottori/operaattori - |-RBS -1 Hin dl11 liitetään sekvenssi, jonka kaava on <DNA-sekvenssi, joka koodaa puhtaan IFN-a>
16. 5. AGCTTAAAGATGTGTGATCTGCCTCAAA ->
17. 3. ATTTCTACACACTAGACGGAGTTT-> <—-ky t k entä os a > siten, että rakennegeenin DNA-sekvenssi liitetään DNA-kytken-täsekvenssiin 3',5'-fosfodiesterisidoksel1 a.
18. 10. Menetelmä valmistaa patenttivaatimuksen 3 mukaista DNA-sekvenssiä, tunnettu siitä, että 646 bp pitkää kloonin 1F7 PstI-insertin AvalI-fargmentti liitetään 34 bp pitkään fragmenttiin, joka on saatu käsittelemällä 177 bp pitkää kloonin 1F7 Pstl-insertin Sau3A-fragmenttia ja näin saatu fragmentti liitetään oiigonukleotidiin, jonka kaava on 5' AGCTTAAAGATGTGT 3' ATTTCTACACACTAG 1 5'AATTCÄCGCTGATCGCTAAACATTGTGTCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTA 3’ GTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG f·- ---------------- promoottori - .......... " · Menetelmä valmistaa patenttivaatimuksen 8 mukaista plasmi-di pER103, tunnettu siitä, että plasmidissa pBR322 restriktioendonukloeaasi 1 ohkaisul1 a poistetaan plasmidille ominainen 29 bp pitkä EcoRI-Hin dill fragmentti ja sen tilalle liitetään ligaasireaktiolla DNA-sekvenssi, jonka kaava on 42 8 6 9 91 GCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGÄGGTTTA CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCCATTCCTCCAAATTCGA -promoottori/operaattori-1- RBS -1 Hin dill
19. 12. Menetelmä valmistaa patenttivaatimuksen 6 mukainen plasmi-di pER33, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 5 mukaisen plasmidin pER103 Hindi 11-1ohkaisukohtaan liitetään 1igaasireaktiol1 a patenttivaatimuksen 5 mukainen DNA-sekvens-si .
20. 13. Menetelmä valmistaa patenttivaatimuksen 7 mukainen plasmi-di pER21/l, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 6 mukaiseen plasmidiin pER33, joka on linearisoitu EcoRI:11a, liitetään DNA-fragmentti, jonka pituus on noin 1300 bp, joka on saatu käsittelemällä plasmidi pER33 restriktioentsyymei1lä EcoRI ja BamHI, joka liitos suoritetaan EcoRI/BamHI-kytkentä-osan avulla.
21. 14. Menetelmä valmistaa patenttivaatimuksen 8 mukainen plasmidi parpER33, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 6 mukaiseen plasmidiin pER33, joka on linearisoitu restriktio-entsyymillä EcoRI, liitetään plasmidista pPM31 eristetty par-lokus.
22. 15. Menetelmä mikro-organismin valmistamiseksi, tunnet-t u siitä, että transformoidaan bakteeri patenttivaatimusten 4-8 mukaisella plasmidilla.
23. 16. Menetelmä valmistaa kypsän polypeptidi, jolla on IFN-ot-vaikutus, tunnettu siitä, että bakteerinen isäntä transformoidaan patenttivaatimusten 6-9 mukaisella plasmidilla polypeptidin säädettyä tuottamista varten ja näin eks-primoitu polypeptidi erotetaan. « 86991