KR900007866B1 - 인간 β-인터페론 유전자를 지닌 대장균 유전자 운반체의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

인간 β-인터페론 유전자를 지닌 대장균 유전자 운반체의 제조방법

제1도는 β-인터페론 유전자의 제한효소지도 및 염기 배열순서를 나타낸 것이고,

제2도는 β-인터페론 유전자를 대장균 발현 운반체로 재조합시키는 과정을 나타낸 것이다.

본 발명은 항 바이러스 및 항암제로 쓰일 수 있는 β-인터페론 유전자를 지닌 대장균 유전자 운반체의 제조방법에 관한 것이다.

지금까지 대장균을 이용한 β-인터페론 생산방법에 대한 보고는 α-인터페론에 비해 적으며, 대부분 포유동물 세포를 이용하여 제조하여 왔다.

그러나 항바이러스 및 항암제로서 보다 높은 효과를 기대하기 위해서는 많은 임상실험 및 기초연구를 진행시켜야 할 것이며, 그러기 위해서는 높은 순도와 활성을 지닌 다량의 β-인터페론 확보에 대한 필요성이 절실히 요구된다.

따라서 본 발명자는 이와같은 필요성 충족에 부응키위해 대장균을 이용하여 β-인터페론 유전자를 지닌 대장균 유전자 운반체의 제조방법을 발명하였다.

지금까지의 β-인터페론 생산방법을 크게 세가지로 나누어 볼 수 있다.

첫째, 사람의 섬유아세포를 대량으로 키우면서 폴리 I, 폴리 C 및 싸이클로헥사미드로 슈퍼인덕숀(Superinduction)시켜 얻는 방법으로, 이 방법은 β-인터페론 발견 후 그에 대한 기초연구를 위한 필요한 양만큼의 β-인터페론을 얻기 위해 사용된 방법으로 다량의 β-인터페론 생산방법으로는 매우 비효율적이다.

둘째, 인간 β-인터페론 유전자를 CHO(Chinese hamster ovary)세포같은 포유동물 세포에 재조합시켜서 β-인터페론을 생산하는 방법으로(McCormick, F. et al(1984) Mol. Cell. Biol. 4,166), 이 방법은 첫째방법에 비해서는 효율적이나, 이 역시 대량 생산하는데는 대장균을 이용한 생산방법에 비해 비효율적이다.

세째, 인간의 β-인터페론 유전자를 대장균 발현 운반체에 재조합시킨 뒤, 대장균에서 β-인터페론을 생산하는 방법으로, 위의 2방법과 비교시 생산율, 시간 및 비용면에서 볼때, 다량의 β-인터페론을 얻기에 가장 효율적인 방법이다.

따라서 본 발명자는 상기 3가지 β-인터페론 제조법중 대장균을 이용한 β-인터페론 제조방법이 가장 효율적이기 때문에 인간 β-인터페론 유전자를 유도 발현 시키는데 필요한 대장균 유전자 운반체를 발명하게 되었다.

즉, 본 발명은 다음과 같다.

시그날펩타이드 유전자가 포함된 β-인터페론 유전자를 박테리아 운반체(M13mp19)에 클로닝한 후 인공프라이머(primer)로 제한효소 NdeI 인지부위를 만들어 시그날펩타이드 유전자가 제거된 β-인터페론 유전자만을 대장균 발현 운반체(ptac5I-100)에 재클로닝 시킴을 특징으로 하는 인간 β-인터페론 유전자를 지닌 대장균 유전자 운반체의 제조방법으로서, 상기 시그날펩타이드 유전자가 포함된 β-인터페론 유전자는 림포블라스토이드 세포에서 얻은 제노믹 DNA를 제한효소 EcoRI으로 절단하여 EcoRI 절편을 얻고 이를 제한효소 Hind II 및 BglII로 처리한 것이며, 상기 제한효소 NdeI 인지부위는 클로닝된 박테리아 운반체(M13mp19-hβ-IFN-1)에 인공으로 합성된 33mer의 프라이머를 삽입하여 국소 돌연변이방법(Site-directed mutagenesis)에 의해 제조한 것이며, 상기 프라이머는 제한효소 NdeI 인지 부위가 있는 5'-CTT, TCC, ACT, ACA, TCT, AGA, CAT, ATG, AGC, TAC, AAC-3'이며, 상기 제한효소 NdeI 인지부위는 시그날펩타이드 유전자와 β-인터페론 유전자의 시작부분(ATG) 사이에 만들어진 것이며, 상기 시그날펩타이드의 제거는 제한효소 NdeI와 SalI을 처리하여 행한 것이며, 재클로닝은 β-인터페론 유전자와 제한효소 SalI 및 NdeI로 처리한 대장균 운반체(ptac5I-100)를 리가제로 결합시켜 시그날펩타이드 유전자가 제거된 β-인터페론 유전자를 지닌 운반체를 제조하는 방법이다.

본 발명에서 IFN-β를 함유하고 림포블라스 토이드 세포는 미국의 ATCC(American Type Culture Collec-tion, 카탈로그 No. CRL1554) 또는 Human Genetic Mutant Cell Repository(Coriell Institute for Medical Research, Camden, N. Y. 08103)에서 구입할 수 있으며, 잘 알려져 있는 유전자 조작방법(Maniatis, T. et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Lab. , Cold Spring Harbor, N. Y., U.S.A. 1982)을 이용하여 IFN-β가 함유된 전체 핵산 절편을 통상의 방법으로 람다 벡터에 클로닝하였고, IFN-β유전자는 상기한 유전자 조작방법에 따라 프로우브(poobe)는 핵산합성기(Applied Biosystems Ine., model 380B DNA Synthesizer, U.S.A. )로 합성하여 플라크 하이브리디제이션(Plaque hybridizattion : Benton, W. D. and Davis, R. W., Science 196,180,1977) 방법으로 선별하였다.

한편 대장균 발현 벡터로 쓰인 ptac 5는 미국의 Pharmacia사(카탈로그 No. 27-5005-01) 또는 Clontech사(카탈로그 No. 6003-1 또는 6002-1)에서 구입할 수 있으며, 참고문헌(Hallewell, R. A. et al., Nucle-ic Acids Res. 13, 2017,1985)을 이용하여 유전공학의 통상의 지식을 갖는 사람이 쉽게 조작할 수 있다. 대장균 균주 D1210은 미국의 ATCC를 통해 구입하거나, 참고문헌(Sadler, J. R. et al., Gene 8, 279, 1980)을 통해 구입할 수 있다.

본 발명은 좀더 상세히 설명하면 다음과 같다.

인간의 섬유아세포(Fibroblast cell)를 이중나선 RNA나 Poly rI : rc로 유도(induction)시킬 때 생성되는 항바이러스 물질인 β-인터페론은 166개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 제1도에서와 같이 세포밖으로 분리되기 전에는 21개의 아미노산으로 구성된 시그날펩타이드는 β-인터페론의 아미노 말단쪽에 붙어 있는 프로인터페론(Prointerferon) 형태로 존재한다.

따라서 본 발명에서는 대장균에, β-인터페론을 클로닝하기 위해 β-인터페론 제노믹 DNA를 다음과 같은 방법으로 분리하였다.

즉, 림포블라스토이드세포(Lymphoblastoid cell line GM 1416)에서 얻은 제노믹 DNA를 제한효소 Sau3A로 부분적으로 절단(partial digestion)하여 λEMBL4 라이브러리(library)를 만들었고, 합성된 프로브(probe)를 이용하여 프라크 하이브리디제이션(plaque hybridization)방법(Benton W.D ＆ Davis R.W(1977) Science 196,180)으로 λEMBL4 라이브러리로부터 β-인터페론 유전자를 지닌 파아지람다(phagelambda)를 선별한 후 제한 효소 EcoRI으로 절단하여 아가로스(agarose)겔 전기 영동을 건뒤 서던블라팅[(southern blotting)(Southern, E (1975) J. Mol. Biol : 98,503)방법으로 β-인터페론을 포함한 EcoRI 조각(fragment,1835bp)을 확인 및 분리시킨 후, 제한효소 EcoRI 반응 및 탈인산반응(dephosphorylation)을 시킨 박테리아 벡터(ptac5I-100)에 클로닝시켰다.

이어서 시그날펩타이드 유전자 제거된 β-인터페론 유전자만을 얻기 위하여 국소 돌연변이 방법[(Sitedirected mutagenesis)(Mark, D.F. et al(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5662)]을 이용하였다. 즉, 시그날펩타이드 유전자와 β-인터페론 유전자 사이에는 적절한 제한효소 부위가 없으므로 국소 돌연변이 방법을 이용하여 β-인터페론 유전자 시작 부분에 제한효소 Xbal, NdeI 부위를 삽입시켰다.

이어서 본 발명자는 제한효소 NdeI, SalI을 이용하여 시그날 펩타이드 유전자가 제거된 형태의 β-인터페론 유전자를 얻은 뒤, 이것을 박테리아운반체(ptac5I-100)에 재클로닝시켜 β-인터페론 유전자를 지닌 대장균 운반체(ptac5I-100hβ-IFN)를 제조하였다.

실시예 1

인간 β-인터페론 유전자분리 및 박테리아 운반체(ptac5I-100)로의 재조합과정

인간 β-인터페론 유전자를 얻기 위해, 림포블라스토이드 세포(Lymphoblastoid cell line) GM1416(Karyotype 48)에서 우선 160kbp(Kilo base pairs) 이상되는 헥산 절편을 블린과스타포드방법[(Blin, N. and Stafford D.W. (1976)] Nucleic Acids Res. 3, 2303)]에 따라 추출한 후 제한효소 Sau3A로 부분적으로 절단 반응시켰다.

부분적 절단(partial digestion)반응 조건은 위에서 추출한 DNA 60g을 총반응액 1ml에서 제한효소 Sau3A 3unit로 37℃에서 자르면서 10분, 20분, 30분 마다 400μl, 300μl, 300μl씩 꺼낸 뒤 EDTA를 최종농도 15mM되게 첨가한 뒤 70℃에서 10분간 처리하여 반응을 멈추게 하였다. 잘라진 DNA의 분포가 20kb 정도에 있는지 0.4% 아가로스겔 전기영동으로 확인한 뒤, 대부분이 20kb 정도인 분획을 2.5배 에타놀을 첨가하여 침전된 형태의 DNA를 원심분리하여 얻었다. 그리고 70% 에타놀로 씻고, 말린뒤 0.1x TE(1mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1mM EDTA)에 0.5μg DNA/μl되게 녹이고 나서 탈인산반응(dephosphorylation)을 시켰다.

탈인산반응 조건은 12g 정도의 DNA에 소창자 알카린 포스파타제(Calf intestine alkaline phosphatase : Boehringer Mannheim cat # 713023 U.S.A.) 1unit를 총 반응액이 40μl되게 넣고, 37℃에서 30분간 반응시켰다.

이때 반응 완충액은 50mM Tris-HCl, pH 9.5, 1mM Spermidine, 0.1mM EDTA되게 하였다. 반응후 트리니트로아세트산을 최종농도 10mM되게 넣고 70℃에서 10분간 가열시킨 후 에타놀로 침전시켰다.

침전된 DNA를 70% 에타놀로 씻어주고 말린 뒤 0.5μg/μl되게 0.1x TE에 녹여 주었다.

한편 운반체 DNA로서는 람다(lambda) 1059에서 유래된 EMBL4 [(Frischauf, A. et al(1983) J Mol. Biol. 170, 827)]를 프로메가 바이오텍 [Promega Biotech (Mennesota, U.S.A)]에서 구입하여 사용하였는데, 그 분리과정은 EMBL4 DNA 20g을 BamHI 및 SalI을 완전히 절단 시킨 뒤 페놀(phenol), 클로로포름(Chloroform) 으로 각각 추출(extraction)을 하고 나서 이소프로파놀(isopropanol)로 침전시켰다.

침전시킨 DNA를 70% 에타놀로 씻고, 말린뒤 1xTE(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1. 0mM EDTA)에 0.5μg/μl되게 녹였다.

이와 같이 하여 분리된 EMBL4 DNA와 위에서 추출한 제한효소 Sau3A로 부분절단 및 탈인산화시킨 DNA를 서로 접합(ligation)시키기 위하여, 벡터와 인서트의 몰랄비(molar ratio)가 3 : 1이 되게 조절한뒤 접합 반응조건(10mM Tris-HCl pH 7.6, 1mM ATP, 10mM MgCl₂, 1mM DTT)하에서 10unit의 리가아제(ligase)를 첨가한 뒤 14℃에서 16시간 반응시켰다.

이와같이 하여 접합된 DNA를 팩키징(packaging)시키기 위하여 프로메가 바이오텍(Promega Biotech)에서 구입한 팩케젠 시스템(Packagene system)을 사용하여 회사가 권장하는 조건하에서 진행시켰다.

이와 같이 팩키지 된 파아지(Phage)를 숙주인 박테리아 NM4539에 감염(Infection)시킨 뒤 증폭(Amplification)시켰다.

이때 10,000-15,000pfu(plaque forming unit)를 직경 15cm의 아가플레이트에 깔고, 37℃에서 파아지를 하룻밤 키운뒤 15ml PSB(=Phage Stock Buffer : 10mM Tris-HCl, pH 7.4, 10mM MgCl₃, 100mM NaCl)를 플레이트에 붓고 4℃에서 5시간 방치하여 파아지를 용출한 뒤, PEG(polyethylene glycol 6000)침전 및 CsC1 경사원심분리로 농축시켰다.

본 발명자는 이와 같이 제조된 제노믹라이브러리에서 β-인터페론을 지닌 파아지 람다를 선별하는 과정(Screening)으로, 플라크하이브리디제이션(plaque hybridization : Benton, W.D ＆ Davis, R.V (1977) Science 196, 180)방법을 이용하여 실시하였다.

이때 필요한 프로우부(probe)는 유전자 합성기(Applied Bio-system model 380B, U S.A)로 3mer을 합성한 β-인터페론 유전자를 γ-32p-ATP(Amersham Co, U.S.A)와 함께 카이네이즈(Kinase)시킨뒤, 세팩(Seppack C14Water, U.S.A) 처리후 사용하였다.

1차로 선별하여 나온 파아지 플라크(phage plaque)를 다시 2차, 3차로 선별하여 β-인터페론 유전자를 지닌 파아지를 순수하게 선별하였다.

이와 같이 하여 얻은 파아지를 키운뒤 DNA를 추출하여 [(ManiatisT. et al (1982) Molecular cloning Cold Spring Harbor Lab , U.S.A.)] 제한효소 EcoRI으로 절단시킨 뒤 1.0% 아가로스겔 전기영동을 걸고, 써던 블라딩(Southern Blotting, Southern E. (1975) J. Mol. Biol. 98,503)을 실시하여 β-인티페론 유전자를 지닌 EcoRI 절편(1835bp)을 찾았다.

이때 사용한 프로우브는 선별 과정시 사용한 것과 동일하다.

이같은 EcoRI 절편(1835bp)을 겔에서 용출(elution)한뒤 ptac5I-100에 재조합 시켰다. ptac5I-100 운반체는 tac 프로모터를 지닌 ptac5[(Hallewell R.A. et al (1985)] Nucleic Acids Res. 132017)]에서 유래된 운반체로 제한효소 NdeI 부위를 SphI으로 바꾸었고, 제한효소 PvuII, SalI 사이에 NdeI. BglII를 지닌

24mer 5'-CTG TTT AAA TTC ATA TGA GAT CTG-3',

28mer 3'-GAC AAA TTT AAG TAT ACT CTA GAC AGCT-5'

의 링커를 합성하여 넣은 것이다.

이와같은 운반체 ptac5I-100을 제한효소 EcoRI으로 절단시키고 탈인산반응(Dephosphorylation)을 시킨뒤, β-인터페론 유전자가 있는 EcoRl 절편(1835bp)과 접합반응 시켰다.

이같이 재조합 시킨 뒤 숙주인 D1210[HB101의 유도체로 1ac 억제물질(repressor)을 많이 생성하는 균주]에 형질변환(Transformation)시켰다. (Mandel, M ＆ Higa A. (1970) J. Mol. Biol. 53, 154) 형질변환된 박테리아에 EcoRI 절편이 들어가 있는지의 선별 과정은 알카린미니스크린과정 [(alkaline miniscreen procedure ; Birnboim. 과 Doly (1979) Nucleic Acids Research 7, 153) U.S.A]으로 실시하였다. 또한 EcoRI 절편(1835bp)내에 있는 β-인터페론 유전자의 배열순서를 확인하고자 M 13 다이데옥시 시퀴언싱으로 실시한 결과 제1도와 같은 결과를 얻었다.

이 유전자 배열순서를 기존에 보고된 유전자 배열순서(Lawn R.M. et al (1981) Nucleic acids Res 9.1045)와 비교한 결과 30번째 아미노산인 티로신(Tyrosine)코드(code)하는 TAT가 TAC로 바뀐 것 이외에는 동일하였다.

그런데 TAC도 티로신을 코드하므로 β-인터페론의 아미노산 배열에는 전혀 영향을 주지 않는다.

본 발명에 쓰여진 운반체 ptac5와 박테리아 균주 D1210 및 림파블라스토이드세포는 카이론사의 호의로 얻었다.

또한 본 발명에 쓰여진 제한효소 및 기타 여러효소는 구입한 회사가 권장하는 조건하에서 사용하였다.

실시예 2

β-인터페론 유전자 앞부분의 시그날펩타이드(Signal peptide)유전자 제거과정

박테리아 β-인터페론이 발현되기 위해서는 β-인터페론 유전자 앞부분의 시그날펩타이드 유전자를 제거해야 한다. 그런데 β-인터페론 유전자 앞부분에 적절한 제한효소 부위가 없기 때문에 본 발명자는 극소돌연변이(Site-directed mutagenesis) 방법으로 β-인터페론의 첫번째 아미노산인 메티오닌(Methionine)을 나타내는 ATG앞에 제한효소 NdeI을 삽입시켰다.

본 과정을 진행시키기 위해 먼저 ptac5I-100에 들어가 있는 EcoRI 절편(1835bp)을 꺼내 제한효소 HindII. BglII로 절단시킨 뒤 561bp의 β-인터페론 유전자(63bp의 시그날펩타이드 유전자 포함)를 지닌 570bP의 헥산 절편 1% 아가로스겔로부터 전기용출(electroelution)시켜 일루팁디(elutip-D ; Schlei-cherk Schuell사 U.S.A)로 추출 정제하였다.

이어 12.5g/ml되게 Poly A를 첨가한 뒤 2.5개의 에타놀을 가하여 -20℃에서 30분 방치시키고 원심 분리로 헥산을 침전시켰다.

이어 70% 에타놀로 두번 씻어준뒤 스피드백 농축기(Speed Vac Concentrator, Savant U.S.A)에서 말렸고, 이어 100μg/μl정도 되게 TE(Tris HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)에 녹여 준뒤 사용할 때까지 -20℃에 보관시켰다.

이같이 하여 얻은 제한효소 HindII, BglII, 조각(270bp)을 M13mp19에 클로닝 시키기 위하여, M13mp19 RF DNA를 제한효소 BamHI과 SmaI으로 처리한 뒤 서로 접합반응(ligation시켰다. (접합반응 조건은 실시예 1. 참조)

이어 메싱(Mesing J. )의 방법(Methods in Enzymology (1983) 101, 51)에 따라 이 반응액에 200L의 대장균 JM101 컴피턴트(Competent) 세포를 형질 전환 시킨 뒤, 제한효소 HindII, BglII 절편(570bp)이 M13mp19에 재조합된 JM101을 선별하였고 상거(Sanger)의 방법에 따른 M13 다이데옥시 시퀴엔싱(dideoxy sequencing)으로 확인하였다. 이어서 국소 돌연변이(Site directed mutagenesis)를 실행하기 위하여, 다음과 같은 조작을 하였다. 먼저 삽입시키고자 하는 제한효소 NdeI 부위가 있는 프라이머(Primer)를 5'-CTT. TCC. ACT. ACA. TCT. AGA. CAT. ATG. AGC. AAC-3'와 같이 DNA 합성기(Applied Biosystem Model 380B U.S.A )로 합성한 뒤, 0.1A 260을 취하여 건조시킨 뒤 인산화반응(phorsphorylation)시켰다.

인산화반응조건은 50mM Tris(pH 8.0) 10mM MgCl₂, 10mp DTT, 1mM ATP로서 폴리뉴클레오타이드 키나아제(Polynucleotide Kinase, New England Nuclear, U.S.A) 9unit를 첨가하여 총반응액 30μL되게 한뒤 37℃에서 40분간 반응시켰고, 90℃에서 3분간 처리하여 키나아제의 활성을 없앴다.

이와같이 하여 합성된 프라이머의 5'-말단 부위에 인산기를 붙인 다음 상기와 같이 β-인터페론 헥산절편(570bp)이 들어가 있는 M13mp19의 단일가닥 DNA(Single Strand)를 주형(template)으로 이용해서 양자를 서로 붙여 주었다. 이 과정은 0.01 A 260의 인산기가 붙은 합성된 프라이머와 1.5μg의 주형 DNA와 섞은뒤 어닐링(annealing)조건 (20mM Tris-HCl pH 7. 10mM MgCl₂, 50mM NaCl, 1mM DTT)하에서 총반응액 10μl로 65℃에서 5분간 가열한 후 상온에서 10분간 방치하여 시켰다. 이어서 윗반응액 10μl에 75ml의 완충용액(2배농도 20mM Tris-HCl pH 7.5, 10mM MgCl₂, 10mM DTT), 4μl의 dNTPs(dGTP, dCTP, dATP, dTTP가 각각 2.5mM), 0.5μl의 10mM ATP, 10unit의 크레나우효소(Boehringer Mannheim Cat. #759-724, U.S.A), 10unit의 DNA 리가제(New England Biolabs, U.S.A)를 섞고 총반응액 25μl로 되게 한 다음 상온에서 3시간 반응시켰다.

이어서 윗반응액 2μl에 S1-뉴크리에즈(Nuclease; Miles U.S.A ) 4유니트를 첨가후 30mM NaOAc(pH 4.6), 300mM NaCl, 4.5mM ZnCl₂, 10μg/ml denatured calf thymus DNA가 되도록 첨가하여 총반응액 10μl를 37℃에서 30분간 반응시키고, 이 반응액 5μl를 대장균 JM101을 형질전환(Transformation)시킨 후 1xYT플레이트(15cm)에 깔았다.

이와 더불어 S1-뉴클리에즈로 처리하지 않는 것과 컨트롤로 MB mp19RF 40ng도 깔은 후, 선별과정에 들어갔다.

돌연변이가 제대로 일어난 파아지를 선별하기 위하여 본 발명자는 플라크 하이브리디제이션(plaque hybridization)을 실시하였다(실시예 1 참고). 이때 사용된 프로우브(Probe)로는 본 실험에 사용된 33mer인 프라이머(Primer) 1μg을 γ-32P-ATP로 표식시킨 두 세펙(SepPak C18)처리후 사용하였다.

플라크 하이브리디제이션에서 양성으로 나타난 플라크를 원래 플레이트와 비교하여 고른뒤 M13 다이데옥시 시퀴엔시으로 최종 확인하였다.

이와같은 과정을 통해 본 발명자는 β-인터페론의 구조 유전자앞에 제한효소 NdeI 부위를 삽입시키는데 성공하였다.

실시예 3

대장균 유전자 운반체의 구조

이어서 본 발명자는 이와 같이 국소돌연변이 시켜 시그날펩타이드 유전자가 제거된 β-인터페론 유전자를 박테리아 발현 운반체인 ptac5I-100로 옮기기 위하여 다음과 같은 조작을 하였다. 먼저 M13mp19-hβINP-2RF DNA를 추출하여 제한효소 NdeI과 SalI으로 처리한 후 1.0% 아가로스겔전기영동을 하여 516 염기쌍의 헥산절편을 전기용출했다.

한편, 박테리아 발현 운반체인 ptac5I-100도 제한효소 NdeI과 SalI으로 절단한 뒤 이와 같이 전기영동으로 2700염기쌍의 헥산을 분리해 내었다.

이와 같이하여 얻은 이두 헥산 절편을 접합반응(ligation 조건은 상기 참조)시켰고, 이어 대장균 숙주인 D1210에 형질전환 시킨 뒤 알카린 미니스크린(Alkaline miniscreen)방법으로 인간 β-인터페론 유전자가 재조합된 대장균 유전자가 운반체(ptac51-100hβ-IFN)를 제조하였다.

Claims (7)

1. 시그날펩타이드 유전자가 포함된 β-인터페론 유전자를 박테리아 운반체(M13mp19)에 클로닝한 후 인공프라이머(Primer)로 제한효소 NdeI인지 부위를 만들어 시그날펩타이드 유전자를 제거시켜 β-인터페론 유전자만을 대장균 운반체(Ptac5I-100)에 재클로닝함을 특징으로 하는 대장균 유전자 운반체(ptac5I-100hβ-IFN) 의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 시그날펩타이드 유전자가 포함된 β-인터페론 유전자는 림포블라스토이드 세포에서 얻은 제노믹 DNA를 제한효소 EcoRI으로 절단하여 EcoRI 절편을 얻고 이를 제한효소 HindII 및 BglII로 처리한 것임을 특징으로 하는 대장균 유전자 운반체의 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 제한효소 NdeI인지 부위는 클로닝된 박테리아 운반체(M13mp19-hβ-IFN-1)에 인공으로 합성된 33mer의 프라이머를 삽입하여 국소 돌연변이방법(Site-directed mutagensis)에 의해 제조한 것임을 특징으로 하는 대장균 유전자 운반체의 제조방법.
4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 프라이머는 제한효소 NdeI인지 부위가 있는 5'-CTT. TCC. ACT. ACA. TCT. AGA. CAT. ATG. AGC. TAC. AAC-3'임을 특징으로 하는 대장균 유전자 운반체의 제조방법.
5. 제1항, 제3항 또는 제4항에 있어서, 제한효소 NdeI 인지 부위는 시그날펩타이드 유전자 종료 부분과 β-인터페론 유전자 시작 부분 사이에 만들어지게 함을 특징으로 하는 대장균 유전자 운반체의 제조방법.
6. 제1항에 있어서, 제한효소 NdeI와 SalI을 처리하여서 시그날펩타이드 유전자를 제거하여 β-인터페론 유전자만을 분리시킴을 특징으로 하는 대장균 유전자 운반체의 제조방법.
7. 제1항에 있어서, 재클로닝한 β-인터페론 유전자와 제한효소 SalI 및 NdeI로 처리한 박테리아 운반체(ptac5I-100)를 리가제로 결합시켜 행함을 특징으로 하는 대장균 유전자 운반체의 제조방법.

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